WO2022172960A1 - 成熟化剤 - Google Patents

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WO2022172960A1
WO2022172960A1 PCT/JP2022/005137 JP2022005137W WO2022172960A1 WO 2022172960 A1 WO2022172960 A1 WO 2022172960A1 JP 2022005137 W JP2022005137 W JP 2022005137W WO 2022172960 A1 WO2022172960 A1 WO 2022172960A1
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cell population
insulin
medium
culture
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秀行 日吉
則子 山添
太郎 豊田
周平 小長谷
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オリヅルセラピューティクス株式会社
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an insulin-producing cell population from pluripotent stem cells. More specifically, a pancreatic endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells and/or a cell population at a later stage of differentiation is treated with tubulin polymerization-promoting activity and/or depolymerization-inhibiting activity.
  • Non-Patent Document 1 Various techniques have been developed and reported so far to induce the differentiation of pluripotent stem cells into insulin-producing cell populations.
  • insulin-producing cell populations obtained by induction of differentiation contain various cells other than target cells such as insulin-producing cells.
  • the purpose of the present invention is to provide a novel method for inducing the differentiation of insulin-producing cell populations from pluripotent stem cells.
  • the present inventors have found that an insulin-producing cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells is subjected to extended culture using a basal medium to obtain the cell population. It was found that even non-target cells (proliferating non-endocrine cells) remaining slightly inside can be detected with high sensitivity.
  • the present inventors found that in the process of inducing an insulin-producing cell population from pluripotent stem cells, the pancreatic endocrine progenitor cell population and/or the cell population at a later stage of differentiation have tubulin polymerization-promoting activity and/or By culturing in a medium containing a compound having depolymerization inhibitory activity (hereinafter sometimes referred to as "microtubule inhibitor"), the non-target cells present in the resulting insulin-producing cell population can be reduced.
  • a compound having depolymerization inhibitory activity hereinafter sometimes referred to as "microtubule inhibitor”
  • a method for producing an insulin-producing cell population comprising: A method comprising culturing a pancreatic endocrine progenitor cell population and/or a cell population at a later stage of differentiation in a medium containing a compound having tubulin polymerization-promoting activity and/or depolymerization-inhibiting activity. .
  • a method for producing an insulin-producing cell population comprising: A method comprising culturing a pancreatic endocrine progenitor cell population and/or a cell population at a later stage of differentiation in a medium containing a compound having tubulin polymerization-promoting activity and/or depolymerization-inhibiting activity. .
  • the compound having tubulin polymerization-promoting activity and/or depolymerization-inhibiting activity is a compound selected from taxoid anticancer agents or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the pancreatic endocrine progenitor cell population to be treated and/or the cell population at a later stage of differentiation is produced by inducing differentiation of pluripotent stem cells of [1] to [5].
  • Culture medium [9] The culture medium of [7] or [8], wherein the compound having tubulin polymerization-promoting activity and/or depolymerization-inhibiting activity is docetaxel or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • EGF epidermal growth factor
  • a method for detecting non-endocrine cells in an insulin-producing cell population comprising culturing the insulin-producing cell population in a medium containing epidermal growth factor (EGF).
  • EGF epidermal growth factor
  • the method of [11], wherein the non-endocrine cells are CHGA-negative and PDX1-positive cells and/or CHGA-negative and PDX1-negative cells.
  • a method of removing non-endocrine cells comprising: A method comprising culturing a pancreatic endocrine progenitor cell population and/or a cell population at a later stage of differentiation in a medium containing a compound having tubulin polymerization-promoting activity and/or depolymerization-inhibiting activity. .
  • a culture medium for an insulin-producing cell population containing a growth factor which is used for detecting non-endocrine cells in the insulin-producing cell population.
  • EGF epidermal growth factor
  • a culture medium for an insulin-producing cell population containing EGF which is used to detect non-endocrine cells in the insulin-producing cell population.
  • a novel method for inducing the differentiation of insulin-producing cell populations from pluripotent stem cells can be provided.
  • an insulin-producing cell population with reduced contamination by unintended cells can be obtained.
  • FIG. 1 shows the results of analysis by flow cytometry of the expression of marker proteins (PDX1 and CHGA) in an insulin-producing cell population that has undergone extended culture in a basal medium containing epidermal growth factor (EGF).
  • FIG. 2 shows that insulin-producing cell populations obtained by treatment with Cisplatin or Docetaxel were subjected to extended culture in a basal medium containing EGF, and then expression of marker proteins (PDX1 and CHGA) in each cell population was examined by flow cytometry. Analyzed results and photographs of each cell population after extended culture are shown.
  • a control cell population was an insulin-producing cell population obtained without using either Cisplatin or Docetaxel, and similarly extended culture.
  • FIG. 1 shows the results of analysis by flow cytometry of the expression of marker proteins (PDX1 and CHGA) in an insulin-producing cell population that has undergone extended culture in a basal medium containing epidermal growth factor (EGF).
  • FIG. 2 shows that insulin-producing cell populations obtained by treatment with Cisplatin
  • FIG. 3 shows that insulin-producing cell populations obtained by treatment with Cisplatin or Docetaxel were subjected to extended culture in a basal medium containing EGF, and then the expression of marker proteins (PDX1 and Ki67) in each cell population was examined by flow cytometry. Analyzed results are shown.
  • a control cell population was an insulin-producing cell population obtained without using either Cisplatin or Docetaxel, and similarly extended culture.
  • FIG. 4 shows the results of flow cytometry analysis of the expression of marker proteins (INS and NKX6.1, and CHGA and Ki67) in insulin-producing cell populations obtained by treatment with Docetaxel.
  • the control cell population is an insulin-producing cell population obtained without Docetaxel.
  • FIG. 5 shows the expression of marker proteins (NKX6.1, C-peptide (insulin), PDX1, CHGA) in the cell population obtained 7 days after the start of (A) step 6) analyzed by flow cytometry.
  • B the insulin-producing cell population obtained by treatment with Docetaxel at step 6) from day 4 to 7 days after initiation or from step 6) from day 7 to 4 days after initiation, After extended culture in a medium, the results of analyzing the expression of marker proteins (PDX1 and CHGA) in each cell population by flow cytometry are shown.
  • the control cell population was an insulin-producing cell population obtained without using Docetaxel and similarly subjected to extended culture.
  • FIG. 6 shows insulin-deficient insulin-producing cell populations treated with Docetaxel (Docetaxel(+)) or insulin-producing cell populations prepared without the addition of Docetaxel (Docetaxel(-)) subcutaneously transplanted.
  • “about” or “approximately” means plus or minus 25%, 20%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, respectively, relative to a reference value. or values that fluctuate up to 1%.
  • the terms “about” or “approximately” denote a range plus or minus 15%, 10%, 5%, or 1%, respectively, relative to the reference value.
  • not using feeder cells basically means not containing feeder cells and not using a medium preconditioned by culturing feeder cells. Therefore, the medium does not contain substances such as growth factors and cytokines secreted from feeder cells.
  • Feeder cells refer to cells that are co-cultured with other types of cells, support the cells, and provide an environment in which they can grow. Feeder cells may be from the same or a different species than the cells they support. For example, human dermal fibroblasts or human embryonic stem cells may be used as feeders for human cells, primary cultures of mouse embryonic fibroblasts, and immortalized mouse embryonic fibroblasts may be used. . Feeder cells can be inactivated such as by irradiation or mitomycin C treatment.
  • adheresion refers to the attachment of cells to a container, e.g., the attachment of cells to a sterile plastic (or coated plastic) cell culture dish or flask in the presence of an appropriate medium. It means that Some cells cannot be maintained or grow in culture unless they are attached to a cell culture vessel. In contrast, non-adherent cells can be maintained and grown in culture without adhering to vessels.
  • culturing refers to maintaining, growing, and/or differentiating cells in an in vitro environment. By “culturing” is meant sustaining, growing, and/or differentiating cells in a tissue or in vitro, eg, in a cell culture dish or flask. Culture includes two-dimensional culture (flat culture) and three-dimensional culture (suspension culture).
  • a composition such as a cell population
  • a composition can be enriched for a target cell type and thus the percentage of the target cell type compared to the percentage of target cells present within the cell population prior to enrichment.
  • Cell populations can also be enriched for target cell types by cell selection and sorting methods known in the art. Cell populations can also be enriched by certain sorting or selection processes described herein.
  • the method of enriching the target cell population results in the cell population enriching at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% with respect to the target cell population. , 90%, 95%, 97%, 98% or 99% enriched.
  • deplete and “depletion” refer to reducing the amount of a particular component in a composition, such as a composition of cells.
  • “depleted” when used to describe the composition of cells, e.g., a cell population is the proportion of a particular constituent in the cell population before the amount of such constituent is depleted refers to a cell population that is reduced compared to For example, a composition such as a cell population can be depleted for a target cell type such that the percentage of the target cell type is reduced compared to the percentage of target cells present within the cell population prior to depletion. .
  • Cell populations can also be depleted for target cell types by cell selection and sorting methods known in the art.
  • Cell populations can also be depleted by certain sorting or selection processes described herein.
  • the method of depleting a target cell population reduces the cell population by at least 50%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% or 99% with respect to the target cell population. (depleted).
  • purify and purification refer to removing impurities in a composition, such as that of cells, to make it pure with respect to a particular component.
  • Purified when used to describe the composition of a cell, e.g., a cell population, refers to the amount of impurities such constituents in the cell population prior to being purified. Refers to a cell population that has decreased relative to the proportion of , and increased purity of certain constituents.
  • a composition such as a cell population can be purified with respect to a target cell type, thus increasing the percentage of target cell type as compared to the percentage of target cells present within the cell population prior to purification.
  • Cell populations can also be purified for target cell types by cell selection and sorting methods known in the art. Cell populations can also be purified by certain sorting or selection processes described herein. In certain embodiments of the invention, the method of purifying the target cell population reduces the purity of the target cell population to at least 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% or 99%. or impurities (including contaminating cells) can be undetectable.
  • marker means a cell antigen or its gene that is specifically expressed by a given cell type, such as “marker protein” and “marker gene”.
  • the marker is a cell surface marker, in which case enrichment, isolation and/or detection of viable cells can be performed.
  • a marker can be a positively selectable marker or a negatively selectable marker.
  • Marker proteins can be detected using immunological assays using antibodies specific to the marker proteins, such as ELISA, immunostaining, and flow cytometry. Marker genes can be detected using nucleic acid amplification methods and/or nucleic acid detection methods known in the art, such as RT-PCR, microarrays, biochips, and the like.
  • the marker protein being “positive” means that it is detected as positive by flow cytometry, and “negative” means that it is below the detection limit by flow cytometry.
  • the marker gene being “positive” means that it is detected by RT-PCR, and “negative” means that it is below the detection limit of RT-PCR.
  • expression is defined as the transcription and/or translation of a specific nucleotide sequence driven by a promoter within a cell.
  • factor having CDK8/19 inhibitory activity means any substance having CDK8/19 inhibitory activity.
  • CDK8 is not required for cell proliferation and inhibition of CDK8 has no significant effect under normal conditions.
  • CDK19 and CDK8 are similar and inhibition of CDK8 is usually accompanied by inhibition of CDK19.
  • factors having CDK8/19 inhibitory activity include diethyl (E)-(4-(3-(5-(4-fluorophenyl)-1-methyl-1H-pyrazol-4-yl) acrylamido)benzyl)phosphonate, 2-(4-(4-(isoquinolin-4-yl)phenyl)-1H-pyrazol-1-yl)-N,N-dimethylacetamide, 4-((2-(6-( 4-methylpiperazine-1-carbonyl)naphthalen-2-yl)ethyl)amino)quinazoline-6-carbonitrile, 4-(4-(2,3-dihydrobenzo[b][1,4]dioxin-6- yl)-1H-pyrazol-3-yl)benzene-1,3-diol, 3-(2-(imidazo[1,2-b]pyridazin-6-ylthio)ethyl)-4-(naphthalen-1-yl)phosphon
  • Factors having CDK8/19 inhibitory activity are not limited to the above compounds, and antisense oligonucleotides and siRNA against CDK8/19 mRNA, antibodies that bind to CDK8/19, dominant-negative CDK8/19 mutants, etc. It can be used as a CDK8/19 inhibitor. Factors having CDK8/19 inhibitory activity or CDK8/19 inhibitors can be commercially available or synthesized according to known methods.
  • a “growth factor” is an endogenous protein that promotes differentiation and/or proliferation of specific cells.
  • “Growth factors” include, for example, epidermal growth factor (EGF), acidic fibroblast growth factor (aFGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), hepatocyte growth factor (HGF), insulin-like growth factor 1 (IGF-1), insulin-like growth factor 2 (IGF-2), keratinocyte growth factor (KGF), nerve growth factor (NGF), platelet-derived growth factor (PDGF), transforming growth factor beta (TGF- ⁇ ), vascular endothelial growth factor (VEGF), transferrin, various interleukins (eg IL-1 to IL-18), various colony stimulating factors (eg granulocyte/macrophage-colony stimulating factor (GM-CSF)), Various interferons, such as IFN- ⁇ , and other cytokines that have effects on stem cells, such as stem cell factor (SCF) and erythropoietin (EGF)
  • ROCK inhibitor means a substance that inhibits Rho kinase (ROCK: Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase), and is a substance that inhibits either ROCK I or ROCK II.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it has the above functions.
  • a “GSK3 ⁇ inhibitor” is a substance having inhibitory activity against GSK3 ⁇ (glycogen synthase kinase 3 ⁇ ).
  • GSK3 (glycogen synthase kinase 3) is a kind of serine/threonine protein kinase, and participates in many signal pathways involved in glycogen production, apoptosis, maintenance of stem cells, and the like. GSK3 exists in two isoforms, ⁇ and ⁇ .
  • the "GSK3 ⁇ inhibitor” used in the present invention is not particularly limited as long as it has GSK3 ⁇ inhibitory activity, and may be a substance having both GSK3 ⁇ inhibitory activity and GSK3 ⁇ inhibitory activity.
  • GSK3 ⁇ inhibitors include CHIR98014 (2-[[2-[(5-nitro-6-aminopyridin-2-yl)amino]ethyl]amino]-4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(1H -imidazol-1-yl)pyrimidine), CHIR99021 (6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl] amino]ethyl]amino]nicotinonitrile), TDZD-8 (4-benzyl-2-methyl-1,2,4-thiadiazolidine-3,5-dione), SB216763 (3-(2,4-dichlorophenyl )-4-(1-methyl-1H-indol-3-yl)-1H-pyrrole-2,5-dione), TWS-119 (3-[6-(3-aminophenyl)-7H
  • GSK3 ⁇ inhibitors are not limited to these, and antisense oligonucleotides and siRNA against GSK3 ⁇ mRNA, antibodies that bind to GSK3 ⁇ , dominant-negative GSK3 ⁇ mutants, and the like can also be used as GSK3 ⁇ inhibitors.
  • GSK3 ⁇ inhibitors are commercially available or can be synthesized according to known methods.
  • FGFR1 inhibitor is a substance that has inhibitory activity against at least fibroblast growth factor receptor (FGFR) 1.
  • FGFR1 is a member of the family of four transmembrane tyrosine kinases (FGFR1, 2, 3, 4) as a receptor with high affinity for the growth factors FGF1-FGF17.
  • FGFR1 inhibitor should have at least FGFR1 inhibitory activity, and may have inhibitory activity against other FGFRs.
  • the term "FGFR1 inhibitor” may be an FGFR2 inhibitor, an FGFR3 inhibitor, an FGFR4 inhibitor, etc., as long as they have FGFR1 inhibitory activity.
  • the FGFR1 inhibitor is PD-166866 (1-[2-amino-6-(3,5-dimethoxyphenyl)-pyrido(2,3-d)pyrimidin-7-yl]-3 -tert-butyl urea: CAS No.: 192705-79-6), E-3810 (CAS No.: 1058137-23-7), PD-173074 (CAS No.: 219580-11-7), FGFR4-IN- 1 (CAS No.: 1708971-72-5), FGFR-IN-1 (CAS No.: 1448169-71-8), FIIN-2 (CAS No.: 1633044-56-0), AZD4547 (CAS No.
  • PD168393 (CAS No.: 194423-15-9), Apatinib (CAS No.: 1218779-75-9), Palbociclib isethionate (CAS No.: 827022-33-3), Foretinib ( CAS No.: 849217-64-7), Lenvatinib (CAS No.: 417716-92-8), Tandutinib (CAS No.: 387867-13-2), etc., or salts thereof.
  • FGFR1 inhibitors are not limited to the compounds shown above, and antisense oligonucleotides and siRNA against FGFR1 mRNA, antibodies that bind to FGFR1, dominant-negative FGFR1 mutants, etc. can also be used as FGFR1 inhibitors. . FGFR1 inhibitors are commercially available or can be synthesized according to known methods.
  • serum replacement includes, for example, KnockOut TM Serum Replacement (KSR: Thermo Fisher Scientific), StemSure (registered trademark) Serum Replacement (Wako), B-27 supplement, N2-supplement, albumin (e.g., lipid-rich albumin), insulin, transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements (eg zinc, selenium (eg sodium selenite)), 2-mercaptoethanol, 3′ thiolglycerol or mixtures thereof (eg ITS- G).
  • Preferred serum replacements are B-27 supplement, KSR, StemSure® Serum Replacement, ITS-G.
  • the concentration in the medium is 0.01-10% by weight, preferably 0.1-2% by weight. In the present invention, it is preferred to use a "serum substitute" instead of serum.
  • a method for producing an insulin-producing cell population, and an insulin-producing cell population produced thereby The present invention relates to a pancreatic endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells and/or cells in a later stage of differentiation.
  • a method for producing an insulin-producing cell population comprising treating a pancreatic endocrine progenitor cell population and/or a cell population at a later stage of differentiation with a microtubule inhibitor in the step of inducing differentiation of the population into an insulin-producing cell population. , as well as insulin-producing cell populations produced thereby.
  • the microtubule inhibitor in the step of inducing differentiation of a pancreatic endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells and/or a cell population at a later stage of differentiation into an insulin-producing cell population, is Acting on the pancreatic endocrine progenitor cell population and/or the later differentiated cell population to produce an insulin-producing cell population that is depleted of endocrine non-endocrine cells.
  • pluripotency means the ability to differentiate into tissues and cells with various different morphologies and functions, and to differentiate into cells of any lineage of the three germ layers. “Pluripotency” refers to “totipotency” that can differentiate into any tissue in the body, including the scutellum, in that the scutellum cannot differentiate and is therefore incapable of forming an individual. ” is distinguished from
  • multipotency means the ability to differentiate into cells of a plurality of limited number of lineages.
  • mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, and neural stem cells are multipotent but not pluripotent.
  • pluripotent stem cells refer to embryonic stem cells (ES cells) and similar pluripotent cells, that is, various tissues of the body (endoderm, mesoderm, ectoderm). refers to cells that potentially have the ability to differentiate into Cells having pluripotency similar to ES cells include "induced pluripotent stem cells” (also referred to herein as “iPS cells”).
  • pluripotent stem cells are human pluripotent stem cells.
  • mouse ES cells can be used in various mouse ES cell lines established by inGenious Inc., RIKEN (RIKEN), etc., and human ES cells can be used in the US National Institutes of Health.
  • RIKEN RIKEN
  • human ES cells can be used in the US National Institutes of Health.
  • Various human ES cell lines established by (NIH), RIKEN, Kyoto University, and Cellartis are available.
  • ES cell lines NIH CHB-1 to CHB-12 strains, RUES1 strain, RUES2 strain, HUES1 to HUES28 strains, WiCell Research Institute H1 strain, H9 strain, RIKEN KhES-1 strain, KhES-2 KhES-3 strain, KhES-4 strain, KhES-5 strain, SSES1 strain, SSES2 strain, SSES3 strain, and the like can be used.
  • “Induced pluripotent stem cells” refer to cells obtained by reprogramming mammalian somatic cells or undifferentiated stem cells by introducing specific factors (nuclear reprogramming factors).
  • induced pluripotent stem cells there are various "induced pluripotent stem cells", and Yamanaka et al. established iPS by introducing four factors of Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc into mouse fibroblasts.
  • iPS cells derived from human cells established by introducing the same four factors into human fibroblasts (Takahashi K, Yamanaka S., et al.
  • Nanog-iPS cells were selected using Nanog expression as an index and established (Okita, K., Ichisaka, T.; , and Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.), iPS cells produced by a method that does not contain c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008) 26 , 101-106)), virus-free iPS cells established by introducing six factors (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May; 8(5): 409-12, Okita K et al. Stem Cells. 31(3):458-66.) can also be used.
  • induced pluripotent stem cells established by introducing four factors of OCT3/4, SOX2, NANOG and LIN28 produced by Thomson et al. (Yu J., Thomson JA. et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), induced pluripotent stem cells produced by Daley et al. (Park IH, Daley GQ. et al., Nature (2007) 451: 141-146), induced pluripotent stem cells produced by Sakurada et al. (JP-A-2008-307007) can also be used.
  • iPS cell lines established by NIH, RIKEN (RIKEN), Kyoto University, etc. can be used as induced pluripotent cell lines.
  • pancreatic endocrine progenitor cell population means a cell population containing pancreatic endocrine progenitor cells.
  • pancreatic endocrine progenitor cells are characterized by expression of at least one marker of chromogranin A (CHGA), NeuroD and NGN3, and lack of expression of markers of pancreatic-related hormone systems (e.g., insulin, etc.). means the cells that are harvested.
  • Pancreatic endocrine progenitor cells may express markers such as PAX-4, NKX2.2, Islet-1, PDX-1.
  • the “pancreatic endocrine progenitor cell population” in the present invention is the culture after step 5) or the ) is the cell population corresponding to the culture in
  • pancreatic endocrine progenitor cell population in the present invention includes 30% or more pancreatic endocrine progenitor cells, preferably 40% or more, more preferably 50% or more, even more preferably 60% or more, and even more preferably 70% or more. Included in proportion.
  • the upper limit of the ratio is not particularly limited, it is 90% or less, 80% or less, 70% or less, or 60% or less.
  • the ratio can be expressed using two numerical values respectively selected from the numerical values of the upper limit and the lower limit, for example, the ratio is 30% to 90%, preferably 40% to 80%, more preferably 50% to 80%, more preferably 60% to 70%.
  • the pancreatic endocrine progenitor cell population may contain other cells (eg, pancreatic progenitor cells, insulin-producing cells, Ki67-positive cells, CHGA-negative cells, etc.) in addition to pancreatic endocrine progenitor cells.
  • other cells eg, pancreatic progenitor cells, insulin-producing cells, Ki67-positive cells, CHGA-negative cells, etc.
  • the "cell population at a later stage of differentiation” means a cell population that contains more cells that have advanced in differentiation stage than the pancreatic endocrine progenitor cell population.
  • Examples of “cells more differentiated than pancreatic endocrine progenitor cells” include insulin-producing cells.
  • insulin-producing cells refer to cells characterized by the expression of at least one marker for insulin and NKX6.1, preferably both markers for insulin and NKX6.1. Insulin-producing cells preferably express NGN3 at a ratio of less than one-third of the maximum expression observed in pancreatic endocrine progenitor cells.
  • the "cell population at a later stage of differentiation" contains 30% or more insulin-producing cells, preferably 40% or more, more preferably 50% or more, even more preferably 60% or more, and even more preferably 70%. % or more.
  • the upper limit of the ratio is not particularly limited, it is 90% or less, 80% or less, 70% or less, or 60% or less.
  • the ratio can be expressed using two numerical values respectively selected from the numerical values of the upper limit and the lower limit, for example, the ratio is 30% to 90%, preferably 40% to 80%, more preferably 50% to 80%, more preferably 60% to 70%.
  • the "cell population at a later stage of differentiation” includes other cells (e.g., pancreatic endocrine progenitor cells, insulin-producing cells, Ki67-positive cells, CHGA-negative cells, etc.). good too.
  • the "cell population in the subsequent differentiation stage" in the present invention is defined as the step of inducing the differentiation of pluripotent stem cells into insulin-producing cells, which will be described in detail below, for 3 days until the end of step 6). , cultures for 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, or more, or cell populations after completion of step 6).
  • the percentage of specific cells in the cell population described in this specification can be determined based on a known method capable of calculating the number of cells, such as flow cytometry.
  • this stage of differentiation can be broadly classified into pluripotent stem cells, definitive endoderm cells, gastrulation tract cells, posterior foregut cells, pancreatic progenitor cells, pancreatic endocrine progenitor cells, and insulin-producing cells in order of relatively undifferentiated. can.
  • pancreatic endocrine progenitor cell population induces differentiation from pluripotent stem cells into definitive endoderm cells, gastrula cells, posterior foregut cells, pancreatic progenitor cells, pancreatic endocrine progenitor cells, and insulin-producing cells.
  • Step 1) Differentiate pluripotent stem cells into definitive endoderm cells; Step 2) Inducing differentiation from definitive endoderm cells to gastrula cells; Step 3) Inducing differentiation from gastrula cells to posterior foregut cells; Step 4) Inducing differentiation from posterior foregut cells to pancreatic progenitor cells; Step 5) Inducing differentiation from pancreatic progenitor cells to pancreatic endocrine progenitor cells; Step 6) Differentiation of pancreatic endocrine progenitor cells into insulin-producing cells is induced.
  • Step 2) Differentiate pluripotent stem cells into definitive endoderm cells; Step 2) Inducing differentiation from definitive endoderm cells to gastrula cells; Step 3) Inducing differentiation from gastrula cells to posterior foregut cells; Step 4) Inducing differentiation from posterior foregut cells to pancreatic progenitor cells; Step 5) Inducing differentiation from pancreatic progenitor cells to pancreatic endocrine progenitor cells; Step 6) Differentiation of pan
  • Step 1) Differentiation into Definitive Endoderm Cells Pluripotent stem cells are cultured in medium containing low doses of activin A to differentiate into definitive endoderm cells.
  • Media used in this step include RPMI medium, MEM medium, iMEM medium, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) medium, Improved MEM Zinc Option medium, Improved MEM/1% B-27 supplement/Penisilin Streptomycin medium, MCDB131/10 mM Glucose. /20 mM Glucose/NaHCO 3 /FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/ascorbic acid/Penisilin Streptomycin medium or other basal media used for culturing mammalian cells can be used.
  • Activin A can be included in the medium at low doses, for example in amounts of 5-100 ng/mL, preferably 5-50 ng/mL, more preferably 5-10 ng/mL.
  • the concentration of activin A in the medium is about 0.1-100 ng/mL, preferably about 1-50 ng/mL, more preferably about 3-10 ng/mL.
  • a ROCK inhibitor and/or a GSK3 ⁇ inhibitor can be added to the medium.
  • the concentration of the GSK3 ⁇ inhibitor in the medium is appropriately set depending on the type of GSK3 ⁇ inhibitor used. 3 ⁇ M.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium is appropriately set depending on the type of ROCK inhibitor used. is about 10 ⁇ M.
  • Insulin can be added to the medium. Insulin can be included in the medium in an amount of 0.01-20 ⁇ M, preferably 0.1-10 ⁇ M, more preferably 0.5-5 ⁇ M.
  • the concentration of insulin in the medium may be, but is not limited to, the concentration of insulin contained in the added B-27 supplement.
  • Cultivation may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the number of cells at the start of culture is not particularly limited. It can be 100,000 to 300,000 cells/cm 2 .
  • the number of cells at the start of culture is not particularly limited. It can be 300,000 to 600,000 cells/mL.
  • the culture period is 1 to 4 days, preferably 1 to 3 days, particularly preferably 3 days.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is carried out at 30-40°C (eg, 37°C). Also, the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • definitive endoderm cells are obtained by first culturing pluripotent stem cells in medium under insulin-acting conditions in the presence of a low dose of activin A, followed by insulin-free culture. It can be produced by performing a second culture in conditioned medium.
  • First Culture means conditions under which insulin activates the insulin signaling pathway in cells. Normally, insulin binds to insulin receptors present on the surface of cell membranes, activates tyrosine kinase endogenous to the receptors, and tyrosine phosphorylates insulin receptor substrate protein family (IRS: IRS-1, 2, 3). As used herein, the phrase "resulting in activation of the insulin signaling pathway” refers to the occurrence of a series of reactions initiated by the binding of insulin to insulin receptors.
  • Conditions under which insulin acts include, for example, the case where the medium contains insulin. Any insulin can be used as long as it can activate the insulin signaling pathway in pluripotent stem cells, and it may be produced by a recombinant method or synthesized by a solid-phase synthesis method. . Insulin can be derived from humans, non-human primates, pigs, cows, horses, sheep, goats, llamas, dogs, cats, rabbits, mice, guinea pigs, etc., but is preferably human insulin. .
  • insulin mutants, insulin derivatives, or insulin agonists can also be used as “insulin” as long as they activate the insulin signaling pathway in pluripotent stem cells.
  • Insulin mutant consists of an amino acid sequence in which 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5 amino acids are deleted, substituted, added or inserted in the amino acid sequence of insulin, and having a sequence identity of 80% or more, more preferably 90% or more, even more preferably 95% or more, most preferably 99% or more, with a polypeptide capable of activating the insulin signaling pathway or with the amino acid sequence of insulin and having a polypeptide that consists of an amino acid sequence having a specific property and is capable of effecting activation of the insulin signaling pathway.
  • Amino acid sequences can be compared by a known method, for example, BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information), etc. It can be implemented using the setting of "Insulin derivative” means that some groups of amino acid residues of insulin or insulin variants are chemically substituted (eg, ⁇ -methylation, ⁇ -hydroxylation), deleted (eg, deamination), or a polypeptide consisting of a modified (eg, N-methylated) amino acid sequence and capable of causing activation of the insulin signaling pathway or a substance with similar action.
  • insulin agonist is meant a polypeptide or substance with similar action that is capable of binding to the insulin receptor resulting in activation of the insulin signaling pathway, regardless of the structure of insulin.
  • the medium for the first culture can contain insulin in an amount of 0.01-20 ⁇ M, preferably 0.1-10 ⁇ M, more preferably 0.5-5 ⁇ M.
  • the concentration of insulin in the medium may be, but is not limited to, the concentration of insulin contained in the added B-27 supplement.
  • a B-27 supplement containing insulin may be referred to as "B-27 (INS+)" and a B-27 supplement not including insulin may be referred to as "B-27 (INS-)".
  • the medium can further contain a ROCK inhibitor and/or a GSK3 ⁇ inhibitor.
  • concentration of the ROCK inhibitor in the medium is appropriately set depending on the type of ROCK inhibitor used. Particularly preferably, it can be about 10 ⁇ M.
  • concentration of the GSK3 ⁇ inhibitor in the medium is appropriately set depending on the type of GSK3 ⁇ inhibitor used. It can be 3 ⁇ M.
  • the medium may further contain one or more selected from the group consisting of pyruvate (such as sodium salt), L-alanyl L-glutamine, and glucose.
  • Pyruvate can be included in the medium in an amount of 10-1000 mg/L, preferably 30-500 mg/L, more preferably 50-200 mg/L, particularly preferably about 110 mg/L.
  • L-alanyl L-glutamine can be included in the medium in an amount of 50-2000 mg/L, preferably 100-1500 mg/L, more preferably 500-1000 mg/L, particularly preferably about 860 mg/L.
  • Glucose can be included in the medium in an amount of 15 mM or more, preferably 15-30 mM, more preferably 15-25 mM, and particularly preferably about 25 mM.
  • concentrations of pyruvate, L- alanyl L-glutamine and glucose in the medium are determined by pyruvate, L -alanyl L-glutamine and glucose concentrations, but not limited thereto.
  • the medium can be based on the above basal medium and added with one or more of the above components.
  • the basal medium is preferably DMEM medium, more preferably DMEM medium containing pyruvate, L-alanyl-L-glutamine, and glucose in the above amounts.
  • the culture period of the first culture can be in a range selected from 6 hours to 48 hours, preferably 12 to 24 hours.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is carried out at 30 to 40°C (eg, 37°C).
  • the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • Cultivation may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the number of cells at the start of culture is not particularly limited. It can be 100,000 to 300,000 cells/cm 2 . In addition, the number of cells at the start of culture is not particularly limited. It can be 300,000 to 600,000 cells/mL.
  • Second culture “Conditions in which insulin does not act” means conditions in which insulin does not activate the insulin signaling pathway in cells. "No activation of the insulin signaling pathway in cells” means not only that no activation of the insulin signaling pathway occurs at all, but also activation of the insulin signaling pathway in the absence of insulin. It also means that there is only a slight activation that does not make a significant difference compared to . Therefore, “conditions in which insulin does not act” means, for example, that the medium does not contain insulin, or even if insulin is contained in the medium, the amount thereof does not show the above-mentioned significant difference. Conditions included in amounts that result in only a modest degree of activation are included.
  • insulin signaling inhibitor an ingredient capable of blocking the insulin signaling pathway at any position.
  • insulin signal inhibitors include polypeptides and compounds that bind to or compete with insulin, insulin receptors, various proteins that act as signal transduction substances, and inhibit the intermolecular interactions involving these factors. is mentioned.
  • insulin signaling inhibitors include LY294002 [2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one], which competitively inhibits ATP binding to the catalytic subunit of PI3 kinase. etc.
  • Insulin signaling inhibitors are not limited to these, but include antibodies that bind to insulin, insulin receptors, various proteins that act as signaling substances, dominant-negative variants thereof, and insulin receptors that act as signaling substances. Antisense oligonucleotides, siRNA, and the like against mRNA of various proteins can also be used as insulin signal inhibitors. Insulin signaling inhibitors are commercially available or can be synthesized according to known methods.
  • the medium can further contain a ROCK inhibitor and/or a GSK3 ⁇ inhibitor.
  • the amount of the ROCK inhibitor and/or GSK3 ⁇ inhibitor in the medium can be selected from the range described in the first culture, and may be the same amount as used in the first culture. , can be different.
  • the medium can further contain one or more selected from the group consisting of pyruvate, L-alanyl L-glutamine, and glucose.
  • the amounts of pyruvate, L-alanyl L-glutamine, and glucose in the medium can be selected from the ranges described in the first culture above, and are the same amounts used in the first culture. may be different.
  • the medium used in the second culture can be based on the basal medium used for culturing mammalian cells, to which one or more of the above ingredients are added.
  • the basal medium the one described in the first culture can be used, and the same basal medium as that used in the first culture may be used, or a different basal medium may be used.
  • DMEM medium is preferred, and DMEM medium containing pyruvate, L-alanyl-L-glutamine, and glucose in the above amounts is more preferred.
  • the culture period of the second culture can be at least 6 hours, preferably 6 to 72 hours, and more preferably a range selected from 24 to 72 hours.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is carried out at 30 to 40°C (eg, 37°C). Cultivation may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture. Also, the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the medium for the first culture and the second culture can contain activin A at the above low dose.
  • the amount of activin A contained in the media of the first culture and the second culture may be the same or different.
  • Dimethyl sulfoxide may be further added to the medium for the first culture and the second culture.
  • Step 2) Differentiation into gastrula cells
  • the definitive endoderm cells obtained in step 1) are further cultured in a medium containing a growth factor to induce differentiation into gastrula cells.
  • the culture period is 2 to 8 days, preferably about 4 days.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is carried out at 30-40°C (eg, 37°C). Also, the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%. Cultivation may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the basal medium used for culturing mammalian cells which is described in step 1) above, can be used.
  • growth factors serum replacements, vitamins, antibiotics, and the like may be added to the medium as appropriate.
  • the growth factor is preferably EGF, KGF, and/or FGF10, more preferably EGF and/or KGF, and even more preferably KGF.
  • the concentration of the growth factor in the medium is appropriately set depending on the type of growth factor used, but it is usually about 0.1 nM to 1000 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to 100 ⁇ M.
  • its concentration is about 5-2000 ng/mL (ie, about 0.8-320 nM), preferably about 5-1000 ng/mL (ie, about 0.8-160 nM), more preferably about 10-2000 ng/mL (ie, about 0.8-160 nM). 1000 ng/mL (ie about 1.6-160 nM).
  • the concentration is about 5-2000 ng/mL (ie, about 0.3-116 nM), preferably about 10-1000 ng/mL (ie, about 0.6-58 nM), more preferably about 10-2000 ng/mL (ie, about 0.6-58 nM). 1000 ng/mL (ie about 0.6-58 nM).
  • the concentration is usually 5-150 ng/mL, preferably 30-100 ng/mL, particularly preferably about 50 ng/mL.
  • Step 3) Differentiation into posterior foregut cells
  • the gastrula cells obtained in step 2) are further cultured in a medium containing a growth factor, cyclopamine, noggin, etc. to induce differentiation into posterior foregut cells.
  • the culture period is 1 to 5 days, preferably about 2 days. Cultivation may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is carried out at 30-40°C (eg, 37°C). Also, the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the basal medium used for culturing mammalian cells which is described in step 1) above, can be used.
  • growth factors serum replacements, vitamins, antibiotics, and the like may be added to the medium as appropriate.
  • the growth factor is preferably EGF, KGF, and/or FGF10, more preferably EGF and/or KGF, and even more preferably KGF.
  • the concentration of the growth factor in the medium is appropriately set depending on the type of growth factor used, but it is usually about 0.1 nM to 1000 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to 100 ⁇ M.
  • its concentration is about 5-2000 ng/mL (ie, about 0.8-320 nM), preferably about 5-1000 ng/mL (ie, about 0.8-160 nM), more preferably about 10-2000 ng/mL (ie, about 0.8-160 nM). 1000 ng/mL (ie about 1.6-160 nM).
  • the concentration is about 5-2000 ng/mL (ie, about 0.3-116 nM), preferably about 10-1000 ng/mL (ie, about 0.6-58 nM), more preferably about 10-2000 ng/mL (ie, about 0.6-58 nM). 1000 ng/mL (ie about 0.6-58 nM).
  • the concentration is usually 5-150 ng/mL, preferably 30-100 ng/mL, particularly preferably about 50 ng/mL.
  • the concentration of cyclopamine in the medium is not particularly limited, but is usually 0.5-1.5 ⁇ M, preferably 0.3-1.0 ⁇ M, and particularly preferably about 0.5 ⁇ M.
  • the concentration of Noggin in the medium is not particularly limited, but is usually 10 to 200 ng/mL, preferably 50 to 150 ng/mL, particularly preferably about 100 ng/mL.
  • dimethylsulfoxide may be added to the medium.
  • Step 4) Differentiation into Pancreatic Progenitor Cells
  • the posterior foregut cells obtained in step 3) are added to a medium containing a factor having CDK8/19 inhibitory activity, preferably a factor having CDK8/19 inhibitory activity and a growth factor. They may be cultured in a medium and induced to differentiate into pancreatic progenitor cells.
  • the culture period is 2 to 10 days, preferably about 5 days.
  • Cultivation may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the posterior foregut cells obtained in step 3) were treated with 0.25% trypsin-EDTA according to a previous report (Toyoda et al., Stem cell Research (2015) 14, 185-197). Disperse by pipetting after treatment, subject the resulting dispersion to centrifugation, resuspend the recovered cells in the new medium of step 4), and resuspend the cell suspension in a new two-dimensional culture vessel. Sow.
  • the medium can be a basal medium used for culturing mammalian cells.
  • growth factors serum replacements, vitamins, antibiotics, and the like may be added to the medium as appropriate.
  • the factor having CDK8/19 inhibitory activity various compounds described above or salts thereof can be used. ⁇ 5 ⁇ M, preferably 0.00001 ⁇ M to 1 ⁇ M.
  • the concentration of the factor having CDK8/19 inhibitory activity in the medium is preferably a concentration that achieves 50% or more inhibitory activity against CDK8/19.
  • the growth factor is preferably EGF, KGF, and/or FGF10, more preferably KGF and/or EGF, and even more preferably KGF and EGF.
  • the concentration of the growth factor in the medium is appropriately set depending on the type of growth factor used, but it is usually about 0.1 nM to 1000 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to 100 ⁇ M.
  • its concentration is about 5-2000 ng/mL (ie, about 0.8-320 nM), preferably about 5-1000 ng/mL (ie, about 0.8-160 nM), more preferably about 10-2000 ng/mL (ie, about 0.8-160 nM). 1000 ng/mL (ie about 1.6-160 nM).
  • the concentration of FGF10 is about 5-2000 ng/mL (ie, about 0.3-116 nM), preferably about 10-1000 ng/mL (ie, about 0.6-58 nM), more preferably about 10-2000 ng/mL (ie, about 0.6-58 nM). 1000 ng/mL (ie about 0.6-58 nM).
  • the concentrations are usually 5 to 150 ng/mL, preferably 30 to 100 ng/mL, particularly preferably about 50 ng/mL for EGF, and usually 10 to 200 ng/mL, preferably 10 to 200 ng/mL for KGF. is between 50 and 150 ng/mL, particularly preferably about 100 ng/mL.
  • the first day of culture in step 4) may be performed in the presence of a ROCK inhibitor, and thereafter cultured in a medium containing no ROCK inhibitor.
  • the medium may contain a PKC activator.
  • a PKC activator PdBU (PKC activator II), TPB (PKC activator V), etc. are used, but not limited thereto.
  • the PKC activator is added at a concentration of about 0.1-100 ng/mL, preferably about 1-50 ng/mL, more preferably about 3-10 ng/mL.
  • dimethylsulfoxide and/or activin (1-50 ng/mL) may be added to the medium.
  • the medium may be supplemented with a serum substitute (eg, B-27 supplement, ITS-G) in addition to the components described above.
  • a serum substitute eg, B-27 supplement, ITS-G
  • amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (product name), non-essential amino acids, vitamins, nicotinamide, antibiotics (e.g., Antibiotic-Antimycotic (hereinafter referred to as AA), penicillin, streptomycin, or mixtures thereof), antibacterial agents (eg, amphotericin B), antioxidants, pyruvic acid, buffers, inorganic salts, and the like may be added.
  • antibiotics e.g., Antibiotic-Antimycotic (hereinafter referred to as AA), penicillin, streptomycin, or mixtures thereof
  • antibacterial agents eg, amphotericin B
  • antioxidants pyruvic acid
  • buffers e.g, inorganic salts, and the like
  • Cultivation
  • cell culture is performed by adhesion culture without using feeder cells in the case of two-dimensional culture.
  • Culture vessels such as dishes, flasks, microplates, and cell culture sheets such as OptiCell (product name) (Nunc) are used for culturing.
  • the culture vessel is surface-treated to improve adhesion (hydrophilicity) with cells, collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin, Matrigel (e.g. BD Matrigel (Japan) It is preferably coated with a substrate for cell adhesion such as Becton Deckinson)), vitronectin or the like.
  • the culture vessel is preferably a culture vessel coated with type I collagen, matrigel, fibronectin, vitronectin, poly-D-lysine, or the like, more preferably matrigel or poly-D-lysine.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is carried out at 30-40°C (eg, 37°C). Also, the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the pancreatic progenitor cells obtained in step 4) can be further purified using a known surface marker such as glycoprotein 2 (GP2).
  • GP2 glycoprotein 2
  • the purification can be performed by a method known per se, for example, using beads on which anti-GP2 antibody is immobilized.
  • Step 5) Differentiation into pancreatic endocrine progenitor cells
  • the pancreatic progenitor cells obtained in step 4) are further cultured in a medium containing growth factors to induce differentiation into pancreatic endocrine progenitor cells. Cultivation may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture. In the case of two-dimensional culture, the pancreatic progenitor cells obtained in step 4) are treated with 0.25% trypsin-EDTA and dispersed by pipetting, and the resulting dispersion is centrifuged, The harvested cells are resuspended in the fresh medium of step 5) and the cell suspension is replated in a new two-dimensional culture vessel.
  • the culture period is 2-3 days, preferably about 2 days.
  • the basal medium used for culturing mammalian cells which is described in step 1) above, can be used.
  • the medium was supplemented with SANT1, retinoic acid, ALK5 inhibitor II, T3, and LDN, as well as a Wnt inhibitor, a ROCK inhibitor, and FGF (preferably FGF2).
  • serum substitutes, vitamins, antibiotics and the like may be added as appropriate.
  • dimethylsulfoxide may be added to the medium.
  • Cultivation is performed in non-adhesive culture without using feeder cells.
  • feeder cells For culturing, dishes, flasks, microplates, porous plates (Nunc), etc., or bioreactors are used.
  • the culture vessel is preferably surface-treated to reduce adhesion to cells.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is carried out at 30-40°C (eg, 37°C). Also, the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the pancreatic endocrine progenitor cells obtained in step 5) can be further purified using a known surface marker such as glycoprotein 2 (GP2).
  • GP2 glycoprotein 2
  • the purification can be performed by a method known per se, for example, using beads on which anti-GP2 antibody is immobilized.
  • Step 6) Differentiation into insulin-producing cells
  • the pancreatic endocrine progenitor cells obtained in step 5) are further cultured in a medium containing an FGFR1 inhibitor to induce differentiation into insulin-producing cells.
  • the culture period is 10 to 30 days, preferably about 10 to 20 days.
  • the basal medium used for culturing mammalian cells which is described in step 1) above, can be used.
  • the medium contains ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor XX, ⁇ -secretase inhibitor RO, N-cysteine, AXL inhibitor, and ascorbic acid according to a previous report (Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133).
  • Wnt inhibitors, ROCK inhibitors, FGF (preferably FGF2), serum substitutes, vitamins, antibiotics, etc. may be added as appropriate.
  • the medium may be supplemented with ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, and ascorbic acid, or T3, ALK5 inhibitor II, ZnSO 4 , heparin, N-acetylcysteine, Trolox, and R428 may be added.
  • the culture can be performed in either two-dimensional or three-dimensional culture.
  • the culture is performed in non-adherent culture without using feeder cells.
  • feeder cells For culturing, dishes, flasks, microplates, porous plates (Nunc), etc., or bioreactors are used.
  • the culture vessel is preferably surface-treated to reduce adhesion to cells.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is carried out at 30-40°C (eg, 37°C). Also, the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the medium can contain the FGFR1 inhibitor in any amount capable of inhibiting FGFR1 activity, e.g. It can be included in amounts less than, less than 2 ⁇ M.
  • the lower limit of the amount of the FGFR1 inhibitor to be added is not particularly limited, but may be 0.1 ⁇ M or more, preferably 0.5 ⁇ M or more.
  • the amount of the FGFR1 inhibitor to be added is preferably less than 5 ⁇ M and 0.1 ⁇ M or more, more preferably less than 5 ⁇ M and 0.5 ⁇ M or more. Culturing in the presence of the FGFR1 inhibitor can be carried out for at least 12 hours, preferably 24 hours or more, 2 days or more, 4 days or more, 8 days or more, 10 days or more, or 15 days or more.
  • Culturing in the presence of the FGFR1 inhibitor is preferably performed for 4 days or more.
  • culturing in the presence of the FGFR1 inhibitor can be performed for about the last 4 to 15 days, preferably about the last 4 to 7 days of step 6). It is possible to replace the medium during the treatment with the FGFR1 inhibitor, and according to the culture schedule, the medium can be replaced with a medium having the same composition as before replacement with the addition of the FGFR1 inhibitor or a medium with a different composition.
  • the insulin-producing cells obtained in step 6) can be dissociated and collected using an enzyme such as trypsin.
  • the recovered insulin-producing cells can be cryopreserved until use.
  • about 500,000 to 5,000,000 cells, preferably about 1,000,000 to 4,000,000 cells, more preferably about 2,000,000 to 3,000,000 cells per culture vessel or well are added to the above-mentioned medium. and three-dimensionally cultured to obtain insulin-producing cells in the form of spheroids.
  • Each spheroid consists of about 100 to about 1000 cells, preferably about 200 to about 800 cells, more preferably about 300 to about 500 cells.
  • the “compound having tubulin polymerization-promoting activity and/or depolymerization-inhibiting activity” or “microtubule inhibitor” used in the present invention is a compound that promotes the polymerization of tubulin that forms microtubules to produce excess microtubules. It means a compound having an activity of forming and stabilizing and/or an activity of suppressing depolymerization of tubulin that forms microtubules. The compound preferably has the effect of inhibiting cell division through the activity.
  • the terms "compound having tubulin polymerization-promoting activity and/or depolymerization-inhibiting activity” and "microtubule inhibitor” are used interchangeably.
  • the "compound having tubulin polymerization-promoting activity and/or depolymerization-inhibiting activity” or “microtubule inhibitor” that can be used in the present invention is not particularly limited as long as it has the above activity. Physically acceptable salts and solvates are included. In addition, these compounds may have one or more substituents as long as they have tubulin polymerization-promoting activity and/or depolymerization-inhibiting activity, and some partial structures (substituents, rings, etc.) It may be converted. Solvates include, but are not limited to, hydrates, acetone adducts, and the like.
  • the "compound having tubulin polymerization-promoting activity and/or depolymerization-inhibiting activity" or “microtubule inhibitor” is a compound used as an active ingredient of a taxoid anticancer agent or its pharmacology.
  • Pharmaceutically acceptable salts and solvates are preferred, more preferably Docetaxel or pharmacologically acceptable salts and solvates thereof.
  • tubulin polymerization promoting activity and/or depolymerization inhibitory activity or "microtubule inhibitor” may be commercially available or synthesized according to a known method. can.
  • treatment of a pancreatic endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells and/or a cell population at a later stage of differentiation with a microtubule inhibitor inhibits the microtubule inhibition of the cell population. It can be carried out by contacting with an agent.
  • treatment with a microtubule inhibitor can be performed by culturing the cell population in a medium supplemented with the microtubule inhibitor.
  • the microtubule inhibitor can be included in the medium in any amount capable of reducing non-endocrine cells endogenous to the final insulin-producing cell population, e.g., 10 ⁇ M, 5 ⁇ M, 4 ⁇ M, 3 ⁇ M.
  • the lower limit of the amount of the microtubule inhibitor added to the medium is not particularly limited, but may be 0.1 ⁇ M, 0.2 ⁇ M, 0.3 ⁇ M, 0.4 ⁇ M, 0.5 ⁇ M, 1 ⁇ M, or more.
  • the range of the amount of the microtubule inhibitor to be added to the medium can be expressed using two numerical values respectively selected from the upper and lower numerical values, for example, 0.1 ⁇ M to 10 ⁇ M, preferably 0.1 ⁇ M to 5 ⁇ M. , more preferably 1 ⁇ M to 3 ⁇ M.
  • culturing the pancreatic endocrine progenitor cell population and/or the cell population at a later stage of differentiation in the presence of a microtubule inhibitor reduces the non-endocrine cells inherent in the finally obtained insulin-producing cell population. for at least 12 hours, preferably 24 hours, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, 10 days, 11 days, It can be done for 12 days, 15 days, or more.
  • the culture period of the pancreatic endocrine progenitor cell population and/or the cell population at a later stage of differentiation in the presence of the microtubule inhibitor is 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, or 8 days. days or longer.
  • the medium can be replaced with a medium having the same composition as before replacement with the addition of the microtubule inhibitor or a medium with a different composition.
  • a medium a basal medium used for culturing the above mammalian cells or a medium for inducing differentiation into insulin-producing cells can be used.
  • a pancreatic endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells and/or a cell population at a later stage of differentiation are treated with a microtubule inhibitor and differentiated into insulin-producing cells.
  • the term "treated with a microtubule inhibitor” means that the step of treating with the microtubule inhibitor and the step of differentiating are performed simultaneously, the case of treating with the microtubule inhibitor and then subjecting it to the step of differentiating, and It also includes the step of treating with a microtubule inhibitor after being subjected to the step of differentiating. Therefore, the medium used for treatment with the microtubule inhibitor and the medium used for differentiating the cell population may be separate, or the microtubule inhibitor may be added to the medium used for the differentiation step.
  • the microtubule inhibitor is included in the medium in step 6 above to act on the cells in the step of inducing the differentiation of pluripotent stem cells into insulin-producing cells.
  • the microtubule inhibitor is included in the medium of step 6 and allowed to act on the cells for 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, or more until the end of step 6. .
  • the microtubule inhibitor in the step of inducing the differentiation of pluripotent stem cells into insulin-producing cells, may be added to the medium and act on the cells after step 6 above.
  • the medium the basal medium used for culturing mammalian cells, which is described in step 1) above, can be used.
  • the medium contains ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor XX, ⁇ -secretase inhibitor RO, N-cysteine, AXL inhibitor, ascorbic acid, Wnt inhibitor, ROCK inhibitor, and FGF. (preferably FGF2), serum substitutes, vitamins, antibiotics, etc. may be added as appropriate.
  • the medium may be supplemented with ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, and ascorbic acid, or T3, ALK5 inhibitor II, ZnSO 4 , heparin, N-acetylcysteine, Trolox, and R428 may be added.
  • the microtubule inhibitor is included in the above medium and allowed to act on the cells for a period of 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, or more after step 6 is completed.
  • the percentage of insulin-producing cells, preferably insulin-positive and NKX6.1-positive cells, in the insulin-producing cell population obtained by the present invention can be determined by conventional methods (for example, the above steps 1) to 6) or Nature Biotechnology 2014;32: 1121-1133, etc.) is 5% or higher, preferably 10% or higher. More specifically, the proportion of insulin-producing cells, more specifically insulin-positive and NKX6.1-positive cells, in the insulin-producing cell population obtained by the present invention is 35% or more, preferably 36% or more, and more It is preferably 37% or more, more preferably 38% or more, even more preferably 39% or more, particularly preferably 40% or more, particularly preferably 41% or more.
  • the upper limit of the ratio is not particularly limited, it is 70% or less, 60% or less, or 50% or less.
  • the ratio can be expressed using two numerical values respectively selected from the numerical values of the upper limit and the lower limit, for example, the ratio is 35% to 50%, preferably 36% to 50%, more preferably 37% to 50%, more preferably 38% to 50%, even more preferably 39% to 50%, particularly preferably 40% to 50%, most preferably 41% to 50%.
  • the proportion of chromogranin A (CHGA)-positive endocrine cells in the insulin-producing cell population obtained by the present invention can be determined by conventional methods (for example, the above steps 1) to 6) or Nature Biotechnology 2014;32:1121-1133. etc.), it is 3% or more, preferably 4% or more, more preferably 5% or more. More specifically, the percentage of chromogranin A (CHGA)-positive, for example, CHGA-positive and PDX1-positive endocrine cells in the insulin-producing cell population obtained by the present invention is 95% or more, preferably 96% or more, and more It is preferably 97% or more, more preferably 98% or more.
  • the upper limit of the ratio is not particularly limited, it is 99% or less. The ratio can be expressed using two numerical values respectively selected from the numerical values of the upper limit and the lower limit, for example, the ratio is 95% to 99%, preferably 96% to 99%, more preferably 97% to 99%, more preferably 98% to 99%.
  • pancreatic endocrine progenitor cells e.g., pancreatic endocrine progenitor cells; glucagon, somatostatin, and at least one pancreatic polypeptide marker are expressed.
  • pancreatic hormone-producing cells Ki67-positive cells; CHGA-negative cells, etc.
  • the insulin-producing cell population obtained by the method of the present invention is compared to insulin-producing cell populations prepared by conventional methods (for example, steps 1) to 6) above, Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133, etc.).
  • a "non-endocrine cell” is a cell characterized by a chromogranin A (CHGA)-negative marker expression pattern.
  • Non-endocrine cells can be further characterized as being PDX1 negative and/or Ki67 positive.
  • "non-endocrine cells” are CHGA-negative and PDX1-positive cells, CHGA-negative and PDX1-negative cells, and/or CHGA-negative and Ki67-positive cells.
  • the percentage of non-endocrine cells in the insulin-producing cell population obtained by the present invention is the insulin-producing cells produced by conventional methods (for example, the above steps 1) to 6) and Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133, etc.). 2% or more, 3% or more, 4% or more, or 5% or more lower than its proportion in the cell population. More specifically, the proportion of non-endocrine cells in the insulin-producing cell population obtained by the present invention is 5% or less, preferably 4% or less, more preferably 3% or less, still more preferably 2% or less, and more preferably 2% or less. More preferably 1% or less, particularly preferably 0.5% or less.
  • the lower limit of the ratio is not particularly limited, it is, for example, 0% or more, 0.01% or more, or 0.05% or more.
  • the ratio can be expressed using two numerical values respectively selected from the upper and lower numerical values, for example, the ratio is 0% to 5%, preferably 0.01% to 4%, more preferably 0 0.01% to 3%, more preferably 0.01% to 2%, even more preferably 0.01% to 1%, and particularly preferably 0.01% to 0.5%.
  • the proportion of CHGA-negative and Ki67-positive cells in the insulin-producing cell population obtained by the present invention is 0.1% or less, preferably 0.05% or less, and the lower limit of the proportion is particularly limited. However, for example, it is 0% or more, 0.01% or more.
  • the ratio can be expressed using two numerical values respectively selected from the numerical values of the upper limit and the lower limit, for example, the ratio is 0% to 0.1%, or 0.01% to 0.1% .
  • the present invention also provides a method for detecting non-endocrine cells present in an insulin-producing cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells.
  • non-endocrine cells present in the insulin-producing cell population are proliferated and detected by subjecting the insulin-producing cell population to further culture (herein, sometimes referred to as "extended culture”).
  • extended culture can be facilitated.
  • the extension culture can be performed using the basal medium used for culturing the above mammalian cells, preferably MCDB131/20 mM Glucose/NaHCO 3 /FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/Penisilin Streptomycin medium as the basal medium.
  • the medium for extended culture further contains epidermal growth factor (EGF) or a substance having an activity equivalent or similar thereto.
  • EGF epidermal growth factor
  • substances capable of activating the signal transduction pathway of EGF e.g., betacellulin
  • growth factors having similar functions to EGF e.g., fibroblast growth factor (FGF; Fibroblast Growth Factor), platelet-derived growth factor (PDGF; Platelet-Derived Growth Factor), vascular endothelial cell growth factor (VEGF; Vascular Endothelial Growth Factor), etc.
  • FGF fibroblast growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • VEGF vascular endothelial cell growth factor
  • VEGF Vascular Endothelial Growth Factor
  • EGF or a substance having equivalent or similar activity is added to the medium in an amount selected from the range of 50 ng/mL, 60 ng/mL, 70 ng/mL, 80 ng/mL, 90 ng/mL, or more.
  • the upper limit is not particularly limited, but can be an amount selected from the range of 250 ng/mL, 200 ng/mL, 150 ng/mL, 100 ng/mL, or less.
  • the content can be expressed using two numerical values respectively selected from the numerical values of the upper and lower limits. An amount selected from the range of mL to 150 ng/mL, or 50 ng/mL to 100 ng/mL.
  • the extended culture period may be performed for a period sufficient for non-endocrine cells to proliferate, and is at least 12 hours, preferably 24 hours or more, for example, 2 days, 3 days, 4 days, 5 days, 7 days, 10 days. days, 14 days, 21 days, 27 days, 28 days, 29 days, 30 days, or more.
  • the medium can be exchanged during the extended culture period, and the medium can be exchanged once every 1 to 7 days, preferably every 2 to 5 days, more preferably every 3 to 4 days.
  • the proportion of non-endocrine cells in the population confirmed after the extended culture can be determined by conventional methods (for example, steps 1) to 6) or Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133, etc.) is 50% or more, preferably 65% or more, more preferably 70% or more, compared to the ratio when the insulin-producing cell population is subjected to extended culture, More preferably, it is reduced by 75% or more, and it can be confirmed that non-endocrine cells endogenously present in the insulin-producing cell population obtained by the present invention are reduced, preferably removed.
  • pancreatic ⁇ cell population a cell population containing pancreatic ⁇ cells
  • pancreatic ⁇ -cells means cells more mature than “insulin-producing cells”, and specifically, at least one marker of MAFA, UCN3, and IAPP, which are maturation markers of pancreatic ⁇ -cells. or characterized by a glucose-stimulated insulinotropic response.
  • the pancreatic ⁇ -cell population may contain other cells (eg, insulin-producing cells, Ki67-positive cells, CHGA-negative cells, etc.) in addition to pancreatic ⁇ -cells.
  • a pancreatic ⁇ -cell population can be obtained by differentiating and maturing an insulin-producing cell population, preferably by differentiating and maturing in vivo in an animal.
  • Animals are preferably mammals, such as humans, non-human primates, pigs, cows, horses, sheep, goats, llamas, dogs, cats, rabbits, mice, guinea pigs, etc., preferably humans. .
  • Transplantation is preferably carried out in an in vivo region where the cell population can be fixed at a fixed position. It can be performed under the capsule.
  • the number of cells to be transplanted may vary depending on factors such as the stage of differentiation of the cells to be transplanted, age, body weight, size of the transplanted site, severity of disease, etc., and is not particularly limited. It can be about 10 ⁇ 10 4 to 10 ⁇ 10 11 cells.
  • the transplanted cell population is induced to differentiate in an in vivo environment, and can be differentiated into a desired cell population, preferably a pancreatic ⁇ cell population, after which it may be recovered or left in vivo as it is. good too.
  • the cell population may be embedded in a gel containing a biocompatible material and then transplanted. can also be encapsulated in a device and implanted in vivo.
  • epibedding means to disperse and contain a pancreatic endocrine progenitor cell population or a cell population at a later stage of differentiation in a gel containing a biocompatible material.
  • biocompatible material refers to any material that does not induce significant immune responses or adverse biological reactions (e.g., toxic reactions, blood coagulation, etc.) when implanted in vivo and left in place for a short or long period of time.
  • biological reactions e.g., toxic reactions, blood coagulation, etc.
  • biocompatible material is preferably a biodegradable material.
  • Such materials include polylactic acid (PLA), polycaprolactone (PCL), polyurethane (PU), polyethylene glycol (PEG), polyhydroxyethyl methacrylate, polyglycolic acid (PGA), polylactic-co-glycolic acid (PLGA), poly(3-hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) (PHBV), poly(ethylene-co-vinyl acetate) (PEVA) polyacrylamide, polyethylene oxide, polyethyleneamine, polyhydroxybutyric acid, poly(N- vinylpyrrolidone), polyvinyl alcohol, polypropylene fumarate, polyacrylic acid, poly e-caprolactone, polymethacrylic acid, polyvinylidene difluoride (PVDF), pectic acid, hyaluronic acid, heparin sulfate, chondroitin sulfate, heparan sulfate proteoglycan, heparin , chitin, chitosan, xanthan
  • the surface of the "biocompatible material” may optionally be modified to allow cell adhesion (e.g., substrates for cell adhesion (collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin). , Matrigel, vitronectin, etc.), or with functional groups known to control cell growth, differentiation and function (e.g., amino, carboxyl, hydroxyl, methacrylic acid, acrylic acid, etc.). may be modified.
  • alginate or alginate can be suitably used as the "biocompatible material".
  • the alginate may be any water-soluble salt, and metal salts, ammonium salts, etc. can be used.
  • metal salts, ammonium salts, etc. can be used.
  • sodium alginate, calcium alginate, ammonium alginate, etc. can be preferably used.
  • Alginic acid ester (also called propylene glycol alginate) is a derivative in which propylene glycol is ester-bonded to the carboxyl group of alginic acid.
  • the ratio of mannuronic acid and guluronic acid contained in alginate is arbitrary, and in general, when M>G, a highly flexible gel can be formed, and M ⁇ When it is G, a strong gel can be formed.
  • those containing 10 to 90%, 20 to 80%, 30 to 70%, or 40 to 60% of guluronic acid can be used.
  • a gel using alginate or alginate can be produced according to known methods (WO2010/032242, WO2011/154941), and gelation is performed by adding a cross-linking agent to an alginate or alginate solution.
  • WO2010/032242, WO2011/154941 WO2010/032242, WO2011/154941
  • gelation is performed by adding a cross-linking agent to an alginate or alginate solution.
  • the alginate or alginate can be contained in the solvent in an amount of 0.05-10% by weight, preferably 0.1-5% by weight, more preferably 0.5-3% by weight. Any solvent can be used as long as it can dissolve alginate or alginate, and water, physiological saline, and the like can be used.
  • the cross-linking agent is not particularly limited as long as it can gel the solution of alginate or alginate, but polyvalent metal cations can be used. As polyvalent metal cations, divalent metal cations are preferred, and calcium ions, strontium ions, and barium ions are more preferred.
  • a cross-linking agent can be used in the form of a salt, and in the present invention, at least one selected from calcium chloride, strontium chloride and barium chloride can be used as a cross-linking agent.
  • Nanofibers are natural or synthetic fibers with diameters in the nanometer range. Natural nanofibers include those comprising one or more of polysaccharides such as collagen, cellulose, silk fibroin, keratin, gelatin, chitosan. Synthetic nanofibers include polylactic acid (PLA), polycaprolactone (PCL), polyurethane (PU), poly(lactide-co-glycolide) (PLGA), poly(3-hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate) ( PHBV), poly(ethylene-co-vinyl acetate) (PEVA), and the like.
  • PLA polylactic acid
  • PCL polycaprolactone
  • PU polyurethane
  • PLGA poly(lactide-co-glycolide)
  • PHBV poly(3-hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate)
  • PEVA poly(ethylene-co-vinyl acetate)
  • Nanofibers are present in gels comprising alginate at less than 1 wt%, such as 0.9 wt%, 0.8 wt%, 0.7 wt%, 0.6 wt%, 0.5 wt%, or less. can be included in quantity.
  • the lower limit of the amount of nanofibers contained in the gel containing alginate or alginate is not particularly limited, it can be 0.05% by weight or more, preferably 0.1% by weight or more.
  • Embedding the cell population in a gel containing alginate or alginate can be performed by any means, but is not particularly limited.
  • the cell population is mixed in an alginate or alginate solution, It can be carried out by gelling.
  • the cell population is contained in an alginate or alginate solution in an amount selected from 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 9 cells/mL, preferably 1 ⁇ 10 7 to 1 ⁇ 10 8 cells/mL. can be done.
  • Gelation of an alginate or alginate solution containing a cell population can be performed by adding a cross-linking agent to the solution.
  • the amount of cross-linking agent added may be an amount selected from 0.1 to 5% by weight, such as 0.1 to 1% by weight of the solution.
  • Gelation can be performed in a container having a predetermined configuration and/or shape used for cell culture or cell transplantation, or in a mold designed to obtain a gel that fits the container.
  • the alginate or alginate solution containing the cell population may be added dropwise to the solution of the cross-linking agent.
  • the size of the droplet can be adjusted according to the shape of the nozzle and the method of dropping, and thus the size of the gel capsule containing alginic acid can be defined.
  • the dropping method is not particularly limited, but methods such as an air spray method, an airless spray method, and an electrostatic spray method can be used.
  • the size of the gel capsule containing alginic acid is not particularly limited, but the diameter can be 5 mm or less, 1 mm or less, or 500 ⁇ m or less.
  • the crosslinker solution may contain an amount of crosslinker selected from 0.1 to 10% by weight, such as 0.1 to 5% by weight.
  • the insulin-producing cell population obtained by the present invention When the insulin-producing cell population obtained by the present invention is transplanted into an animal body and differentiated in the animal body, it can be left as it is and used as cells that produce and secrete insulin. .
  • the insulin-producing cell population obtained by the present invention is useful as a cell medicine for treating diabetes, particularly type I diabetes, either as it is or by encapsulating it and transplanting it to the affected area.
  • the insulin-producing cell population obtained by the present invention may be a prodrug.
  • prodrug refers to a cell population that differentiates after being transplanted into a living body and changes into cells that have the ability to treat diseases.
  • the insulin-producing cell population obtained by the present invention has low toxicity (e.g., acute toxicity, chronic toxicity, genotoxicity, reproductive toxicity, cardiotoxicity, carcinogenicity), and may be used as is or in combination with pharmacologically acceptable carriers, etc. can be safely administered to mammals (for example, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys, and humans) by mixing with a pharmaceutical composition.
  • mammals for example, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys, and humans
  • the present invention provides culture media for pancreatic endocrine progenitor cell populations and/or later differentiated cell populations comprising microtubule inhibitors.
  • the culture medium of the present invention includes RPMI 1640 medium, MEM medium, iMEM medium, DMEM/F12 medium, Improved MEM Zinc Option medium, Improved MEM/1% B-27/Penisilin Streptomycin medium, MCDB131/20 mM Glucose/NaHCO 3 /FAF.
  • a basal medium used for culturing mammalian cells such as BSA/ITS-X/GlutaMAX TM /ascorbic acid/Penisilin Streptomycin medium, to which the microtubule inhibitor is added in the above amount.
  • the culture medium of the present invention can be used as a differentiation medium for inducing the differentiation of a pancreatic endocrine progenitor cell population and/or a cell population at a later stage of differentiation into an insulin-producing cell population.
  • the differentiation medium of the present invention can be used in step 6) in the method for inducing the differentiation of pluripotent stem cells into insulin-positive cells.
  • the differentiation medium of the present invention further contains growth factors, various inhibitors, serum replacements, antibiotics, vitamins, and other factors required in step 6).
  • the differentiation medium used in step 6 contains ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor XX, ⁇ -secretase inhibitor RO , N-cysteine, AXL inhibitors, ascorbic acid, Wnt inhibitors, ROCK inhibitors, FGF (preferably FGF2), serum replacements, vitamins, antibiotics, ZnSO 4 , heparin, N-acetylcysteine, Trolox, R428, FGFR1 Inhibitors and the like can be added in predetermined amounts.
  • the culture medium of the present invention can be used as a culture medium for culturing the above-mentioned "cell population at a later stage of differentiation". In one embodiment, 3 days, 4 days, 5 days, 6 days, 7 days, 8 days, or more until the end of step 6) in the above-described method for inducing differentiation of pluripotent stem cells into insulin-positive cells or after completion of step 6).
  • the culture medium further contains ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor XX, ⁇ -secretase inhibitor RO, N-cysteine, AXL inhibitor, ascorbic acid, and Wnt inhibitors, ROCK inhibitors, FGF (preferably FGF2), serum replacements, vitamins, antibiotics, etc. may be added as appropriate, for example, ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, and Ascorbic acid may be added, or T3, ALK5 inhibitor II, ZnSO 4 , heparin, N-acetylcysteine, Trolox, and R428 may be added.
  • ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor XX, ⁇ -secretase inhibitor RO, N-cysteine, AXL inhibitor, ascorbic acid, and Wnt inhibitors, ROCK inhibitors, FGF (preferably FGF2), serum replacements, vitamins, antibiotics, etc. may be added as
  • the present invention also provides a culture medium for an insulin-producing cell population containing EGF or a substance having an activity equivalent or similar thereto.
  • the culture medium of the present invention comprises the above-mentioned basal medium and the above-mentioned EGF or a substance having an activity equivalent or similar thereto in an arbitrary amount capable of promoting the growth of non-endocrine cells.
  • the basal medium is preferably MCDB131/20 mM Glucose/NaHCO 3 /FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/Penisilin Streptomycin medium.
  • the amount of EGF or a substance having equivalent or similar activity contained in the medium is as described above.
  • the culture medium containing EGF or a substance having an activity equivalent or similar thereto is a culture medium for detecting non-endocrine cells present in the insulin-producing cell population, and is used for the above-described prolonged culture of the insulin-producing cell population. can be used
  • any of the culture media of the present invention may be provided in one form by mixing the basal medium, the microtubule inhibitor or EGF or a substance having an activity equivalent or similar thereto, and the other factors mentioned above, or They may be provided and prepared in multiple forms in any combination or each separately.
  • a method for removing non-endocrine cells also includes treating a pancreatic endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells and/or a cell population at a later stage of differentiation with a microtubule inhibitor.
  • the present invention relates to a method for removing non-endocrine cells, including A pancreatic endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells and/or a cell population at a later differentiation stage can be treated with a microtubule inhibitor as defined above.
  • Example 1 Evaluation of proliferation of non-endocrine cells when an insulin-producing cell population was cultured for an extended period in a basal medium containing EGF1.
  • Method (1) Preparation of insulin-producing cell population Differentiation induction from the Ff-I14s04 iPS cell line into an insulin-producing cell population was performed according to the above steps 1) to 6) and a previous report (Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133). It was carried out by a three-dimensional culture method using a reactor and a multi-hole plate.
  • a medium DMEM / 1% B-27 (INS +) / Penisilin Streptomycin / dimethyl sulfoxide containing differentiation inducers (GSK3 ⁇ inhibitor, ROCK inhibitor and low dose activin A) under conditions where iPS cells act on insulin
  • medium DMEM/1% B-27 (INS-)/Penisilin Streptomycin/dimethylsulfoxide
  • a differentiation inducer low dose activin A
  • pancreatic endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from the definitive endoderm cell population was treated with a differentiation-inducing factor (ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, ascorbic acid) and FGF receptor 1 inhibition.
  • the cells were cultured in a medium (Improved MEM/1% B-27 (INS+)/Penisilin Streptomycin) containing the agent (PD-166866) to obtain an insulin-producing cell population. Switching from the bioreactor to the perforated plate was performed in step 6).
  • Example 2 Evaluation of proliferation of non-endocrine cells when an insulin-producing cell population prepared by adding the taxoid anticancer agent Docetaxel was cultured for an extended period of time in a basal medium containing EGF.
  • Method (1) Preparation of insulin-producing cell population including treatment with Cisplatin or Docetaxel in the induction step Differentiation induction from the QHJI-I14s04 iPS cell line to the insulin-producing cell population is performed according to the above steps 1) to 6) or previously reported (Nature Biotechnology 2014; 32:1121-1133), a three-dimensional culture method using a bioreactor was performed.
  • a medium DMEM / 1% B-27 (INS +) / Penisilin Streptomycin / dimethyl sulfoxide containing differentiation inducers (GSK3 ⁇ inhibitor, ROCK inhibitor and low dose activin A) under conditions where iPS cells act on insulin
  • medium DMEM/1% B-27 (INS-)/Penisilin Streptomycin/dimethylsulfoxide
  • a differentiation inducer low dose activin A
  • pancreatic endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from the definitive endoderm cell population was treated with a differentiation-inducing factor (ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, ascorbic acid) and FGF receptor 1 inhibition.
  • the cells were cultured in a medium (Improved MEM/1% B-27 (INS+)/Penisilin Streptomycin) containing the agent (PD-166866) to obtain an insulin-producing cell population.
  • step 6 Induction is performed by adding Cisplatin at a final concentration of 3 ⁇ M or Docetaxel at a final concentration of 1 ⁇ M to the medium for 7 days from day 4 to the end of culture (day 11). gone.
  • the percentage of PDX1-negative and CHGA-negative (PDX1-/CHGA-) cells was greatly reduced.
  • the ratio of PDX1-positive and CHGA-negative (PDX1+/CHGA-) and PDX1-negative and CHGA-negative (PDX1-/CHGA-) after extended culture containing EGF was higher than that of the control cell population. Both decreased significantly.
  • the total number of cells after extended culture containing EGF increased with the increase in non-endocrine cells in the control cell population and the Cisplatin-added cell population. Since no increase in non-endocrine cells was observed in the docetaxel-added cell population, the total cell number after extended culture decreased. On the other hand, no change in the number of CHGA-positive endocrine cells after extended culture was observed in the Cisplatin-added cell population and the Docetaxel-added cell population compared to the control cell population. From the above, it is considered that treatment with cisplatin or docetaxel suppresses the increase of non-endocrine cells, but does not affect the number of endocrine cells.
  • the PDX1-positive, CHGA-negative and PDX1-negative, CHGA-negative non-endocrine cells increased by extended culture contained a large number of proliferation marker Ki67-positive cells. Therefore, these non-endocrine cells are considered to be proliferative.
  • Example 3 Evaluation of marker protein expression of insulin-producing cell population prepared by adding Docetaxel1.
  • Method (1) Preparation of insulin-producing cell population including Docetaxel treatment in the induction step Differentiation induction from QHJI-I14s04 iPS cell lines to insulin-producing cells is performed according to the above steps 1) to 6) or previously reported (Nature Biotechnology 2014; 32: 1121 -1133), it was carried out by a three-dimensional culture method using a bioreactor and a perforated plate.
  • a medium DMEM / 1% B-27 (INS +) / Penisilin Streptomycin / dimethyl sulfoxide containing differentiation inducers (GSK3 ⁇ inhibitor, ROCK inhibitor and low dose activin A) under conditions where iPS cells act on insulin
  • a medium DMEM/1% B-27 (INS-)/Penisilin Streptomycin/dimethylsulfoxide containing a differentiation inducer (low dose activin A) under insulin-inhibited conditions.
  • a pancreatic endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from the definitive endoderm cells was treated with a differentiation-inducing factor (ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, ascorbic acid) and an FGF receptor 1 inhibitor.
  • Insulin-producing cell populations were obtained by culturing in a medium (MCDB131/20 mM Glucose/NaHCO 3 /FAF-BSA/ITS-X/Glutamax/Penisilin Streptomycin) containing (PD-166866). Switching from the bioreactor to the perforated plate was performed in step 6).
  • Docetaxel was treated, it was induced by adding it to the medium at a final concentration of 1, 3 or 10 ⁇ M for 7 days from the 4th day after the start of Step 6) to the end of the culture (11th day).
  • NKX6.1 Marker Protein Expression and Cell Number Marker protein expression (NKX6.1, C-peptide (Insulin), CHGA, and Ki67) in each insulin-producing cell population after culture was measured by flow cytometry.
  • Each sample was sampled from a separate culture vessel. The number of cells was measured with an automatic cell counter at the time of sample preparation for flow cytometry, and the total number of cells per well of the multi-hole plate was calculated.
  • FIG. 4 shows measurement results and cell counts by flow cytometry.
  • Docetaxel (+Docetaxel)
  • the proportion of INS-positive and NKX6.1-positive cells expected to mature into pancreatic ⁇ cells increased by about 10% relative to the control cell population. This effect was unchanged by increasing the concentration of Docetaxel to 10 ⁇ M.
  • Example 4 Evaluation of proliferation of non-endocrine cells when a cell population containing insulin-producing cells was treated with Docetaxel and then subjected to extended culture in a basal medium containing EGF1.
  • Method (1) Preparation of insulin-producing cell populations by subjecting cell populations containing insulin-producing cells to Docetaxel treatment QHJI-I14s04 Induction of differentiation from iPS cell lines to insulin-producing cell populations is performed according to the above steps 1) to 6) and in the previous report ( Nature Biotechnology 2014; 32: 1121-1133), it was performed by a three-dimensional culture method using a bioreactor.
  • a medium DMEM / 1% B-27 (INS +) / Penisilin Streptomycin / dimethyl sulfoxide containing differentiation inducers (GSK3 ⁇ inhibitor, ROCK inhibitor and low dose activin A) under conditions where iPS cells act on insulin
  • medium DMEM/1% B-27 (INS-)/Penisilin Streptomycin/dimethylsulfoxide
  • a differentiation inducer low dose activin A
  • pancreatic endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from the definitive endoderm cell population was treated with a differentiation-inducing factor (ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, ascorbic acid) and FGF receptor 1 inhibition.
  • a cell population obtained by culturing for 7 days in a medium (Improved MEM/1% B-27 (INS+)/Penisilin Streptomycin) containing an agent (PD-166866) obtained on day 7 after the start of step 6).
  • a medium Improved MEM/1% B-27 (INS+)/Penisilin Streptomycin
  • PD-166866 an agent
  • Step 6 (3) Evaluation of Marker Protein Expression and Cell Number Marker protein expression (PDX1, CHGA) in each cell population before and after extension culture was measured by flow cytometry. Step 6) The expression of marker proteins (NKX6.1, C-peptide (Insulin), PDX1, and CHGA) in the cell population obtained 7 days after initiation was also measured by flow cytometry. Each sample was sampled from a separate culture vessel. The number of cells was measured with an automatic cell counter at the time of sample preparation for flow cytometry, and the total number of cells per well of the multi-hole plate was calculated.
  • marker proteins NKX6.1, C-peptide (Insulin), PDX1, and CHGA
  • the control cell population was mostly CHGA-positive endocrine cells before extended culture, but after extended culture in a basal medium containing EGF, it became PDX1-positive and CHGA-negative (PDX1+/CHGA-) and PDX1-negative.
  • the proportion of /CHGA-negative (PDX1-/CHGA-) non-endocrine cells was significantly increased.
  • the Docetaxel-added cell population was PDX1-positive after extended culture containing EGF and Both the proportion of CHGA-negative (PDX1+/CHGA-) and PDX1-negative and CHGA-negative (PDX1-/CHGA-) decreased significantly.
  • proliferative non-endocrine cells contaminating the cell population can be detected by prolonged culture of the insulin-producing cell population in a basal medium containing EGF.
  • non-endocrine cells are reduced by treating the pancreatic endocrine progenitor cell population and the cell population in the subsequent differentiation stage with a taxoid anticancer drug such as Docetaxel.
  • a taxoid anticancer drug such as Docetaxel
  • Example 5 Evaluation of efficacy and safety by in vivo transplantation of insulin-producing cell population prepared by adding Docetaxel1.
  • Method (1) In vivo transplantation of insulin-producing cell population prepared by adding Docetaxel An immunodeficient NOD/SCID mouse in which insulin-deficient diabetes was induced by streptozotocin was prepared, and Docetaxel was added by the method described in Example 2 above. The resulting insulin-producing cell population was dispersed in a fibrin gel, which was subcutaneously implanted into the mouse. After transplantation, plasma human C-peptide concentrations were measured over time. At 6 months after transplantation, the grafts were excised and weighed. As a control, an insulin-producing cell population prepared without the addition of Docetaxel was subcutaneously transplanted into the mouse, and the plasma human C-peptide concentration was measured over time and the weight of the explant removed at 6 months after transplantation. were similarly measured.
  • FIG. 6 shows the results of human C-peptide concentration in plasma and graft weight measured as a follow-up observation after in vivo transplantation of an insulin-producing cell population prepared by adding Docetaxel.
  • the subcutaneously implanted insulin-producing cell population prepared with the addition of Docetaxel showed the same level of human C-peptide secretion in plasma as the insulin-producing cell population prepared without the addition of Docetaxel, which continued up to 6 months after transplantation. confirmed for sure. Graft weight at 6 months tended to be lower in insulin-producing cell populations prepared with Docetaxel added.
  • Table 9 shows the number and frequency of occurrence of non-endocrine cell populations aggregated from the results of four transplantation tests conducted using the insulin-producing cell populations prepared by adding Docetaxel.
  • the incidence of Outgrowth and Cyst was 73% (16/22) and 100% (22/22), respectively. 22
  • the transplanted group of insulin-producing cell populations prepared by adding Docetaxel Docetaxel(+)
  • 0% (0/21) and 10% (2/21) A clear reduction in the non-endocrine cell appearance rate in the strips was confirmed.
  • Outgrowth shown in Table 9 refers to a population of human nucleus-positive, PDX1-negative, and Ki67-positive non-endocrine cells, the presence of which was determined by immunohistochemical staining together with morphology by HE staining.
  • Cyst shown in Table 9 refers to human nucleus-positive, PDX1-positive, and CK19-positive non-endocrine ductal cells, the presence of which was determined by immunohistochemical staining along with tubular morphology by HE staining.
  • the insulin-producing cell population prepared by adding Docetaxel suppresses the proliferation of non-endocrine cells and produces endocrine cells and insulin-producing cells at a high rate even in the transplanted body. Efficacy and safety were confirmed.

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Abstract

本発明は、多能性幹細胞からインスリン産生細胞集団を分化誘導するための新規な方法を提供することを目的とするものであり、インスリン産生細胞集団を製造する方法であって、膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を処理対象とし、チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物を含む培地中で培養することを含む、方法を提供する。

Description

成熟化剤
　本発明は、多能性幹細胞からのインスリン産生細胞集団の製造方法に関する。より詳細には、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物で処理することを特徴とする、インスリン産生細胞集団の製造方法に関する。
　［発明の背景］
　ｉＰＳ細胞やＥＳ細胞などの多能性幹細胞から、インスリン産生細胞や膵β細胞を分化誘導し、糖尿病の治療に応用する研究が進められている。
　これまでに、多能性幹細胞からインスリン産生細胞集団へと分化誘導するために様々な手法が、開発・報告されている（非特許文献１）。しかしながら、分化誘導して得られるインスリン産生細胞集団には、インスリン産生細胞等の目的細胞以外にも、様々な細胞が含まれている。インスリン産生細胞集団を糖尿病治療に応用しようとした場合、細胞集団に含まれる細胞の種類を厳密に制御することは、安全性の観点から極めて重要である。そのため、目的外細胞の混入を低減することが可能な新たなインスリン産生細胞集団の分化誘導方法が切望されていた。
Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４、１８５－１９７
　本発明は、多能性幹細胞からインスリン産生細胞集団を分化誘導するための新規な方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、多能性幹細胞から分化誘導して得られたインスリン産生細胞集団を、基礎培地を用いた延長培養に付すことによって、当該細胞集団中に僅かに残存する目的外細胞（増殖性の非内分泌系細胞）でも、高感度に検出できることを見出した。
　また、本発明者らは、多能性幹細胞からインスリン産生細胞集団を誘導する過程において、膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をチューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物（以下、「微小管阻害剤」と記載する場合がある）を含む培地中で培養することによって、得られるインスリン産生細胞集団中に存在する前記目的外細胞を低減できることを見出した。
　本発明は、これらの新規知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
［１］　インスリン産生細胞集団を製造する方法であって、
膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を処理対象とし、チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物を含む培地中で培養することを含む、方法。
［２］　チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物が、タキソイド系抗がん剤より選択される化合物又はその薬理学的に許容される塩である、［１］の方法。
［３］　チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物が、ドセタキセル又はその薬理学的に許容される塩である、［１］又は［２］の方法。
［４］　製造されたインスリン産生細胞集団が、ＣＨＧＡ陽性細胞を９５％以上含む、［１］～［３］のいずれかの方法。
［５］　製造されたインスリン産生細胞集団が、ＣＨＧＡ陰性かつＫｉ６７陽性細胞を０．１％以下含む、［１］～［３］のいずれかの方法。
［６］　処理対象である膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導して製造されたものである、［１］～［５］のいずれかの方法。
［７］　チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物を含む、膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の培養培地。
［８］　チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物が、タキソイド系抗がん剤より選択される化合物又はその薬理学的に許容される塩である、［７］の培養培地。
［９］　チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物が、ドセタキセル又はその薬理学的に許容される塩である、［７］又は［８］の培養培地。
［１０］　ＣＨＧＡ陽性細胞の割合を増大させるため、ならびに／あるいは、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性細胞の割合を増大させるために使用される、［７］～［９］のいずれかの培養培地。
［１０－１］　インスリン産生細胞集団を増殖因子を含む培地中で培養することを含む、前記インスリン産生細胞集団における非内分泌系細胞を検出する方法。
［１０－２］　インスリン産生細胞集団を上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）又はそれと同等もしくは類似の活性を有する物質を含む培地中で培養することを含む、前記インスリン産生細胞集団における非内分泌系細胞を検出する方法。
［１１］　インスリン産生細胞集団を上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む培地中で培養することを含む、前記インスリン産生細胞集団における非内分泌系細胞を検出する方法。
［１２］　非内分泌系細胞が、ＣＨＧＡ陰性かつＰＤＸ１陽性細胞及び／又はＣＨＧＡ陰性かつＰＤＸ１陰性細胞である、［１１］の方法。
［１３］　非内分泌系細胞を除去する方法であって、
膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を処理対象とし、チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物を含む培地中で培養することを含む、方法。
［１３－１］　インスリン産生細胞集団における非内分泌系細胞を検出するために使用される、増殖因子を含むインスリン産生細胞集団の培養培地。
［１３－２］　インスリン産生細胞集団における非内分泌系細胞を検出するために使用される、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）又はそれと同等もしくは類似の活性を有する物質を含むインスリン産生細胞集団の培養培地。
［１４］　インスリン産生細胞集団における非内分泌系細胞を検出するために使用される、ＥＧＦを含むインスリン産生細胞集団の培養培地。
　本明細書は本願の優先権の基礎である２０２１年２月９日に出願された日本国特許出願２０２１－０１９１２０号の明細書等に記載される内容を包含する。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとりいれるものとする。
　本発明によれば、多能性幹細胞からインスリン産生細胞集団を分化誘導するための新規な方法を提供することができる。本発明によれば、目的外細胞の混入が低減されたインスリン産生細胞集団を得ることができる。
図１は、上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む基礎培地で延長培養したインスリン産生細胞集団におけるマーカータンパク質（ＰＤＸ１及びＣＨＧＡ）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。 図２は、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ又はＤｏｃｅｔａｘｅｌで処理して得られたインスリン産生細胞集団を、ＥＧＦを含む基礎培地で延長培養した後、当該各細胞集団におけるマーカータンパク質（ＰＤＸ１及びＣＨＧＡ）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果、ならびに延長培養後の当該各細胞集団の写真図を示す。ｃｏｎｔｒｏｌ細胞集団は、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ及びＤｏｃｅｔａｘｅｌのいずれも用いずに得られたインスリン産生細胞集団であり、同様に延長培養した。 図３は、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ又はＤｏｃｅｔａｘｅｌで処理して得られたインスリン産生細胞集団を、ＥＧＦを含む基礎培地で延長培養した後、当該各細胞集団におけるマーカータンパク質（ＰＤＸ１及びＫｉ６７）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。ｃｏｎｔｒｏｌ細胞集団は、Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ及びＤｏｃｅｔａｘｅｌのいずれも用いずに得られたインスリン産生細胞集団であり、同様に延長培養した。 図４は、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌで処理して得られたインスリン産生細胞集団におけるマーカータンパク質（ＩＮＳ及びＮＫＸ６．１、ならびに、ＣＨＧＡ及びＫｉ６７）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。ｃｏｎｔｒｏｌ細胞集団は、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを用いずに得られたインスリン産生細胞集団である。 図５は、（Ａ）工程６）開始後７日目にて得られた細胞集団におけるマーカータンパク質（ＮＫＸ６．１、Ｃ－ペプチド（インスリン）、ＰＤＸ１、ＣＨＧＡ）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果、ならびに、（Ｂ）工程６）開始後４日目から７日間、又は工程６）開始後７日目から４日間、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌで処理して得られたインスリン産生細胞集団を、ＥＧＦを含む基礎培地で延長培養した後、当該各細胞集団におけるマーカータンパク質（ＰＤＸ１及びＣＨＧＡ）の発現をフローサイトメトリーにより解析した結果を示す。ｃｏｎｔｒｏｌの細胞集団は、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを用いずに得られたインスリン産生細胞集団であり、同様に延長培養した。 図６は、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌで処理して得られたインスリン産生細胞集団（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ（＋））又はＤｏｃｅｔａｘｅｌを添加せず作製したインスリン産生細胞集団（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ（－））が皮下移植された、インスリン欠乏性の糖尿病を誘発させた免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスにおける血漿中のヒトＣ－ペプチド濃度（Ａ）、ならびに、移植６か月後の時点で摘出された当該移植片の重量（Ｂ）の測定結果を示す。
１．用語
　以下、本明細書において記載される用語について説明する。
　本明細書において、「約」又は「およそ」とは、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ２５％、２０％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％又は１％まで変動する値を示す。好ましくは、「約」又は「およそ」という用語は、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ１５％、１０％、５％、又は１％の範囲を示す。
　本明細書において、「～を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ）又はｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。
　本明細書において、「～からなる（ｃｏｎｓｉｓｔ（ｓ）　ｏｆ又はｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｏｆ）」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「～からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。
　本明細書において、「フィーダー細胞を使用」しないとは、基本的にフィーダー細胞を含まないこと、フィーダー細胞を培養することによってプレコンディショニングした培地などを使用しないことを意味する。したがって、培地中にはフィーダー細胞から分泌される成長因子及びサイトカインなどの物質は含まれない。
　なお、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」とは、別な種類の細胞と共培養され、その細胞を支持し、成長することができる環境をもたらす細胞を意味する。フィーダー細胞は、それらが支持する細胞とは同じ種由来であっても、異なる種由来であってもよい。例えば、ヒト細胞のフィーダーとして、ヒト皮膚線維芽細胞又はヒト胚性幹細胞を使用してもよいし、マウス胚線維芽細胞の初代培養物、及び不死化マウス胚線維芽細胞を使用してもよい。フィーダー細胞は、放射線照射又はマイトマイシンＣ処理などによって不活性化することができる。
　本明細書において、「接着」とは、細胞が容器に付着していること、例えば、細胞が適切な培地の存在下で滅菌プラスチック（又はコーティングされたプラスチック）の細胞培養ディッシュ又はフラスコに付着していることを指す。細胞のなかには、細胞培養容器に接着させなければ培養物中で維持できない、あるいは成長しないものもある。これに対し、非接着性細胞は、容器に接着させることなく培養物中で維持され、増殖できる。
　本明細書において、「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、成長させ、かつ／又は分化させることを指す。「培養する」とは、組織又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ又はフラスコ中で細胞を持続させ、増殖させ、かつ／又は分化させることを意味する。培養には２次元培養（平面培養）や、３次元培養（浮遊培養）が含まれる。
　本明細書において、「富化する（ｅｎｒｉｃｈ）」及び「富化すること（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を増加させることを指し、「富化された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、富化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して増加している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して富化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、富化される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について富化することもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって富化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％富化される。
　本明細書において、「枯渇する（ｄｅｐｌｅｔｅ）」及び「枯渇すること（ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を減少させることを指し、「枯渇された（ｄｅｐｌｅｔｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、枯渇される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して枯渇させることができ、したがって、標的細胞型の割合は、枯渇される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して減少する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について枯渇させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって枯渇させることもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を枯渇させる方法により、細胞集団は標的細胞集団に関して少なくとも５０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％減少（枯渇）している。
　本明細書において、「純化する（ｐｕｒｉｆｙ）」及び「純化すること（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、細胞の組成物などの組成物中の不純物を取り除き、特定の構成成分について純粋なものにすることを指し、「純化された（ｐｕｒｉｆｉｅｄ）」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、不純物の量が、純化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少し、特定の構成成分の純度が向上している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して純化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、純化する前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について純化させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって純化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を純化する方法により、標的細胞集団の純度は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％になるか、不純物（夾雑細胞を含む）は検出できない程度になりうる。
　本明細書において、「マーカー」とは、「マーカータンパク質」、「マーカー遺伝子」など、所定の細胞型により特異的に発現される細胞抗原又はその遺伝子を意味する。好ましくは、マーカーは細胞表面マーカーであり、その場合、生存細胞の濃縮、単離、及び／又は検出が実施可能となる。マーカーは、陽性選択マーカー或いは陰性選択マーカーでありうる。
　マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＡ、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法及び／又は核酸検出方法、例えば、ＲＴ－ＰＣＲ、マイクロアレイ、バイオチップ等を利用して行うことができる。本明細書において、マーカータンパク質が「陽性」であるとは、フローサイトメトリーで陽性と検出されることを意味し、「陰性」とは、フローサイトメトリーで検出限界以下であることを意味する。また、本明細書において、マーカー遺伝子が「陽性」であるとは、ＲＴ－ＰＣＲにより検出されることを意味し、「陰性」とはＲＴ－ＰＣＲで検出限界以下であることを意味する。
　本明細書において、「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」とは、細胞内のプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。
　本明細書において、「ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子」とは、ＣＤＫ８／１９の阻害活性を有するあらゆる物質を意味する。同じＣＤＫファミリーの他のタンパク質とは対照的に、ＣＤＫ８は、細胞増殖には必要とされず、ＣＤＫ８の阻害は、通常の条件下では大きな効果はない。ＣＤＫ１９とＣＤＫ８は類似しており、ＣＤＫ８の阻害は通常ＣＤＫ１９の阻害も伴う。本発明において、ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子は、従来公知のものを使用することができ、特許文献又は非特許文献から見つけることができる。例えば、ＵＳ２０１２／００７１４７７、ＷＯ２０１５／１５９９３７、ＷＯ２０１５／１５９９３８、ＷＯ２０１３／１１６７８６、ＷＯ２０１４／００３８９５８、ＷＯ２０１４／１３４１６９、ＪＰ２０１５／５０６３７６、ＵＳ２０１５／０２７４７２６、ＵＳ２０１６／００００７８７、ＷＯ２０１６／００９０７６、ＷＯ２０１６／００１６９５１、ＷＯ２０１６／０１８５１１、ＷＯ２０１６／１００７８２及びＷＯ２０１６／１８２９０４に記載される化合物のうち、ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する化合物（又はその塩）が挙げられる。より具体的には、ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子としては、ジエチル（Ｅ）－（４－（３－（５－（４－フルオロフェニル）－１－メチル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）アクリルアミド）ベンジル）ホスホネート、２－（４－（４－（イソキノリン－４－イル）フェニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ－ジメチルアセトアミド、４－（（２－（６－（４－メチルピペラジン－１－カルボニル）ナフタレン－２－イル）エチル）アミノ）キナゾリン－６－カルボニトリル、４－（４－（２，３－ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン－６－イル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ベンゼン－１，３－ジオール、３－（２－（イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イルチオ）エチル）－４－（ナフタレン－１－イルスルホニル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン、（Ｅ）－３－（４－（１－シクロプロピル－１Ｈ－ピラゾール－４－イル）ピリジン－３－イル）－Ｎ－（４－（モルホリノメチル）フェニル）アクリルアミド、８－（２，４－ジフルオロフェノキシ）－１－メチル－４，５－ジヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｇ］インダゾール－６－カルボキサミド、４－（（４－フルオロフェニル）スルホニル）－３－（２－（イミダゾ［１，２－ｂ］ピリダジン－６－イルスルファニル）エチル）－３，４－ジヒドロキノキサリン－２（１Ｈ）－オン、２－（ベンジルアミノ）－４－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル）ベンズアミド、３－（３－（ベンジルオキシ）フェニル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン、４－（４－（２，３－ジヒドロ－１，４－ベンゾジオキシン－６－イル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ベンゼン－１，３－ジオール、Ｎ－ブチル－８－（４－メトキシフェニル）－１，６－ナフチリジン－２－カルボキサミド、８－（４－メチルフェニル）－Ｎ，Ｎ－ジプロピル－１，６－ナフチリジン－２－カルボキサミド又はそれらの塩等が挙げられる。
　ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子は上記した化合物に限定されるものではなく、ＣＤＫ８／１９のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＣＤＫ８／１９に結合する抗体、ドミナントネガティブＣＤＫ８／１９変異体等もＣＤＫ８／１９阻害剤として使用することができる。ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子又はＣＤＫ８／１９阻害剤は、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成されたものを利用することができる。
　本明細書において、「増殖因子」は特定の細胞の分化及び／又は増殖を促す内因性タンパク質である。「増殖因子」としては、例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）、酸性線維芽細胞増殖因子（ａＦＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ－１）、インスリン様増殖因子２（ＩＧＦ－２）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ－β）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、トランスフェリン、種々のインターロイキン（例えば、ＩＬ－１～ＩＬ－１８）、種々のコロニー刺激因子（例えば、顆粒球／マクロファージ－コロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ））、種々のインターフェロン（例えば、ＩＦＮ－γなど）及び幹細胞に対する効果を有する他のサイトカイン、例えば、幹細胞因子（ＳＣＦ）及びエリスロポエチン（Ｅｐｏ）が挙げられる。
　本明細書において、「ＲＯＣＫ阻害剤」とは、Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ：Ｒｈｏ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ，ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）を阻害する物質を意味し、ＲＯＣＫ　ＩとＲＯＣＫ　ＩＩのいずれを阻害する物質であってもよい。ＲＯＣＫ阻害剤は、上記の機能を有する限り特に限定されず、例えば、Ｎ－（４－ピリジニル）－４β－［（Ｒ）－１－アミノエチル］シクロヘキサン－１α－カルボアミド（本明細書中、Ｙ－２７６３２と称することもある）、Ｆａｓｕｄｉｌ（ＨＡ１０７７）、（２Ｓ）－２－メチル－１－［（４－メチル－５－イソキノリニル］スルホニル］ヘキサヒドロ－１Ｈ－１，４－ジアゼピン（Ｈ－１１５２）、４β－［（１Ｒ）－１－アミノエチル］－Ｎ－（４－ピリジル）ベンゼン－１α－カルボアミド（Ｗｆ－５３６）、Ｎ－（１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－４－イル）－４ＰＥＲ（Ｒ）－１－アミノエチル］シクロヘキサン－１α－カルボアミド（Ｙ－３０１４１）、Ｎ－（３－｛［２－（４－アミノ－１，２，５－オキサジアゾール－３－イル）－１－エチル－１Ｈ－イミダゾ［４，５－ｃ］ピリジン－６－イル］オキシ｝フェニル）－４－｛［２－（４－モルホリニル）エチル］－オキシ｝ベンズアミド（ＧＳＫ２６９９６２Ａ）、Ｎ－（６－フルオロ－１Ｈ－インダゾール－５－イル）－６－メチル－２－オキソ－４－［４－（トリフルオロメチル）フェニル］－３，４－ジヒドロ－１Ｈ－ピリジン－５－カルボキサミド（ＧＳＫ４２９２８６Ａ）を挙げることができる。ＲＯＣＫ阻害剤はこれらに限定されるものではなく、ＲＯＣＫのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＲＯＣＫに結合する抗体、ドミナントネガティブＲＯＣＫ変異体等もＲＯＣＫ阻害剤として使用することができる。ＲＯＣＫ阻害剤は、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
　本明細書において、「ＧＳＫ３β阻害剤」とは、ＧＳＫ３β（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β）に対する阻害活性を有する物質である。ＧＳＫ３（グリコーゲンシンターゼキナーゼ３）は、セリン／スレオニンプロテインキナーゼの一種であり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。ＧＳＫ３にはαとβの２つのアイソフォームが存在する。本発明で用いられる「ＧＳＫ３β阻害剤」は、ＧＳＫ３β阻害活性を有すれば特に限定されず、ＧＳＫ３β阻害活性と合わせてＧＳＫ３α阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。
　ＧＳＫ３β阻害剤としては、ＣＨＩＲ９８０１４（２－［［２－［（５－ニトロ－６－アミノピリジン－２－イル）アミノ］エチル］アミノ］－４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（１Ｈ－イミダゾール－１－イル）ピリミジン）、ＣＨＩＲ９９０２１（６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル）、ＴＤＺＤ－８（４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、ＴＷＳ－１１９（３－［６－（３－アミノフェニル）－７Ｈ－ピロロ［２，３－ｄ］ピリミジン－４－イルオキシ］フェノール）、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、１－アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、ＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）及びＡＲ－ＡＯ１４４－１８、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、ピリドカルバゾール－シクロペンタジエニルルテニウム複合体、ＯＴＤＺＴ、アルファ－４－ジブロモアセトフェノン、リチウム等が例示される。ＧＳＫ３β阻害剤はこれらに限定されるものではなく、ＧＳＫ３βのｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＧＳＫ３βに結合する抗体、ドミナントネガティブＧＳＫ３β変異体等もＧＳＫ３β阻害剤として使用することができる。ＧＳＫ３β阻害剤は、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
　本明細書において、「ＦＧＦＲ１阻害剤」とは、少なくとも線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）１に対する阻害活性を有する物質である。ＦＧＦＲ１は、成長因子であるＦＧＦ１～ＦＧＦ１７に対して高い親和性を有する受容体として、４回膜貫通型チロシンキナーゼのファミリー（ＦＧＦＲ１，２，３，４）のメンバーである。本明細書において、「ＦＧＦＲ１阻害剤」とは、少なくともＦＧＦＲ１阻害活性を有していればよく、他のＦＧＦＲに対する阻害活性を有していてもよい。例えば、本明細書において、「ＦＧＦＲ１阻害剤」とはＦＧＦＲ１阻害活性を有する限り、ＦＧＦＲ２阻害剤、ＦＧＦＲ３阻害剤、ＦＧＦＲ４阻害剤等であってもよい。本発明において、ＦＧＦＲ１阻害剤は、従来公知のものを使用することができる。より具体的には、ＦＧＦＲ１阻害剤としては、ＰＤ－１６６８６６（１－［２－アミノ－６－（３，５－ジメトキシフェニル）－ピリド（２，３－ｄ）ピリミジン－７－イル］－３－ｔｅｒｔ－ブチルウレア：ＣＡＳ　Ｎｏ．：１９２７０５－７９－６）、Ｅ－３８１０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０５８１３７－２３－７）、ＰＤ－１７３０７４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２１９５８０－１１－７）、ＦＧＦＲ４－ＩＮ－１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１７０８９７１－７２－５）、ＦＧＦＲ－ＩＮ－１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１４４８１６９－７１－８）、ＦＩＩＮ－２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１６３３０４４－５６－０）、ＡＺＤ４５４７（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０３５２７０－３９－３）、ＦＩＩＮ－３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１６３７７３５－８４－２）、ＮＶＰ－ＢＧＪ３９８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３１０７４６－１０－１）、ＮＶＰ－ＢＧＪ３９８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８７２５１１－３４－７）、ＣＨ５１８３２８４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２６５２２９－２５－１）、Ｄｅｒａｚａｎｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２３４３５６－６９－４）、Ｄｅｒａｚａｎｔｉｎｉｂ　Ｒａｃｅｍａｔｅ、Ｆｅｒｕｌｉｃ　ａｃｉｄ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１１３５－２４－６）、ＳＳＲ１２８１２９Ｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８４８３１８－２５－２）、ＳＳＲ１２８１２９Ｅ　ｆｒｅｅ　ａｃｉｄ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８４８４６３－１３－８）、Ｅｒｄａｆｉｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３４６２４２－８１－６）、ＢＬＵ９９３１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１５３８６０４－６８－０）、ＰＲＮ１３７１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１８０２９２９－４３－６）、Ｓ４９０７６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２６５９６５－２２－７）、ＬＹ２８７４４５５（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２５４４７３－６４－７）、Ｌｉｎｓｉｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６７１６０－７１－２）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４０５１６９－１６－６）、Ａｎｌｏｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０５８１５６－９０－３）、Ｂｒｉｖａｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６４９７３５－４６－６）、Ｄｅｒａｚａｎｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２３４３５６－６９－４）、Ａｎｌｏｔｉｎｉｂ　Ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３６０４６０－８２－７）、ＡＣＴＢ－１００３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９３９８０５－３０－８）、ＢＬＵ－５５４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１７０７２８９－２１－１）、Ｒｏｇａｒａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１４４３５３０－０５－９）、ＢＩＢＦ　１１２０　ｅｓｙｌａｔｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６５６２４７－１８－６）、ＴＧ　１００５７２　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６７３３１－６４－４）、ＥＮＭＤ－２０７６（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９３４３５３－７６－１）、Ｂｒｉｖａｎｉｂ　ａｌａｎｉｎａｔｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６４９７３５－６３－７）、ＴＧ　１００５７２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６７３３４－０５－２）、ＢＩＢＦ　１１２０（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６５６２４７－１７－５）、ＥＮＭＤ－２０７６　Ｔａｒｔｒａｔｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２９１０７４－８７－７）、ＴＳＵ－６８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２５２９１６－２９－３）、Ｐｏｎａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：９４３３１９－７０－８）、Ｓｕｌｆａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１３０８６７２－７４－３）、ＬＹ２７８４５４４（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２２９２３６－８６－５）、Ｄｏｖｉｔｉｎｉｂ　ｌａｃｔａｔｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６９２７３７－８０－７）、ＳＵ　５４０２（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２１５５４３－９２－３）、ＦＧＦ－４０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１７０８９７１－５５－４）、Ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ－ＩＮ－１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：７０５９４６－２７－６）、ＰＰ５８（ＣＡＳ　Ｎｏ．：２１２３９１－５８－７）、ＴＧ　１００８０１　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１０１８０６９－８１－２）、Ｃｒｅｎｏｌａｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６７０２２０－８８－９）、ＴＧ　１００８０１（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８６７３３１－８２－６）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ　Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：６３５７０２－６４－６）、Ｐａｚｏｐａｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４４４７３１－５２－６）、ＰＤ１６８３９３（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１９４４２３－１５－９）、Ａｐａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：１２１８７７９－７５－９）、Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂ　ｉｓｅｔｈｉｏｎａｔｅ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８２７０２２－３３－３）、Ｆｏｒｅｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：８４９２１７－６４－７）、Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：４１７７１６－９２－８）、Ｔａｎｄｕｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ　Ｎｏ．：３８７８６７－１３－２）、等又はそれらの塩が例示される。
　ＦＧＦＲ１阻害剤は上記に示した化合物に限定されるものではなく、ＦＧＦＲ１のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ、ＦＧＦＲ１に結合する抗体、ドミナントネガティブＦＧＦＲ１変異体等もＦＧＦＲ１阻害剤として使用することができる。ＦＧＦＲ１阻害剤は、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
　本明細書において「血清代替物」とは、例えば、ＫｎｏｃｋＯｕｔTM　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ：Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（Ｗａｋｏ）、Ｂ－２７サプリメント、Ｎ２－サプリメント、アルブミン（例えば、脂質リッチアルブミン）、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素（例えば亜鉛、セレン（例えば、亜セレン酸ナトリウム））、２－メルカプトエタノール、３’チオールグリセロール又はこれらの混合物（例えば、ＩＴＳ－Ｇ）が挙げられる。血清代替物としては、Ｂ－２７サプリメント、ＫＳＲ、ＳｔｅｍＳｕｒｅ（登録商標）　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、ＩＴＳ－Ｇが好ましい。培地に血清代替物を添加する場合の培地中の濃度は０．０１～１０重量％、好ましくは０．１～２重量％である。本発明においては、血清に代えて「血清代替物」を使用することが好ましい。
２．インスリン産生細胞集団の製造方法、及びそれによって製造されたインスリン産生細胞集団
　本発明は、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をインスリン産生細胞集団に分化誘導する工程において、膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を微小管阻害剤で処理することを含む、インスリン産生細胞集団を製造する方法、ならびにそれによって作製されたインスリン産生細胞集団を提供する。
　本発明において、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をインスリン産生細胞集団に分化誘導する工程において、微小管阻害剤は膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団に作用して、内在する非内分泌系細胞が低減されたインスリン産生細胞集団を生じる。
　本発明において、「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、３胚葉のどの系統の細胞にも分化し得る能力を意味する。「多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）」は、胚盤には分化できず、したがって個体を形成する能力はないという点で、胚盤を含めて、生体のあらゆる組織に分化しうる「全能性（ｔｏｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは区別される。
　本発明において「多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を意味する。例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞はｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔだが、ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔではない。
　本発明において、「多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ）」とは、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織（内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て）に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ＥＳ細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」（本明細書中、「ｉＰＳ細胞」と称することもある）が挙げられる。好ましくは、本発明において、多能性幹細胞とはヒト多能性幹細胞である。
　「ＥＳ細胞」としては、マウスＥＳ細胞であれば、ｉｎＧｅｎｉｏｕｓ社、理化学研究所（理研）等が樹立した各種マウスＥＳ細胞株が利用可能であり、ヒトＥＳ細胞であれば、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）、理研、京都大学、Ｃｅｌｌａｒｔｉｓ社が樹立した各種ヒトＥＳ細胞株が利用可能である。たとえばＥＳ細胞株としては、ＮＩＨのＣＨＢ－１～ＣＨＢ－１２株、ＲＵＥＳ１株、ＲＵＥＳ２株、ＨＵＥＳ１～ＨＵＥＳ２８株等、ＷｉＣｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　ＩｎｓｔｉｔｕｔｅのＨ１株、Ｈ９株、理研のＫｈＥＳ－１株、ＫｈＥＳ－２株、ＫｈＥＳ－３株、ＫｈＥＳ－４株、ＫｈＥＳ－５株、ＳＳＥＳ１株、ＳＳＥＳ２株、ＳＳＥＳ３株等を利用することができる。
　「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子（核初期化因子）を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にＯｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４及びｃ－Ｍｙｃの４因子を導入することにより、樹立されたｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，Ｃｅｌｌ，（２００６）１２６：６６３－６７６）のほか、同様の４因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のｉＰＳ細胞（Ｔａｋａｈａｓｈｉ　Ｋ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｃｅｌｌ，（２００７）１３１：８６１－８７２．）、上記４因子導入後、Ｎａｎｏｇの発現を指標として選別し、樹立したＮａｎｏｇ－ｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ，Ｋ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，ａｎｄ　Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｎａｔｕｒｅ　４４８，３１３－３１７．）、ｃ－Ｍｙｃを含まない方法で作製されたｉＰＳ細胞（Ｎａｋａｇａｗａ　Ｍ，Ｙａｍａｎａｋａ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，１０１－１０６））、ウイルスフリーで６因子を導入して樹立されたｉＰＳ細胞（Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ　２０１１　Ｍａｙ；８（５）：４０９－１２，Ｏｋｉｔａ　Ｋ　ｅｔ　ａｌ．Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌｓ．３１（３）：４５８－６６．）も用いることができる。また、Ｔｈｏｍｓｏｎらにより作製されたＯＣＴ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ及びＬＩＮ２８の４因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞（Ｙｕ　Ｊ．，Ｔｈｏｍｓｏｎ　ＪＡ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（２００７）３１８：１９１７－１９２０．）、Ｄａｌｅｙらにより作製された人工多能性幹細胞（Ｐａｒｋ　ＩＨ，Ｄａｌｅｙ　ＧＱ．ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（２００７）４５１：１４１－１４６）、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞（特開２００８－３０７００７号）等も用いることができる。
　このほか、公開されているすべての論文（例えば、Ｓｈｉ　Ｙ．，Ｄｉｎｇ　Ｓ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ，（２００８）Ｖｏｌ３，Ｉｓｓｕｅ　５，５６８－５７４；Ｋｉｍ　ＪＢ．，Ｓｃｈｏｌｅｒ　ＨＲ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，（２００８）４５４，６４６－６５０；Ｈｕａｎｇｆｕ　Ｄ．，Ｍｅｌｔｏｎ，ＤＡ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，（２００８）２６，Ｎｏ　７，７９５－７９７）、あるいは特許（例えば、特開２００８－３０７００７号、特開２００８－２８３９７２号、ＵＳ２００８／２３３６６１０、ＵＳ２００９／０４７２６３、ＷＯ２００７／０６９６６６、ＷＯ２００８／１１８２２０、ＷＯ２００８／１２４１３３、ＷＯ２００８／１５１０５８、ＷＯ２００９／００６９３０、ＷＯ２００９／００６９９７、ＷＯ２００９／００７８５２）に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
　人工多能性細胞株としては、ＮＩＨ、理化学研究所（理研）、京都大学等が樹立した各種ｉＰＳ細胞株が利用可能である。例えば、ヒトｉＰＳ細胞株であれば、理研のＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－２Ａ株、ＨｉＰＳ－ＲＩＫＥＮ－１２Ａ株、Ｎｉｐｓ－Ｂ２株、京都大学のＦｆ－ＷＪ－１８株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０１株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０２株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０４株、Ｆｆ－Ｉ０１ｓ０６株、Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０３株、Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４株、ＱＨＪＩ０１ｓ０１株、ＱＨＪＩ０１ｓ０４株、ＱＨＪＩ１４ｓ０３株、ＱＨＪＩ１４ｓ０４株２５３Ｇ１株、２０１Ｂ７株、４０９Ｂ２株、４５４Ｅ２株、６０６Ａ１株、６１０Ｂ１株、６４８Ａ１株、ＣＤＩ社のＭｙＣｅｌｌ　ｉＰＳ　Ｃｅｌｌｓ（２１５２５．１０２．１０Ａ）株、ＭｙＣｅｌｌ　ｉＰＳ　Ｃｅｌｌｓ（２１５２６．１０１．１０Ａ）株、等が挙げられる。
　本発明において「膵内分泌前駆細胞集団」とは、膵内分泌前駆細胞を含む細胞集団を意味する。本発明において、膵内分泌前駆細胞は、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）、ＮｅｕｒｏＤ及びＮＧＮ３の少なくとも一つのマーカーの発現、および膵関連のホルモン系（例えば、インスリン等）のマーカーが発現していないことによって特徴付けられる細胞を意味する。膵内分泌前駆細胞は、ＰＡＸ－４、ＮＫＸ２．２、Ｉｓｌｅｔ－１、ＰＤＸ－１などのマーカーが発現していてもよい。
　一実施形態において、本発明における「膵内分泌前駆細胞集団」は、下記に詳述する多能性幹細胞をインスリン産生細胞へと分化誘導する工程において、工程５）終了後の培養物、又は工程６）における培養物に該当する細胞集団である。
　本発明における「膵内分泌前駆細胞集団」には、膵内分泌前駆細胞が３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、よりさらに好ましくは７０％以上の割合で含まれる。当該割合の上限は特に限定されないが、９０％以下、８０％以下、７０％以下、又は６０％以下である。当該割合は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該割合は３０％～９０％、好ましくは４０％～８０％、より好ましくは５０％～８０％、さらに好ましくは６０％～７０％である。膵内分泌前駆細胞集団には、膵内分泌前駆細胞に加えて、その他の細胞（例えば、膵前駆細胞、インスリン産生細胞、Ｋｉ６７陽性細胞、ＣＨＧＡ陰性細胞等）が含まれていてもよい。
　本発明において「それ以降の分化段階にある細胞集団」とは、膵内分泌前駆細胞よりも分化段階が進んだ細胞を、膵内分泌前駆細胞集団よりも多く含む細胞集団を意味する。「膵内分泌前駆細胞よりも分化段階が進んだ細胞」としては、インスリン産生細胞が挙げられる。本発明において、インスリン産生細胞は、インスリン及びＮＫＸ６．１の少なくとも一つのマーカーの発現、好ましくはインスリン及びＮＫＸ６．１の両マーカーの発現によって特徴付けられる細胞を意味する。インスリン産生細胞は好ましくは、ＮＧＮ３の発現量が膵内分泌前駆細胞にて確認される最大発現時の３分の１未満の割合である。
　本発明における「それ以降の分化段階にある細胞集団」には、インスリン産生細胞が３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらに好ましくは６０％以上、よりさらに好ましくは７０％以上の割合で含まれる。当該割合の上限は特に限定されないが、９０％以下、８０％以下、７０％以下、又は６０％以下である。当該割合は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該割合は３０％～９０％、好ましくは４０％～８０％、より好ましくは５０％～８０％、さらに好ましくは６０％～７０％である。「それ以降の分化段階にある細胞集団」には、インスリン産生細胞に加えて、その他の細胞（例えば、膵内分泌前駆細胞、インスリン産生細胞、Ｋｉ６７陽性細胞、ＣＨＧＡ陰性細胞等）が含まれていてもよい。
　一実施形態において、本発明における「それ以降の分化段階にある細胞集団」は、下記に詳述する多能性幹細胞をインスリン産生細胞へと分化誘導する工程において、工程６）終了までの３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、又はそれ以上の期間の培養物、あるいは工程６）終了後の培養物の細胞集団に該当する。
　なお、本明細書中に記載する細胞集団中の特定の細胞の割合は、フローサイトメトリーのような細胞数を算出可能な公知の手法に基づいて求めることができる。
　多能性幹細胞からインスリン産生細胞へと分化する過程においては、分化段階に応じて異なる特徴を有する細胞が出現することが知られている（ＷＯ２００９／０１２４２８、ＷＯ２０１６／０２１７３４）。例えば、この分化段階は比較的未分化な順に、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、膵前駆細胞、膵内分泌前駆細胞、インスリン産生細胞に大きく分類することができる。
　膵内分泌前駆細胞集団は、多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、膵前駆細胞、膵内分泌前駆細胞、及びインスリン産生細胞へと分化誘導する、以下の公知の分化誘導工程を利用して得ることができる：
　　工程１）多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞へと分化誘導する；
　　工程２）胚体内胚葉細胞から原腸管細胞へと分化誘導する；
　　工程３）原腸管細胞から後方前腸細胞へと分化誘導する；
　　工程４）後方前腸細胞から膵前駆細胞へと分化誘導する；
　　工程５）膵前駆細胞から膵内分泌前駆細胞へと分化誘導する；
　　工程６）膵内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞へと分化誘導する。
　以下、各工程を説明するが、各細胞への分化誘導はこれらの手法に限定されない。
工程１）胚体内胚葉細胞への分化
　多能性幹細胞は、低用量のアクチビンＡを含む培地中で培養して、胚体内胚葉細胞に分化させる。
　本工程で用いる培地としては、ＲＰＭＩ培地、ＭＥＭ培地、ｉＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ／１％Ｂ－２７サプリメント／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地、ＭＣＤＢ１３１／１０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／２０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ3／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／アスコルビン酸／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地など、哺乳類細胞の培養に使用される基礎培地を使用することができる。
　アクチビンＡは培地中に低用量にて、例えば、５～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは５～１０ｎｇ／ｍＬの量にて含めることができる。
　別の態様として、アクチビンＡの培地中の濃度は、約０．１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約３～１０ｎｇ／ｍＬである。
　培地にはさらに、ＲＯＣＫ阻害剤、及び／又はＧＳＫ３β阻害剤を添加することができる。
　ＧＳＫ３β阻害剤の培地中の濃度は、用いるＧＳＫ３β阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合の濃度は、通常２～５μＭ、好ましくは２～４μＭ、特に好ましくは約３μＭである。
　ＲＯＣＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いるＲＯＣＫ阻害剤の種類によって適宜設定されるが、例えばＲＯＣＫ阻害剤としてＹ２７６３２を使用する場合の濃度は、通常５～２０μＭ、好ましくは５～１５μＭ、特に好ましくは約１０μＭである。
　培地にはさらに、インスリンを添加することができる。インスリンは培地中に０．０１～２０μＭ、好ましくは０．１～１０μＭ、より好ましくは０．５～５μＭの量で含めることができる。培地中のインスリンの濃度は、添加したＢ－２７サプリメントに含まれるインスリンの濃度であってもよいが、これに限定されない。
　培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。培養開始時の細胞数は、特に限定されないが、２次元培養であれば、約５万～１００万細胞個／ｃｍ2、好ましくは約１０万～８０万細胞個／ｃｍ2、より好ましくは約１０～３０万細胞個／ｃｍ2とすることができる。また、培養開始時の細胞数は、特に限定されないが、３次元培養であれば、約１万～１００万細胞個／ｍＬ、好ましくは約１０万～８０万細胞個／ｍＬ、より好ましくは約３０万～６０万細胞個／ｍＬとすることができる。培養期間は１日～４日、好ましくは１日～３日、特に好ましくは３日である。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
　あるいは、本発明において胚体内胚葉細胞は、低用量のアクチビンＡの存在下、多能性幹細胞を、インスリンが作用する条件下の培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下の培地中で第２の培養を行うことにより製造することができる。
（１）第１の培養
　「インスリンが作用する条件」とは、インスリンによって細胞におけるインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じる条件を意味する。通常、インスリンは、細胞膜表面上に存在するインスリンレセプターと結合し、レセプターに内在するチロシンキナーゼを活性化させ、インスリンレセプター基質タンパクファミリー（ＩＲＳ：ＩＲＳ－１，２，３）をチロシンリン酸化する。本明細書において「インスリンシグナル伝達経路の活性化を生じる」とは、インスリンとインスリンレセプターとの結合により開始されるこれら一連の反応が生じることをいう。
　インスリンが作用する条件としては、例えば、培地中にインスリンを含む場合が挙げられる。インスリンは、多能性幹細胞におけるインスリンシグナル伝達経路を活性化できるものであればよく、組換え法で製造したものであっても、固相合成法で合成して製造したものであってもよい。インスリンは、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット等に由来するものを利用することができるが、好ましくはヒトインスリンである。
　本発明においては、多能性幹細胞におけるインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じる限り、インスリン変異体、インスリン誘導体又はインスリンアゴニストも、「インスリン」として用いることができる。「インスリン変異体」とは、インスリンのアミノ酸配列において１～２０個、好ましくは１～１０個、さらに好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、置換、付加もしくは挿入されたアミノ酸配列からなり、かつインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じることが可能なポリペプチドや、インスリンのアミノ酸配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じることが可能なポリペプチドを有するものが挙げられる。アミノ酸配列の比較は公知の手法によって行うことができ、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ　Ｌｏｃａｌ　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　Ｓｅａｒｃｈ　Ｔｏｏｌ　ａｔ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（米国国立生物学情報センターの基本ローカルアラインメント検索ツール））等を例えば、デフォルトの設定で用いて実施できる。「インスリン誘導体」とは、インスリン又はインスリン変異体のアミノ酸残基の一部の基が化学的に置換（例えば、α－メチル化、α－ヒドロキシル化）、欠失（例えば、脱アミノ化）、又は修飾（例えば、Ｎ－メチル化）されたアミノ酸配列からなり、かつインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じることが可能なポリペプチドまたは同様の作用を有する物質を意味する。「インスリンアゴニスト」とは、インスリンの構造に関係なく、インスリンレセプターと結合してインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じることが可能なポリペプチドまたは同様の作用を有する物質を意味する。
　第１の培養の培地には、インスリンを０．０１～２０μＭ、好ましくは０．１～１０μＭ、より好ましくは０．５～５μＭの量で含めることができる。培地中のインスリンの濃度は、添加したＢ－２７サプリメントに含まれるインスリンの濃度であってもよいが、これに限定されない。なお、本明細書中、インスリンを含むＢ－２７サプリメントを「Ｂ－２７（ＩＮＳ＋）」と記載し、インスリンを含まないＢ－２７サプリメントを「Ｂ－２７（ＩＮＳ－）」と記載する場合がある。
　培地にはさらに、ＲＯＣＫ阻害剤、及び／又はＧＳＫ３β阻害剤を含めることができる。ＲＯＣＫ阻害剤の培地中の濃度は、用いるＲＯＣＫ阻害剤の種類によって適宜設定されるが、例えばＲＯＣＫ阻害剤としてＹ－２７６３２を使用する場合の濃度は、通常５～２０μＭ、好ましくは５～１５μＭ、特に好ましくは約１０μＭとすることができる。ＧＳＫ３β阻害剤の培地中の濃度は、用いるＧＳＫ３β阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばＧＳＫ３β阻害剤としてＣＨＩＲ９９０２１を使用する場合の濃度は、通常２～５μＭ、好ましくは２～４μＭ、特に好ましくは約３μＭとすることができる。
　培地にはさらに、ピルビン酸塩（ナトリウム塩等）、Ｌ－アラニルＬ－グルタミン、及びグルコースからなる群から選択される一以上を含めることができる。ピルビン酸塩は培地中に、１０～１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは３０～５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０～２００ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは約１１０ｍｇ／Ｌの量で含めることができる。Ｌ－アラニルＬ－グルタミンは培地中に、５０～２０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１００～１５００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５００～１０００ｍｇ／Ｌ、特に好ましくは約８６０ｍｇ／Ｌの量で含めることができる。グルコースは培地中に、１５ｍＭ以上、好ましくは１５～３０ｍＭ、より好ましくは１５～２５ｍＭ、特に好ましくは約２５ｍＭの量で含めることができる。培地中のピルビン酸塩、Ｌ－アラニルＬ－グルタミン及びグルコースの濃度は、ＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ，ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ，ＧｌｕｔａＭＡＸＴＭ，ｐｙｒｕｖａｔｅ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））またはその他のＤＭＥＭ培地に含まれるピルビン酸塩、Ｌ－アラニルＬ－グルタミン及びグルコースの濃度であってもよいが、これに限定されない。
　培地は、上記基礎培地をベースとし上記成分の一又はそれ以上を添加したものを用いることができる。基礎培地としては、好ましくはＤＭＥＭ培地であり、より好ましくはピルビン酸塩、Ｌ－アラニルＬ－グルタミン、及びグルコースを上記の量で含むＤＭＥＭ培地である。
　第１の培養の培養期間は６時間～４８時間、好ましくは１２～２４時間より選択される範囲とすることができる。培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。培養開始時の細胞数は、特に限定されないが、２次元培養であれば、約５万～１００万細胞個／ｃｍ2、好ましくは約１０万～８０万細胞個／ｃｍ2、より好ましくは約１０～３０万細胞個／ｃｍ2とすることができる。
また、培養開始時の細胞数は、特に限定されないが、３次元培養であれば、約１万～１００万細胞個／ｍＬ、好ましくは約１０万～８０万細胞個／ｍＬ、より好ましくは約３０万～６０万細胞個／ｍＬとすることができる。
（２）第２の培養
　「インスリンが作用しない条件」とは、インスリンによる細胞におけるインスリンシグナル伝達経路の活性化が生じない条件を意味する。「細胞におけるインスリンシグナル伝達経路の活性化を生じない」とは、当該インスリンシグナル伝達経路の活性化が全く生じないことを意味するだけでなく、インスリン非存在下における当該インスリンシグナル伝達経路の活性化と比べて有意な差が認められない程度のわずかな活性化しか生じない場合も意味するものである。したがって、「インスリンが作用しない条件」とは、例えば、培地中にインスリンが含まれないこと、あるいは、培地中にインスリンが含まれる場合であっても、その量が前記有意な差が認められない程度のわずかな活性化しか生じない量で含まれる条件が挙げられる。あるいは、培地中にインスリンが含まれる場合であっても、一緒にインスリンシグナル阻害剤を含むことによって、前記インスリンシグナル伝達経路の活性化が生じない場合も意味する。「インスリンシグナル阻害剤」は、インスリンシグナル伝達経路をいずれかの位置で遮断することが可能な成分を意味する。このようなインスリンシグナル阻害剤としては、インスリン、インスリンレセプター、シグナル伝達物質として作用する各種タンパク質等に結合して又は競合し、これら因子が関与する分子間の相互作用を阻害するポリペプチドや化合物等が挙げられる。例えば、このようなインスリンシグナル阻害剤としては、ＰＩ３キナーゼの触媒サブユニットへのＡＴＰ結合を競合阻害するＬＹ２９４００２［２－（４－モルホリニル）－８－フェニル－４Ｈ－１－ベンゾピラン－４－オン］等が挙げられる。インスリンシグナル阻害剤はこれらに限定されるものではなく、インスリン、インスリンレセプター、シグナル伝達物質として作用する各種タンパク質に結合する抗体やそれらのドミナントネガティブ型変異体、ならびにインスリンレセプターやシグナル伝達物質として作用する各種タンパク質のｍＲＮＡに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやｓｉＲＮＡ等もインスリンシグナル阻害剤として使用することができる。インスリンシグナル阻害剤は、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
　培地にはさらに、ＲＯＣＫ阻害剤、及び／又はＧＳＫ３β阻害剤を含めることができる。培地中のＲＯＣＫ阻害剤、及び／又はＧＳＫ３β阻害剤の量は上記第１の培養において記載した範囲より選択することができ、第１の培養にて用いられるのと同じ量であってもよいし、異なっていてもよい。
　培地にはさらに、ピルビン酸塩、Ｌ－アラニルＬ－グルタミン、及びグルコースからなる群から選択される一以上を含めることができる。培地中のピルビン酸塩、Ｌ－アラニルＬ－グルタミン、及びグルコースの量は上記第１の培養において記載した範囲より選択することができ、第１の培養にて用いられるのと同じ量であってもよいし、異なっていてもよい。
　第２の培養で用いる培地は、哺乳類細胞の培養に使用される基礎培地をベースとし上記成分の一又はそれ以上を添加したものを用いることができる。基礎培地としては、上記第１の培養において記載したものを用いることができ、第１の培養にて用いられるものと同じ基礎培地であってもよいし、異なっていてもよい。好ましくは、ＤＭＥＭ培地であり、より好ましくはピルビン酸塩、Ｌ－アラニルＬ－グルタミン、及びグルコースを上記の量で含むＤＭＥＭ培地である。
　第２の培養の培養期間は少なくとも６時間、好ましくは６～７２時間、さらに好ましくは２４時間～７２時間より選択される範囲とすることができる。培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
　第１の培養及び第２の培養の培地には、アクチビンＡを上記低用量にて含めることができる。第１の培養及び第２の培養の培地に含まれるアクチビンＡの量は同じ量であってもよいし、異なっていてもよい。
　第１の培養及び第２の培養の培地にはさらに、ジメチルスルホキシドを添加してもよい。
　多能性幹細胞を、低用量のアクチビンＡの存在下にて培養を行うことによって、あるいは、多能性幹細胞を、低用量のアクチビンＡの存在下、インスリンが作用する条件下の培地中で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下の培地中で第２の培養を行うことによって、工程６）以降にて、得られる内分泌細胞の割合を高めることができる。
工程２）原腸管細胞への分化
　工程１）で得られた胚体内胚葉細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して原腸管細胞に分化誘導する。培養期間は２日～８日、好ましくは約４日である。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
　培地は、上記工程１）にて記載される、哺乳類細胞の培養に用いられる基礎培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
　増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、及び／又はＦＧＦ１０が好ましく、ＥＧＦ及び／又はＫＧＦがより好ましく、ＫＧＦがさらに好ましい。
　増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ～１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～３２０ｎＭ）、好ましくは約５～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約１．６～１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．３～１１６ｎＭ）、好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．６～５８ｎＭ）、より好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．６～５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦを使用する場合の濃度は、通常５～１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０～１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
工程３）後方前腸細胞への分化
　工程２）で得られた原腸管細胞を、さらに増殖因子、シクロパミン、ノギン等を含む培地で培養し、後方前腸細胞に分化誘導する。培養期間は１日～５日、好ましくは約２日程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
　培地は、上記工程１）にて記載される、哺乳類細胞の培養に用いられる基礎培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
　増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、及び／又はＦＧＦ１０が好ましく、ＥＧＦ及び／又はＫＧＦがより好ましく、ＫＧＦがさらに好ましい。
　増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ～１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～３２０ｎＭ）、好ましくは約５～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約１．６～１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．３～１１６ｎＭ）、好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．６～５８ｎＭ）、より好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．６～５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦを使用する場合の濃度は、通常５～１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０～１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬである。
　シクロパミンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常０．５～１．５μＭ、好ましくは０．３～１．０μＭ、特に好ましくは約０．５μＭである。
　ノギンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
　また培地にはジメチルスルホキシドを添加してもよい。
工程４）膵前駆細胞への分化
　工程３）で得られた後方前腸細胞を、さらにＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子を含む培地、好ましくはＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子と増殖因子を含む培地で培養し、膵前駆細胞に分化誘導してもよい。培養期間は２日～１０日、好ましくは約５日程度である。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。２次元培養の場合には、工程３）で得られた後方前腸細胞を、既報（Ｔｏｙｏｄａ　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１５）１４，１８５－１９７）に従い、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡで処理後にピペッティングすることにより分散させ、得られた分散液を遠心分離に付し、回収した細胞を工程４）の新しい培地に再懸濁し、その細胞懸濁液を新しい２次元培養容器に再播種する。
　培地は、工程１）と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基礎培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
　ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子としては、前述した各種化合物又はその塩を用いることができ、用いる化合物又はその塩に応じて、培地への添加量は適宜決定されるが、通常約０．００００１μＭ～５μＭ、好ましくは０．００００１μＭ～１μＭである。ＣＤＫ８／１９阻害活性を有する因子の培地中の濃度としては、ＣＤＫ８／１９に対して５０％以上の阻害活性に達する濃度が好ましい。
　増殖因子としては、ＥＧＦ、ＫＧＦ、及び／又はＦＧＦ１０が好ましく、ＫＧＦ及び／又はＥＧＦがより好ましく、ＫＧＦ及びＥＧＦがさらに好ましい。
　増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約０．１ｎＭ～１０００μＭ、好ましくは約０．１ｎＭ～１００μＭである。ＥＧＦの場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～３２０ｎＭ）、好ましくは約５～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．８～１６０ｎＭ）、より好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約１．６～１６０ｎＭ）である。ＦＧＦ１０の場合、その濃度は、約５～２０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．３～１１６ｎＭ）、好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．６～５８ｎＭ）、より好ましくは約１０～１０００ｎｇ／ｍＬ（すなわち、約０．６～５８ｎＭ）である。例えば増殖因子としてＫＧＦ及びＥＧＦを使用する場合の濃度は、ＥＧＦは通常５～１５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは３０～１００ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約５０ｎｇ／ｍＬ、ＫＧＦは通常１０～２００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは５０～１５０ｎｇ／ｍＬ、特に好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬである。
　工程４）における培養の最初の１日はＲＯＣＫ阻害剤の存在下で行い、以後はＲＯＣＫ阻害剤を含まない培地で培養してもよい。
　また、培地にはＰＫＣ活性化剤を含めても良い。ＰＫＣ活性化剤としては、ＰｄＢＵ（ＰＫＣ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＩＩ）、ＴＰＢ（ＰＫＣ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　Ｖ）などを使用するが、その限りでない。ＰＫＣ活性化剤の濃度は約０．１～１００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１～５０ｎｇ／ｍＬ、より好ましくは約３～１０ｎｇ／ｍＬで添加する。
　また、培地にはジメチルスルホキシド、及び／又はアクチビン（１～５０ｎｇ／ｍＬ）を添加してもよい。
　いずれの工程においても、培地には、上記した成分のほか、血清代替物（例えば、Ｂ－２７サプリメント、ＩＴＳ－Ｇ）を添加してもよい。また、必要に応じて、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（製品名）、非必須アミノ酸、ビタミン、ニコチンアミド、抗生物質（例えば、Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ－Ａｎｔｉｍｙｃｏｔｉｃ（本明細書中、ＡＡと称することがある）、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物）、抗菌剤（例えば、アンホテリシンＢ）、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を添加してもよい。培地に抗生物質を添加する場合には、その培地中の濃度は通常０．０１～２０重量％、好ましくは０．１～１０重量％である。
　培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。
　また細胞培養は、２次元培養の場合は、フィーダー細胞を使用せず、接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、ＯｐｔｉＣｅｌｌ（製品名）（Ｎｕｎｃ社）等の細胞培養シートなどの培養容器が使用される。培養容器は、細胞との接着性（親水性）を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル（例：ＢＤマトリゲル（日本ベクトン・デッキンソン社））、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていることが好ましい。培養容器としては、Ｉ型コラーゲン、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチン又はポリ－Ｄ－リジンなどでコートされた培養容器が好ましく、マトリゲル又はポリ－Ｄ－リジンでコートされた培養容器がより好ましい。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
　工程４）で得られた膵前駆細胞は公知の表面マーカーである糖タンパク質２（ＧＰ２）などを利用して、さらに純化することができる。上記純化は自体公知の方法、例えば、抗ＧＰ２抗体を固定化したビーズを用いて行うことができる。
工程５）膵内分泌前駆細胞への分化
　工程４）で得られた膵前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して膵内分泌前駆細胞に分化誘導する。培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。２次元培養の場合には、工程４）で得られた膵前駆細胞を、０．２５％トリプシン－ＥＤＴＡで処理後にピペッティングすることにより分散させ、得られた分散液を遠心分離に付し、回収した細胞を工程５）の新しい培地に再懸濁し、その細胞懸濁液を新しい２次元培養容器に再播種する。培養期間は２日～３日、好ましくは約２日である。
　培地は、上記工程１）にて記載される、哺乳類細胞の培養に用いられる基礎培地を用いることができる。培地には、既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、ＳＡＮＴ１、レチノイン酸、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮを添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。また、培地にはジメチルスルホキシドを添加してもよい。
　培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
　工程５）で得られた膵内分泌前駆細胞は公知の表面マーカーである糖タンパク質２（ＧＰ２）などを利用して、さらに純化することができる。上記純化は自体公知の方法、例えば、抗ＧＰ２抗体を固定化したビーズを用いて行うことができる。
工程６）インスリン産生細胞への分化
　工程５）で得られた膵内分泌前駆細胞を、さらにＦＧＦＲ１阻害剤を含む培地で培養してインスリン産生細胞に分化誘導する。培養期間は１０日～３０日、好ましくは約１０～２０日である。
　培地は、上記工程１）にて記載される、哺乳類細胞の培養に用いられる基礎培地を用いることができる。培地には、既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＸＸ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ－システイン、ＡＸＬインヒビター、アスコルビン酸を添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。例えば、培地にはＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、及びアスコルビン酸を添加してもよく、あるいはＴ３、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、ＺｎＳＯ4、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、及びＲ４２８を添加してもよい。
　培養は２次元培養及び３次元培養のいずれで行ってもよい。好ましくは、培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート（Ｎｕｎｃ社）等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
　培養温度は、特に限定されないが、３０～４０℃（例えば、３７℃）で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば５％程度である。
　培地には、ＦＧＦＲ１阻害剤を、ＦＧＦＲ１活性を阻害することが可能な任意の量にて含めることができ、例えば、１０μＭ以下、又は５μＭ以下の量にて、好ましくは５μＭ未満、４μＭ未満、３μＭ未満、２μＭ未満の量にて含めることができる。ＦＧＦＲ１阻害剤の添加量の下限は、特に限定されないが、０．１μＭ以上、好ましくは０．５μＭ以上とすることができる。ＦＧＦＲ１阻害剤の添加量は、好ましくは、５μＭ未満０．１μＭ以上であり、より好ましくは５μＭ未満０．５μＭ以上である。ＦＧＦＲ１阻害剤の存在下における培養は、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間以上、２日以上、４日以上、８日以上、１０日以上、又は１５日以上行うことができる。ＦＧＦＲ１阻害剤の存在下における培養は、４日以上行うことが好ましい。例えば、工程６）の最後の約４～１５日、好ましくは最後の約４～７日間について、ＦＧＦＲ１阻害剤の存在下における培養を行うことができる。ＦＧＦＲ１阻害剤による処理期間中も培地の交換は可能であり、培養スケジュールにしたがって、ＦＧＦＲ１阻害剤が添加された交換前と同じ組成を有する培地又は異なる組成を有する培地と交換することができる。
　ＦＧＦＲ１阻害剤を含む培地中で、細胞を培養することによって、得られるインスリン産生細胞におけるＫｉ６７陽性細胞の増殖を抑制することができる。
　工程６）で得られたインスリン産生細胞は、トリプシン等の酵素を用いて解離し回収することができる。回収されたインスリン産生細胞は使用するまで凍結保存することができる。次いで、回収されたインスリン産生細胞を上記培地中に、１培養器または１ウェルあたり、約５０万～５００万個、好ましくは約１００万～４００万個、より好ましくは約２００万～３００万個の量で播種して３次元培養を行い、インスリン産生細胞をスフェロイドの形態で得ることができる。各スフェロイドは約１００～約１０００個、好ましくは約２００～約８００個、より好ましくは約３００個～約５００個程度の細胞からなる。
　本発明で使用する「チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物」又は「微小管阻害剤」とは、微小管を形成するチューブリンの重合を促進して微小管を過剰形成・安定化させる活性、及び／又は、微小管を形成するチューブリンの脱重合を抑制する活性を有する化合物を意味する。当該化合物は、当該活性により細胞分裂を阻害する効果を有することが好ましい。なお、本明細書中、用語「チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物」と「微小管阻害剤」は、相互互換的に用いられる。
　本発明において利用可能な「チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物」又は「微小管阻害剤」は、上記活性を有する限り特に限定されないが、例えば、下記化合物又はその薬理学的に許容される塩や溶媒和物が挙げられる。また、これらの化合物はチューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する限り一又は複数の置換基を有していてもよいし、一部の部分構造（置換基、環等）が変換されていてもよい。溶媒和物としては、水和物やアセトン付加物等が挙げられるが、これらに限定はされない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明において、「チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物」又は「微小管阻害剤」としては、タキソイド系抗がん剤の有効成分として利用される化合物又はその薬理学的に許容される塩や溶媒和物が好ましく、より好ましくはドセタキセル（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）又はその薬理学的に許容される塩や溶媒和物である。
　上記の「チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物」又は「微小管阻害剤」は、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成されたものを利用することができる。
　本発明において、微小管阻害剤による、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の処理は、当該細胞集団を微小管阻害剤と接触させることにより行うことができる。例えば、微小管阻害剤による処理は、微小管阻害剤を添加した培地で当該細胞集団を培養することにより行うことができる。微小管阻害剤は培地に、最終的に得られるインスリン産生細胞集団に内在する非内分泌系細胞を低減することが可能な任意の量にて含めることができ、例えば、１０μＭ、５μＭ、４μＭ、３μＭ、２μＭ、又はそれ以下の量にて含めることができる。微小管阻害剤の培地への添加量の下限は、特に限定されないが、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ又、０．５μＭ、１μＭ、又はそれ以上とすることができる。微小管阻害剤の培地への添加量の範囲は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、０．１μＭ～１０μＭ、好ましくは０．１μＭ～５μＭ、より好ましくは１μＭ～３μＭである。
　また、膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の微小管阻害剤の存在下における培養は、最終的に得られるインスリン産生細胞集団に内在する非内分泌系細胞を低減することが可能な任意の期間行うことができ、例えば、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、１０日間、１１日間、１２日間、１５日間、又はそれ以上行うことができる。好ましくは、微小管阻害剤の存在下における膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の培養期間は、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間又、８日間、又はそれ以上である。微小管阻害剤による処理期間中も培地の交換は可能であり、培養スケジュールにしたがって、微小管阻害剤が添加された交換前と同じ組成を有する培地又は異なる組成を有する培地と交換することができる。培地は、上記哺乳類細胞の培養に使用される基礎培地、又は上記インスリン産生細胞への分化誘導培地を用いることができる。
　本発明において、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団は、微小管阻害剤で処理すると共に、インスリン産生細胞へと分化させる工程に付すことができる。ここで「微小管阻害剤で処理すると共に」とは、微小管阻害剤で処理する工程と分化させる工程とを同時に行う場合、微小管阻害剤で処理した後に分化させる工程に付す場合、ならびに、分化させる工程に付した後に微小管阻害剤で処理する工程に付す場合も含む。したがって、微小管阻害剤で処理するのに用いる培地と細胞集団を分化させるのに用いる培地とは別々のものであってもよいし、分化させる工程に用いる培地に微小管阻害剤がさらに添加されてもよい。
　本発明の一実施形態において、微小管阻害剤は、多能性幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する工程において、上記工程６の培地に含めて、細胞に作用させる。好ましくは、工程６終了までの３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、又はそれ以上の期間にわたって、微小管阻害剤を工程６の培地に含めて、細胞に作用させる。
　本発明の別の一実施形態において、微小管阻害剤は、多能性幹細胞からインスリン産生細胞を分化誘導する工程において、上記工程６終了後の細胞に培地に含めて作用させてもよい。培地は、上記工程１）にて記載される、哺乳類細胞の培養に用いられる基礎培地を用いることができる。培地には、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＸＸ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ－システイン、ＡＸＬインヒビター、アスコルビン酸を添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。例えば、培地にはＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、及びアスコルビン酸を添加してもよく、あるいはＴ３、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、ＺｎＳＯ4、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、及びＲ４２８を添加してもよい。好ましくは、工程６終了後、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、又はそれ以上の期間にわたって、微小管阻害剤を上記培地に含めて、細胞に作用させる。
　本発明により得られたインスリン産生細胞集団における、インスリン産生細胞、好ましくはインスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞の割合は、従来法（例えば、上記工程１）～６）やＮａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３等）により作製されたインスリン産生細胞集団におけるその割合と比べて５％以上、好ましくは１０％以上高いものである。より詳細には、本発明により得られたインスリン産生細胞集団における、インスリン産生細胞、より詳細には、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性の細胞の割合は、３５％以上、好ましくは３６％以上、より好ましくは３７％以上、さらに好ましくは３８％以上、よりさらに好ましくは３９％以上、特に好ましくは４０％以上、とりわけ好ましくは４１％以上である。当該割合の上限は特に限定されないが、７０％以下、６０％以下、又は５０％以下である。当該割合は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該割合は３５％～５０％、好ましくは３６％～５０％、より好ましくは３７％～５０％、さらに好ましくは３８％～５０％、よりさらに好ましくは３９％～５０％、特に好ましくは４０％～５０％、とりわけ好ましくは４１％～５０％である。
　また、本発明により得られたインスリン産生細胞集団における、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性の内分泌系細胞の割合は、従来法（例えば、上記工程１）～６）やＮａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３等）により作製されたインスリン産生細胞集団におけるその割合と比べて３％以上、好ましくは４％以上、より好ましくは５％以上高いものである。より詳細には、本発明により得られたインスリン産生細胞集団における、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性、例えばＣＨＧＡ陽性かつＰＤＸ１陽性、の内分泌系細胞の割合は、９５％以上、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上である。当該割合の上限は特に限定されないが、９９％以下である。当該割合は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該割合は９５％～９９％、好ましくは９６％～９９％、より好ましくは９７％～９９％、さらに好ましくは９８％～９９％である。
　本発明により得られたインスリン産生細胞集団には、上記インスリン産生細胞や内分泌細胞に加えて、その他の細胞（例えば、膵内分泌前駆細胞；グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも一つのマーカーを発現する他の膵ホルモン産生細胞；Ｋｉ６７陽性細胞；ＣＨＧＡ陰性細胞等）が含まれていてもよい。
　また、本発明方法により得られたインスリン産生細胞集団は、従来法（例えば、上記工程１）～６）やＮａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３等）により作製されたインスリン産生細胞集団と比べて、内在する非内分泌系細胞が低減、好ましくは除去されたインスリン産生細胞集団である。ここで「非内分泌系細胞」とは、クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陰性のマーカー発現様式により特徴付けられる細胞である。非内分泌系細胞はさらに、ＰＤＸ１陰性、及び／又はＫｉ６７陽性により特徴付けることができる。好ましくは、「非内分泌系細胞」は、ＣＨＧＡ陰性かつＰＤＸ１陽性細胞、ＣＨＧＡ陰性かつＰＤＸ１陰性細胞、及び／又は、ＣＨＧＡ陰性かつＫｉ６７陽性細胞である。
　本発明により得られたインスリン産生細胞集団における、非内分泌系細胞の割合は、従来法（例えば、上記工程１）～６）やＮａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３等）により作製されたインスリン産生細胞集団におけるその割合と比べて２％以上、３％以上、４％以上、又は５％以上、低いものである。より詳細には、本発明により得られたインスリン産生細胞集団における、非内分泌系細胞の割合は、５％以下、好ましくは４％以下、より好ましくは３％以下、さらに好ましくは２％以下、よりさらに好ましくは１％以下、特に好ましくは０．５％以下である。当該割合の下限は特に限定されないが、例えば、０％以上、０．０１％以上、又は０．０５％以上である。当該割合は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該割合は０％～５％、好ましくは０．０１％～４％、より好ましくは０．０１％～３％、さらに好ましくは０．０１％～２％、よりさらに好ましくは０．０１％～１％、特に好ましくは０．０１％～０．５％である。より詳細には、本発明により得られたインスリン産生細胞集団における、ＣＨＧＡ陰性かつＫｉ６７陽性細胞の割合は、０．１％以下、好ましくは０．０５％以下であり、当該割合の下限は特に限定されないが、例えば、０％以上、０．０１％以上ある。当該割合は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該割合は０％～０．１％、又は０．０１％～０．１％である。
　本発明はまた、多能性幹細胞から分化誘導して得られたインスリン産生細胞集団中に存在する非内分泌系細胞を検出する方法を提供する。
　本発明において、インスリン産生細胞集団中に存在する非内分泌系細胞は、インスリン産生細胞集団をさらなる培養（本明細書中、「延長培養」と記載する場合がある）に付すことにより増殖させ、検出を容易にすることができる。延長培養は、上記哺乳類細胞の培養に使用される基礎培地を用いて行うことができ、好ましくは、ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ3／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地を基礎培地として使用する。
　好ましくは、延長培養の培地はさらに、上皮成長因子（Ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ；ＥＧＦ）又はそれと同等もしくは類似の活性を有する物質を含む。ＥＧＦと「同等もしくは類似の活性を有する物質」としては、ＥＧＦのシグナル伝達経路を活性化し得る物質（例えば、Ｂｅｔａｃｅｌｌｕｌｉｎ等）や、ＥＧＦと類似の機能を有する増殖因子（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ；Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ；Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ；Ｖａｓｃｕｌａｒ　Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）等）が挙げられるが、これらに限定はされない。ＥＧＦ又はそれと同等もしくは類似の活性を有する物質は培地中に、非内分泌系細胞が増殖するのに十分な任意の量で含めることができる。例えば、ＥＧＦ又はそれと同等もしくは類似の活性を有する物質は培地中に、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、又はそれ以上の範囲より選択される量にて含めることができ、その上限は特に限定されないが、２５０ｎｇ／ｍＬ、２００ｎｇ／ｍＬ、１５０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、又はそれ以下の範囲より選択される量とすることができる。当該含有量は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される２つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該含有量は５０ｎｇ／ｍＬ～２５０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ～２００ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ～１５０ｎｇ／ｍＬ、又は５０ｎｇ／ｍＬ～１００ｎｇ／ｍＬの範囲より選択される量である。
　延長培養の期間は、非内分泌系細胞が増殖するのに十分な期間行えばよく、少なくとも１２時間、好ましくは２４時間以上、例えば、２日、３日、４日、５日、７日、１０日、１４日、２１日、２７日、２８日、２９日、３０日、又はそれ以上である。延長培養の期間中も培地の交換は可能であり、１～７日、好ましくは２～５日、より好ましくは３～４日に１回の頻度で培地交換を行うことができる。
　本発明により得られたインスリン産生細胞集団を上記延長培養に付した場合、延長培養後に確認される当該集団中の非内分泌系細胞の割合は、従来法（例えば、上記工程１）～６）やＮａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３等）により作製されたインスリン産生細胞集団を延長培養に付した場合のその割合と比べて、５０％以上、好ましくは６５％以上、より好ましくは７０％以上、さらに好ましくは７５％以上低減され、本発明により得られたインスリン産生細胞集団中に内在する非内分泌系細胞が低減、好ましくは除去されていることが確認できる。
　本発明により得られたインスリン産生細胞集団は、膵β細胞を含む細胞集団（以下、「膵β細胞集団」と記載する）に分化誘導することができる。本明細書において「膵β細胞」は、「インスリン産生細胞」より成熟した細胞を意味しており、具体的には、膵β細胞の成熟マーカーであるＭＡＦＡ、ＵＣＮ３、及びＩＡＰＰの少なくとも一つのマーカーを発現する、あるいはグルコース刺激によるインスリン分泌上昇反応によって特徴付けられる細胞を意味する。膵β細胞集団には、膵β細胞に加えて、その他の細胞（例えば、インスリン産生細胞、Ｋｉ６７陽性細胞、ＣＨＧＡ陰性細胞等）が含まれていてもよい。
　膵β細胞集団は、インスリン産生細胞集団を分化・成熟させることによって、好ましくは動物生体内で分化・成熟させることによって得ることができる。
　「動物」は哺乳動物が好ましく、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット等が挙げられるが、好ましくはヒトである。
　移植は、細胞集団を一定の位置で固定できる生体内領域に行うことが好ましく、例えば、動物の皮下、腹腔内、腹膜上皮、大網、脂肪組織、筋肉組織や膵臓、腎臓等の各臓器の被膜下などに行うことできる。移植される細胞数は、移植される細胞の分化段階や、移植対象の、年齢、体重、移植部位の大きさ、疾患の重篤度等の要因により変化し得、特に限定されないが、例えば、１０×１０4細胞個～１０×１０11細胞個程度とすることができる。移植された細胞集団は、生体内環境において分化誘導され、目的の細胞集団、好ましくは膵β細胞集団へと分化することができ、その後、回収されてもよいし、そのまま生体内に留置してもよい。
　移植に際して、細胞集団は、生体適合性材料を含むゲル中に包埋して移植してもよく、例えば、生体適合性材料を含むゲル中に包埋された細胞集団をカプセル、バッグ、チャンバーなどのデバイスに封入して生体内に移植することもできる。
　本明細書において「包埋」とは、生体適合性材料を含むゲル中に膵内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、散在させ収容することを意味する。
　本明細書において「生体適合性材料」とは生体内に移植し、短期又は長期留置した場合に、顕著な免疫応答や有害な生体反応（例えば、毒性反応、凝血等）を誘導しない任意の材料を意味する。また、「生体適合性材料」は生分解性材料であることが好ましい。このような材料としては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸－ｃｏ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－ヒドロキシバリレート）（ＰＨＢＶ）、ポリ（エチレン－ｃｏ－ビニルアセテート）（ＰＥＶＡ）ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンアミン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリビニルアルコール、ポリフマル酸プロピレン、ポリアクリル酸、ポリｅ－カプロラクトン、ポリメタクリル酸、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ペクチン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、キチン、キトサン、キサンタン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキトサン、アルギン酸塩、アルギン酸エステル、コラーゲン、セルロース、シルクフィブロイン、ケラチン、ゼラチン、フィブリン、プルラン、ラミニン、ゲラン、シリコン、ウレタン、エラスチン等及びそれらの修飾体、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。「生体適合性材料」の表面は必要に応じて、細胞の接着を可能とする表面修飾（例えば、細胞接着用基質（コラーゲン、ゼラチン、ポリ－Ｌ－リジン、ポリ－Ｄ－リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、ビトロネクチン等）によるコーティング）や、細胞の増殖、分化や機能を制御することが知られている官能基（例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メタクリル酸基、アクリル酸基等）での改変、が施されていてもよい。特定の態様において、「生体適合性材料」として、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを好適に用いることができる。
　アルギン酸塩は水溶性の塩であればよく、金属塩、アンモニウム塩等を利用することができる。例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸アンモニウム等を好適に用いることができる。
　アルギン酸エステル（アルギン酸プロピレングリコールとも称される）はアルギン酸のカルボキシル基にプロピレングルコールがエステル結合した誘導体である。
　アルギン酸塩に含まれるマンヌロン酸とグルロン酸の割合（Ｍ／Ｇ比）は任意であり、一般的に、Ｍ＞Ｇである場合には柔軟性に富んだゲルを形成することができ、Ｍ＜Ｇである場合には強固なゲルを形成することができる。本発明においては、グルロン酸を１０～９０％、２０～８０％、３０～７０％、又は、４０～６０％の割合で含むものを利用することができる。
　アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを用いたゲルの作製は、公知の手法（ＷＯ２０１０／０３２２４２、ＷＯ２０１１／１５４９４１）に準じて作製することができ、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液に架橋剤を添加してゲル化させることにより得ることができる。
　アルギン酸塩又はアルギン酸エステルは溶媒中に、０．０５～１０重量％、好ましくは、０．１～５重量％、より好ましくは０．５～３重量％の量で含めることができる。溶媒はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルを溶解可能なものであればよく、水、生理食塩水等を利用することができる。
　架橋剤はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液をゲル化できるものであればよく、特に限定されないが、多価の金属カチオンを利用することができる。多価の金属カチオンとしては、２価の金属カチオンが好ましく、より好ましくは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンである。架橋剤は塩の形態で利用することができ、本発明においては、塩化カルシウム、塩化ストロンチウム、塩化バリウムから選択される少なくとも一つを架橋剤として利用することができる。
　アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを含むゲルにはナノファイバーを含めることができる。ナノファイバーは、ナノメートル領域の直径を有する天然又は合成ファイバーである。天然ナノファイバーとしては、コラーゲン、セルロース、シルクフィブロイン、ケラチン、ゼラチン、キトサンなどの多糖類の一又は複数を含むものが挙げられる。合成ナノファイバーとしては、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリウレタン（ＰＵ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（３－ヒドロキシブチレート－ｃｏ－ヒドロキシバリレート）（ＰＨＢＶ）、ポリ（エチレン－ｃｏ－ビニルアセテート）（ＰＥＶＡ）などが挙げられる。ナノファイバーはアルギン酸を含むゲル中に１重量％未満、例えば、０．９重量％、０．８重量％、０．７重量％、０．６重量％、０．５重量％、又はそれ未満の量にて含めることができる。アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを含むゲル中に含めるナノファイバーの量の下限は特に限定されないが、０．０５重量％以上、好ましくは０．１重量％以上とすることができる。
　アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを含むゲルへの細胞集団の包埋は任意の手段で行うことができ、特に限定されるものではないが例えば、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液中に細胞集団を混合し、ゲル化させることにより行うことができる。
　細胞集団はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液中に１×１０4細胞～１×１０9細胞／ｍＬ、好ましくは１×１０7細胞～１×１０8細胞／ｍＬから選択される量にて含めることができる。
　細胞集団を含むアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液のゲル化は、当該溶液に架橋剤を添加して行うことができる。添加する架橋剤の量は、当該溶液に対し０．１～５重量％、例えば、０．１～１重量％、から選択される量とすることができる。ゲル化は、細胞培養や細胞移植に用いられる所定の構成及び／又は形状を有する容器内にて、あるいは当該容器に適合するゲルが得られるように設計された鋳型内で行うことができる。
　あるいは、公知の手法（ＷＯ２０１０／０１０９０２）に準じてアルギン酸を含むゲルカプセルを形成することにより行われてもよい。すなわち、架橋剤の溶液に対し、細胞集団を含むアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液を滴下して行ってもよい。滴下する際のノズルの形状や滴下方法に応じて、液滴のサイズを調整することができ、ひいてはアルギン酸を含むゲルカプセルの大きさを規定することができる。滴下方法は特に限定されないが、エアスプレー法、エアレススプレー方式、静電スプレー法等の手法により行うことができる。アルギン酸を含むゲルカプセルの大きさは特に限定されないが、直径が５ｍｍ以下、１ｍｍ以下、５００μｍ以下とすることができる。架橋剤溶液には、０．１～１０重量％、例えば、０．１～５重量％、から選択される量の架橋剤を含めることができる。
　本発明により得られたインスリン産生細胞集団は、動物生体内に移植して、動物生体内で分化させた場合にはそのまま留置して、インスリンを産生・分泌する細胞として利用することが可能である。
　本発明により得られたインスリン産生細胞集団は、そのままあるいはカプセル化して患部に移植することで、糖尿病、特にＩ型糖尿病を治療するための細胞医薬として有用である。
　また、本発明により得られたインスリン産生細胞集団は、プロドラッグであってもよい。本明細書において、プロドラッグとは、生体内に移植した後に分化し、疾患を治療する機能を有する細胞に変化する細胞集団をいう。
　本発明により得られたインスリン産生細胞集団は、毒性（例、急性毒性、慢性毒性、遺伝毒性、生殖毒性、心毒性、癌原性）が低く、そのまま、または薬理学的に許容される担体等と混合して医薬組成物とすることにより、哺乳動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト）に対して、安全に投与することができる。
３．培養培地
　本発明は、微小管阻害剤を含む、膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の培養培地を提供する。
　本発明の培養培地は、ＲＰＭＩ　１６４０培地、ＭＥＭ培地、ｉＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ　Ｚｉｎｃ　Ｏｐｔｉｏｎ培地、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ／１％Ｂ－２７／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地、ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ3／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／ＧｌｕｔａＭＡＸTM／アスコルビン酸／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地など、哺乳類細胞の培養に使用される基礎培地に、上記微小管阻害剤が上記の量で添加されてなる。
　本発明の培養培地は、膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をインスリン産生細胞集団へと分化誘導するため分化培地とすることができる。本発明の分化培地は、上述の多能性幹細胞をインスリン陽性細胞へと分化誘導する方法における、工程６）にて使用することができる。
　本発明の分化培地は微小管阻害剤に加えてさらに、工程６）にて要求される増殖因子、各種阻害剤、血清代替物、抗生物質、ビタミン等のその他の因子を含む。既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、例えば、工程６）にて使用される分化培地には、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＸＸ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ－システイン、ＡＸＬインヒビター、アスコルビン酸、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質、ＺｎＳＯ4、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、Ｒ４２８、ＦＧＦＲ１阻害剤等を所定の量にて添加することができる。
　本発明の培養培地は、上記「それ以降の分化段階にある細胞集団」を培養するための培養培地とすることができる。一実施形態において、上述の多能性幹細胞をインスリン陽性細胞へと分化誘導する方法における、工程６）終了までの３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、又はそれ以上の期間、あるいは工程６）の終了後に使用することができる。当該培養培地は微小管阻害剤に加えてさらに、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＸＸ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、Ｎ－システイン、ＡＸＬインヒビター、アスコルビン酸を添加し、さらに、Ｗｎｔ阻害薬、ＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦ（好ましくはＦＧＦ２）、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよく、例えば、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、及びアスコルビン酸を添加してもよく、あるいはＴ３、ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、ＺｎＳＯ4、ヘパリン、Ｎ－アセチルシステイン、Ｔｒｏｌｏｘ、及びＲ４２８を添加してもよい。
　本発明はまた、ＥＧＦ又はそれと同等もしくは類似の活性を有する物質を含む、インスリン産生細胞集団の培養培地を提供する。
　本発明の培養培地は、上記基礎培地に、上記ＥＧＦ又はそれと同等もしくは類似の活性を有する物質を非内分泌系細胞の増殖を促すことが可能な任意の量にて含んでなる。基礎培地は、好ましくは、ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ3／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ培地である。培地に含まれるＥＧＦ又はそれと同等もしくは類似の活性を有する物質の量は上記のとおりである。
　ＥＧＦ又はそれと同等もしくは類似の活性を有する物質を含む当該培養培地は、インスリン産生細胞集団中に存在する非内分泌系細胞を検出するための培養培地であり、上述のインスリン産生細胞集団の延長培養にて使用することができる。
　本発明の培養培地はいずれも、基礎培地、微小管阻害剤又はＥＧＦ又はそれと同等もしくは類似の活性を有する物質、及び上記その他の因子は全て混合され一つの形態で提供されてもよいし、あるいは任意の組み合わせで、又はそれぞれ別々に複数の形態で提供され用事調製されてもよい。
４．非内分泌系細胞の除去方法
　本発明はまた、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、微小管阻害剤で処理することを含む、非内分泌系細胞の除去方法に関するものである。
　微小管阻害剤による、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の処理は、上記定義のとおり行うことができる。
　以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１：インスリン産生細胞集団をＥＧＦを含む基礎培地で延長培養した場合の非内分泌系細胞の増殖評価
１．方法
（１）インスリン産生細胞集団の作製
　Ｆｆ－Ｉ１４ｓ０４　ｉＰＳ細胞株からインスリン産生細胞集団への分化誘導は、上記工程１）～６）や既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、バイオリアクター及び多孔プレートを用いた３次元培養法により実施した。すなわち、ｉＰＳ細胞をインスリンが作用する条件下で分化誘導因子（ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤及び低用量のアクチビンＡ）を含む培地（ＤＭＥＭ／１％Ｂ－２７（ＩＮＳ＋）／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ジメチルスルホキシド）で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下で分化誘導因子（低用量のアクチビンＡ）を含む培地（ＤＭＥＭ／１％Ｂ－２７（ＩＮＳ－）／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ジメチルスルホキシド）で第２の培養を行い、胚体内胚葉細胞集団を得た。さらに、その胚体内胚葉細胞集団から分化誘導して得られた膵内分泌前駆細胞集団を分化誘導因子（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、アスコルビン酸）とＦＧＦ受容体１阻害剤（ＰＤ－１６６８６６）を含む培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ／１％Ｂ－２７（ＩＮＳ＋）／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で培養して、インスリン産生細胞集団を得た。バイオリアクターから多孔プレートへの切り替えは工程６）にて実施した。
（２）ＥＧＦを含む基礎培地による延長培養
　インスリン産生細胞集団を、基礎培地（ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ3／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）にて４週間延長培養を行った。目的外細胞の増殖を促す目的でＥＧＦを添加する場合は、終濃度が５０ｎｇ／ｍＬとなるように基礎培地に添加して培養を行った。
（３）マーカータンパク質発現及び細胞数の評価
　延長培養開始前及び終了後のインスリン産生細胞集団のマーカータンパク質発現（ＰＤＸ１、ＣＨＧＡ）をフローサイトメトリーにより測定した。各サンプルは、別々の培養容器からサンプリングを行った。細胞数については、フローサイトメトリー用のサンプル調整時に自動セルカウンターにて測定し、多孔プレート　１ｗｅｌｌあたりの総細胞数を算出した。また、得られた総細胞数及びフローサイトメトリーの結果より、ＣＨＧＡ陽性細胞数、ＰＤＸ１陽性かつＣＨＧＡ陰性細胞数、ＰＤＸ１陰性かつＣＨＧＡ陰性細胞数を算出した。
２．結果
（１）マーカータンパク質発現及び細胞数の評価
　フローサイトメトリーによる測定結果及び細胞数を図１及び表２に示す。延長培養前は大部分がＣＨＧＡ陽性の内分泌細胞であった。ＥＧＦを含まない基礎培地で４週間延長培養を行っても大部分がＣＨＧＡ陽性細胞であることに変化はなかった。しかし、ＥＧＦを含む基礎培地で延長培養を行ったところ、ＰＤＸ１陽性かつＣＨＧＡ陰性（ＰＤＸ１＋／ＣＨＧＡ－）ならびにＰＤＸ１陰性かつＣＨＧＡ陰性（ＰＤＸ１－／ＣＨＧＡ－）の非内分泌系細胞の割合が顕著に増加した。また、これら非内分泌系細胞は割合だけでなく、細胞数としても増加が確認された。非内分泌系細胞の増加に伴い、ＥＧＦを含む基礎培地中での延長培養後の総細胞数も増加した。一方で、ＣＨＧＡ陽性の内分泌系細胞の細胞数には大きな変化はなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
実施例２：タキソイド系抗がん剤Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加し作製したインスリン産生細胞集団をＥＧＦを含む基礎培地で延長培養した場合の非内分泌系細胞の増殖評価
１．方法
（１）Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ又はＤｏｃｅｔａｘｅｌ処理を誘導工程に含むインスリン産生細胞集団の作製
　ＱＨＪＩ－Ｉ１４ｓ０４　ｉＰＳ細胞株からインスリン産生細胞集団への分化誘導は、上記工程１）～６）や既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、バイオリアクターを用いた３次元培養法により実施した。すなわち、ｉＰＳ細胞をインスリンが作用する条件下で分化誘導因子（ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤及び低用量のアクチビンＡ）を含む培地（ＤＭＥＭ／１％Ｂ－２７（ＩＮＳ＋）／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ジメチルスルホキシド）で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下で分化誘導因子（低用量のアクチビンＡ）を含む培地（ＤＭＥＭ／１％Ｂ－２７（ＩＮＳ－）／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ジメチルスルホキシド）で第２の培養を行い胚体内胚葉細胞集団を得た。さらに、その胚体内胚葉細胞集団から分化誘導して得られた膵内分泌前駆細胞集団を分化誘導因子（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、アスコルビン酸）とＦＧＦ受容体１阻害剤（ＰＤ－１６６８６６）を含む培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ／１％Ｂ－２７（ＩＮＳ＋）／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で培養して、インスリン産生細胞集団を得た。Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ又はＤｏｃｅｔａｘｅｌを処理する場合は、工程６）開始後４日目から培養終了（１１日目）までの７日間、終濃度３μＭ　Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ又は終濃度１μＭ　Ｄｏｃｅｔａｘｅｌとなるように培地に添加して誘導を行った。
（２）ＥＧＦを含む基礎培地による延長培養
　Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ又はＤｏｃｅｔａｘｅｌ添加して得られたインスリン産生細胞集団を、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む基礎培地（ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ3／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）にて４週間延長培養を行った。Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ及びＤｏｃｅｔａｘｅｌを添加せず得られたインスリン産生細胞集団をｃｏｎｔｒｏｌ細胞集団とし、同様に延長培養を行った。
（３）マーカータンパク質発現及び細胞数の評価
　延長培養開始前及び終了後の各インスリン産生細胞集団のマーカータンパク質発現（ＰＤＸ１、ＣＨＧＡ、Ｋｉ６７）をフローサイトメトリーにより測定した。延長培養終了後のサンプルについては、同じ培養容器から３回サンプリングを行った。細胞数については、フローサイトメトリー用のサンプル調整時に自動セルカウンターにて測定し、バイオリアクター　１ｍＬあたりの総細胞数を算出した。また、得られた総細胞数及びフローサイトメトリーの結果より、ＣＨＧＡ陽性細胞数、ＰＤＸ１陽性かつＣＨＧＡ陰性細胞数、ＰＤＸ１陰性かつＣＨＧＡ陰性細胞数を算出した。
２．結果
（１）マーカータンパク質発現及び細胞数の評価
　フローサイトメトリーによる測定結果及び細胞数を図２、図３及び表３、４、５に示す。Ｃｏｎｔｒｏｌ細胞集団は、延長培養前は大部分がＣＨＧＡ陽性の内分泌細胞であったが、ＥＧＦを含む基礎培地で延長培養を行ったところ、ＰＤＸ１陽性かつＣＨＧＡ陰性（ＰＤＸ１＋／ＣＨＧＡ－）ならびにＰＤＸ１陰性／ＣＨＧＡ陰性（ＰＤＸ１－／ＣＨＧＡ－）の非内分泌系細胞の割合が顕著に増加した。
　Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ添加細胞集団（＋Ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）は、ｃｏｎｔｒｏｌ細胞集団（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に対して、ＥＧＦを含む延長培養後のＰＤＸ１陽性かつＣＨＧＡ陰性（ＰＤＸ１＋／ＣＨＧＡ－）細胞の割合に大きな変化は認められなかったが、ＰＤＸ１陰性かつＣＨＧＡ陰性（ＰＤＸ１－／ＣＨＧＡ－）細胞の割合が大幅に減少した。
　Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ添加細胞集団（＋Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）は、ｃｏｎｔｒｏｌ細胞集団に対して、ＥＧＦを含む延長培養後のＰＤＸ１陽性かつＣＨＧＡ陰性（ＰＤＸ１＋／ＣＨＧＡ－）ならびにＰＤＸ１陰性かつＣＨＧＡ陰性（ＰＤＸ１－／ＣＨＧＡ－）の割合がどちらも大幅に減少した。
　ＥＧＦを含む延長培養後の総細胞数は、ｃｏｎｔｒｏｌ細胞集団やＣｉｓｐｌａｔｉｎ添加細胞集団において、非内分泌系細胞の増加に伴い増加した。Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ添加細胞集団では、非内分泌系細胞の増加が認められなかったため、延長培養後の総細胞数は減少した。一方で、延長培養後のＣＨＧＡ陽性の内分泌細胞数はｃｏｎｔｒｏｌ細胞集団に対してＣｉｓｐｌａｔｉｎ添加細胞集団やＤｏｃｅｔａｘｅｌ添加細胞集団において変化は認められなかった。以上より、ＣｉｓｐｌａｔｉｎやＤｏｃｅｔａｘｅｌ処理は非内分泌系細胞の増加を抑制する一方で、内分泌細胞の細胞数には影響しないと考えられる。
　延長培養により増加するＰＤＸ１陽性かつＣＨＧＡ陰性ならびにＰＤＸ１陰性かつＣＨＧＡ陰性の非内分泌系細胞は、増殖マーカーであるＫｉ６７陽性の細胞を多数含んでいた。したがって、これらの非内分泌系細胞は増殖性であると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
実施例３：Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加し作製したインスリン産生細胞集団のマーカータンパク質発現評価
１．方法
（１）Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ処理を誘導工程に含むインスリン産生細胞集団の作製
　ＱＨＪＩ－Ｉ１４ｓ０４　ｉＰＳ細胞株からインスリン産生細胞への分化誘導は、上記工程１）～６）や既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、バイオリアクターおよび多孔プレートを用いた３次元培養法により実施した。すなわち、ｉＰＳ細胞をインスリンが作用する条件下で分化誘導因子（ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤及び低用量のアクチビンＡ）を含む培地（ＤＭＥＭ／１％Ｂ－２７（ＩＮＳ＋）／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ジメチルスルホキシド）で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下で分化誘導因子（低用量のアクチビンＡ）を含む培地（ＤＭＥＭ／１％Ｂ－２７（ＩＮＳ－）／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ジメチルスルホキシド）で第２の培養を行い胚体内胚葉細胞を得た。さらに、その胚体内胚葉細胞から分化誘導して得られた膵内分泌前駆細胞集団を分化誘導因子（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、アスコルビン酸）とＦＧＦ受容体１阻害剤（ＰＤ－１６６８６６）を含む培地（ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ3／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で培養して、インスリン産生細胞集団を得た。バイオリアクターから多孔プレートへの切り替えは工程６）にて実施した。Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを処理する場合は、工程６）開始後４日目から培養終了（１１日目）までの７日間、終濃度が１、３又は１０μＭとなるように培地に添加して誘導を行った。
（２）マーカータンパク質発現及び細胞数の評価
　培養終了後の各インスリン産生細胞集団のマーカータンパク質発現（ＮＫＸ６．１、Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、ＣＨＧＡ、及びＫｉ６７）をフローサイトメトリーにより測定した。各サンプルは、別々の培養容器からサンプリングを行った。細胞数については、フローサイトメトリー用のサンプル調整時に自動セルカウンターにて測定し、多孔プレート　１ｗｅｌｌあたりの総細胞数を算出した。
２．結果
（１）マーカータンパク質発現および細胞数の評価
　フローサイトメトリーによる測定結果および細胞数を図４に示す。ｃｏｎｔｒｏｌ細胞集団に対して、１μＭのＤｏｃｅｔａｘｅｌを処理した細胞集団（＋Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）は、膵β細胞への成熟が予想されるＩＮＳ陽性かつＮＫＸ６．１陽性細胞の割合が１０％程度増加した。この作用は、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌの濃度を１０μＭまで上げても変化しなかった。また、総細胞数についてはＤｏｃｅｔａｘｅｌ処理による変化は認められなかった。
　加えて、ＦＧＦ受容体１阻害剤（ＰＤ－１６６８６６）を添加した培地を用いて分化誘導された細胞集団においては、目的外細胞であるＣＨＧＡ陰性かつＫｉ６７陽性（ＣＨＧＡ－／Ｋｉ６７＋）細胞の存在量が大幅に低減されていることもあり（ＷＯ２０１９／２０８５０５参照）、その存在量はＤｏｃｅｔａｘｅｌ処理の有無にかかわらず０．１％以下であった。本実施例のように延長培養を行わずに評価を行う場合、僅かに残存する目的外細胞の差を検出することは難しい場合がある。一方、上記のとおりＥＧＦを含む基礎培地で延長培養を行うことで、僅かに残存する目的外細胞を増幅し検出することが可能となるため、細胞集団に含まれる細胞の種類や量を厳密に把握することが可能となる。
実施例４：インスリン産生細胞を含む細胞集団をＤｏｃｅｔａｘｅｌで処理したのちＥＧＦを含む基礎培地で延長培養した場合の非内分泌系細胞の増殖評価
１．方法
（１）インスリン産生細胞を含む細胞集団にＤｏｃｅｔａｘｅｌ処理を施したインスリン産生細胞集団の作製
　ＱＨＪＩ－Ｉ１４ｓ０４　ｉＰＳ細胞株からインスリン産生細胞集団への分化誘導は、上記工程１）～６）や既報（Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　２０１４；３２：１１２１－１１３３）に従い、バイオリアクターを用いた３次元培養法により実施した。すなわち、ｉＰＳ細胞をインスリンが作用する条件下で分化誘導因子（ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤及び低用量のアクチビンＡ）を含む培地（ＤＭＥＭ／１％Ｂ－２７（ＩＮＳ＋）／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ジメチルスルホキシド）で第１の培養を行い、続いて、インスリンが作用しない条件下で分化誘導因子（低用量のアクチビンＡ）を含む培地（ＤＭＥＭ／１％Ｂ－２７（ＩＮＳ－）／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ／ジメチルスルホキシド）で第２の培養を行い胚体内胚葉細胞集団を得た。さらに、その胚体内胚葉細胞集団から分化誘導して得られた膵内分泌前駆細胞集団を分化誘導因子（ＡＬＫ５インヒビターＩＩ、Ｔ３、ＬＤＮ、γ－ｓｅｃｒｅｔａｓｅ阻害剤ＲＯ、アスコルビン酸）とＦＧＦ受容体１阻害剤（ＰＤ－１６６８６６）を含む培地（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ　ＭＥＭ／１％Ｂ－２７（ＩＮＳ＋）／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）で７日間培養して得られた（工程６開始後７日目に得られた）細胞集団に対し、工程６）の培養終了（１１日目）までの４日間、終濃度１μＭ　Ｄｏｃｅｔａｘｅｌとなるよう培地に添加して引き続き誘導を行った。バイオリアクターから多孔プレートへの切り替えを工程６）にて実施した。
（２）ＥＧＦを含む基礎培地による延長培養
　上記の手法により得られた細胞集団（＋Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ　７日目から４日間）を、終濃度５０ｎｇ／ｍＬのＥＧＦを含む基礎培地（ＭＣＤＢ１３１／２０ｍＭ　Ｇｌｕｃｏｓｅ／ＮａＨＣＯ3／ＦＡＦ－ＢＳＡ／ＩＴＳ－Ｘ／Ｇｌｕｔａｍａｘ／Ｐｅｎｉｓｉｌｉｎ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ）にて４週間延長培養を行った。Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加せず得られたインスリン産生細胞集団（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、また、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌの処理を工程６）開始後４日目から培養終了（１１日目）までの７日間とした以外は同様にして作製された細胞集団（＋Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ　４日目から７日間）についても、それぞれ同様に延長培養を行った。
（３）マーカータンパク質発現及び細胞数の評価
　延長培養開始前及び終了後の各細胞集団のマーカータンパク質発現（ＰＤＸ１、ＣＨＧＡ）をフローサイトメトリーにより測定した。工程６）開始後７日目に得られた細胞集団のマーカータンパク質発現（ＮＫＸ６．１、Ｃ－ｐｅｐｔｉｄｅ（Ｉｎｓｕｌｉｎ）、ＰＤＸ１、及びＣＨＧＡ）についてもフローサイトメトリーにより測定した。各サンプルは、別々の培養容器からサンプリングを行った。細胞数については、フローサイトメトリー用のサンプル調整時に自動セルカウンターにて測定し、多孔プレート１ｗｅｌｌあたりの総細胞数を算出した。
２．結果
（１）マーカータンパク質発現及び細胞数の評価
　フローサイトメトリーによる測定結果及び細胞数を図５及び表６、７、８に示す。
　工程６）開始後７日目に得られた細胞集団におけるマーカータンパク質発現の測定結果を、図５（Ａ）に示す。当該細胞集団においては、インスリン、ＮＫＸ６．１、ＰＤＸ１、ＣＨＧＡについて陽性の細胞が多く含まれことが確認された（インスリン及びＮＫＸ６．１の両マーカーを発現するインスリン産生細胞は３０％超える割合で存在し、また、ＣＨＧＡ及びＰＤＸ１の両マーカーを発現する細胞はおよそ９０％の割合で存在した）。
　Ｃｏｎｔｒｏｌの細胞集団は、延長培養前は大部分がＣＨＧＡ陽性の内分泌細胞であったが、ＥＧＦを含む基礎培地で延長培養を行ったところ、ＰＤＸ１陽性かつＣＨＧＡ陰性（ＰＤＸ１＋／ＣＨＧＡ－）ならびにＰＤＸ１陰性／ＣＨＧＡ陰性（ＰＤＸ１－／ＣＨＧＡ－）の非内分泌系細胞の割合が顕著に増加した。
　Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ添加細胞集団は、「＋Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ　７日目から４日間」及び「＋Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ　４日目から７日間」のいずれの細胞集団においてもＣｏｎｔｒｏｌの細胞集団に対して、ＥＧＦを含む延長培養後のＰＤＸ１陽性かつＣＨＧＡ陰性（ＰＤＸ１＋／ＣＨＧＡ－）ならびにＰＤＸ１陰性かつＣＨＧＡ陰性（ＰＤＸ１－／ＣＨＧＡ－）の割合がどちらも大幅に減少した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　以上より、インスリン産生細胞集団をＥＧＦを含む基礎培地で延長培養することにより、当該細胞集団中に混入している増殖性の非内分泌系細胞を検出できることが確認された。
　また、インスリン産生細胞集団を分化誘導する過程において、膵内分泌前駆細胞集団及びそれ以降の分化段階にある細胞集団を、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌといったタキソイド系抗がん剤で処理することによって、非内分泌系細胞を低減し、内分泌細胞やインスリン産生細胞を高い割合で含むインスリン産生細胞集団を製造できることが明らかとなった。
実施例５：Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加し作製したインスリン産生細胞集団の生体内移植による有効性および安全性評価
１．方法
（１）Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加し作製したインスリン産生細胞集団の生体内移植
　ストレプトゾトシンによりインスリン欠乏性の糖尿病を誘発させた免疫不全ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを準備し、上記実施例２に記載の方法によりＤｏｃｅｔａｘｅｌを添加し作製したインスリン産生細胞集団をＦｉｂｒｉｎゲルに分散させ、それを当該マウスに皮下移植した。移植後、経時的に血漿中ヒトＣ－ペプチド濃度を測定した。移植６か月後の時点で移植片を摘出し、重量を測定した。対照として、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加せず作製したインスリン産生細胞集団を当該マウスに皮下移植し、経時的に血漿中ヒトＣ－ペプチド濃度を、ならびに移植６か月後の時点で摘出された移植片の重量を、それぞれ同様に測定した。
（２）移植片中の非内分泌細胞およびタンパク質発現の評価
　摘出した移植片を固定、脱水後にパラフィン切片を作製し、ＨＥ染色および目的タンパク質発現（インスリン、グルカゴン、Ｋｉ６７、ヒト核、ＰＤＸ１、ＣＫ１９）のための免疫組織染色を実施し、その形態や染色像を元に非内分泌細胞の有無を確認した。移植片中の非内分泌細胞の出現数や出現頻度は、同一処理の複数バッチ由来の細胞で４試験実施した際の合計数として集計した。
２．結果
（１）Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加し作製したインスリン産生細胞集団の生体内
　移植後の経過観察として測定した血漿中ヒトＣ－ペプチド濃度および移植片重量の結果を図６に示す。皮下移植されたＤｏｃｅｔａｘｅｌを添加し作製したインスリン産生細胞集団は、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加せず作製したインスリン産生細胞集団と同程度の血漿中ヒトＣ－ペプチド分泌が認められ、それは移植後６ヶ月後まで継続的に確認された。６か月時点での移植片重量は、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加し作製したインスリン産生細胞集団において低い傾向が観察された。
（２）移植片中の非内分泌細胞およびタンパク質発現の評価
　移植６か月後の移植片の免疫組織染色の結果において、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加し作製したインスリン産生細胞集団の移植片においては、インスリン陽性、グルカゴン陽性の細胞が移植片の全体にわたって多く確認された一方、Ｋｉ６７陽性の細胞はわずかに点在する程度であった。それに対して、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加せず作製したインスリン産生細胞集団の移植片においては、インスリン陽性、グルカゴン陽性細胞の存在とともに、多くのＫｉ６７陽性細胞が出現することが確認された。
　上記Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加し作製したインスリン産生細胞集団を用いて実施した４つの移植試験結果について、集計した非内分泌細胞集団の出現数および出現頻度を表９に示す。Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加せず作製したインスリン産生細胞集団の移植群（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ（－））については、ＯｕｔｇｒｏｗｔｈおよびＣｙｓｔの出現率（出現数割合）は、各々７３％（１６/２２）および１００％（２２/２２）であったのに対し、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加し作製したインスリン産生細胞集団の移植群（Ｄｏｃｅｔａｘｅｌ（＋））においては、各々０％（０/２１）および１０％（２/２１）と、移植片における非内分泌細胞出現率の明確な低下が確認された。
　このことから、培養工程にＤｏｃｅｔａｘｅｌを添加することは、移植後生体内での目的外非内分泌細胞の出現を抑制するために有効であることが示唆された。なお表９に示すＯｕｔｇｒｏｗｔｈとは、ヒト核陽性かつＰＤＸ１陰性かつＫｉ６７陽性の非内分泌細胞の集団を指し、ＨＥ染色による形態とともに免疫組織染色によりその存在を判断した。表９に示すＣｙｓｔとは、ヒト核陽性かつＰＤＸ１陽性かつＣＫ１９陽性の非内分泌性導管細胞を指し、ＨＥ染色による管状形態とともに免疫組織染色によりその存在を判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　以上より、Ｄｏｃｅｔａｘｅｌを添加し作製したインスリン産生細胞集団は、移植された生体内においても、非内分泌系細胞の増殖が抑えられ、内分泌細胞やインスリン産生細胞を高い割合で産生できることが示され、その有効性と安全性が確認された。

 

Claims (14)

  1. 　インスリン産生細胞集団を製造する方法であって、
    膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を処理対象とし、チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物を含む培地中で培養することを含む、方法。
  2. 　チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物が、タキソイド系抗がん剤より選択される化合物又はその薬理学的に許容される塩である、請求項１に記載の方法。
  3. 　チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物が、ドセタキセル又はその薬理学的に許容される塩である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　製造されたインスリン産生細胞集団が、ＣＨＧＡ陽性細胞を９５％以上含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　製造されたインスリン産生細胞集団が、ＣＨＧＡ陰性かつＫｉ６７陽性細胞を０．１％以下含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　処理対象である膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団が、多能性幹細胞を分化誘導して製造されたものである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物を含む、膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の培養培地。
  8. 　チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物が、タキソイド系抗がん剤より選択される化合物又はその薬理学的に許容される塩である、請求項７に記載の培養培地。
  9. 　チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物が、ドセタキセル又はその薬理学的に許容される塩である、請求項７又は８に記載の培養培地。
  10. 　ＣＨＧＡ陽性細胞の割合を増大させるため、ならびに／あるいは、インスリン陽性かつＮＫＸ６．１陽性細胞の割合を増大させるために使用される、請求項７～９のいずれか一項に記載の培養培地。
  11. 　インスリン産生細胞集団を上皮成長因子（ＥＧＦ）を含む培地中で培養することを含む、前記インスリン産生細胞集団における非内分泌系細胞を検出する方法。
  12. 　非内分泌系細胞が、ＣＨＧＡ陰性かつＰＤＸ１陽性細胞及び／又はＣＨＧＡ陰性かつＰＤＸ１陰性細胞である、請求項１１に記載の方法。
  13. 　非内分泌系細胞を除去する方法であって、
    膵内分泌前駆細胞集団及び／又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を処理対象とし、チューブリンの重合促進活性及び／又は脱重合阻害活性を有する化合物を含む培地中で培養することを含む、方法。
  14. 　インスリン産生細胞集団における非内分泌系細胞を検出するために使用される、ＥＧＦを含むインスリン産生細胞集団の培養培地。

     
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Citations (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004121165A (ja) * 2002-10-07 2004-04-22 Asahi Kasei Corp 膵幹様細胞の分化誘導方法
WO2007069666A1 (ja) 2005-12-13 2007-06-21 Kyoto University 核初期化因子
US20080236610A1 (en) 2004-04-10 2008-10-02 Holger Bartels Hair Rollers
WO2008118220A2 (en) 2006-11-28 2008-10-02 Veritainer Corporation Radiation detection unit for mounting a radiation sensor to a container crane
WO2008124133A1 (en) 2007-04-07 2008-10-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Reprogramming of somatic cells
WO2008151058A2 (en) 2007-05-30 2008-12-11 The General Hospital Corporation Methods of generating pluripotent cells from somatic cells
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
WO2009012428A2 (en) 2007-07-18 2009-01-22 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
US20090047263A1 (en) 2005-12-13 2009-02-19 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
WO2010010902A1 (ja) 2008-07-24 2010-01-28 国立大学法人新潟大学 マイクロカプセル及びその製造方法並びにマイクロカプセルを含む飲食品
WO2010032242A1 (en) 2008-09-17 2010-03-25 Beta O2 Technologies Ltd. Optimization of alginate encapsulation of islets for transplantation
WO2011154941A2 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Beta-O2 Technologies Ltd. Multiple-layer immune barrier for donor cells
US20120071477A1 (en) 2009-11-30 2012-03-22 Senex Biotechnology, Inc. Cdki pathway inhibitors and uses thereof
WO2013116786A1 (en) 2012-02-02 2013-08-08 Senex Biotechnology Inc. Cdk8/cdk19 selective inhibitors and their use in anti-metastatic and chemopreventative methods for cancer
WO2014038958A1 (en) 2012-09-10 2014-03-13 Besseggen 1896 As Balance chair
WO2014134169A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Senex Biotechnology, Inc. Inhibitors of cdk8/19 for use in treating estrogen receptor positive breast cancer
US20150274726A1 (en) 2012-11-08 2015-10-01 Selvita Sa Substituted tricyclic benzimidazoles as kinase inhibitors
WO2015159937A1 (ja) 2014-04-18 2015-10-22 武田薬品工業株式会社 縮合複素環化合物
WO2015159938A1 (ja) 2014-04-18 2015-10-22 武田薬品工業株式会社 複素環化合物
WO2016009076A1 (en) 2014-07-17 2016-01-21 Merck Patent Gmbh Novel naphthryidines and isoquinolines and their use as cdk8/19 inhibitors
WO2016018511A2 (en) 2014-06-10 2016-02-04 University Of South Carolina Methods and compositions for treatment of her-positive cancers
WO2016016951A1 (ja) 2014-07-29 2016-02-04 櫻護謨株式会社 安全弁機能を備えた結合金具
WO2016021734A1 (ja) 2014-08-04 2016-02-11 武田薬品工業株式会社 膵前駆細胞の増殖方法
WO2016100782A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 University Of South Carolina Suppression of neointimal formation following vascular surgery using cdk8 inhibitors
WO2016182904A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 President And Fellows Of Harvard College Targeted selection of patients for treatment with cortistatin derivatives
WO2019208505A1 (ja) 2018-04-23 2019-10-31 国立大学法人京都大学 増殖抑制剤
JP2021019120A (ja) 2019-07-22 2021-02-15 株式会社タムラ製作所 電子部品ユニット

Patent Citations (33)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004121165A (ja) * 2002-10-07 2004-04-22 Asahi Kasei Corp 膵幹様細胞の分化誘導方法
US20080236610A1 (en) 2004-04-10 2008-10-02 Holger Bartels Hair Rollers
US20090047263A1 (en) 2005-12-13 2009-02-19 Kyoto University Nuclear reprogramming factor and induced pluripotent stem cells
WO2007069666A1 (ja) 2005-12-13 2007-06-21 Kyoto University 核初期化因子
JP2008283972A (ja) 2005-12-13 2008-11-27 Kyoto Univ 誘導多能性幹細胞の製造方法
WO2008118220A2 (en) 2006-11-28 2008-10-02 Veritainer Corporation Radiation detection unit for mounting a radiation sensor to a container crane
WO2008124133A1 (en) 2007-04-07 2008-10-16 Whitehead Institute For Biomedical Research Reprogramming of somatic cells
WO2008151058A2 (en) 2007-05-30 2008-12-11 The General Hospital Corporation Methods of generating pluripotent cells from somatic cells
WO2009006930A1 (en) 2007-06-15 2009-01-15 Izumi Bio, Inc. Human pluripotent stem cells induced from undifferentiated stem cells derived from a human postnatal tissue
WO2009007852A2 (en) 2007-06-15 2009-01-15 Izumi Bio, Inc Multipotent/pluripotent cells and methods
WO2009006997A1 (en) 2007-06-15 2009-01-15 Izumi Bio, Inc. Human pluripotent stem cells and their medical use
JP2008307007A (ja) 2007-06-15 2008-12-25 Bayer Schering Pharma Ag 出生後のヒト組織由来未分化幹細胞から誘導したヒト多能性幹細胞
WO2009012428A2 (en) 2007-07-18 2009-01-22 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
WO2010010902A1 (ja) 2008-07-24 2010-01-28 国立大学法人新潟大学 マイクロカプセル及びその製造方法並びにマイクロカプセルを含む飲食品
WO2010032242A1 (en) 2008-09-17 2010-03-25 Beta O2 Technologies Ltd. Optimization of alginate encapsulation of islets for transplantation
US20120071477A1 (en) 2009-11-30 2012-03-22 Senex Biotechnology, Inc. Cdki pathway inhibitors and uses thereof
WO2011154941A2 (en) 2010-06-07 2011-12-15 Beta-O2 Technologies Ltd. Multiple-layer immune barrier for donor cells
WO2013116786A1 (en) 2012-02-02 2013-08-08 Senex Biotechnology Inc. Cdk8/cdk19 selective inhibitors and their use in anti-metastatic and chemopreventative methods for cancer
JP2015506376A (ja) 2012-02-02 2015-03-02 セネックス バイオテクノロジー インク．Ｓｅｎｅｘ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ． Ｃｄｋ８／ｃｄｋ１９選択的阻害剤、ならびに癌のための抗転移および化学防御の方法におけるそれらの使用
WO2014038958A1 (en) 2012-09-10 2014-03-13 Besseggen 1896 As Balance chair
US20150274726A1 (en) 2012-11-08 2015-10-01 Selvita Sa Substituted tricyclic benzimidazoles as kinase inhibitors
US20160000787A1 (en) 2013-02-26 2016-01-07 Senex Biotechnology, Inc. Inhibitors of cdk8/19 for use in treating estrogen receptor positive breast cancer
WO2014134169A1 (en) 2013-02-26 2014-09-04 Senex Biotechnology, Inc. Inhibitors of cdk8/19 for use in treating estrogen receptor positive breast cancer
WO2015159937A1 (ja) 2014-04-18 2015-10-22 武田薬品工業株式会社 縮合複素環化合物
WO2015159938A1 (ja) 2014-04-18 2015-10-22 武田薬品工業株式会社 複素環化合物
WO2016018511A2 (en) 2014-06-10 2016-02-04 University Of South Carolina Methods and compositions for treatment of her-positive cancers
WO2016009076A1 (en) 2014-07-17 2016-01-21 Merck Patent Gmbh Novel naphthryidines and isoquinolines and their use as cdk8/19 inhibitors
WO2016016951A1 (ja) 2014-07-29 2016-02-04 櫻護謨株式会社 安全弁機能を備えた結合金具
WO2016021734A1 (ja) 2014-08-04 2016-02-11 武田薬品工業株式会社 膵前駆細胞の増殖方法
WO2016100782A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 University Of South Carolina Suppression of neointimal formation following vascular surgery using cdk8 inhibitors
WO2016182904A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 President And Fellows Of Harvard College Targeted selection of patients for treatment with cortistatin derivatives
WO2019208505A1 (ja) 2018-04-23 2019-10-31 国立大学法人京都大学 増殖抑制剤
JP2021019120A (ja) 2019-07-22 2021-02-15 株式会社タムラ製作所 電子部品ユニット

Non-Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALIREZA REZANIA, JENNIFER E BRUIN, PAYAL ARORA, ALLISON RUBIN, IRINA BATUSHANSKY, ALI ASADI, SHANNON O'DWYER, NINA QUISKAMP, MAJID: "Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells", NATURE BIOTECHNOLOGY, GALE GROUP INC., vol. 32, no. 11, 11 September 2014 (2014-09-11), pages 1121 - 1133, XP055200937, ISSN: 10870156, DOI: 10.1038/nbt.3033 *
CAS , no. 1218779-75-9
CAS, no. 1018069-81-2
HUANGFU D.MELTON, DA. ET AL., NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 26, no. 7, 2008, pages 795 - 797
KIM JB.SCHOLER HR. ET AL., NATURE, vol. 454, 2008, pages 646 - 650
NATURE BIOTECHNOLOGY, vol. 32, 2014, pages 1121 - 1133
OKITA K ET AL., NAT. METHODS, vol. 8, no. 5, May 2011 (2011-05-01), pages 409 - 12
OKITA K ET AL., STEM CELLS, vol. 31, no. 3, pages 458 - 66
OKITA, K.ICHISAKA, T.YAMANAKA, S, NATURE, vol. 451, 2007, pages 141 - 146
SHI Y.DING S. ET AL., CELL STEM CELL, vol. 3, 2008, pages 568 - 574
STEM CELL RESEARCH, vol. 14, 2015, pages 185 - 197
TAKAHASHI KYAMANAKA S. ET AL., CELL, vol. 131, 2007, pages 861 - 872
TAKAHASHI KYAMANAKA S., CELL, vol. 126, 2006, pages 663 - 676
TOYODA ET AL., STEM CELL RESEARCH, vol. 14, 2015, pages 185 - 197
YU J.THOMSON JA ET AL., SCIENCE, vol. 318, 2007, pages 1917 - 1920

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