JP6108426B2 - 血小板産生方法及び血小板産生装置 - Google Patents

Description

本発明は、血小板産生方法及び血小板産生装置に関し、特に、血小板の効率的な産生に関する。

血小板輸血には血小板製剤が使用される。血小板製剤は、一般に、献血により得られた血液から調製される。しかしながら、献血に依存する血小板製剤の供給量は、献血者の減少や、ウイルス感染症を患った献血者の増加による影響を受けやすい。

そこで、近年、献血に代わる血小板ソースの開発が注目されている。例えば、体性幹細胞である造血幹細胞（臍帯血幹細胞）をソースとして血小板を体外で大量に生産する技術の開発が進められた。しかしながら、造血幹細胞自体を体外で増幅する方法が未だ確立されていないため実用化には至っていない。

一方、多能性幹細胞である肺性幹（ＥＳ）細胞は、体外で無限に増殖させることができるという利点があるため、血小板を含む血液細胞を産生するソースとして注目されている。この点、非特許文献１においては、ヒトＥＳ細胞から成熟巨核球及び血小板を産生する技術が報告されている。

また、血小板の輸血においては、初回は患者のものと異なるヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を有する血小板を使用できるが、輸血を繰り返すと患者の体内でＨＬＡに対する特異的抗体が産生され、その結果、輸血した血小板が迅速に拒絶される血小板輸血不応に陥ってしまう。

これに対し、患者由来の人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から血小板を誘導できれば、理論的には拒絶を受けないオーダーメイドの血小板製剤を調製することが可能となり、血小板輸血を繰り返し行うことが容易となる。

しかしながら、例えば、血小板輸血を繰り返し受けなければならない患者が、特異的な遺伝子異常に伴う出血性疾患の患者である場合には、患者由来のｉＰＳ細胞から実際に血小板の産生が可能であるか不明であり、また、機能異常が維持されたままの血小板しか産生されない可能性もある。

そこで、健常人ドナーから得られた様々なＨＬＡタイプの血液（例えば、臍帯血バンクに保存されている臍帯血）からｉＰＳ細胞を樹立し、当該ｉＰＳ細胞から、さらに血小板の産生に適した株を選択して保存しておくことが考えられる。

こうしたｉＰＳ細胞バンクが実現すれば、患者に適合するＨＬＡタイプの血小板を体外で大量に産生し、繰り返しの輸血に使用可能な血小板製剤を安定して供給することが可能になると期待される。

この点、非特許文献２において、ヒトｉＰＳ細胞から巨核球を誘導し、さらに生体内で止血機能を発揮する血小板を産生する技術が報告されている。

Takayama, N. et al.: Blood. 111: 5298-5306, 2008 Takayama, N. et al.: Journal of Experimental Medicine. 207:2817-2830,2010

しかしながら、血小板製剤の安定的な供給を実現するために十分な量の血小板を体外で効率よく産生する技術は未だ確立されていない。

本発明は、上記課題に鑑みて為されたものであり、体外において血小板を効率よく産生する血小板産生方法及び血小板産生装置を提供することをその目的の一つとする。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る血小板産生方法は、巨核球を培養することにより血小板を産生する方法であって、（ａ）培養液が通過可能な多孔構造を有する保持部に前記巨核球を保持すること：及び（ｂ）前記保持部の一方側に設けられた前室部から、前記保持部の他方側に設けられた流路部へ、前記保持部を介して前記培養液を通過させながら前記巨核球を培養すること、を含むことを特徴とする。本発明によれば、体外において血小板を効率よく産生する血小板産生方法を提供することができる。

また、前記（ｂ）において、前記保持部を介して前記培養液を通過させるとともに、前記流路部の上流端部からも前記流路部に前記培養液を流入させながら、前記巨核球を培養することとしてもよい。

上記課題を解決するための本発明の一実施形態に係る血小板産生装置は、巨核球を培養することにより血小板を産生するための装置であって、前記巨核球を保持可能で且つ培養液が通過可能な多孔構造を有する保持部と、前記保持部の一方側及び他方側にそれぞれ設けられた前室部及び流路部と、を備え、前記前室部から前記流路部へ、前記巨核球を保持した前記保持部を介して前記培養液を通過させながら、前記巨核球を培養することを特徴とする。本発明によれば、体外において血小板を効率よく産生する血小板産生装置を提供することができる。

また、前記血小板産生装置は、前記巨核球の培養中に、前記前室部から前記流路部へ、前記巨核球を保持した前記保持部を介して前記培養液を通過させるための外部流路部をさらに備えることとしてもよい。

また、前記血小板産生装置においては、前記巨核球を保持した前記保持部を介して前記培養液を通過させるとともに、前記流路部の上流端部からも前記流路部に前記培養液を流入させながら、前記巨核球を培養することとしてもよい。この場合、前記血小板産生装置は、前記巨核球の培養中に、前記巨核球を保持した前記保持部を介して前記培養液を通過させるとともに、前記流路部の上流端部からも前記流路部に前記培養液を流入させるための外部流路部をさらに備えることとしてもよい。

本発明によれば、体外において血小板を効率よく産生する血小板産生方法及び血小板産生装置を提供することができる。

本発明の一実施形態に係る血小板産生装置の主な構成及び当該血小板産生装置を使用した血小板産生方法の一例を模式的に示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る血小板産生装置の一例の培養開始前の主な構成を模式的に示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る血小板産生装置の一例への巨核球の播種を模式的に示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る血小板産生装置の他の例の主な構成及び当該血小板産生装置を使用した血小板産生方法を模式的に示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例において使用した血小板産生装置及び当該血小板産生装置を使用した血小板産生方法を模式的に示す説明図である。 図５に示す血小板産生装置を使用して血小板を産生した結果の一例を示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例２において使用した血小板産生装置を模式的に示す説明図である。 図７に示す血小板産生装置のＶＩＩＩ部分を拡大して模式的に示す説明図である。 図８に示すＩＸ−ＩＸ線で切断した血小板産生装置の断面を模式的に示す説明図である。 本発明の一実施形態に係る実施例３において使用した血小板産生装置を模式的に示す説明図である。 図１０に示す血小板産生装置のＸＩ部分を拡大して模式的に示す説明図である。 図１０及び図１１に示す血小板産生装置を使用して血小板を産生した結果の一例を示す説明図である。

以下に、本発明の一実施形態について説明する。なお、本発明は、本実施形態に限られるものではない。

まず、本実施形態に係る血小板産生方法（以下、「本方法」という。）及び血小板産生装置（以下、「本装置」という。）の概要について説明する。

図１は、本装置１の主な構成及び本装置１を使用した本方法の一例を模式的に示す説明図である。図２は、本装置１の培養開始前の主な構成を模式的に示す説明図である。図３は、本装置１への巨核球Ｍの播種を模式的に示す説明図である。図４は、本装置１の主な構成及び本装置１を使用した本方法の他の例を模式的に示す説明図である。

本方法は、図１及び図４に示すように、巨核球Ｍを培養することにより血小板Ｐを産生する方法であって、（ａ）培養液が通過可能な多孔構造を有する保持部１０に巨核球Ｍを保持すること：及び（ｂ）保持部１０の一方側に設けられた前室部２０から、保持部１０の他方側に設けられた流路部３０へ、保持部１０を介して培養液を通過させながら巨核球Ｍを培養すること、を含む。

すなわち、本方法は、培養液を流しながら巨核球Ｍを培養する連続培養系において、巨核球Ｍを培養液が通過可能な多孔構造を有する保持部１０に保持するとともに、図１及び図４において矢印Ｆ１で示すように、保持部１０の一方側から他方側に向けて、保持部１０内に培養液を通過させながら巨核球Ｍを培養することにより、巨核球Ｍから血小板Ｐを産生する方法である。

本装置１は、図１〜図４に示すように、巨核球Ｍを培養することにより血小板Ｐを産生するための装置１であって、巨核球Ｍを保持可能で且つ培養液が通過可能な多孔構造を有する保持部１０と、保持部１０の一方側及び他方側にそれぞれ設けられた前室部２０及び流路部３０と、を備え、前室部２０から流路部３０へ、巨核球Ｍを保持した保持部１０を介して培養液を通過させながら巨核球Ｍを培養する。

すなわち、本装置１は、内部に培養液を流しながら巨核球Ｍを培養する連続培養装置であって、保持部１０に巨核球Ｍを保持するとともに、図１及び図４において矢印Ｆ１で示すように、前室部２０から流路部３０に向けて、保持部１０内に培養液を通過させながら巨核球Ｍを培養することにより、巨核球Ｍから血小板Ｐを産生する装置である。本装置１は、本方法の実施に好ましく使用される。

なお、保持部１０を介して流路部３０に流出した培養液、及び保持部１０に保持された巨核球Ｍから産生された血小板Ｐは、図１において矢印Ｆ２及び図４において矢印Ｆ３で示すように、流路部３０を下流側に流れて、その下流端部３１から回収される。

ここで、培養液を流しながら巨核球Ｍを培養する方法としては、例えば、巨核球Ｍが保持された保持部１０の一方側のみ（例えば、流路部３０のみ）に培養液を流す方法も考えられる。

しかしながら、本発明の発明者らが独自に検討を行った結果、流路部３０のみに培養液を流す場合には、流路部３０から保持部１０内へ、及び流路部３０から保持部１０を介して前室部２０へも培養液が流れてしまい、巨核球Ｍから産生された血小板Ｐを流路部３０から効率よく回収できないことがあった。すなわち、この場合、保持部１０に保持された巨核球Ｍから産生された血小板Ｐの一部は、前室部２０に漏出してしまい、流路部３０の下流端部３１からは回収できなかった。

この点、血小板製剤の安定的な供給を実現するためには、巨核球Ｍから産生された血小板Ｐの回収効率を可能な限り高めることが重要である。

そこで、発明者らは、上記課題を解決する技術的手段について独自に鋭意検討を重ねた結果、前室部２０から流路部３０へ、巨核球Ｍを保持した保持部１０を介して培養液を通過させながら当該巨核球Ｍを培養することにより、当該巨核球Ｍから産生された血小板Ｐの前室部２０への漏出を効果的に抑制して、当該血小板Ｐを効率よく回収できることを見出した。

また、保持部１０を介して培養液を通過させることによって、当該保持部１０に保持されている巨核球Ｍに、培養液の流れによるせん断応力を負荷することもできる。この点、巨核球Ｍは本来、生体内（骨髄内）で血液の流れによるせん断応力を受けている。したがって、同様に保持部１０内で巨核球Ｍにせん断応力を負荷することにより、生体内の環境を模倣した培養環境を形成し、巨核球Ｍによる血小板Ｐの産生を促進することができる。

このように、本方法及び本装置１によれば、巨核球Ｍによる血小板Ｐの産生を効果的に促進するとともに、巨核球Ｍから産生された血小板Ｐを効率的に回収することができる。

次に、本方法及び本装置１の詳細について説明する。保持部１０は、前室部２０と流路部３０との間に設けられ、巨核球Ｍを保持可能で且つ培養液が通過可能な多孔構造を有する構造体であれば特に限られない。

保持部１０は、その多孔構造に巨核球Ｍを収容可能な孔が形成されることにより、巨核球Ｍを保持可能となっている。すなわち、この多孔構造には、巨核球Ｍを収容可能なサイズ及び形状の孔が多数形成されている。

そして、例えば、保持部１０の多孔構造に、巨核球Ｍが接着可能な接着分子を塗布することにより、巨核球Ｍを当該多孔構造に確実に保持することができる。接着分子は、巨核球Ｍの細胞膜表面に存在する分子と結合可能な分子であれば特に限られず、例えば、フィブロネクチン、ＶＣＡＭ−１、ビトロネクチン、コラーゲン、オステオポンチン及びラミニンからなる群より選択される１種以上が挙げられる。

また、保持部１０は、その多孔構造に、その一方側（前室部２０側）から他方側（流路部３０側）まで連通する孔が形成されることにより、培養液が通過可能となっている。

また、保持部１０は、例えば、その前室部２０側に巨核球Ｍが通過できる開口が形成され、その流路部３０側に当該巨核球Ｍが通過できない開口が形成された多孔構造を有することとしてもよい。

具体的に、保持部１０は、例えば、特開２００９−１１９２０６号公報に記載されているような、いわゆるソルトリーチング法により形成された多孔構造を有する多孔性担体であることとしてもよい。また、保持部１０は、例えば、発泡成形により形成された多孔構造を有する多孔性担体であることとしてもよい。

また、保持部１０は、複数の多孔性担体を積層することにより形成された多孔性担体であることとしてもよい。すなわち、例えば、巨核球Ｍを収容可能なサイズ及び形状の孔が形成された第一の多孔性担体と、当該巨核球Ｍが通過できないサイズ及び形状の孔が形成された第二の多孔性担体と、を有する多孔性積層体であることとしてもよい。この場合、前室部２０側の第一の多孔性担体に巨核球Ｍを保持しつつ、流路部３０側の第二の多孔性担体によって当該巨核球Ｍの漏出を効果的に防止することができる。

また、保持部１０は、例えば、有機繊維及び／又は無機繊維により形成された多孔構造を有する繊維体（例えば、不織布又は織布）であることとしてもよい。また、保持部１０は、巨核球Ｍを収容可能な繊維密度の第一の繊維体と、当該巨核球Ｍが通過できない繊維密度の第二の繊維体と、を有する積層繊維体であることとしてもよい。この場合、前室部２０側の第一の繊維体に巨核球Ｍを保持しつつ、流路部３０側の第二の繊維体によって当該巨核球Ｍの漏出を効果的に防止することができる。

また、保持部１０は、フォトリソグラフィ等の微細加工により形成された多孔構造を有する構造体であることとしてもよい。この場合、孔のサイズ及び形状等の条件を厳密に制御できるため、例えば、巨核球Ｍを収容可能であって且つ巨核球Ｍの漏出を効果的に防止できる多孔構造を確実に作製することができる。

前室部２０及び流路部３０は、保持部１０を介して連通するよう当該保持部１０の一方側及び他方側にそれぞれ設けられた部屋であれば特に限られない。前室部２０は、図１〜図４に示すように、培養液を当該前室部２０に流入させるための開口が形成された上流端部２１を有している。流路部３０は、図１〜図４に示すように、培養液及び巨核球Ｍから産生された血小板Ｐを当該流路部３０から回収するための開口が形成された下流端部３１を有している。

なお、本装置１及び本装置１を構成する部分の形状及び数は、本実施形態で示す例に限られない。すなわち、例えば、本装置１が有する保持部１、前室部２０及び流路部３０の形状及び数は、図１〜図４に示す例に限られない。また、保持部１０は、例えば、平板状又はシート状の構造体であることとしてもよく、筒状の構造体であることとしてもよいが、これらに限られない。本装置１の外形状は、平板状又はシート状の保持部１０を含む箱形状であることとしてもよく、筒状の保持部１０を含む筒状であることとしてもよいが、これらに限られない。

巨核球Ｍは、培養することにより血小板Ｐを産生できるものであれば特に限られない。すなわち、巨核球Ｍは、例えば、ＣＤ４２ａ陽性及びＣＤ４２ｂ陽性の多核化した血球系細胞として特定され、より具体的には、ＣＤ４１ａ陽性、ＣＤ４２ａ陽性及びＣＤ４２ｂ陽性の血球系細胞として特定される。また、血小板を放出する直前の成熟した巨核球Ｍは、さらにｖＷＦ（ｖｏｎ Ｗｉｌｌｅｂｒａｎｄ ｆａｃｔｏｒ）陽性の血球系細胞として特定される。すなわち、巨核球Ｍは、成熟することでｖＷＦを発現し、このｖＷＦが細胞核周囲から細胞膜周囲へ移動することにより、血小板を放出する準備が整う（Eto K, Nishikii H, Ogaeri T, Suetsugu S, Kamiya A, Kobayashi T, Yamazaki D, Oda A, Takenawa T, Nakauchi H. Blood 110, 3637-3647 (2007).）。巨核球Ｍは、ヒトの巨核球であることが好ましいが、ヒト以外の動物の巨核球であってもよい。

ヒト巨核球Ｍは、ヒトｉＰＳ細胞又はヒトＥＳ細胞に由来する巨核球であることが好ましいが、これに限られず、例えば、健常人ドナー又は患者から得られた造血幹細胞（例えば、臍帯血幹細胞）に由来する巨核球であってもよい。

保持部１０への巨核球Ｍの保持は、例えば、上述した巨核球Ｍを保持部１０に播種することにより行うことができる。巨核球Ｍを播種する方法は、保持部１０に巨核球Ｍを保持できるものであれば特に限られないが、例えば、図３に示すように、巨核球Ｍを含む培養液Ｌを前室部２０に流入させ、当該培養液Ｌを前室部２０から流路部３０へ保持部１０を介して通過させる方法が挙げられる。

すなわち、この場合、例えば、まず、図２に示すように、保持部１０、前室部２０及び流路部３０を有する本装置１を準備し、次いで、図３に示すように、当該本装置１に、ポンプ等の送液部５０を含む播種用流路部７０を接続する。

そして、図３に示すように、播種用流路部７０を介して、巨核球Ｍを含む培養液Ｌを前室部２０に流入させ、当該培養液Ｌを前室部２０から流路部３０へ保持部１０を介して通過させることにより、当該巨核球Ｍを保持部１０に捕捉する。こうして、巨核球Ｍを保持部１０に保持することができる。

なお、巨核球Ｍを保持部１０に播種する方法は、上述の例に限られず、例えば、巨核球Ｍを含む培養液Ｌ中に保持部１０を浸漬することとしてもよい。この場合、例えば、培養液Ｌ中において、重力の作用により、前室部２０から保持部１０内に巨核球Ｍを沈降させることにより、当該巨核球Ｍを保持部１０に容易に保持することができる。また、保持部１０の多孔構造に、上述したような接着分子を予め塗布しておくことにより、保持部１０に巨核球Ｍを効率よく保持することができる。

保持部１０への巨核球Ｍの保持は、例えば、当該巨核球Ｍの前駆細胞を保持部１０に播種し、続いて当当該前駆細胞を培養することにより、当該前駆細胞を当該巨核球Ｍに分化させることにより行うこととしてもよい。

すなわち、この場合、まず、上述した巨核球Ｍの播種と同様の方法で、前駆細胞を保持部１０に播種する。次いで、前駆細胞を保持部１０で培養することにより、当該前駆細胞の分化により生成された、保持部１０に保持された巨核球Ｍが得られる。

前駆細胞は、培養することにより分化して、血小板Ｐを産生可能なより成熟した状態に変化した巨核球Ｍを生成するものであれば特に限られない。すなわち、前駆細胞としては、例えば、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、造血幹細胞、巨核球赤芽球前駆細胞、巨核球系前駆細胞、巨核芽球、前巨核球、単核又は４ｎ以下の多核を有するＣＤ４２ｂ陽性細胞を使用することができ、特に、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞又はこれらに由来する細胞を好ましく使用することができる。

なお、前駆細胞から巨核球Ｍを分化誘導する培養においては、サイトカイン等の適切な成分を含む培養液を使用する。すなわち、例えば、ヒトｉＰＳ細胞から巨核球Ｍ又は当該巨核球Ｍの前駆細胞を分化誘導する場合には、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＳＣＦ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｆａｃｔｏｒ）及びヘパリンが添加された培養液を使用することが好ましい。

巨核球Ｍ又はその前駆細胞は、株化細胞（不死化細胞）であってもよいし、初代細胞であってもよい。すなわち、例えば、ヒトｉＰＳ細胞由来の巨核球細胞株を使用することができ、より具体的には、ヒトｉＰＳ細胞由来であって、ＣＤ４１ａ陽性及びＣＤ４２ｂ陽性、又はＣＤ４１ａ陽性、ＣＤ４２ａ陽性及びＣＤ４２ｂ陽性である、単核、２ｎ核又は４ｎ核を有する巨核球細胞株を使用することができる（国際出願ＰＣＴ／２０１０／０６５９０３（ＷＯ２０１１／０３４０７３）参照）。

そして、本方法及び本装置１においては、上述のとおり、前室部２０から流路部３０へ、巨核球Ｍを保持した保持部１０を介して培養液を通過させながら当該巨核球Ｍを培養する。すなわち、巨核球Ｍを培養して血小板Ｐを産生する間、図１及び図４において矢印Ｆ１で示すように、前室部２０側から流路部３０側に向けて、当該巨核球Ｍが保持されている保持部１０の内部に培養液を流す。この矢印Ｆ１で示す流れによって、保持部１０に保持された巨核球Ｍから産生された血小板Ｐを流路部３０に効率よく放出させることができる。

また、保持部１０に保持された巨核球Ｍに、矢印Ｆ１で示す培養液の流れを接触させることにより、巨核球Ｍを培養して血小板Ｐを産生する間、当該巨核球Ｍに当該流れによるせん断応力を負荷することができる。この生体内の環境を模倣したせん断応力の負荷によって、巨核球Ｍによる血小板Ｐの産生を効果的に促進することができる。

そして、図１において矢印Ｆ２及び図４において矢印Ｆ３で示すように、流出部３０に流出した培養液及び血小板Ｐは、当該流出部３０内を下流側に流れ、当該流出部３０の下流端部３１から回収される。

このように、本方法及び本装置１においては、巨核球Ｍから血小板Ｐを効率よく産生するとともに、当該産生された血小板Ｐを効率よく回収することができる。

図１及び図４に示す例において、本装置１は、巨核球Ｍの培養中に、前室部２０から流路部３０へ、当該巨核球Ｍを保持した保持部１０を介して培養液を通過させるための外部流路部４０をさらに備えている。

この外部流路部４０は、流出部３０の下流端部３１と前室部２０の上流端部２１とを接続して、巨核球Ｍを培養して血小板Ｐを産生する間、培養液を循環させる。外部流路部４０は、前室部２０に培養液を流入させるための流入流路部４１と、流路部３０から当該培養液及び血小板Ｐを回収するための流出流路部４２と、を含む。

流入流路部４１の下流端は前室部２０の上流端部２１に接続され、流出流路部４２の上流端は流路部３０の下流端部３１に接続されている。流入流路部４１及び流出流路部４２は、例えば、内部に培養液を流すことのできる筒状構造体（例えば、樹脂製のチューブ）から構成される。

また、図１及び図４に示す例において、外部流路部４０は、当該外部流路部４０に培養液を流すための動力を発生させる送液部５０と、当該培養液を貯留するためのリザーバ−部６０と、を含む。流入流路部４１の上流端及び流出流路部４２の下流端は、リザーバ−部６０に接続されている。リザーバ−部６０は、培養液を貯留できる容器であれば特に限られず、例えば、ガラス製又は樹脂製のタンクを好ましく使用することができる。

送液部５０は、外部流路部４０に培養液を流すための動力を発生させるものであれば特に限られず、例えば、培養液を圧送するためのポンプである。ポンプとしては、生体の血管内における血流と同様の脈流を発生させるものを好ましく使用することができる。

本方法及び本装置１においては、図４に示すように、前室部２０から流路部３０へ保持部１０を介して培養液を通過させるとともに、流路部３０の上流端部３２からも当該流路部３０に培養液を流入させながら、当該巨核球Ｍを培養することとしてもよい。

すなわち、この場合、図４において矢印Ｆ１で示すような保持部１０を介した培養液の流れに加えて、図４において矢印Ｆ３で示すような流路部３０の上流端部３２から下流端部３１への培養液の流れを形成する。

そして、前室部２０から流路部３０に流入した培養液と、上流端部３２から流路部３０に流入した培養液と、は合流して当該流路部３０の下流側に流れ、その下流端部３１から流出する。

ここで、流路部３０の上流端部３２から下流端部３１への培養液の流れを追加することにより、例えば、当該流路部３０内の流量を、保持部１０を介した培養液の流量よりも大きくすることができる。

このため、保持部１０を介した流れによって血小板Ｐの前室部２０への漏出を効果的に抑制しつつ、流路部３０の下流端部３１から当該血小板Ｐを効率よく回収することができる。また、保持部１０に保持された巨核球Ｍに対して、より効果的にせん断応力を負荷することもできる。

生体内においては、血液の脈流及び脈圧による血流速度、血圧及びせん断応力等の血管内環境の瞬間的な変化によって、血小板の放出が促進されていると推測される。この点、本方法及び本装置１においては、保持部１０を介した流れと、流路部３０の上流端部３２から下流端部３１への流れとの２方向流れによって、生体内に類似した流速、圧力及びせん断応力の変化を人為的に（例えば、ポンプの使用等による機械的手段によって）発生させ、局所における血小板Ｐの滞留を効果的に防止することができる。この結果、巨核球Ｍから放出された血小板Ｐを効率よく回収することができる。

図４に示す例において、本装置１は、巨核球Ｍの培養中に、当該巨核球Ｍを保持した保持部１０を介して培養液を通過させるとともに、流路部３０の上流端部３２からも当該流路部３０に当該培養液を流入させるための外部流路部４０をさらに備えている。

この外部流路部４０は、流出部３０の下流端部３１と、前室部２０の上流端部２１及び流路部３０の上流端部３２と、を接続して、巨核球Ｍを培養して血小板Ｐを産生する間、培養液を循環させる。

外部流路部４０は、前室部２０に培養液を流入させるための第一流入流路部４１ａと、流路部３０の上流端部３２から当該流路部３０に培養液を流入させるための第二流入流路部４１ｂと、流路部３０から培養液及び血小板Ｐを回収するための流出流路部４２と、を含む。

第一流入流路部４１ａの下流端は前室部２０の上流端部２１に接続され、第二流入流路部４１ｂの下流端は流路部３０の上流端部３２に接続され、流出流路部４２の上流端は流路部３０の下流端部３１に接続されている。

また、図４に示す例において、外部流路部４０は、第一流入流路部４１ａに培養液を流すための動力を発生させる第一送液部５０ａと、第二流入流路部４１ｂに培養液を流すための動力を発生させる第二送液部５０ｂと、当該培養液を貯留するためのリザーバ−部６０と、を含む。第一流入流路部４１ａの上流端、第二流入流路部４１ｂの上流端及び流出流路部４２の下流端は、リザーバ−部６０に接続されている。

この外部流路部４０においては、互いに独立した２つの送液部５０ａ，５０ｂによって、前室部２０への培養液の流入条件と、流路部３０の上流端部３２への培養液の流入条件と、を互いに独立に設定することができる。

次に、本実施形態に係る具体的な実施例について説明する。

［実施例１］
図５は、実施例１において使用した血小板産生装置１００及び当該血小板産生装置１００を使用した血小板産生方法を模式的に示す説明図である。実施例１においては、図５に示すように、巨核球Ｍを保持可能で且つ培養液が通過可能な多孔構造を有する第一多孔性担体１１１と、血管内皮細胞Ｅを保持可能で且つ培養液が通過可能な第二多孔性担体１１２と、を積層することにより形成された積層担体１１０と、当該積層担体１１０の第一多孔性担体１１１側に設けられたチャンバー１２０と、当該積層担体１１０の第二多孔性担体１１２側に設けられた流路１３０と、を備えた血小板産生装置１００を作製した。

積層担体１１０は、特開２００９−１１９２０６号公報に記載されているソルトリーチング法により作製した。すなわち、生体適合性の高い樹脂であるＰＬＣＬ（ｐｏｌｙ−Ｌ−ｌａｃｔｉｄｅ−ｃｏ−ｉｐｓｉｌｏｎ−ｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ）と、直径が５０〜１０６μｍのＮａＣｌ粒子と、をクロロホルムに溶解して調製した溶液をシート状の型内で硬化させ、次いで、得られたシートから当該ＮａＣｌ粒子を溶出することにより、厚さが約５０〜１０００μｍ、平均孔径が３０μｍ以上のシート状の第一多孔性担体１１１を得た。すなわち、この第一多孔性担体１１１は、巨核球Ｍを収容可能な多孔構造を有していた。

また、同様に、ＮａＣｌ粒子として、直径が２３μｍ以下のものを使用して、厚さが約５０〜１０００μｍ、平均孔径が１０μｍ以下のシート状の第二多孔性担体１１２を得た。すなわち、この第二多孔性担体１１２は、血管内皮細胞Ｅを収容可能で且つ巨核球Ｍは通過できない多孔構造を有していた。

一方、直径７．０ｍｍ、高さ２．０ｃｍのチャンバー１２０と、幅５．０ｍｍ、高さ０．３ｍｍの流路１３０と、をＰＤＭＳ（ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ）の成形により作製した。

巨核球Ｍとしては、ヒトｉＰＳ細胞由来の不死化巨核球細胞株（国際出願ＰＣＴ／２０１０／０６５９０３（ＷＯ２０１１／０３４０７３）参照）を使用した。また、血管内皮細胞Ｅとしては、ヒト臍帯静脈内皮細胞（Ｈｕｍａｎ Ｕｍｂｉｌｉｃａｌ Ｖｅｉｎ Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ Ｃｅｌｌ：ＨＵＶＥＣ、ＫＵＲＡＢＯ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ. Ｌｔｄ.）を使用した。

そして、まず、予めＩ型コラーゲンが塗布された第二多孔性担体１１２に血管内皮細胞Ｅを播種し、２４時間インキュベーションすることにより、当該血管内皮細胞Ｅを当該第二多孔性担体１１２に接着させた。

その後、この第二多孔性担体１１２に第一多孔性担体１１１を積層して積層担体１１０を形成し、当該積層担体１１０、チャンバー１２０及び流路１３０を図５に示すように組み立てた。

さらに、図５に示すように、ローラーポンプ１５０と、ガラス製容器からなるリザーバ−１６０と、フッ素樹脂（ＰＦＡ）製チューブと、を含む外部流路１４０を形成した。外部流路部１４０の一方端は流路１３０の上流端１３１に接続され、他方端は当該流路１３０の下流端１３２に接続された。

次に、巨核球Ｍを含む培養液をチャンバー１２０内に流入させることによって、当該巨核球Ｍを第一多孔性担体１１１に播種し、１２時間インキュベーションすることにより、当該巨核球Ｍを第一多孔性担体１１１に保持した。こうして、生体内の骨髄血管構造を模倣した血小板産生装置１００を作製した。

その後、ローラーポンプ１５０を駆動させることにより、リザーバ−１６０内の培養液を、流路１３０の上流端１３１から下流端１３２に流しながら循環させることにより、巨核球Ｍと血管内皮細胞Ｅとの共培養を行った。

培養液としては、基礎培地ＩＭＤＭ（Ｓｉｇｍａ、Ｉ３３９０）に、１５％のＦＢＳ(ニチレイ)、５０ｍｇ／ｍｌのＡｓｃｏｒｂｉｃ ａｃｉｄ（Ｓｉｇｍａ、Ａ−４５４４）、２ｍＭのＬ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２５０３０）、１ｘＩＴＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｉ３１４６：１０μｇ／ｍｌのｈｕｍａｎ ｉｎｓｕｌｉｎ、５．５μｇ／ｍｌのｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ、５ｎｇ／ｍｌのｓｏｄｉｕｍ ｓｅｌｅｎｉｔｅ）、０．４５ｍＭのＭＴＧ（Ｓｉｇｍａ、Ｍ６１４５）、５０ｎｇ／ｍｌのＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍｌのＴＰＯ及び２５Ｕ／ｍｌのｈｅｐａｒｉｎを添加して調製された培養液を使用した（Takayama et al., Blood, 2008; Takayama et al., Journal of Experimental Medicine, 2010）。培養は、５％ＣＯ_２／９５％ａｉｒの雰囲気下、３７℃で２４時間行った。なお、流路１３０内のせん断応力は、当該流路１３０のアスペクト比が１：１６であることから、当該流路１３０内の培養液の流れを平板間流れと仮定し、次の式；τ＝６μＱ／ａｂ^２（τ：せん断応力、μ：培養液の粘度（Ｐａ・ｓ）、ａ：流路１３０の幅（５ｍｍ）、ｂ：流路１３０の高さ（０．３ｍｍ））から算出したところ、０．１４ｄｙｎｅ／ｃｍ^２であった。

２４時間の連続培養後、チャンバー１２０内の培養液を回収し、当該培養液中に含まれる血小板の数を、当該チャンバー１２０内の血小板数として計測した。一方、本装置１のチャンバー１２０以外の部分（流路１３０及び外部流路１４０を含む）からも培養液を回収し、当該培養液中に含まれる血小板の数を、リザーバ−１６０内の血小板数として計測した。

血小板数は、蛍光標識抗ＣＤ４１ａ抗体（ＣＤ４１ａ−ＡＰＣ）及び蛍光標識抗ＣＤ４２ａ抗体（ＣＤ４２ａ−ＦＩＴＣ）を使用したフローサイトメトリーにより測定した。

また、比較のために、培養液を流さない以外は同様にして、血小板産生装置１００における巨核球Ｍ及び血管内皮細胞Ｅの静置培養も行い、血小板数を測定した。

図６に、血小板数を評価した結果を示す。すなわち、図６には、静置培養及び連続培養のそれぞれにおいて、チャンバー１２０内の血小板数（白抜き棒グラフ）及びリザーバ−１３０内の血小板数（黒塗り棒グラフ）を評価した結果を示す。

図６に示すように、血小板産生装置１００において産生された血小板の数は、連続培養した場合の方が、静置培養した場合に比べて顕著に大きかった。すなわち、連続培養を行うことによって、静置培養に比べて巨核球Ｍから産生される血小板の数が増加することが確認された。

このように血小板の産生が促進された原因の一つとしては、流路１３０内に培養液を流すことによって、積層担体１１０内の巨核球Ｍに適度なせん断応力を負荷できたことが考えられた。

ただし、図６に示すように、連続培養においては、チャンバー１２０から回収された血小板の数が、リザーバ−１３０から回収された血小板の数に比べて大きかった。これは、流路１３０の上流端１３１から下流端１３２にのみ培養液を流すことによって、当該流路１３０から積層担体１１０の内部及びチャンバー１２０への流れも形成されて、巨核球Ｍから産生された血小板の一部がチャンバー１２０に漏出したためと考えられた。

［実施例２］
図７は、実施例２において使用した血小板産生装置１を模式的に示す説明図である。図８は、図７に示す血小板産生装置１のＶＩＩＩ部分を拡大して模式的に示す説明図である。図９は、図８に示すＩＸ−ＩＸ線で切断した血小板産生装置１の断面を模式的に示す説明図である。

実施例２においては、フォトリソグラフィによって、図７〜図９に示すように、巨核球Ｍを保持可能で且つ培養液が流通可能な多孔構造を有する保持部１０と、当該保持部１０の一方側及び他方側にそれぞれ設けられた前室部２０及び流路部３０と、を備えた血小板産生装置１を作製した。

すなわち、まず、スピンコーティングによってシリコンウェハ上にレジスト（ＳＵ８−３０５０）を塗布した。次いで、このウェハ上に、図７に示すような流路パターンが形成されたクロムマスクを重ね合わせ、露光を行った。さらに、ウェハを現像し、純水によりリンスした。

こうしてウェハ上に形成されたパターンにＰＤＭＳを流し込み、硬化した。その後、硬化したＰＤＭＳをウェハから剥がし、プラズマイオンボンバーターによる浸水化処理を施した。そして、このＰＤＭＳをガラス基板上に貼り付けることにより、図７〜図９に示すような血小板産生装置１を作製した。

ここで、図８及び図９に示すように、保持部１０は、巨核球Ｍが通過できない一定の間隔で並んだ複数の柱状体１１を含む多孔構造を有していた。すなわち、複数の柱状体１１は、隣接する当該柱状体１１の間に、巨核球Ｍが通過できない孔１２が形成されるように、下板部８０（ＰＤＭＳ）と上板部８１（ガラス基板）との間に形成された。また、各柱状体１１の表面には、巨核球Ｍが接着可能な接着タンパク質であるＶＣＡＭ−１が塗布された。

また、図７には図示していないが、図１に示すように、シリンジポンプからなる送液部５０と、ガラス製容器からなるリザーバ−部６０と、シリコンチューブと、を含む外部流路４０を形成した。すなわち、外部流路部４０の一方端は前室部２０の上流端部２１に接続され、他方端は流路部３０の下流端部３１に接続された。

巨核球Ｍとしては、上述の実施例１と同様、ヒトｉＰＳ細胞由来の不死化巨核球細胞株を使用した。なお、培養の開始に先立って、巨核球Ｍの細胞核をヘキスト染色するとともに、その細胞質を蛍光標識抗ＣＤ４１ａ抗体（ＣＤ４１ａ−ＦＩＴＣ）により染色した。

そして、送液部５０を駆動させることにより、巨核球Ｍを含む培養液を前室部２０に流入させ、さらに保持部１０の孔１２内を通過させることによって、図８及び図９に示すように、当該巨核球Ｍを当該柱状体１１間（孔１２内）に捕捉した。さらに、その後、巨核球Ｍを保持部１０で１時間静置培養することにより、当該巨核球Ｍを、予めＶＣＡＭ−１が塗布された柱状体１１の表面に接着させた。

その後、再び送液部５０を駆動させ、前室部２０から流路部３０へ、巨核球Ｍを保持した保持部１０を介して、リザーバ−部６０内の培養液を通過させながら循環することにより、当該巨核球Ｍの連続培養を行った。

培養液としては、上述の実施例１で使用したものと同一組成の培養液を使用した。培養は、５％ＣＯ２／９５％ａｉｒの雰囲気下、３７℃で６時間行った。培養液の流量は、１．０ｍｌ／ｈであった。

そして、培養期間中、Ｔｉｍｅ−ｌａｐｓｅビデオにより、血小板産生装置１内の流れ環境下における巨核球Ｍの様子を観察した。その結果、培養開始から９０分が経過した時点で、巨核球Ｍの大きな変形が観察された。さらに、この変形の開始から３分が経過した時点から、巨核球Ｍの細胞質が培養液の流れによってちぎれ、血小板が産生される様子が観察された。

すなわち、巨核球Ｍが保持された保持部１０を介して培養液を通過させながら当該巨核球Ｍを培養することによって、当該巨核球Ｍから血小板Ｐを産生し、且つ産生された当該血小板Ｐを当該培養液の流れにのせて流路部３０に効率よく流出させることができた。

なお、実施例２では図７〜図９に示すような血小板産生装置１を使用したが、この例に限られず、巨核球Ｍを保持可能で且つ培養液が通過可能な保持部１０を使用して、当該保持部１０を介した培養液の流れを形成することにより、巨核球Ｍによる血小板Ｐの産生を効果的に促進するとともに、巨核球Ｍから産生された血小板Ｐを効率的に回収することができると考えられた。

［実施例３］
図１０は、実施例３において使用した血小板産生装置１を模式的に示す説明図である。図１１は、図１０に示す血小板産生装置１のＸＩ部分を拡大して模式的に示す説明図である。

実施例３においては、フォトリソグラフィによって、図１０及び図１１に示すように、巨核球Ｍを保持可能で且つ培養液が流通可能な多孔構造を有する保持部１０と、当該保持部１０の一方側及び他方側にそれぞれ設けられた前室部２０及び流路部３０と、を備えた血小板産生装置１を作製した。

すなわち、まず、スピンコーティングによってシリコンウェハ上にレジスト（ＳＵ８−３０５０）を塗布した。次いで、このウェハ上に、図１０に示すような流路パターンが形成されたクロムマスクを重ね合わせ、露光を行った。さらに、ウェハをディベロッパーにより現像し、純水によりリンスして、装置用の型（mold）を作製した。

この型にＰＤＭＳを流し込み、６０℃のオーブンに１時間静置することにより硬化した。その後、硬化したＰＤＭＳ成形体を型から剥がし、ガラス基板上に貼り付けることにより、図１０及び図１１に示すような血小板産生装置１を作製した。

ここで、図１１に示すように、保持部１０は、巨核球Ｍが通過できない一定の間隔で並んだ複数の柱状体１１を含む多孔構造を有していた。すなわち、複数の柱状体１１は、隣接する当該柱状体１１の間に、巨核球Ｍを保持可能であって、当該巨核球Ｍが流路部３０側に通過できない孔１２が形成されるように、ＰＤＭＳ成形体とガラス基板との間に形成された。隣接する２つの柱状体１１の流路部３０側の先端部間の距離は４μｍであった。

血小板産生装置１をエタノールに３０分浸漬し、さらにＵＶランプ下で風乾することにより滅菌した。滅菌後の血小板産生装置１を共焦点顕微鏡のインキュベータ内に設置し、培養システムと接続した。共焦点顕微鏡のインキュベータを稼働し、その温度を３７℃に安定させた。

なお、図１０には図示していないが、血小板産生装置１と接続された培養システムは、図４に示すように、シリンジポンプからなる第一送液部５０ａと、シリンジポンプからなる第二送液部５０ｂと、ガラス製容器からなるリザーバ−部６０と、シリコンチューブと、を含む外部流路４０を有していた。

巨核球Ｍとしては、上述の実施例１と同様、ヒトｉＰＳ細胞由来の不死化巨核球細胞株を使用した。なお、培養の開始に先立って、巨核球Ｍの細胞核をヘキスト染色するとともに、その細胞質を蛍光標識抗ＣＤ４１ａ抗体（ＣＤ４１ａ−ＦＩＴＣ）により染色した。

そして、まず、第一送液部５０ａを駆動させることにより、巨核球Ｍを含む培養液を前室部２０に流入させ、さらに保持部１０の孔１２内を通過させることによって、図１１に示すように、当該巨核球Ｍを柱状体１１間（孔１２内）に捕捉した。さらに、その後、巨核球Ｍを保持部１０で１時間静置培養することにより、当該巨核球Ｍを、柱状体１１の表面に接着させた。

その後、第一送液部５０ａを駆動させて、前室部２０から流路部３０へ、巨核球Ｍを保持した保持部１０を介して、リザーバ−部６０内の培養液を通過させるとともに、第二送液部５０ｂを駆動させて、当該流路部３０の上流端部３２からも当該流路部３０に当該培養液を流入させながら、当該巨核球Ｍの連続培養を行った。培養液は全てリザーバ−部６０に回収した。培養液としては、上述の実施例１で使用したものと同一組成の培養液を使用した。

培養終了後、回収された培養液にＡＣＤを１０倍希釈で加えて遠心チューブに移し、遠心した（９００ｒｐｍ×１０分）。上澄み液を新たな遠心チューブに回収し、遠心した（１５００ｒｐｍ×１０分）。上澄み液を吸引し除去した。

遠心チューブに残ったペレットに、ＣＤ４１ａ−ＡＰＣ、ＣＤ４２ｂ−ＰＥを各２ｍＬ加え、遮光して室温で３０分置いた。その後、ペレットをカウントチューブに入れ、ビーズと混合してよく撹拌し、フローサイトメトリーを行った。

なお、比較の対象として、ウェルプレート内に、上述の血小板産生装置１に播種した巨核球Ｍの数と同数の巨核球Ｍを播種し、静置培養を行った。そして、静置培養後の巨核球Ｍについても、上述と同様の操作を行った。

図１２には、静置培養と、血小板産生装置１を使用した連続培養とのそれぞれにおいてＣＤ４１ａ陽性細胞数及び血小板数を評価した結果を示す。図１２に示すように、連続培養を行うことによって、静置培養を行った場合に比べて、ＣＤ４１ａ陽性細胞数及び血小板数が顕著に増加することが示された。

すなわち、血小板産生装置１において、前室部２０から流路部３０へ、巨核球Ｍを保持した保持部１０を介して培養液を通過させることに加えて、当該流路部３０の上流端部３２からも当該流路部３０に培養液を流入させながら、当該巨核球Ｍを培養することにより、当該２方向の流れを形成せずに培養する場合に比べて、当該巨核球Ｍによる血小板Ｐの産生を効果的に促進し、当該巨核球Ｍから産生された当該血小板Ｐを効率的に回収することができることが確認された。

１ 血小板産生装置、１０ 保持部、１１ 柱状体、１２ 孔、２０ 前室部、２１ 上流端部、３０ 流路部、３１ 下流端部、３２ 上流端部、４０ 外部流路部、４１ 流入流路部、４１ａ 第一流入流路部、４１ｂ 第二流入流路部、４２ 流出流路部、５０ 送液部、５０ａ 第一送液部、５０ｂ 第二送液部、６０ リザーバー部、７０ 播種用流路部、８０ 下板部、８１ 上板部、１００ 血小板産生装置、１１０ 第一多孔質担体、１１１ 第二多孔質担体、１２０ チャンバー、１３０ 流路、１３１ 上流端、１３２ 下流端、１４１ 流入流路、１４２ 流出流路、１５０ ポンプ、１６０ リザーバ−、Ｍ 巨核球、Ｐ 血小板。

Claims (2)

1. 巨核球を培養することにより血小板を産生する方法であって、
   （ａ）培養液が通過可能な多孔構造を有する保持部に前記巨核球を保持すること：及び
   （ｂ）前記保持部の一方側に設けられた前室部から、前記保持部の他方側に設けられた流路部へ、前記保持部を介して前記培養液を通過させながら前記巨核球を培養すること、
   を含む
   ことを特徴とする血小板産生方法。
2. 前記（ｂ）において、前記保持部を介して前記培養液を通過させるとともに、前記流路部の上流端部からも前記流路部に前記培養液を流入させながら、前記巨核球を培養する
   ことを特徴とする請求項１に記載の血小板産生方法。

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