CN115023233A - 包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明解决了源自自体血浆的富含血小板血浆及其冷冻干燥制剂中生长因子等在成分和量上批次差异大、效果不恒定的问题。具体地，本发明提供了包含从干细胞分化诱导的巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂、包含该冷冻干燥制剂的药物组合物等。

Description

包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂
技术领域
本发明涉及包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂。具体地，本发明涉及包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂、以及该制剂促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病的用途。
背景技术
在外伤引起的骨折以及腰椎滑脱症和腰部脊柱管狭窄症等的腰椎变性疾病中，与不稳定性相伴随的疼痛和麻痹等症状成为问题，因此实施以病变部位的稳定化为目的的、固定骨的连续性断开部分或固定相邻的多个可动性要素的手术。在这些手术中，通过骨癒合引起的稳定化是非常重要的要素，这是整形外科手术的主要目的之一。但是，现状是，即使在手术后，也只能期待自然时间经过引起的骨癒合，并且完全骨癒合最早需要数周，根据情况，有时需要接近一年，且随着时间经过，还观察到没有获得完全的骨癒合而是发生作为慢性不稳定状态的假关节，引起慢性不稳定化和疼痛。
与骨癒合相关的这样的治疗经过有时牵涉到患者的ADL(Activities of DailyLiving，日常生活活动)和QOL(Quality of Life，生活质量)严重受损，因此追求术后有效促进骨癒合在整形外科领域是当务之急。
对于这个课题，通过自体血浆的离心和浓缩而安全地获得富含血小板血浆(Platelet Rich Plasma：PRP)正受到关注。已知PRP具有强大的组织修复能力，在形成外科和齿科领域、以及整形外科领域进行了许多期待修复肌腱和韧带的效果的研究；此外，在运动领域，作为对大联盟的自体PRP治疗也受到关注，在世界范围内正在进行进一步的研究。然而，迄今为止，关于PRP以骨癒合为目的的研究研究进行的很少。本发明人们已经在先前的研究中证实，在大鼠脊椎固定术中施用PRP显著地促进骨癒合，且没有感染或排斥反应的危险性(非专利文献1)。此外，在使用大鼠的动物实验中，还报道了通过将作为人造骨使用的羟基磷灰石与PRP组合使用，可以获得良好的骨癒合(非专利文献2)。然后，基于在动物实验中获得的结果，作为转化研究，进行了使用PRP的两个临床试验的结果是：在脊椎固定术中，自体骨或异体骨与新鲜PRP联合使用时，均获得了骨癒合期间缩短平均约1-2个月的结果(非专利文献3)。由此，PRP安全性高，且具有优良的骨癒合促进效果，因此在整形外科领域的治疗中非常有用，强烈提示其可以提供有希望的治疗法。
此外，PRP可以用于PRP疗法。PRP疗法是利用自体血液中含有的血小板具有生长因子等保有生理活性的蛋白质的组织修复能力，提高人本来具有的“治愈力”的再生医学。例如，为了促进难治性皮肤溃疡或褥疮(压疮)、烧伤、糖尿病患者下肢的坏死或坏疽、齿科的牙槽骨和牙龈的再生，可以对这些患部施用PRP。此外，为了改善脸和脖子等皮肤的皱纹或促进毛发生长，可以向患者施用PRP。特别地，当皮肤内施用时，由于PRP释放生长因子等具有生理活性的多种蛋白质，使得皮肤内毛细淋巴管増加，以及皮肤成纤维细胞迁移，因此期待可以再生毛细淋巴管、毛细血管和皮肤新生肉芽组织。
然而，作为PRP的问题点，由于其寿命短，只有几小时～几天左右，所以为了有效使用，需要在使用前不久从患者本人采集一定量的血液，并作为自体PRP准备好备用。具体地，在手术中使用时，需要在术前不久采血约200cc左右，这不仅给患者的身体带来沉重的负担，而且由于要在短时间准备好，难以保持品质恒定，并且这需要多的人工和花费。因此，特别是在外伤等需要紧急的情况下，使用时极为困难的。为了克服新鲜PRP具有的这些问题，本发明人们着眼于冷冻干燥PRP(Freeze-dried PRP：FD-PRP)并进行了反复研究。结果证实，FD-PRP即使在室温下储存8周后，大部分生长因子仍不消失且维持，并且具有与新鲜PRP同等的骨癒合促进效果，显示了FD-PRP的有效性(非专利文献4、非专利文献5)。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Kamoda H等人，J Bone Joint Surg Am.2013年6月19日；95(12)：1109-16
非专利文献2：Kamoda等人，Spine(Phila Pa 1976).2012年9月15日；37(20)：1727-33
非专利文献3：Kubota等人，Asian Spine J.2017年4月；11(2)：272-277
非专利文献4：Shiga等人，Sci Rep.2016年11月11日；6：36715
非专利文献5：Shiga Y等人，Asian Spine J.，2017年6月；11(3)：329-336
发明概述
发明要解决的课题
另一方面，对PRP和冷冻干燥PRP中的任一者从进一步减小对患者的侵袭和有效供给的观点来看，认为更希望有一种不是通过自我采血为每个场合准备的源自自身血的，而是既成的已制品化的安全制剂。另外，对治疗对象范围广的情形和重症例，PRP和冷冻干燥PRP需要多的使用量。但是，作为PRP原料的血小板有效期限极短，是4天，难以稳定供应。目前，这取决于个人或献血供者，预计在不久的将来供应将无法满足包括日本在内的许多国家的需求。另外，源自自身血浆的富含血小板血浆及其冷冻干燥制剂中生长因子等的成分和量的批次差异大，并且效果不恒定也是的问题。
作为一种替代自体采血和献血的新生产系统，使用人工多能性干细胞(inducedpluripotent stem cells：iPSC)的血小板制备技术受到人们的期待。江藤等人在2010年发表了可以从人iPS细胞生产血小板(Takayama，Eto等人，J Exp Med.Vol.207，2010年12月20日)，该小组也在2014年建立了自人iPS细胞制备能自我复制的巨核细胞的方法，所述能自我复制的巨核细胞作为可以在体外冷冻保存的永生化巨核细胞株(Nakamura，Eto等人，Cell Stem Cell 14，535-548，2014年4月3日)。从2019年6月起，京都大学于世界上率先开始了使用该血小板的临床试验。
因此，使用自包含iPS细胞的多能性干细胞分化诱导的血小板制备的冷冻干燥制剂是否与源自自体血浆的PRP和冷冻干燥PRP同样地没有副作用或不良事件、是否有期望的效果例如骨癒合促进效果是个问题。
用于解决课题的方法
本发明人们经过反复锐意研究的结果，确认了使用从干细胞体外分化诱导的血小板制备冷冻干燥制剂，所制备的冷冻干燥制剂与源自自体血浆的PRP和冷冻干燥PRP同样地包含丰富的生长因子。在该冷冻干燥制剂中，除了血小板外还包含巨核细胞，BMP2和BMP4的含有量也比源自自体血浆的PRP和冷冻干燥PRP高。使用该冷冻干燥制剂，在使用大鼠的腰椎后侧方固定术模型中研究骨癒合促进效果时，发现骨癒合和骨形成能力强，从而完成了本发明。
因此，本发明包括以下方面。
<冷冻干燥制剂>
[1]包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂。
[2][1]所述的冷冻干燥制剂，其中，巨核细胞和血小板是从干细胞体外分化诱导的。
[3][1]或[2]所述的冷冻干燥制剂，其中，干细胞是多能性干细胞或造血干细胞。
[4][2]或[3]所述的冷冻干燥制剂，其中，多能性干细胞是iPS细胞。
[5][1]至[4]中任一项所述的冷冻干燥制剂，其进一步含有从巨核细胞和/或血小板释放的生长因子。
[6][5]所述的冷冻干燥制剂，其中，所述生长因子是选自由骨形成蛋白、血小板衍生生长因子、血小板衍生血管生成因子、转化生长因子、血管内皮细胞生长因子、上皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、和血小板因子IV组成的组中的至少一种因子。
<药物组合物>
[7]用于促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病的药物组合物，其包含[1]至[6]中任一项所述的冷冻干燥制剂。
[8][7]所述的药物组合物，其包含促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病有效量的[1]至[6]中任一项所述的冷冻干燥制剂。
<医药用途>
[9]用于促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病的方法，所述方法包括将权利要求1至6中任一项所述的冷冻干燥制剂施用给需要这样处理的对象。
[10][9]所述的方法，所述方法包括将促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病有效量的权利要求1至6中任一项所述的冷冻干燥制剂施用给需要这样处理的对象。
[11][1]至[6]中任一项所述的冷冻干燥制剂，其用于促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病。
[12][1]至[6]中任一项所述的冷冻干燥制剂用于制备促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病的药物的用途。
<冷冻干燥制剂的制备方法>
[13]制备包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂的方法，所述方法的特征在于，
(A)制备血小板和巨核细胞的细胞混合液；和
(B)冷冻干燥血小板和巨核细胞的细胞混合液。
[14][13]所述的方法，其中在步骤(A)中，巨核细胞是从干细胞分化诱导的永生化巨核细胞。
[15][13]或[14]所述的方法，其中活化步骤(A)中制备的细胞混合液。
发明的效果
根据本发明，通过冷冻干燥自包含iPS细胞的干细胞分化诱导的血小板衍生PRP，使得在需要时将其作为药物制剂提供成为可能。如果开发出无抗原性的源自iPS细胞的FD-PRP，且可以对其他患者安全使用的话，则无需进行手术中的制备，其作为有效的新制剂而通用的可能性显著提高。另外，如果对患者无侵袭和对医生无负担，用已有的制品化材料能够有效地促进骨折或脊椎手术中早期的骨癒合，则认为谋求了显著改善患者的ADL和QOL，对减少和减轻手术并发症、缩短住院时间所致的改善医疗经济有大的贡献。
附图简述
[图1]图1是大鼠脊椎的X射线图像，显示包含源自iPS细胞的永生化巨核细胞和血小板的本发明冷冻干燥制剂在腰椎固定术大鼠模型中具有优异的骨癒合促进效果和骨形成能力。
[图2]图2是显示在本发明的冷冻干燥制剂的制备过程中，测定巨核细胞/血小板活化后即刻(冷冻干燥前)的制剂(FD前)、自人外周血制备的包含相同数量血小板的PRP进行同样地活化后的PRP(人PRP1、人PRP2)和对照(分化培养基)中BMP2和BMP4浓度的结果图。可以看出，本发明的制剂(FD前)具有比包含相同血小板数量的活化PRP更高的BMP2和BMP4浓度。
[图3]图3是显示源自iPS细胞来源的永生化巨核细胞株(imMKCL)的成熟巨核细胞和血小板(MMK-PLT)中细胞因子基因表达随成熟而变化的图。
[图4]图4是显示源自iPS细胞来源的永生化巨核细胞株(imMKCL)的成熟巨核细胞和血小板(MMK-PLT)通过活化释放的细胞因子蛋白量(pg/ml)随成熟而变化的图。
[图5]图5(左)是显示源自iPS细胞来源的永生化巨核细胞株(imMKCL)的成熟巨核细胞和血小板(MMK/PLT)活化获得的上清对人原代培养的成纤维细胞的增殖的影响的图。图5(右)是培养第5天的人原代培养的成纤维细胞的照片。
[图6]图6(左)是显示源自iPS细胞来源的永生化巨核细胞株(imMKCL)的成熟巨核细胞和血小板(MMK/PLT)对创伤面积缩小率的影响的图。图6(右)是第7天的创伤面积缩小率的图和创伤部位的照片。
[图7]图7是显示在大鼠腰椎固定术模型中，包含源自iPS细胞来源的永生化巨核细胞株的巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂对新骨形成的效果的图。
[图8]图8是用流式细胞仪监测源自iPS细胞来源的永生化巨核细胞株经时地向血小板分化的结果。右上部分对应于血小板。纵轴表示侧向散射，横轴表示前向散射。
[图9]图9是用流式细胞仪监测源自iPS细胞来源的永生化巨核细胞株经时地向成熟巨核细胞分化的结果。右上部分对应于成熟巨核细胞。纵轴表示侧向散射，横轴表示前向散射。
[图10]图10是显示分化培养后的血小板(CD41+42+Plt)和成熟巨核细胞(CD41+MK)的数量经时地变化的图。
具体实施方式
<冷冻干燥制剂>
作为本发明的一个方面，其涉及包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂。
本发明的冷冻干燥制剂具有组织修复能力。已知类似地具有组织修复能力且在形成外科、齿科领域和整形外科领域广泛确认了效果的源自血液的富含血小板血浆(PRP）和/或将其冷冻干燥后的冷冻干燥PRP制剂(Kamoda H等人，J Bone Joint Surg Am.2013年6月19日；95(12)：1109-16，Shiga等人，Sci Rep.2016年11月11日；6：36715，Shiga Y，AsianSpine J.2017年6月；11(3)：329-336)。这些PRP制剂中，由于基本上不含“巨核细胞”，因此在这点上与本发明的冷冻干燥制剂的组成不同。具体地，与现有的PRP制剂相比较，本发明的冷冻干燥制剂的不同点有：比较多地包含巨核细胞。另外，与现有的PRP制剂相比较，本发明的冷冻干燥制剂在特定的液性因子例如BMP2和/或BMP4的含有量高这一点上不同。巨核细胞在生物体内来源于造血干细胞，在骨髓中经巨核细胞系祖细胞(CFU-Meg)、成巨核细胞、前巨核细胞成熟为巨核细胞，由于没有细胞分裂，只有核从2N分裂到64N，因此成熟为具有大的多形核的大型细胞的结果。巨核细胞在骨髓内一般存在于窦状血管附近、但不能离开骨髓，在外周血中不能观察到。其发生不伴随细胞分裂的胞体内核分裂，由此具有多形核。由一个巨核细胞可以产生数千个血小板。血小板是血栓形成和止血中必不可少的细胞，因此在白血病、骨髓移植、血小板减少症、抗癌治疗等中对血小板的需求非常大。
在本发明中，巨核细胞是指永生化巨核细胞、未成熟巨核细胞、成熟巨核细胞等所有能够提供血小板的巨核细胞。在此，本发明中的“未成熟巨核细胞”是指没有进入多核化的巨核细胞(约2N至8N)。例如，在表达CD41的巨核细胞中，“未成熟巨核细胞”是与巨核细胞成熟相关的基因群(GATA1、NF-E2、c-MPL、β1-微管蛋白和MYH9)表达量低的、MYH10表达量高的巨核细胞。因此，未成熟巨核细胞可以与“巨核细胞祖细胞”互换使用。作为这样的未成熟巨核细胞，可以例示自造血祖细胞人工制备的未成熟巨核细胞。在本发明中，未成熟巨核细胞可以是克隆化的，也可以是未克隆化的，对此没有特别的限定，但有时也将克隆化的未成熟巨核细胞称为未成熟巨核细胞株。另一方面，“成熟巨核细胞”是指巨核细胞成熟相关基因群表达量高的、MYH10表达量低的巨核细胞，是进入多核化的巨核细胞(8N以上)。在本发明中，“成熟化”是指巨核细胞的成熟在进行，即，多核化或细胞质的増加在进行，巨核细胞成熟相关基因的表达量増加、以及巨核细胞未成熟相关基因的表达量降低等，只要与实施成熟化的步骤之前相比观察到这些趋势，也包含不一定达到上述定义中所述的成熟巨核细胞的情形。另外，“成熟化”是指比较培养前后的细胞群，整个细胞群的成熟化正在进行的情形，即整个细胞群的细胞核总数增加或(还有)细胞质増加(体积増加)的情形。
在本发明中，冷冻干燥制剂是指通过本领域技术人员熟知的冻干或冷冻干燥等方法制备的粉末状或粒状制剂。其是化学且生物学稳定的制剂，可以长期保存。冷冻干燥制剂在施用给对象而使用时，用水或生理盐水等溶解或悬浮使用。
作为本发明的具体方面，涉及本发明的冷冻干燥制剂，其中，在包含巨核细胞和血小板的本发明冷冻干燥制剂中，巨核细胞和血小板是从干细胞体外分化诱导的，更具体地，干细胞是多能性干细胞或造血干细胞，进一步具体地，多能性干细胞是iPS细胞。
在本发明中，干细胞是指同时具有能够分化成构成生物体的许多种类细胞的分化多能性(pluripotency)和即使经过分裂增殖也能够维持分化多能性的具有自我复制能力的细胞，任何能够分化成血小板的干细胞都可以。
在本发明中，多能性干细胞是指不形成个体但具有分化成属于三个胚层(内胚层、中胚层、外胚层)的所有细胞系列的能力的干细胞，任何能够分化成血小板的多能性干细胞都可以。作为多能性干细胞的优选例子，可以例举ES细胞、iPS细胞、源自原始生殖细胞的胚性生殖干细胞(EG细胞)、源自通过核移植获得的克隆胚的胚性干(ntES)细胞、精子干细胞(GS细胞)、培养的成纤维细胞和骨髓干细胞来源的多能性细胞(Muse细胞)等。ES细胞也可以是从体细胞通过核重编程产生的ES细胞。多能性干细胞优选地是ES细胞或iPS细胞。多能性干细胞可以是哺乳动物来源的，优选地是人来源的多能性干细胞。
造血干细胞是能够分化成造血细胞的干细胞，在成人中主要存在于骨髓中，产生白细胞(中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞)、红细胞、血小板、肥大细胞，树状细胞。造血干细胞也称为成血细胞或骨髓干细胞。
在下文中，描述了多能性干细胞的优选例子。
ES细胞是来源于动物发育早期阶段的囊胚期的胚的多能性干细胞。可以通过从哺乳动物受精卵的囊胚中取出内细胞团并在成纤维细胞饲养层上培养内细胞团来建立ES细胞。另外，通过传代培养维持细胞可以使用添加了白血病抑制因子(leukemia inhibitoryfactor (LIF))、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor (bFGF))等物质的培养液进行。关于人和猴的ES细胞的建立和维持方法，参见例如USP5,843,780；Thomson JA等人，(1995)，Proc Natl.Acad.Sci.U SA.92：7844-7848；Thomson JA等人，(1998)，Science.282：1145-1147；H.Suemori等人，(2006)，Biochem.Biophys.Res.Commun.，345：926-932；M.Ueno等人，(2006)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：9554-9559；H.Suemori等人，(2001)，Dev.Dyn.，222：273-279；H.Kawasaki等人，(2002)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，99：1580-1585；Klimanskaya I等人，(2006)，Nature.444：481-485等中所述。
一般可以以碱性磷酸酶、Oct-3/4、Nanog等基因标志物的表达为指标进行ES细胞的选择。特别地，人ES细胞的选择可以通过实时PCR法检测OCT-3/4、NANOG等基因标志物的表达和/或通过免疫染色法检测细胞表面抗原SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81而实施(Klimanskaya I等人(2006)，Nature.444：481-485)。
作为小鼠ES细胞，可以使用由inGenious公司、理化学研究所(理研)等建立的各种小鼠ES细胞株。作为人ES细胞，可以使用由美国国立卫生研究所(NIH)、理研、京都大学、Cellartis公司建立的各种人ES细胞株。例如作为ES细胞株，可以使用NIH的CHB-1～CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1～HUES28株等；WisCell Research Institute的WA01(H1)株、WA09(H9)株；理研的KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。另外，作为人ES细胞株，例如WA01(H1)和WA09(H9)可以从WiCell ResearchInstitute获得；KhES-1、KhES-2、KhES-3和KthES11可以从京都大学病毒·再生医科学研究所(日本京都)获得。
iPS细胞也称为人工多能性干细胞或诱导多能性干细胞，是可以通过向成纤维细胞等体细胞以DNA或蛋白质形式导入特定的一种或多种核重编程物质或者通过使用特定的一种或多种药剂使得所述核重编程物质的内源性mRNA和蛋白质的表达量提高而制备的、获得了分化多能性和自我复制能力的细胞(K.Takahashi和S.Yamanaka(2006)Cell，126：663-676；K.Takahashi等人，(2007)，Cell，131：861-872；J.Yu等人，(2007)，Science，318：1917-1920；Nakagawa，M.等人，Nat.Biotechnol.26：101-106(2008)；国际公开WO 2007/069666)。这里，“体细胞”是指除了卵子、卵母细胞、ES细胞等生殖系列细胞或分化全能性细胞之外的所有动物细胞(优选地是哺乳动物细胞，所述哺乳动物包括人)，包含胎儿(仔)体细胞、新生儿(仔)体细胞和成熟的健康或患病性体细胞中的任一者，另外，也包含原代培养细胞、传代细胞和细胞株化细胞中的任一者。具体地，体细胞可以例示例如(1)神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、牙髓干细胞等组织干细胞(体性干细胞)，(2)组织祖细胞，(3)淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、肌肉细胞、成纤维细胞(皮肤细胞等)、毛细胞、肝细胞、胃粘膜细胞、肠细胞、脾细胞、胰腺细胞(胰腺外分泌细胞等)、脑细胞、肺细胞、肾细胞和脂肪细胞等分化的细胞等。
核重编程物质可以由在ES细胞中特异性表达的基因、其基因产物或非编码RNA构成；或者由在保持ES细胞的未分化状态方面发挥重要作用的基因、其基因产物或非编码RNA构成或由低分子量化合物构成。对此没有特别的限定，可以例示例如Oct3/4、Klf4、Klf1、Klf2、Klf5、Sox2、Sox1、Sox3、Sox15、Sox17、Sox18、c-Myc、L-Myc、N-Myc、TERT、SV40LargeTantigen、HPV16E6、HPV16E7、Bmil、Lin28、Lin28b、Nanog、Fbx15、ERas、ECAT15-2、Tcl1、β-连环蛋白、Sall1、Sall4、Esrrb、Esrrg、Nr5a2、Tbx3和Glis1。在建立iPS细胞时，这些重编程物质可以单独使用，也可以组合使用。这样的组合可以是包含至少一种、两种或三种上述重编程物质的组合，优选地是包含三种或四种上述重编程物质的组合。
上述各核重编程物质的小鼠和人cDNA的核苷酸序列信息以及由所述cDNA编码的蛋白质的氨基酸序列信息可以通过访问WO2007/069666中所述的GenBank(美国NCBI)或EMBL(德国)的登录号获得。另外，L-Myc、Lin28、Lin28b、Esrrb、Esrrg和Glis1的小鼠和人cDNA序列信息和氨基酸序列信息可以通过访问表1所示的NCBI登录号获得。本领域技术人员可以根据所述cDNA序列或氨基酸序列信息按照常规方法制备所需的核重编程物质。
[表1]
基因名称 小鼠 人
L-Myc NM_008506 NM_001033081
Lin28 NM_145833 NM_024674
Lin28b NM_001031772 NM_001004317
Esrrb NM_011934 NM_004452
Esrrg NM_011935 NM_001438
Glis1 NM_147221 NM_147193
这些核重编程物质可以通过例如脂转染、与细胞膜穿透性肽(例如，HIV衍生的TAT和聚精氨酸)的结合、显微注射等技术以蛋白质形式导入体细胞内；或者，可以通过例如病毒、质粒、人工染色体等载体、脂转染、脂质体的使用、显微注射等技术以DNA或RNA形式导入体细胞内。作为病毒载体，可以例示逆转录病毒载体、慢病毒载体(这些载体基于Cell，126，pp.663-676，2006；Cell，131，pp.861-872，2007；Science，318，pP.1917-1920，2007中所述)、腺病毒载体(Science，322，945-949，2008)、腺相关病毒载体、仙台病毒载体(Proc JpnAcad Ser B Phys Biol Sci.85，348-62，2009)等。另外，作为人工染色体载体，包含例如人类人工染色体(HAC)、酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC和PAC)等。作为质粒，可以使用哺乳动物细胞用质粒(Science，322：949-953，2008)。载体中可以包含启动子、增强子、核糖体结合序列、终止子、多聚腺苷酸化位点或多聚腺苷酸化信号等调控序列，以使核重编程物质能够表达。作为使用的启动子，可以使用例如EF1α启动子、CAG启动子、SRα启动子、SV40启动子、LTR启动子、CMV(巨细胞病毒)启动子、RSV(劳斯肉瘤病毒)启动子、MoMuLV(莫罗尼小鼠白血病病毒)LTR、HSV-TK(单纯疱疹病毒胸苷激酶)启动子等。其中可以例举EF1α启动子、CAG启动子、MoMuLV LTR、CMV启动子、SRα启动子等作为优选的例子。进一步地，根据需要，可以包含耐药性基因(例如卡那霉素耐药性基因、氨苄青霉素耐药性基因或嘌呤霉素耐药性基因)、胸苷激酶基因和白喉毒素基因或其片段等选择标记序列；以及绿色荧光蛋白(GFP)、β-葡糖醛酸酶(GUS)或FLAG等报告基因序列。另外，为了在导入体细胞后切除编码核重编程物质的基因或一同切除启动子以及与其连接的编码核重编程物质的基因，上述载体中在它们之前和之后可以具有LoxP序列。在其他优选的实施方案中，可以使用如下方法：使用转座子将导入基因整合到染色体之后，使用质粒载体或腺病毒载体使转移酶作用于细胞，将导入基因自染色体中完全去除的方法。作为优选的转座子，可以例举例如源自鳞翅目昆虫的转座子piggyBac等(Kaji，K.等人，(2009)，Nature，458：771-775、Woltjen等人，(2009)，Nature，458：766-770、WO2010/012077)。进一步地，载体中可以包含嗜淋巴疱疹病毒(lymphotrophic herpes virus)、BK病毒和牛乳头瘤病毒(Bovine papillomavirus)的起点及其参与复制的序列，以使得载体不整合入染色体也能够复制，以附加型存在。可以例举包含例如EBNA-1和oriP或Large T和SV40ori序列(WO2009/115295、WO 2009/157201和WO2009/149233)。另外，为了将两种或两种以上的核重编程物质同时导入，可以使用能够表达多顺反子的表达载体。为了表达多顺反子，编码基因的序列和序列之间可以通过IRES或口蹄病病毒(FMDV)2A编码区连接(Science，322：949-953，2008、WO2009/092042和WO 2009/152529)。
在核重编程时，为了提高iPS细胞的诱导效率，可以使用上述因子之外的物质，例如，组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂[例如，丙戊酸(VPA)(Nat.Biotechnol.，26(7)：795-797(2008))、曲古抑菌素A、丁酸钠、MC1293、M344等小分子抑制剂；针对HDAC的siRNA和shRNA(例如，HDAC1 siRNA Smartpool(注册商标)(Millipore)、针对HDAC1的HuSH29mer shRNA构建体(OriGene)等)等核酸表达抑制剂等]、DNA甲基转移酶抑制剂(例如，5’-氮杂胞苷(5’-azacytidine))(Nat.Biotechnol.，26(7)：795-797(2008))、G9a组蛋白甲基转移酶抑制剂[例如，BIX-01294(Cell Stem Cell，2：525-528(2008))等小分子抑制剂、针对G9a的siRNA和shRNA(例如G9a siRNA(人)(Santa Cruz Biotechnology)等)等的核酸性表达抑制剂等]、L-通道钙激动剂(L-channel calcium agonist)(例如Bayk8644)(Cell Stem Cell，3，568-574(2008))、丁酸、TGFβ抑制剂或ALK5抑制剂(例如，LY364947、SB431542、616453和A-83-01)、p53抑制剂(例如，针对p53的siRNA和shRNA)(Cell Stem Cell，3，475-479(2008))、Wnt信号传递活化因子(例如可溶性Wnt3a)(Cell Stem Cell，3，132-135(2008))、LIF或bFGF等生长因子、ALK5抑制剂(例如，SB431542)(Nat.Methods，6：805-8(2009))、有丝分裂活化蛋白激酶信号传递(mitogen-activated protein kinase signaling)抑制剂、糖原合酶激酶(glycogen synthase kinase)-3抑制剂(PloS Biology，6(10)，2237-2247(2008))、miR-291-3p、miR-294、miR-295和mir-302等miRNA(R.L.Judson等人，Nat.Biotech.，27：459-461(2009))等。
可以使用通过药剂使核重编程物质的内源性蛋白质的表达量提高的方法。作为这样的药剂，可以例示6-溴靛玉红-3’-肟、靛玉红-5-硝基-3’-肟、丙戊酸、2-(3-(6-甲基吡啶-2-基)-1H-吡唑-4-基)-1，5-萘啶，1-(4-甲基苯基)-2-(4，5，6，7-四氢-2-亚氨基-3(2H)-苯并噻唑基)乙酮HBr(pifithrin-α)、前列腺素类(例如，前列腺素J2和前列腺素E2)等(WO 2010/068955)。
另外，以提高建立效率为目的，可以使用ARID3A抑制剂(例如，针对ARID3A的siRNA和shRNA)、神经肽Y、UTF1、IRX6、PITX2、DMRTBl等。
作为核重编程物质等的组合，可以例示WO2007/069666、WO2008/118820、WO2009/007852、WO2009/032194、WO2009/058413、WO2009/057831、WO2009/075119、WO2009/079007、WO2009/091659、WO2009/101084、WO2009/101407、WO2009/102983、WO2009/114949、WO2009/117439、WO2009/126250、WO2009/126251、WO2009/126655、WO2009/157593、WO2010/009015、WO2010/033906、WO2010/033920、WO2010/042800、WO2010/050626、WO 2010/056831、WO2010/068955、WO2010/098419、WO2010/102267、WO 2010/111409、WO 2010/111422、WO2010/115050、WO2010/124290、WO2010/147395、WO2010/147612、Huangfu D等人，(2008)，Nat.Biotechnol.，26：795-797、Shi Y等人，(2008)，Cell Stem Cell，2：525-528、Eminli S等人，(2008)，Stem Cells.26：2467-2474、Huangfu D等人，(2008)，Nat Biotechnol.26：1269-1275、Shi Y等人，(2008)，Cell Stem Cell，3，568-574、Zhao Y等人，(2008)，CellStem Cell，3：475-479、Marson A，(2008)，Cell Stem Cell，3，132-135、Feng B等人，(2009)，Nat Cell Biol.11：197-203、R.L.Judson等人，(2009)，Nat.Biotech.，27：459-461、Lyssiotis CA等人，(2009)，Proc Natl Acad Sci U S A.106：8912-8917、Kim JB等人，(2009)，Nature.461：649-643、Ichida JK等人，(2009)，Cell Stem Cell.5：491-503、Heng JC等人，(2010)，Cell Stem Cell.6：167-74、Han J等人，(2010)，Nature.463：1096-100、Mali P等人，(2010)，Stem Cells.28：713-720、Maekawa M等人，(2011)，Nature.474：225-9中所述的组合。
作为用于iPS细胞诱导的培养基，包括例如(1)含有10～15％FBS(胎牛血清)的DMEM、DMEM/F12或DME培养基(这些培养基可以还合适地包含LIF、青霉素/链霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸类、β-巯基乙醇)；(2)含有bFGF或SCF的ES细胞培养用培养基，例如小鼠ES细胞培养用培养基(例如TX-WES培养基，Thromb X公司)或灵长类ES细胞培养用培养基(例如灵长类(人或猴)ES细胞用培养基(销售方：ReproCELL，日本京都)、mTeSR-1)等。
作为培养法的例子，可以例如，在37℃、5％CO2存在下，于含有10％FBS的DMEM或DMEM/F12培养基中使体细胞与核重编程物质(DNA、RNA或蛋白质)接触，培养约4～7天后，将细胞重新接种到饲养细胞(例如，丝裂霉素C处理的STO细胞、SNL细胞等)上，并在自体细胞与核重编程物质接触约10天后用含有bFGF的灵长类ES细胞培养用培养基进行培养，在该接触约30～约45天或更长时间后产生ES细胞样集落。另外，为了提高iPS细胞的诱导效率，可以在5～10％的低氧浓度条件下进行培养。
或者，将上述细胞在37℃、5％CO2存在下于饲养细胞(例如，丝裂霉素C处理的STO细胞或SNL细胞等)上用含有10％FBS的DMEM培养基(该培养基可以还合适地包含LIF、青霉素/链霉素、嘌呤霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸类、β-巯基乙醇等)培养，约25～约30天或更长时间后可以形成ES样集落。也例示了用重编程的体细胞本身代替饲养细胞(TakahashiK等人，(2009)，PLoS One.4：e8067或WO2010/137746)或使用细胞外基质(例如，层粘连蛋白-5(WO2009/123349)和Matrigel(BD公司))的方法。
除此之外，也例示了使用不含有血清的培养基进行培养的方法(Sun N等人，(2009)，Proc Natl Acad Sci U S A.106：15720-15725)。进一步地，为了提高建立效率，可以通过低氧条件(0.1％以上、15％以下的氧浓度)建立iPS细胞(Yoshida Y等人，(2009)，Cell Stem Cell.5：237-241或WO2010/013845)。
在上述培养期间，从培养开始的第二天以后，每天进行一次新鲜培养基对培养基的更换。另外，不限制核重编程中使用的体细胞的细胞数量，每个培养皿(100cm2)约5x 103～约5x 106细胞的范围。
可以根据形成的集落形状选择iPS细胞。在使用包含与体细胞重编程时表达的基因(例如，Oct3/4、Nanog)一起表达的耐药性基因作为标记基因的DNA的情形，可以通过用包含相应的药剂的培养基(即，选择培养基)进行细胞的培养来选择标记基因表达细胞(即，建立的iPS细胞)。另外，标记基因是荧光蛋白质基因的情形，可以通过用荧光显微镜观察；标记基因是发光酶基因的情形，可以通过添加发光底物；或者，标记基因是发色酶基因的情形，可以通过添加发色底物，来检测或选择标记基因表达细胞(即，建立的iPS细胞)。
本说明书中使用的“体细胞”可以是除生殖细胞之外的任何细胞(优选哺乳动物(例如，人、小鼠、猴、猪和大鼠)细胞)。体细胞包括但不限于胎儿(仔)体细胞、新生儿(仔)体细胞、以及成熟的健康或患病的体细胞，另外，也包含原代培养的细胞、传代细胞和细胞株化细胞的任一者。具体地，体细胞可以例举例如角质化的上皮细胞(例如，角质化表皮细胞)、粘膜上皮细胞(例如，舌表层的上皮细胞)、外分泌腺上皮细胞(例如，乳腺细胞)、激素分泌细胞(例如，肾上腺髓质细胞)、用于代谢和储存的细胞(例如，肝细胞)、构成界面的内腔上皮细胞(例如，I型肺泡细胞)、内锁管的内腔上皮细胞(例如，血管内皮细胞)、带具有运输能力的纤毛的细胞(例如，气道上皮细胞)、细胞外基质分泌用细胞(例如，成纤维细胞)、收缩性细胞(例如，平滑肌细胞)、血液和免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞)、感觉相关细胞(例如，杆细胞)、自主神经系统神经元(例如，胆碱能神经元)、感觉器官和周围神经元支持细胞(例如，伴随细胞)、中枢神经系统的神经细胞和神经胶质细胞(例如，星状神经胶质细胞)、色素细胞(例如，视网膜色素上皮细胞)及它们的祖细胞(组织祖细胞)等。对细胞分化程度或采集细胞的动物的年龄没有特别限制，未分化的祖细胞或干细胞(包含体性干细胞)、最终分化的成熟细胞都同样地可以作为本发明中体细胞的来源使用。本文中作为未分化的干细胞，可以例举例如神经干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、齿髓干细胞等组织干细胞(体性干细胞)。
将iPS细胞和/或自它们分化诱导的细胞作为移植用细胞材料使用的情形，由不引起排斥反应的观点出发，使用与移植方个体的HLA基因型相同或基本上相同的体细胞是所希望的。本文中，HLA型“基本上相同”是指，在移植细胞的情形，HLA基因型与移植细胞可以存活的程度相匹配。可以例举例如主要的HLA(例如，HLA-A、HLA-B和HLA-DR的3个基因座、或加上HLA-C的4个基因座)相同的情形等。
EG细胞是源自精原细胞的多能性于细胞(参考文献：Nature.2008，456，344-49)。通过在LIF、bFGF、干细胞因子(stem cell factor)等物质存在下培养原始生殖细胞可以建立EG细胞(Y.Matsui等人(1992)，Cell，70：841-847；J.L.Resnick等人(1992)，Nature，359：550-551)。
ntES细胞是源自通过核移植技术产生的克隆胚的ES细胞，具有与源自受精卵的ES细胞几乎相同的特性(T.Wakayama等人，(2001)，Science，292：740-743；S.Wakayama等人，(2005)，Biol.Reprod.，72：932-936；J.Byrne等人，(2007)，Nature，450：497-502)。即，自通过将未受精卵的核置换为体细胞的核而获得的克隆胚来源的囊胚内细胞团建立的ES细胞是ntES(核转移ES(nuclear transfer ES))细胞。对于ntES细胞的制备，可以使用核移植技术(J.B.Cibelli等人，(1998)，Nature Biotechnol.，16：642-646)和ES细胞制备技术(见上述)的组合(若山清香等人(2008)，实验医学，26卷，5期(増刊)，47～52页)。在核移植中，将体细胞的核注入哺乳动物的已除核未受精卵中并培养几个小时，可以重编程。
精子干细胞是睾丸来源的多能性干细胞，是用于精子形成的成为起源的细胞。该细胞与ES细胞同样地可以分化诱导为各种系列的细胞，具有例如移植至小鼠囊胚时能够产生嵌合小鼠等的性质(M.Kanatsu-Shinohara等人(2003)Biol.Reprod.，69：612-616；K.Shinohara等人(2004)，Cell，119：1001-1012)。精子干细胞在包含神经胶质细胞系衍生的神经营养因子(glial cell line-derived neurotrophic factor(GDNF))的培养基中可以自我复制，通过在与ES细胞同样的培养条件下重复传代，可以获得精子干细胞(竹林正则等人(2008)，实验医学，26卷，5期(増刊)，41～46页，羊土社(日本东京))。
Muse细胞是从间充质细胞分离的多能性干细胞(参考文献：Proc Natl Acad SciUSA.2010，107，8639-43)。其可以通过WO2011/007900中所述的方法制备，具体地，其是将成纤维细胞或骨髓间质细胞用胰蛋白酶长时间处理、优选地8小时或16小时胰蛋白酶处理后，通过悬浮培养获得的具有多能性的细胞，其SSEA-3和CD105是阳性。
在本发明中，可以使用自除多能性干细胞以外的“具有向巨核细胞的分化能力的细胞”在体外分化诱导的巨核细胞和血小板。可以使用例如造血干细胞来源的细胞作为起始材料，其是通过分化诱导条件能够向巨核细胞分化的细胞。作为其例子，可以例举造血干细胞、造血祖细胞、CD34阳性细胞、巨核细胞/成红细胞祖细胞(MEP)、巨核细胞祖细胞等。具有向巨核细胞的分化能力的细胞可以通过公知方法获得，例如，除了从骨髓、脐带血、外周血等分离外，还可以自ES细胞、iPS细胞等多能性干细胞分化诱导。当造血祖细胞用作具有向巨核细胞的分化能力的细胞的情形，可以在本发明的培养步骤之前预先导入癌基因(例如c-MYC基因)和凋亡抑制基因(例如BCL-xL基因)、癌基因(例如c-MYC基因)和多梳基因(例如BMI1基因)、或癌基因(例如c-MYC基因)、多梳基因(例如BMI1基因)和凋亡抑制基因(例如，和BCL-xL基因)至细胞中(WO2014/123242、WO2011/034073、WO2012/157586、US2016/002599、US2012/238023、US2014/127815)。
本发明的冷冻干燥制剂的特征在于，包含巨核细胞和血小板。在本发明的冷冻干燥制剂中，巨核细胞和血小板的混合比例可以以期望的比例混合。巨核细胞和血小板的混合比例具体地用巨核细胞和血小板的个数之比来表示。在本发明中，巨核细胞和血小板的个数之比没有特别制限，例如相对于1×106个血小板包含1×103～1×105个巨核细胞(永生化巨核细胞株)、优选地相对于1×106个血小板包含1×103～5×104个巨核细胞(永生化巨核细胞株)、更优选地相对于1×106个血小板包含2×103～1×104个巨核细胞(永生化巨核细胞株)、进一步优选地相对于1×106个血小板包含2×103～5×103个巨核细胞(永生化巨核细胞株)。更具体地，本发明的冷冻干燥制剂可以相对于2-3x 106个血小板包含5-6x 103个至最多104个巨核细胞(永生化巨核细胞株)。在进一步的方面，本发明的冷冻干燥制剂中包含的巨核细胞和血小板个数之比为相对于1×103个巨核细胞(永生化巨核细胞株、成熟巨核细胞等)，是2×102～1.5×104个血小板、优选地是1.1×103～1.5×104个血小板。在进一步的方面，对本发明的冷冻干燥制剂中包含的巨核细胞的个数没有特别的限定，作为一个例子，可以是同一制剂中包含的血小板个数的3％以上、优选地是5％以上、更优选地是10％以上。对本发明的冷冻干燥制剂中包含的巨核细胞个数的上限值没有特别的限定，作为一个例子，可以是同一制剂中包含的血小板个数的500％以下、优选地是100％以下、更优选地是50％以下。
本发明的冷冻干燥制剂包含巨核细胞和血小板，可以将血小板和巨核细胞的混合比例调整为所需的比例。作为调整所需的比例的方法，通过在自多能性干细胞例如iPS细胞的分化诱导阶段的哪个时间点冷冻干燥可以将制剂中巨核细胞和血小板的比例调整为相对于血小板而言巨核细胞多、相对于血小板而言巨核细胞少。或者，可以准备在释放血小板之前的阶段，即，在仅有巨核细胞的阶段回收的细胞；准备分离和回收的仅释放的血小板细胞，以所需的比例混合(例如，WO2009/122747、US2011/053267)。本领域技术人员可以通过任何方法例如收集和观察一部分培养液来确定血小板是否从巨核细胞中释放出来。另外，可以用任何方法回收释放的血小板。因此，通过仅回收巨核细胞或仅回收血小板并以任意比例混合它们而获得的混合液可以用于本发明的制剂。或者，通过任何方法例如收集培养液的一部分并观察，回收包含任意比例的巨核细胞和血小板的混合物，可以将其用于制备本发明的制剂。
本发明的冷冻干燥制剂中包含的巨核细胞和血小板可以是活细胞，也可以不是活细胞。进一步地，本发明的冷冻干燥制剂由于制备中的活化或其后的冷冻干燥，存在巨核细胞和血小板破碎的可能性，这样的冷冻干燥制剂也包括在本发明的包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂中。
本发明的冷冻干燥制剂可以在体外自iPS细胞分化诱导的永生化巨核细胞株向血小板分化诱导来制备(Cell Stem Cell 14，535-548，2014年4月3日/WO2012/157586、US2014/127815)。本发明的目的之一是消除来源于自身血浆的PRP和冷冻干燥PRP中生长因子等的成分和量的批次差异大，并且每批次的效果不恒定的问题。一般而言，在再生医疗的普及中构建以大量供应细胞为目的的系统是重要的。在本发明中，活性成分是由干细胞制备的，以在一定程度上保证效果，作为大量供应系统，它使得事先储存iPS细胞和永生化巨核细胞株，分化诱导它们成为血小板的商业应用成为可能。另外，第三方有可能获得储存的永生化巨核细胞株，并将其向血小板分化。由此，在本发明的制备工程中，作为起始材料的不仅是干细胞(例如，多能性干细胞(iPS细胞等)、造血干细胞)，而且可以利用在从干细胞体外分化诱导的永生化巨核细胞株，来分化诱导血小板。由此，将在体外从干细胞(例如，多能性干细胞(iPS细胞等)、造血干细胞)分化诱导的永生化巨核细胞株作为起始材料使用，通过将该永生化巨核细胞株进一步体外分化诱导而获得的巨核细胞和血小板也应包括在“从干细胞体外分化诱导的巨核细胞和血小板”中。
本发明的冷冻干燥制剂还可以含有巨核细胞和/或血小板释放的生长因子。本发明中的生长因子包含选自骨形成蛋白(Bone morphogenetic protein)例如BMP2、BMP4、BMP7；血小板衍生生长因子(Platelet-Derived Growth Factor：PDGF)例如PDGF-BB；血小板衍生血管生成因子(Platelet-Derived Angiogenesis Factor：PDAF)；转化生长因子(Transforming Growth Factor：TGF)例如TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3；血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor：VEGF)；上皮细胞生长因子(Epidermal GrowthFactor：EGF)；成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors：FGF)例如碱性FGF；肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor：HGF)；血小板衍生内皮细胞生长因子(Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor：PD-ECGF)；胰岛素样生长因子(Insulin-likeGrowth Factor：IGF)；和血小板因子IV(Platelet Factor IV：PF4)中的至少一种。在优选的实施方案中，本发明的冷冻干燥制剂至少含有BMP2和/或BMP4。由于这些生长因子是通过巨核细胞和/或血小板的活化或通过冷冻干燥所致的巨核细胞和/或血小板的破碎而从巨核细胞和/或血小板释放的，因此巨核细胞和血小板以及这些生长因子的混合物可以构成本发明的冷冻干燥制剂。在优选的实施方案中，本发明的冷冻干燥制剂包含BMP2和/或BMP4，此外还可以包含其他的生长因子，例如，选自PDGF、PDAF、TGF、VEGF、EGF、FGF、HGF、PD-ECGF、IGF和PF4等中的一种或多种因子，由此能够发挥更优异的效果。
作为优选的本发明的冷冻干燥制剂，可以例举BMP-2高的血小板/巨核细胞混合物和BMP-4高的血小板/巨核细胞混合物以所需比例混合的制剂。
本发明的制剂含有多种这些生长因子作为活性成分。由于这些生长因子是稳定的，它们可以溶解或悬浮在水或生理盐水等中，即使低温保存也可以使用；可以将它们冷冻干燥，在使用时溶解或悬浮于水或生理盐水等中使用。另外，由于自活化的巨核细胞和/或血小板释放的生长因子作为活性成分是重要的，例如，可以残留巨核细胞和/或血小板而原样地或者可以过滤血小板后作为制剂施用给对象。
本发明的冷冻干燥制剂可以含有本领域技术人员周知的冷冻干燥制剂中常规使用的稳定剂、pH调节剂、等张化剂、赋形剂等、或血浆。作为冷冻干燥制剂中使用的稳定化剂，可以例举糖类例如蔗糖、海藻糖等、糖醇类例如山梨糖醇等、氨基酸类例如L-精氨酸等、水溶性高分子例如HES，PVP等、非离子型表面活性剂例如聚山梨醇酯等。作为pH调节剂，可以例举磷酸钠缓冲液、组氨酸缓冲液等；作为等张化剂，可以例举氯化钠等；作为赋形剂，可以例举甘露醇、甘氨酸等。
本发明的冷冻干燥制剂的特征在于，包含从干细胞体外分化诱导的巨核细胞和血小板，与富含血小板血浆(PRP)同样地，具有组织修复能力。因此，本发明的冷冻干燥制剂预期在皮肤科、形成外科、齿科领域以及整形外科领域广泛地有效果，例如，可以用于皮肤科的难治性皮肤溃疡或褥疮(压疮)、烧伤、糖尿病患者的坏疽、齿科的牙槽骨和牙龈的再生促进、以及骨癒合促进这样的用途。另外，可以施用本发明的冷冻干燥制剂至软骨和肌肉的损伤部位、外科手术时的患部、骨关节炎和风湿病、半月板损伤、肱骨外上髁炎的患部、以及脸和脖子等，用于改善皮肤的皱纹或促进毛发生长。
<冷冻干燥制剂的制备方法>
作为另一方面，本发明涉及制备包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂的方法，所述方法的特征在于，
(A)制备血小板和巨核细胞的细胞混合液，具体地，制备血小板和从干细胞体外分化诱导的永生化巨核细胞的细胞混合液，优选地，活化获得的细胞混合液；和
(B)冷冻干燥血小板和巨核细胞的细胞混合液。
步骤(A)中使用的血小板是从干细胞体外分化诱导的血小板。优选地，从从干细胞体外分化诱导的巨核细胞分化诱导的血小板是优选的。可以通过公知方法从干细胞、优选地造血干细胞或iPS细胞等多能性干细胞分化诱导巨核细胞(WO2012/157586、US2014/127815、Nakamura，Eto等人，Cell Stem Cell 14，535-548，2014年4月3日)。因为从巨核细胞分化培养血小板后的培养物中通常包含血小板和巨核细胞，故可以将该培养物作为血小板和巨核细胞的细胞混合液。然后，通过离心分离等，分离细胞和培养上清，通过移液等分散选择的细胞部分，然后，优选地活化细胞。所有这些优选地无菌实施。
在步骤(A)中，活化细胞混合液(血小板和巨核细胞)的情形，作为刺激方法，可以例举凝血酶、CaCl2、TXA2、肾上腺素、ADP，但不限于此。优选地，使用CaCl2或使用凝血酶和CaCl2的组合。由此，血小板和/或巨核细胞中包含的生长因子释放至细胞外。
在步骤(B)中，使用本领域技术人员熟知的冷冻干燥机进行冷冻干燥。不特别限定冷冻干燥方法，可以应用所有蒸馏除去水分的方法。因此，本发明的冷冻干燥制剂包括不经过冷冻干燥方法而通过任意方法除去水分的制剂。
下面详细描述制备本发明冷冻干燥制剂的方法，在一个例子中，实施两个步骤：(a)血小板和永生化巨核细胞的细胞混合液的活化；和(b)血小板和永生化巨核细胞的细胞混合液的冷冻干燥处理：
(a)血小板和永生化巨核细胞的细胞混合液的活化
通过分化培养105个细胞/ml数量级的永生化巨核细胞而获得的培养后第6～7天的血小板和永生化巨核细胞的细胞混合液于900rpm(170G)、15分钟条件下离心分离后，弃去培养上清。然后，向离心沉淀物添加培养上清1/10量的已灭菌0.1％CaCl2的Tyrode缓冲液(12ml)，使得细胞浓度成为培养时的10倍。对其通过移液，使前述血小板和永生化巨核细胞的细胞混合液松散，原样地将其在培养箱中于37℃反应1小时，以无菌活化血小板和巨核细胞。
(b)血小板和永生化巨核细胞的细胞混合液的冷冻干燥处理
将前述活化的血小板和永生化巨核细胞的细胞混合液转移到带膜过滤器的无菌培养容器中，将其作为冷冻干燥处理用样本。将该冷冻干燥处理用样本首先在共晶点以下的-60℃经过一昼夜以上的充分预冷冻。然后，将其置于预先设定为-45℃以下的冷冻干燥机(EYELA FDU-1200)中，通过真空泵在减压下冷冻干燥处理一昼夜以上，制备制剂。
本发明的冷冻干燥制剂可以添加本领域技术人员周知的冷冻干燥制剂中常规使用的稳定剂、pH调节剂、等张化剂、赋形剂等、或血浆。作为冷冻干燥制剂中使用的稳定化剂，可以例举糖类例如蔗糖、海藻糖等、糖醇类例如山梨糖醇等、氨基酸类例如L-精氨酸等、水溶性高分子例如HES，PVP等、非离子型表面活性剂例如聚山梨醇酯等。作为pH调节剂，可以例举磷酸钠缓冲液、组氨酸缓冲液等；作为等张化剂，可以例举氯化钠等；作为赋形剂，可以例举甘露醇、甘氨酸等。
在制备本发明的冷冻干燥制剂的另一例子中，将本发明的多能性干细胞通过本身公知的方法)分化诱导为多能性造血祖细胞后，将前述一系列基因(c-MYC/BMI1/BCL-xL等)用例如强力霉素依赖性地可调控表达的载体进行细胞导入而制备的永生化巨核细胞株通过在强力霉素存在下(即，表达c-MYC/BMI1/BCL-xL等的状态)培养，使增殖，然后，通过用除去了强力霉素的培养基条件(即，停止c-MYC/BMI1/BCL-xL等表达的状态)培养，诱导自永生化巨核细胞株向血小板的分化(培养基条件：例如，WO2012/157586、US2014/127815、Nakamura，Eto等人，Cell Stem Cell 14，535-548，2014年4月3日、WO2019/009364)。该条件的培养物中依然残存永生化巨核细胞株(作为一个例子，播种2-3x 105/ml永生化巨核细胞株，实施除去强力霉素的血小板制造培养基条件。瓶中产生约2-3x 106/ml左右的血小板。每个永生化巨核细胞株产生10-15个血小板。每个瓶残存5-6x 103至104/ml左右的永生化巨核细胞株)。例如，分化诱导(强力霉素除去)后4天以后(例如，第4天、第5天、第6天、第7天)回收细胞培养物(血小板和永生化巨核细胞株的混合物)。通过活化获得的血小板和永生化巨核细胞株的混合物(例如CaCl2 1mM+凝血酶1U)，可以获得活化的包含巨核细胞和血小板的混合物。
如上所述，本发明的冷冻干燥制剂除了巨核细胞和血小板之外，还含有巨核细胞和/或血小板释放的生长因子，能够构成混合物。这些生长因子是通过巨核细胞和/或血小板的活化、或通过冷冻干燥而由巨核细胞和/或血小板的破碎，从巨核细胞和/或血小板释放的。可以通过刺激多能性干细胞衍生的巨核细胞和/或血小板，使其释放生长因子来制备本发明中的混合物。作为刺激手段，可以例举凝血酶、CaCl2、TXA2、肾上腺素、ADP。
作为优选的本发明冷冻干燥制剂的制备方法，可以例举BMP-2高的血小板/巨核细胞混合物与BMP-4高的血小板/巨核细胞混合物以所需比例混合来制备的方法。
作为制备本发明的冷冻干燥制剂的其他例子，可以举出以下。
A.将人来源的ES细胞或iPS细胞播种在C3H10T1/2细胞或OP9细胞等饲养细胞上，例如，在VEGF存在下培养14～17天，选择在适合造血祖细胞分化诱导的条件下培养获得的、内含造血祖细胞的网状结构物的产生能力高的ES细胞或iPS细胞克隆，分离该ES细胞或iPS细胞克隆产生的、形成网状结构物隔膜的细胞作为造血祖细胞，将得到的造血祖细胞播种在饲养细胞上，通过在适于巨核细胞和/或血小板的分化诱导的条件培养，可以制备本发明使用的巨核细胞和/或血小板(WO2009/122747)。另外，通过液体培养人来源的ES细胞或iPS细胞，使在胚样体内部形成造血祖细胞，将该胚样体在TPO和SCF存在下进一步培养例如5～7天，可以制备巨核细胞和/或血小板(同上)。
B.为了增殖自人ES细胞或iPS细胞分化诱导的细胞例如多核化前的巨核细胞祖细胞，通过导入MYC家族基因等外来癌基因、或者癌基因和BMI1等多梳基因，并强制表达该癌基因或强制表达该癌基因和该多梳基因，可以制备本发明使用的成熟巨核细胞和/或血小板(WO2011/034073、WO2011/034073、日本特开2015-130866)。
C.在多核化前的巨核细胞中强制表达BCL-XL基因等凋亡抑制基因，同时实施(a)通过布雷比他汀(Blebbistatin)等肌动球蛋白复合体机能抑制剂的处理、(b)通过Y27632等ROCK抑制剂的处理、(c)通过StemRegenin(SR)-1(4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚)等芳香烃受体(arylhydrocarbon receptor；AhR)拮抗剂的处理、或(d)通过丙戊酸等HDAC抑制剂的处理，培养该细胞，可以制备本发明使用的多核化巨核细胞(WO2012/157586、特开2019-026591)。将此处获得的多核化巨核细胞抑制前述凋亡抑制基因的强制表达或自细胞除去前述凋亡抑制基因，在添加了ROCK抑制剂和/或肌动球蛋白复合体机能抑制剂的培养基进行培养，可以制备本发明使用的血小板(同上)。
D.(a)在具有能通过培养液的多孔结构的保持部中保持巨核细胞：和(b)从设置在前述保持部一侧的前室部向设置在前述保持部另一侧的流路部经由前述保持部来通过前述培养液，同时培养前述巨核细胞，由此可以从巨核细胞制备本发明使用的血小板(日本特开2013-031428)。
E.将多能性干细胞在含有VEGF的培养液中于C3H10T1/2细胞上培养，分化诱导为造血祖细胞，使得到的造血祖细胞中的凋亡抑制基因和癌基因强制表达并培养，然后使得到的细胞停止凋亡抑制基因和癌基因的强制表达并培养，可以制备本发明使用的巨核细胞(WO2014/123242、US2016/002599)。通过回收自此处获得的巨核细胞的培养物，可以制备本发明使用的血小板(同上)。
F.在包含ABC转运蛋白的C家族的抑制剂例如丙磺舒(Probenecid)等ABC转运蛋白抑制剂的培养液中培养例如自多能性干细胞来源的造血祖细胞制备的未成熟巨核细胞，可以制备本发明使用的巨核细胞(日本再表2014/168255)。
G.通过在致死不表达巨核细胞特异性表达基因的细胞条件下，培养包含巨核细胞或具有向巨核细胞的分化能力的细胞的细胞群，通过制备包含巨核细胞或巨核细胞祖细胞的培养物，可以制备本发明使用的巨核细胞(WO2016/143836、US2018/044634)。通过使用此处获得的巨核细胞，可以制备本发明使用的血小板(同上)。
H.通过将包含一种或多种芳香烃受体(arylhydrocarbon receptor；AhR)拮抗剂和一种或多种ROCK(Rho结合激酶)抑制剂的、高功能性的血小板产生促进剂与巨核细胞或其祖细胞接触，可以制备本发明使用的血小板(WO2016/204256)。
I.通过在IL-1α存在下培养巨核细胞或血小板的祖细胞，收集所产生的巨核细胞或血小板，可以制备本发明使用的巨核细胞和/或血小板(日本特开2017-122049)。
J.通过包括将包含选自Wnt抑制剂和FLT抑制剂的一种或多种物质的血小板产生促进剂与巨核细胞和/或其祖细胞接触的步骤的培养法，可以制备本发明使用的血小板(WO2017/131230)。
K.通过包括将包含选自由受体型酪氨酸激酶抑制剂、类香草素(Vanilloid)受体抑制剂、PDGFR抑制剂、TrioN抑制剂、SIRT2抑制剂、H+，K+-ATPase抑制剂、苯二氮卓类(Benzodiazepine)反向激动剂和神经发生促进剂组成的组中的一种或多种AhR拮抗剂的血小板产生促进剂与巨核细胞和/或其祖细胞接触的步骤的培养法，可以制备本发明使用的血小板(日本特开2019-026591)。
L.通过血小板的制造方法可以制备本发明使用的血小板，所述血小板的制造方法是包括在血小板产生培养基中培养巨核细胞的步骤的血小板的制造方法，其中前述培养步骤包括使用搅拌叶片，搅拌容器内的前述血小板产生培养基的步骤，其中搅拌步骤包括使前述搅拌叶片往复运动以充分满足选自以下的一个以上指标：(a)约0.0005m2/s2～约0.02m2/s2的湍流能量；(b)约0.2Pa～约6.0Pa的剪切应力；和(c)约100μm～约600μm科尔莫戈罗夫量表(Kolmogorov scale)(WO2019/009364)。
<药物组合物>
作为本发明又一其他方面，涉及包含本发明的冷冻干燥制剂的药物组合物。
本发明的冷冻干燥制剂具有与自血液制备的富含血小板血浆(PRP)及其冷冻干燥制剂同样的组织修复能力。因此，本发明的药物组合物预期在皮肤科、形成外科、齿科领域以及整形外科领域广泛地有其效果，例如，可以用于皮肤科的难治性皮肤溃疡或褥疮(压疮)、烧伤、糖尿病患者的坏疽、齿科的牙槽骨和牙龈的再生促进、以及骨癒合促进这样的用途。另外，可以施用本发明的药物组合物至软骨和肌肉的损伤部位、外科手术时的患部、骨关节炎、风湿病、半月板损伤、肱骨外上髁炎的患部、以及脸和脖子等，用于改善皮肤的皱纹或促进毛发生长。由于本发明的冷冻干燥制剂富含BMP2和/或BMP4，在上述用途中尤其适用于促进骨癒合的用途或者治疗或预防皮肤疾病的用途。优选地，本发明的药物组合物包含促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病有效量的本发明的冷冻干燥制剂。
骨断裂称为骨折，骨的裂开、骨的一部分缺失或骨凹陷的情形也是骨折。通常，作为骨折的症状，因为骨及其周围神经和血管是丰富的，故发生骨折的话，骨折部位出现疼痛和肿胀，在骨折严重的情形，则会变得无法活动，外观变形。骨折包括在骨折的同时撕裂皮肤并暴露出骨折部分的开放性骨折、骨折部分复杂地粉碎的粉碎性骨折、以及只有裂开而没有错位(脱位)的不完全骨折。当发生骨折时，骨和覆盖骨的骨膜或周围的软组织损伤，引起出血。出血的血液中含有一些纤维，该纤维分化诱导产生和分泌胶原蛋白和蛋白聚糖的成骨细胞、形成成为骨组织支柱的胶原纤维，构建骨组织。重建这种骨组织的过程是“骨癒合”。骨癒合与骨融合同义。
在本发明中，“促进骨癒合”是指重建由骨折破坏、分离的骨片，恢复断裂的骨组织的连续性，恢复骨的支持性和强度的过程。另外，在本发明中，“促进骨癒合”是指，除了单纯地恢复骨的支持性和强度的过程之外，它还比上述天然的骨组织重建更早期且更合适地重建因骨折而破坏、分离的骨片、恢复折断的骨组织的连续性、恢复骨的支持性和强度的过程。
通常，骨折部位的愈合经过以下第1期到第5期的规定期间发生。为骨膜、骨髓、肌肉、血管损伤，造成血肿的骨折血肿期(第1期，8～10天)；增生的组织与周围可以明确区分、纤维软骨变硬的初期假骨形成期(第2期，10～25天)；初期假骨缩小且全部成骨的成骨细胞增殖期(第3期，20～60天)；海绵骨样假骨变为硬骨的硬化期(第4期，50天～6个月)；以及成为被正常骨膜包覆的完全骨的改变期(第5期，4～12个月)的过程。
在本发明中，“促进骨癒合”中所述的“比该天然的骨组织重建更早期且更合适地“是指比该愈合过程更早期且更可靠地引起骨癒合的方式。
在本发明中，皮肤疾病是指皮肤的创伤，例如难治性皮肤溃疡或褥疮(压疮)、烧伤、糖尿病患者的下肢坏死或坏疽。当皮肤内施用本发明的药物组合物时，本发明的药物组合物释放出生长因子等具有生理活性的多种蛋白质，增加皮肤内的毛细淋巴管，并使皮肤成纤维细胞迁移，预期能够再生毛细淋巴管和毛细血管以及皮肤新生肉芽组织，能够治疗或预防下肢缺血时发生的皮肤溃疡、皮肤褥疮、皮肤损伤等皮肤疾病。另外，为了改善面部和颈部等皮肤的皱纹或促进毛发的生长，也可以对对象施用本发明的药物组合物。
目前，还没有关于从自iPS细胞等干细胞分化诱导的血小板制备与献血PRP同样的创伤治愈用制剂并研究其效果和安全性的报道。本发明人们通过开发供体非依赖性输血用血小板制剂(Ito Y，Nakamura S，Sugimoto N.等人，Cell，174(3)：636-648，2018：https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/30017246)，已经进入了开始对无法找到供体的再生障碍性贫血患者以自体iPS细胞为原材料的、iPS人工自体血小板输血治疗法的临床研究阶段。
另外，血小板没有细胞核、科学地说是非增殖的功能性细胞，或在药事中被定位为细胞碎片化制剂，为了杀死混在的有核细胞等目的，对输血制剂进行合适的15-25Gy以上的放射线照射之后使用。因此，在使用iPS细胞的移植医学、再生医学中安全性高(癌化风险降低等)，认为本发明具有极大的优势。
作为本发明药物组合物的活性成分的巨核细胞和血小板可以与包含从干细胞体外分化诱导的巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂同样地制备。干细胞等的定义及其制备方法等与本发明的冷冻干燥制剂中所述的同样。本发明的药物组合物中“促进骨癒合的有效量”的巨核细胞和血小板只要是能够促进骨癒合的量即可，对其数值没有特别限定。“治疗或预防皮肤疾病的有效量”也是同样的。特别地例如，巨核细胞和血小板在每次施用时，作为血小板数，可以以约2x 106至约2x 1010个细胞、优选地约2x 107至约2x 109个细胞用量施用。在另一方面，对于皮肤创伤的处理，巨核细胞和血小板对每1cm2创伤部位在每次施用时，作为血小板数，可以以约2x106至约2x 1010个细胞、优选地约2x 107至约2x 109个细胞(例如4.5×107个细胞)施用。另一方面，对每次施用时所施用的巨核细胞个数没有特别的限定，作为一个例子，在每次施用时，可以是施用的血小板个数的3％以上、优选地5％以上、更优选地10％以上。对每次施用时所施用的巨核细胞个数的上限值没有特别的限定，作为一个例子，可以是每次施用时所施用的血小板个数的500％以下、优选地100％以下、更优选地50％以下。施用的量取决于多个因素，包括年龄、体重、对象的性别、待治疗的疾病/病症及其范围和严重程度。
本发明的药物组合物除了含有巨核细胞和血小板，可以还含有巨核细胞和/或血小板释放的生长因子。本发明的生长因子包含选自骨形成蛋白(Bone morphogeneticprotein)例如BMP2、BMP4、BMP7；血小板衍生生长因子(Platelet-Derived Growth Factor：PDGF)例如PDGF-BB；血小板衍生血管生成因子(Platelet-Derived Angiogenesis Factor：PDAF)；转化生长因子(Transforming Growth Factor：TGF)例如TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3；血管内皮细胞生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor：VEGF)、上皮细胞生长因子(Epidermal Growth Factor：EGF)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factors：FGF)例如Basic FGF；肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor：HGF)血小板衍生内皮细胞生长因子(Platelet-Derived Endothelial Cell Growth Factor：PD-ECGF)；胰岛素样生长因子(Insulin-like Growth Factor：IGF)；和血小板因子IV(Platelet Factor IV：PF4)中的至少一种。在优选的实施方案中，本发明的药物组合物至少含有BMP2和/或BMP4。这些生长因子的定义及其制备方法与本发明的冷冻干燥制剂中所述同样。
本发明的组合物可以与药学上可接受的载体一起配制。例如，本发明的药物组合物可以单独施用或作为制剂处方成分施用。可以将受试化合物配制成以用于药物使用的任何方便的方式施用。适于施用的医药品可以与一种或多种药学上可接受的无菌等张水性或非水性溶液(例如，平衡盐类溶液(BSS))、分散体、悬浮液或乳液组合、或者在使用前即刻可以与任选地含有抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂、溶质或悬浮或增稠剂的能无菌注入的溶液组合、或者可以与能回到分散体的无菌粉末组合。
本发明的组合物可以是无发热性物质或基本无发热性物质且无菌等适合治疗用途的制剂。施用时，本发明使用的药物可以是无发热性物质且无菌的、生理学上可接受的形式。本发明的药物组合物可以以悬浮液、凝胶、胶体、浆液或在混合物中施用。
用于本发明的药物组合物和冷冻干燥制剂的基材如下。
本发明一般可以包括对骨折患部施用作为移植片的本发明药物组合物或冷冻干燥制剂的步骤。在具体的实施方案中，本发明包含分散在可生物降解的聚合物基材中的活性药剂。可生物降解的聚合物可以是例如聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)共聚物、可生物降解的聚(DL-乳酸-共-乙醇酸)膜或PLLA/PLGA聚合物基质。聚合物中乙醇酸单体的比例为约25/75、40/60、50/50、60/40、75/25，更优选地为约50/50重量百分比。PLGA共聚物可以是体内可降解植入片的约20、30、40、50、60、70、80～约90重量％。PLGA共聚物可以是体内可降解植入片的约30～约50重量％、优选地是约40重量％。本发明的药物组合物和冷冻干燥制剂可以与聚乳酸、聚(乳酸-共-乙醇酸)、50：50PDLGA、85：15PDLGA、和INION GTR(注册商标)可生物降解性膜(生物相容性聚合物混合物)等生物相容性聚合物一起移植。也参见Lu等人，(1998)J Biomater Sci Polym Ed 9：1187-205；和Tomita等人(2005)Stem Cells 23：1579-88。
作为另一方面，本发明涉及用于促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病的方法，所述方法包括将本发明的包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂施用给需要这种治疗等的对象，优选地包括将有效量的本发明冷冻干燥制剂施用给需要其对象。
进一步地，作为另一方面，本发明涉及用于促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病的本发明的包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂。
再一方面，本发明涉及本发明的包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂的用途，用于制备促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病的药物。
如本说明书中所用，术语“对象”或“患者”是指人和非人动物，作为非人动物，可以例举灵长类、狗、猫和小型鸟类等代表性宠物动物、小鼠、大鼠、豚鼠、兔、鸡、猪、马、羊和牛，但不限于这些。优选地，对象或患者是人和宠物动物，更优选地是人。
本说明书中引用的所有参考文献，包括出版物、专利文献等，与它们分别作为具体参考所援引的那样并以其内容全部具体记载的那样的相同程度通过引用而援用于本说明书中。
以下，通过实施例详细地描述本发明，但应当注意，这些实施例仅仅是例示，并不限制本发明的范围。
实施例
参考例1
永生化巨核细胞的建立以及向血小板的分化诱导
根据Cell Stem Cell.2014年4月3日；14(4)：535-48所述，自已建立的永生化巨核细胞株分化诱导血小板。即，向购买的胎儿成纤维细胞中通过仙台病毒导入山中4因子而制备的iPS细胞系Sev2按照已有报道(Takayama等人，Blood 111，5298-5306(2008)；Takayama等人，J Exp Med207，2817-30，2010)，在CH3T10T1/2细胞上于VEGF存在下培养11～14天，通过Sac法获得多能性造血祖细胞。使用慢病毒载体衍生病毒(2种)将c-MYC和BMI-1感染该多能性造血祖细胞。进一步地，将BCL-xL基因导入增殖中的该细胞群体，经过1个月以上获得仍维持CD41a/CD42b表达且增殖的细胞群体。这称为永生化巨核细胞株(imMKCL)。imMKCL克隆7用于以下试验。imMKCL克隆7通过在强力霉素存在下(即，表达c-MYC/BMI-1/BCL-xL的情况下)培养，增殖，然后通过在没有强力霉素的培养基条件下(即，停止了表达c-MYC/BMI-1/BCL-xL的情况下)培养6～7天，诱导向血小板的分化。培养条件参照Cell Stem Cell.2014年4月3日；14(4)：535-48。
实施例1
包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂的制备
实施例1-1：血小板和永生化巨核细胞的细胞混合液的活化
将2.0x 105个细胞/ml永生化巨核细胞株克隆7(也称为Sev2克隆：Nakamura等人，Cell Stem Cell.2014年4月3日；14(4)：535-48；Ito Y，Nakamura S等人，Cell 174(3)：636-648，2018)(25ml x 5、125ml三角瓶)通过强力霉素不存在下的上述分化培养方法(ItoY，Nakamura S等人，Cell174(3)：636-648，2018))获得的液体培养后第6～7天的血小板和永生化巨核细胞的细胞混合液(120m1)在900rpm(170G)、15分钟条件下离心分离后，弃去培养上清。然后，向离心沉淀物添加培养上清1/10量的已灭菌0.1％CaCl2的Tyrode缓冲液(12ml)，使得细胞浓度成为培养时的10倍。通过移液使离心沉淀物松散，获得血小板和永生化巨核细胞的细胞混合液，原样地将其在培养箱中于37℃反应1小时，以无菌活化血小板和巨核细胞。由此获得了血小板和永生化巨核细胞的细胞混合液(无菌)。
实施例1-2：血小板和永生化巨核细胞的细胞混合液的冷冻干燥处理
将实施例1-1制备的血小板和永生化巨核细胞的细胞混合液(无菌)分装到冷冻干燥用的管(1ml x 9个管和750μl x 4个管)中，转移到带膜过滤器的无菌培养容器中，将其作为冷冻干燥处理用样本。将该冷冻干燥处理用样本首先在共晶点以下的-60℃经过一昼夜以上的充分预冷冻。然后，将其置于预先设定为-45℃以下的冷冻干燥机(EYELA FDU-1200)中，通过真空泵在减压下冷冻干燥处理一昼夜以上，以制备所需的冷冻干燥制剂。
实施例2
确认包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂的骨癒合效果
根据Shiga等人，Sci Rep.2016Nov 11；6：36715中所述的方法，制备了大鼠腰椎固定术模型，确认了实施例1-2制备的包含源自iPS细胞的永生化巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂的骨癒合促进效果。即，使用SD大鼠(8周龄)制备了腰椎固定术模型。在第4-6腰椎棘突起水平切开皮肤，且在距棘突起中央1.5mm的外侧部纵切开约2cm筋膜。慢慢地展开背肌，使第4-6腰椎横突起露出。粉碎0.5ml作为人工骨的羟基磷灰石胶原蛋白复合体Refit(HoyaCorporation，Tokyo，Japan)，与10μg上述冷冻干燥制剂混合，移植至腰椎两侧。缝合筋膜和皮肤，完成了模型制备。在术后2周、4周、6周通过X射线撮影进行骨癒合评价。
图1显示了移植2周后的大鼠脊椎的X射线图像。大鼠脊椎横突起之间移植有包含源自iPS细胞的永生化巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂时，移植后2周在横突起之间观察到骨性交联。根据该结果，提示包含源自iPS细胞的永生化巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂具有优异的骨癒合促进效果和骨形成能力。
实施例3
制剂中的生长因子浓度测定
在实施例1-2的冷冻干燥制剂的制备过程中，通过ELISA测定巨核细胞/血小板活化后即刻的和冷冻干燥后的制剂中的生长因子浓度。使用的试剂盒如[表2]所示。活化时巨核细胞的细胞浓度为1x 106个细胞/ml。结果如[表3]所示。在[表3]中，活化后即刻(FD前)的生长因子浓度是1ml细胞混合液中的浓度。另外，冷冻干燥后(FD后)的生长因子浓度是各小瓶装填1ml纯化水时的浓度。即使在冷冻干燥后，也良好地维持了制剂中含有的各细胞因子的量。
[表2]
Figure BDA0003770686910000321
Human：人
[表3]
细胞因子 FD前 FD后
TGF β1 23，620 25，252
PDGF-BB 2，812 2，079
EGF 792 642
BMP-2 2，921 2，331
(pg/ml)
实施例4
BMP2和BMP4浓度的测定
在实施例1-2的冷冻干燥制剂的制备过程中，测定了巨核细胞/血小板活化后即刻(FD前)的制剂中的BMP2和BMP4浓度。另外，使用自人外周血制备的包含相同数量血小板的PRP，与实施例1-2同样地活化(2个人：人PRP1和人PRP2)，测定了PRP中的BMP2和BMP4浓度。作为对照，使用分化培养基(自增殖培养基除去强力霉素并添加SR1 750uM、Y27632 10mM和KP457 15mM)。
结果如图2所示。与源自人外周血的包含相同血小板数量的活化PRP相比，源自iPS细胞的永生化巨核细胞和血小板的活化上清中BMP2和BMP4浓度更高。观察到源自人外周血的活化PRP中的BMP2和BMP4浓度存在个体差异。
实施例5
源自iPS细胞的成熟巨核细胞和血小板释放的细胞因子的检测
通过将参考例1中制备的源自iPS细胞的永生化巨核细胞株imMKCL在分化培养基(自增殖培养基除去强力霉素且添加SR1 750uM、Y27632 10mM和KP457 15mM)中摇动培养，获得成熟巨核细胞和血小板(MMK-PLT)。验证了MMK-PLT是否与源自人外周血的PRP同样地释放促进创伤治愈的细胞因子。首先，在分化的第0、4和6天从MMK-PLT回收mRNA，使用RT-qPCR随时间分析TGF-β1、PDGF-BB、EGF的基因表达。另外，向各MMK-PLT添加CaCl2和凝血酶并活化、离心分离并回收上清。通过ELISA法测定该上清中包含的TGFβ、PDGF-BB、EGF、bFGF蛋白的浓度。
得到的结果如图3和图4所示。
各细胞因子的基因表达随着巨核细胞的成熟直到第6天都显著增加。另外，通过活化而释放的各细胞因子的蛋白浓度也随着成熟而增加，但在第4天和第6天之间没有观察到显著性差异。这些结果表明分化第4天以后的MMK-PLT富含各细胞因子。
实施例6
体外创伤治愈测定法
在创伤治愈的增殖期，由创伤部位存在的成纤维细胞构建胶原蛋白等细胞外基质。分析了MMK-PLT对人原代培养的成纤维细胞增殖能力的影响。
具体而言，向人原代培养的成纤维细胞的培养液(无血清)中添加实施例5制备的活化MMK-PLT(第6天)上清，测定第3天和第5天的细胞数。与无任何添加的对照组和作为阳性对照的FBS添加组进行比较(n＝3)。
得到的结果示于图5。
与对照组相比，MMK/PLT添加组的细胞数显著性増加。另外，继续培养5天时，FBS添加组的增殖能力下降，但MMK/PLT添加组的增殖持续，观察到细胞数的显著性差异。
实施例7
体内创伤治愈测定法
使用动物模型验证MMK-PLT是否实际上促进创伤治愈。
具体而言，在免疫缺陷小鼠(NOD/SCID IL2R缺陷)(从Claire Japan获得)的左右背部产生6mm大的全层皮肤缺损。回收分化第5天的MMK-PLT(如实施例5所述制备)，在皮肤缺损周围皮下注射作为分化培养开始时的永生化巨核细胞株细胞数，为8×105个细胞。另外，将2×105个分化培养开始时的永生化巨核细胞株细胞数与基底膜基质制剂混和，涂布于创面，并用聚氨酯薄膜包扎。一个创伤部位的总施用量是1×106个作为分化培养开始时的永生化巨核细胞株细胞数，这相当于每1cm2创伤部位施用量是3×106个作为分化培养开始时的永生化巨核细胞株细胞数。由实施例10的表5可知，施用时(分化第5天)对一个创伤部位估计施用了约2.2×106个巨核细胞和约1.5×107个血小板(每1cm2创伤部位约6.6×106个巨核细胞和约4.5×107个血小板)。在创伤部位周围缝了由硅橡胶制成的环，以防止创伤部位收缩。每3天测定创面大小，测定10天，分析其缩小率。将PBS施用组作为对照进行比较(n＝4)。
得到的结果示于图6。
与PBS组比较，MK/PLT施用组的创伤面积缩小率有高的倾向，观察到在第7天有显著性差异。该结果表明MMK/PLT可能促进创伤治愈。
实施例8
包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂的制备2
使用从不同于实施例1的iPS细胞株(MKCL21#)分化诱导的永生化巨核细胞株(NC13X)。将2.3x 107个NC13X细胞与实施例1同样地在强力霉素不存在下进行分化培养(Ito Y，Nakamura S等人，Cell 174(3)：636-648，2018))。将分化第6天的血小板和巨核细胞的细胞混合液离心分离，弃去培养上清，向得到的血小板和巨核细胞的混合物添加已灭菌的0.1％CaCl2的Tyrode缓冲液(23ml)。通过37℃孵育1小时来无菌地活化血小板和巨核细胞。活化的血小板和巨核细胞的混合液与实施例1-2同样地冷冻干燥处理，获得冷冻干燥制剂。
将获得的冷冻干燥制剂用蒸馏水稀释至作为分化培养开始时的NC13X细胞的1.0x106个细胞/ml浓度，通过ELISA测定PDGF、FGF、TGF-β和VEGF浓度。结果如[表4]所示。
[表4]
细胞因子浓度(ng/ml)
PDGF 15.99
FGF 2.12
TGF-β 57.82
VEGF 0.07
该结果表明，得到的冷冻干燥制剂含有足够量的主要细胞因子。
实施例9
包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂的骨癒合效果的确认2
与实施例2同样地制备了大鼠腰椎固定术模型，评价了实施例8制备的从iPS细胞来源的永生化巨核细胞株制备的包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂的骨癒合促进效果。具体地，使SD大鼠(n＝4)的腰椎横突起露出，分别向其右侧仅移植作为人工骨的羟基磷灰石胶原蛋白复合体Refit(Hoya Corporation，Tokyo，Japan)，向其左侧移植Refit和实施例8的冷冻干燥制剂的混合物，通过ImageJ测定和比较移植5周后，左右的新骨形成量。结果，移植了包含从iPS细胞来源的永生化巨核细胞株诱导的巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂的一侧，新骨形成量显著性増加(图7)。
该结果与实施例2的结果相结合表明，与iPS细胞株的种类无关，包含从iPS细胞来源的永生化巨核细胞株诱导的巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂均富含促进组织修复和骨形成的细胞因子，并具有优异的骨形成能力。
实施例10
巨核细胞和血小板的混合比率的分析
与实施例1同样地，将永生化巨核细胞株Clone 7在强力霉素不存在下进行分化培养(Ito Y，Nakamura S等人，Cell 174(3)：636-648，2018))，用流式细胞仪经时地测量培养物中成熟巨核细胞(CD41+)和血小板(CD41+CD42+)的数，计算血小板相对巨核细胞的比例。
图8显示了用流式细胞仪监测向血小板分化的结果，图9显示了用流式细胞仪监测向成熟巨核细胞分化的结果。基于图8和图9的结果，在图10中显示了数值化图。在此，分化培养后的血小板用“CD41+42+Plt”表示，成熟巨核细胞用“CD41+MK”表示。图10中各细胞数的具体数值在表5中显示。从分化的第0天到第6天，成熟巨核细胞的数量平缓地増加(图9、表5)。另一方面，血小板的数量直至第3天都非常少，但是在第4天之后急剧地增加(图8、表5)。在第4天，成熟巨核细胞的数量和血小板的数量几乎相同，但在第6天时相对于1个成熟巨核细胞数，血小板数是15个。表5显示了根据各流式细胞术及其图示的结果计算的血小板数相对于巨核细胞数的比例。
[表5]
第0天 第1天 第2天 第3天 第4天 第5天 第6天
Plt 1456 1502 5712 19818 129800 740515 2839530
MK 48224 130844 105846 103917 121055 105108 187193
[表6]
血小板数相对于巨核细胞数的比例
Figure BDA0003770686910000361
表6显示了作为巨核细胞和血小板个数的比率，相对于1×103个巨核细胞，包含2×102～1.5×104个血小板。
由这些结果表明了，随着分化的进行，血小板/巨核细胞的比例増加，通过改变分化天数，能够制备具有各种血小板/巨核细胞比例的冷冻干燥制剂，可以根据使用目的调整分化天数。
产业可利用性
根据本发明，通过冷冻干燥保存从包含iPS细胞的干细胞分化诱导的血小板衍生PRP，使得在需要时将其作为药物制剂提供成为可能。作为对未来的展望，如果开发出完全无抗原性的源自iPS细胞的FD-PRP，且可以对其他患者安全使用的话，则无需进行手术中的制备，其作为有效的新制剂而通用的可能性显著提高，能够期待整形外科领域和皮肤科领域的治疗会飞跃地发展。另外，由于对患者无侵袭和对医生无负担，用已有的制品化材料能够有效地促进骨折或脊椎手术中早期的骨癒合或皮肤修复，由此谋求显著改善患者的ADL和QOL，认为这对减少和减轻手术并发症、缩短住院时间所致的改善医疗经济等有大的贡献。此外，本发明中PRP强大的组织修复能力也可以用于现有技术中难以治疗的溃疡性难治创口、以及神经损伤、脊髓损伤等，预计本发明的组合物有望发展成为世界性的商业工业制品。

Claims (15)

1.冷冻干燥制剂，其包含巨核细胞和血小板。
2.根据权利要求1所述的冷冻干燥制剂，其中，巨核细胞和血小板是从干细胞体外分化诱导的。
3.根据权利要求1或2所述的冷冻干燥制剂，其中，干细胞是多能性干细胞或造血干细胞。
4.根据权利要求2或3所述的冷冻干燥制剂，其中，多能性干细胞是iPS细胞。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的冷冻干燥制剂，其进一步含有从巨核细胞和/或血小板释放的生长因子。
6.根据权利要求5所述的冷冻干燥制剂，其中，所述生长因子是选自由骨形成蛋白、血小板衍生生长因子、血小板衍生血管生成因子、转化生长因子、血管内皮细胞生长因子、上皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子、胰岛素样生长因子、和血小板因子IV组成的组中的至少一种因子。
7.用于促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病的药物组合物，其包含权利要求1至6中任一项所述的冷冻干燥制剂。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其包含促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病有效量的权利要求1至6中任一项所述的冷冻干燥制剂。
9.用于促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病的方法，所述方法包括将权利要求1至6中任一项所述的冷冻干燥制剂施用给需要这样处理的对象。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法包括将促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病有效量的权利要求1至6中任一项所述的冷冻干燥制剂施用给需要这样处理的对象。
11.权利要求1至6中任一项所述的冷冻干燥制剂，其用于促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病。
12.权利要求1至6中任一项所述的冷冻干燥制剂用于制备促进骨癒合或者治疗或预防皮肤疾病的药物的用途。
13.制备包含巨核细胞和血小板的冷冻干燥制剂的方法，所述方法的特征在于，
(A)制备血小板和巨核细胞的细胞混合液；和
(B)冷冻干燥血小板和巨核细胞的细胞混合液。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在步骤(A)中，巨核细胞是从干细胞分化诱导的永生化巨核细胞。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中活化步骤(A)中制备的细胞混合液。
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