TW202246489A - 成熟化劑 - Google Patents

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山添則子
豊田太郎
小長谷周平
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Abstract

本發明之目的為提供一種用以從多能性幹細胞分化誘導出產生胰島素之細胞集團之新穎方法，本發明係提供一種產生胰島素之細胞集團之製造方法，該製造方法包含以胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團為處理對象，於包含具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物之培養基中進行培養之步驟。

Description

成熟化劑
本發明係關於從多能性幹細胞製造產生胰島素之細胞集團之方法。更詳細而言，本發明係關於一種產生胰島素之細胞集團之製造方法，該製造方法係以將從多能性幹細胞分化誘導所得之胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團，以具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物進行處理為特徵。
目前正持續進行著自iPS細胞或ES細胞等多能性幹細胞分化誘導胰島素產生細胞或胰臟β細胞，並應用於糖尿病治療之研究。
迄今已開發/報導為了自多能性幹細胞分化誘導成產生胰島素之細胞集團之各種手法(非專利文獻1)。惟，分化誘導所得之產生胰島素之細胞集團中，除了目標之產生胰島素之細胞等以外，亦包含各種細胞。從安全性之觀點而言，將產生胰島素之細胞集團應用於糖尿病治療時，極為重要的是嚴格地控制細胞集團所含的細胞種類。因此，期望有可減少目標外細胞混入的新穎的產生胰島素之細胞集團之分化誘導方法。
[先前技術文獻]
[非專利文獻]
[非專利文獻1] Stem Cell Research(2015)14, 185-197
本發明之目的為提供一種用以從多能性幹細胞分化誘導產生胰島素之細胞集團之新穎方法。
本發明者們為了解決上述課題積極檢討的結果，發現藉由將從多能性幹細胞分化誘導所得之產生胰島素之細胞集團，供給至使用了基礎培養基之延長培養，即使是該細胞集團中微量殘存之目標外細胞(增殖性之非內分泌系細胞)亦可高靈敏度地被檢測出。
又，本發明者們發現，在從多能性幹細胞誘導產生胰島素之細胞集團之過程中，藉由將胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團於包含具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物(以下，亦有記載為「微小管抑制劑」之情形)之培養基中進行培養，可減少存在於所得之產生胰島素之細胞集團中之前述目標外細胞。
本發明為根據此等新穎知識者，並包含下列發明。
[1]一種產生胰島素之細胞集團之製造方法，係包含以胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團為處理對象，於包含具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物之培養基中進行培養之步驟。
[2]如[1]之方法，其中，具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物為選自類紫杉醇(taxoid)系抗癌劑之化合物或其藥理學所容許之鹽。
[3]如[1]或[2]之方法，其中，具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物為歐洲紫杉醇(docetaxel)或其藥理學所容許之鹽。
[4]如[1]至[3]之任一方法，其中，所製造之產生胰島素之細胞集團包含95%以上之CHGA陽性細胞。
[5]如[1]至[3]之任一方法，其中，所製造之產生胰島素之細胞集團包含0.1%以下之CHGA陰性且Ki67陽性細胞。
[6]如[1]至[5]之任一方法，其中，屬於處理對象之胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團為多能性幹細胞經分化誘導所製造者。
[7]一種胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團的培養基，係包含具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物。
[8]如[7]之培養基，其中，具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物為選自類紫杉醇系抗癌劑之化合物或其藥理學所容許之鹽。
[9]如[7]或[8]之培養基，其中，具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物為歐洲紫杉醇或其藥理學所容許之鹽。
[10]如[7]至[9]之任一培養基，係用以增大CHGA陽性細胞之比例、及/或增大胰島素陽性且NKX6.1陽性細胞之比例而使用者。
[10-1]一種產生胰島素之細胞集團中之非內分泌系細胞之檢測方法，係包含將前述產生胰島素之細胞集團於含生長因子(growth factor)之培養基中進行培養之步驟。
[10-2]一種前述產生胰島素之細胞集團中之非內分泌系細胞之檢測方法，係包含將產生胰島素之細胞集團於含上皮成長因子(Epidermal Growth Factor；EGF)或者與其具有同等或類似活性之物質之培養基中進行培養之步驟。
[11]一種前述產生胰島素之細胞集團中之非內分泌系細胞之檢測方法，係包含將產生胰島素之細胞集團於含上皮成長因子(EGF)之培養基中進行培養之步驟。
[12]如[11]之方法，其中，非內分泌系細胞為CHGA陰性且PDX1陽性細胞及/或CHGA陰性且PDX1陰性細胞。
[13]一種非內分泌系細胞之去除方法，係包含以胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團為處理對象，於包含具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物之培養基中進行培養之步驟。
[13-1]一種含生長因子之產生胰島素之細胞集團之培養基，係為了檢測產生胰島素之細胞集團中之非內分泌系細胞而使用者。
[13-2]一種含上皮成長因子(Epidermal Growth Factor；EGF)或者與其具有同等或類似活性之物質之產生胰島素之細胞集團的培養基，係為了檢測產生胰島素之細胞集團中之非內分泌系細胞而使用者。
[14]一種含EGF之產生胰島素之細胞集團之培養基，係為了檢測產生胰島素之細胞集團中之非內分泌系細胞而使用者。
本說明書包含屬於本申請案之優先權基礎之於2021年2月9天申請之日本專利申請第2021-019120號說明書等所記載之內容。
本說明書中引用之所有出版物、專利及專利申請案係直接作為參考併入本說明書中。
藉由本發明，可提供一種用以從多能性幹細胞分化誘導產生胰島素之細胞集團之新穎方法。藉由本發明，可獲得目標外細胞之混入經減少的產生胰島素之細胞集團。
圖1顯示將於含上皮成長因子(EGF)之基礎培養基經延長培養之產生胰島素之細胞集團中之標記蛋白(PDX1及CHGA)之表現，藉由流式細胞分析儀解析之結果。
圖2顯示將經順鉑(cisplatin)或歐洲紫杉醇處理所得之產生胰島素之細胞集團於含EGF之基礎培養基進行延長培養後，該各細胞集團中之標記蛋白(PDX1及CHGA)之表現藉由流式細胞分析儀解析之結果，以及延長培養後之該各細胞集團之照片。對照組(control)細胞集團為順鉑及歐洲紫杉醇皆未使用所得之產生胰島素之細胞集團，並同樣地進行延長培養。
圖3顯示將經順鉑或歐洲紫杉醇處理所得之產生胰島素之細胞集團於含EGF之基礎培養基進行延長培養後，該各細胞集團中之標記蛋白(PDX1 及Ki67)之表現藉由流式細胞分析儀解析之結果。對照組細胞集團為順鉑及歐洲紫杉醇皆未使用所得之產生胰島素之細胞集團，並同樣地進行延長培養。
圖4顯示經歐洲紫杉醇處理所得之產生胰島素之細胞集團中之標記蛋白(INS及NKX6.1、以及CHGA及Ki67)之表現，藉由流式細胞分析儀解析之結果。對照組細胞集團為未使用歐洲紫杉醇所得之產生胰島素之細胞集團。
圖5顯示(A)步驟6)開始後第7天所得之細胞集團中之標記蛋白(NKX6.1、C-肽(胰島素)、PDX1、CHGA)之表現藉由流式細胞分析儀解析之結果、以及(B)步驟6)開始後第4天後之7天間、或步驟6)開始後第7天後之4天間，將經歐洲紫杉醇處理所得之產生胰島素之細胞集團於含EGF之基礎培養基進行延長培養後，該各細胞集團中之標記蛋白(PDX1及CHGA)之表現藉由流式細胞分析儀解析之結果。對照組細胞集團為未使用歐洲紫杉醇所得之產生胰島素之細胞集團，並同樣地進行延長培養。
圖6顯示經歐洲紫杉醇處理所得之產生胰島素之細胞集團(歐洲紫杉醇(+))或未添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團(歐洲紫杉醇(-))被皮下移植至胰島素缺乏性糖尿病已被誘發之免疫不全NOD/SCID小鼠之血漿中之人類C-肽濃度(A)、以及於移植6個月後之時間點所摘取出之該移植片之重量(B)的測量結果。
1.用語
以下針對本說明書中所記載之用語進行說明。
於本說明書中，所謂的「約」或「大約」係表示相對於基準值而分別增加或減少變動至25%、20%、10%、8%、6%、5%、4%、3%、2%或1%為止之值。較佳為「約」或「大約」之用語表示相對於基準值而分別增加或減少15%、10%、5%、或1%之範圍。
於本說明書中，所謂的「包含(comprise(s)或comprising)...」，意指包含該語句後續之要素，但不限於此。因此，雖教示包含該語句後續之要素，但並未教示排除其它任意要素。
於本說明書中，所謂的「由…所組成(consist(s) of或consisting of)」意指包含該語句後續之所有要素，且限定於此等要素。因此，「由…所組成」之語句表示所列舉之要素為所其要求者或必須者，並且實質上不存在其他要素。
於本說明書中，所謂的「不使用餵養細胞(feeder cell)」意指基本上不包含餵養細胞、不使用藉由培養餵養細胞而預處理(preconditioning)之培養基等。因此，培養基中不包含從餵養細胞所分泌之成長因子及細胞激素等物質。
此外，所謂的「餵養細胞」或「餵養」，意指與其他種類之細胞共同培養並提供可支持該細胞且使其成長之環境之細胞。餵養細胞與其所支持之細胞可源自同種細胞，亦可源自不同種細胞。例如，人類細胞之餵養可使用人類皮膚纖維母細胞或人類胚胎幹細胞，亦可使用小鼠胚纖維母細胞之初代培養物、及永生化小鼠胚纖維母細胞。餵養細胞可藉由放射線照射或絲裂霉素(Mitomycin)C處理等進行不活化。
於本說明書中，所謂的「貼附(adherent)」係指細胞附著於容器，例如，細胞在合適的培養基存在下附著於已滅菌之塑膠(或經塗覆之塑膠)之細胞培養皿或燒瓶。於細胞之中，亦有若未貼附於細胞培養容器就無法 在培養物中維持或無法生長者。相對於此，非貼附性細胞係不須與容器貼附就可維持在培養物中且增殖。
於本說明書中，所謂的「培養」係指細胞於試管內(in-vitro)環境中維持、成長、及/或分化。所謂的「進行培養」意指於組織或體外，例如於細胞培養皿或瓶中使細胞維持、增殖、及/或分化。培養包含二維培養(平面培養)及三維培養(懸浮培養)。
於本說明書中，所謂的「進行富集化(enrich)」及「富集化(enrichment)」係指使細胞之組成物等組成物中之特定構成成分的量增加，所謂的「經富集化(enriched)」，在為了說明細胞之組成物(例如，細胞集團)而使用時，係特定構成成分的量相較於富集化前之細胞集團中之該構成成分之比例而為增加之細胞集團。例如，可將細胞集團等組成物針對標的細胞型進行富集化，因此，相較於富集化前之細胞集團內所存在之標的細胞之比例，標的細胞型之比例增加。細胞集團也可藉由本技術領域中習知之細胞選擇及篩選方法而針對標的細胞型進行富集化。細胞集團亦可藉由本說明書所述之特定之篩選或選擇流程進行富集化。於本發明之特定實施形態中，依據將標的細胞集團進行富集化之方法，使細胞集團中關於標的細胞集團至少被富集化20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%。
於本說明書中，所謂的「進行耗乏(deplete)」及「耗乏(depletion)」係指使細胞之組成物等組成物中之特定構成成分的量減少，所謂的「經耗乏(depleted)」，在為了說明細胞之組成物(例如，細胞集團)而使用時，係指特定構成成分的量相較於耗乏前之細胞集團中之該構成成分之比例為減少之細胞集團。例如，可將細胞集團等組成物針對標的細胞型進行耗乏，因此，相較於耗乏前之細胞集團內所存在之標的細胞之比例，標 的細胞型之比例減少。細胞集團也可藉由本技術領域中習知之細胞選擇及篩選方法而針對標的細胞型進行耗乏。細胞集團亦可藉由本說明書所述之特定之篩選或選擇流程進行耗乏。於本發明之特定實施形態中，依據將標的細胞集團進行耗乏之方法，使細胞集團中關於標的細胞集團而減少(耗乏)至少50%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%。
於本說明書中，所謂的「進行純化(purify)」及「純化(purification)」，係指去除細胞之組成物等組成物中之雜質，而使特定構成成分成為純粹者，所謂的「經純化(purified)」，在為了說明細胞之組成物(例如，細胞集團)而使用時，係指使雜質量相較於純化前之細胞集團中之該構成成分之比例而為減少且使特定構成成分之純度提升之細胞集團。例如，可將細胞集團等組成物針對標的細胞型進行純化，因此，相較於純化前之細胞集團內所存在之標的細胞之比例，標的細胞型之比例增加。細胞集團也可藉由本技術領域中習知之細胞選擇及篩選方法而針對標的細胞型進行純化。細胞集團亦可藉由本說明書所述之特定之篩選或選擇流程進行純化。於本發明之特定實施形態中，依據將標的細胞集團進行純化之方法，使標的細胞集團之純度變成至少70%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%，或是可變成無法檢測到雜質(包含汙染細胞(contaminating cell))之程度。
於本說明書中，所謂的「標記(marker)」意指「標記蛋白質」、「標記基因」等藉由預定細胞型而特異性地表現之細胞抗原或其基因。標記較佳為細胞表面標記，此時，可實施生存細胞之濃縮、分離、及/或檢測。標記可為陽性選擇標記或陰性選擇標記。
標記蛋白質之檢測，係可利用經使用該標記蛋白質之特異性抗體之免疫學分析法，例如，ELISA、免疫染色、流式細胞分析儀而進行。標記基因之檢測係可利用該領域中習知之核酸增幅方法及/或核酸檢測方 法，例如，RT-PCR、微陣列、生物晶片等而進行。於本說明書中，所謂的標記蛋白質為「陽性」意指以流式細胞分析儀檢測為陽性，所謂的「陰性」意指為流式細胞分析儀之檢測極限以下。又，於本說明書中，所謂的標記基因為「陽性」意指經RT-PCR檢測出，所謂的「陰性」意指為RT-PCR之檢測極限以下。
於本說明書中，所謂的「表現(expression)」係定義為藉由細胞內之啟動子所驅動之特定核苷酸序列之轉錄及/或轉譯。
於本說明書中，所謂的「具有CDK8/19抑制活性之因子」意指具有CDK8/19抑制活性之所有物質。相對於同為CDK家族之其他蛋白質，CDK8對細胞增殖而言並非必要，CDK8之抑制在一般條件下並無太大的效果。CDK19與CDK8類似，CDK8抑制通常亦伴隨著CDK19之抑制。於本發明中，具有CDK8/19抑制活性之因子可使用以往習知者，可找自專利文獻或非專利文獻。可舉例如：US2012/0071477、WO2015/159937、WO2015/159938、WO2013/116786、WO2014/0038958、WO2014/134169、JP2015/506376、US2015/0274726、US2016/0000787、WO2016/009076、WO2016/0016951、WO2016/018511、WO2016/100782及WO2016/182904所記載之化合物中，具有CDK8/19抑制活性之化合物(或其鹽)。更具體而言，具有CDK8/19抑制活性之因子可列舉：(E)-(4-(3-(5-(4-氟苯基)-1-甲基-1H-吡唑-4-基)丙烯醯胺)苯甲基)磷酸二乙酯、2-(4-(4-(異喹啉-4-基)苯基)-1H-吡唑-1-基)-N,N-二甲基乙醯胺、4-((2-(6-(4-甲基哌
Figure 111104774-A0202-12-0010-16
-1-羰基)萘-2-基)乙基)胺基)喹唑啉-6-甲腈、4-(4-(2,3-二氫苯并[b][1,4]戴奧辛-6-基)-1H-吡唑-3-基)苯-1,3-二醇、3-(2-(咪唑并[1,2-b]嗒
Figure 111104774-A0202-12-0010-17
-6-基硫基)乙基)-4-(萘-1-基磺醯基)-3,4-二氫喹
Figure 111104774-A0202-12-0010-18
啉-2(1H)-酮、(E)-3-(4-(1-環丙基-1H-吡唑-4-基)吡啶-3-基)-N-(4-(嗎啉甲基)苯基)丙烯醯胺、8-(2,4-二氟苯氧 基)-1-甲基-4,5-二氫-1H-噻吩并[3,4-g]吲唑-6-甲醯胺、4-((4-氟苯基)磺醯基)-3-(2-(咪唑并[1,2-b]嗒
Figure 111104774-A0202-12-0011-20
-6-基對胺基苯磺醯基)乙基)-3,4-二氫喹
Figure 111104774-A0202-12-0011-21
啉-2(1H)-酮、2-(苯甲基胺基)-4-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-基)苯甲醯胺、3-(3-(苯甲基氧基)苯基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶、4-(4-(2,3-二氫-1,4-苯并戴奧辛-6-基)-1H-吡唑-3-基)苯-1,3-二醇、N-丁基-8-(4-甲氧基苯基)-1,6-
Figure 111104774-A0202-12-0011-22
啶-2-甲醯胺、8-(4-甲基苯基)-N,N-二丙基-1,6-
Figure 111104774-A0202-12-0011-23
啶-2-甲醯胺或其等鹽等。
具有CDK8/19抑制活性之因子不限定於上述化合物，亦可使用下列者作為CDK8/19抑制劑：相對於CDK8/19之mRNA的反義寡核苷酸或siRNA、與CDK8/19結合之抗體、CDK8/19顯性負突變體等。具有CDK8/19抑制活性之因子或CDK8/19抑制劑可利用可商業購入者或是根據習知方法所合成者。
於本說明書中，「生長因子」為促進特定細胞之分化及/或增殖之內源性蛋白質。「生長因子」可舉例如：上皮生長因子(EGF)、酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)、鹼性纖維母細胞生長因子(bFGF)、肝細胞生長因子(HGF)、類胰島素生長因子1(IGF-1)、類胰島素生長因子2(IGF-2)、角質細胞生長因子(KGF)、神經生長因子(NGF)、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉化生長因子β(TGF-β)、血管內皮細胞生長因子(VEGF)、運鐵蛋白、各種介白素(例如，IL-1至IL-18)、各種菌落刺激因子(例如，顆粒球/巨噬細胞-菌落刺激因子(GM-CSF))、各種干擾素(例如，IFN-γ等)及對幹細胞有效果之其他細胞激素，例如，幹細胞因子(SCF)及紅血球生成素(Epo)。
於本說明書中，所謂的「ROCK抑制劑」意指抑制Rho激酶(ROCK：Rho-associated,coiled-coil containing protein kinase)之物質，可為抑制ROCK I與ROCK II之任一者之物質。ROCK抑制劑只要具有上 述功能則無特別限制，可舉例如下列者作為ROCK抑制劑：N-(4-吡啶基)-4β-[(R)-1-胺基乙基]環己烷-1α-甲醯胺(本說明書中有時亦稱為Y-27632)、Fasudil(HA1077)、(2S)-2-甲基-1-[(4-甲基-5-異喹啉基]磺醯基]六氫-1H-1,4-二氮呯(H-1152)、4β-[(1R)-1-胺基乙基]-N-(4-吡啶基)苯-1α-甲醯胺(Wf-536)、N-(1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-4-基)-4PER(R)-1-胺基乙基]環己烷-1α-甲醯胺(Y-30141)、N-(3-{[2-(4-胺基-1,2,5-
Figure 111104774-A0202-12-0012-24
二唑-3-基)-1-乙基-1H-咪唑并[4,5-c]吡啶-6-基]氧基}苯基)-4-{[2-(4-嗎啉基)乙基]-氧基}苯甲醯胺(GSK269962A)、N-(6-氟-1H-吲唑-5-基)-6-甲基-2-氧基-4-[4-(三氟甲基)苯基]-3,4-二氫-1H-吡啶-5-甲醯胺(GSK429286A)。ROCK抑制劑不限定於此等，亦可使用ROCK之mRNA之反義寡核苷酸或siRNA、與ROCK結合之抗體、ROCK之顯性負突變體等。ROCK抑制劑可為可商業購入者或是可根據習知方法而合成者。
於本說明書中，所謂的「GSK3β抑制劑」係對GSK3β(肝醣合成酶激酶3β)具有抑制活性之物質。GSK3(肝醣合成酶激酶3)為絲胺酸/蘇胺酸蛋白激酶的一種，參與肝醣之產生、細胞凋亡、幹細胞之維持等許多的訊息傳遞路徑。GSK3中存在α與β之2個同功型(Isoform)。本發明中所用之「GSK3β抑制劑」只要具有GSK3β抑制活性則無特別限制，可為具有GSK3β抑制活性並兼具有GSK3α抑制活性之物質。
GSK3β抑制劑可例示：CHIR98014(2-[[2-[(5-硝基-6-胺基吡啶-2-基)胺基]乙基]胺基]-4-(2,4-二氯苯基)-5-(1H-咪唑-1-基)嘧啶)、CHIR99021(6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(4-甲基-1H-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]胺基]乙基]胺基]菸鹼甲腈)、TDZD-8(4-苯甲基-2-甲基-1,2,4-噻二唑-3,5-二酮)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯基-2,5-二酮)、TWS-119(3-[6-(3-胺基苯基)-7H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-4-基 氧基]酚)、肯帕羅酮(kenpaullone)、1-氮肯帕羅酮(azakenpaullone)、SB216763(3-(2,4-二氯苯基)-4-(1-甲基-1H-吲哚-3-基)-1H-吡咯基-2,5-二酮)、SB415286(3-[(3-氯-4-羥基苯基)胺基]-4-(2-硝基苯基)-1H-吡咯基-2,5-二酮)及AR-AO144-18、CT99021、CT20026、BIO、BIO-丙酮肟、吡啶并咔唑-環戊二烯釕複合體、OTDZT、α-4-二溴苯乙酮、鋰等。GSK3β不限定於此等，亦可使用GSK3β之mRNA之反義寡核苷酸或siRNA、與GSK3 β結合之抗體、GSK3β之顯性負突變體等作為GSK3β抑制劑。GSK3β抑制劑可為可商業購入手者或是可根據習知方法而合成。
於本說明書中，所謂的「FGFR1抑制劑」係至少對纖維母細胞生長因子受體(FGFR)1具有抑制活性之物質。FGFR1作為對屬於生長因子之FGF1至FGF17具有高親和性之受體而言，係4次跨膜型酪胺酸激酶家族(FGFR1,2,3,4)之成員。於本說明書中，所謂的「FGFR1抑制劑」係至少具有FGFR1抑制活性即可，亦可具有對其他FGFR之抑制活性。例如，於本說明書中，所謂的「FGFR1抑制劑」，只要具有FGFR1抑制活性，亦可為FGFR2抑制劑、FGFR3抑制劑、FGFR4抑制劑等。於本發明中，FGFR1抑制劑可使用以往習知者。更具體而言，FGFR1抑制劑可例示：PD-166866(1-[2-胺基-6-(3,5-二甲氧基苯基)-吡啶并(2,3-d)嘧啶-7-基]-3-第三丁基脲：CAS No.：192705-79-6)、E-3810(CAS No.：1058137-23-7)、PD-173074(CAS No.：219580-11-7)、FGFR4-IN-1(CAS No.：1708971-72-5)、FGFR-IN-1(CAS No.：1448169-71-8)、FIIN-2(CAS No.：1633044-56-0)、AZD4547(CAS No.：1035270-39-3)、FIIN-3(CAS No.：1637735-84-2)、NVP-BGJ398(CAS No.：1310746-10-1)、NVP-BGJ398(CAS No.：872511-34-7)、CH5183284(CAS No.：1265229-25-1)、德贊替尼(derazantinib，CAS No.：1234356-69-4)、德贊替尼外消旋物、阿魏酸 (ferulic acid，CAS No.：1135-24-6)、SSR128129E(CAS No.：848318-25-2)、無SSR128129E酸(CAS No.：848463-13-8)、厄達替尼(erdafitinib，CAS No.：1346242-81-6)、BLU9931(CAS No.：1538604-68-0)、PRN1371(CAS No.：1802929-43-6)、S49076(CAS No.：1265965-22-7)、LY2874455(CAS No.：1254473-64-7)、林西替尼(linsitinib，CAS No.：867160-71-2)、多韋替尼(dovitinib，CAS No.：405169-16-6)、安羅替尼(anlotinib，CAS No.：1058156-90-3)、布立尼布(brivanib，CAS No.：649735-46-6)、德贊替尼(CAS No.：1234356-69-4)、安羅替尼二鹽酸鹽(CAS No.：1360460-82-7)、ACTB-1003(CAS No.：939805-30-8)、BLU-554(CAS No.：1707289-21-1)、羅伽替尼(rogaratinib，CAS No.：1443530-05-9)、BIBF 1120乙磺酸鹽(CAS No.：656247-18-6)、TG 100572鹽酸鹽(CAS No.：867331-64-4)、ENMD-2076(CAS No.：934353-76-1)、布立尼布丙胺酸鹽(CAS No.：649735-63-7)、TG 100572(CAS No.：867334-05-2)、BIBF 1120(CAS No.：656247-17-5)、ENMD-2076酒石酸鹽(CAS No.：1291074-87-7)、TSU-68(CAS No.：252916-29-3)、普納替尼(ponatinib，CAS No.：943319-70-8)、索凡替尼(sulfatinib，CAS No.：1308672-74-3)、LY2784544(CAS No.：1229236-86-5)、多韋替尼乳酸鹽(CAS No.：692737-80-7)、SU 5402(CAS No.：215543-92-3)、FGF-401(CAS No.：1708971-55-4)、酪胺酸激酶-IN-1(CAS No.：705946-27-6)、PP58(CAS No.：212391-58-7)、TG 100801鹽酸鹽(CAS No.：1018069-81-2)、克諾拉尼(crenolanib，CAS No.：670220-88-9)、TG 100801(CAS No.：867331-82-6)、帕唑帕尼鹽酸鹽(CAS No.：635702-64-6)、帕唑帕尼(pazopanib，CAS No.：444731-52-6)、PD168393(CAS No.：194423-15-9)、阿帕替尼(apatinib，CAS No.：1218779-75-9)、帕博西尼羥乙基磺酸鹽(palbociclib isethionate，CAS No.： 827022-33-3)、福瑞替尼(foretinib，CAS No.：849217-64-7)、樂伐替尼(lenvatinib，CAS No.：417716-92-8)、坦度替尼(tandutinib，CAS No.：387867-13-2)等或其等之鹽。
FGFR1抑制劑不限定於上述化合物，亦可使用相對於FGFR1之mRNA的反義寡核苷酸或siRNA、與FGFR1結合之抗體、FGFR1之顯性負突變體等作為FGFR1抑制劑。FGFR1抑制劑可為可商業購入者或是可根據習知方法而合成。
於本說明書中，所謂的「血清替代物」可舉例如：KnockOutTM血清替代物(KSR：賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific))、StemSure(註冊商標)血清替代物(和光純藥)、B-27添加劑、N2-添加劑、白蛋白(例如，富脂質白蛋白)、胰島素、運鐵蛋白、脂肪酸、原膠原、微量元素(例如，鋅、硒(例如，亞硒酸鈉))、2-巰基乙醇、3’硫基甘油或此等之混合物(例如，ITS-G)。血清替代物較佳為B-27添加劑、KSR、StemSure(註冊商標)血清替代物、ITS-G。於培養基添加血清替代物時，其在培養基中之濃度為0.01至10重量%，較佳為0.1至2重量%。於本發明中，較佳為使用「血清替代物」取代血清。
2.產生胰島素之細胞集團之製造方法、及藉此所製造之產生胰島素之細胞集團
本發明提供一種產生胰島素之細胞集團之製造方法、以及藉此所製作之產生胰島素之細胞集團，該製造方法包含在將從多能性幹細胞分化誘導所得之胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團分化誘導成產生胰島素之細胞集團之步驟中，以微小管抑制劑處理胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團。
於本發明中，在將從多能性幹細胞分化誘導所得之胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團分化誘導成產生胰島素之細胞集團之步驟中，微小管抑制劑係作用於胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團，而產生存在於內部之非內分泌系細胞經減少之產生胰島素之細胞集團。
於本發明中，所謂的「多能性(pluripotency)」意指可分化成具備各種不同形態或功能之組織或細胞，亦可分化成3胚層之任何系統之細胞的能力。「多能性(pluripotency)」係以因無法分化成胎盤而沒有形成個體之能力的特點而言，可與能分化成包含胎盤之生體所有組織之「全能性(totipotency)」區別。
於本發明中，所謂的「多潛能性(multipotency)」意指可分化成複數個限定數量之系統之細胞的能力。例如，間葉系幹細胞、造血幹細胞、神經幹細胞為多潛能性(multipotent)，但非多能性(pluripotent)。
於本發明中，所謂的「多能性幹細胞(pluripotent stem cell)」係指胚胎幹細胞(ES細胞)及與其具有同樣的分化多能性，亦即，具有分化成生體之各種組織(內胚層、中胚層、外胚層之全部)之潛在能力的細胞。與ES細胞具有同樣的分化多能性之細胞可列舉「人工多能性幹細胞」(本說明書中，有時亦稱為「iPS細胞(induced pluripotent stem cell)」)。於本發明中，多能性幹細胞較佳為人類多能性幹細胞。
就「ES細胞」而言，若是小鼠ES細胞，可利用inGenious公司、理化學研究所(理研)等所建構之各種小鼠ES細胞株，若是人類ES細胞，可利用美國國立衛生研究所(NIH)、理研、京都大學、Cellartis公司所建構之各種人類ES細胞株。例如，ES細胞株可利用：NIH之CHB-1至CHB-12株、RUES1株、RUES2株、HUES1至HUES28株等、WiCell Research Institute之H1株、H9株、理研之KhES-1株、KhES-2株、KhES-3株、KhES-4株、KhES-5株、SSES1株、SSES2株、SSES3株等。
所謂的「人工多能性幹細胞」係指藉由對於哺乳動物體細胞或未分化幹細胞導入特定因子(核初期化因子)而進行再程序化(reprogramming)所得之細胞。目前，有各式各樣的「人工多能性幹細胞」，除了由山中氏等所製之藉由對小鼠纖維母細胞中導入Oct3/4、Sox2、Klf4及c-Myc之4因子所建構之iPS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,Cell,(2006)126：663-676)之外，亦可使用：將同樣的4因子導入人類纖維母細胞所建構之衍生自人類細胞之PS細胞(Takahashi K,Yamanaka S.,et al.Cell,(2007)131：861-872.)；導入上述4因子後，以Nanog之表現為指標進行篩選所建構之Nanog-iPS細胞(Okita,K.,Ichisaka,T.,and Yamanaka,S.(2007).Nature 448,313-317.)；以不含c-Myc之方法所製作之iPS細胞(Nakagawa M,Yamanaka S.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,101-106))；以無病毒方式導入6因子所建構之iPS細胞(Okita K et al.,Nat.Methods 2011 May；8(5)：409-12,Okita K et al.,Stem Cells.31(3)：458-66.)。又，亦可使用：Thomson等所製作之導入OCT3/4、SOX2、NANOG及LIN28之4因子而建構之人工多能性幹細胞(Yu J,Thomson JA．et al,Science(2007)318：1917-1920.)、Daley們所製作之人工多能性幹細胞(Park IH,Daley GQ.et al.,Nature(2007)451：141-146)、櫻田氏等所製作之人工多能性幹細胞(日本特開第2008-307007號)等。
除此之外，亦可使用已公開之所有論文(例如，Shi Y.,Ding S.,et al.,Cell Stem Cell,(2008)Vol3,Issue 5,568-574；Kim JB.,Scholer HR.,et al.,Nature,(2008)454,646-650；Huangfu D.,Melton,DA.,et al.,Nature Biotechnology,(2008)26,No7,795-797)、或者專利(例如，日本特 開第2008-307007號、日本特開第2008-283972號、US2008/2336610、US2009/047263、WO2007/069666、WO2008/118220、WO2008/124133、WO2008/151058、WO2009/006930、WO2009/006997、WO2009/007852)所述之該技術領域中習知之人工多能性幹細胞之任一者。
人工多能性細胞株可利用NIH、理化學研究所(理研)、京都大學等所建構之各種iPS細胞株。例如，若是人類iPS細胞株，可列舉：理研之HiPS-RIKEN-1A株、HiPS-RIKEN-2A株、HiPS-RIKEN-12A株、Nips-B2株、京都大學之Ff-WJ-18株、Ff-I01s01株、Ff-I01s02株、Ff-I01s04株、Ff-I01s06株、Ff-I14s03株、Ff-I14s04株、QHJI01s01株、QHJI01s04株、QHJI14s03株、QHJI14s04株253G1株、201B7株、409B2株、454E2株、606A1株、610B1株、648A1株、CDI公司之MyCell iPS Cells(21525.102.10A)株、MyCell iPS Cells(21526.101.10A)株等。
於本發明中，所謂的「胰臟內分泌前驅細胞集團」，意指包含胰臟內分泌前驅細胞之細胞集團。於本發明中，胰臟內分泌前驅細胞意指藉由「染色顆粒素A(chromogranin A，CHGA)、NeuroD及NGN3之至少一種標記的表現」、及「胰臟關聯之激素系(例如，胰島素等)之標記的不表現」而附加特徵的細胞。胰臟內分泌前驅細胞亦可表現PAX-4、NKX22、Islet-1、PDX-1等標記。
於一實施形態中，本發明之「胰臟內分泌前驅細胞集團」係在下述詳述之將多能性幹細胞分化誘導成產生胰島素之細胞之步驟中，相當於步驟5)結束後之培養物、或步驟6)之培養物的細胞集團。
於本發明之「胰臟內分泌前驅細胞集團」中，胰臟內分泌前驅細胞係以30%以上，較佳為40%以上，更佳為50%以上，再更佳為60%以上，又再更佳為70%以上之比例而包含。該比例之上限並無特別限制， 係90%以下、80%以下、70%以下、或60%以下。該比例可使用自前述上限及下限之數值所各自選擇之2個數值表示，例如，該比例為30%至90%，較佳為40%至80%，更佳為50%至80%，再更佳為60%至70%。於胰臟內分泌前驅細胞集團中，除了胰臟內分泌前驅細胞，亦可包含其他細胞(例如，胰臟前驅細胞、胰島素產生細胞、Ki67陽性細胞、CHGA陰性細胞等)。
於本發明中，所謂的「處於其後的分化階段之細胞集團」意指包含相較於胰臟內分泌前驅細胞集團，包含更多分化階段較胰臟內分泌前驅細胞更為前進之細胞的細胞集團。「分化階段較胰臟內分泌前驅細胞更為前進之細胞」可列舉：胰島素產生細胞。於本發明中，胰島素產生細胞意指藉由胰島素及NKX6.1之至少一種標記的表現，較佳為藉由胰島素及NKX6.1之兩標記皆表現而附加特徵之細胞。胰島素產生細胞較佳為NGN3之表現量係未達利用胰臟內分泌前驅細胞中所確認之最大表現時之3分之1的比例。
於本發明之「處於其後的分化階段之細胞集團」中，胰島素產生細胞係以30%以上，較佳為40%以上，更佳為50%以上，再更佳為60%以上，又再更佳為70%以上之比例包含。該比例之上限並無特別限制，係90%以下、80%以下、70%以下、或60%以下。該比例可使用自前述上限及下限之數值所各自選擇之2個數值表示，例如，該比例為30%至90%，較佳為40%至80%，更佳為50%至80%，再更佳為60%至70%。於「處於其後的分化階段之細胞集團」中，除了胰島素產生細胞，亦可包含其他細胞(例如，胰臟內分泌前驅細胞、胰島素產生細胞、Ki67陽性細胞、CHGA陰性細胞等)。
於一實施形態中，本發明之「處於其後的分化階段之細胞集團」相當於下述詳述之將多能性幹細胞分化誘導成胰島素產生細胞之步驟 中，到步驟6)結束為止之3天、4天、5天、6天、7天、8天、或其以上之期間之培養物、或者步驟6)結束後之培養物的細胞集團。
此外，本說明書中所記載之細胞集團中之特定細胞之比例可根據如流式細胞分析儀之可算出細胞數之習知手法而求得。
於自多能性幹細胞分化成胰島素產生細胞之過程中，已知出現因應分化階段具有不同特徵之細胞(WO2009/012428、WO2016/021734)。例如，此分化階段係相對未分化之順序，可大致分類為多能性幹細胞、胚胎內胚層細胞、原腸胚細胞、後方前腸細胞、胰臟前驅細胞、胰臟內分泌前驅細胞、胰島素產生細胞。
胰臟內分泌前驅細胞集團可利用自多能性幹細胞分化誘導成胚胎內胚層細胞、原腸胚細胞、後方前腸細胞、胰臟前驅細胞、胰臟內分泌前驅細胞、及胰島素產生細胞的以下習知之分化誘導步驟而獲得：
步驟1)自多能性幹細胞分化誘導成胚胎內胚層細胞；
步驟2)自胚胎內胚層細胞分化誘導成原腸胚細胞；
步驟3)自原腸胚細胞分化誘導成後方前腸(Posterior Foregut)細胞；
步驟4)自後方前腸細胞分化誘導成胰臟前驅細胞；
步驟5)自胰臟前驅細胞分化誘導成胰臟內分泌前驅細胞；
步驟6)自胰臟內分泌前驅細胞分化誘導成胰島素產生細胞。
以下說明各步驟，但各細胞之分化誘導不限定於此等手法。
步驟1)分化成胚胎內胚層細胞
多能性幹細胞係於含低用量之活化素A之培養基中進行培養，分化成胚胎內胚層細胞。
本步驟所使用之培養基可使用：RPMI培養基、MEM培養基、iMEM培養基、DMEM培養基(Dulbecco Modified Eagle培養基)、 Improved MEM Zinc Option培養基、Improved MEM/1%B-27添加劑/青黴素鏈黴素培養基、MCDB131/10mM葡萄糖/20mM葡萄糖/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAX/抗壞血酸/青黴素鏈黴素培養基等哺乳類細胞之培養所使用之基本培養基。
活化素A於培養基中為低用量，可包含例如5至100ng/mL，較佳為5至50ng/mL，更佳為5至10ng/mL之量。
就其他態樣而言，活化素A之培養基中之濃度為約0.1至100ng/mL，較佳為約1至50ng/mL，更佳為約3至10ng/mL。
培養基中可進一步添加ROCK抑制劑、及/或GSK3β抑制劑。
GSK3β抑制劑之培養基中之濃度係根據使用之GSK3β抑制劑之種類而適當地設定，例如使用CHIR99021作為GSK3β抑制劑時，濃度通常為2至5μM，較佳為2至4μM，特佳為約3μM。
ROCK抑制劑之培養基中之濃度係根據使用之ROCK抑制劑之種類而適當地設定，例如使用Y27632作為ROCK抑制劑時，濃度通常為5至20μM，較佳為5至15μM，特佳為約10μM。
培養基中可進一步添加胰島素。培養基中可包含0.01至20μM，較佳為0.1至10μM，更佳為0.5至5μM之量之胰島素。培養基中之胰島素之濃度可為經添加之B-27添加劑所含之胰島素之濃度，但不限於此。
培養可以二維培養及三維培養之任一種進行。培養開始時之細胞數並無特別限定，若是二維培養，可培養至約5萬至100萬細胞個/cm2，較佳為約10萬至80萬細胞個/cm2，更佳為約10至30萬細胞個/cm2。又，培養開始時之細胞數並無特別限定，若是三維培養，可培養至約1萬至100萬細胞個/mL，較佳為約10萬至80萬細胞個/mL，更佳為約 30萬至60萬細胞個/mL。培養期間為1天至4天，較佳為1天至3天，特佳為3天。
培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如，37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如5%左右。
或者，本發明之胚胎內胚層細胞可藉由在低用量之活化素A存在下，將多能性幹細胞於胰島素進行作用之條件下的培養基中進行第一培養，接著，於胰島素不進行作用之條件下的培養基中進行第二培養而製造。
(1)第一培養
所謂的「胰島素進行作用之條件」意指藉由胰島素而產生細胞中之胰島素訊息傳遞路徑之活化的條件。通常，胰島素係與存在細胞膜表面上之胰島素受體結合，使存在於受體內之酪胺酸激酶活化，將胰島素受體基質蛋白質家族(IRS：IRS-1,2,3)進行酪胺酸磷酸化。本說明書中所謂的「產生…胰島素訊息傳遞路徑之活化」，係指產生藉由胰島素與胰島素受體之結合而開始之該等一連串反應。
胰島素進行作用之條件可舉例如培養基中包含胰島素之情形。胰島素只要是可活化多能性幹細胞中之胰島素訊息傳遞路徑者即可，可為經重組法而製造者，亦可為經固相合成法合成而製造者。胰島素可利用源自人類、非人類靈長類、豬、牛、馬、綿羊、山羊、羊駝、狗、貓、兔、小鼠、天竺鼠等者，較佳為人類胰島素。
於本發明中，只要可產生多能性幹細胞中之胰島素訊息傳遞路徑之活化，亦可使用胰島素突變體、胰島素衍生物或胰島素促效劑作為「胰島素」。所謂的「胰島素突變體」可列舉具有以下多肽者：由胰島素之胺基酸序列中1至20個，較佳為1至10個，再更佳為1至5個胺基酸 經缺失、取代、附加或插入之胺基酸序列構成，且可產生胰島素訊息傳遞路徑之活化之多肽；或是由與胰島素之胺基酸序列具有80%以上，更佳為90%以上，再更佳為95%以上，最佳為99%以上之序列相同性之胺基酸序列構成，且可產生胰島素訊息傳遞路徑之活化之多肽。胺基酸序列之比較可藉由習知手法進行，例如，以BLAST(Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information，美國國立生物學資訊中心之基本局部比對檢索工具))等而例，可使用預設值之設定而實施。所謂的「胰島素衍生物」意指由胰島素或胰島素突變體之胺基酸殘基一部分之基經化學性取代(例如，α-甲基化、α-羥基化)、缺失(例如，脫胺基化)、或修飾(例如，N-甲基化)之胺基酸序列構成，且可產生胰島素訊息傳遞路徑之活化之多肽或具有同樣作用的物質。所謂的「胰島素促效劑」意指與胰島素之結構無關，可與胰島素受體結合從而產生胰島素訊息傳遞路徑之活化之多肽或具有同樣作用的物質。
於第一培養之培養基中，可包含0.01至20μM，較佳為0.1至10μM，更佳為0.5至5μM之量之胰島素。培養基中之胰島素之濃度可為經添加之B-27添加劑所包含之胰島素之濃度，但不限於此。此外，本說明書中，包含胰島素之B-27添加劑有時記載為「B-27(INS+)」，不含胰島素之B-27添加劑有時記載為「B-27(INS-)」。
培養基中可進一步包含ROCK抑制劑、及/或GSK3β抑制劑。ROCK抑制劑之培養基中之濃度係根據使用之ROCK抑制劑之種類而適當地設定，例如使用Y-27632作為ROCK抑制劑時，濃度通常可為5至20μM，較佳可為5至15μM，特佳可為約10μM。GSK3β抑制劑之培養基中之濃度係根據使用之GSK3β抑制劑之種類而適當地設定，例如使用 CHIR99021作為GSK3β抑制劑時，濃度通常可為2至5μM，較佳可為2至4μM，特佳可為約3μM。
培養基可進一步包含選自由丙酮酸鹽(鈉鹽等)、L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸、及葡萄糖所組成群組中之一種以上。於培養基中，可以10至1000mg/L，較佳為30至500mg/L，更佳為50至200mg/L，特佳為約110mg/L之量包含丙酮酸鹽。於培養基中，可以50至2000mg/L，較佳為100至1500mg/L，更佳為500至1000mg/L，特佳為約860mg/L之量包含L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸。於培養基中，可以15mM以上，較佳為15至30mM，更佳為15至25mM，特佳為約25mM之量包含葡萄糖。培養基中之丙酮酸鹽、L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸及葡萄糖之濃度可為DMEM培養基(DMEM，高葡萄糖，GlutaMAXTM，丙酮酸(賽默飛世爾科技))或其他DMEM培養基所含之丙酮酸鹽、L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸及葡萄糖之濃度，但不限於此。
培養基可使用以上述基礎培養基為基礎並經添加上述成分之一種以上者。基礎培養基較佳為DMEM培養基，更佳為包含上述量之丙酮酸鹽、L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸及葡萄糖的DMEM培養基。
第一培養之培養期間可選自6小時至48小時，較佳為12至24小時之範圍。培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如，37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如5%左右。培養可以二維培養及三維培養之任一種進行。培養開始時之細胞數並無特別限制，若是二維培養，可培養至約5萬至100萬細胞個/cm2，較佳為約10萬至80萬細胞個/cm2，更佳為約10至30萬細胞個/cm2。
又，培養開始時之細胞數並無特別限制，若是三維培養，可培養至約1萬至100萬細胞個/mL，較佳為約10萬至80萬細胞個/mL，更佳為約30萬至60萬細胞個/mL。
(2)第二培養
所謂「胰島素不進行作用之條件」意指不產生藉由胰島素所致之細胞中之胰島素訊息傳遞路徑活化的條件。所謂的「不產生...細胞中之胰島素訊息傳遞路徑之活化」，不僅完全不產生意指該胰島素訊息傳遞路徑之活化，亦意指相較於胰島素不存在下之該胰島素訊息傳遞路徑之活化，只產生無法認定為具有顯著差異程度的少許活化的情形。因此，所謂「胰島素不進行作用之條件」可舉例如：培養基中不包含胰島素；或者即使在培養基中包含胰島素之情形中，其量係以前述只產生無法認定為具有顯著差異程度的少許活化之量包含之條件。或者是，亦意指即使在培養基中包含胰島素之情形中，藉由一起包含胰島素訊息抑制劑，而不產生前述胰島素訊息傳遞路徑之活化之情形。「胰島素訊息抑制劑」意指可在任一位置中斷胰島素訊息傳遞路徑之成分。如此之胰島素訊息抑制劑可列舉：與胰島素、胰島素受體、作為訊息傳遞物質作用之各種蛋白質等結合或競爭，抑制此等因子所參與之分子間之相互作用的多肽或化合物等。例如，如此之胰島素訊息抑制劑可列舉：競爭抑制PI3激酶之觸媒次單元對ATP結合的LY294002[2-(4-嗎啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮]等。胰島素訊息抑制劑不限定於此等，與胰島素、胰島素受體、作為訊息傳遞物質進行作用之各種蛋白質結合之抗體或其等之顯性負突變體、以及相對於胰島素受體或作為訊息傳遞物質進行作用之各種蛋白質之mRNA的反義寡核苷酸或siRNA等亦可使用為胰島素訊息抑制劑。胰島素訊息抑制劑可為可商業購入者或是可根據習知方法而合成。
培養基中可進一步包含ROCK抑制劑、及/或GSK3β抑制劑。培養基中之ROCK抑制劑、及/或GSK3β抑制劑之量可選自上述第一培養中所述之範圍，可與第一培養中所使用之量相同亦可不同。
培養基中可進一步包含選自由丙酮酸鹽、L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸、及葡萄糖所組成群組中之一種以上。培養基中之丙酮酸鹽、L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸、及葡萄糖之量可選自上述第一培養中所述之範圍，可與第一培養中所使用之量相同亦可不同。
第二培養中使用之培養基，可使用以培養哺乳類細胞所使用之基礎培養基為基礎並經添加上述成分之一種以上者。基礎培養基可使用上述第一培養中所述者，可使用與第一培養中所使用之基礎培養基相同亦可不同。較佳為DMEM培養基，更佳為包含上述量之丙酮酸鹽、L-丙胺醯基-L-麩醯胺酸、及葡萄糖之DMEM培養基。
第二培養之培養期間可選自至少6小時，較佳為6至72小時，再更佳為24小時至72小時之範圍。培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如，37℃)進行。培養可以二維培養及三維培養之任一種進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如5%左右。
於第一培養及第二培養之培養基中，可包含上述低用量之活化素A。第一培養及第二培養之培養基所包含之活化素A之量可為相同量亦可為不同量。
第一培養及第二培養之培養基可進一步添加二甲亞碸。
藉由將多能性幹細胞於低用量之活化素A之存在下進行培養，或者將多能性幹細胞於低用量之活化素A之存在下，於胰島素進行作用下之培養基中進行第一培養，接著於胰島素不進行作用之條件下之培養基中進行第二培養，可提高步驟6)之後所得之內分泌細胞之比例。
步驟2)分化成原腸胚細胞
將步驟1)所得之胚胎內胚層細胞進一步於包含生長因子之培養基中進行培養，分化誘導成原腸胚細胞。培養期間為2天至8天，較佳為約4天。
培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如，37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如5%左右。培養可以二維培養及三維培養之任一種進行。
培養基可使用上述步驟1)所記載之培養哺乳類細胞所使用之基礎培養基。培養基中，除了生長因子之外，亦可適當地添加血清替代物、維生素、抗生素等。
生長因子較佳為EGF、KGF、及/或FGF10，更佳為EGF及/或KGF，再更佳為KGF。
生長因子之培養基中之濃度係根據使用之生長因子之種類而適當地設定，通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即，約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即，約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即，約1.6至160nM)。FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即，約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)。例如使用KGF作為生長因子時之濃度通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，特佳為約50ng/mL。
步驟3)分化成後方前腸細胞
將步驟2)所得之原腸胚細胞進一步於包含生長因子、環杷胺(cyclopamine)、頭蛋白(noggin)等之培養基中進行培養，分化誘導成後方 前腸細胞。培養期間為1天至5天，較佳為約2天左右。培養可以二維培養及三維培養之任一種進行。
培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如，37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如5%左右。
培養基可使用上述步驟1)所述之培養哺乳類細胞所使用之基礎培養基。培養基中，除了生長因子之外，亦可適當地添加血清替代物、維生素、抗生素等。
生長因子較佳為EGF、KGF、及/或FGF10，更佳為EGF及/或KGF，再更佳為KGF。
生長因子之培養基中之濃度係根據使用之生長因子種類而適當地設定，通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM，EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即，約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即，約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即，約1.6至160nM)。FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即，約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)。例如使用KGF作為生長因子時之濃度通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，特佳為約50ng/mL。
環杷胺之培養基中之濃度並無特別限制，通常為0.5至1.5μM，較佳為0.3至1.0μM，特佳為約0.5μM。
頭蛋白之培養基中之濃度並無特別限制，通常為10至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，特佳為約100ng/mL。
又，培養基中可添加二甲亞碸。
步驟4)分化成胰臟前驅細胞
可將步驟3)所得之後方前腸細胞進一步可於包含具有CDK8/19抑制活性之因子之培養基，較佳為於包含具有CDK8/19抑制活性之因子及生長因子之培養基中進行培養，分化誘導成胰臟前驅細胞。培養期間為2天至10天，較佳為約5天左右。培養可以二維培養及三維培養之任一種進行。二維培養時，依據過往報導(Toyoda et al.,Stem cell Research(2015)14,185-197)，將步驟3)所得之後方前腸細胞以0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液處理後藉由吸液(pipetting)分散，將所得之分散液施以離心，將經回收之細胞再懸濁於步驟4)之新培養基，將該細胞懸濁液再播種於新的二維培養容器。
培養基係與步驟1)相同，可使用培養哺乳類細胞所使用之基礎培養基。培養基中，除了生長因子之外，亦可適當地添加血清替代物、維生素、抗生素等。
具有CDK8/19抑制活性之因子可使用前述之各種化合物或其鹽，依據使用之化合物或其鹽適當地決定添加至培養基之量，通常為約0.00001μM至5μM，較佳為0.00001μM至1μM。具有CDK8/19抑制活性之因子之培養基中之濃度較佳為達到對CDK8/19有50%以上之抑制活性的濃度。
生長因子較佳為EGF、KGF、及/或FGF10，更佳為KGF及/或EGF，再更佳為KGF及EGF。
生長因子之培養基中之濃度係根據使用之生長因子種類而適當地設定，通常為約0.1nM至1000μM，較佳為約0.1nM至100μM。EGF時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即，約0.8至320nM)，較佳為約5至1000ng/mL(亦即，約0.8至160nM)，更佳為約10至1000ng/mL(亦即，約1.6至160nM)。FGF10時，其濃度為約5至2000ng/mL(亦即，約0.3至116nM)，較佳為約10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)，更佳為約 10至1000ng/mL(亦即，約0.6至58nM)。例如使用KGF及EGF作為生長因子時之濃度，EGF通常為5至150ng/mL，較佳為30至100ng/mL，特佳為約50ng/mL，KGF通常為10至200ng/mL，較佳為50至150ng/mL，特佳為約100ng/mL。
步驟4)之培養之最初1天係在ROCK抑制劑之存在下進行，之後可在不含ROCK抑制劑之培養基中進行培養。
又，培養基中可包含PKC活化劑。PKC活化劑係使用PdBU(PKC活化劑II)、TPB(PKC活化劑V)等，但不限於此。PKC活化劑之濃度係以約0.1至100ng/mL，較佳為以約1至50ng/mL，更佳為以約3至10ng/mL添加。
又，培養基中可添加二甲亞碸、及/或活化素(1至50ng/mL)。
於任一步驟中，培養基中，亦可添加上述成分以外之血清替代物(例如，B-27添加劑、ITS-G)。又，因應所需，可添加胺基酸、L-麩醯胺酸、GlutaMAX(製品名)、非必須胺基酸、維生素、菸鹼醯胺、抗生素(例如，抗生素-抗黴菌劑(Antibiotic-Antimycotic，本說明書中有時稱為AA)、青黴素、鏈黴素、或此等之混合物)、抗菌劑(例如，雙性黴素B(amphotericin B))、抗氧化劑、丙酮酸、緩衝劑、無機鹽類等。於培養基添加抗生素時，該培養基中之濃度通常為0.01至20重量%，較佳為0.1至10重量%。
培養可以二維培養及三維培養之任一種進行。
又，細胞培養係二維培養時，不使用餵養細胞，以貼附培養進行。培養時使用皿、燒瓶、微量多孔盤、OptiCell(製品名)(Nunc公司)等細胞培養片材等培養容器。培養容器較佳為以用以提升與細胞之貼附性(親水性)之表面處理、膠原蛋白、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層連結蛋白(laminin)、纖維連接蛋白(fibronectin)、Matrigel基質凝膠(例如BD Matrigel基質凝膠(日本Becton‧Dickinson公司))、玻璃體結合蛋白(vitronectin)等細胞貼附用基質塗覆。培養容器較佳為經I型膠原蛋白、Matrigel基質凝膠、纖維連接蛋白、玻璃體結合蛋白或聚-D-離胺酸等塗覆之培養容器，更佳為經Matrigel基質凝膠或聚-D-離胺酸塗覆之培養容器。
培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如，37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如5%左右。
步驟4)所得之胰臟前驅細胞可利用屬於習知表面標記之糖蛋白質2(GP2)等，而進一步進行純化。上述純化可使用本身習知之方法，例如，使用固定化有抗GP2抗體之珠子進行。
步驟5)分化成胰臟內分泌前驅細胞
將步驟4)所得之胰臟前驅細胞進一步於包含生長因子之培養基中進行培養，分化誘導成胰臟內分泌前驅細胞。培養可以二維培養及三維培養之任一種進行。二維培養時，將步驟4)所得之胰臟前驅細胞以0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液處理後藉由吸液分散，將所得之分散液施以離心，將經回收之細胞再懸濁於步驟5)之新培養基，將該細胞懸濁液再播種於新二維培養容器。培養期間為2天至3天，較佳為約2天。
培養基可使用上述步驟1)所述之培養哺乳類細胞所使用之基礎培養基。培養基中，依據過往報導(Nature Biotechnology,2014；32：1121-1133)，添加SANT1、視黃酸、ALK5抑制劑II、T3、LDN，可進一步適當地添加Wnt抑制藥、ROCK抑制劑、FGF(較佳為FGF2)、血清替代物、維生素、抗生素等。又，培養基中可添加二甲亞碸。
培養係不使用餵養細胞，以非貼附培養進行。培養時使用皿、燒瓶、微量多孔盤、多孔盤(Nunc公司)等或者生物反應器。培養容器較佳為進行用以降低與細胞之貼附性之表面處理。
培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如，37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如5%左右。
步驟5)所得之胰臟內分泌前驅細胞係可利用習知之表面標記之糖蛋白質2(GP2)等，而進一步進行純化。上述純化可使用本身習知之方法進行，例如，固定化有抗GP2抗體之珠子而進行。
步驟6)分化成胰島素產生細胞
將步驟5)所得之胰臟內分泌前驅細胞進一步於包含FGFR1抑制劑之培養基中進行培養，分化誘導成胰島素產生細胞。培養期間為10天至30天，較佳為約10至20天。
培養基可使用上述步驟1)所記載之培養哺乳類細胞所使用之基礎培養基。培養基中，依據過往報導(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑XX、γ-分泌酶抑制劑RO、N-半胱胺酸、AXL抑制劑、抗壞血酸，可進一步適當地添加Wnt抑制藥、ROCK抑制劑、FGF(較佳為FGF2)、血清替代物、維生素、抗生素等。例如，培養基中可添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、及抗壞血酸，或者可添加T3、ALK5抑制劑II、ZnSO4、肝素、N-乙醯基半胱胺酸、水溶性維生素E衍生物(trolox)、及R428。
培養可以二維培養及三維培養之任一種進行。培養較佳為不使用餵養細胞，以非貼附培養進行。培養時使用皿、燒瓶、微量多孔盤、多孔盤(Nunc公司)等或者生物反應器。培養容器較佳為進行用以降低與細胞之貼附性之表面處理。
培養溫度並無特別限制，於30至40℃(例如，37℃)進行。又，培養容器中之二氧化碳濃度為例如5%左右。
培養基中，可包含能抑制FGFR1活性之任意量之FGFR1抑制劑，例如，可包含10μM以下、或5μM以下之量，較佳可為未達5μM、未達4μM、未達3μM、未達2μM之量。FGFR1抑制劑之添加量之下限並無特別限制，可為0.1μM以上，較佳可為0.5μM以上。FGFR1抑制劑之添加量較佳為未達5μM且0.1μM以上，更佳為未達5μM且0.5μM以上。在FGFR1抑制劑之存在下之培養可進行至少12小時，較佳可為24小時以上、2天以上、4天以上、8天以上、10天以上、或15天以上。在FGFR1抑制劑之存在下之培養較佳為進行4天以上。例如，可於步驟6)之最後約4至15天，較佳為最後約4至7天，進行在FGFR1抑制劑之存在下之培養。經FGFR1抑制劑之處理期間中亦可交換培養基，依據培養日程，可與經添加FGFR1抑制劑之與交換前具有相同組成之培養基或具有不同組成之培養基進行交換。
藉由於包含FGFR1抑制劑之培養基中培養細胞，可抑制所得之胰島素產生細胞中之Ki67陽性細胞之增殖。
步驟6)中所得之胰島素產生細胞可使用胰蛋白酶等酵素解離並回收。經回收之胰島素產生細胞至使用為止可冷凍保存。接著，將經回收之胰島素產生細胞於上述培養基中，以每1培養器或每1孔(well)約50萬至500萬個，較佳為約100萬至400萬個，更佳為約200萬至300萬個之量進行播種，從而進行三維培養，可獲得球狀體形態之胰島素產生細胞。各球狀體由約100至約1000個，較佳為約200至約800個，更佳為約300個至約500個左右之細胞構成。
所謂本發明中使用之「具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物」或「微小管抑制劑」，意指具有促進形成微小管之微管蛋白的聚合，從而使微小管過剩地形成/安定化之活性、及/或抑制形 成微小管之微管蛋白的解聚合之活性的化合物。該化合物較佳為具有藉由該活性抑制細胞分裂之效果。此外，本說明書中，用語「具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物」與「微小管抑制劑」係互相交換使用。
本發明中可利用之「具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物」或「微小管抑制劑」只要具有上述活性，則無特別限制，可舉例如下述化合物或者其藥理學所容許之鹽或溶劑合物。又，只要此等化合物具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性，可具有一個或複數個取代基，亦可一部分之部分結構(取代基、環等)經變換。溶劑合物可列舉水合物或丙酮加成物等，但不限於此等。
[表1]
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於本發明中，「具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物」或「微小管抑制劑」較佳為作為類紫杉醇系抗癌劑之有效成分所利用之化合物或者其藥理學所容許之鹽或溶劑合物，更佳為歐洲紫杉醇或者其藥理學所容許之鹽或溶劑合物。
上述「具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物」或「微小管抑制劑」可利用可商業購入者或是根據習知方法而合成者。
於本發明中，利用微小管抑制劑進行的從多能性幹細胞分化誘導而獲得之胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團之處理，係可藉由使該細胞集團與微小管抑制劑接觸而進行。例如，利用微小管抑制劑進行之處理係可藉由於經添加微小管抑制劑之培養基中培養該細胞集團而進行。微小管抑制劑係在培養基中可以能夠減少最終所得之產生胰島素之細胞集團內存之非內分泌系細胞之任意量被含有，例如，可包含10μM、5μM、4μM、3μM、2μM或其以下之量。微小管抑制劑添加至培養基之量的下限並無特別限制，可為0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM又、0.5μM、1μM或其以上。微小管抑制劑添加至培養基之量之範圍可使用自前述上限及下限之數值所各自選擇之2個數值表示，例如，0.1μM至10μM，較佳為0.1μM至5μM，更佳為1μM至3μM。
又，胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團之微小管抑制劑存在下的培養可在能減少最終所得之產生胰島素之細胞集團內存在之非內分泌系細胞之任意期間進行，例如，可進行至少12小時，較佳為24小時、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、10天、11天、12天、15天或其以上。較佳為微小管抑制劑之存在下之胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團的培養期間係3天、 4天、5天、6天、7天、8天或其以上。經微小管抑制劑之處理期間中亦可交換培養基，依據培養日程，可與經添加微小管抑制劑之與交換前具有相同組成之培養基或具有不同組成之培養基進行交換。培養基可使用上述培養哺乳類細胞所使用之基礎培養基、或至上述胰島素產生細胞之分化誘導培養基。
於本發明中，從多能性幹細胞分化誘導所得之胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團可附加與經微小管抑制劑之處理一起的分化成胰島素產生細胞之步驟。於此，所謂的「與經微小管抑制劑之處理一起」亦包含同時進行經微小管抑制劑處理之步驟與分化步驟之情形、經微小管抑制劑處理後供給至使其分化之步驟之情形、以及供給至使其分化之步驟後供給至經微小管抑制劑之處理之步驟之情形。因此，經微小管抑制劑處理所使用之培養基與使細胞集團分化所使用之培養基可為不同者，亦可於分化之步驟所用之培養基中進一步添加微小管抑制劑。
於本發明之一實施形態中，微小管抑制劑係於從多能性幹細胞分化誘導胰島素產生細胞之步驟中，包含於上述步驟6之培養基，而作用於細胞。較佳為直到步驟6結束為止之3天、4天、5天、6天、7天、8天或其以上之期間，於步驟6之培養基包含微小管抑制劑，而使其作用於細胞。
於本發明之另一實施形態中，微小管抑制劑係於從多能性幹細胞分化誘導胰島素產生細胞之步驟中，可包含於培養基而作用在上述步驟6結束後之細胞。培養基可使用上述步驟1)所記載之培養哺乳類細胞所使用之基礎培養基。培養基中可添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑XX、γ-分泌酶抑制劑RO、N-半胱胺酸、AXL抑制劑、抗壞血 酸，並進一步適當地添加Wnt抑制藥、ROCK抑制劑、FGF(較佳為FGF2)、血清代替物、維生素、抗生素等。例如，培養基中可添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、及抗壞血酸，或者可添加T3、ALK5抑制劑II、ZnSO4、肝素、N-乙醯基半胱胺酸、水溶性維生素E衍生物、及R428。較佳為微小管抑制劑在步驟6結束後3天、4天、5天、6天、7天、8天或其以上之期間，包含於上述培養基，而作用於細胞。
藉由本發明所得之產生胰島素之細胞集團中的胰島素產生細胞，較佳為胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞之比例為相較於藉由以往方法(例如，上述步驟1)至6)或Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133等)所製作之產生胰島素之細胞集團中之其比例，高5%以上者，較佳為高10%以上者。更詳言之，藉由本發明所得之產生胰島素之細胞集團中的胰島素產生細胞，更詳細而言，胰島素陽性且NKX6.1陽性之細胞之比例為35%以上，較佳為36%以上，更佳為37%以上，再更佳為38%以上，又再更佳為39%以上，特佳為40%以上，格外地佳為41%以上。該比例之上限並無特別限制，係70%以下、60%以下、或50%以下。該比例可使用自前述上限及下限之數值所各自選擇之2個數值表示，例如，該比例為35%至50%，較佳為36%至50%，更佳為37%至50%，再更佳為38%至50%，又再更佳為39%至50%，特佳為40%至50%，格外地佳為41%至50%。
又，相較於藉由以往方法(例如，上述步驟1)至6)或Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133等)所製作之產生胰島素之細胞集團中之染色顆粒素A(CHGA)陽性之內分泌系細胞比例，藉由本發明所得之產生胰島素之細胞集團中的染色顆粒素A(CHGA)陽性之內分泌系細胞之比例為高3%以上，較佳為高4%以上，更佳為高5%以上者。更詳細而言，藉由本發明所得之產生胰島素之細胞集團中的染色顆粒素A(CHGA)陽性， 例如CHGA陽性且PDX1陽性之內分泌系細胞之比例為95%以上，較佳為96%以上，更佳為97%以上，再更佳為98%以上。該比例之上限並無特別限制，係99%以下。該比例可使用自前述上限及下限之數值所各自選擇之2個數值表示，例如，該比例為95%至99%，較佳為96%至99%，更佳為97%至99%，再更佳為98%至99%。
藉由本發明所得之產生胰島素之細胞集團中，除了上述胰島素產生細胞或內分泌細胞，亦可包含其他細胞(例如，胰臟內分泌前驅細胞；表現升糖素、體抑素、及胰多肽之至少一種標記之其他胰臟激素產生細胞；Ki67陽性細胞；CHGA陰性細胞等)。
又，相較於藉由以往方法(例如，上述步驟1)至6)或Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133等)所製作之產生胰島素之細胞集團，藉由本發明所得之產生胰島素之細胞集團係內部存在之非內分泌系細胞經減少，較佳為經去除之產生胰島素之細胞集團。於此，所謂的「非內分泌系細胞」係藉由染色顆粒素A(CHGA)陰性之標記表現型式而附加特徵之細胞。非內分泌系細胞可進一步藉由PDX1陰性、及/或Ki67陽性而附加特徵。較佳為「非內分泌系細胞」係CHGA陰性且PDX1陽性細胞、CHGA陰性且PDX1陰性細胞、及/或CHGA陰性且Ki67陽性細胞。
相較於藉由以往方法(例如，上述步驟1)至6)或Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133等)所製作之產生胰島素之細胞集團中之非內分泌系細胞比例，藉由本發明所得之產生胰島素之細胞集團中的非內分泌系細胞之比例為低2%以上、3%以上、4%以上、或5%以上者。更詳細而言，藉由本發明所得之產生胰島素之細胞集團中的非內分泌系細胞之比例為5%以下，較佳為4%以下，更佳為3%以下，再更佳為2%以下，又再更佳為1%以下，特佳為0.5%以下。該比例之下限並無特別限制， 例如，0%以上、0.01%以上、或0.05%以上。該比例可使用自前述上限及下限之數值所各自選擇之2個數值表示，例如，該比例為0%至5%，較佳為0.01%至4%，更佳為0.01%至3%，再更佳為0.01%至2%，又再更佳為0.01%至1%，特佳為0.01%至0.5%。更詳細而言，藉由本發明所得之產生胰島素之細胞集團中的CHGA陰性且Ki67陽性細胞之比例為0.1%以下，較佳為0.05%以下，該比例之下限並無特別限制，例如，0%以上、0.01%以上。該比例可使用自前述上限及下限之數值所各自選擇之2個數值表示，例如，該比例為0%至0.1%、或0.01%至0.1%。
本發明還提供檢測存在於從多能性幹細胞分化誘導所得之產生胰島素之細胞集團中之非內分泌系細胞的方法。
於本發明中，存在於產生胰島素之細胞集團中之非內分泌系細胞，係可藉由將產生胰島素之細胞集團供給至進一步的培養(本說明書中有時記載為「延長培養」)而增殖，變得易於檢測。延長培養可使用上述培養哺乳類細胞所使用之基礎培養基進行，較佳為使用MCDB131/20mM葡萄糖/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAX/青黴素鏈黴素培養基作為基礎培養基。
較佳為延長培養之培養基進一步包含上皮成長因子(Epiderma Growth Factor；EGF)或者與其具有同等或類似活性之物質。就EGF與「與其具有同等或類似活性之物質」而言，可列舉使EGF之訊息傳遞路徑活化而獲得之物質(例如，細胞素(betacellulin)等)、與EGF具有類似功能之生長因子(例如，纖維母細胞生長因子(FGF；Fibroblast Growth Factor)、血小板衍生生長因子(PDGF；Platelet-Derived Growth Factor)、血管內皮細胞生長因子(VEGF；Vascular Endothelial Growth Factor)等)，但不限於此等。EGF或者與其具有同等或類似活性之物質可於培養基中包 含使非內分泌系細胞增殖之充足之任意量。例如，EGF或者與其具有同等或類似活性之物質可於培養基中包含選自50ng/mL、60ng/mL、70ng/mL、80ng/mL、90ng/mL、或其以上之範圍之量，其上限並無特別限制，可為選自250ng/mL、200ng/mL、150ng/mL、100ng/mL、或其以下之範圍之量。該含有量可使用自前述上限及下限之數值所各自選擇之2個數值表示，例如，該含有量可為選自50ng/mL至250ng/mL、50ng/mL至200ng/mL、50ng/mL至150ng/mL、或50ng/mL至100ng/mL之範圍之量。
延長培養之期間只要是可充分地增殖非內分泌系細胞之期間即可，係至少12小時，較佳為24小時以上，例如2天、3天、4天、5天、7天、10天、14天、21天、27天、28天、29天、30天、或其以上。延長培養之期間中亦可交換培養基，可以1至7天，較佳為2至5天，更佳為3至4天1次之頻率進行培養基交換。
將藉由本發明所得之產生胰島素之細胞集團供給於上述延長培養時，相較於將藉由以往方法(例如，上述步驟1)至6)或Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133等)所製作之產生胰島素之細胞集團供給於延長培養時之非內分泌系細胞比例，延長培養後所確認之該集團中之非內分泌系細胞之比例係減少50%以上，較佳為減少65%以上，更佳為減少70%以上，再更佳為減少75%以上，可確認藉由本發明所得之產生胰島素之細胞集團中內部存在之非內分泌系細胞被減少，較佳為被去除。
藉由本發明所得之產生胰島素之細胞集團可分化誘導成包含胰臟β細胞之細胞集團(以下，記載成「胰臟β細胞集團」)。於本說明書中，「胰臟β細胞」意指比「胰島素產生細胞」更成熟之細胞，具體而言，意指表現屬於胰臟β細胞成熟標記之MAFA、UCN3、及IAPP的至少一種標記之細胞，或者藉由葡萄糖刺激所致之胰島素分泌上升反應而附加特徵 之細胞。胰臟β細胞集團中，除了胰臟β細胞，也可包含其他細胞(例如，胰島素產生細胞、Ki67陽性細胞、CHGA陰性細胞等)。
胰臟β細胞集團，係可藉由使產生胰島素之細胞集團進行分化/成熟，較佳為於動物生體內分化/成熟而得之。
「動物」以哺乳動物為佳，可舉例如人類、非人類靈長類、豬、牛、馬、綿羊、山羊、羊駝、狗、貓、兔、小鼠、天竺鼠等，較佳為人類。
移植較佳為在可將細胞集團固定於一定位置之生體內領域中進行，例如，可在動物皮下、腹腔內、腹膜上皮、大胃繫膜、脂肪組織、肌肉組織或胰臟、腎臟等各臟器之被膜下等進行。移植之細胞數係可根據移植之細胞之分化階段、移植對象之年齡、體重、移植部位之尺寸大小、疾病之嚴重程度等要素而變化，並無特別限制，例如，可為10×104個細胞至10×1011個細胞左右。移植之細胞集團可在生體內環境進行分化誘導而分化成目標之細胞集團(較佳為胰臟β細胞集團)，然後可予以回收，亦可維持留在生體內。
在進行移植時，細胞集團可包埋於包含生物相容性材料之凝膠中而進行移植，例如，亦可將經包含生物相容性材料之凝膠所包埋之細胞集團封入膠囊、袋、小室等裝置中而移植至生體內。
於本說明書中，所謂的「包埋」意指於包含生物相容性材料之凝膠中，使胰臟內分泌前驅細胞集團或處於其後的分化階段之細胞集團分散並收容。
於本說明書中，所謂的「生物相容性材料」，意指移植至生體內並短期或長期留存時，不會誘導出顯著之免疫反應或有害之生體反應(例如，毒性反應、凝血等)的任意材料。又，「生物相容性材料」較佳為生物 可分解性材料。如此之材料可列舉：聚乳酸(PLA)、聚己內酯(PCL)、聚胺甲酸酯(PU)、聚乙二醇(PEG)、聚甲基丙烯酸羥基乙酯、聚乙醇酸(PGA)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚(3-羥基丁酸酯-羥基戊酸酯)共聚物(PHBV)、聚(乙烯-乙酸乙烯酯)共聚物(PEVA)、聚丙烯醯胺、聚乙二醇、聚乙烯亞胺、聚羥基丁酸酯、聚(N-乙烯吡咯啶酮)、聚乙烯醇、聚延胡索酸丙二醇酯、聚丙烯酸、聚e-己內酯、聚甲基丙烯酸、聚偏二氟乙烯(PVDF)、果膠酸、玻尿酸、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸肝素蛋白多醣(heparan sulfate proteoglycan)、肝素、幾丁質、幾丁聚醣、三仙膠、羧甲基纖維素、羧甲基幾丁聚醣、海藻酸鹽、海藻酸酯、膠原蛋白、纖維素、絲蛋白、角蛋白、明膠、血纖維蛋白、聚三葡萄糖(pullulan)、層連結蛋白、結蘭膠(gellan gum)、矽、胺甲酸乙酯、彈性蛋白等及其等之修飾物、以及其等之組合。「生物相容性材料」之表面依照需要可施予：能實現細胞貼附之表面修飾(例如，以細胞貼附用基質(膠原蛋白、明膠、聚-L-離胺酸、聚-D-離胺酸、層連結蛋白、纖維連接蛋白、Matrigel基質凝膠、玻璃體結合蛋白等)塗覆)，或者經已知能控制細胞之增殖、分化或功能之官能基(例如，胺基、羧基、羥基、甲基丙烯酸基、丙烯酸基等)之改變。於特定態樣中，「生物相容性材料」可合適地使用海藻酸鹽或海藻酸酯。
海藻酸鹽只要是水溶性鹽即可，可利用金屬鹽、銨鹽等。例如可合適地使用海藻酸鈉、海藻酸鈣、海藻酸銨等。
海藻酸酯(亦稱為海藻酸丙二醇酯)，係藉由使海藻酸之羧基與丙二醇進行酯鍵結而成之衍生物。
海藻酸鹽所包含之甘露糖醛酸與葡萄糖醛酸之比例(M/G比)為任意者，一般而言，M>G時可形成富有柔軟性之凝膠，M<G時可形成 堅固之凝膠。於本發明中，可利用包含葡萄糖醛酸之比例為10至90%、20至80%、30至70%或40至60%者。
使用海藻酸鹽或海藻酸酯之凝膠之製作可依照習知手法(WO2010/032242、WO2011/154941)而製作，可藉由在海藻酸鹽或海藻酸酯之溶液中添加交聯劑並進行凝膠化而得。
於溶劑中可包含0.05至10重量%，較佳為0.1至5重量%、更佳為0.5至3重量%之量的海藻酸鹽或海藻酸酯。溶劑只要是可溶解海藻酸鹽或海藻酸酯者即可，可利用水、生理食鹽水等。
交聯劑只要是可使海藻酸鹽或海藻酸酯之溶液進行凝膠化者即可，並無特別限制，可利用多價之金屬陽離子。就多價之金屬陽離子而言，較佳為2價之金屬陽離子，更佳為鈣離子、鍶離子、鋇離子。可利用鹽之形態之交聯劑，於本發明中，可利用選自氯化鈣、氯化鍶、氯化鋇中之至少一者作為交聯劑。
在包含海藻酸鹽或海藻酸酯之凝膠中可包含奈米纖維。奈米纖維為具有奈米等級直徑之天然或合成纖維。天然奈米纖維可列舉包含膠原蛋白、纖維素、絲蛋白、角蛋白、明膠、幾丁聚醣等多糖類之一種或複數種者。合成奈米纖維可列舉：聚乳酸(PLA)、聚己內酯(PCL)、聚胺甲酸酯(PU)、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚(3-羥基丁酸酯-羥基戊酸酯)共聚物(PHBV)、聚(乙烯-乙酸乙烯酯)共聚物(PEVA)等。於包含海藻酸之凝膠中，可包含未達1重量%，例如，0.9重量%、0.8重量%、0.7重量%、0.6重量%、0.5重量%或未達該量的奈米纖維。於包含海藻酸鹽或海藻酸酯之凝膠中所包含之奈米纖維量之下限並無特別限制，可為0.05重量%以上，較佳為0.1重量%以上。
可藉由任意手段進行「將細胞集團包埋於包含海藻酸鹽或海藻酸酯之凝膠中」，並無特別限制，例如，可藉由於海藻酸鹽或海藻酸酯之溶液中將細胞集團進行混合並使其凝膠化而進行。
於海藻酸鹽或海藻酸酯之溶液中，可包含選自1×104個細胞/mL至1×109個細胞/mL，較佳為1×107個細胞/mL至1×108個細胞/mL之量之細胞集團。
包含細胞集團之海藻酸鹽或海藻酸酯之溶液之凝膠化，係可藉由在該溶液中添加交聯劑而進行。關於添加之交聯劑之量，係相對於該溶液，而可設為選自0.1至5重量%，例如，0.1至1重量%之量。關於凝膠化，係可於細胞培養或細胞移植所用之具有預定結構及/或形狀之容器內進行，或可於為了獲得適合該容器之凝膠而設計之鑄模內進行。
或者，亦可依據習知手法(WO2010/010902)，藉由形成包含海藻酸之凝膠之膠囊而進行。亦即，可對交聯劑之溶液滴加包含細胞集團之海藻酸鹽或海藻酸酯之溶液而進行。根據滴加時之噴嘴形狀或滴加方法，可調整液滴之尺寸大小，從而可規定包含海藻酸之凝膠之膠囊之大小。滴加方法並無特別限制，可藉由空氣噴霧法、無空氣噴霧方式、靜電噴霧法等手法進行。包含海藻酸之凝膠之膠囊之大小並無特別限制，可為直徑5mm以下、1mm以下、500μm以下。於交聯劑溶液中，可包含選自0.1至10重量%，例如，0.1至5重量%之量之交聯劑。
本發明所得之產生胰島素之細胞集團係可移植至動物生體內，於動物生體內分化時可直接留置而作為產生/分泌胰島素之細胞來利用。
本發明所得之產生胰島素之細胞集團，係可直接或膠囊化以移植至患部，藉此而可用於作為糖尿病，特別是I型糖尿病治療用之細胞醫藥。
又，本發明所得之產生胰島素之細胞集團可為前藥。於本說明書中，所謂的前藥，係指移植至生體內之後進行分化而變化成具有治療疾病之功能之細胞的細胞集團。
本發明所得之產生胰島素之細胞集團係毒性(例如急性毒性、慢性毒性、遺傳毒性、生殖毒性、心臟毒性、癌原性)低，藉由直接或與藥理學上容許之載體等混合作成醫藥組成物，可對哺乳動物(例如，小鼠、大鼠、倉鼠、兔、貓、狗、牛、綿羊、猴、人類)安全地投予。
3.培養基
本發明提供包含微小管抑制劑之胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團之培養基。
本發明之培養基係於RPMI 1640培養基、MEM培養基、iMEM培養基、DMEM/F12培養基、Improved MEM Zinc Option培養基、Improved MEM/1%B-27/青黴素鏈黴素培養基、MCDB131/20mM葡萄糖/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAXTM/抗壞血酸/青黴素鏈黴素培養基等培養哺乳類細胞所使用之基礎培養基中添加上述量之上述微小管抑制劑而成者。
本發明之培養基可作為用以將胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團分化誘導成產生胰島素之細胞集團之分化培養基。本發明之分化培養基可使用於將上述多能性幹細胞分化誘導成胰島素產生細胞之方法中之步驟6)。
本發明之分化培養基除了微小管抑制劑，進一步包含步驟6)中所要求之生長因子、各種抑制劑、血清代替物、抗生素、維生素等其他因子。依據過往報導(Nature Biotechnology,2014；32：1121-1133)，例如，可於步驟6)中所使用之分化培養基中添加預定量之ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑XX、γ-分泌酶抑制劑RO、N-半胱胺酸、AXL抑制劑、抗壞血酸、Wnt抑制藥、ROCK抑制劑、FGF(較佳為FGF2)、血清代替物、維生素、抗生素、ZnSO4、肝素、N-乙醯基半胱胺酸、水溶性維生素E衍生物、R428、FGFR1抑制劑等。
本發明之培養基可作為用以培養上述「處於其後的分化階段之細胞集團」之培養基。於一實施形態中，可於將上述多能性幹細胞分化誘導成胰島素產生細胞之方法中，在直至步驟6)結束為止的3天、4天、5天、6天、7天、8天或其以上之期間使用，或者於步驟6)結束後使用。該培養基除了添加微小管抑制劑以外，可添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑XX、γ-分泌酶抑制劑RO、N-半胱胺酸、AXL抑制劑、抗壞血酸，並進一步適當地添加Wnt抑制藥、ROCK抑制劑、FGF(較佳為FGF2)、血清代替物、維生素、抗生素等，例如，可添加ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、及抗壞血酸，或者可添加T3、ALK5抑制劑II、ZnSO4、肝素、N-乙醯基半胱胺酸、水溶性維生素E衍生物、及R428。
本發明還提供包含EGF或者具有與其同等或類似活性之物質之產生胰島素之細胞集團的培養基。
本發明之培養基係於上述基礎培養基以任意量包含促進非內分泌系細胞之增殖的上述EGF或者具有與其同等或類似活性之物質而成者。基礎培養基較佳為MCDB131/20mM葡萄糖/NaHCO3/FAF-BSA/ITS- X/GlutaMAX/青黴素鏈黴素培養基。培養基所包含之EGF或者具有與其同等或類似活性之物質之量如上所述。
包含EGF或者具有與其同等或類似活性之物質之該培養基，係用以檢測產生胰島素之細胞集團中所存在之非內分泌系細胞之培養基，可使用於上述產生胰島素之細胞集團之延長培養。
本發明之培養基可提供將基礎培養基、微小管抑制劑或EGF或者具有與其同等或類似活性之物質、及上述其他因子全部混合之一種形態，或者可提供任意地組合、或各自分別之複數種形態而於用時進行調製。
4.內分泌系細胞之去除方法
本發明還關於非內分泌系細胞之去除方法，該方法包含將從多能性幹細胞分化誘導所得之胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團以微小管抑制劑進行處理。
利用微小管抑制劑進行之從多能性幹細胞分化誘導所得之胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團之處理可如上述定義進行。
以下藉由實施例說明本發明，但本發明並非被此等實施例所限制者。
[實施例]
實施例1：將產生胰島素之細胞集團於包含EGF之基礎培養基中進行延長培養時之非內分泌系細胞之增殖評估
1.方法
(1)產生胰島素之細胞集團之製作
從Ff-I14s04 iPS細胞株分化誘導成產生胰島素之細胞集團，係依據上述步驟1)至6)或過往報導(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)， 藉由使用了生物反應器及多孔盤之三維培養法而實施。亦即，將iPS細胞在胰島素進行作用之條件下，於包含分化誘導因子(GSK3β抑制劑、ROCK抑制劑及低用量之活化素A)之培養基(DMEM/1%B-27(INS+)/青黴素鏈黴素/二甲亞碸)中進行第一培養，接著，在胰島素不進行作用之條件下，於包含分化誘導因子(低用量之活化素A)之培養基(DMEM/1%B-27(INS-)/青黴素鏈黴素/二甲亞碸)中進行第二培養，獲得胚胎內胚層細胞集團。再者，將自該胚胎內胚層細胞集團分化誘導而得之胰臟內分泌前驅細胞集團於包含分化誘導因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、抗壞血酸)與FGF受體1抑制劑(PD-166866)之培養基(Improved MEM/1%B-27(INS+)/青黴素鏈黴素)中進行培養，從而獲得產生胰島素之細胞集團。自生物反應器切換至多孔盤係以步驟6)實施。
(2)利用包含EGF之基礎培養基進行之延長培養
將產生胰島素之細胞集團利用基礎培養基(MCDB131/20mM葡萄糖/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAX/青黴素鏈黴素)進行4週延長培養。以促進目標外細胞之增殖為目的添加EGF時，以最終濃度成為50ng/mL之方式添加於基礎培養基，從而進行培養。
(3)標記蛋白表現及細胞數之評估
藉由流式細胞分析儀測量延長培養開始前及結束後之產生胰島素之細胞集團之標記蛋白表現(PDX1、CHGA)。各樣品進行來自分別之培養容器之取樣。關於細胞數，在流式細胞分析儀用之樣品調整時以自動細胞計數器進行測量，算出多孔盤每孔之總細胞數。又，自所得之總細胞數及流式細胞分析儀之結果，算出CHGA陽性細胞數、PDX1陽性且CHGA陰性細胞數、PDX1陰性且CHGA陰性細胞數。
2.結果
(1)標記蛋白表現及細胞數之評估
利用流式細胞分析儀所得之測量結果及細胞數顯示於圖1及表2。延長培養前大部分為CHGA陽性之內分泌細胞。即使於不含EGF之基礎培養基中進行4週之延長培養，大部分為CHGA陽性細胞此點仍無變化。惟，於包含EGF之基礎培養基中延長培養後，PDX1陽性且CHGA陰性(PDX1+/CHGA-)以及PDX1陰性且CHGA陰性(PDX1-/CHGA-)之非內分泌系細胞之比例顯著增加。又，已確認此等非內分泌系細胞不只比例，細胞數亦增加。伴隨著非內分泌系細胞之增加，包含EGF之基礎培養基中之延長培養後之總細胞數亦增加。另一方面，CHGA陽性之內分泌系細胞之細胞數無大變化。
[表2]
Figure 111104774-A0202-12-0049-2
實施例2：將添加類紫杉醇系抗癌劑歐洲紫杉醇(Docetaxel)而製作之產生胰島素之細胞集團於包含EGF之基礎培養基中進行延長培養時之非內分泌系細胞之增殖評估
1.方法
(1)誘導步驟中包含順鉑(Cisplatin)或歐洲紫杉醇處理之產生胰島素之細胞集團之製作
從QHJI-I14s04 iPS細胞株分化誘導成產生胰島素之細胞集團係依據上述步驟1)至6)或過往報導(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，藉由使用了生物反應器之三維培養法而實施。亦即，將iPS細胞在胰島素進行作用下，於包含分化誘導因子(GSK3β抑制劑、ROCK抑制劑及低用量之活化素A)之培養基(DMEM/1%B-27(INS+)/青黴素鏈黴素/二甲亞碸)中進行第一培養，接著，在胰島素不進行作用之條件下於包含分化誘導因子(低用量之活化素A)之培養基(DMEM/1%B-27(INS-)/青黴素鏈黴素/二甲亞碸)中進行第二培養，獲得胚胎內胚層細胞集團。再者，將從該胚胎內胚層細胞集團分化誘導而獲得之胰臟內分泌前驅細胞集團，於包含分化誘導因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、抗壞血酸)與FGF受體1抑制劑(PD-166866)之培養基(Improved MEM/1%B-27(INS+)/青黴素鏈黴素)中進行培養，從而獲得產生胰島素之細胞集團。以順鉑或歐洲紫杉醇處理時，步驟6)開始後第4天至培養結束(第11天)為止之7天，以順鉑之最終濃度成為3μM或歐洲紫杉醇之最終濃度成為1μM之方式，將該等添加於培養基從而進行誘導。
(2)利用包含EGF之基礎培養基進行之延長培養
將添加順鉑或歐洲紫杉醇所得之產生胰島素之細胞集團，於包含最終濃度50ng/mL之EGF之基礎培養基(MCDB131/20mM葡萄糖/NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAX/青黴素鏈黴素)中進行4週之延長培養。以未添加順鉑及歐洲紫杉醇所得之產生胰島素之細胞集團作為對照組(control)細胞集團，進行相同之延長培養。
(3)標記蛋白表現及細胞數之評估
藉由流式細胞分析儀測量延長培養開始前及結束後之各產生胰島素之細胞集團之標記蛋白表現(PDX1、CHGA、Ki67)。關於延長培養結束後之樣品，進行3次來自相同培養容器之取樣。關於細胞數，在流式細胞分析儀用之樣品調整時於自動細胞計數器測量，算出生物反應器每1mL之總細胞數。又，自所得之總細胞數及流式細胞分析儀之結果，算出CHGA陽性細胞數、PDX1陽性且CHGA陰性細胞數、PDX1陰性且CHGA陰性細胞數。
2.結果
(1)標記蛋白表現及細胞數之評估
利用流式細胞分析儀所得之測量結果及細胞數顯示於圖2、圖3及表3、4、5。對照組細胞集團係在延長培養前大部分為CHGA陽性之內分泌細胞，但於包含EGF基礎培養基延長培養後，PDX1陽性且CHGA陰性(PDX1+/CHGA-)以及PDX1陰性/CHGA陰性(PDX1-/CHGA-)之非內分泌系細胞之比例顯著增加。
相對於對照組細胞集團(Control)，添加順鉑之細胞集團(+順鉑)係在包含EGF之延長培養後，PDX1陽性且CHGA陰性(PDX1+/CHGA-)細胞之比例未確認到大幅變化，但PDX1陰性且CHGA陰性(PDX1-/CHGA-)細胞之比例大幅減少。
相對於對照組細胞集團，添加歐洲紫杉醇之細胞集團(+歐洲紫杉醇)係在包含EGF之延長培養後，PDX1陽性且CHGA陰性(PDX1+/CHGA-)以及PDX1陰性且CHGA陰性(PDX1-/CHGA-)之比例皆大幅減少。
於對照組細胞集團或添加順鉑之細胞集團中，包含EGF之延長培養後之總細胞數伴隨著非內分泌系細胞之增加而增加。於添加歐洲紫杉醇之細胞集團中，由於未確認到非內分泌系細胞之增加，因此延長培養 後之總細胞數係減少。另一方面，延長培養後之CHGA陽性之內分泌細胞數，相對於對照組細胞集團，於添加順鉑之細胞集團或添加歐洲紫杉醇之細胞集團中，未確認到變化。由上述可推測，順鉑或歐洲紫杉醇處理抑制非內分泌系細胞之增加，另一方面，對內分泌細胞之細胞數並無影響。
藉由延長培養增加之PDX1陽性且CHGA陰性以及PDX1陰性且CHGA陰性之非內分泌系細胞包含大量屬於增殖標記之Ki67陽性的細胞。因此，可認為此等非內分泌系細胞為增殖性。
[表3]
Figure 111104774-A0202-12-0052-3
[表4]
Figure 111104774-A0202-12-0052-4
[表5]
Figure 111104774-A0202-12-0053-5
實施例3：添加了歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團之標記蛋白表現評估
1.方法
(1)誘導步驟中包含歐洲紫杉醇處理之產生胰島素之細胞集團之製作
從QHJI-I14s04 iPS細胞株分化誘導成胰島素產生細胞係依據上述步驟1)至6)或過往報導(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，藉由經使用生物反應器及多孔盤之三維培養法而實施。亦即，將iPS細胞在胰島素進行作用下於包含分化誘導因子(GSK3β抑制劑、ROCK抑制劑及低用量之活化素A)之培養基(DMEM/1%B-27(INS+)/青黴素鏈黴素/二甲亞碸)中進行第一培養，接著，在胰島素不進行作用之條件下於包含分化誘導因子(低用量之活化素A)之培養基(DMEM/1%B-27(INS-)/青黴素鏈黴素/二甲亞碸)中進行第二培養，獲得胚胎內胚層細胞。再者，將從該胚胎內胚層細胞分化誘導而得之胰臟內分泌前驅細胞集團，於包含分化誘導因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、抗壞血酸)與FGF受體1抑制劑(PD-166866)之培養基(MCDB131/20mM葡萄糖/NaHCO3/ FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAX/青黴素鏈黴素)，從而獲得產生胰島素之細胞集團。自生物反應器至多孔盤之切換係以步驟6)實施。以歐洲紫杉醇處理時，步驟6)開始後第4天至培養結束(第11天)為止之7天，以最終濃度成為1、3或10μM之方式，添加歐洲紫杉醇於培養基從而進行誘導。
(2)標記蛋白表現及細胞數之評估
藉由流式細胞分析儀測量培養結束後之各產生胰島素之細胞集團之標記蛋白表現(NKX6.1、C-肽(胰島素)、CHGA、及Ki67)。各樣品自分別之培養容器進行取樣。關於細胞數，在流式細胞分析儀用之樣品調整時於自動細胞計數器測量，算出多孔盤每孔之總細胞數。
2.結果
(1)標記蛋白表現及細胞數之評估
利用流式細胞分析儀所得之測量結果及細胞數顯示於圖4。相對於對照組細胞集團，經1μM之歐洲紫杉醇處理之細胞集團(+歐洲紫杉醇)，係預期成為成胰臟β細胞的INS陽性且NKX6.1陽性細胞之比例增加10%左右。此作用係即使歐洲紫杉醇之濃度上升至10μM亦無變化。又，總細胞數方面係未觀察到由歐洲紫杉醇處理所致之變化。
再者，於使用經添加FGF受體1抑制劑(PD-166866)之培養基所分化誘導之細胞集團中，屬於目標外細胞之CHGA陰性且Ki67陽性(CHGA-/Ki67+)細胞之存在量亦大幅降低(參照WO2019/208505)，其存在量係不管有無歐洲紫杉醇處理皆為0.1%以下。如本實施例般未進行延長培養而進行評估時，有難以檢測出少數殘存之目標外細胞之差的情形。另一方面，如上所述，藉由利用包含EGF之基礎培養基進行延長培養，增幅少數殘存之目標外細胞而成為可檢測，因而可嚴格地掌握細胞集團所包含之細胞之種類或量。
實施例4：將包含胰島素產生細胞之細胞集團經歐洲紫杉醇處理後，於包含EGF之基礎培養基中進行延長培養時之非內分泌系細胞之增殖評估
1.方法
(1)對包含胰島素產生細胞之細胞集團施以歐洲紫杉醇處理之產生胰島素之細胞集團之製作
從QHJI-I14s04 iPS細胞株分化誘導成產生胰島素之細胞集團係依據上述步驟1)至6)或過往報導(Nature Biotechnology 2014；32：1121-1133)，藉由經使用生物反應器之三維培養法而實施。亦即，將iPS細胞在胰島素進行作用下於包含分化誘導因子(GSK3β抑制劑、ROCK抑制劑及低用量之活化素A)之培養基(DMEM/1%B-27(INS+)/青黴素鏈黴素/二甲亞碸)中進行第一培養，接著，在胰島素不進行作用之條件下於包含分化誘導因子(低用量之活化素A)之培養基(DMEM/1%B-27(INS-)/青黴素鏈黴素/二甲亞碸)中進行第二培養，獲得胚胎內胚層細胞集團。再者，對從該胚胎內胚層細胞集團分化誘導所得之胰臟內分泌前驅細胞集團，於包含分化誘導因子(ALK5抑制劑II、T3、LDN、γ-分泌酶抑制劑RO、抗壞血酸)與FGF受體1抑制劑(PD-166866)之培養基(Improved MEM/1%B-27(INS+)/青黴素鏈黴素)中進行7天培養，所得(步驟6開始後第7天所得)之細胞集團至步驟6)之培養結束(第11天)為止之4天，以最終濃度成為1μM歐洲紫杉醇之方式，將歐洲紫杉醇添加於培養基，接著進行誘導。自生物反應器至多孔盤之切換係以步驟6)實施。
(2)利用包含EGF之基礎培養基進行之延長培養
將藉由上述手法所得之細胞集團(+歐洲紫杉醇之第7天後之4天間)於包含最終濃度50ng/mL之EGF之基礎培養基(MCDB131/20mM葡萄糖 /NaHCO3/FAF-BSA/ITS-X/GlutaMAX/青黴素鏈黴素)中進行4週之延長培養。關於未添加歐洲紫杉醇所得之產生胰島素之細胞集團(對照組)，以及除了歐洲紫杉醇之處理係於步驟6)開始後第4天至培養結束(第11天)為止之7天以外而以相同方式所製作之細胞集團(+歐洲紫杉醇第4天開始之7天)，各自同樣地進行延長培養。
(3)標記蛋白表現及細胞數之評估
藉由流式細胞分析儀測量延長培養開始前及結束後之各細胞集團之標記蛋白表現(PDX1、CHGA)。關於步驟6)開始後第7天所得之細胞集團之標記蛋白表現(NKX6.1、C-肽(胰島素)、PDX1、及CHGA)亦藉由流式細胞分析儀測量。各樣品自分別之培養容器進行取樣。關於細胞數，在流式細胞分析儀用之樣品調整時於自動細胞計數器測量，算出多孔盤每1孔之總細胞數。
2.結果
(1)標記蛋白表現及細胞數之評估
以流式細胞分析儀所得之測量結果及細胞數顯示於圖5及表6、7、8。
於步驟6)開始後第7天所得細胞集團中之標記蛋白表現之測量結果顯示於圖5(A)。於該細胞集團中，已確認包含許多胰島素、NKX6.1、PDX1、CHGA陽性之細胞(表現胰島素及NKX6.1之兩標記之胰島素產生細胞以超過30%之比例存在，又，表現CHGA及PDX1之兩標記之細胞以約90%之比例存在)。
對照組細胞集團係在延長培養前大部分為CHGA陽性之內分泌細胞，但於包含EGF之基礎培養基延長培養後，PDX1陽性且CHGA陰性(PDX1+/CHGA-)以及PDX1陰性/CHGA陰性(PDX1-/CHGA-)之非內分泌系細胞之比例顯著增加。
歐洲紫杉醇添加細胞集團係相對於對照組細胞集團，即使於「+歐洲紫杉醇第7天開始之4天」及「+歐洲紫杉醇第4天開始之7天」之任一細胞集團中，包含EGF之延長培養後之PDX1陽性且CHGA陰性(PDX1+/CHGA-)以及PDX1陰性且CHGA陰性(PDX1-/CHGA-)之比例皆大幅減少。
[表6]
Figure 111104774-A0202-12-0057-6
[表7]
Figure 111104774-A0202-12-0057-7
[表8]
Figure 111104774-A0202-12-0058-8
由上述可確認，藉由將產生胰島素之細胞集團於包含EGF之基礎培養基中進行延長培養，可檢測出該細胞集團中所混入之增殖性之非內分泌系細胞。
又，已查明於分化誘導產生胰島素之細胞集團之過程中，藉由將胰臟內分泌前驅細胞集團及處於其後的分化階段之細胞集團經稱為歐洲紫杉醇之類紫杉醇系抗癌劑處理，可製造非內分泌系細胞降低，且包含高比例之內分泌細胞或胰島素產生細胞之產生胰島素之細胞集團。
實施例5：經添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團以生體內移植進行之有效性及安全性評估
1.方法
(1)添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團之生體內移植
準備藉由鏈佐黴素所誘導之胰島素缺乏性糖尿病之免疫不全NOD/SCID小鼠，將藉由上述實施例2所述之方法添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團分散於血纖維蛋白(Fibrin)凝膠，將其對該小鼠進行皮 下移植。移植後，測量隨時間變化之血漿中人類C-肽濃度。於移植6個月後之時間點摘取出移植片，測量重量。作為對照組，將未添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團對該小鼠進行皮下移植，分別同樣地測量隨時間變化之血漿中人類C-肽濃度、以及移植6個月後之時間點所摘取出之移植片之重量。
(2)移植片中之非內分泌細胞及蛋白質表現之評估
將摘取出之移植片固定，脫水後製作成石蠟切片，實施HE染色及目標蛋白質表現(胰島素、升糖素、Ki67、人類細胞核、PDX1、CK19)用之免疫組織染色，已基於其形態及染色影像確認非內分泌細胞之有無。移植片中之非內分泌細胞之出現數及出現頻率係作為以源自同一處理之複數批細胞實施4個試驗時之合計數進行總計。
2.結果
(1)添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團之生體內
將作為移植後之追蹤觀察所測量之血漿中人類C-肽濃度及移植片重量之結果顯示於圖6。經皮下移植之添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團，係已認定有與未添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團相同程度之血漿中人類C-肽分泌，其係至移植後6個月後為止持續被確認。6個月之時間點之移植片重量，係於添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團中已觀察到低傾向。
(2)移植片中之非內分泌細胞及蛋白質表現之評估
在移植6個月後之移植片之免疫組織染色之結果中，於添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團之移植片中，係在整個移植片全體中已確認許多胰島素陽性、升糖素陽性之細胞，另一方面，Ki67陽性之細胞係僅些微散佈之程度。相對於此，於未添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素 之細胞集團之移植片中，已確認胰島素陽性、升糖素陽性細胞之存在，以及出現許多Ki67陽性細胞。
關於使用上述添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團而實施之4個移植試驗結果，係總計之非內分泌細胞集團之出現數及出現頻率顯示於表9。關於未添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團之移植群(歐洲紫杉醇(-))，係贅生物(Outgrowth)及囊腫(Cyst)之出現率(出現數比例)各為73%(16/22)及100%(22/22)，相對於此，於添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團之移植群(歐洲紫杉醇(+))中，各為0%(0/21)及10%(2/21)，已確認移植片中之非內分泌細胞出現率顯著降低。
由此結果暗示，於培養步驟添加歐洲紫杉醇，有效地抑制移植後生體內之目標外非內分泌細胞之出現。此外，表9所示之所謂的贅生物，係指人類細胞核陽性且PDX1陰性且Ki67陽性之非內分泌細胞之集團，已藉由HE染色所得之形態及免疫組織染色而判斷其存在。表9所示之所謂的囊腫，係指人類細胞核陽性且PDX1陽性且CK19陽性之非內分泌性導管細胞，已藉由HE染色所得之管狀形態及免疫組織染色而判斷其存在。
[表9]
Figure 111104774-A0202-12-0060-9
由上述可知，添加歐洲紫杉醇而製作之產生胰島素之細胞集團即使於經移植之生體內，仍顯示可抑制非內分泌系細胞之增殖，可產生高比例之內分泌細胞或胰島素產生細胞，而確認其有效性與安全性。

Claims (14)

  1. 一種產生胰島素之細胞集團之製造方法，係包含以胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團為處理對象，於包含具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物之培養基中進行培養之步驟。
  2. 如請求項1所述之製造方法，其中，具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物為選自類紫杉醇系抗癌劑之化合物或其藥理學所容許之鹽。
  3. 如請求項1或2所述之製造方法，其中，具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物為歐洲紫杉醇或其藥理學所容許之鹽。
  4. 如請求項1至3中任一項所述之製造方法，其所製造之產生胰島素之細胞集團包含95%以上之CHGA陽性細胞。
  5. 如請求項1至3中任一項所述之製造方法，其所製造之產生胰島素之細胞集團包含0.1%以下之CHGA陰性且Ki67陽性細胞。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之製造方法，其中，屬於處理對象之胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團為多能性幹細胞經分化誘導所製造者。
  7. 一種胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團的培養基，係包含具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物。
  8. 如請求項7所述之培養基，其中，具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物為選自類紫杉醇系抗癌劑之化合物或其藥理學所容許之鹽。
  9. 如請求項7或8所述之培養基，其中，具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物為歐洲紫杉醇或其藥理學所容許之鹽。
  10. 如請求項7至9中任一項所述之培養基，係用以增大CHGA陽性細胞之比例、及/或增大胰島素陽性且NKX6.1陽性細胞之比例而使用者。
  11. 一種產生胰島素之細胞集團中之非內分泌系細胞之檢測方法，係包含將前述產生胰島素之細胞集團於含上皮成長因子(EGF)之培養基中進行培養之步驟。
  12. 如請求項11所述之檢測方法，其中，非內分泌系細胞為CHGA陰性且PDX1陽性細胞及/或CHGA陰性且PDX1陰性細胞。
  13. 一種非內分泌系細胞之去除方法，係包含以胰臟內分泌前驅細胞集團及/或處於其後的分化階段之細胞集團為處理對象，於包含具有微管蛋白之聚合促進活性及/或解聚合抑制活性之化合物之培養基中進行培養之步驟。
  14. 一種含EGF之產生胰島素之細胞集團之培養基，係用以檢測產生胰島素之細胞集團中之非內分泌系細胞而使用者。
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