TWI589699B - 自罹患神經管缺陷病患羊水分離人類神經幹細胞 - Google Patents

Description

自罹患神經管缺陷病患羊水分離人類神經幹細胞

本發明係關於人類神經幹細胞。更特定言之，本發明提供一種自一病患之羊水分離人類神經幹細胞之方法，該病患之胎兒經診斷為罹患神經管缺陷；及該經分離之人類神經幹細胞之用途。

目前已發現於中樞神經系統(CNS)之神經幹細胞(NSC)可同時具有自我更新及分化成大腦中每一種主要細胞類型之能力。自從首先在小鼠大腦中發現NSC在治療神經退化病症上之潛在治療用途後，NSC已成為深入研究之主題[1,2]。具體言之，NSC之移植可在損傷或病變的CNS中誘發細胞修復及恢復功能[3-6]。先前研究已證明植入CNS中之NSC不僅可形成新的神經元，亦可表現保護及營養因子並將其釋放至受損區。

先前在成年哺乳動物CNS中發現NSC之來源包括海馬顆粒下區及前腦腹側之室管膜下區[7]。人類NSC通常係由夭折胎兒、死者大腦或手術樣品中獲得[7-9]。然而，此等樣本之供體年齡、儲存、存活率及潛在污染之變數使得其難以在醫療用途中使用[10]。其他的障礙包括：有限的可獲得性、採集之技術困難及倫理問題。最後，於初級培養中，人類NSC之生長緩慢動力學對獲得臨床應用所需品質細胞之能 力造成嚴重限制。近年來，已建立了一些永生之神經幹/祖細胞株[11,12]，相較於典型的NSC，此等細胞株具有相對較高的增殖力，同時仍保持可分化成不同神經細胞類型之能力。然而，在建立此等細胞株時使用了致癌基因及病毒感染，因此引發其在醫療目的應用中之風險的疑慮。其他團體已自多能性幹細胞(諸如胚胎幹細胞或誘導性多能性幹細胞)來建立細胞株[13-15]。雖然此等方法確實可引入新的NSC來源，但仍具有於群體中存留未分化細胞且因此形成畸胎瘤之可能性[16]。因此，若要將源自多能性幹細胞之NSC應用於醫療用途，亦受到倫理問題、安全問題及不良效率之限制。

神經管缺陷(NTD)為神經管發育異常時最常見之缺陷，且其影響大約1/1000之懷孕者[17]。神經管係在胚胎發育期間形成且最終產生整個CNS。當神經管在任一端未完全閉合時，即會造成NTD。在人類中，最常見的NTD為無腦症及脊髓膜膨出。前者因神經管之頭端閉合失敗造成，且其特徵在於顱頂及大腦半球全部或部分不存在，而後者為尾部神經管及脊柱之缺陷性閉合[18-20]。無腦症導致大腦及顱骨之形成不完全，且因此致死。大多數患有脊髓膜膨出之個體具有多系統障礙及有限的壽命。超音波技術或母體血清α-胎兒蛋白含量之量測可在胎兒尚未出生前即偵測出NTD[21]。後續通常藉由量測羊水中α-胎兒蛋白及乙醯膽鹼酯酶之含量來證實NTD的存在[22]。

羊水(AF)已知含有多種源於胎兒發育之細胞類型，且先前研究已證明多潛能幹細胞可經由羊膜穿刺術而分離。此等AF源性幹細胞(AFSC)可表現一些多能性標誌，且可在誘導條件下分化成間質或神經譜系之細胞[23-25]。雖然AFSC在體內與體外均展現神經潛能，但其仍缺乏一些典型的NSC特性，諸如NSC的適當生長特性、形態及形成神經球之潛力。迄今為止，尚無團體能夠直接自任何物種之正常羊水樣本中分離出NSC之報告。最近，已有一個團體報導可自胎兒患有 NTD之懷孕大鼠之羊水中建立NSC[26]。

人類神經幹細胞為研究神經系統發育與成人神經生成功能特別有價值的工具。NSC在治療神經退化病症中亦具有極大治療潛能。然而，人類NSC之當前來源因技術原因(諸如分離之難度及增殖所需之時間)而受限。因此，仍需要發展一種分離並建立人類神經幹細胞之方法，其中該人類神經幹細胞可長時間擴展且不會損失幹細胞特性。

本發明一方面係關於一種自懷孕人類個體之羊水獲得人類神經幹細胞之方法，該懷孕人類個體之胎兒經診斷為罹患神經管缺陷，其中該經分離之人類神經幹細胞可表現巢蛋白(Nestin)、Sox2、Musashi-1及ATP結合匣G2(ATP-binding cassette G2，ABCG2)標誌但不表現SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及TRA-1-81。

本發明另一方面係關於一種經分離之人類神經幹細胞，其係由根據本發明之方法獲得。

本發明再一方面係關於一種醫藥組合物，其包含自本發明之方法獲得之經分離之人類神經幹細胞及醫藥上可接受之載劑。

本發明又一方面係關於一種於有需要之哺乳動物中治療神經狀態之方法，其包含給予本發明之醫藥組合物至該哺乳動物。

本發明更一方面係關於一種篩選藥物候選物之方法，其中該方法包含下列步驟：使自本發明之方法獲得之經分離之人類神經幹細胞與一藥物候選物接觸；及測定該細胞之一或多個細胞狀態；如經測定之一或多個細胞狀態與未接觸該藥物候選物之細胞之相同狀態相比更好，則表示該藥物候選物具有治療神經狀態之潛力。

本發明另一方面係關於一種測試一藥物候選物之細胞毒性之方法，其中該方法包含下列步驟：使自本發明之方法獲得之經分離之人類神經幹細胞與一藥物候選物接觸；及測定該細胞之一或多個細胞狀 態；如經測定之一或多個細胞狀態與未接觸該藥物候選物之細胞之相同狀態相比更差，則表示該藥物候選物可能具有細胞毒性。

圖1顯示AF-NSC之培養物特性。(A)在NeuroCult^TM NS-A增殖培養基中初始接種羊水細胞後，神經樣細胞開始附著至培養盤(左方組)。隨後，此等細胞增殖且聚攏而形成懸浮初級神經球(右方組)。(B)當神經球分散為單細胞懸浮液後，該等細胞會持續分裂且再形成神經球。成熟AF-NSC衍生神經球在外表面含有典型的微突起結構(右側，黑色箭頭)。比例尺：10μm。(C)AF-NSC之倍增時間受接種密度影響。*：p<0.05；**：p<0.01。(D)長期體外培養物之AF-NSC細胞計數。由繼代5開始，將兩種不同AF-NSC細胞株用於此分析，且計算累積於每一繼代之總細胞數目。兩種AF-NSC細胞株(100及106)分別培養18及23繼代。(黑正方形：AF-NSC細胞株#100；黑圓：AF-NSC細胞株#106)縮寫：DIV：體外天數。

圖2顯示NSC特異性標誌之表現及AF-NSC之端粒酶活性之量測。(A)免疫染色成熟神經球之共軛焦影像(第14天)顯示特異性NSC標誌之表現(巢蛋白、Musashi-1及Sox2)。比例尺：20μm。(B)以流式細胞儀測定較早及較晚繼代數之NSC特異性細胞標誌在AF-NSC中之表現。點線：同位素對照；灰線：較早繼代#(10-12)；黑線：較晚繼代#(20-22)。(C)qPCR用於確定較早及較晚繼代數之NSC特異性基因之mRNA含量。白條：較早繼代#10；灰條：較晚繼代#20。(D)端粒酶活性於不同培養時間下之量測(繼代#6、10及17)。三角形表示藉由熱去活化處理之樣本。縮寫：SSEA：階段特異性胚胎抗原；ABCG2：ATP結合匣子族G2；HLA：人類白細胞抗原；N：陰性對照；P：陽性對照。

圖3顯示AF-NSC之體外分化。AF-NSC係培養於神經分化培養基 中，且藉由免疫細胞化學誘發2(A)天及7(B)天後偵測成熟神經元之標誌。比例尺：20μm。(C)qPCR用於量測此等神經元標誌之表現量。白條：未分化之細胞；灰條：第2天分化之細胞；黑條：第7天分化之細胞。*：p<0.05；**：p<0.01。縮寫：DAPI：4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚。

圖4顯示AF-NSC會定向分化成星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞及多巴胺激導性神經元。(A)AF-NSC係培養於特異性分化培養基中，且使用免疫染色特異性標誌以證實星形膠質細胞(GFAP)、寡樹突神經膠質細胞(O4)及多巴胺激導性神經元(TH及AADC)之存在。比例尺：20μm。(B)qPCR用於分析星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞(左方)及多巴胺激導性神經元(右方)特異性標誌之基因表現。白條：分化之前；黑條：分化後。*：p<0.05；**：p<0.01。縮寫：GFAP：膠質原纖維酸性蛋白；TH：酪胺酸羥化酶；AADC：芳族L-胺基酸去羧酶；及DAPI：4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚。

圖5顯示將AF-NSC移植入MCAO缺血性中風大鼠中具有治療效果。移植AF-NSC後，缺血性中風大鼠經歷旋桿測試(A)及握力測試(B)。黑條：健康對照；白條：假手術對照；灰條：MCAO後之AF-NSC移植。(C)AF-NSC移植4週後，藉由TTC之定量半球形損傷區。(D)頂部：免疫組織化學顯示巢蛋白(綠色)在注射區域中表現。底部：此區域之較高放大率顯示經移植之AF-NSC在受損區中共表現巢蛋白(綠色)及人類細胞核(human Nuclei)(紅色，箭頭)。比例尺：50μm。

圖6顯示此研究中建立之4個AF-NSC細胞株之核型。所有4個AF-NSC細胞株皆具有正常核型，包括一個46XX且三個46XY。

參考以下對本發明之各態樣、實例、及伴隨相關描述及表格的詳細描述，可更容易地瞭解本發明。除非另外特別地指出，本文中所 使用之所有用語(包含技術及科學用語)與本發明所屬技術領域中具通常知識者所通常理解者具有相同意義。應進一步瞭解者，如通常使用字典中所定義之用語應解釋為與其在相關領域的上下文中一致，且不解釋為在理想化或過於正式之意義，除非於本文中明確地如此定義。另應瞭解者，本文所用之術語僅用於描述特定態樣之目的而不意欲用於限制性本發明之範疇。

必須指出，除非上下文另外清楚規定，否則如本說明書及隨附申請專利範圍中所用之單數形式「一」及「該」包括複數個所指標的物。因此，除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。

範圍在本文中通常表述為「約」一個特定值及/或至「約」另一個特定值。當表述此類範圍時，一態樣為包括一個特定值及/或至另一個特定值之範圍。類似地，當值藉由使用字「約」表述為近似值時，應瞭解特定值可形成另一態樣。另外應瞭解，每一範圍之各端點皆有顯著性，一端點與另一端點既有相關性，亦彼此獨立。本文所用之術語「約」之範圍為±20%；較佳為±10%；更佳為±5%。

本發明揭示分離及繁殖人類神經幹細胞(NSC)之方法，該NSC係獲自一病患之羊水，而該病患之胎兒經診斷為罹患神經管缺陷(NTD)。這些羊水源性神經幹細胞(AF-NSC)會形成神經球，並可於體外進行長時間之擴增。此外，他們表現NSC特異性標誌，包含巢蛋白、Sox2、Musashi-1及ATP結合匣G2(ABCG2)，且亦會顯現端粒酶活性。當於體外經誘導分化後，羊水源性神經幹細胞會顯現典型的型態模式並表現與神經元、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞及多巴胺激導性神經元一致的特異性標誌。再者，羊水源性幹細胞可移植至動物中來治療神經狀態。

因此，本發明提供一種獲得經分離之人類神經幹細胞之方法， 其包含：(a)由獲自懷孕人類個體之羊水中收集細胞，該懷孕個體之胎兒經診斷為罹患神經管缺陷(NTD)；(b)以培養基培養該等細胞；及(c)自該培養基分離人類神經幹細胞，其中該經分離之人類神經幹細胞會表現巢蛋白(Nestin)、Sox2、Musashi-1及ATP結合匣G2(ABCG2)標誌且會顯現端粒酶活性，但不會表現SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及TRA-1-81。

神經幹細胞為一種未分化之神經細胞，其可經誘導而增殖。神經幹細胞具有自我維持之能力，其意指每次細胞分裂，其子細胞仍為一幹細胞。因此，本文中所使用之「神經幹細胞」乙詞，在適當情況下，應瞭解為可包含真正之幹細胞及神經祖細胞(neural progenitor cell)。

根據本發明，神經管缺陷包含但不限於為無腦(anencephaly)及脊髓膜膨出(myelomeningocele)。更特定言之，神經管缺陷為無腦。

本發明之步驟(a)，該細胞可經由任何本領域之已知方法而收集。例如，可將羊水離心及/或過濾。

根據本發明，該培養基可為任何可容許神經幹細胞增殖之培養基。該培養基可為，但不限於NeuroCultTM NS-A增殖培養基(StemCell Technologies，溫哥華，BC，加拿大)、Stemline^TM神經幹細胞擴張培養基(Sigma)(附帶加入20ng/ml表皮生長因子(Sigma)及10ng/ml白血病抑制因子(Chemicon))、NS-A培養基(Euroclone)(附帶加入1xN2及10ng/ml EGF(PeproTech)及10ng/ml bFGF)、NS-A基底無血清培養基(Euroclone)(附帶加入20人類重組EGF ng/ml、10ng/ml人類重組FGF2、2mM L-麩醯胺酸、0.6%葡萄糖、9.6μg/ml腐胺(putrescine)、6.3ng/ml孕酮、5.2ng/mls亞硒酸鈉、0.025mg/ml胰島 素及0.1mg/ml轉鐵(鈉鹽，II等級；Sigma；控制培養基))、Dulbecco’s基本必需培養基(DMEM)/F12(1：1)(附帶加入B27補充劑(1：50)、2mM麩醯胺酸、50單位/ml盤尼西林、50μg/ml鏈黴素(Gibco)、20ng/ml人類重組EGF及20ng/ml bFGF(R&D Systems))、Dulbecco’s改質Eagle’s培養基(DMEM)/HAMS-F12(3：1，Gibco)(附帶加入盤尼西林G/鏈黴素/兩性黴素B(1% v/v；Gibco)、B27補充劑(2% v/v；Gibco)、表皮生長因子(EGF，20ng/ml，Sigma)、纖維母細胞生長因子2(FGF-2，20ng/ml，R&D Systems)及肝素(5mg/ml，Sigma))。

本發明亦提供經分離之人類神經幹細胞，其具有與自本發明之方法獲得之神經幹細胞全部相同之特性。該等細胞可用作細胞治療時之細胞來源。例如，該等細胞可移植以回復受損之神經迴路及/或回復大腦功能。

於某些實施態樣中，該等經分離之細胞係存在於醫藥組合物中。據此，該包含此等神經幹細胞之醫藥組合物另包含醫藥上可接受之載劑，例如一或多個緩衝劑(中性緩衝鹽水或磷酸緩衝鹽水)、使製劑呈等滲透之溶質、接受者的低滲透或弱高滲透血液、懸浮劑、增稠劑及/或防腐劑。

在某些實施態樣中，該醫藥組合物係調配成單位劑量可注射型式，例如溶液、懸浮液或乳液。適於注射細胞之醫藥組合物通常為無菌之水溶液和分散劑。可注射製劑之載體可以是溶劑或分散介質，其包含，例如水、鹽水、磷酸緩衝鹽水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液體聚乙二醇等)，及其合適混合物。

本發明所屬技術領域中具通常知識者可容易地確定於本發明之醫藥組合物中細胞及任選的添加劑、賦型劑及/或載劑之含量。通常地，任何添加劑(除所述細胞)在例如磷酸鹽緩衝鹽水之溶液中之存在量為約0.001至約50重量%。活性成分之存在量為微克至毫克，例如 約0.0001至約5重量%；較佳約0.0001至約1重量%；更佳約0.0001至約0.05重量；或約0.001至約20重量%；較佳約0.01至約10重量%；更佳約0.05至約5重量%。

神經幹細胞可用來移植至異源、自體或異種之宿主。該神經幹細胞之後代可施用於任何罹患因任何方式導致之不正常神經或神經退化性症狀之動物，包含導因於機械、化學或電解病變，或為局部缺血或神經區域缺氧，或為老化過程的結果。

因此，本發明又關於一種於有需要之哺乳動物中治療神經狀態之方法，其包含給予本發明之醫藥組合物至該哺乳動物。

如本文所用之術語「治療」表示減緩、中斷、阻止或終止疾病或症狀之進展，但不一定要求完全消除所有疾病的症狀和表徵。「預防」意指包括該神經狀態之預防，其中「預防」應理解為可任何程度地抑制發病時間或疾病或狀態之表徵或症狀嚴重性，其包含但不限於完全防止疾病或狀態。

根據本發明可治療之神經狀態可大致分為三類：具有缺血性或缺氧機制之疾病、神經退化性疾病及與神經細胞死亡相關的神經及精神疾病。根據本發明可治療之其他神經狀態包含增強認知能力和腦腫瘤(如成膠質細胞瘤(glioblastomas)、星形細胞瘤(astrocytomas)、腦膜瘤(meningiomas)和神經鞘瘤(neurinomas))之治療。

具有缺血性或缺氧機制之疾病可進一步分為一般疾病及大腦缺血。涉及缺血性或缺氧機制之該等一般疾病之實例包括心肌梗塞、心機能不全、心臟衰竭、充血性心臟衰竭、心肌炎、心包炎、心包心肌炎、冠心病(冠狀動脈狹窄)、心絞痛、先天性心臟病、休克、肢端缺血、腎動脈狹窄、糖尿病性視網膜病變、與瘧疾相關的血塞、人工心臟瓣膜、貧血、脾性症候群、氣腫、肺纖維化及肺水腫。大腦缺血疾病之實例包括中風(以及出血性中風)、大腦微血管病變(小血管疾 病)、分娩中大腦缺血、心跳驟停或復蘇期間/後大腦缺血、由於手術中問題所致的大腦缺血、頸動脈手術期間之大腦缺血、由於至大腦之供血動脈狹窄所致的慢性大腦缺血、大腦靜脈之竇血塞或血塞、大腦血管畸形及糖尿病性視網膜病變。

神經退化性疾病之實例包括肌肉萎縮性側索硬化(ALS)、帕金森氏病(Parkinson's disease)、亨廷頓氏病(Huntington's disease)、威爾遜氏疾(Wilson's disease)、多系統萎縮、阿茲海默氏症(Alzheimer's disease)、皮克氏病(Pick's disease)、路易體病(Lewy-body disease)、哈勒沃登-施帕茨病(Hallervorden-Spatz disease)、扭轉張力障礙、遺傳感覺運動神經病(HMSN)、格斯特曼氏病(Gerstmann-Sträussler-Schanker disease)、克雅氏病(Creutzfeld-Jakob-disease)、馬查多-約瑟夫病(Machado-Joseph disease)、弗里德賴希共濟失調症(Friedreich ataxia)、非弗里德賴希共濟失調症、妥瑞症候群(Gilles de la Tourette syndrome)、家族性震顫、橄欖體腦橋小腦變性、副腫瘤大腦症候群、遺傳痙攣性截癱、遺傳眼神經病變(Leber)、色素性視網膜炎、施塔加特病(Stargardt disease)及卡-賽症候群(Kearns-Sayre syndrome)。

與神經細胞死亡相關的神經及精神疾病之實例包括敗血性休克、腦內出血、蛛膜下出血、多發性硬化癡呆、發炎疾病(諸如血管炎、多發性硬化症及格林-巴利-症候群(Guillain-Barre-syndrome))、神經外傷(諸如脊髓外傷及大腦外傷)、周邊神經病、多發性神經病、癲癇、精神分裂症、憂鬱症、代謝腦病及中樞神經系統感染(病毒、細菌、真菌)。

因由本發明所分離之人類神經幹細胞可於體外形成神經球、進行長時間之擴展及分化為星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞及多巴胺激導性神經元，該經分離之人類神經幹細胞適於藥物研發及神經毒性測試。

因此，本發明更關於一種體外篩選藥物候選物之方法，其中該方法包含使自本發明之方法獲得之經分離之人類神經幹細胞與一藥物候選物接觸；及測定該細胞之一或多個細胞狀態；如經測定之一或多個細胞狀態與未接觸該藥物候選物之細胞之相同狀態相比更好，則表示該藥物候選物具有治療神經狀態之潛力。

此外，本發明可包含一種細胞毒性測試方法，該方法於體外實施，並包含下列步驟：使自本發明之方法獲得之經分離之人類神經幹細胞與一藥物候選物接觸；及測定該細胞之一或多個細胞狀態；如經測定之一或多個細胞狀態與未接觸該藥物候選物之細胞之相同狀態相比更差，則表示該藥物候選物可能具有細胞毒性。

根據本發明，該經分離之人類神經幹細胞可以神經球培養物或單層培養物之型態提供，且該測試藥物候選物可為有機或有機物、胜肽、聚肽或蛋白質；且該測定之細胞狀態可包含但不限於神經球形成、細胞凋亡、增殖、分化、移行或其任何組合。

該細胞狀態可以本領域已知之任何方法而測定，以觀察其細胞之表型及/或基因型之變化。舉例言之，神經球形成、細胞凋亡、增殖、分化及移行可使用相位差顯微鏡觀察。也可使用比色法或基於免疫螢光之分析法。再者，例如基因表現、電活動測量及代謝組學(metabonomics)等技術亦可作為使用工具。舉例言之，可使用量測一細胞標誌之mRNA量以代表細胞發育及成熟之特定階段。

根據本發明，「更好」乙詞係指經與藥物候選物接觸之人類神經幹細胞的細胞狀態之程度(例如細胞計數、神經球直徑或隨時間測量之代謝活性)「高於」未與藥物候選物接觸之人類神經幹細胞的細胞狀態；「更差」乙詞係指經與藥物候選物接觸之人類神經幹細胞的細胞狀態之程度(例如細胞計數、神經球直徑或隨時間測量之代謝活性)「低於」未與藥物候選物接觸之人類神經幹細胞的細胞狀態。於 本發明之實施態樣中，「更好」乙詞代表至少0.5倍高；較佳至少1倍高；而「更差」表示0.5倍以下；較佳至少1倍以下。

以下之非限制性之實例有助於本發明所屬技術領域中具通常知識者實施本發明。該等實例不應視為過度地限制本發明。本發明所屬技術領域中具有通常知識者可在不背離本發明之精神或範疇的情況下對本文所討論之實施例進行修改及變化，而仍屬於本發明之範圍。

實例 材料及方法 樣本收集

用於此研究之羊水樣本係獲得自臺北之國泰綜合醫院(Cathay General Hospital)及臺灣桃園之長庚紀念醫院(Chang Gung Memorial Hospital)。年齡為25至35歲，16週與20週之間妊娠的懷孕女性經歷基於診斷目的而執行之羊水取樣，並藉由超音波及篩選母體血清來診斷胎兒患有無腦NTD或未患有NTD。所有程序經國泰綜合醫院及長庚紀念醫院之機構審查委員會(Institutional Review Board)批准，且所有參與者提供書面知情同意以參與此研究。

AF-NSC之培養

以1,000rpm離心各羊水樣本5分鐘，且在37℃下於5% CO₂潮濕氛圍中使細胞集結粒再懸浮於T25燒瓶中之NeuroCult^TM NS-A增殖培養基(StemCell Technologies，溫哥華，BC，加拿大)中。3-5天後，可自NTD樣本觀察到一些附著的神經樣細胞，接著藉由更換培養基來移除懸浮細胞及殘渣。添加新製NeuroCult^TM NS-A增殖培養基後，使附著神經樣細胞複製且聚攏以形成初級神經球。為了維持此等細胞，每2-3天添加1/5體積之額外培養基。將細胞培養(plating)3-4週後可觀察到初始成熟神經球。此等細胞即為人類羊水衍生神經幹細胞(AF-NSC)。

當神經球直徑生長至50-100μm時，使此等細胞繼代。首先，以800rpm離心細胞5min，且在37℃下用TrypLE(Life Technologies，蓋瑟斯堡，MD，USA)處理3分鐘。在移除TrypLE溶液之額外離心步驟後，將細胞再懸浮於NeuroCult NS-A增殖培養基中，小心地混合(pipetting)獲得單一細胞懸浮液並避免氣泡形成。以0.5-1×10⁴/cm²之密度接種AF-NSC且維持在如上文所描述之條件。神經球每10-14天繼代，且AF-NSC在體外可擴展大於8個月。亦可冷凍保存神經球以用於後續實驗。

為了確定最佳接種密度，在T25培養盤中以1,000-20,000細胞/平方公分之密度分散AF-NSC，且以如先前所描述之條件培養。10天後，收集神經球且使其以胰蛋白酶處理。用血球計執行細胞計數，且計算每個繼代之倍增時間。所描述之每一實驗進行三重複。

在累積細胞數目測試中，在T25燒瓶中以5,000細胞/平方公分接種AF-NSC，且以如先前所描述之條件培養。細胞每10-14天繼代，且將各繼代執行細胞計數，計算細胞之增加倍數以及總細胞數目。

流式細胞儀

將AF-NSC以胰蛋白酶處理使其呈單一細胞形式後再懸浮於磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)中。於直接分析時，將經或未經透化處理(permeabilization)之細胞以Cytofix^TM(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)固定，且用以下抗人類抗體免疫標記該等細胞：CD73-藻紅素(PE)、CD105-異硫氰酸螢光素(FITC)、CD117-PE、HLA-I-PE、HLA-DR-PE、Nanog-PE、Oct-4-FITC、Sox2-PE、ABCG2-PE(均來自BD Biosciences)、SSEA-1-PE、SSEA-3-FITC、SSEA-4-PE、TRA-1-60-PE、TRA-1-81-PE、巢蛋白-FITC(均來自R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)或CD133-PE(Merck Millipore，Billerica，MA，USA)。於間接分析時，將該等細胞固定、用Perm緩衝液II(BD Biosciences)透化處理、阻斷、用Musashi-1(R&D Systems)免疫標記細胞、及用Alexa Fluor 488染料(Life technologies)染色。使用FACSCantoII流式細胞儀(BD Biosciences)處理所有樣本，且於每個樣本收集至少30,000個細胞資料。使用FACSDiva 6.0(BD Biosciences)及FCS Express V3.00(De Novo Software，Thornhill，Canada)執行資料獲取及分析。

免疫細胞化學

用4%多聚甲醛(Merck Millipore)固定細胞，且用0.1% Triton X-100(Sigma-Aldrich，St Louis，MO)進行細胞穿透。用10%特異性正常血清在PBS中阻斷30min後，用以下適當初級抗體培育該等細胞1小時：Tuj-1(Sigma)、巢蛋白、Sox2、微管相關蛋白2(MAP2)、神經微絲重鏈(NFH)、膠質原纖維酸性蛋白(GFAP)、人類神經元特異性核蛋白(hNeuN)、酪胺酸羥化酶(TH)(均來自Merck Millipore)、Musashi-1、O4或芳族L-胺基酸去羧酶(AADC)(均來自R&D system)。洗滌兩次後，在室溫下隨後用經Alexa Fluor 488或Alexa Fluor 546共軛之二級抗體(Life Technologies)與該等細胞培育1小時。在共軛焦顯微鏡(TCS-SP5-X AOBS，Leica，Solms，Germany)或螢光顯微鏡(Axio Observer.Z1，Carl Zeiss，Oberkochen，Germany)下觀測所得免疫反應性細胞。

端粒酶活性分析

使用市售可得之TRAPeze RT套組(Millipore)，藉由端粒重複擴增步驟(TRAP)量測端粒酶活性。在12.5%聚丙烯醯胺凝膠上分離擴增TRAP反應產物且觀察TRAP梯級分佈。

定量聚合酶鏈反應(qPCR)

用TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)萃取總RNA，且根據製造商提供之方法，使用M-MuLV逆轉錄酶(Thermo Scientific， San Jose，CA，USA)及寡聚-dT引子，合成第一股cDNA。藉由SYBR Green PCR主混合物(Thermo Scientific)，使用ABI Prism 7700序列偵測系統(Applied Biosystems，Foster City，CA)執行qPCR。β-肌動蛋白之相對表現量用作內部對照以使各樣本中之基因表現標準化。根據△△Ct方法測量標記基因之相對定量。用於此研究之引子對列舉於表2。

AF-NSC分化

使AF-NSC衍生神經球(繼代#10-12)經胰蛋白酶處理，且培養於塗佈100μg/ml聚-L-離胺酸(Sigma-Aldrich)及10μg/ml層黏連蛋白(Sigma-Aldrich)之培養皿上，以5×10⁴細胞/平方公分之密度將其接種於NeuroCult^TM NS-A增殖培養基中。細胞附著至培養皿底部後，根據製造商提供之方法，藉由添加NeuroCult^TM NS-A分化培養基(StemCell Technologies)來誘發神經分化。誘發後，用4%多聚甲醛固定分化細胞以用於免疫細胞化學，或收集以用於mRNA萃取及後續之qPCR。為了誘導特異性細胞類型之分化，在NS-A增殖培養基存在下，將AF-NSC以5×10⁴細胞/平方公分之密度接種於塗佈有100μg/ml聚-L-離胺酸之平盤上。附著後，根據先前公開之方法[27]，將培養基改成特異性誘發培養基來將產生星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞及多巴胺激導性神經元。

局部缺血及AF-NSC移植

所有史泊格多利大白鼠(Sprague-Dawley rat)(8週齡，250-300g)係獲自Lasco(宜蘭，台灣)，且將其圈養於國立中興大學(National Chung Hsing University)之動物機構中。所有實驗程序均以動物福利設計且經國立中興大學之實驗動物照護及使用委員會(Institutional Animal Care and Use Committee)批准。使大鼠(n=12)之大腦右半球接受1.5小時長時間的中大腦動脈閉塞(MCAO)後縫合[28]。手術後第一 天，在AP：-0.4 R：3.4 DV：5之位置將1×10⁶ AF-NSC(繼代#10-12，10μL，1L/min)移植入受損波紋體(n=6)。手術後4週處死動物，且藉由灌注4%多聚甲醛來固定其大腦。

行為分析

將MCAO大鼠進行旋桿及握力分析。在訓練一週後，所有大鼠在二設備(pieces)上具類似能力。於旋桿測試中，當在300s內自4rpm加速至40rpm時，假手術大鼠仍可保持於圓柱上。於測試其握力時，大鼠以其前腳抓握拉桿，其握力藉由連接至該拉桿之電子感測器來定量。記錄各大鼠之三重複之結果。

TTC染色及免疫組織化學染色

將MCAO大鼠大腦以冠向切割(sectioned coronally)成6個切片，隨後在37℃下將其浸泡於2% 2,3,5-氯化三苯四銼(TTC)中30分鐘，接著再用福馬林固定(formalin fixation)。梗塞區為淺色，而正常大腦組織則被染成紅色。為與健康腦半球區比較，將中風腦半球之剩餘部分中淺梗塞、空心液化及已變小之正常組織區域指定為萎縮區。用電腦影像分析系統(Image-Pro Plus，Media Cybernetics，Carlsbad，CA，USA)估算梗塞及萎縮區，且組織損傷之程度的計算為對側健康半球之總面積之百分比。

於免疫組織化學分析中，使用蔗糖梯度使大腦脫水，並浸潤於OCT(Sakura Fine Technical，Tokyo，Japan)，將大腦在-70℃下冷凍且以40μm厚度冰凍切片。於免疫染色中，將切片在含有0.1% Tween-20(PBST)之PBS中沖洗，用0.1% Triton X-100透化且用於PBS中之10%特異性正常血清阻斷30min，隨後將其與初級抗體(包括人類細胞核(Merck Millipore)及巢蛋白(Merck Millipore))培育隔夜。然後，將切片用PBST洗滌兩次，且將其與經若丹明(rhodamine)或FITC共軛之適當二級抗體(Thermo Scientific)在室溫下培育1小時。最後，使用螢 光顯微鏡觀察標記細胞之分佈。

統計分析

實例中之所有結果均呈現為平均值±標準差(SD)。使用史都登氏t-測試(Student's t-test)比較兩個平均值之間的顯著差異。若比較兩個以上組，則使用單因子變異數分析之Scheffe's post hoc測試評定顯著差異。當p<0.05時，認為結果為統計顯著的。

實例1：自羊水分離NSC

為了自羊水分離NSC，藉由羊膜穿刺術收集正常(n=7)及NTD(無腦症n=6，非無腦症n=6)衍生的羊水樣本。當在NeuroCult^TM NS-A增殖培養基中培養自此等樣本中分離之細胞時，在前3-5天期間僅於無腦症樣本產生一些略微附著之神經樣細胞群落(圖1A)。謹慎移除未附著之細胞及細胞殘渣後，使此等神經樣細胞可增殖且聚集並在3週後形成生長於懸浮液中之初級神經球(圖1A)。繼代後，將神經球經胰蛋白酶處理成單一細胞，且在各繼代中，細胞可在懸浮液中增殖並再形成神經球(圖1B)。神經球之直徑範圍為約50μm至100μm，且其在其外表面上具有典型的微突(圖1B)。此等AF-NSC可藉由連續繼代擴增。重要的是，應注意AF-NSC僅可自診斷有無腦之NTD病患之羊水樣本中建立並獲得(表1)。AF-NSC細胞株可自6個無腦症樣本中之4個建立(成功率67%)，且所有4個細胞株皆具有正常核型(圖6)。

神經球生長速率受接種AF-NSC之密度影響。最佳接種密度經測 定為5,000-10,000細胞/平方公分(圖1C)，當密度低於2,500細胞/平方公分時幾乎零生長。當將細胞以10,000細胞/平方公分密度分布時，AF-NSC以109.4±14.8小時之速率倍增。

為了測試AF-NSC之長期增殖潛能，吾人將2個不同細胞株(以繼代5起始)於體外生長幾個月。兩個細胞株皆能維持恆定生長達至少5個月(圖1D)，且其中一個細胞株可繁殖超過8個月。此兩個細胞株可增殖超過10⁵-10¹⁰倍。

實例2：AF-NSC之表徵

為了鑑定AF-NSC之表徵，使用免疫細胞化學及流式細胞儀來偵測NSC特異性標誌之表現。共軛焦顯微鏡顯示AF-NSC衍生神經球之細胞質內會大量地表現巢蛋白與Musashi-1。Sox2(一種細胞核蛋白)亦可在神經球中觀察到(圖2A)。

流式細胞儀顯示AF-NSC會表現巢蛋白、Sox2、Musashi-1及ABCG2 NSC特異性標誌(圖2B)。CD133首先以低量表現，但信號強度隨著後續繼代增加。吾人亦分析胚胎幹(ES)細胞特異性標誌之表現，且確定吾人之AF-NSC與ES細胞皆會表現類似的轉錄因子組，包括Nanog、Oct-4及Sox2及低量之SSEA-1；然而，其皆不表現SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及TRA-81。此外，AF-NSC中之人類白細胞抗原(HLA)的表現模式與大多數基質細胞類似，其表現HLA I級但不表現HLA II級。當與來自羊水之間質幹細胞(其表現CD73、CD105及部分表現CD117)相比時，吾人之AF-NSC不表現CD105及CD117，而僅會偶爾表現CD73。特別引起關注的是，吾人所偵測AF-NSC之所有標誌，在其體外時間內(經由繼代#20-22)皆維持其之表現模式。

吾人亦使用qPCR量測多個繼代中此等標誌之表現量，且發現巢蛋白、Sox2、Oct-4、Nanog及hTERT均一致地在20個繼代過程中表現(圖2C)，此結果亦證實了吾人先前藉由流式細胞儀之觀察結果。最 後，評定吾人之AF-NSC之端粒酶活性，發現即使在增加繼代數之長期培養物中，AF-NSC仍能維持端粒酶之活性程度(圖2D)。

實例3：AF-NSC之體外神經分化

為了確定AF-NSC是否可分化成神經元，將細胞解離成單個細胞懸浮液，在NeuroCult^TM分化培養基中培養且隨後藉由免疫細胞化學分析。2天誘發後，AF-NSC開始進行形態變化，且巢蛋白及Tuj-1在此階段會在細胞內表現(圖3A)。7天誘發後，可偵測到額外的神經元特異性標誌，其包括巢蛋白、Tuj-1、MAP2、hNeuN及NFH(圖3B)。吾人亦使用qPCR來測定此等神經元特異性基因之轉錄程度，並發現7天分化後Tuj-1及MAP2分別上調5.2倍及6.2倍。相反地，巢蛋白(NSC特異性基因)之表現在此相同期間則顯著地降低(圖3C)。

然後，吾人藉由將AF-NSC暴露於經定義分化培養基來使其誘發為星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞及多巴胺激導性神經元。大多數(>80%)AF-NSC可經誘發而變為GFAP陽性星形膠質細胞(圖4A)，此可由誘發2週後GFAP之表現顯著增加4,700倍來確定(圖4B)。O4抗原之免疫染色可用來偵測寡樹突神經膠質細胞(圖4A)。與未分化AF-NSC相比，經定義培養基中之誘發引起寡樹突神經膠質細胞特異性基因CNP、MBP及O2之表現分別升高至2.15倍、4.97倍及1.9倍。另外，1個月後TH陽性細胞及AADC陽性細胞之存在表示AF-NSC可產生多巴胺激導性神經元(圖4A)。此觀察結果可藉由qPCR分析驗證，確定對多巴胺激導性神經元所具有之特異性標誌(包括AADC、Pax2、Lmx-1b及Nurr-1)在分化後顯著上調(圖4B)。

實例4：將AF-NSC移植入缺血性大鼠中且誘導功能恢復

為了確定AF-NSC是否能在體內誘導中風之功能恢復，將1×10⁶個細胞移植入已經歷MCAO之大鼠腦之缺血性邊界區中。藉由旋轉桿及握力測試評估，與健康對照組相較下，未處理之MCAO大鼠一致地顯 示較弱的運動效能。

在旋桿測試中，當與假注射之MCAO對照大鼠相比時，移植了AF-NSC之MCAO組顯示復原了43±18%之時間，此表示AF-NSC之存在改善了缺血性大鼠中所觀察到的運動缺陷。值得注意的是，AF-NSC在注射後之第一週期間即可使運動功能迅速恢復(85±26%)，且此改善可維持到移植後4週(98±18%；圖5A)。

利用握力測試觀察到類似的功能改善(圖5B)。MCAO顯著地降低大鼠的最大握力。在其接受AF-NSC移植一週後，此等缺血性大鼠之最大握力與假手術對照組之最大握力相當。然而，接受AF-NSC之大鼠可在移植3至4週後則可恢復其正常握力，而假手術對照組仍較弱。

為了確定MCAO後之損傷程度，在AF-NSC移植4週後用TTC將經移植之大腦染色。移植後梗塞區之尺寸顯著減小(假手術：22.17±1.12%；AF-NSC移植：0.62±0.15%)，而萎縮區域仍相同(假手術：7.21±0.48%；AF-NSC移植：5.26±0.57%；圖5C)。隨後，吾人使用免疫組織化學分析，藉由用針對巢蛋白之抗體及人類細胞核抗體對冷凍切片進行雙重標記來確定移植後AF-NSC是否在大鼠腦中存活。結果顯示，巢蛋白/人類核雙重陽性細胞緊密靠近注射區(圖5D)，此顯示移植之AF-NSC可存活且整合入宿主大腦中。

討論

在過去的二十年，已可自胎兒與成人CNS中分離出初級神經幹細胞。最新研究建議，具有成為神經元之潛能的細胞亦可於羊水中發現[23，25，29]；然而，尚未自此位置分離且培養出人類神經幹細胞。Turner等人報導，NSC可自經歷產前暴露於網膜酸而導致NTD之史泊格多利大白鼠之羊水中分離且培養；然而，此等細胞並不存在於健康對照大鼠中[26]。此等AF衍生細胞展現典型的神經祖細胞形態且穩健地表現NSC特異性標誌巢蛋白及Sox-2。先前研究亦已報導，當與僅 患有露腦畸形或患有脊柱裂(spina bifida)與露腦畸形之彼等動物相比時，衍生自患有脊柱裂之大鼠羊水的神經幹細胞之數目具有統計上顯著增加[30]。在此研究中，吾人能夠自已診斷罹患無腦症之人類胎兒羊水中分離出AF-NSC(67%)，但未能自正常病患或自罹患非無腦症NTD之彼等病患分離出AF-NSC。此等結果顯示罹患NTD(具體言之為無腦症)之彼等胎兒羊水中，神經幹細胞之比例較高。前神經管未能閉合時出現無腦，且導致顱頂及大腦半球完全或部分不存在使腦脊髓液朝外流入羊水中，此發現亦用於診斷NTD[30-32]。吾人主張，神經幹細胞存在於羊水中可能由暴露神經組織及/或腦脊髓液滲漏入羊膜腔中所引起。

神經幹細胞可自我更新分化成所有CNS細胞類型，且在體外無血清條件下通常會生長成神經球[33]。在吾人之研究中，吾人建立之所有4個AF-NSC細胞株皆可呈神經球形式並維持大於5個月，且在其表面上發育出典型的微突起結構。先前研究已表明，自人類胚胎分離之神經前驅物細胞具有降低的端粒酶活性，其在族群倍增20次後會降低至不可偵測的程度[34]。反之，吾人之AF-NSC可擴展幾個月，且甚至在後續繼代數下維持其端粒酶活性。雖然AF-NSC可維持其端粒酶活性，但其在體內不會形成畸胎瘤。自6-14.5週齡人類胎兒之各種CNS結構中分離出之典型人類NSC細胞，其在體外的倍增時間長(8-10天)[35]。相對而言，吾人之AF-NSC每4-5天即可分裂。由於NSC之生長會受額外細胞-細胞相互作用而影響細胞密度，因此神經球數目在較高細胞密度下比在較低細胞密度下為大[36，37]。吾人發現，當以較低密度(<2,500細胞/平方公分)接種時，AF-NSC仍處於靜止狀態(<1倍增/繼代)，而其將在較高細胞密度培養物(5,000-10,000細胞/平方公分)條件下繼續增殖。然而，當密度過高(20,000細胞/平方公分)時，細胞反而無法生長。

巢蛋白、Sox2、ABCG2、SSEA-1及Musashi-1先前已經建立為NSC特異性標誌[38，39]。吾人之AF-NSC在長期體外培養期間下可維持其此等標誌之表現。CD133為可用於分離造血幹細胞及神經幹細胞之細胞表面標誌[40]。在此研究中，在其培養時間，CD133在AF-NSC中之表現增加。羊水已被認定為分離胎兒多潛能幹細胞(AFSC)之理想來源[24，41]。AFSC與間質幹細胞共用一些標誌，諸如CD73、CD105及CD117，且與多能性幹細胞共用一些標誌，諸如Oct-4、Nanog及Sox2等。然而，AF-NSC不表現CD105及CD117，其僅在表面上表現CD73。雖然AF-NSC確實會表現Nanog及Oct-4，但任何胚胎幹細胞標誌，包括SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及TRA-1-81都不會在其上被染色。綜合而言，此等結果顯示AF-NSC不同於先前已鑑別出之AFSC。

NSC之另一特點為其能夠分化成多種CNS細胞類型。吾人已證明，AF-NSC具有體外變為神經元、星形膠質細胞、寡樹突神經膠質細胞及多巴胺激導性神經元之潛能。在寡樹突神經膠質細胞發育期間，O4在寡樹突神經膠質細胞前驅物與成熟寡樹突神經膠質細胞中表現，而CNP及MBP僅在成熟髓鞘化寡樹突神經膠質細胞中表現[42]。AF-NSC可成功地在體外誘發成O4免疫反應性細胞；然而，此等細胞不以蛋白層次表現CNP或MBP(資料中未顯示)，但可藉由多AF-NSC細胞株中之qPCR偵測出其mRNA顯著增加。此不一致性可反映AF-NSC需要進一步體外刺激以產生成熟寡樹突神經膠質細胞。先前研究已證明，大腦衍生NSC可分化成神經元且提供缺血性大鼠行為改善之功能[43-44]。如同胎兒NSC，在大鼠中風模型中，未分化AF-NSC可有效地移植接近至損害區域。此外，AF-NSC可誘發因缺血導致握力及旋桿效能減少之恢復。另一個假設為，NSC移植可能係由於此等細胞可減弱發炎反應、增加抗凋亡活性或減小梗塞尺寸而誘發組 織修復[43，45]。此處，吾人觀察到注射AF-NSC後，缺血性大鼠大腦中所標記之梗塞尺寸減小。綜上所述，上述結果顯示AF-NSC不僅具有體外分化之潛能，且亦具有對缺血性大鼠之神經保護作用。

將人類NSC用於細胞療法中之主要障礙通常為可獲得來源之限制、複雜之分離方法及耗時之擴展。在此研究中，吾人已證明，衍生自患有NTD之病患之AF-NSC可於體外分離及增殖，且展現與其他NSC來源類似的生理特徵。使用高解析度超音波檢查及羊水穿刺術偵測懷孕期間之NTD將允許人類AF-NSC之有效收集。因此，人類AF-NSC庫可為臨床及臨床前測試之目的而建立。

已知人類中之NTD受複雜基因及環境因素影響[18-20]。在Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)中，僅五十一個實體與無腦相關。骨形態生成蛋白(BMP)(為轉變生長因子-β總科之一部分)在胚胎發育期間之神經管形成及閉合中顯示至關重要[20]。最新研究顯示，衍生於NTD羊水之間質細胞在經TGF-β1處理後不表現足量之I型膠原蛋白[46]。因此，此研究之侷限性之一為，吾人未窮盡性地鑑定出此等NTD衍生AF-NSC細胞株中之潛在致病基因之突變，但此研究中之AF供給母體不患有糖尿病，或使其攝入葉酸拮抗劑或丙戊酸。顯而易見，在NTD衍生AF-NSC細胞株用於臨床應用之前，仍需要充分地進行特徵鑑定。

結論

總結而言，自罹患NTD胎兒之AF-NSC與其他來源之人類NSC具有共同之特徵，包含形成神經球之能力、表現幹細胞特異標誌、經歷長時間增殖之能力、於體外分化之潛力及在中風大鼠模式中具有醫療效果。因此此新穎人類NSC來源於未來移植及治療研究中具有顯著之影響。

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<130> 185871

<160> 32

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<223> 引子

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<212> DNA

<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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<213> 人工序列

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Claims (7)

1. 一種獲得經分離之人類神經幹細胞之方法，其包含：(a)由獲自懷孕人類個體之羊水中收集細胞，該懷孕個體之胎兒經診斷為罹患神經管缺陷，其中該神經管缺陷為無腦；(b)以培養基於無聚-L-鳥胺酸/層黏蛋白塗覆(non-poly-L-ornithine/lamine-coated)之培養容器中培養該等細胞；及(c)自該培養基分離人類神經幹細胞，其中該經分離之人類神經幹細胞會表現巢蛋白(Nestin)、Sox2、Musashi-1、ATP結合匣G2(ABCG2)、Nanog及Oct-4標誌並會顯現端粒酶活性，但不表現SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60及TRA-1-81。
2. 一種經分離之人類神經幹細胞，其係由根據請求項1之方法所獲得。
3. 一種醫藥組合物，其包含根據請求項2之經分離之人類神經幹細胞及醫藥上可接受之載劑。
4. 一種根據請求項2之經分離之人類神經幹細胞或根據請求項3之醫藥組合物之用途，其係用以製備於有需要之哺乳動物中用於治療神經狀態之藥物。
5. 根據請求項4之用途，其中該神經狀態為與缺血性病生理機制相關之神經疾病、與缺氧性病生理機制相關之神經疾病、神經退化性疾病或伴隨神經細胞死亡的神經系統疾病。
6. 一種篩選一藥物候選物之方法，其中該方法包含將根據請求項2之經分離之人類神經幹細胞與一藥物候選物接觸；及測定該細胞之一或多個細胞狀態；其中如經測定之一或多個細胞狀態與未接 觸該藥物候選物之細胞之相同狀態相比更好，則表示該藥物候選物具有治療神經狀態之潛力。
7. 一種測試一藥物候選物之細胞毒性之方法，其中該方法包含將根據請求項2之經分離之人類神經幹細胞與一藥物候選物接觸；及測定該細胞之一或多個細胞狀態；如經測定之一或多個細胞狀態與未接觸該藥物候選物之細胞之相同狀態相比更差，則表示該藥物候選物可能具有細胞毒性。