WO2021079874A1 - 増殖抑制剤 - Google Patents

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WO2021079874A1 PCT/JP2020/039380 JP2020039380W WO2021079874A1 WO 2021079874 A1 WO2021079874 A1 WO 2021079874A1 JP 2020039380 W JP2020039380 W JP 2020039380W WO 2021079874 A1 WO2021079874 A1 WO 2021079874A1
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健介 佐久間
則子 山添
太郎 豊田
周平 小長谷
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武田薬品工業株式会社
国立大学法人京都大学
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    • C12N2510/00Genetically modified cells

Definitions

  • the present invention relates to a method for removing non-endocrine non-target cells present in an insulin-producing cell population or a pancreatic ⁇ -cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells.
  • insulin-secreting cells such as insulin-producing cells and pancreatic ⁇ -cells
  • pluripotent stem cells such as iPS cells and ES cells
  • Non-Patent Document 1 the insulin-secreting cell population obtained by inducing differentiation includes non-endocrine cells as well as the target insulin-secreting cells, and is a target insulin-secreting cell in promoting its use in the treatment of diabetes. There was a long-awaited method for obtaining insulin more efficiently.
  • pancreatic ⁇ -cells chromogranin A in the cell population induced to differentiate from pluripotent stem cells to insulin-producing cells or pancreatic ⁇ -cells. It has been found that there are non-endocrine cells (hereinafter sometimes referred to as "CHGA negative cells”) characterized by negative (described as "CHGA"). It was also found that CHGA-negative cells include highly proliferative cells characterized by Ki67 marker positivity (CHGA-negative and Ki67-positive cells).
  • an object of the present invention is to provide a method for removing CHGA-negative cells coexisting with insulin-secreting cells that have been induced to differentiate.
  • pancreatic progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells, preferably an endocrine progenitor cell population, more preferably an insulin-producing cell population, or
  • a PLK inhibitor By treating the cell population in the subsequent differentiation stage with a PLK inhibitor, the proliferation of CHGA-negative cells can be suppressed, and the pancreatic progenitor cell population, the endocrine progenitor cell population, in which the content of these cells is reduced, It has been found that it is possible to obtain an insulin-producing cell population or a cell population in a subsequent differentiation stage.
  • a method for producing an insulin-producing cell population which comprises a step of treating an insulin-producing cell population induced to differentiate from pluripotent stem cells with a PLK inhibitor.
  • a method for producing an insulin-producing cell population which comprises a step of treating an endocrine progenitor cell population induced to differentiate from pluripotent stem cells with a PLK inhibitor.
  • a method for producing an insulin-producing cell population which comprises a step of treating a pancreatic progenitor cell population induced to differentiate from pluripotent stem cells with a PLK inhibitor.
  • [2] The production method according to any one of [1] to [1-2], wherein the produced cell population contains CHGA-negative cells at a ratio of 20% or less.
  • [3] The production method according to any one of [1] to [2], wherein the produced cell population contains CHGA-negative and Ki67-positive cells at a ratio of 3% or less.
  • [4] The production method according to any one of [1] to [3], wherein the produced cell population contains insulin-positive and NKX6.1-positive cells at a rate of 15% or more.
  • [5] The production method according to any one of [1] to [4], further comprising a step of differentiating a cell population treated with a PLK inhibitor.
  • [7] A method for suppressing the proliferation of CHGA-negative cells present in an insulin-producing cell population induced to differentiate from pluripotent stem cells. A method comprising treating the cell population with a PLK inhibitor.
  • [7-1] A method for suppressing the proliferation of CHGA-negative cells present in an endocrine progenitor cell population induced to differentiate from pluripotent stem cells.
  • [7-2] A method for suppressing the proliferation of CHGA-negative cells present in a pancreatic progenitor cell population induced to differentiate from pluripotent stem cells.
  • a method comprising treating the cell population with a PLK inhibitor.
  • a drug for treating diabetes which comprises any of the cell populations of [12] to [15].
  • a method for treating or preventing diabetes which comprises the step of transplanting an insulin-producing cell population induced to differentiate from pluripotent stem cells or a cell population in a subsequent differentiation stage treated with a PLK inhibitor.
  • the PLK4 inhibitor is (1S, 2R) -2-[3-[(1E) -2- [4-[[(2R, 6S) -2,6-dimethyl-4-morpholinyl] methyl] phenyl.
  • the PLK1 inhibitor is (R) -5-(6-((4-methylpiperazin-1-yl) methyl) -1H-benzo [d] imidazol-1-yl) -3-(1-( The method for producing any of [1] to [6], which is 2- (trifluoromethyl) phenyl) ethoxy) thiophene-2-carboxamide (CAS No. 929095-18-1) or a salt thereof. [23] The method according to any one of [7] to [11], wherein the PLK inhibitor is a PLK1 inhibitor or a PLK4 inhibitor.
  • the PLK4 inhibitor is (1S, 2R) -2-[3-[(1E) -2- [4-[[(2R, 6S) -2,6-dimethyl-4-morpholinyl] methyl] phenyl.
  • the PLK1 inhibitor is (R) -5-(6-((4-methylpiperazin-1-yl) methyl) -1H-benzo [d] imidazol-1-yl) -3-(1-( The method of any of [7] to [11], which is 2- (trifluoromethyl) phenyl) ethoxy) thiophene-2-carboxamide (CAS No. 929095-18-1) or a salt thereof.
  • the cell population according to any one of [12] to [15], wherein the PLK inhibitor is a PLK1 inhibitor or a PLK4 inhibitor.
  • a medicament for treating diabetes which comprises the cell population of [28].
  • the method according to any one of [7] to [11] which does not reduce the number of non-CHGA-negative cells present in the cell population.
  • [35] The cell population according to any one of [12] to [14], which contains CHGA-negative and Ki67-positive cells at a rate of 1% or less.
  • a prodrug comprising any of the cell populations [12]-[14], [34] and [35].
  • [37] A method for producing an insulin-producing cell population or a pancreatic ⁇ -cell population. (1) a step of treating an insulin-producing cell population or a pancreatic ⁇ -cell population with a PLK inhibitor, and (2) a step of embedding the insulin-producing cell population in a gel containing a biocompatible material. How to include.
  • (1) A step of treating an insulin-producing cell population or a pancreatic ⁇ -cell population with a PLK inhibitor, and (2) a step of differentiating an insulin-producing cell population treated with a PLK inhibitor. How to include.
  • [39] The method of [30], wherein the PLK4 inhibitor is a substance having a 50% inhibitory concentration (IC 50) of PLK4 of less than 5 nM.
  • the PLK4 inhibitor is (1S, 2R) -2-[3-[(1E) -2- [4-[[(2R, 6S) -2,6-dimethyl-4-morpholinyl] methyl] phenyl. ] ethenyl]-1H-indazol-6-yl] -5-methoxy - spiro [cyclopropane-1,3 '- [3 H] indol] -2'(1'H) - on (CAS No.1338800- 06-8) or a salt thereof, the method of [30].
  • the PLK1 inhibitor is (R) -5-(6-((4-methylpiperazin-1-yl) methyl) -1H-benzo [d] imidazol-1-yl) -3-(1-( The method of [30], which is 2- (trifluoromethyl) phenyl) ethoxy) thiophene-2-carboxamide (CAS No. 929095-18-1) or a salt thereof.
  • An insulin-producing cell population that has been treated with a PLK inhibitor and has been induced to differentiate from pluripotent stem cells for use in methods for treating or preventing diabetes, or a cell population that is in a subsequent differentiation stage.
  • the PLK4 inhibitor is a substance having a 50% inhibitory concentration (IC 50) of PLK4 of less than 5 nM.
  • the PLK4 inhibitor is (1S, 2R) -2-[3-[(1E) -2- [4-[[(2R, 6S) -2,6-dimethyl-4-morpholinyl] methyl] phenyl. ] ethenyl]-1H-indazol-6-yl] -5-methoxy - spiro [cyclopropane-1,3 '- [3 H] indol] -2'(1'H) - on (CAS No.1338800- 06-8) or a salt thereof, the cell population of [47].
  • the PLK1 inhibitor is (R) -5-(6-((4-methylpiperazin-1-yl) methyl) -1H-benzo [d] imidazol-1-yl) -3-(1-( The cell population of [47], which is 2- (trifluoromethyl) phenyl) ethoxy) thiophene-2-carboxamide (CAS No. 929095-18-1) or a salt thereof.
  • [57] Use of an insulin-producing cell population induced from pluripotent stem cells or a cell population in a subsequent differentiation stage treated with a PLK inhibitor in the manufacture of a medicament for treating or preventing diabetes.
  • the PLK inhibitor is a PLK1 inhibitor or a PLK4 inhibitor.
  • the PLK4 inhibitor is a substance having a 50% inhibitory concentration (IC 50 ) of PLK4 of less than 5 nM.
  • the PLK4 inhibitor is (1S, 2R) -2-[3-[(1E) -2- [4-[[(2R, 6S) -2,6-dimethyl-4-morpholinyl] methyl] phenyl.
  • the PLK1 inhibitor is (R) -5-(6-((4-methylpiperazin-1-yl) methyl) -1H-benzo [d] imidazol-1-yl) -3-(1-( Use of [58], which is 2- (trifluoromethyl) phenyl) ethoxy) thiophene-2-carboxamide (CAS No. 929095-18-1) or a salt thereof.
  • Use of any of [57] to [62] wherein the cell population contains CHGA-negative cells in a proportion of 20% or less.
  • Use of any of [57] to [62] wherein the cell population contains CHGA-negative and Ki67-positive cells in a proportion of 3% or less.
  • “about” means up to 25%, 20%, 10%, 8%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% or 1%, respectively, plus or minus with respect to the reference value. Indicates a fluctuating value.
  • the term “about” or “approximately” refers to a range of plus or minus 15%, 10%, 5%, or 1%, respectively, relative to the reference value.
  • not using feeder cells basically means that the feeder cells are not contained and that a medium or the like preconditioned by culturing the feeder cells is not used. Therefore, the medium does not contain substances such as growth factors and cytokines secreted from feeder cells.
  • the "feeder cell” or “feeder” means a cell that is co-cultured with another type of cell, supports the cell, and provides an environment in which the cell can grow.
  • the feeder cells may be of the same species as the cells they support, or they may be of a different species.
  • human skin fibroblasts or human embryonic stem cells may be used as human cell feeders, primary cultures of mouse embryonic fibroblasts, and immortalized mouse embryonic fibroblasts may be used. ..
  • Feeder cells can be inactivated by irradiation, mitomycin C treatment, or the like.
  • adheresion means that cells are attached to a container, eg, cells are attached to a cell culture dish or flask of sterile plastic (or coated plastic) in the presence of a suitable medium. Refers to that. Some cells cannot be maintained or grow in the culture unless they are adhered to a cell culture vessel. In contrast, non-adhesive cells can be maintained and proliferated in culture without adhering to the vessel.
  • culture refers to maintaining, growing, and / or differentiating cells in an in vitro environment. “Culturing” means sustaining, proliferating, and / or differentiating cells in tissues or in vitro, eg, in cell culture dishes or flasks.
  • the culture includes two-dimensional culture (plane culture) and three-dimensional culture (suspended culture).
  • enriching and enrichment refer to increasing the amount of a particular component in a composition, such as a cell composition, “enriching”.
  • “Enriched” is the composition of a cell, eg, when used to describe a cell population, such as in a cell population before the amount of a particular component is enriched. Refers to a cell population that is increasing compared to the proportion of constituents.
  • a composition such as a cell population can be enriched with respect to the target cell type, thus the proportion of the target cell type is compared to the proportion of target cells present in the cell population before enrichment.
  • Cell populations can also be enriched for target cell types by cell selection and selection methods known in the art.
  • Cell populations can also be enriched by the specific sorting or selection processes described herein.
  • the method of enriching the target cell population causes the cell population to be at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85% with respect to the target cell population. , 90%, 95%, 97%, 98% or 99% enriched.
  • deplete and “depletion” refer to reducing the amount of a particular component in a composition, such as a cell composition, and is “depleted.”
  • depleted means that the amount of a particular component is the proportion of such component in the cell population before it is depleted. Refers to a cell population that is declining compared to.
  • a composition such as a cell population can be depleted with respect to the target cell type, thus the proportion of the target cell type is reduced compared to the proportion of target cells present in the cell population before it is depleted. ..
  • Cell populations can also be depleted for target cell types by cell selection and selection methods known in the art.
  • Cell populations can also be depleted by the specific sorting or selection processes described herein.
  • the method of depleting the target cell population reduces the cell population by at least 50%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% or 99% with respect to the target cell population. (Exhausted).
  • purifying and purifying mean removing impurities in a composition, such as a cell composition, to purify a particular component.
  • purified when used to describe a cell composition, eg, a cell population, is such a component in the cell population before the amount of impurities is purified. Refers to a cell population that is reduced compared to the proportion of cells and the purity of a particular component is improved.
  • a composition such as a cell population can be purified with respect to the target cell type, thus the proportion of the target cell type is increased compared to the proportion of target cells present in the cell population before purification.
  • Cell populations can also be purified for target cell types by cell selection and selection methods known in the art.
  • Cell populations can also be purified by the specific sorting or selection processes described herein.
  • the purity of the target cell population is at least 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% or 99% by the method of purifying the target cell population.
  • impurities including contaminating cells can be undetectable.
  • does not reduce the number of cells means that the number of cells does not decrease significantly due to the implementation of the method of the present invention, and the number of cells before the implementation of the method and the implementation of the method. It means that there is no significant difference from the later cell number. However, a decrease in the number of cells that is not caused by the implementation of the method of the present invention (for example, natural death of cells that can usually occur in conventionally known steps of cell culture and differentiation) can occur. Therefore, "does not reduce the number of cells” means that the reduction rate of cells after the implementation of the method of the present invention is 30% or less, 20% or less, 10% or less, or 5% or less. Is also included.
  • pressing proliferation means that the number of cells does not increase significantly due to the implementation of the method of the present invention, and the number of cells before the implementation of the method and after the implementation of the method. It means that there is no significant increase in the number of cells. Therefore, “suppressing proliferation” also includes cases where the rate of increase in cells after the implementation of the method of the present invention is 30% or less, 20% or less, 10% or less, or 5% or less. Is done.
  • the term “marker” means a cell antigen or a gene thereof that is specifically expressed by a predetermined cell type, such as “marker protein” or “marker gene”.
  • the marker is a cell surface marker, which allows enrichment, isolation, and / or detection of viable cells.
  • the marker can be a positive selectable marker or a negative selectable marker.
  • Detection of a marker protein can be performed using an immunological assay using an antibody specific to the marker protein, for example, ELISA, immunostaining, or flow cytometry.
  • the marker gene can be detected by using a nucleic acid amplification method and / or a nucleic acid detection method known in the art, for example, RT-PCR, microarray, biochip and the like.
  • RT-PCR nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid detection method known in the art
  • RT-PCR a nucleic acid
  • expression is defined as transcription and / or translation of a particular nucleotide sequence driven by an intracellular promoter.
  • factor having CDK8 / 19 inhibitory activity means any substance having CDK8 / 19 inhibitory activity.
  • CDK8 is not required for cell proliferation and inhibition of CDK8 has no significant effect under normal conditions.
  • CDK19 and CDK8 are similar, and CDK8 inhibition is usually accompanied by inhibition of CDK19.
  • “Growth factor” is an endogenous protein that promotes the differentiation and / or proliferation of specific cells.
  • growth factor include epithelial growth factor (EGF), acidic fibroblast growth factor (aFGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), hepatocellular growth factor (HGF), and insulin-like growth factor 1.
  • IGF-1 insulin-like growth factor 2
  • IGF-2 insulin-like growth factor 2
  • KGF keratinocyte growth factor
  • NGF nerve growth factor
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • TGF- ⁇ transformed growth factor ⁇
  • VEGF Vascular endothelial cell growth factor
  • transferase various interleukins (eg IL-1 to IL-18), various colony stimulators (eg granulocytes / macrophages-colony stimulators (GM-CSF)), Included are various interferons (eg, IFN- ⁇ , etc.) and other cytokines that have effects on stem cells, such as stem cell factor (SCF) and erythropoetin (Epo).
  • SCF stem cell factor
  • Epo erythropoetin
  • ROCK inhibitor means a substance that inhibits Rho kinase (ROCK: Rho-associated, coiled-coil protein kinase), and is a substance that inhibits either ROCK I or ROCK II. You may.
  • the ROCK inhibitor is not particularly limited as long as it has the above-mentioned function, and for example, N- (4-pyridinyl) -4 ⁇ -[(R) -1-aminoethyl] cyclohexane-1 ⁇ -carbamide (in the present specification, Y).
  • the "GSK3 ⁇ inhibitor” is a substance having an inhibitory activity on GSK3 ⁇ (glycogen synthase kinase 3 ⁇ ).
  • GSK3 (glycogen synthase kinase 3) is a type of serine / threonine protein kinase and is involved in many signaling pathways involved in glycogen production, apoptosis, and stem cell maintenance. There are two isoforms of ⁇ and ⁇ in GSK3.
  • the "GSK3 ⁇ inhibitor” used in the present invention is not particularly limited as long as it has a GSK3 ⁇ inhibitory activity, and may be a substance having a GSK3 ⁇ inhibitory activity together with a GSK3 ⁇ inhibitory activity.
  • GSK3 ⁇ inhibitor examples include CHIR98014 (2-[[2-[(5-nitro-6-aminopyridine-2-yl) amino] ethyl] amino] -4- (2,4-dichlorophenyl) -5- (1H).
  • GSK3 ⁇ is not limited to these, and antisense oligonucleotides against GSK3 ⁇ mRNA, siRNA, antibodies that bind to GSK3 ⁇ , dominant negative GSK3 ⁇ variants, etc. can also be used as GSK3 ⁇ inhibitors and are commercially available. It can be synthesized according to a known method.
  • serum substitute refers to, for example, KnockOut TM Serum Replacement (KSR: Thermo Fisher Scientific), StemSure® Serum Replacement (Wako), B-27 supplement, N2-supplement, for example, N2-supplement. Lipid-rich albumin), insulin, transferrin, fatty acids, collagen precursors, trace elements (eg zinc, selenium (eg sodium selenate)), 2-mercaptoethanol, 3'thiolglycerol or mixtures thereof (eg ITS- G) can be mentioned.
  • B-27 supplements, KSR, StemSure® Serum Replacement, ITS-G are preferred.
  • the concentration in the medium is 0.01 to 10% by weight, preferably 0.1 to 2% by weight. In the present invention, it is preferable to use a "serum substitute" instead of serum.
  • the present invention relates to an insulin-producing cell population in which the growth of CHGA-negative cells is suppressed, and these cell populations can be obtained by treating with a PLK inhibitor. Can be done.
  • the present invention also relates to a method of suppressing the proliferation of CHGA-negative cells by treatment with a PLK inhibitor.
  • CHGA-negative cells are pancreatic precursor cell populations induced to differentiate from pluripotent stem cells, preferably endocrine precursor cell populations, more preferably insulin-producing cells in the process of differentiating from pluripotent stem cells to pancreatic ⁇ cells. It means a non-endocrine cell characterized by negative expression of the CHGA marker, which is present in the population or a cell population in a subsequent stage of differentiation.
  • CHGA-negative cells can include cells characterized by the presence of Ki67 expression as a marker (ie, CHGA-positive and Ki67-positive cells).
  • Ki67 is known as a cell cycle-related nuclear protein, and its expression is observed in the G1, S, G2, and M phases of proliferating cells, and in the G0 phase when proliferation is stopped. It is also known as a marker for cell proliferation and cell cycle because it does not. Therefore, CHGA-positive and Ki67-positive cells are highly proliferative cells.
  • the "insulin-producing cell population” means a cell population containing insulin-producing cells obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells.
  • “Insulin-producing cell” means a cell characterized by the presence of expression of an insulin marker (ie, an insulin-positive cell).
  • the “insulin-producing cell” may express the marker for NK6 homeobox 1 (NKX6.1), preferably cells expressing both the insulin and NKX6.1 markers (ie, insulin positive and NKX6.1 positive cells).
  • the "insulin-producing cell population” has a lower content of CHGA-negative cells than the insulin-producing cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells according to a conventionally known method, and its content ( In the present specification, “ratio” may be referred to as “ratio") is 40% or less, or 30% or less, preferably 20% or less, more preferably 15% or less, still more preferably 10% or less, for example, 9%. Below, 8% or less, 7% or less, 6% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less, or 1% or less. The lower limit of the content is not particularly limited, but is 0% or more, 0.1% or more, or 0.5% or more.
  • the content rate can be expressed using two numerical values selected from the upper limit value and the lower limit value, respectively.
  • the content rate is 0.5% to 40%, or 0.5% to 30%, preferably 0.5% to 30%. Is 0.5% to 20%, more preferably 0.5% to 15%, still more preferably 0.5% to 10%.
  • the "insulin-producing cell population" according to the present invention is an insulin-positive cell, particularly an insulin-positive and NKX6.1, as compared with an insulin-producing cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells according to a conventionally known method.
  • the content of insulin-positive and NKX6.1-positive cells is 14% or more, preferably 15% or more, more preferably 20% or more, still more preferably 25% or more, for example. , 30% or more, 35% or more, 40% or more, or 45% or more.
  • the upper limit of the content rate is not particularly limited, but is 70% or less, 60% or less, or 50% or less.
  • the content rate can be expressed using two numerical values selected from the upper limit value and the lower limit value, respectively.
  • the content rate is 14% to 50%, preferably 15% to 50%, and more preferably 20. % To 50%, more preferably 25% to 50%.
  • the "insulin-producing cell population” is a pancreatic progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells, preferably an endocrine progenitor cell population, more preferably an insulin-producing cell population, or a subsequent differentiation stage. It can be obtained by treating a cell population in PLK with a PLK inhibitor. By treating a cell population at a predetermined differentiation stage with a PLK inhibitor, the proliferation of CHGA-negative cells is suppressed, the cell content thereof is reduced, and insulin-positive cells, preferably insulin-positive and NKX6.1-positive cells, are produced. It can be enriched.
  • this differentiation stage is broadly classified into pluripotent stem cells, embryonic embryonic follicle cells, proto-intestinal cells, posterior anterior intestinal cells, pancreatic progenitor cells, endocrine progenitor cells, insulin-producing cells, and pancreatic ⁇ -cells in relatively undifferentiated order. can do.
  • pluripotency means the ability to differentiate into tissues and cells having various different morphologies and functions, and to differentiate into cells of any lineage of three germ layers.
  • Pluripotency is a “totipotency” that can differentiate into any tissue in the body, including the scutellum, in that it cannot differentiate into the scutellum and therefore has no ability to form individuals. Is distinguished from.
  • multipotency means the ability to differentiate into a plurality of limited lineages of cells.
  • mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, and neural stem cells are multipotent, but not pluripotent.
  • pluripotent stem cell refers to embryonic stem cells (ES cells) and similar differentiated pluripotent cells, that is, various tissues of the living body (endoderm, mesodermal, ectoderm). Refers to cells that have the potential to differentiate into (all of the germ layer). Examples of cells having pluripotency similar to ES cells include "induced pluripotent stem cells” (sometimes referred to as “iPS cells” in the present specification). Preferably, in the present invention, the pluripotent stem cell is a human pluripotent stem cell.
  • ES cell various mouse ES cell lines established by inGenius, RIKEN, etc. can be used for mouse ES cells, and the US National Institutes of Health for human ES cells.
  • Various human ES cell lines established by (NIH), RIKEN, Kyoto University, and Cellartis are available.
  • NIH CHB-1 to CHB-12 strains
  • RUES1 strains, RUES2 strains, HUES1 to HUES28 strains, etc. WiCell Research Institute H1 strains, H9 strains, RIKEN KhES-1 strains, KhES-2 strains, etc.
  • a strain, KhES-3 strain, KhES-4 strain, KhES-5 strain, SSES1 strain, SSES2 strain, SSES3 strain and the like can be used.
  • “Induced pluripotent stem cells” refers to cells obtained by introducing a specific factor (nuclear reprogramming factor) into mammalian somatic cells or undifferentiated stem cells and reprogramming them.
  • a specific factor nuclear reprogramming factor
  • iPS induced pluripotent stem cells
  • Yamanaka et al. By introducing four factors, Oct3 / 4, Sox2, Klf4, and c-Myc, into mouse fibroblasts.
  • human cell-derived iPS cells (Takahashi K, Yamanaka) established by introducing the same four factors into human fibroblasts. S., et al.
  • Nanog-iPS cells Okita, K., Ichisaka, T. et al.). , And Yamanaka, S. (2007). Nature 448, 313-317.
  • IPS cells prepared by a method that does not contain c-Myc (Nakagawa M, Yamanaka S., et al. Nature Biotechnology, (2008). , 101-106)
  • virus-free iPS cells established by introducing 6 factors (Okita K et al. Nat. Methods 2011 May; 8 (5): 409-12, Okita K et al. Stem Cells.
  • induced pluripotent stem cells (Yu J., Thomason JA. Et al., Science (2007) 318: 1917-1920.), Induced pluripotent stem cells produced by Dayy et al. (Park IH, Dayley GQ. Et al., Nature (2007) 451: 141-146), induced pluripotent stem cells produced by Sakurada et al. (Japanese Patent Laid-Open No. 2008-307007) and the like can also be used.
  • iPS cell lines established by NIH, RIKEN (RIKEN), Kyoto University, etc. can be used.
  • RIKEN's HiPS-RIKEN-1A strain, HiPS-RIKEN-2A strain, HiPS-RIKEN-12A strain, Nippons-B2 strain, Kyoto University's Ff-WJ-18 strain Ff- I01s01 shares, Ff-I01s02 shares, Ff-I01s04 shares, Ff-I01s06 shares, Ff-I14s03 shares, Ff-I14s04 shares, QHJI01s01 shares, QHJI01s04 shares, QHJI14s03 shares, QHJI14s03 shares, QHJI14s04 shares, 253G1 shares , 606A1 strain, 610B1 strain, 648A1 strain, MyCell iPS Cells (21525.102.10A) strain of
  • pancreatic progenitor cell population means a cell population containing pancreatic progenitor cells.
  • pancreatic progenitor cells mean cells characterized by expression of at least one marker of PDX-1, NKX6.1, PTF-1 ⁇ , GATA4 and SOX9.
  • the pancreatic progenitor cell population is a cell population containing pancreatic progenitor cells in a proportion of 30% or more, preferably 40% or more, more preferably 50% or more, still more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more.
  • the pancreatic progenitor cell population may include other cells (eg, endocrine progenitor cells, insulin-producing cells, Ki67-positive cells, CHGA-negative cells, etc.).
  • endocrine progenitor cell population means a cell population containing endocrine progenitor cells.
  • endocrine progenitor cells mean cells characterized by the expression of at least one marker of CHGA, NeuroD and NGN3, and the absence of markers of pancreatic-related hormonal systems (eg, insulin, etc.). To do.
  • Endocrine progenitor cells may express markers such as PAX-4, NKX2.2, Islet-1, PDX-1, PTF-1 ⁇ .
  • the endocrine progenitor cell population is a cell population containing endocrine progenitor cells in a proportion of 30% or more, preferably 40% or more, more preferably 50% or more, still more preferably 60% or more, still more preferably 70% or more.
  • the endocrine progenitor cell population may include other cells (eg, pancreatic progenitor cells, insulin-producing cells, Ki67-positive cells, CHGA-negative cells, etc.).
  • the proportion of specific cells in the cell population can be determined based on a known method such as flow cytometry that can calculate the number of cells.
  • the "insulin-producing cells” are as described above, and the "insulin-producing cell population" usually contains 5% or more, preferably 10% or more, more preferably 15% or more, still more preferably 20% or more, more insulin-producing cells. It is more preferably 25% or more, and particularly preferably 30% or more.
  • the cell population includes other cells (eg, endocrine precursor cells; other pancreatic hormone-producing cells expressing at least one marker of glucagon, somatostatin, and pancreatic polypeptide; Ki67-positive cells, CHGA-negative cells, etc.) may be included.
  • pancreatic ⁇ -cell means a cell more mature than "insulin-producing cell", and specifically, at least one marker of MAFA, UCN3, and IAPP, which are maturation markers of pancreatic ⁇ -cell. Means cells that express or are characterized by a glucose-stimulated insulin secretagogue response.
  • pancreatic ⁇ -cell population is a cell population containing pancreatic ⁇ -cells that can be obtained by differentiating and maturing an insulin-producing cell population, preferably by differentiating and maturing in vivo.
  • the cell population may include other cells (eg, insulin-producing cells, Ki67-positive cells, CHGA-negative cells, etc.).
  • each target cell population can be obtained by using the following differentiation induction step: Step 1) Induce differentiation from pluripotent stem cells into germ layer cells in the embryonic body; Step 2) Induce differentiation from germ layer cells in the embryo to proto-intestinal cells; Step 3) Induce differentiation from protointestinal cells to posterior anterior intestinal cells; Step 4) Induce differentiation from posterior foregut cells to pancreatic progenitor cells; Step 5) Induce differentiation from pancreatic progenitor cells to endocrine progenitor cells; Step 6) Induce differentiation from endocrine progenitor cells to insulin-producing cells.
  • each step will be described, but the induction of differentiation into each cell is not limited to these methods.
  • Step 1) Differentiation into endoderm cells The pluripotent stem cells are first differentiated into germ layer cells in the embryo. Methods for inducing embryonic germ layers from pluripotent stem cells are already known, and any of these methods may be used.
  • pluripotent stem cells are cultured in a medium containing activin A, more preferably a medium containing activin A, a ROCK inhibitor, and a GSK3 ⁇ inhibitor to differentiate into embryonic germ layer cells.
  • the number of cells at the start of culturing is not particularly limited, and is 22,000 to 150,000 cells / cm 2 , preferably 22,000 to 100,000 cells / cm 2 , and more preferably 22,000 to 80,000 cells / cm 2 .
  • the culture period is 1 to 4 days, preferably 1 to 3 days, and particularly preferably 3 days.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C (for example, 37 ° C).
  • the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the medium used in this step RPMI 1640 medium, MEM medium, IMEM medium, DMEM / F12 medium, Improved MEM Zinc Option media, Improved MEM / 1% B- 27 / Penisilin Streptomycin medium, MCDB131 / 20mM Glucose / NaHCO 3 / Basic media used for culturing mammalian cells, such as FAF-BSA / ITS-X / GlutaMAX TM / ascorbic acid / Penisilin Streptomycin medium, can be used.
  • the concentration of activin A in the medium is usually 30 to 200 ng / mL, preferably 50 to 150 ng / mL, more preferably 70 to 120 ng / mL, and particularly preferably about 100 ng / mL.
  • activin A can be included in the medium in low doses, eg, in an amount of 5-100 ng / mL, preferably 5-50 ng / mL, more preferably 5-10 ng / mL.
  • the concentration of activin A in the medium is about 0.1-100 ng / mL, preferably about 1-50 ng / mL, more preferably about 3-10 ng / mL.
  • the concentration of the GSK3 ⁇ inhibitor in the medium is appropriately set depending on the type of GSK3 ⁇ inhibitor used.
  • the concentration is usually 2 to 5 ⁇ M, preferably 2 to 4 ⁇ M, particularly preferably about. It is 3 ⁇ M.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium is appropriately set depending on the type of ROCK inhibitor used.
  • the concentration is usually 5 to 20 ⁇ M, preferably 5 to 15 ⁇ M, particularly preferably about. It is 10 ⁇ M.
  • Insulin can be further added to the medium.
  • Insulin can be included in the medium in an amount of 0.01 to 20 ⁇ M, preferably 0.1 to 10 ⁇ M, more preferably 0.5 to 5 ⁇ M.
  • the concentration of insulin in the medium may be, but is not limited to, the concentration of insulin contained in the added B-27 supplement.
  • the cells are cultured in a medium containing activin A, a ROCK inhibitor, and a GSK3 ⁇ inhibitor for 1 day, and then cultured in a medium containing only activin A for another 2 days while changing the medium every day.
  • a medium containing activin A a ROCK inhibitor, and a GSK3 ⁇ inhibitor for 1 day
  • pluripotent stem cells are first cultured in medium containing 0.01-20 ⁇ M insulin, followed by a second culture in insulin-free medium. It can be manufactured by doing.
  • Step 2) Differentiation into proto-intestinal cells
  • the embryonic germ layer cells obtained in step 1) are further cultured in a medium containing a growth factor to induce differentiation into proto-intestinal cells.
  • the culture period is 2 to 8 days, preferably about 4 days.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C (for example, 37 ° C).
  • the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the basal medium used for culturing mammalian cells can be used as in step 1).
  • growth factors serum substitutes, vitamins, antibiotics and the like may be appropriately added to the medium.
  • EGF EGF
  • KGF EGF
  • FGF10 EGF
  • EGF and / or KGF are more preferable
  • KGF is further preferable.
  • the concentration of the growth factor in the medium is appropriately set depending on the type of growth factor used, but is usually about 0.1 nM to 1000 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to 100 ⁇ M. In the case of EGF, its concentration is about 5 to 2000 ng / mL (ie, about 0.8 to 320 nM), preferably about 5 to 1000 ng / mL (ie, about 0.8 to 160 nM), more preferably about 10 to. It is 1000 ng / mL (ie, about 1.6-160 nM).
  • FGF10 its concentration is about 5 to 2000 ng / mL (ie, about 0.3 to 116 nM), preferably about 10 to 1000 ng / mL (ie, about 0.6 to 58 nM).
  • concentration is usually 5 to 150 ng / mL, preferably 30 to 100 ng / mL, and particularly preferably about 50 ng / mL.
  • Step 3) Differentiation into posterior anterior intestinal cells
  • the protointestinal cells obtained in step 2) are further cultured in a medium containing growth factors, cyclopamine, nogin and the like to induce differentiation into posterior anterior enterocytes.
  • the culture period is 1 to 5 days, preferably about 2 days.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C (for example, 37 ° C).
  • the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the basal medium used for culturing mammalian cells can be used as in step 1).
  • growth factors serum substitutes, vitamins, antibiotics and the like may be appropriately added to the medium.
  • EGF EGF
  • KGF EGF
  • FGF10 EGF
  • EGF and / or KGF are more preferable
  • KGF is further preferable.
  • the concentration of the growth factor in the medium is appropriately set depending on the type of growth factor used, but is usually about 0.1 nM to 1000 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to 100 ⁇ M. In the case of EGF, its concentration is about 5 to 2000 ng / mL (ie, about 0.8 to 320 nM), preferably about 5 to 1000 ng / mL (ie, about 0.8 to 160 nM), more preferably about 10 to. It is 1000 ng / mL (ie, about 1.6-160 nM).
  • FGF10 its concentration is about 5 to 2000 ng / mL (ie, about 0.3 to 116 nM), preferably about 10 to 1000 ng / mL (ie, about 0.6 to 58 nM).
  • concentration is usually 5 to 150 ng / mL, preferably 30 to 100 ng / mL, and particularly preferably about 50 ng / mL.
  • the concentration of cyclopamine in the medium is not particularly limited, but is usually 0.5 to 1.5 ⁇ M, preferably 0.3 to 1.0 ⁇ M, and particularly preferably about 0.5 ⁇ M.
  • the concentration of nogin in the medium is not particularly limited, but is usually 10 to 200 ng / mL, preferably 50 to 150 ng / mL, and particularly preferably about 100 ng / mL.
  • Step 4) Differentiation into pancreatic progenitor cells
  • the posterior anterior intestinal cells obtained in step 3) further contain a medium containing a factor having CDK8 / 19 inhibitory activity, preferably a factor having CDK8 / 19 inhibitory activity and a growth factor. It is cultured in a medium to induce differentiation into pancreatic progenitor cells.
  • the culture period is 2 to 10 days, preferably about 5 days.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the posterior anterior intestinal cells obtained in step 3 are treated with 0.25% trypsin-EDTA according to the previously reported (Toyoda et al., Stem cell Research (2015) 14,185-197). And the cells are dispersed by pipetting, the obtained dispersion is centrifuged, the collected cells are resuspended in a small amount of new medium, and the cell suspension is reseeded in the new medium of step 4).
  • the basal medium used for culturing mammalian cells can be used as in step 1).
  • growth factors serum substitutes, vitamins, antibiotics and the like may be appropriately added to the medium.
  • the factor having the CDK8 / 19 inhibitory activity the above-mentioned various compounds or salts thereof can be used, and the amount to be added to the medium is appropriately determined depending on the compound used or the salt thereof, but is usually about 0.00001 ⁇ M. It is ⁇ 5 ⁇ M, preferably 0.00001 ⁇ M to 1 ⁇ M.
  • concentration of the factor having the CDK8 / 19 inhibitory activity in the medium a concentration that reaches 50% or more of the inhibitory activity with respect to CDK8 / 19 is preferable.
  • EGF EGF
  • KGF EGF
  • FGF10 EGF
  • KGF and / or EGF is more preferable
  • KGF and EGF are further preferable.
  • the concentration of the growth factor in the medium is appropriately set depending on the type of growth factor used, but is usually about 0.1 nM to 1000 ⁇ M, preferably about 0.1 nM to 100 ⁇ M. In the case of EGF, its concentration is about 5 to 2000 ng / mL (ie, about 0.8 to 320 nM), preferably about 5 to 1000 ng / mL (ie, about 0.8 to 160 nM), more preferably about 10 to. It is 1000 ng / mL (ie, about 1.6-160 nM).
  • FGF10 its concentration is about 5 to 2000 ng / mL (ie, about 0.3 to 116 nM), preferably about 10 to 1000 ng / mL (ie, about 0.6 to 58 nM).
  • concentrations of EGF are usually usually 5 to 150 ng / mL, preferably 30 to 100 ng / mL, particularly preferably about 50 ng / mL, and KGF is usually 10 to 200 ng / mL. It is preferably 50 to 150 ng / mL, particularly preferably about 100 ng / mL.
  • the first day of culturing in step 4) may be performed in the presence of a ROCK inhibitor, and thereafter, culturing may be performed in a medium containing no ROCK inhibitor.
  • the medium may contain a protein kinase C (PKC) activator.
  • PKC protein kinase C
  • PDBu PKC activator II
  • TPB PKC activator V
  • the concentration of the PKC activator is about 0.1-100 ng / mL, preferably about 1-50 ng / mL, more preferably about 3-10 ng / mL.
  • dimethyl sulfoxide and / or activin (1 to 50 ng / mL) may be added to the medium.
  • serum substitutes for example, B-27 supplement, ITS-G
  • amino acids, L-glutamine, GlutaMAX (product name), non-essential amino acids, vitamins, nicotine amides, antibiotics (for example, Antibiotic-Atimycotic (hereinafter, may be referred to as AA)), Penicillin, streptomycin, or mixtures thereof), antibacterial agents (eg, amphotericin B), antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts and the like may be added.
  • the concentration in the medium is usually 0.01 to 20% by weight, preferably 0.1 to 10% by weight.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • cell culture is performed by adhesive culture without using feeder cells.
  • a culture container such as a dish, a flask, a microplate, or a cell culture sheet such as OptiCell (product name) (Nunc) is used.
  • the culture vessel has surface treatment to improve adhesion (hydrophilicity) to cells, collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin, and matrigel (eg, BD matrigel (Japan)). It is preferably coated with a substrate for cell adhesion such as Becton Deckonson)) and Vitronectin.
  • a culture vessel coated with type I collagen, matrigel, fibronectin, vitronectin, poly-D-lysine or the like is preferable, and a culture vessel coated with matrigel or poly-D-lysine is more preferable.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C (for example, 37 ° C).
  • the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the pancreatic progenitor cells obtained in step 4) can be further purified by using a known surface marker such as glycoprotein 2 (GP2).
  • GP2 glycoprotein 2
  • the purification can be carried out by a method known per se, for example, beads on which an anti-GP2 antibody is immobilized.
  • Step 5) Differentiation into endocrine progenitor cells
  • the pancreatic progenitor cells obtained in step 4) are further cultured in a medium containing a growth factor to induce differentiation into endocrine progenitor cells.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture.
  • the pancreatic precursor cells obtained in step 4) are treated with 0.25% trypsin-EDTA, dispersed by pipetting, centrifuged, and centrifuged to 0.25% trypsin-EDTA. Disperse by treatment and pipetting, centrifuge the resulting dispersion, resuspend the recovered cells in a small amount of fresh medium, and resee the cell suspension in the new medium of step 5). ..
  • the culture period is 2 to 3 days, preferably about 2 days.
  • the basal medium used for culturing mammalian cells can be used as in step 1).
  • SANT1, retinoic acid, ALK5 inhibitor II, T3, and LDN were added to the medium, and Wnt inhibitor, ROCK inhibitor, and FGF (preferably FGF2) were added.
  • Wnt inhibitor, ROCK inhibitor, and FGF preferably FGF2
  • Serum substitutes, vitamins, antibiotics and the like may be added as appropriate.
  • Culturing is performed by non-adhesive culture without using feeder cells. During culturing, dishes, flasks, microplates, porous plates (Nunc), etc. or bioreactors are used.
  • the culture vessel is preferably surface-treated to reduce adhesion to cells.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C (for example, 37 ° C).
  • the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • Step 6) Differentiation into insulin-producing cells
  • the endocrine progenitor cells obtained in step 5) are further cultured in a medium containing a growth factor to induce differentiation into insulin-producing cells.
  • the culture period is 10 to 30 days, preferably about 10 to 20 days.
  • the basal medium used for culturing mammalian cells can be used as in step 1).
  • ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor XX, ⁇ -secretase inhibitor RO, N-cysteine, AXL inhibitor, ascorbic acid were added.
  • a Wnt inhibitor, a ROCK inhibitor, FGF (preferably FGF2), a serum substitute, vitamins, antibiotics and the like may be appropriately added.
  • ALK5 inhibitor II T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, and ascorbic acid may be added to the medium, or T3, ALK5 inhibitor II, ZnSO 4 , heparin, N-acetylcysteine, Trolox, and R428 may be added.
  • the culture may be performed by either two-dimensional culture or three-dimensional culture. Culture does not use feeder cells. In the case of 3D culture, non-adhesive culture is used. During culturing, dishes, flasks, microplates, porous plates (Nunc), etc. or bioreactors are used.
  • the culture vessel is preferably surface-treated to reduce adhesion to cells.
  • the culture temperature is not particularly limited, but is 30 to 40 ° C (for example, 37 ° C).
  • the carbon dioxide concentration in the culture vessel is, for example, about 5%.
  • the cells obtained in the above step can be induced to differentiate into pancreatic ⁇ cells.
  • the step of differentiating into a pancreatic ⁇ -cell population can be performed by transplanting an endocrine progenitor cell population or a cell population in a subsequent differentiation stage, preferably an insulin-producing cell population, into an animal body.
  • the "animal” is preferably a mammal, and examples thereof include humans, non-human primates, pigs, cows, horses, sheep, goats, llamas, dogs, cats, rabbits, mice, guinea pigs, etc., but humans are preferable. ..
  • Transplantation is preferably performed in an in vivo region where the cell population can be fixed at a fixed position. It can be performed under the coating.
  • the number of cells to be transplanted can vary depending on factors such as the stage of differentiation of the cells to be transplanted, the age, body weight, size of the transplant site, and the severity of the disease of the transplant target, and is not particularly limited. It can be about 10 ⁇ 10 4 cells to 10 ⁇ 10 11 cells.
  • the transplanted cell population can be induced to differentiate in the in vivo environment and differentiate into a target cell population, preferably a pancreatic ⁇ cell population, and then may be recovered or left in vivo as it is. May be good.
  • the cell population may be implanted and transplanted in a gel containing a biocompatible material, for example, a cell population embedded in a gel containing a biocompatible material may be encapsulated in a capsule, a bag, a chamber, or the like. It can also be encapsulated in the device of the above and transplanted in vivo.
  • epibedding means that a population of endocrine progenitor cells or a population of cells in the subsequent differentiation stage is interspersed and contained in a gel containing a biocompatible material.
  • biocompatible material refers to any material that does not induce a significant immune response or harmful biological reaction (eg, toxic reaction, blood clot, etc.) when transplanted into a living body and left in place for a short or long period of time. Means. Further, the "biocompatible material” is preferably a biodegradable material. Examples of such materials include polylactic acid (PLA), polycaprolactone (PCL), polyurethane (PU), polyethylene glycol (PEG), polyhydroxyethyl methacrylate, polyglycolic acid (PGA), and polylactic acid-co-glycolic acid (polylactic acid-co-glycolic acid).
  • PLA polylactic acid
  • PCL polycaprolactone
  • PU polyurethane
  • PEG polyethylene glycol
  • PGA polyhydroxyethyl methacrylate
  • PGA polyglycolic acid
  • polylactic acid-co-glycolic acid polylactic acid-co-glycolic acid
  • PLGA poly (3-hydroxybutyrate-co-hydroxyvariate)
  • PEVA poly (ethylene-co-vinyl acetate)
  • PEVA polyacrylamide, polyethylene oxide, polyethylene amine, polyhydroxybutyrate, poly (N-) Vinylpyrrolidone), polyvinyl alcohol, propylene polyfumarate, polyacrylic acid, polye-caprolactone, polymethacrylic acid, polyvinylidene difluoride (PVDF), pectic acid, hyaluronic acid, heparin sulfate, chondroitin sulfate, heparan sulfate proteoglycan, heparin , Chitin, chitosan, xanthane, carboxymethyl cellulose, carboxymethyl chitosan, alginate, alginate ester, collagen, cellulose, silk fibroin, keratin, gelatin, fibrin, purulan, laminin, gellan, silicon, urethane,
  • the surface of the "biocompatible material” is optionally surface-modified to allow cell adhesion (eg, cell adhesion substrates (collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin). , Matrigel, vitronectin, etc.) and functional groups known to control cell proliferation, differentiation and function (eg, amino group, carboxyl group, hydroxyl group, methacrylic acid group, acrylic acid group, etc.) May be modified.
  • cell adhesion substrates collagen, gelatin, poly-L-lysine, poly-D-lysine, laminin, fibronectin).
  • Matrigel vitronectin, etc.
  • functional groups known to control cell proliferation, differentiation and function eg, amino group, carboxyl group, hydroxyl group, methacrylic acid group, acrylic acid group, etc.
  • alginate or alginate ester can be preferably used as the "biocompatible material”.
  • Alginate may be a water-soluble salt, and metal salts, ammonium salts, etc. can be used.
  • metal salts, ammonium salts, etc. can be used.
  • sodium alginate, calcium alginate, ammonium alginate and the like can be preferably used.
  • Alginic acid ester (also called propylene glycol alginate) is a derivative in which propylene glycol is ester-bonded to the carboxyl group of alginic acid.
  • the ratio of mannuronic acid to gluronic acid (M / G ratio) contained in alginate is arbitrary, and in general, when M> G, a flexible gel can be formed, and M ⁇ When it is G, a strong gel can be formed.
  • those containing gluronic acid at a ratio of 10 to 90%, 20 to 80%, 30 to 70%, or 40 to 60% can be used.
  • the gel using alginate or alginate ester can be prepared according to a known method (WO2010 / 032242, WO2011 / 154941), and gelation is performed by adding a cross-linking agent to a solution of alginate or alginate ester. It can be obtained by letting it.
  • the alginate or alginate ester can be contained in the solvent in an amount of 0.05 to 10% by weight, preferably 0.1 to 5% by weight, and more preferably 0.5 to 3% by weight.
  • the solvent may be any solvent as long as it can dissolve alginate or alginate ester, and water, physiological saline or the like can be used.
  • the cross-linking agent may be any as long as it can gel a solution of alginate or alginate ester, and is not particularly limited, but a polyvalent metal cation can be used.
  • a polyvalent metal cation a divalent metal cation is preferable, and calcium ion, strontium ion, and barium ion are more preferable.
  • the cross-linking agent can be used in the form of a salt, and in the present invention, at least one selected from calcium chloride, strontium chloride, and barium chloride can be used as the cross-linking agent.
  • Nanofibers can be included in gels containing alginate or alginate ester.
  • Nanofibers are natural or synthetic fibers with diameters in the nanometer range. Examples of natural nanofibers include those containing one or more polysaccharides such as collagen, cellulose, silk fibroin, keratin, gelatin and chitosan.
  • Synthetic nanofibers include polylactic acid (PLA), polycaprolactone (PCL), polyurethane (PU), poly (lactide-co-glycolide) (PLGA), poly (3-hydroxybutyrate-co-hydroxyvariate) ( PHBV), poly (ethylene-co-vinyl acetate) (PEVA) and the like.
  • Nanofibers are less than 1% by weight in gels containing alginic acid, eg 0.9% by weight, 0.8% by weight, 0.7% by weight, 0.6% by weight, 0.5% by weight, or less. Can be included in quantity.
  • the lower limit of the amount of nanofibers contained in the gel containing alginate or alginate ester is not particularly limited, but may be 0.05% by weight or more, preferably 0.1% by weight or more.
  • Embedding the cell population in a gel containing an alginate or alginate ester can be performed by any means, and for example, the cell population is mixed in a solution of alginate or alginate ester, and the cell population is mixed in a solution of alginate or alginate ester. It can be done by gelling.
  • the cell population should be included in a solution of alginate or alginate in an amount selected from 1 ⁇ 10 4 cells to 1 ⁇ 10 9 cells / mL, preferably 1 ⁇ 10 7 cells to 1 ⁇ 10 8 cells / mL. Can be done.
  • Gelation of a solution of alginate or alginate ester containing a cell population can be performed by adding a cross-linking agent to the solution.
  • the amount of the cross-linking agent to be added can be selected from 0.1 to 5% by weight, for example, 0.1 to 1% by weight, based on the solution.
  • Gelation can be performed in a container having a predetermined configuration and / or shape used for cell culture or cell transplantation, or in a template designed to obtain a gel suitable for the container.
  • a gel capsule containing alginic acid may be formed according to a known method (WO2010 / 010902). That is, a solution of alginate or alginate ester containing a cell population may be added dropwise to the solution of the cross-linking agent.
  • the size of the droplet can be adjusted according to the shape of the nozzle and the method of dropping, and the size of the gel capsule containing alginic acid can be specified.
  • the dropping method is not particularly limited, but it can be carried out by a method such as an air spray method, an airless spray method, or an electrostatic spray method.
  • the size of the gel capsule containing alginic acid is not particularly limited, but the diameter can be 5 mm or less, 1 mm or less, and 500 ⁇ m or less.
  • the cross-linking agent solution can contain an amount of cross-linking agent selected from 0.1 to 10% by weight, for example 0.1 to 5% by weight.
  • the "PLK inhibitor” is a substance having an inhibitory activity against Polo-like kinase (PLK).
  • PLK is a family of eukaryotic-conserved serine-threonine kinases, kinases responsible for the progression of the M phase of the cell cycle, and four known are PLK1, PLK2, PLK3, and PLK4.
  • the PLK inhibitor used in the present invention may be an inhibitor for any of PLK1, PLK2, PLK3, and PLK4 as long as it can suppress the proliferation of CHGA-negative cells, and the inhibitor for each PLK is another PLK. It may be an inhibitor against.
  • the PLK inhibitor used in the present invention may be a substance having other activities (inhibitory activity, etc.) in addition to the PLK inhibitory activity, as long as it can suppress the proliferation of CHGA-negative cells.
  • the "PLK inhibitor" in the present invention is an inhibitor having an inhibitory activity against PLK1 or PLK4, and preferably an inhibitor having more selectivity for PLK1 or PLK4.
  • the method for determining the PLK inhibitory activity may be selected from known methods, and examples thereof include a determination method using Serine / Threonine Kinase Assay Kits (MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.).
  • Serine / Threonine Kinase Assay Kits MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD.
  • conventionally known "PLK inhibitors” can be used and can be found in patented or non-patented documents.
  • Examples of the PLK inhibitor that can be used in the present invention include (R) -5-(6-((4-methylpiperazin-1-yl) methyl) -1H-benzo [d] imidazole-1-yl) -3-. (1- (2- (Trifluoromethyl) phenyl) ethoxy) thiophen-2-carboxamide (CAS No. 92995-18-1) (In the present specification, when the compound is described as "CAS92995-18-1".
  • Phenyl] thio] -5-methoxy-N- (5-methyl-1H-pyrazol-3-yl) -6- (4-morpholinyl) -4-pyrimidinamine (CAS No. 1798871-30-3)
  • 2- [[2-Fluoro-4-[[(2-fluoro-3-nitrophenyl) methyl] sulfonyl] phenyl] thio] -5-methoxy-N- (5-methyl-1H-pyrazol-3-yl) -6 -(1-Piperidinyl) -4-pyrimidineamine (CAS No. 1798871-31-4), 7-nitro-5- (trifluoromethyl) -2-benzothiazolecarboxamide-3-oxide (CAS No.
  • the 50% inhibitory concentration (IC50) with respect to PLK1 or PLK4 is preferably 1 ⁇ M or less, preferably 100 nM or less, more preferably 50 nM or less, still more preferably 10 nM or less, particularly preferably. May have one or more substituents, and some partial structures (substituents, rings, etc.) may be converted, as long as is 5 nM or less, particularly preferably 3 nM or less.
  • the PLK inhibitor in the present invention is (R) -5-(6-((4-methylpiperazin-1-yl) methyl) -1H-benzo [d] imidazole-, which can be used as a PLK1 inhibitor.
  • the PLK inhibitor is not limited to the compounds shown above, and antisense oligonucleotides against PLK mRNA, siRNA, antibodies that bind to PLK, dominant negative PLK mutants, and the like can also be used as PLK inhibitors. , Commercially available or can be synthesized according to known methods.
  • the PLK inhibitor the above-mentioned various compounds or salts thereof can be used, and the amount to be added to the medium is appropriately determined depending on the compound used or the salt thereof, but is usually about 0.00001 ⁇ M to 100 ⁇ M, preferably about 0.00001 ⁇ M to 100 ⁇ M. It is 0.01 ⁇ M to 10 ⁇ M, more preferably 0.1 ⁇ M to 5 ⁇ M, and particularly preferably 0.1 ⁇ M to 3 ⁇ M.
  • pancreatic progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells, preferably an endocrine progenitor cell population, more preferably an insulin-producing cell population, or a cell population in a subsequent differentiation stage with a PLK inhibitor
  • the cell population can be contacted with a PLK inhibitor.
  • a PLK inhibitor can be included in the medium in any amount capable of inhibiting PLK activity, eg, in an amount of 10 ⁇ M or less, or 5 ⁇ M or less, preferably 4 ⁇ M or less, more preferably 3 ⁇ M or less.
  • the lower limit of the amount of the PLK inhibitor added is not particularly limited, but can be 0.1 ⁇ M or more, preferably 0.5 ⁇ M or more.
  • the amount of the PLK inhibitor added is 10 ⁇ M or less and 0.1 ⁇ M or more, preferably 5 ⁇ M or less and 0.5 ⁇ M or more, and particularly preferably 3 ⁇ M or less and 0.5 ⁇ M or more. Culturing in the presence of a PLK inhibitor can be carried out for at least 12 hours, preferably 24 hours or more, 2 days or more, 4 days or more, 8 days or more, 10 days or more, or 15 days or more.
  • Culturing in the presence of a PLK inhibitor is preferably carried out for 4 days or longer.
  • the medium can be exchanged during the treatment period with the PLK inhibitor, and can be exchanged with a medium having the same composition as before the exchange to which the PLK inhibitor was added or a medium having a different composition according to the culture schedule.
  • a pancreatic progenitor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells, preferably an endocrine progenitor cell population, more preferably an insulin-producing cell population, or a cell population in a subsequent differentiation stage is treated with a PLK inhibitor.
  • it can be subjected to a step of further differentiating into a target cell population.
  • "while treating with a PLK inhibitor” means a step of simultaneously performing a step of treating with a PLK inhibitor and a step of differentiating, a step of treating with a PLK inhibitor and then subjecting to a step of differentiating, and a step of differentiating.
  • the medium used for treatment with the PLK inhibitor and the medium used for differentiating the cell population may be separate, or even if the PLK inhibitor is further added to the medium used for the differentiation step. Good.
  • This method can reduce or suppress the remaining number of proliferative cells contained in the pancreatic genealogy, instead of suppressing the growth of teratoma.
  • This method does not suppress the proliferation of iPS cells (for example, it is not necessary to reduce the number of alkaline phosphatase-positive cells), but can reduce or suppress the remaining number of proliferative cells contained in the pancreatic lineage. ..
  • treatment with a PLK inhibitor can reduce the absolute number of CHGA-negative cells, especially CHGA-negative and Ki67-positive cells, in the endocrine progenitor cell population or the cell population in the subsequent differentiation stage. It is possible. As a result, CHGA-negative cells, particularly CHGA-negative and Ki67-positive cells, can be depleted in the obtained cell population.
  • the proportion of CHGA-negative cells in the obtained cell population is 40% or less, 30% or less, 20% or less, 15% or less, or 10% or less, preferably 20% or less, 15% or less, or 10 % Or less, for example, 9% or less, 8% or less, 7% or less, 6% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less, or 1% or less.
  • the lower limit of the ratio is not particularly limited, but is, for example, 0% or more, 0.1% or more, or 0.5% or more.
  • the ratio can be expressed using two numerical values selected from the upper and lower limit values, respectively.
  • the ratio is 0.1% to 40%, 0.1% to 30%, and 0.1%. -20%, 0.1% -15%, or 0.1% -10%, preferably 0.1% -20%, 0.1% -15%, or 0.1% -10%. Is.
  • the ratio is 0.5% to 40%, 0.5% to 30%, 0.5% to 20%, 0.5% to 15%, or 0.5% to 10%, preferably 0.5% to 10%. , 0.5% to 20%, 0.5% to 15%, or 0.5% to 10%.
  • the proportion of CHGA-negative and Ki67-positive cells in the obtained cell population was 8% or less, 7% or less, 6% or less, 5% or less, 4% or less, 3% or less, 2% or less, 1% or less, Or 0.5% or less, preferably 3% or less, 2% or less, 1% or less, or 0.5% or less.
  • the lower limit of the ratio is not particularly limited, but is, for example, 0% or more, or 0.1% or more.
  • the ratio can be expressed using two numerical values selected from the upper and lower limit values, respectively. For example, the ratio is 0.1% to 8%, 0.1% to 7%, and 0.1%.
  • ⁇ 6% 0.1% ⁇ 5%, 0.1% ⁇ 4%, 0.1% ⁇ 3%, 0.1% ⁇ 2%, 0.1% ⁇ 1%, or 0.1% ⁇ It is 0.5%, preferably 0.1% to 3%, 0.1% to 2%, 0.1% to 1%, or 0.1% to 0.5%.
  • a pancreatic precursor cell population obtained by inducing differentiation from pluripotent stem cells treated with a PLK inhibitor, preferably an endocrine precursor cell population, more preferably an insulin-producing cell population, or later.
  • a PLK inhibitor preferably an endocrine precursor cell population, more preferably an insulin-producing cell population, or later.
  • the proportion of insulin-producing cells or pancreatic ⁇ -cells in the obtained cell population is 40% or more, 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, or 90% or more.
  • the upper limit of the ratio is not particularly limited, but is 100% or less, 99% or less, 98% or less, 97% or less, 96% or less, or 95% or less.
  • the ratio can be expressed using two numerical values selected from the upper and lower limit values, for example, the ratio is 40% to 95%, 50% to 95%, 60% to 95%, 70%. It is ⁇ 95%, 80% ⁇ 95%, or 90% ⁇ 95%.
  • the proportion of insulin-positive and NKX6.1-positive cells is 14% or more, preferably 15% or more, more preferably 20% or more, still more preferably 25% or more, for example, 30% or more, 35% or more, 40% or more. , Or 45% or more.
  • the upper limit of the ratio is not particularly limited, but is 50% or less.
  • the ratio can be expressed using two numerical values selected from the upper and lower limit values, for example, the ratio is 14% to 50%, preferably 15% to 50%, and more preferably 20% to 20%. It is 50%, more preferably 25% to 50%.
  • the insulin-producing cells or pancreatic ⁇ cells obtained by this method are transplanted into an animal living body and differentiated in the animal living body, they can be left as they are and used as insulin-secreting cells. According to the insulin-producing cells or pancreatic ⁇ cells obtained by this method, it is possible to avoid the proliferation of CHGA-negative cells, particularly CHGA-negative and Ki67-positive cells, and achieve safe and long-term engraftment of transplanted cells.
  • an insulin-producing cell population or a pancreatic ⁇ -cell population (cell population of the present invention) from which CHGA-negative cells, particularly CHGA-negative and Ki67-positive cells having high proliferative potential, have been removed, is transplanted to the affected area as it is or encapsulated. Therefore, it is useful as a cell medicine for treating diabetes, especially type I diabetes.
  • the cell population of the present invention may be a prodrug.
  • prodrug refers to a cell population that differentiates after being transplanted into a living body and changes into cells having a function of treating a disease.
  • the cell population of the present invention has low toxicity (eg, acute toxicity, chronic toxicity, genetic toxicity, reproductive toxicity, cardiotoxicity, carcinogenicity), and is pharmaceutical as it is or mixed with a pharmacologically acceptable carrier or the like.
  • the composition can be safely administered to mammals (eg, mice, rats, hamsters, rabbits, cats, dogs, cows, sheep, monkeys, humans).
  • Example 1 Decrease in non-target cells (CHGA-negative cells) and increase in target cells (insulin-positive and NKX6.1-positive cells) in the cell population obtained by treating an insulin-producing cell population with a PLK inhibitor (1) 1.
  • Method 1 Differentiation-inducing medium (Improved MEM / 1%) containing differentiation factors (ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, ascorbic acid) in the endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from iPS cells. B-27 / Penisilin Streptomycin medium) was cultured for 7 days to induce differentiation into an insulin-producing cell population.
  • a PLK1 inhibitor (CAS92995-18) was added to a differentiation-inducing medium (Improved MEM / 1% B-27 / Penicillin Streptomycin medium) containing a differentiation factor (ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, ascorbic acid).
  • ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, ascorbic acid a differentiation factor
  • -1, 3 ⁇ M or PLK4 inhibitor (CAS1338800-06-8, 3 ⁇ M) was added and cultured for 4 days.
  • the endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from iPS cells contains differentiation factors (ALK5 inhibitor II, T3, LDN, ⁇ -secretase inhibitor RO, ascorbic acid) and is a PLK1 inhibitor (CAS92995-18-).
  • the number of insulin-positive and NKX6.1-positive cells in the cell population obtained by each of the above methods 1) and 2) was counted by flow cytometry, and the target cells in each method, that is, insulin-positive and NKX6.1-positive.
  • the cell rate was determined.
  • the target cells insulin positive and NKX6.1 in the cell population are treated. It was confirmed that the rate of positive cells) increased reproducibly and remarkably with the decrease of non-target cells as compared with the control.
  • Example 2 Decrease in non-target cells (CHGA-negative cells) and increase in target cells (insulin-positive and NKX6.1-positive cells) in the cell population obtained by treating the insulin-producing cell population with a PLK inhibitor (2) 1.
  • Method The above Example 1 except that the endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from iPS cells was treated with a 30 mL culture reactor and the insulin-producing cell population was treated with a PLK inhibitor for 7 days. Culturing was carried out in the same manner as in the above method.
  • the endocrine progenitor cell population obtained by inducing differentiation from iPS cells was cultured in a differentiation-inducing medium for 4 days in a 30 mL culture reactor to induce differentiation into an insulin-producing cell population. Then, the cells were cultured for 7 days in a differentiation-inducing medium supplemented with a PLK1 inhibitor (CAS92995-18-1, 3 ⁇ M) or a PLK4 inhibitor (CAS1338800-06-8, 3 ⁇ M).
  • a PLK1 inhibitor CAS92995-18-1, 3 ⁇ M
  • a PLK4 inhibitor CAS1338800-06-8, 3 ⁇ M
  • the CHGA-negative cell rate of Ki67-positive and Ki67-negative cells was increased by treatment with a PLK1 inhibitor or PLK4 inhibitor in the step of inducing differentiation into insulin-producing cells. It was confirmed that all of them were reproducibly and remarkably decreased as compared with the control, and the insulin-positive (and NKX6.1-positive) cell rate was more reproducible as compared with the control as the number of non-target cells decreased. It was confirmed that it increased remarkably.
  • the treatment period using the PLK1 inhibitor or PLK4 inhibitor was lengthened as compared with Example 1, but no effect was observed, and treatment with the PLK1 inhibitor or PLK4 inhibitor was at least for insulin-producing cell production. It was confirmed that this should be done for cell populations in the final differentiation stage of the process.
  • Example 3 Single-cell RNA-seq expression analysis of insulin-producing cell population Induced differentiation from pluripotent stem cells according to previously reported (Stem Cell Research (2015) 14, 185-197), steps 1) -6) above.
  • the PLK gene was highly expressed in CHGA-negative cells, which are non-target cells. From this, when an inhibitor targeting PLK was used to reduce / suppress the proliferation of non-target cells, a remarkable effect was observed as described above.

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Abstract

本発明は、分化誘導したインスリン分泌細胞と共存する非内分泌性の目的外細胞を除去する手法を提供することを目的とする。本発明は、多能性幹細胞より分化誘導されたインスリン産生細胞集団をPLK阻害剤で処理する工程を含む、インスリン産生細胞集団の製造方法に関する。

Description

増殖抑制剤
 本発明は、多能性幹細胞から分化誘導して得られたインスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団中に存在する非内分泌性の目的外細胞を除去する方法に関する。
 [発明の背景]
 iPS細胞やES細胞などの多能性幹細胞から、インスリン産生細胞や膵β細胞といったインスリン分泌細胞を分化誘導し、糖尿病の治療に応用する研究が進められている。
 これまでに、多能性幹細胞からインスリン分泌細胞集団へと分化誘導するために様々な手法が、開発・報告されている(非特許文献1)。しかしながら、分化誘導して得られるインスリン分泌細胞集団には、目的とするインスリン分泌細胞と共に、非内分泌性の細胞も含まれており、糖尿病治療への利用を進める上で、目的とするインスリン分泌細胞をより効率的に取得する手法が切望されていた。
Stem Cell Research(2015)14、185-197
 本発明者らは、多能性幹細胞からインスリン産生細胞又は膵β細胞へと分化誘導した細胞集団中に、これらインスリン分泌細胞(インスリン産生細胞や膵β細胞)とは別に、クロモグラニンA(以下、「CHGA」と記載)陰性によって特徴付けられる非内分泌性の細胞(以下、「CHGA陰性細胞」と記載する場合がある)が存在することを見出した。また、CHGA陰性細胞には、Ki67マーカー陽性によって特徴付けられる増殖性の高い細胞(CHGA陰性かつKi67陽性細胞)が含まれることを見出した。
 分化誘導したインスリン分泌細胞を糖尿病の治療等に応用しようとした場合、インスリン分泌細胞以外の細胞を厳密に制御することは、安全性の観点から極めて重要である。また、高い増殖性を有する細胞の混入・残存は、レシピエントへの悪影響や移植されたインスリン分泌細胞の長期の生着に影響を及ぼす虞があり、好ましくない。
 そこで本発明は、分化誘導したインスリン分泌細胞と共存するCHGA陰性細胞を除去する手法を提供することを目的とする。
 本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、好ましくは内分泌前駆細胞集団、より好ましくはインスリン産生細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をPLK阻害剤で処理することによって、CHGA陰性細胞の増殖を抑制することができ、それら細胞の含有量が低減された膵前駆細胞集団、内分泌前駆細胞集団、インスリン産生細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を得ることが可能であることを見出した。
 本発明は、これらの新規知見に基づくものであり、以下の発明を包含する。
[1] 多能性幹細胞より分化誘導されたインスリン産生細胞集団をPLK阻害剤で処理する工程を含む、インスリン産生細胞集団の製造方法。
[1-1] 多能性幹細胞より分化誘導された内分泌前駆細胞集団をPLK阻害剤で処理する工程を含む、インスリン産生細胞集団の製造方法。
[1-2] 多能性幹細胞より分化誘導された膵前駆細胞集団をPLK阻害剤で処理する工程を含む、インスリン産生細胞集団の製造方法。
[2] 製造された細胞集団が、CHGA陰性細胞を20%以下の割合で含む、[1]~[1-2]のいずれかの製造方法。
[3] 製造された細胞集団が、CHGA陰性かつKi67陽性の細胞を3%以下の割合で含む、[1]~[2]のいずれかの製造方法。
[4] 製造された細胞集団が、インスリン陽性かつNKX6.1陽性の細胞を15%以上の割合で含む、[1]~[3]のいずれかの製造方法。
[5] さらに、PLK阻害剤で処理した細胞集団を分化させる工程を含む、[1]~[4]のいずれかの製造方法。
[6] 3μM以下のPLK阻害剤で処理する、[1]~[5]のいずれかの製造方法。
[7] 多能性幹細胞より分化誘導されたインスリン産生細胞集団中に存在するCHGA陰性細胞の増殖を抑制する方法であって、
 該細胞集団をPLK阻害剤で処理することを含む、方法。
[7-1] 多能性幹細胞より分化誘導された内分泌前駆細胞集団中に存在するCHGA陰性細胞の増殖を抑制する方法であって、
 該細胞集団をPLK阻害剤で処理することを含む、方法。
[7-2] 多能性幹細胞より分化誘導された膵前駆細胞集団中に存在するCHGA陰性細胞の増殖を抑制する方法であって、
 該細胞集団をPLK阻害剤で処理することを含む、方法。
[8] インスリン産生細胞集団を3μM以下のPLK阻害剤で処理する、[7]の方法。
[9] インスリン産生細胞集団中に存在するCHGA陰性細胞を20%以下の割合に減少させる、[7]又は[8]の方法。
[10] 多能性幹細胞より分化誘導された細胞集団中に存在するCHGA陰性かつKi67陽性の細胞を3%以下の割合に減少させる、[7]~[9]のいずれかの方法。
[11] 多能性幹細胞より分化誘導された細胞集団中に存在するインスリン陽性かつNKX6.1陽性の細胞を15%以上の割合に増大させる、[7]~[10]のいずれかの方法。
[12] CHGA陰性細胞を20%以下の割合で含む、PLK阻害剤で処理した、多能性幹細胞より分化誘導されたインスリン産生細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
[13] CHGA陰性かつKi67陽性の細胞を3%以下の割合で含む、[12]の細胞集団。
[14] インスリン陽性かつNKX6.1陽性の細胞を15%以上の割合で含む、[12]又は[13]の細胞集団。
[15] 移植用に使用される、[12]~[14]のいずれかの細胞集団。
[16] [12]~[15]のいずれかの細胞集団を含む糖尿病を治療するための医薬。
[17] PLK阻害剤で処理した、多能性幹細胞より分化誘導されたインスリン産生細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を移植する工程を含む、糖尿病を治療又は予防するための方法。
[18] PLK阻害剤がPLK1阻害剤又はPLK4阻害剤である、[1]~[6]のいずれかの製造方法。
[19] PLK4阻害剤が、PLK4の50%阻害濃度(IC50)が5nM未満の物質である、[1]~[6]のいずれかの製造方法。
[20] PLK4阻害剤が、(1S,2R)-2-[3-[(1E)-2-[4-[[(2R,6S)-2,6-ジメチル-4-モルホリニル]メチル]フェニル]エテニル]-1H-インダゾール-6-イル]-5’-メトキシ-スピロ[シクロプロパン-1,3’-[3H]インドール]-2’(1’H)-オン(CAS No.1338800-06-8)又はその塩である、[1]~[6]のいずれかの製造方法。
[21] PLK1阻害剤が、PLK1の50%阻害濃度(IC50)が5nM未満の物質である、[1]~[6]のいずれかの製造方法。
[22] PLK1阻害剤が、(R)-5-(6-((4-メチルピペラジン-1-イル)メチル)-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)-3-(1-(2-(トリフルオロメチル)フェニル)エトキシ)チオフェン-2-カルボキサミド(CAS No.929095-18-1)又はそれらの塩である、[1]~[6]のいずれかの製造方法。
[23] PLK阻害剤がPLK1阻害剤又はPLK4阻害剤である、[7]~[11]のいずれかの方法。
[24] PLK4阻害剤が、PLK4の50%阻害濃度(IC50)が5nM未満の物質である、[7]~[11]のいずれかの方法。
[25] PLK4阻害剤が、(1S,2R)-2-[3-[(1E)-2-[4-[[(2R,6S)-2,6-ジメチル-4-モルホリニル]メチル]フェニル]エテニル]-1H-インダゾール-6-イル]-5’-メトキシ-スピロ[シクロプロパン-1,3’-[3H]インドール]-2’(1’H)-オン(CAS No.1338800-06-8)又はその塩である、[7]~[11]のいずれかの方法。
[26] PLK1阻害剤が、PLK1の50%阻害濃度(IC50)が5nM未満の物質である、[7]~[11]のいずれかの方法。
[27] PLK1阻害剤が、(R)-5-(6-((4-メチルピペラジン-1-イル)メチル)-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)-3-(1-(2-(トリフルオロメチル)フェニル)エトキシ)チオフェン-2-カルボキサミド(CAS No.929095-18-1)又はそれらの塩である、[7]~[11]のいずれかの方法。
[28] PLK阻害剤がPLK1阻害剤又はPLK4阻害剤である、[12]~[15]のいずれかの細胞集団。
[29] [28]の細胞集団を含む糖尿病を治療するための医薬。
[30] PLK阻害剤がPLK1阻害剤又はPLK4阻害剤である、[17]の方法。
[31] PLK阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程が、動物に移植することにより行われる、[5]の方法。
[32] 前記細胞集団中に存在するCHGA陰性細胞の絶対数を減少させる、[7]~[11]のいずれかの方法。
[33] 前記細胞集団中に存在するCHGA陰性細胞でない細胞の数を減少させない、[7]~[11]のいずれかの方法。
[34] CHGA陰性かつKi67陽性の細胞を2%以下の割合で含む、[12]~[14]のいずれかの細胞集団。
[35] CHGA陰性かつKi67陽性の細胞を1%以下の割合で含む、[12]~[14]のいずれかの細胞集団。
[36] [12]~[14]、[34]及び[35]のいずれかの細胞集団を含むプロドラッグ。
[37] インスリン産生細胞集団または膵β細胞集団の製造方法であって、
(1)インスリン産生細胞集団または膵β細胞集団をPLK阻害剤で処理する工程、ならびに(2)生体適合性材料を含むゲル中にインスリン産生細胞集団を包埋する工程、
を含む方法。
[38] インスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団の製造方法であって、
(0)標的細胞集団を純化する方法により、標的細胞集団の純度を少なくとも70%以上にする工程、
(1)インスリン産生細胞集団または膵β細胞集団をPLK阻害剤で処理する工程、および
(2)PLK阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程、
を含む方法。
[39] PLK4阻害剤が、PLK4の50%阻害濃度(IC50)が5nM未満の物質である、[30]の方法。
[40] PLK4阻害剤が、(1S,2R)-2-[3-[(1E)-2-[4-[[(2R,6S)-2,6-ジメチル-4-モルホリニル]メチル]フェニル]エテニル]-1H-インダゾール-6-イル]-5’-メトキシ-スピロ[シクロプロパン-1,3’-[H]インドール]-2’(1’H)-オン(CAS No.1338800-06-8)又はその塩である、[30]の方法。
[41] PLK1阻害剤が、PLK1の50%阻害濃度(IC50)が5nM未満の物質である、[30]の方法。
[42] PLK1阻害剤が、(R)-5-(6-((4-メチルピペラジン-1-イル)メチル)-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)-3-(1-(2-(トリフルオロメチル)フェニル)エトキシ)チオフェン-2-カルボキサミド(CAS No.929095-18-1)又はそれらの塩である、[30]の方法。
[43] 前記細胞集団がCHGA陰性細胞を20%以下の割合で含む、[17]、[30]及び[39]~[42]のいずれかの方法。
[44] 前記細胞集団が、CHGA陰性かつKi67陽性の細胞を3%以下の割合で含む、[17]、[30]及び[39]~[42]のいずれかの方法。
[45] 前記細胞集団が、インスリン陽性かつNKX6.1陽性の細胞を15%以上の割合で含む、[17]、[30]及び[39]~[42]のいずれかの方法。
[46] 糖尿病を治療又は予防するための方法において使用するための、PLK阻害剤で処理した、多能性幹細胞より分化誘導されたインスリン産生細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
[47] PLK阻害剤がPLK1阻害剤又はPLK4阻害剤である、[46]の細胞集団。
[48] PLK4阻害剤が、PLK4の50%阻害濃度(IC50)が5nM未満の物質である、[47]の細胞集団。
[49] PLK4阻害剤が、(1S,2R)-2-[3-[(1E)-2-[4-[[(2R,6S)-2,6-ジメチル-4-モルホリニル]メチル]フェニル]エテニル]-1H-インダゾール-6-イル]-5’-メトキシ-スピロ[シクロプロパン-1,3’-[H]インドール]-2’(1’H)-オン(CAS No.1338800-06-8)又はその塩である、[47]の細胞集団。
[50] PLK1阻害剤が、PLK1の50%阻害濃度(IC50)が5nM未満の物質である、[47]の細胞集団。
[51] PLK1阻害剤が、(R)-5-(6-((4-メチルピペラジン-1-イル)メチル)-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)-3-(1-(2-(トリフルオロメチル)フェニル)エトキシ)チオフェン-2-カルボキサミド(CAS No.929095-18-1)又はそれらの塩である、[47]の細胞集団。
[52] CHGA陰性細胞を20%以下の割合で含む、[46]~[51]のいずれかの細胞集団。
[53] CHGA陰性かつKi67陽性の細胞を3%以下の割合で含む、[46]~[51]のいずれかの細胞集団。
[54] CHGA陰性かつKi67陽性の細胞を2%以下の割合で含む、[46]~[51]のいずれかの細胞集団。
[55] CHGA陰性かつKi67陽性の細胞を1%以下の割合で含む、[46]~[51]のいずれかの細胞集団。
[56] インスリン陽性かつNKX6.1陽性の細胞を15%以上の割合で含む、[46]~[51]のいずれかの細胞集団。
[57] 糖尿病を治療又は予防するための医薬の製造における、PLK阻害剤で処理した、多能性幹細胞より分化誘導されたインスリン産生細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の使用。
[58] PLK阻害剤がPLK1阻害剤又はPLK4阻害剤である、[57]の使用。
[59] PLK4阻害剤が、PLK4の50%阻害濃度(IC50)が5nM未満の物質である、[58]の使用。
[60] PLK4阻害剤が、(1S,2R)-2-[3-[(1E)-2-[4-[[(2R,6S)-2,6-ジメチル-4-モルホリニル]メチル]フェニル]エテニル]-1H-インダゾール-6-イル]-5’-メトキシ-スピロ[シクロプロパン-1,3’-[H]インドール]-2’(1’H)-オン(CAS No.1338800-06-8)又はその塩である、[58]の使用。
[61] PLK1阻害剤が、PLK1の50%阻害濃度(IC50)が5nM未満の物質である、[58]の使用。
[62] PLK1阻害剤が、(R)-5-(6-((4-メチルピペラジン-1-イル)メチル)-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)-3-(1-(2-(トリフルオロメチル)フェニル)エトキシ)チオフェン-2-カルボキサミド(CAS No.929095-18-1)又はそれらの塩である、[58]の使用。
[63] 前記細胞集団が、CHGA陰性細胞を20%以下の割合で含む、[57]~[62]のいずれかの使用。
[64] 前記細胞集団が、CHGA陰性かつKi67陽性の細胞を3%以下の割合で含む、[57]~[62]のいずれかの使用。
[65] 前記細胞集団が、CHGA陰性かつKi67陽性の細胞を2%以下の割合で含む、[57]~[62]のいずれかの使用。
[66] 前記細胞集団が、CHGA陰性かつKi67陽性の細胞を1%以下の割合で含む、[57]~[62]のいずれかの使用。
[67] インスリン陽性かつNKX6.1陽性の細胞を15%以上の割合で含む、[57]~[62]のいずれかの使用。
 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2019-191876号の明細書および/または図面に記載される内容を包含する。
 本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。
 本発明によれば、分化誘導したインスリン産生細胞と共存するCHGA陰性細胞を除去する手法を提供することができる。
1.用語
 以下、本明細書において記載される用語について説明する。
 本明細書において、「約」とは、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ25%、20%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%又は1%まで変動する値を示す。好ましくは、「約」又は「およそ」という用語は、基準値に対してプラス又はマイナスそれぞれ15%、10%、5%、又は1%の範囲を示す。
 本明細書において、「~を含む(comprise(s)又はcomprising)」とは、その語句に続く要素の包含を示すがこれに限定されないことを意味する。したがって、その語句に続く要素の包含は示唆するが、他の任意の要素の除外は示唆しない。
 本明細書において、「~からなる(consist(s) of又はconsisting of)」とは、その語句に続くあらゆる要素を包含し、かつ、これに限定されることを意味する。したがって、「~からなる」という語句は、列挙された要素が要求されるか又は必須であり、他の要素は実質的に存在しないことを示す。
 本明細書において、「フィーダー細胞を使用」しないとは、基本的にフィーダー細胞を含まないこと、フィーダー細胞を培養することによってプレコンディショニングした培地などを使用しないことを意味する。したがって、培地中にはフィーダー細胞から分泌される成長因子及びサイトカインなどの物質は含まれない。
 なお、「フィーダー細胞」又は「フィーダー」とは、別な種類の細胞と共培養され、その細胞を支持し、成長することができる環境をもたらす細胞を意味する。フィーダー細胞は、それらが支持する細胞とは同じ種由来であっても、異なる種由来であってもよい。例えば、ヒト細胞のフィーダーとして、ヒト皮膚線維芽細胞又はヒト胚性幹細胞を使用してもよいし、マウス胚線維芽細胞の初代培養物、及び不死化マウス胚線維芽細胞を使用してもよい。フィーダー細胞は、放射線照射又はマイトマイシンC処理などによって不活性化することができる。
 本明細書において、「接着」とは、細胞が容器に付着していること、例えば、細胞が適切な培地の存在下で滅菌プラスチック(又はコーティングされたプラスチック)の細胞培養ディッシュ又はフラスコに付着していることを指す。細胞のなかには、細胞培養容器に接着させなければ培養物中で維持できない、あるいは成長しないものもある。これに対し、非接着性細胞は、容器に接着させることなく培養物中で維持され、増殖できる。
 本明細書において、「培養」とは、細胞をインビトロ環境において維持し、成長させ、かつ/又は分化させることを指す。「培養する」とは、組織又は体外で、例えば、細胞培養ディッシュ又はフラスコ中で細胞を持続させ、増殖させ、かつ/又は分化させることを意味する。培養には2次元培養(平面培養)や、3次元培養(浮遊培養)が含まれる。
 本明細書において、「富化する(enrich)」及び「富化すること(enrichment)」とは、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を増加させることを指し、「富化された(enriched)」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、富化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して増加している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して富化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、富化される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について富化することもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって富化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を富化する方法により、細胞集団が標的細胞集団に関して少なくとも20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%富化される。
 本明細書において、「枯渇する(deplete)」及び「枯渇すること(depletion)」とは、細胞の組成物などの組成物中の特定の構成成分の量を減少させることを指し、「枯渇された(depleted)」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、特定の構成成分の量が、枯渇される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して枯渇させることができ、したがって、標的細胞型の割合は、枯渇される前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して減少する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について枯渇させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって枯渇させることもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を枯渇させる方法により、細胞集団は標的細胞集団に関して少なくとも50%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%減少(枯渇)している。
 本明細書において、「純化する(purify)」及び「純化すること(purification)」とは、細胞の組成物などの組成物中の不純物を取り除き、特定の構成成分について純粋なものにすることを指し、「純化された(purified)」とは、細胞の組成物、例えば、細胞集団を説明するために使用される場合、不純物の量が、純化される前の細胞集団におけるそのような構成成分の割合と比較して減少し、特定の構成成分の純度が向上している細胞集団を指す。例えば、細胞集団などの組成物を、標的細胞型に関して純化することができ、したがって、標的細胞型の割合は、純化する前の細胞集団内に存在する標的細胞の割合と比較して増加する。細胞集団は、当技術分野で公知の細胞選択及び選別方法によって、標的細胞型について純化させることもできる。細胞集団は、本明細書に記載した特定の選別又は選択プロセスによって純化することもできる。本発明の特定の実施形態では、標的細胞集団を純化する方法により、標的細胞集団の純度は、少なくとも70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%又は99%になるか、不純物(夾雑細胞を含む)は検出できない程度になりうる。
 本明細書において、「細胞の数を減少させない」とは、本発明方法の実施に起因して細胞数が顕著に減少しないことを意味し、当該方法の実施前の細胞数と当該方法の実施後の細胞数との間に顕著な差がないことを意味する。ただし、本発明方法の実施を原因とするものではない細胞数の減少(例えば、従来公知の細胞培養及び分化の工程において通常生じ得る細胞の自然死等)は生じ得る。したがって、「細胞の数を減少させない」とは、本発明方法の実施前と比べた実施後の細胞の減少率が、30%以下、20%以下、10%以下、または5%以下である場合も含まれる。
 本明細書において、「増殖を抑制する」とは、本発明方法の実施に起因して細胞数が顕著に増加しないことを意味し、当該方法の実施前の細胞数と当該方法の実施後の細胞数との間に顕著な増加がないことを意味する。したがって、「増殖を抑制する」とは、本発明方法の実施前と比べた実施後の細胞の増加率が、30%以下、20%以下、10%以下、または5%以下である場合も含まれる。
 本明細書において、「マーカー」とは、「マーカータンパク質」、「マーカー遺伝子」など、所定の細胞型により特異的に発現される細胞抗原又はその遺伝子を意味する。好ましくは、マーカーは細胞表面マーカーであり、その場合、生存細胞の濃縮、単離、及び/又は検出が実施可能となる。マーカーは、陽性選択マーカー或いは陰性選択マーカーでありうる。
 マーカータンパク質の検出は、当該マーカータンパク質に特異的な抗体を用いた免疫学的アッセイ、例えば、ELISA、免疫染色、フローサイトメトリーを利用して行うことができる。マーカー遺伝子の検出は、当該分野で公知の核酸増幅方法及び/又は核酸検出方法、例えば、RT-PCR、マイクロアレイ、バイオチップ等を利用して行うことができる。本明細書において、マーカータンパク質が「陽性」であるとは、フローサイトメトリーで陽性と検出されることを意味し、「陰性」とは、フローサイトメトリーで検出限界以下であることを意味する。また、本明細書において、マーカー遺伝子が「陽性」であるとは、RT-PCRにより検出されることを意味し、「陰性」とはRT-PCRで検出限界以下であることを意味する。
 本明細書において、「発現(expression)」とは、細胞内のプロモーターにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び/又は翻訳として定義される。
 本明細書において、「CDK8/19阻害活性を有する因子」とは、CDK8/19の阻害活性を有するあらゆる物質を意味する。同じCDKファミリーの他のタンパク質とは対照的に、CDK8は、細胞増殖には必要とされず、CDK8の阻害は、通常の条件下では大きな効果はない。CDK19とCDK8は類似しており、CDK8阻害は通常CDK19の阻害も伴う。
 「増殖因子」は特定の細胞の分化及び/又は増殖を促す内因性タンパク質である。「増殖因子」としては、例えば、上皮成長因子(EGF)、酸性線維芽細胞増殖因子(aFGF)、塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、インスリン様増殖因子1(IGF-1)、インスリン様増殖因子2(IGF-2)、ケラチノサイト増殖因子(KGF)、神経増殖因子(NGF)、血小板由来増殖因子(PDGF)、形質転換増殖因子β(TGF-β)、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)、トランスフェリン、種々のインターロイキン(例えば、IL-1~IL-18)、種々のコロニー刺激因子(例えば、顆粒球/マクロファージ-コロニー刺激因子(GM-CSF))、種々のインターフェロン(例えば、IFN-γなど)及び幹細胞に対する効果を有する他のサイトカイン、例えば、幹細胞因子(SCF)及びエリスロポエチン(Epo)が挙げられる。
 本明細書において、「ROCK阻害剤」とは、Rhoキナーゼ(ROCK:Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase)を阻害する物質を意味し、ROCK IとROCK IIのいずれを阻害する物質であってもよい。ROCK阻害剤は、上記の機能を有する限り特に限定されず、例えば、N-(4-ピリジニル)-4β-[(R)-1-アミノエチル]シクロヘキサン-1α-カルボアミド(本明細書中、Y-27632と称することもある)、Fasudil(HA1077)、(2S)-2-メチル-1-[(4-メチル-5-イソキノリニル]スルホニル]ヘキサヒドロ-1H-1,4-ジアゼピン(H-1152)、4β-[(1R)-1-アミノエチル]-N-(4-ピリジル)ベンゼン-1α-カルボアミド(Wf-536)、N-(1H-ピロロ[2,3-b]ピリジン-4-イル)-4PER(R)-1-アミノエチル]シクロヘキサン-1α-カルボアミド(Y-30141)、N-(3-{[2-(4-アミノ-1,2,5-オキサジアゾール-3-イル)-1-エチル-1H-イミダゾ[4,5-c]ピリジン-6-イル]オキシ}フェニル)-4-{[2-(4-モルホリニル)エチル]-オキシ}ベンズアミド(GSK269962A)、N-(6-フルオロ-1H-インダゾール-5-イル)-6-メチル-2-オキソ-4-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]-3,4-ジヒドロ-1H-ピリジン-5-カルボキサミド(GSK429286A)を挙げることができる。ROCK阻害剤はこれらに限定されるものではなく、ROCKのmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA、ROCKに結合する抗体、ドミナントネガティブROCK変異体等もROCK阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
 本明細書において、「GSK3β阻害剤」とは、GSK3β(グリコーゲンシンターゼキナーゼ3β)に対する阻害活性を有する物質である。GSK3(グリコーゲンシンターゼキナーゼ3)は、セリン/スレオニンプロテインキナーゼの一種であり、グリコーゲンの産生やアポトーシス、幹細胞の維持などにかかわる多くのシグナル経路に関与する。GSK3にはαとβの2つのアイソフォームが存在する。本発明で用いられる「GSK3β阻害剤」は、GSK3β阻害活性を有すれば特に限定されず、GSK3β阻害活性と合わせてGSK3α阻害活性を併せ持つ物質であってもよい。
 GSK3β阻害剤としては、CHIR98014(2-[[2-[(5-ニトロ-6-アミノピリジン-2-イル)アミノ]エチル]アミノ]-4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(1H-イミダゾール-1-イル)ピリミジン)、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-ジクロロフェニル)-5-(4-メチル-1H-イミダゾール-2-イル)-2-ピリミジニル]アミノ]エチル]アミノ]ニコチノニトリル)、TDZD-8(4-ベンジル-2-メチル-1,2,4-チアジアゾリジン-3,5-ジオン)、SB216763(3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン)、TWS-119(3-[6-(3-アミノフェニル)-7H-ピロロ[2,3-d]ピリミジン-4-イルオキシ]フェノール)、ケンパウロン(Kenpaullone)、1-アザケンパウロン(Azakenpaullone)、SB216763(3-(2,4-ジクロロフェニル)-4-(1-メチル-1H-インドール-3-イル)-1H-ピロール-2,5-ジオン)、SB415286(3-[(3-クロロ-4-ヒドロキシフェニル)アミノ]-4-(2-ニトロフェニル)-1H-ピロール-2,5-ジオン)及びAR-AO144-18、CT99021、CT20026、BIO、BIO-アセトキシム、ピリドカルバゾール-シクロペンタジエニルルテニウム複合体、OTDZT、アルファ-4-ジブロモアセトフェノン、リチウム等が例示される。GSK3βはこれらに限定されるものではなく、GSK3βのmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA、GSK3βに結合する抗体、ドミナントネガティブGSK3β変異体等もGSK3β阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
 本明細書において「血清代替物」とは、例えば、KnockOutTM Serum Replacement(KSR:Thermo Fisher Scientific)、StemSure(登録商標) Serum Replacement(Wako)、B-27サプリメント、N2-サプリメント、アルブミン(例えば、脂質リッチアルブミン)、インスリン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素(例えば亜鉛、セレン(例えば、亜セレン酸ナトリウム))、2-メルカプトエタノール、3’チオールグリセロール又はこれらの混合物(例えば、ITS-G)が挙げられる。血清代替物としては、B-27サプリメント、KSR、StemSure(登録商標) Serum Replacement、ITS-Gが好ましい。培地に血清代替物を添加する場合の培地中の濃度は0.01~10重量%、好ましくは0.1~2重量%である。本発明においては、血清に代えて「血清代替物」を使用することが好ましい。
2.CHGA陰性細胞の増殖が抑制されたインスリン産生細胞集団
 本発明は、CHGA陰性細胞の増殖が抑制されたインスリン産生細胞集団に関するものであり、これらの細胞集団はPLK阻害剤で処理することにより得ることができる。
 本発明はまた、PLK阻害剤で処理することによりCHGA陰性細胞の増殖を抑制する方法に関するものである。
 「CHGA陰性細胞」とは、多能性幹細胞から膵β細胞へと分化する過程において、多能性幹細胞から分化誘導された膵前駆細胞集団、好ましくは内分泌前駆細胞集団、より好ましくはインスリン産生細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中に存在する、CHGAマーカーの発現陰性によって特徴付けられる非内分泌性の細胞を意味する。
 「CHGA陰性細胞」には、マーカーとしてKi67の発現が認められることにより特徴付けられる細胞(すなわち、CHGA陽性かつKi67陽性細胞である)が含まれうる。
 「Ki67」は細胞周期関連核タンパク質として公知であり、増殖中の細胞のG1期、S期、G2期、M期において発現が認められ、増殖を休止しているG0期においては発現が認められないため、細胞増殖と細胞周期のマーカーとしても知られている。このため、CHGA陽性かつKi67陽性細胞は、高い増殖性を示す細胞である。
 本発明に係る「インスリン産生細胞集団」は、多能性幹細胞から分化誘導して得られる、インスリン産生細胞を含む細胞集団を意味する。「インスリン産生細胞」は、インスリンのマーカーの発現が認められることによって特徴付けられる細胞(すなわち、インスリン陽性細胞)を意味する。「インスリン産生細胞」は、NK6ホメオボックス1(NKX6.1)のマーカーを発現していてもよく、好ましくは、インスリン及びNKX6.1の両方のマーカーが発現している細胞(すなわち、インスリン陽性かつNKX6.1陽性細胞)である。
 本発明に係る「インスリン産生細胞集団」は、従来公知の手法に従い多能性幹細胞から分化誘導して得られたインスリン産生細胞集団と比べて、CHGA陰性細胞の含有量が低く、その含有率(本明細書中、「割合」と記載する場合がある)は、40%以下、又は30%以下、好ましくは20%以下、より好ましくは15%以下、さらに好ましくは10%以下、例えば、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である。当該含有率の下限は特に限定されないが、0%以上、0.1%以上、又は0.5%以上である。当該含有率は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される2つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該含有率は0.5%~40%、又は0.5%~30%、好ましくは0.5%~20%、より好ましくは0.5%~15%、さらに好ましくは0.5%~10%である。一方、本発明に係る「インスリン産生細胞集団」は、従来公知の手法に従い多能性幹細胞から分化誘導して得られたインスリン産生細胞集団と比べて、インスリン陽性細胞、特にインスリン陽性かつNKX6.1陽性細胞が富化された細胞集団であり、インスリン陽性かつNKX6.1陽性細胞の含有率は、14%以上、好ましくは15%以上、より好ましくは20%以上、さらに好ましくは25%以上、例えば、30%以上、35%以上、40%以上、又は45%以上である。当該含有率の上限は特に限定されないが、70%以下、60%以下、又は50%以下である。当該含有率は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される2つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該含有率は14%~50%、好ましくは15%~50%、より好ましくは20%~50%、さらに好ましくは25%~50%である。
 本発明に係る「インスリン産生細胞集団」は、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、好ましくは内分泌前駆細胞集団、より好ましくはインスリン産生細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団をPLK阻害剤で処理することにより得ることができる。所定の分化段階にある細胞集団をPLK阻害剤で処理することによって、CHGA陰性細胞の増殖を抑制し、その細胞含有量を低下させ、インスリン陽性細胞、好ましくはインスリン陽性かつNKX6.1陽性細胞を富化することができる。
 多能性幹細胞から膵β細胞へと分化する過程においては、分化段階に応じて異なる特徴を有する細胞が出現することが知られている(WO2009/012428、WO2016/021734)。例えば、この分化段階は比較的未分化な順に、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、後方前腸細胞、膵前駆細胞、内分泌前駆細胞、インスリン産生細胞、膵β細胞に大きく分類することができる。
 本明細書において、「多能性(pluripotency)」とは、種々の異なった形態や機能を持つ組織や細胞に分化でき、3胚葉のどの系統の細胞にも分化し得る能力を意味する。「多能性(pluripotency)」は、胚盤には分化できず、したがって個体を形成する能力はないという点で、胚盤を含めて、生体のあらゆる組織に分化しうる「全能性(totipotency)」とは区別される。
 本明細書において「多能性(multipotency)」とは、複数の限定的な数の系統の細胞へと分化できる能力を意味する。例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞はmultipotentだが、pluripotentではない。
 本明細書において、「多能性幹細胞(pluripotent stem cell)」とは、胚性幹細胞(ES細胞)及びこれと同様の分化多能性、すなわち生体の様々な組織(内胚葉、中胚葉、外胚葉の全て)に分化する能力を潜在的に有する細胞を指す。ES細胞と同様の分化多能性を有する細胞としては、「人工多能性幹細胞」(本明細書中、「iPS細胞」と称することもある)が挙げられる。好ましくは、本発明において、多能性幹細胞とはヒト多能性幹細胞である。
 「ES細胞」としては、マウスES細胞であれば、inGenious社、理化学研究所(理研)等が樹立した各種マウスES細胞株が利用可能であり、ヒトES細胞であれば、米国国立衛生研究所(NIH)、理研、京都大学、Cellartis社が樹立した各種ヒトES細胞株が利用可能である。たとえばES細胞株としては、NIHのCHB-1~CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1~HUES28株等、WiCell Research InstituteのH1株、H9株、理研のKhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等を利用することができる。
 「人工多能性幹細胞」とは、哺乳動物体細胞又は未分化幹細胞に、特定の因子(核初期化因子)を導入して再プログラミングすることにより得られる細胞を指す。現在、「人工多能性幹細胞」にはさまざまなものがあり、山中らにより、マウス線維芽細胞にOct3/4、Sox2、Klf4及びc-Mycの4因子を導入することにより、樹立されたiPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126:663-676)のほか、同様の4因子をヒト線維芽細胞に導入して樹立されたヒト細胞由来のiPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,et al.Cell,(2007)131:861-872.)、上記4因子導入後、Nanogの発現を指標として選別し、樹立したNanog-iPS細胞(Okita,K.,Ichisaka,T., and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)、c-Mycを含まない方法で作製されたiPS細胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al.Nature Biotechnology,(2008)26,101-106))、ウイルスフリーで6因子を導入して樹立されたiPS細胞(Okita K et al.Nat.Methods 2011 May;8(5):409-12,Okita K et al.Stem Cells.31(3):458-66.)も用いることができる。また、Thomsonらにより作製されたOCT3/4、SOX2、NANOG及びLIN28の4因子を導入して樹立された人工多能性幹細胞(Yu J.,Thomson JA.et al.,Science(2007)318:1917-1920.)、Daleyらにより作製された人工多能性幹細胞(Park IH,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451:141-146)、桜田らにより作製された人工多能性幹細胞(特開2008-307007号)等も用いることができる。
 このほか、公開されているすべての論文(例えば、Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574;Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650;Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No 7,795-797)、あるいは特許(例えば、特開2008-307007号、特開2008-283972号、US2008/2336610、US2009/047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/006997、WO2009/007852)に記載されている当該分野で公知の人工多能性幹細胞のいずれも用いることができる。
 人工多能性細胞株としては、NIH、理化学研究所(理研)、京都大学等が樹立した各種iPS細胞株が利用可能である。例えば、ヒトiPS細胞株であれば、理研のHiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大学のFf-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、CDI社のMyCell iPS Cells(21525.102.10A)株、MyCell iPS Cells(21526.101.10A)株、等が挙げられる。
 本明細書において「膵前駆細胞集団」とは、膵前駆細胞を含む細胞集団を意味する。本明細書において、膵前駆細胞は、PDX-1、NKX6.1、PTF-1α、GATA4およびSOX9の少なくとも一つのマーカーの発現によって特徴付けられる細胞を意味する。
 膵前駆細胞集団は、膵前駆細胞を30%以上、好ましくは40%以上、より好ましくは50%以上、さらに好ましくは60%以上、よりさらに好ましくは70%以上の割合で含む細胞集団である。膵前駆細胞集団には、膵前駆細胞に加えて、その他の細胞(例えば、内分泌前駆細胞、インスリン産生細胞、Ki67陽性細胞、CHGA陰性細胞等)が含まれていてもよい。
 本明細書において「内分泌前駆細胞集団」とは、内分泌前駆細胞を含む細胞集団を意味する。
 本明細書において、内分泌前駆細胞は、CHGA、NeuroD及びNGN3の少なくとも一つのマーカーの発現、および膵関連のホルモン系(例えば、インスリン等)のマーカーが発現していないことによって特徴付けられる細胞を意味する。内分泌前駆細胞は、PAX-4、NKX2.2、Islet-1、PDX-1、PTF-1αなどのマーカーが発現していてもよい。
 内分泌前駆細胞集団は、内分泌前駆細胞を30%以上、好ましくは40%以上、より好ましくは50%以上、さらに好ましくは60%以上、よりさらに好ましくは70%以上の割合で含む細胞集団である。内分泌前駆細胞集団には、内分泌前駆細胞に加えて、その他の細胞(例えば、膵前駆細胞、インスリン産生細胞、Ki67陽性細胞、CHGA陰性細胞等)が含まれていてもよい。
 細胞集団中の特定の細胞の割合は、フローサイトメトリーのような細胞数を算出可能な公知の手法に基づいて求めることができる。
 「インスリン産生細胞」は上述のとおりであり、「インスリン産生細胞集団」は通常、インスリン産生細胞を5%以上、好ましくは10%以上、より好ましくは15%以上、さらに好ましくは20%以上、よりさらに好ましくは25%以上、特に好ましくは30%以上の割合で含む。当該細胞集団には、インスリン産生細胞に加えて、その他の細胞(例えば、内分泌前駆細胞;グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵臓ポリペプチドの少なくとも一つのマーカーを発現する他の膵ホルモン産生細胞;Ki67陽性細胞、CHGA陰性細胞等)が含まれていてもよい。
 本明細書において「膵β細胞」は、「インスリン産生細胞」より成熟した細胞を意味しており、具体的には、膵β細胞の成熟マーカーであるMAFA、UCN3、及びIAPPの少なくとも一つのマーカーを発現する、あるいはグルコース刺激によるインスリン分泌上昇反応によって特徴付けられる細胞を意味する。
 「膵β細胞集団」は、インスリン産生細胞集団を分化・成熟させることによって、好ましくは生体内で分化・成熟させることによって、得ることができる、膵β細胞を含む細胞集団である。当該細胞集団には、膵β細胞に加えて、その他の細胞(例えば、インスリン産生細胞、Ki67陽性細胞、CHGA陰性細胞等)が含まれていてもよい。
 各分化段階にある細胞集団は、多能性幹細胞を膵β細胞へと分化誘導する公知の手法を用いて得ることができる。すなわち、以下の分化誘導工程を利用して各目的の細胞集団を得ることができる:
  工程1)多能性幹細胞から胚体内胚葉細胞へと分化誘導する;
  工程2)胚体内胚葉細胞から原腸管細胞へと分化誘導する;
  工程3)原腸管細胞から後方前腸細胞へと分化誘導する;
  工程4)後方前腸細胞から膵前駆細胞へと分化誘導する;
  工程5)膵前駆細胞から内分泌前駆細胞へと分化誘導する;
  工程6)内分泌前駆細胞からインスリン産生細胞へと分化誘導する。
 以下、各工程を説明するが、各細胞への分化誘導はこれらの手法に限定されない。
工程1)胚体内胚葉細胞への分化
 多能性幹細胞は、まず胚体内胚葉細胞に分化させる。多能性幹細胞から胚体内胚葉を誘導する方法は既に公知であり、そのいずれの方法を用いてもよい。好ましくは、多能性幹細胞は、アクチビンAを含む培地、より好ましくはアクチビンA、ROCK阻害剤、GSK3β阻害剤を含む培地で培養して、胚体内胚葉細胞に分化させる。培養開始時の細胞数としては、特に限定されず、22000~150000細胞/cm2、好ましくは22000~100000細胞/cm2、より好ましくは22000~80000細胞/cm2である。培養期間は1日~4日、好ましくは1日~3日、特に好ましくは3日である。
 培養温度は、特に限定されないが、30~40℃(例えば、37℃)で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5%程度である。培養は2次元培養及び3次元培養のいずれで行ってもよい。
 本工程で用いる培地としては、RPMI 1640培地、MEM培地、iMEM培地、DMEM/F12培地、Improved MEM Zinc Option培地、Improved MEM/1%B-27/Penisilin Streptomycin培地、MCDB131/20mM Glucose/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAXTM/アスコルビン酸/Penisilin Streptomycin培地など、哺乳類細胞の培養に使用される基本培地を使用することができる。
 アクチビンAの培地中の濃度は、通常30~200ng/mL、好ましくは50~150ng/mL、より好ましくは70~120ng/mL、特に好ましくは約100ng/mLである。
 別の態様として、アクチビンAは培地中に低用量にて、例えば、5~100ng/mL、好ましくは5~50ng/mL、より好ましくは5~10ng/mLの量にて含めることができる。
 さらに別の態様として、アクチビンAの培地中の濃度は、約0.1~100ng/mL、好ましくは約1~50ng/mL、より好ましくは約3~10ng/mLである。
 GSK3β阻害剤の培地中の濃度は、用いるGSK3β阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばGSK3β阻害剤としてCHIR99021を使用する場合の濃度は、通常2~5μM、好ましくは2~4μM、特に好ましくは約3μMである。
 ROCK阻害剤の培地中の濃度は、用いるROCK阻害剤の種類によって適宜設定され、例えばROCK阻害剤としてY27632を使用する場合の濃度は、通常5~20μM、好ましくは5~15μM、特に好ましくは約10μMである。
 培地にはさらに、インスリンを添加することができる。インスリンは培地中に0.01~20μM、好ましくは0.1~10μM、より好ましくは0.5~5μMの量で含めることができる。培地中のインスリンの濃度は、添加したB-27サプリメントに含まれるインスリンの濃度であってもよいが、これに限定されない。
 特定の態様では、アクチビンA、ROCK阻害剤、GSK3β阻害剤を含む培地で1日培養した後、アクチビンAのみを含む培地で1日毎に培地を交換しながらさらに2日培養する。あるいは、低用量のアクチビンAの存在下、多能性幹細胞を、インスリンを0.01~20μM含む培地中で第1の培養を行い、続いて、インスリンを含まない培地中で第2の培養を行うことにより製造することができる。
工程2)原腸管細胞への分化
 工程1)で得られた胚体内胚葉細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して原腸管細胞に分化誘導する。培養期間は2日~8日、好ましくは約4日である。
 培養温度は、特に限定されないが、30~40℃(例えば、37℃)で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5%程度である。培養は2次元培養及び3次元培養のいずれで行ってもよい。
 培地は、工程1)と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
 増殖因子としては、EGF、KGF、FGF10が好ましく、EGF及び/又はKGFがより好ましく、KGFがさらに好ましい。
 増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約0.1nM~1000μM、好ましくは約0.1nM~100μMである。EGFの場合、その濃度は、約5~2000ng/mL(すなわち、約0.8~320nM)、好ましくは約5~1000ng/mL(すなわち、約0.8~160nM)、より好ましくは約10~1000ng/mL(すなわち、約1.6~160nM)である。FGF10の場合、その濃度は、約5~2000ng/mL(すなわち、約0.3~116nM)、好ましくは約10~1000ng/mL(すなわち、約0.6~58nM)である。例えば増殖因子としてKGFを使用する場合の濃度は、通常5~150ng/mL、好ましくは30~100ng/mL、特に好ましくは約50ng/mLである。
工程3)後方前腸細胞への分化
 工程2)で得られた原腸管細胞を、さらに増殖因子、シクロパミン、ノギン等を含む培地で培養し、後方前腸細胞に分化誘導する。培養期間は1日~5日、好ましくは約2日程度である。培養は2次元培養及び3次元培養のいずれで行ってもよい。
 培養温度は、特に限定されないが、30~40℃(例えば、37℃)で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5%程度である。
 培地は、工程1)と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
 増殖因子としては、EGF、KGF、FGF10が好ましく、EGF及び/又はKGFがより好ましく、KGFがさらに好ましい。
 増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約0.1nM~1000μM、好ましくは約0.1nM~100μMである。EGFの場合、その濃度は、約5~2000ng/mL(すなわち、約0.8~320nM)、好ましくは約5~1000ng/mL(すなわち、約0.8~160nM)、より好ましくは約10~1000ng/mL(すなわち、約1.6~160nM)である。FGF10の場合、その濃度は、約5~2000ng/mL(すなわち、約0.3~116nM)、好ましくは約10~1000ng/mL(すなわち、約0.6~58nM)である。例えば増殖因子としてKGFを使用する場合の濃度は、通常5~150ng/mL、好ましくは30~100ng/mL、特に好ましくは約50ng/mLである。
 シクロパミンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常0.5~1.5μM、好ましくは0.3~1.0μM、特に好ましくは約0.5μMである。
 ノギンの培地中の濃度は、特に限定するものではないが、通常10~200ng/mL、好ましくは50~150ng/mL、特に好ましくは約100ng/mLである。
工程4)膵前駆細胞への分化
 工程3)で得られた後方前腸細胞を、さらにCDK8/19阻害活性を有する因子を含む培地、好ましくはCDK8/19阻害活性を有する因子と増殖因子を含む培地で培養し、膵前駆細胞に分化誘導する。培養期間は2日~10日、好ましくは約5日程度である。培養は2次元培養及び3次元培養のいずれで行ってもよい。
 2次元培養の場合には、既報(Toyoda et al.,Stem cell Research(2015)14,185-197)に従い、工程3)で得られた後方前腸細胞を0.25%トリプシン-EDTAで処理及びピペッティングにより分散させ、得られた分散液を遠心分離に付し、回収した細胞を少量の新たな培地に再懸濁し、その細胞懸濁液を工程4)の新しい培地に再播種する。
 培地は、工程1)と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、増殖因子のほか、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
 CDK8/19阻害活性を有する因子としては、前述した各種化合物又はその塩を用いることができ、用いる化合物又はその塩に応じて、培地への添加量は適宜決定されるが、通常約0.00001μM~5μM、好ましくは0.00001μM~1μMである。CDK8/19阻害活性を有する因子の培地中の濃度としては、CDK8/19に対して50%以上の阻害活性に達する濃度が好ましい。
 増殖因子としては、EGF、KGF、FGF10が好ましく、KGF及び/又はEGFがより好ましく、KGF及びEGFがさらに好ましい。
 増殖因子の培地中の濃度は、用いる増殖因子の種類によって適宜設定されるが、通常約0.1nM~1000μM、好ましくは約0.1nM~100μMである。EGFの場合、その濃度は、約5~2000ng/mL(すなわち、約0.8~320nM)、好ましくは約5~1000ng/mL(すなわち、約0.8~160nM)、より好ましくは約10~1000ng/mL(すなわち、約1.6~160nM)である。FGF10の場合、その濃度は、約5~2000ng/mL(すなわち、約0.3~116nM)、好ましくは約10~1000ng/mL(すなわち、約0.6~58nM)である。例えば増殖因子としてKGF及びEGFを使用する場合の濃度は、EGFは通常通常5~150ng/mL、好ましくは30~100ng/mL、特に好ましくは約50ng/mL、KGFは通常10~200ng/mL、好ましくは50~150ng/mL、特に好ましくは約100ng/mLである。
 工程4)における培養の最初の1日はROCK阻害剤の存在下で行い、以後はROCK阻害剤を含まない培地で培養してもよい。
 また、培地にはプロテインキナーゼC(PKC)活性化剤を含めても良い。PKC活性化剤としては、PDBu(PKC activator II)、TPB(PKC actovator V)などを使用するが、その限りでない。PKC活性化剤の濃度は約0.1~100ng/mL、好ましくは約1~50ng/mL、より好ましくは約3~10ng/mLで添加する。
 また、培地にはジメチルスルホキシド、及び/又はアクチビン(1~50ng/mL)を添加してもよい。
 いずれの工程においても、培地には、上記した成分のほか、血清代替物(例えば、B-27サプリメント、ITS-G)を添加してもよい。また、必要に応じて、アミノ酸、L-グルタミン、GlutaMAX(製品名)、非必須アミノ酸、ビタミン、ニコチンアミド、抗生物質(例えば、Antibiotic-Antimycotic(本明細書中、AAと称することがある)、ペニシリン、ストレプトマイシン、又はこれらの混合物)、抗菌剤(例えば、アンホテリシンB)、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を添加してもよい。培地に抗生物質を添加する場合には、その培地中の濃度は通常0.01~20重量%、好ましくは0.1~10重量%である。培養は2次元培養及び3次元培養のいずれで行ってもよい。
 また細胞培養は、2次元培養の場合は、フィーダー細胞を使用せず、接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、OptiCell(製品名)(Nunc社)等の細胞培養シートなどの培養容器が使用される。培養容器は、細胞との接着性(親水性)を向上させるための表面処理や、コラーゲン、ゼラチン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル(例:BDマトリゲル(日本ベクトン・デッキンソン社))、ビトロネクチンなどの細胞接着用基質でコーティングされていることが好ましい。培養容器としては、I型コラーゲン、マトリゲル、フィブロネクチン、ビトロネクチン又はポリ-D-リジンなどでコートされた培養容器が好ましく、マトリゲル又はポリ-D-リジンでコートされた培養容器がより好ましい。
 培養温度は、特に限定されないが、30~40℃(例えば、37℃)で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5%程度である。
 工程4)で得られた膵前駆細胞は公知の表面マーカーである糖タンパク質2(GP2)などを利用して、さらに純化することができる。上記純化は自体公知の方法、例えば、抗GP2抗体を固定化したビーズを用いて行うことができる。
工程5)内分泌前駆細胞への分化
 工程4)で得られた膵前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養して内分泌前駆細胞に分化誘導する。培養は2次元培養及び3次元培養のいずれで行ってもよい。2次元培養の場合には、工程4)で得られた膵前駆細胞を、0.25%トリプシン-EDTAで処理後にピペッティングすることにより分散し、遠心分離して0.25%トリプシン-EDTAで処理及びピペッティングにより分散させ、得られた分散液を遠心分離に付し、回収した細胞を少量の新たな培地に再懸濁し、その細胞懸濁液を工程5)の新しい培地に再播種する。培養期間は2日~3日、好ましくは約2日である。
 培地は、工程1)と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報(Nature Biotechnology 2014;32:1121-1133)に従い、SANT1、レチノイン酸、ALK5インヒビターII、T3、LDNを添加し、さらに、Wnt阻害薬、ROCK阻害剤、FGF(好ましくはFGF2)、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。
 培養は、フィーダー細胞を使用せず、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート(Nunc社)等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
 培養温度は、特に限定されないが、30~40℃(例えば、37℃)で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5%程度である。
工程6)インスリン産生細胞への分化
 工程5)で得られた内分泌前駆細胞を、さらに増殖因子を含む培地で培養してインスリン産生細胞に分化誘導する。培養期間は10日~30日、好ましくは約10~20日である。
 培地は、工程1)と同様に、哺乳類細胞の培養に用いられる基本培地を用いることができる。培地には、既報(Nature Biotechnology 2014;32:1121-1133)に従い、ALK5インヒビターII、T3、LDN、γ-secretase阻害剤XX、γ-secretase阻害剤RO、N-システイン、AXLインヒビター、アスコルビン酸を添加し、さらに、Wnt阻害薬、ROCK阻害剤、FGF(好ましくはFGF2)、血清代替物、ビタミン、抗生物質等を適宜添加してもよい。例えば、培地にはALK5インヒビターII、T3、LDN、γ-secretase阻害剤RO、及びアスコルビン酸を添加してもよく、あるいはT3、ALK5インヒビターII、ZnSO4、ヘパリン、N-アセチルシステイン、Trolox、及びR428を添加してもよい。
 培養は2次元培養及び3次元培養のいずれで行ってもよい。培養は、フィーダー細胞を使用しない。3次元培養の場合、非接着培養にて行う。培養時には、ディッシュ、フラスコ、マイクロプレート、多孔プレート(Nunc社)等あるいはバイオリアクターが使用される。培養容器は、細胞との接着性を低下させるための表面処理されていることが好ましい。
 培養温度は、特に限定されないが、30~40℃(例えば、37℃)で行う。また、培養容器中の二酸化炭素濃度は例えば5%程度である。
膵β細胞への分化
 上記工程で得られた細胞は、膵β細胞に分化誘導することができる。膵β細胞集団へと分化させる工程は、内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団、好ましくはインスリン産生細胞集団、を動物生体内に移植することによって行うことができる。
 「動物」は哺乳動物が好ましく、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ラマ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウス、モルモット等が挙げられるが、好ましくはヒトである。
 移植は、細胞集団を一定の位置で固定できる生体内領域に行うことが好ましく、例えば、動物の皮下、腹腔内、腹膜上皮、大網、脂肪組織、筋肉組織や膵臓、腎臓等の各臓器の被膜下などに行うことできる。移植される細胞数は、移植される細胞の分化段階や、移植対象の、年齢、体重、移植部位の大きさ、疾患の重篤度等の要因により変化し得、特に限定されないが、例えば、10×104細胞~10×1011個程度とすることができる。移植された細胞集団は、生体内環境において分化誘導され、目的の細胞集団、好ましくは膵β細胞集団へと分化することができ、その後、回収されてもよいし、そのまま生体内に留置してもよい。
 移植に際して、細胞集団は、生体適合性材料を含むゲル中に包埋して移植してもよく、例えば、生体適合性材料を含むゲル中に包埋された細胞集団をカプセル、バッグ、チャンバーなどのデバイスに封入して生体内に移植することもできる。
 本発明において「包埋」とは、生体適合性材料を含むゲル中に内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、散在させ収容することを意味する。
 本明細書において「生体適合性材料」とは生体内に移植し、短期又は長期留置した場合に、顕著な免疫応答や有害な生体反応(例えば、毒性反応、凝血等)を誘導しない任意の材料を意味する。また、「生体適合性材料」は生分解性材料であることが好ましい。このような材料としては、ポリ乳酸(PLA)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリウレタン(PU)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸-co-グリコール酸(PLGA)、ポリ(3-ヒドロキシブチレート-co-ヒドロキシバリレート)(PHBV)、ポリ(エチレン-co-ビニルアセテート)(PEVA)ポリアクリルアミド、ポリエチレンオキシド、ポリエチレンアミン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリ(N-ビニルピロリドン)、ポリビニルアルコール、ポリフマル酸プロピレン、ポリアクリル酸、ポリe-カプロラクトン、ポリメタクリル酸、ポリビニリデンジフルオライド(PVDF)、ペクチン酸、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ヘパリン、キチン、キトサン、キサンタン、カルボキシメチルセルロース、カルボキシメチルキトサン、アルギン酸塩、アルギン酸エステル、コラーゲン、セルロース、シルクフィブロイン、ケラチン、ゼラチン、フィブリン、プルラン、ラミニン、ゲラン、シリコン、ウレタン、エラスチン等及びそれらの修飾体、ならびにそれらの組み合わせが挙げられる。「生体適合性材料」の表面は必要に応じて、細胞の接着を可能とする表面修飾(例えば、細胞接着用基質(コラーゲン、ゼラチン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ラミニン、フィブロネクチン、マトリゲル、ビトロネクチン等)によるコーティング)や、細胞の増殖、分化や機能を制御することが知られている官能基(例えば、アミノ基、カルボキシル基、水酸基、メタクリル酸基、アクリル酸基等)での改変、が施されていてもよい。特定の態様において、「生体適合性材料」として、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを好適に用いることができる。
 アルギン酸塩は水溶性の塩であればよく、金属塩、アンモニウム塩等を利用することができる。例えば、アルギン酸ナトリウム、アルギン酸カルシウム、アルギン酸アンモニウム等を好適に用いることができる。
 アルギン酸エステル(アルギン酸プロピレングリコールとも称される)はアルギン酸のカルボキシル基にプロピレングルコールがエステル結合した誘導体である。
 アルギン酸塩に含まれるマンヌロン酸とグルロン酸の割合(M/G比)は任意であり、一般的に、M>Gである場合には柔軟性に富んだゲルを形成することができ、M<Gである場合には強固なゲルを形成することができる。本発明においては、グルロン酸を10~90%、20~80%、30~70%、又は、40~60%の割合で含むものを利用することができる。
 アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを用いたゲルの作製は、公知の手法(WO2010/032242、WO2011/154941)に準じて作製することができ、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液に架橋剤を添加してゲル化させることにより得ることができる。
 アルギン酸塩又はアルギン酸エステルは溶媒中に、0.05~10重量%、好ましくは、0.1~5重量%、より好ましくは0.5~3重量%の量で含めることができる。溶媒はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルを溶解可能なものであればよく、水、生理食塩水等を利用することができる。
 架橋剤はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液をゲル化できるものであればよく、特に限定されないが、多価の金属カチオンを利用することができる。多価の金属カチオンとしては、2価の金属カチオンが好ましく、より好ましくは、カルシウムイオン、ストロンチウムイオン、バリウムイオンである。架橋剤は塩の形態で利用することができ、本発明においては、塩化カルシウム、塩化ストロンチウム、塩化バリウムから選択される少なくとも一つを架橋剤として利用することができる。
 アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを含むゲルにはナノファイバーを含めることができる。ナノファイバーは、ナノメートル領域の直径を有する天然又は合成ファイバーである。天然ナノファイバーとしては、コラーゲン、セルロース、シルクフィブロイン、ケラチン、ゼラチン、キトサンなどの多糖類の一又は複数を含むものが挙げられる。合成ナノファイバーとしては、ポリ乳酸(PLA)、ポリカプロラクトン(PCL)、ポリウレタン(PU)、ポリ(ラクチド-co-グリコリド)(PLGA)、ポリ(3-ヒドロキシブチレート-co-ヒドロキシバリレート)(PHBV)、ポリ(エチレン-co-ビニルアセテート)(PEVA)などが挙げられる。ナノファイバーはアルギン酸を含むゲル中に1重量%未満、例えば、0.9重量%、0.8重量%、0.7重量%、0.6重量%、0.5重量%、又はそれ未満の量にて含めることができる。アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを含むゲル中に含めるナノファイバーの量の下限は特に限定されないが、0.05重量%以上、好ましくは0.1重量%以上とすることができる。
 アルギン酸塩又はアルギン酸エステルを含むゲルへの細胞集団の包埋は任意の手段で行うことができ、特に限定されるものではないが例えば、アルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液中に細胞集団を混合し、ゲル化させることにより行うことができる。
 細胞集団はアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液中に1×104細胞~1×109細胞/mL、好ましくは1×107細胞~1×108細胞/mLから選択される量にて含めることができる。
 細胞集団を含むアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液のゲル化は、当該溶液に架橋剤を添加して行うことができる。添加する架橋剤の量は、当該溶液に対し0.1~5重量%、例えば、0.1~1重量%、から選択される量とすることができる。ゲル化は、細胞培養や細胞移植に用いられる所定の構成及び/又は形状を有する容器内にて、あるいは当該容器に適合するゲルが得られるように設計された鋳型内で行うことができる。
 あるいは、公知の手法(WO2010/010902)に準じてアルギン酸を含むゲルカプセルを形成することにより行われてもよい。すなわち、架橋剤の溶液に対し、細胞集団を含むアルギン酸塩又はアルギン酸エステルの溶液を滴下して行ってもよい。滴下する際のノズルの形状や滴下方法に応じて、液滴のサイズを調整することができ、ひいてはアルギン酸を含むゲルカプセルの大きさを規定することができる。滴下方法は特に限定されないが、エアスプレー法、エアレススプレー方式、静電スプレー法等の手法により行うことができる。アルギン酸を含むゲルカプセルの大きさは特に限定されないが、直径が5mm以下、1mm以下、500μm以下とすることができる。架橋剤溶液には、0.1~10重量%、例えば、0.1~5重量%、から選択される量の架橋剤を含めることができる。
 本発明において「PLK阻害剤」とは、Polo-like kinase(PLK)に対する阻害活性を有する物質である。PLKは、真核生物で保存されたセリン・スレオニン・キナーゼファミリーであり、細胞周期のM期の進行を担うキナーゼであり、PLK1、PLK2、PLK3、及びPLK4の4つが知られている。本発明で用いられるPLK阻害剤は、CHGA陰性細胞の増殖を抑えることができればよく、PLK1、PLK2、PLK3、及びPLK4のいずれに対する阻害剤であってもよく、各PLKに対する阻害剤は別のPLKに対する阻害剤であってもよい。本発明で用いられるPLK阻害剤は、CHGA陰性細胞の増殖を抑えることができればよく、PLK阻害活性と合わせてその他の活性(阻害活性等)を併せ持つ物質であってもよい。好ましくは、本発明において「PLK阻害剤」は、PLK1、又はPLK4に対して阻害活性を有する阻害剤であり、好ましくはPLK1、又はPLK4に対してより選択性を有する阻害剤である。例えば、PLK1、又はPLK4に対する50%阻害濃度(IC50)が1μM以下、好ましくは100nM以下、より好ましくは50nM以下、さらに好ましくは10nM以下、特に好ましくは5nM以下、とりわけ好ましくは3nM以下である物質を好適に利用することができる。PLK阻害活性の判定方法としては、公知の方法から選択すればよく、例えばSerine/Threonine Kinase Assay Kits(MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO.,LTD.)を使った判定方法などが挙げられる。本発明において「PLK阻害剤」は従来公知のものを利用することが可能であり、特許文献又は非特許文献から見つけることができる。
 本発明において利用可能なPLK阻害剤としては、(R)-5-(6-((4-メチルピペラジン-1-イル)メチル)-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)-3-(1-(2-(トリフルオロメチル)フェニル)エトキシ)チオフェン-2-カルボキサミド(CAS No.929095-18-1)(本明細書中、当該化合物を「CAS929095-18-1」と記載する場合がある)、(1S,2R)-2-[3-[(1E)-2-[4-[[(2R,6S)-2,6-ジメチル-4-モルホリニル]メチル]フェニル]エテニル]-1H-インダゾール-6-イル]-5’-メトキシ-スピロ[シクロプロパン-1,3’-[3H]インドール]-2’(1’H)-オン(CAS No.1338800-06-8)(本明細書中、当該化合物を「CAS1338800-06-8」と記載する場合がある)、2-[[2-フルオロ-4-[[(2-フルオロ-3-ニトロフェニル)メチル]スルホニル]フェニル]チオ]-5-メトキシ-N-(5-メチル-1H-ピラゾール-3-イル)-6-(4-モルホリニル)-4-ピリミジンアミン(CAS No.1798871-30-3)、2-[[2-フルオロ-4-[[(2-フルオロ-3-ニトロフェニル)メチル]スルホニル]フェニル]チオ]-5-メトキシ-N-(5-メチル-1H-ピラゾール-3-イル)-6-(1-ピペリジニル)-4-ピリミジンアミン(CAS No.1798871-31-4)、7-ニトロ-5-(トリフルオロメチル)-2-ベンゾチアゾールカルボキサミド-3-オキシド(CAS No.40533-25-3)、5-(5,6-ジメトキシ-1H-ベンズイミダゾール-1-イル)-3-[[2-(トリフルオロメチル)フェニル]メトキシ]-2-チオフェンカルボキサミド(CAS No.660868-91-7)、4-[(9-シクロペンチル-7,7-ジフルオロ-6,7,8,9-テトラヒドロ-5-メチル-6-オキソ-5H-ピリミド[4,5-b][1,4]ジアゼピン-2-イル)アミノ]-2-フルオロ-5-メトキシ-N-(1-メチル-4-ピペリジニル)ベンズアミドハイドロクロリド(CAS No.2108449-45-0)、3-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-N-[(1S)-1-フェニルエチル]-イソキサゾロ[5,4-c]ピリジン-5-アミン(CAS No.1082739-92-1)、(1S,6bR,9aS,11R,11bR)11-(アセチルオキシ)-1,6b,7,8,9a,10,11,11b-オクタヒドロ-1-(メトキシメチル)-9a,11b-ジメチル-3H-フロ[4,3,2-de]インデノ[4,5,-h]-2-h]-2-ベンゾピラン-3,6,9-トリオン(CAS No.19545-26-7)、5-シアノ-7-ニトロ-2-ベンゾチアゾールカルボキサミド-3-オキシド(CAS No.40647-02-7)、2,3,4,5-テトラヒドロ-7-ヒドロキシ-1H-ベンゾフロ[2,3-c]アゼピン-1-オン(CAS No.521937-07-5)、1-[6-[(3-アセチル-2,4,6-トリヒドロキシ-5-メチルフェニル)メチル]-5,7-ジヒドロキシ-2,2-ジメチル-2H-1-ベンゾピラン-8-イル]-3-フェニル-2-プロペン-1-オン(CAS No.82-08-6)、N-[[4-[(6-クロロ-3-ピリジニル)メトキシ]-3-メトキシフェニル]メチル]-3,4-ジメトキシ-ベンゼンエタンアミン塩酸塩(CAS No.1052532-15-6)、A66 (CAS No.1166227-08-2)、(R)-2-(1-(7-メチル-2-モルホリノ-4-オキソ-4H-ピリド[1,2-a]ピリミジン-9-イル)エチルアミノ)安息香酸(CAS No.1173900-33-8)、N-[(4-メトキシフェニル)スルホニル]-N-[2-[(1E)-2-(1-オキシド-4-ピリジニル)エテニル]フェニル]-アセトアミド(CAS No.173529-46-9)、ナトリウム(E)-2-((2-メトキシ-5-(((2,4,6-トリメトキシスチリル)スルホニル)メチル)フェニル)アミノ)アセテート(CAS No.1225497-78-8)、4-((9-シクロペンチル-7,7-ジフルオロ-5-メチル-6-オキソ-6,7,8,9-テトラヒドロ-5H-ピリミド[4,5-b][1,4]ジアゼピン-2-イル)アミノ)-2-フルオロ-5-メトキシ-N-(1-メチルピペリジン-4-イル)ベンズアミド(CAS No.1137868-52-0)、4-((6-クロロ-2-メトキシアクリジン-9-イル)メチル)-2-((4-(2-(ジメチルアミノ)エチル)ピペラジン-1-イル)メチル)フェノール(CAS No.2247919-28-2)、2-メチル-5-(1-メチルエチル)-1-[O-(2-メチルベンゾイル)オキシム]-2,5-シクロヘキサジエン-1,4-ジオン(CAS No.321688-88-4)、9-シクロペンチル-2-[[2-エトキシ-4-(4-ヒドロキシ-1-ピペリジニル)フェニル]アミノ]-5,7,8,9-テトラヒドロ-5-メチル-6H-ピリミド[4,5-b][1,4]ジアゼピン-6-オン(CAS No.1228817-38-6)、2,5-シクロヘキサジエン-1,4-ジオン,2-メチル-5-(1-メチルエチル)-,1-オキシム(CAS No.17302-61-3)等又はその塩が例示される(これらに限定はされない)。また、これらの化合物はPLK阻害活性を有する限り、好ましくはPLK1、又はPLK4に対する50%阻害濃度(IC50)が1μM以下、好ましくは100nM以下、より好ましくは50nM以下、さらに好ましくは10nM以下、特に好ましくは5nM以下、とりわけ好ましくは3nM以下である限り、一又は複数の置換基を有していてもよいし、一部の部分構造(置換基、環等)が変換されていてもよい。
 好ましくは、本発明においてPLK阻害剤は、PLK1阻害剤として利用可能な、(R)-5-(6-((4-メチルピペラジン-1-イル)メチル)-1H-ベンゾ[d]イミダゾール-1-イル)-3-(1-(2-(トリフルオロメチル)フェニル)エトキシ)チオフェン-2-カルボキサミド(CAS No.:929095-18-1)、PLK4阻害剤として利用可能な、(1S,2R)-2-[3-[(1E)-2-[4-[[(2R,6S)-2,6-ジメチル-4-モルホリニル]メチル]フェニル]エテニル]-1H-インダゾール-6-イル]-5’-メトキシ-スピロ[シクロプロパン-1,3’-[3H]インドール]-2’(1’H)-オン(CAS No.1338800-06-8)である。
 PLK阻害剤は上記に示した化合物に限定されるものではなく、PLKのmRNAに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドやsiRNA、PLKに結合する抗体、ドミナントネガティブPLK変異体等もPLK阻害剤として使用することができ、商業的に入手可能であるか公知の方法に従って合成することができる。
 PLK阻害剤としては、前述した各種化合物又はその塩を用いることができ、用いる化合物又はその塩に応じて、培地への添加量は適宜決定されるが、通常約0.00001μM~100μM、好ましくは0.01μM~10μM、より好ましくは0.1μM~5μM、特に好ましくは0.1μM~3μMである。
 PLK阻害剤による、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、好ましくは内分泌前駆細胞集団、より好ましくはインスリン産生細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団の処理は、当該細胞集団をPLK阻害剤と接触させることにより行うことができる。例えば、PLK阻害剤を添加した培地で当該細胞集団を培養することにより行うことができる。PLK阻害剤は培地に、PLK活性を阻害することが可能な任意の量にて含めることができ、例えば、10μM以下、又は5μM以下の量にて、好ましくは4μM以下、より好ましくは3μM以下、例えば、2μM以下又は1μM以下の量にて含めることができる。PLK阻害剤の添加量の下限は、特に限定されないが、0.1μM以上、好ましくは0.5μM以上とすることができる。PLK阻害剤の添加量は、10μM以下0.1μM以上であり、好ましくは5μM以下0.5μM以上、特に好ましくは3μM以下0.5μM以上である。PLK阻害剤の存在下における培養は、少なくとも12時間、好ましくは24時間以上、2日以上、4日以上、8日以上、10日以上、又は15日以上行うことができる。PLK阻害剤の存在下における培養は、4日以上行うことが好ましい。PLK阻害剤による処理期間中も培地の交換は可能であり、培養スケジュールにしたがって、PLK阻害剤が添加された交換前と同じ組成を有する培地又は異なる組成を有する培地と交換することができる。
 多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、好ましくは内分泌前駆細胞集団、より好ましくはインスリン産生細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団は、PLK阻害剤で処理すると共に、目的の細胞集団へとさらに分化させる工程に付すことができる。ここで「PLK阻害剤で処理すると共に」とは、PLK阻害剤で処理する工程と分化させる工程とを同時に行う場合、PLK阻害剤で処理した後に分化させる工程に付す場合、ならびに、分化させる工程に付した後にPLK阻害剤で処理する工程に付す場合も含む。したがって、PLK阻害剤で処理するのに用いる培地と細胞集団を分化させるのに用いる培地とは別々のものであってもよいし、分化させる工程に用いる培地にPLK阻害剤がさらに添加されてもよい。
 本手法は、テラトーマの増殖を抑制するのでなく、膵系譜に含まれる増殖性細胞の残存数を減少または抑制することができる。
 本手法は、iPS細胞の増殖を抑制するのでなく(例えば、アルカリフォスファターゼ陽性細胞の数を減少させなくてもよい)、膵系譜に含まれる増殖性細胞の残存数を減少または抑制することができる。
 本手法によれば、PLK阻害剤を用いた処理により、内分泌前駆細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団中におけるCHGA陰性細胞、特にCHGA陰性かつKi67陽性細胞の絶対数を低減することが可能である。これにより、得られた細胞集団中におけるCHGA陰性細胞、特にCHGA陰性かつKi67陽性細胞を枯渇させることができる。
 すなわち、得られた細胞集団中におけるCHGA陰性細胞、特にCHGA陰性かつKi67陽性細胞の割合を、PLK阻害剤で処理せずに培養及び/又は分化させた場合と比べて低減することが可能である。得られた細胞集団中におけるCHGA陰性細胞の割合は、40%以下、30%以下、20%以下、15%以下、又は10%以下であり、好ましくは、20%以下、15%以下、又は10%以下、例えば、9%以下、8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、又は1%以下である。当該割合の下限は特に限定されないが、例えば、0%以上、0.1%以上、又は0.5%以上である。当該割合は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される2つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該割合は0.1%~40%、0.1%~30%、0.1%~20%、0.1%~15%、又は0.1%~10%であり、好ましくは、0.1%~20%、0.1%~15%、又は0.1%~10%である。あるいは、当該割合は0.5%~40%、0.5%~30%、0.5%~20%、0.5%~15%、又は0.5%~10%であり、好ましくは、0.5%~20%、0.5%~15%、又は0.5%~10%である。特にCHGA陰性かつKi67陽性細胞の割合については得られた細胞集団中に8%以下、7%以下、6%以下、5%以下、4%以下、3%以下、2%以下、1%以下、又は0.5%以下であり、好ましくは、3%以下、2%以下、1%以下、又は0.5%以下である。当該割合の下限は特に限定されないが、例えば、0%以上、又は0.1%以上である。当該割合は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される2つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該割合は0.1%~8%、0.1%~7%、0.1%~6%、0.1%~5%、0.1%~4%、0.1%~3%、0.1%~2%、0.1%~1%、又は0.1%~0.5%であり、好ましくは、0.1%~3%、0.1%~2%、0.1%~1%、又は0.1%~0.5%である。
 また、本手法によれば、PLK阻害剤で処理した、多能性幹細胞から分化誘導して得られた膵前駆細胞集団、好ましくは内分泌前駆細胞集団、より好ましくはインスリン産生細胞集団、又はそれ以降の分化段階にある細胞集団を、インスリン産生細胞又は膵β細胞へと分化させることによって、CHGA陰性細胞、特にCHGA陰性かつKi67陽性細胞の増殖が抑制され、インスリン産生細胞又は膵β細胞が富化された細胞集団を得ることができる。すなわち、分化誘導後に得られた細胞集団におけるインスリン産生細胞又は膵β細胞の割合を、PLK阻害剤で処理することなく得られた場合と比べて増大させることが可能である。得られた細胞集団中におけるインスリン産生細胞又は膵β細胞の割合は40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、又は90%以上である。当該割合の上限は特に限定されないが、100%以下、99%以下、98%以下、97%以下、96%以下、又は95%以下である。当該割合は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される2つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該割合は40%~95%、50%~95%、60%~95%、70%~95%、80%~95%、又は90%~95%である。特にインスリン陽性かつNKX6.1陽性細胞の割合は、14%以上、好ましくは15%以上、より好ましくは20%以上、さらに好ましくは25%以上、例えば、30%以上、35%以上、40%以上、又は45%以上である。当該割合の上限は特に限定されないが、50%以下である。当該割合は前記上限及び下限の数値よりそれぞれ選択される2つの数値を用いて表すことができ、例えば、当該割合は14%~50%、好ましくは15%~50%、より好ましくは20%~50%、さらに好ましくは25%~50%である。
 本手法により得られたインスリン産生細胞又は膵β細胞は、動物生体内に移植して、動物生体内で分化させた場合にはそのまま留置して、インスリン分泌細胞として利用することが可能である。本手法により得られたインスリン産生細胞又は膵β細胞によれば、CHGA陰性細胞、特にCHGA陰性かつKi67陽性細胞の増殖を回避して、安全、かつ移植細胞の長期の生着を達成し得る。
 本発明により、CHGA陰性細胞、特に高い増殖性を有するCHGA陰性かつKi67陽性細胞を除去したインスリン産生細胞集団又は膵β細胞集団(本発明の細胞集団)は、そのままあるいはカプセル化して患部に移植することで、糖尿病、特にI型糖尿病を治療するための細胞医薬として有用である。
 また、本発明の細胞集団は、プロドラッグであってもよい。本明細書において、プロドラッグとは、生体内に移植した後に分化し、疾患を治療する機能を有する細胞に変化する細胞集団をいう。
 本発明の細胞集団は、毒性(例、急性毒性、慢性毒性、遺伝毒性、生殖毒性、心毒性、癌原性)が低く、そのまま、または薬理学的に許容される担体等と混合して医薬組成物とすることにより、哺乳動物(例えば、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、サル、ヒト)に対して、安全に投与することができる。
 以下、実施例により本発明を説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
 多能性幹細胞から内分泌前駆細胞集団への分化誘導は、上記工程1)-5)、既報(Stem Cell Research(2015)14、185-197)等に従い実施した。インスリン産生細胞への分化誘導は、上記工程6)等に従い実施した。
実施例1:インスリン産生細胞集団をPLK阻害剤で処理して得られた細胞集団における目的外細胞(CHGA陰性細胞)の減少と目的細胞(インスリン陽性かつNKX6.1陽性細胞)の増加(1)
1.方法
 1) iPS細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を分化因子(ALK5インヒビターII、T3、LDN、γ-secretase阻害剤RO、アスコルビン酸)を含む分化誘導培地(Improved MEM/1%B-27/Penisilin Streptomycin培地)で7日間培養してインスリン産生細胞集団に分化誘導した。次いで、分化因子(ALK5インヒビターII、T3、LDN、γ-secretase阻害剤RO、アスコルビン酸)を含む分化誘導培地(Improved MEM/1%B-27/Penisilin Streptomycin培地)にPLK1阻害剤(CAS929095-18-1、3μM)又はPLK4阻害剤(CAS1338800-06-8、3μM)を添加して4日間培養した。
 2)iPS細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を分化因子(ALK5インヒビターII、T3、LDN、γ-secretase阻害剤RO、アスコルビン酸)を含み、かつPLK1阻害剤(CAS929095-18-1)又はPLK4阻害剤(CAS1338800-06-8)を含まない分化誘導培地(Improved MEM/1%B-27/Penisilin Streptomycin培地)で11日間培養してインスリン産生細胞集団に分化誘導した。
 上記1)及び2)の各方法で得られた細胞集団中のCHGA陰性(かつKi67陽性もしくはKi67陰性)細胞数をフローサイトメトリーにより計数し、各細胞集団中における目的外細胞、すなわちCHGA陰性(かつKi67陽性もしくはKi67陰性)率を求めた。
 また、上記1)及び2)の各方法で得られた細胞集団中のインスリン陽性かつNKX6.1陽性細胞数をフローサイトメトリーにより計数し、各方法における目的細胞、すなわちインスリン陽性かつNKX6.1陽性細胞率を求めた。
2.結果
 実験は各方法を用いてそれぞれ2回行った。インスリン産生細胞の製造工程においてPLK1阻害剤(CAS929095-18-1)又はPLK4阻害剤(CAS1338800-06-8)で処理した場合に得られたCHGA陰性(かつKi67陽性もしくはKi67陰性)細胞率及びインスリン陽性かつNKX6.1陽性細胞率の結果を表1に示す。
 インスリン産生細胞への分化誘導工程の最後の4日間をPLK1阻害剤(CAS929095-18-1)またはPLK4阻害剤(CAS1338800-06-8)を用いて処理した場合、CHGA陰性細胞率は、Ki67陽性及びKi67陰性細胞のいずれについても対照と比べて再現性よく顕著に減少することが確認された。この結果は、インスリン産生細胞の製造過程でPLK1阻害剤(CAS929095-18-1)又はPLK4阻害剤(CAS1338800-06-8)の処理を行うことによって、細胞集団中の目的外細胞(CHGA陰性細胞)を減少させる、又はそれら目的外細胞の増殖を抑制できることを示す。
 一方、インスリン産生細胞の製造過程でPLK1阻害剤(CAS929095-18-1)又はPLK4阻害剤(CAS1338800-06-8)の処理を行うことによって、細胞集団中の目的細胞(インスリン陽性かつNKX6.1陽性細胞)率は、目的外細胞の減少に伴って、対照と比べて再現性よく顕著に増加することが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 以上の結果より、インスリン産生細胞製造工程の最終分化段階にある細胞集団をPLK1阻害剤又はPLK4阻害剤で処理することによって、当該該細胞集団中に存在する目的外細胞(CHGA陰性細胞)を減少させること又はそれら目的外細胞の増殖を抑制することが可能であり、その結果、目的細胞(インスリン陽性かつNKX6.1陽性細胞)が富化された細胞集団が得られることが明らかとなった。
 実施例2:インスリン産生細胞集団をPLK阻害剤で処理して得られた細胞集団における目的外細胞(CHGA陰性細胞)の減少と目的細胞(インスリン陽性かつNKX6.1陽性細胞)の増加(2)
1.方法
 iPS細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を、30mL培養用リアクターを用いたこと、また、PLK阻害剤によるインスリン産生細胞集団の処理を7日間とした以外は、上記実施例1の手法と同様に培養を行った。すなわち、iPS細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を、30mL培養用リアクターにて、分化誘導培地で4日間培養してインスリン産生細胞集団に分化誘導した。次いで、PLK1阻害剤(CAS929095-18-1、3μM)又はPLK4阻害剤(CAS1338800-06-8、3μM)を添加した分化誘導培地にて7日間培養した。
 対照は、iPS細胞から分化誘導して得られた内分泌前駆細胞集団を、30mL培養用リアクターにて、分化誘導培地で11日間培養してインスリン産生細胞集団に分化誘導した。
2.結果
 30mL培養用リアクターを用いた系においても、インスリン産生細胞への分化誘導工程にてPLK1阻害剤又はPLK4阻害剤を用いて処理することによって、CHGA陰性細胞率は、Ki67陽性及びKi67陰性細胞のいずれについても対照と比べて再現性よく顕著に減少することが確認され、また、インスリン陽性(かつNKX6.1陽性)細胞率は、目的外細胞の減少に伴って、対照と比べて再現性よく顕著に増加することが確認された。また、上記実施例1と比べて、PLK1阻害剤又はPLK4阻害剤を用いた処理期間を長くしたが、その影響は認められず、PLK1阻害剤又はPLK4阻害剤での処理は少なくともインスリン産生細胞製造工程の最終分化段階にある細胞集団に対し行えば良いことが確認された。
実施例3:インスリン産生細胞集団のシングルセルRNA-seq発現解析
 既報(Stem Cell Research(2015)14、185-197)、上記工程1)-6)等に従い、多能性幹細胞から分化誘導して得られたインスリン産生細胞集団について、シングルセルRNA-seq発現解析を実施した結果、目的外細胞であるCHGA陰性細胞にPLK遺伝子が高発現していることが見いだされた。このことから、目的外細胞を減少/増殖抑制するために、PLKをターゲットとした阻害剤を使用したところ、上述のとおり顕著な効果が見られた。

 

Claims (17)

  1.  多能性幹細胞より分化誘導されたインスリン産生細胞集団をPLK阻害剤で処理する工程を含む、インスリン産生細胞集団の製造方法。
  2.  製造された細胞集団が、CHGA陰性細胞を20%以下の割合で含む、請求項1に記載の製造方法。
  3.  製造された細胞集団が、CHGA陰性かつKi67陽性の細胞を3%以下の割合で含む、請求項1又は2に記載の製造方法。
  4.  製造された細胞集団が、インスリン陽性かつNKX6.1陽性の細胞を15%以上の割合で含む、請求項1~3のいずれか一項に記載の製造方法。
  5.  さらに、PLK阻害剤で処理したインスリン産生細胞集団を分化させる工程を含む、請求項1~4のいずれかに記載の製造方法。
  6.  インスリン産生細胞集団を3μM以下のPLK阻害剤で処理する、請求項1~5のいずれか一項に記載の製造方法。
  7.  多能性幹細胞より分化誘導されたインスリン産生細胞集団中に存在するCHGA陰性細胞の増殖を抑制する方法であって、
     該細胞集団をPLK阻害剤で処理することを含む、方法。
  8.  インスリン産生細胞集団を3μM以下のPLK阻害剤で処理する、請求項7に記載の方法。
  9.  インスリン産生細胞集団中に存在するCHGA陰性細胞を20%以下の割合に減少させる、請求項7又は8に記載の方法。
  10.  インスリン産生細胞集団中に存在するCHGA陰性かつKi67陽性の細胞を3%以下の割合に減少させる、請求項7~9のいずれか一項に記載の方法。
  11.  インスリン産生細胞集団中に存在するインスリン陽性かつNKX6.1陽性の細胞を15%以上の割合に増大させる、請求項7~10のいずれか一項に記載の方法。
  12.  CHGA陰性細胞を20%以下の割合で含む、PLK阻害剤で処理した、多能性幹細胞より分化誘導されたインスリン産生細胞集団又はそれ以降の分化段階にある細胞集団。
  13.  CHGA陰性かつKi67陽性の細胞を3%以下の割合で含む、請求項12に記載の細胞集団。
  14.  インスリン陽性かつNKX6.1陽性の細胞を15%以上の割合で含む、請求項12又は13に記載の細胞集団。
  15.  移植用に使用される、請求項12~14のいずれか一項に記載の細胞集団。
  16.  請求項12~15のいずれか一項に記載の細胞集団を含む糖尿病を治療するための医薬。
  17.  PLK阻害剤で処理した、多能性幹細胞より分化誘導されたインスリン産生細胞集団を移植する工程を含む、糖尿病の治療方法。

     
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