JP2023156413A - 背側化シグナル伝達物質又は腹側化シグナル伝達物質による錐体視細胞又は桿体視細胞の増加方法 - Google Patents

背側化シグナル伝達物質又は腹側化シグナル伝達物質による錐体視細胞又は桿体視細胞の増加方法 Download PDF

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Mototsugu Eiraku
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Akishi Onishi
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Masayo Takahashi
芳樹 笹井
Yoshiki Sasai
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Abstract

【課題】本発明は、錐体視前駆細胞及び／又は錐体視細胞に富む網膜組織、桿体視細胞前駆細胞及び／又は桿体視細胞に富む網膜組織、及びそれらの製造方法等を提供することを課題とする。【解決手段】発生初期段階から錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階までの網膜組織を、i)腹側マーカーの発現を抑制する程度の濃度の背側化シグナル伝達物質を含む培地で培養する工程を含む、網膜組織に含まれる視細胞前駆細胞及び視細胞中の錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の割合を増加させる方法、あるいはii)腹側マーカーの発現を促進する程度の濃度の腹側化シグナル伝達物質の存在下に培養する工程を含む、網膜組織に含まれる視細胞前駆細胞及び視細胞中の桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞の割合を増加させる方法を提供する。【選択図】なし

Description

本発明は、錐体視細胞又は桿体視細胞に富む網膜組織及びそれらの製造方法に関するものである。
マウス、ラット、ヒト又はニワトリの網膜組織は、いずれも背側化シグナル及び腹側化シグナルにより領域決定されると言われているが、動物種によってそれぞれ独自の構造を有する。
例えば、ヒト及びニワトリの網膜では、マウスやラットと異なり眼底（または中心網膜：central retina）に黄斑部と呼ばれる錐体視細胞(Cone)の割合が高い領域が存在するが、その中心部には錐体視細胞のみが存在し(Rod-Free Zone)、特にヒト網膜組織における黄斑部では中心部ほどLM錐体視細胞の含有率が高く、周辺に向かうに従って逆にS錐体視細胞の割合が高まる。また、黄斑部の外側にはS錐体視細胞と桿体視細胞が含まれる領域が存在し、桿体視細胞は黄斑部の外縁部に密集している。
ニワトリの網膜組織では、ニワトリ胚の眼胞期にある網膜組織の背側化領域全体を切除することによりRod-free zoneが消失すること、及び、腹側化シグナルの過剰発現により、Rod-free zoneが消失することが知られており、Rod-free zoneは背側化領域の寄与により形成されることが示唆されている（非特許文献１）。
一方、ES細胞等の多能性幹細胞から網膜組織へ分化誘導を行う培養法がいくつか知られている（特許文献１～５）。
しかしながら、ヒト又はニワトリの網膜組織において背側化領域がRod-free zoneの形成にどのように寄与するかどうかは知られていなかった。特に、錐体視細胞（LM錐体視細胞、及び／又はS錐体視細胞）又は桿体視細胞に富む網膜組織を製造する方法は、全く知られていなかった。
国際公開第2009/148170号 国際公開第2011/055855号 国際公開第2013/077425号 国際公開第2013/065763号 国際公開第2015/025967号
J Neurosci. 25(11):2823-2831 (2005)
本発明が解決しようとする課題は、錐体視細胞又は桿体視細胞に富む網膜組織及びそれらの製造方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく検討を重ねたところ、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含み、かつ神経節細胞が出現していない分化段階にある網膜組織、即ち発生初期段階（Initial Developmental Stage）の網膜組織を、腹側マーカーの発現を抑制する程度の濃度の背側化シグナル伝達物質の存在下に培養し、成熟させることにより、視細胞中に含まれる錐体視細胞の割合を、前記背側化シグナル伝達物質非存在下に培養した場合に比べて増加させることができることを見出した。
また、発生初期段階の網膜組織を、腹側化シグナル伝達物質の存在下に培養し、成熟させることにより、視細胞中に含まれる桿体視細胞の割合を、前記腹側化シグナル伝達物質非存在下に培養した場合に比べて増加させることができることを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち、本発明は以下に関する：
［１］発生初期段階から錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階までの網膜組織を、腹側マーカーの発現を抑制する程度の濃度の背側化シグナル伝達物質を含む培地で培養する工程を含む、網膜組織に含まれる視細胞前駆細胞（photoreceptor precursor）及び視細胞(photoreceptor)中の錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の割合を増加させる方法；
［２］錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞が、CRX陽性かつRXR-γ陽性、又はCRX陽性かつTRβ2陽性であって、NRL陰性の細胞である、上記［１］に記載の方法；
［３］腹側マーカーがALDH1A3及び／又はCOUP-TF Iである、上記［１］又は［２］に記載の方法；
［４］背側化シグナル伝達物質の濃度が、最も背側のマーカーの発現は誘導しない程度である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法；
［５］背側化シグナル伝達物質の濃度が、背側マーカーの発現を促進する程度である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法；
［６］背側化シグナル伝達物質の濃度が、最も背側のマーカーの発現を誘導しない程度であり且つそれ以外の背側マーカーの発現は促進する程度である、上記［１］～［３］のいずれかに記載の方法；
［７］背側マーカーがCYP26A1及び／又はCYP26C1である、上記［５］又は［６］に記載の方法；
［８］最も背側のマーカーがCOUP-TF IIである、上記［４］又は［６］に記載の方法；
［９］背側マーカーがALDH1A1である、上記［５］又は［６］に記載の方法；
［１０］背側化シグナル伝達物質の濃度が、1.35 nMのBMP4が促進するALDH1A1の発現量の0.1%以上30%以下のALDH1A1の発現が誘導される程度である、上記［９］に記載の方法；
［１１］発生初期段階の網膜組織が、毛様体周縁部様構造体を含む、上記［１］～［１０］のいずれかに記載の方法；
［１２］発生初期段階の網膜組織が、視細胞及び神経節細胞に分化し得る細胞を含む、上記［１］～［１０］のいずれかに記載の方法；
［１３］発生初期段階の網膜組織が、多能性幹細胞由来である、上記［１］～［１２］のいずれかに記載の方法；
［１４］発生初期段階の網膜組織が、成体組織から得られる神経上皮細胞由来である、上記［１］～［１２］のいずれかに記載の方法；
［１５］発生初期段階の網膜組織が、PAX6陽性かつRX陽性の細胞を含むことを特徴とする、上記［１］～［１４］のいずれかに記載の方法；
［１６］発生初期段階の網膜組織が、PAX6陽性、RX陽性かつCHX10陽性の細胞を含むことを特徴とする、上記［１］～［１５］のいずれかに記載の方法；
［１７］背側化シグナル伝達物質の存在下に培養する工程が、4日間～170日間継続される、上記［１］～［１６］のいずれかに記載の方法；
［１８］背側化シグナル伝達物質の存在下に培養する工程が、背側化シグナル伝達物質非存在下に培養した場合に桿体視細胞前駆細胞が出現する時期まで継続される、上記［１７］に記載の方法；
［１９］背側化シグナル伝達物質が0.01 nM～0.90 nMのBMP4に相当するBMPシグナルを誘導可能な、BMPシグナル伝達経路作用物質もしくはWntシグナル伝達経路作用物質、又はSHHシグナル伝達経路阻害物質である、上記［１］～［１８］のいずれかに記載の方法；
［２０］背側化シグナル伝達物質がBMP4である、上記［１］～［１９］のいずれかに記載の方法；
［２１］BMP4の濃度が、0.05 nM～0.45 nMである、上記［２０］に記載の方法；
［２２］背側化シグナル伝達物質がCyclopamine-KAADである、上記［１］～［１９］のいずれかに記載の方法；
［２３］Cyclopamine-KAADの濃度が、0.01 μM～5 μMである、上記［２２］に記載の方法；
［２４］Cyclopamine-KAADの濃度が、0.2 μM～1 μMである、上記［２３］に記載の方法；
［２５］９－シスレチノイン酸を含まない培地中で実施される、上記［１］～［２４］のいずれかに記載の方法；
［２６］上記［１］～［２５］のいずれかに記載の方法によって得られる、錐体視細胞前駆細胞に富む視細胞前駆細胞、及び／又は錐体視細胞に富む視細胞を含む網膜組織；
［２７］視細胞前駆細胞及び視細胞中の、錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の細胞数が、桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞の細胞数に比べて、２倍以上、好ましくは４倍以上であり、かつ神経節細胞を有する、錐体視細胞前駆細胞に富む視細胞前駆細胞、及び／又は錐体視細胞に富む視細胞を含む網膜組織；
［２８］全視細胞前駆細胞及び全視細胞に含まれる錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の細胞数が70%以上、好ましくは80%以上である、上記［２６］又は［２７］に記載の網膜組織；
［２９］培養することにより、上記［２６］又は［２７］に記載の網膜組織へ成熟化され得る網膜組織；
［３０］網膜組織の層構造の50%以上が連続上皮構造を形成する、上記［２６］～［２９］のいずれかに記載の網膜組織；
［３１］網膜組織の長軸方向の直径が0.6 ｍｍ以上である、上記［３０］に記載の網膜組織；
［３２］上記［２６］～［３１］のいずれかに記載の網膜組織から切り出された網膜組織片を含む、網膜疾患患者の移植を必要とする網膜組織へ移植されるための医薬組成物；
［３３］移植を必要とする網膜組織が、Rod-free zoneを含む領域の組織である、上記［３２］に記載の医薬組成物；
［３４］Rod-free zoneを含む領域が、黄斑部（Macular）様構造を有する、上記［３３］に記載の医薬組成物；
［３５］発生初期段階から錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階までの網膜組織を、少なくとも１日間、腹側マーカーの発現を促進する程度の濃度の腹側化シグナル伝達物質の存在下に培養する工程を含む、網膜組織に含まれる視細胞前駆細胞（photoreceptor precursor）及び視細胞(photoreceptor)中の桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞の割合を増加させる方法；
［３６］桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞が、NRL陽性かつCRX陽性の細胞である、上記［３５］に記載の方法；
［３７］腹側マーカーがALDH1A3及び／又はCOUP-TF Iである、上記［３５］又は［３６］に記載の方法；
［３８］発生初期段階の網膜組織が、毛様体周縁部様構造体を含む、上記［３５］～［３７］のいずれかに記載の方法；
［３９］発生初期段階の網膜組織が、視細胞及び神経節細胞に分化し得る細胞を含む、上記［３５］～［３８］のいずれかに記載の方法；
［４０］発生初期段階の網膜組織が、多能性幹細胞由来である、上記［３５］～［３９］のいずれかに記載の方法；
［４１］発生初期段階の網膜組織が、成体組織から得られる神経上皮細胞を含む細胞由来である、上記［３５］～［３９］のいずれかに記載の方法；
［４２］発生初期段階の網膜組織が、PAX6陽性かつRX陽性の細胞を含むことを特徴とする、上記［３５］～［４１］のいずれかに記載の方法；
［４３］発生初期段階の網膜組織が、PAX6陽性、RX陽性かつCHX10陽性の細胞を含むことを特徴とする、上記［４２］に記載の方法；
［４４］腹側化シグナル伝達物質の存在下に培養する工程が、4日間～170日間継続される、上記［３５］～［４３］のいずれかに記載の方法；
［４５］腹側化シグナル伝達物質の存在下に培養する工程が、桿体視細胞前駆細胞が出現する時期まで継続される、上記［４４］に記載の方法；
［４６］腹側化シグナル伝達物質が1 nM～10 μMのSAGに相当するSHHシグナル伝達経路促進作用を有する物質、又は0.1 nM～20 μMのLDN193189に相当するBMPシグナル伝達経路阻害作用を有する物質である、上記［３５］～［４５］のいずれかに記載の方法；
［４７］腹側化シグナル伝達物質がSAGである、上記［４６］に記載の方法；
［４８］SAGの濃度が、1 nM～10 μMである、上記［４７］に記載の方法；
［４９］SAGの濃度が、10 nM～500 nMである、上記［４８］に記載の方法；
［５０］腹側化シグナル伝達物質がLDN193189である、上記［４６］に記載の方法；
［５１］LDN193189の濃度が、0.1 nM～20 μMである、上記［５０］に記載の方法；
［５２］LDN193189の濃度が、30 nM～1 μMである、上記［５１］に記載の方法；
［５３］９－シスレチノイン酸を含まない培地中で実施される、上記［３５］～［５２］のいずれかに記載の方法；
［５４］上記［３５］～［５３］のいずれかに記載の方法によって得られる、桿体視細胞前駆細胞に富む視細胞前駆細胞、及び／又は桿体視細胞に富む視細胞を含む網膜組織；
［５５］視細胞前駆細胞及び視細胞の細胞数に対して、40%以上、好ましくは５５%以上が桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞であり、かつ神経節細胞を有する、桿体視細胞前駆細胞に富む視細胞前駆細胞、及び／又は桿体視細胞に富む視細胞を含む網膜組織；
［５６］培養することにより、上記［５５］に記載の網膜組織へ成熟化され得る網膜組織；
［５７］網膜組織の層構造の50%以上が連続上皮構造を形成する、上記［５４］～［５６］のいずれかに記載の網膜組織；
［５８］網膜組織の長軸方向の直径が0.6 mm以上である、上記［５７］に記載の網膜組織；
［５９］上記［５４］～［５８］のいずれかに記載の網膜組織から切り出された網膜組織片を含む、網膜疾患患者の移植を必要とする網膜組織へ移植されるための医薬組成物；
［６０］移植を必要とする網膜組織が、桿体視細胞前駆細胞（Rod precursor）及び／又は桿体視細胞の割合が高い黄斑部の周縁部及びその外側を含む領域である、上記［５９］に記載の医薬組成物；
［６１］上記［２６］～［３１］のいずれか、又は上記［５４］～［５８］のいずれかに記載の網膜組織の有効量を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜細胞もしくは網膜組織の障害に基づく疾患の治療方法；
［６２］上記［２６］～［３１］のいずれか、又は上記［５４］～［５８］のいずれかに記載の網膜組織の毒性・薬効評価用試薬としての使用；
［６３］錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞を含む網膜組織を、血清を含まない培地で培養する工程を含む、S-opsin、L-opsin及び／又はM-opsinを発現する、完全に成熟化した網膜組織を製造する方法；
［６４］錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞を含む網膜組織が、上記［２６］～［３１］のいずれかに記載の網膜組織である、上記［６３］記載の方法；
［６５］血清を含まない培地が、背側化シグナル伝達物質を含む培地である、上記［６３］又は［６４］に記載の方法；
［６６］背側化シグナル伝達物質が、BMPである、上記［６５］に記載の方法；
［６７］血清を含まない培地が、更に甲状腺ホルモンシグナル伝達物質を含む培地である、上記［６３］～［６６］のいずれかに記載の方法。
本発明によれば、錐体視細胞に富む網膜組織を製造し、加齢黄斑変性症等の患者の眼の黄斑部への移植用網膜組織として提供すること、及び桿体視細胞に富む網膜組織を製造し、加齢黄斑変性症等の患者の眼の黄斑部周縁部、又はその外側への移植用網膜組織として提供することが可能となる。
図1は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体を浮遊培養開始後35日目（ａ、ｂ）及び42日目（ｃ、ｄ）に蛍光実体顕微鏡により撮影した画像を示す図である。ａ及びｂは、網膜組織を含む細胞凝集体を浮遊培養開始後35日目にピンセットで切り出し、蛍光実体顕微鏡により撮影した画像であり、ｃ及びｄは、浮遊培養開始後42日目に網膜組織を含む細胞凝集体に、CRX:: Venusタンパク質の蛍光がみとめられる細胞、すなわち、視細胞前駆細胞が出現していることを確認した画像である。 図２は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体を浮遊培養開始後70日目まで培養し、蛍光実態顕微鏡により撮影した画像（ａ～ｅ）、及び75日目まで培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について切片を作製し、抗CRX抗体、抗TRβ2抗体、DAPIを用いて免疫染色を実施した画像（ｆ～ｔ）である。無処理群（Control）に比べ、背側化シグナル伝達物質を添加した場合(+BMP、+Cyclopamine-KAAD)はCRX::Venus陽性細胞、CRX陽性細胞、TRβ2陽性細胞が増加し、逆に腹側化シグナル伝達物質を添加した場合（＋LDN193189、＋SAG）は減少していることが分かる。この分化段階で出現するCRX::Venus陽性細胞、CRX陽性細胞、及びTRβ2陽性細胞はいずれも視細胞前駆細胞、または錐体視細胞前駆細胞である。 図３は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体をミューラー細胞が認められる分化段階である浮遊培養開始後191～192日目まで培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について切片を作製し、抗GFP抗体（CRX::Venusタンパク質を検出する）、抗NRL抗体、抗RXR-γ抗体、DAPIを用いて通常の方法により免疫染色を実施し、GFP陽性細胞、すなわちCRX::Venus陽性細胞のうちRXR-γ陽性かつNRL陰性細胞（錐体視細胞前駆細胞）、またはCRX::Venus陽性細胞のうちNRL陽性細胞（桿体視細胞前駆細胞）を同定した図である（ａ～ｔ）。無処理群（Control）に比べ、背側化シグナル伝達物質を添加した場合(+BMP4、+Cyclopamine-KAAD)は錐体視細胞前駆細胞の割合が高く、逆に腹側化シグナル伝達物質を添加した場合（＋LDN193189、＋SAG）は低いことが分かる。また、逆に無処理群（Control）に比べ、背側化シグナル伝達物質を添加した場合(+BMP4、+Cyclopamine-KAAD)は桿体視細胞前駆細胞の割合が低く、逆に腹側化シグナル伝達物質を添加した場合（＋LDN193189、＋SAG）は高いことが分かる。 図４は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体を浮遊培養開始後約70-75日目まで培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について切片を作製し、抗CRX抗体、抗TRβ2抗体、DAPIを用いて免疫染色を実施した後、DAPI陽性細胞に対するCRX陽性細胞、及びCRX陽性かつTRβ2陽性細胞のそれぞれの割合を画像解析ソフトを用いて測定した結果を示すグラフである。無処理群（Control（NUC））に比べ、背側化シグナル伝達物質を添加した場合(+BMP4、+Cyclopamine-KAAD)はCRX陽性細胞およびCRX陽性かつTRβ2陽性細胞が増加し、逆に腹側化シグナル伝達物質を添加した場合（＋LDN193189、＋SAG）は減少していることが分かる。この分化段階ではCRX陽性細胞、及びCRX陽性かつTRβ2陽性細胞は、それぞれ視細胞前駆細胞、及び錐体視細胞前駆細胞である。 図５は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体を浮遊培養開始後75日目まで培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について切片を作製し、抗OC2抗体、抗OTX2抗体、抗TRβ2抗体、DAPIを用いて免疫染色を実施した図(画像)及び、浮遊培養開始後約70-75日目の網膜組織について同様に免疫染色を実施した後、OTX2陽性細胞、OC2陽性細胞の割合、並びにOC2陽性細胞の蛍光シグナル強度を画像解析ソフトを用いて測定したグラフである。これら画像及びグラフから無処理群（Control（NUC））に比べ、背側化シグナル伝達物質を添加した場合(+BMP4、+Cyclopamine-KAAD)はOTX2陽性細胞およびTRβ2陽性細胞がいずれも増加するのに対し、OC2陽性細胞は減少し、発現量も低くなっていることが分かる。逆に腹側化シグナル伝達物質を添加した場合（＋LDN193189、＋SAG）はOTX2陽性細胞、TRβ2陽性細胞がいずれも減少するのに対し、＋LDN193189ではOC2陽性細胞が増加することが分かる。 図６は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体を浮遊培養開始後約191-192日目まで培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について切片を作製し、抗GFP抗体（CRX::Venusタンパク質を検出する）、抗NRL抗体、抗RXR-γ抗体、DAPIを用いて免疫染色を実施した後、CRX::Venus陽性細胞のうちRXR-γ陽性かつNRL陰性細胞（錐体視細胞前駆細胞）、又はCRX::Venus陽性細胞のうちNRL陽性細胞（桿体視細胞前駆細胞）の割合を、画像解析ソフトを用いて測定した結果を示すグラフである。無処理群（Control（NUC））に比べ、背側化シグナル伝達物質を添加した場合(+BMP4、+Cyclopamine-KAAD)は錐体視細胞前駆細胞（Cone）の割合が高く、逆に腹側化シグナル伝達物質を添加した場合（＋LDN193189、＋SAG）は低いことが分かる。また、逆に無処理群（Control（NUC））に比べ、背側化シグナル伝達物質を添加した場合(+BMP4、+Cyclopamine-KAAD)は桿体視細胞前駆細胞様細胞（Rod-like）の割合が低く、逆に腹側化シグナル伝達物質を添加した場合（＋LDN193189、＋SAG）は高いことが分かる。 図７－１は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体を浮遊培養開始後約75日目まで培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について切片を作製し、抗GFP抗体（CRX::Venusタンパク質を検出する）、抗ALDH1A3抗体、DAPIを用いて免疫染色を実施した図(画像)である。無処理群（Control（NUC））ではALDH1A3陽性領域、すなわち網膜における腹側化領域でGFP陽性細胞、すなわちCRX::Venus陽性細胞が相対的に少なく、視細胞前駆細胞の分化が抑制されていることが分かる。一方、背側化シグナル伝達物質を添加した場合(+BMP4)は、ALDH1A3陽性領域の減少とそれに伴うCRX::Venus陽性細胞の増加が認められる一方、腹側化シグナル伝達物質を添加した場合（＋LDN193189、＋SAG）はALDH1A3陽性領域の増加とそれに伴うCRX::Venus陽性細胞の減少が認められることが分かる。 図７－２は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体を浮遊培養開始後約40-44日目（d40）又は70-75日目（d70）まで培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について定量的PCRを実施した結果を示すグラフである。浮遊培養開始後約70-75日目（白色バー）では免疫染色の結果と同様に、無処理群（Control（NUC））に比べ、背側化シグナル伝達物質を添加した場合(+BMP4)は、ALDH1A3遺伝子発現の減少が認められる一方、腹側化シグナル伝達物質を添加した場合（＋LDN193189、＋SAG）はALDH1A3遺伝子発現の上昇が認められることが分かる。また、このようなALDH1A3遺伝子発現は浮遊培養開始後約40-44日目と同程度であり、浮遊培養開始後約40-44日目から継続してALDH1A3遺伝子が発現していることが示唆された。また、これらのことから、視細胞前駆細胞もしくは視細胞への分化誘導と、ALDH1A3発現抑制が相関しており、ALDH1A3発現又はALDH1A3遺伝子発現を抑制する程度の背側化シグナル伝達物質がCRX::Venus細胞の分化を促進することが分かる。 図８－１は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体を浮遊培養開始後約40日目又は約75日目まで培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について切片を作製し、抗ALDH1A1抗体を用いて免疫染色を実施した図(画像)である。浮遊培養開始後約40日目の無処理群（Control（NUC））、腹側化シグナル伝達物質を添加した場合（＋LDN193189、＋SAG）はALDH1A1陽性領域が認められない一方、背側化シグナル伝達物質を添加した場合(+BMP4)は、浮遊培養開始後約40日目にALDH1A1陽性領域が認められた。しかしながら、背側化シグナル伝達物質を添加した場合(+BMP4)でも、浮遊培養開始後約75日目にはこのような明確なALDH1A1陽性領域はみとめられなくなることが分かる。 図８－２は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体を浮遊培養開始後約40-44日目（d40）又は70-75日目（d70）まで培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について定量的PCRを実施したグラフである。浮遊培養開始後約40-44日目（黒色バー）では免疫染色の結果と同様に、無処理群（Control（NUC））、腹側化シグナル伝達物質を添加した場合（＋LDN193189、＋SAG）に比べ、背側化シグナル伝達物質を添加した場合(+BMP4)は、ALDH1A1遺伝子発現の上昇が認められることが分かる。しかしながら、このようなALDH1A1遺伝子発現は浮遊培養開始後約70-75日目までに減少し、はっきりとしたALDH1A1発現が認められなくなった免疫染色の結果と相関することが分かる。以上のことから、ALDH1A1の発現は、錐体分化が極大となる段階で低下していることがわかる。 図８－３は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体を浮遊培養開始後約70-75日目（d70）まで培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について定量的PCRを実施したグラフである。腹側化シグナル伝達物質を添加した場合（＋LDN193189）に比べ、背側化シグナル伝達物質を添加した場合(+BMP4)は、CYP26A1遺伝子発現の上昇が認められることが分かる。 図９は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体を浮遊培養開始後約70-75日目まで培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について蛍光顕微鏡によるCRX::Venusの観察（画像上段）、定量的PCR（グラフ）、及び免疫染色（画像下段）を実施した結果を示す図である。0.15nMの BMP4を添加した場合に比べ、0.45nMあるいは1.35nMのBMP4を添加した場合には、CRX::Venusの蛍光強度がかえって低くなり、CRX::Venus陽性細胞が減少することが分かる（画像上段）。また、高濃度(1.35nM)のBMP4を添加することにより、網膜組織の背側化領域で発現するALDH1A1遺伝子が発現上昇することが分かる（グラフ）。また、1.35nMのBMP4を添加して培養した場合、抗ALDH1A1抗体によって強く染色される領域ではCRX::Venus陽性細胞が相対的に少ないのに対し、抗ALDH1A1抗体によって染色される程度が比較的低い領域ではCRX::Venus陽性細胞が相対的に多いことが分かる（ブラケット）。このため、高濃度のBMP4添加により、ALDH1A1の発現が誘導され、ALDH1A1の発現量が高い領域では視細胞の分化促進が起こりにくく、ALDH1A1の過剰な発現誘導は、視細胞前駆細胞の分化をかえって促進させないことが分かる。 図１０は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体をミューラー細胞が認められる程度に成熟した分化段階（例えば、浮遊培養開始後190日目）を経て、270日目まで培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について切片を作製し、視細胞の更なる成熟化に伴って発現するS-Opsin(S-OPN)、LM-Opsin(LM-OPN)、Rhodopsin(RET-P1)、Cone arrestin(ARR3)、錐体視細胞特異的なcyclic nucleotide-gated channel(CNGA3)の免疫染色を行った結果を示す図である。その結果、若干のS-opsin発現は認められたが、ほとんど全ての視細胞前駆細胞は更なる成熟化に伴って発現するS-opsin(S-OPN)、LM-Opsin(LM-OPN)、Rhodopsin(RET-P1)、Cone arrestin(ARR3)を発現せず、生体内と異なり最終的な成熟化が認められないことが分かる。 図１１は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体をミューラー細胞が認められる程度に成熟した分化段階の網膜組織となるまで、培養開始から190日目まで培養し、その後、グルタミン酸を成分として含むDMEM/F12培地にN2 supplement、およびタウリンが添加されているが、牛胎児血清は添加されていない培地により、培養開始からさらに260～338日目まで培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について切片を作製し、視細胞の更なる成熟化に伴って発現するS-opsin(S-OPN)、Rhodopsin(RET-P1)、Cone arrestin(ARR3)、Rod Arrestin(SAG)、錐体視細胞特異的なcyclic nucleotide-gated channel(CNGA3)、桿体特異的なcyclic nucleotide-gated channel(CNGA1)、錐体視細胞特異的なtransducin alpha subunit(Gat2)、桿体視細胞特異的なtransducin alpha subunit(Gat1)、錐体視細胞特異的なPhosphodiesterase 6C(PDE6c)、桿体視細胞特異的なPhosphodiesterase 6A（PDE6a）の免疫染色を行った結果を示す図である。その結果、更なる成熟化に伴って発現するこれら機能分子が錐体視細胞又は桿体視細胞で発現しており、最終的な成熟化が促進されていることが分かった。また、成熟化した視細胞は網膜組織の全体に認められることが分かった。 図１２は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体をミューラー細胞が認められる程度に成熟した分化段階の網膜組織となるまで、培養開始から190日目まで培養し、その後、グルタミン酸を成分として含むDMEM/F12培地にN2 supplement、およびタウリンが添加されているが、牛胎児血清は添加されていない培地にBMP4及びT3を添加し、培養開始からさらに341～344日目まで培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について切片を作製し、視細胞の更なる成熟化に伴って発現するLM-opsin(LM-OPN)、Cone arrestin(ARR3)、錐体視細胞特異的なcyclic nucleotide-gated channel(CNGA3)、錐体視細胞特異的なtransducin alpha subunit(Gat2)、錐体視細胞特異的なPhosphodiesterase 6C(PDE6c)の免疫染色を行った結果を示す図である。その結果、更なる成熟化に伴って発現するこれら機能分子が錐体視細胞で発現しており、最終的な成熟化が促進されていることが分かった。また、BMP4及びT3を添加しなかった時に比べ、BMP4及びT3を加えた時、LM-opsinの発現が促進されることが分かった。 図１３は、ヒトES細胞から作製された網膜組織を含む細胞凝集体をミューラー細胞が認められる程度に成熟した分化段階の網膜組織となるまで、培養開始から190日目まで培養し、その後、グルタミン酸を成分として含むDMEM/F12培地にN2 supplement、およびタウリンが添加されているが、牛胎児血清は添加されていない培地にBMP4及びT3を添加し、更に成熟化させるための培養を開始してから、さらに30日以上培養し、回収した網膜組織を含む細胞凝集体について、定法に従って定量的PCRを実施し、S-opsin、M-opsin、L-opsinの発現量を確認した結果を示す図である。その結果、T3を含まない場合、BMP4の添加の有無にかかわらずS-opsinの発現が促進されていたことから、S錐体視細胞への更なる成熟化、即ち最終的な成熟化が促進されていることが分かった。一方、T3を添加した場合はS-opsinの発現が抑制されており、S錐体視細胞への最終的な成熟化にはT3が抑制的に働くことが分かった。また、T3に加え、BMP4を組み合わせて添加した場合、L及びM-opsinの発現が促進されており、L又はM錐体視への更なる成熟化、即ち最終的な成熟化が促進されていることが分かった。
１．定義
本明細書において、「幹細胞」とは、細胞分裂を経ても同じ分化能を維持する、増殖能（特に自己複製能）を有する未分化な細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞（pluripotent stem cell）、複能性幹細胞（multipotent stem cell）、単能性幹細胞（unipotent stem cell）等の亜集団が含まれる。多能性幹細胞とは、インビトロにおいて培養することが可能で、かつ、三胚葉（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に属する細胞系列すべてに分化し得る能力（分化多能性（pluripotency））を有する幹細胞をいう。複能性幹細胞とは、全ての種類ではないが、複数種の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。単能性幹細胞とは、特定の組織や細胞へ分化し得る能力を有する幹細胞を意味する。
多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞等から誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ES細胞：Embryonic stem cell）、EG細胞(Embryonic germ cell)、人工多能性幹細胞（iPS細胞：induced pluripotent stem cell）等を挙げることが出来る。
胚性幹細胞は、1981年に初めて樹立され、1989年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。1998年にはヒト胚性幹細胞が樹立されており、再生医学にも利用されつつある。ES細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上又はLIFを含む培地中で培養することにより製造することが出来る。ES細胞の製造方法は、例えば、WO96／22362、WO02／101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718等に記載されている。胚性幹細胞は、所定の機関より入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒト胚性幹細胞であるKhES－1、KhES－2及びKhES－3は、京都大学再生医科学研究所より入手可能である。いずれもマウス胚性幹細胞である、EB5細胞は国立研究開発法人理化学研究所より、D3株はATCCより、入手可能である。
ES細胞の一つである核移植ES細胞（ntES細胞）は、細胞株を取り除いた卵子に体細胞の細胞核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。
本発明における「人工多能性幹細胞」（iPS細胞ともいう）とは、体細胞を、公知の方法等により初期化（reprogramming）することにより、多能性を誘導した細胞である。具体的には、線維芽細胞や末梢血単核球等分化した体細胞をOct3/4、Sox2、Klf4、Myc（c-Myc、N-Myc、L-Myc）、Glis1、Nanog、Sall4、lin28、Esrrb等を含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現により初期化して多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい、初期化因子の組み合わせとしては、（１）Oct3/4、Sox2、Klf4、及びMyc(c-Myc又はL-Myc)、（２）Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28及びL-Myc（Stem Cells, 2013;31:458-466）等を挙げることができる。
人工多能性幹細胞は、2006年、山中らによりマウス細胞で樹立された（Cell, 2006, 126(4) pp.663-676）。人工多能性幹細胞は、2007年にヒト線維芽細胞でも樹立され、胚性幹細胞と同様に多能性と自己複製能を有する（Cell, 2007, 131(5) pp.861-872；Science, 2007, 318(5858) pp.1917-1920；Nat. Biotechnol., 2008, 26(1) pp.101-106）。人工多能性幹細胞の誘導方法についてはその後も様々な改良が行われている（例えば、マウスiPS細胞：Cell. 2006 Aug 25;126(4):663-76、ヒトiPS細胞： Cell. 2007 Nov 30;131(5):861-72）。
遺伝子発現による直接初期化で人工多能性幹細胞を製造する方法以外に、化合物の添加などにより体細胞より人工多能性幹細胞を誘導することもできる（Science, 2013, 341 pp. 651-654）。
また、株化された人工多能性幹細胞を入手する事も可能であり、例えば、京都大学で樹立された201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞、1231A3細胞、Ff-I01細胞又はQHJI01細胞等のヒト人工多能性細胞株が、国立大学法人京都大学より入手可能である。
人工多能性幹細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞（例えば、末梢血単核球やT細胞）、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞等が挙げられる。線維芽細胞としては、真皮由来のもの等が挙げられる。
人工多能性幹細胞を製造する際に、数種類の遺伝子の発現により初期化する場合、遺伝子の発現させるための手段は特に限定されない。前記手段としては、ウイルスベクター（例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター）を用いた感染法、プラスミドベクター（例えば、プラスミドベクター、エピソーマルベクター）を用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、エレクトロポレーション法）、RNAベクターを用いた遺伝子導入法（例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、エレクトロポレーション法）、タンパク質の直接注入法等が挙げられる。
本発明に用いられる多能性幹細胞は、好ましくはES細胞又は人工多能性幹細胞であり、より好ましくは人工多能性幹細胞（iPS細胞）である。
本発明に用いる多能性幹細胞は、好ましくは霊長類（例、ヒト、サル）の多能性幹細胞であり、好ましくはヒト多能性幹細胞である。従って、本発明に用いる多能性幹細胞は、好ましくはヒトES細胞又はヒト人工多能性幹細胞（ヒトiPS細胞）であり、最も好ましくは、ヒト人工多能性幹細胞（ヒトiPS細胞）である。
遺伝子改変された多能性幹細胞は、例えば、相同組換え技術を用いることにより作製できる。改変される染色体上の遺伝子としては、例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子、網膜細胞の障害に基づく疾患関連遺伝子などがあげられる。染色体上の標的遺伝子の改変は、Manipulating the Mouse Embryo，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1994）；Gene Targeting，A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press（1993）；バイオマニュアルシリーズ8，ジーンターゲッティング，ES細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（1995）；等に記載の方法を用いて行うことができる。
具体的には、例えば、改変する標的遺伝子（例えば、細胞マーカー遺伝子、組織適合性抗原の遺伝子や疾患関連遺伝子など）を含むゲノムＤＮＡを単離し、単離されたゲノムＤＮＡを用いて標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターを作製する。作製されたターゲットベクターを幹細胞に導入し、標的遺伝子とターゲットベクターの間で相同組換えを起こした細胞を選択することにより、染色体上の遺伝子が改変された幹細胞を作製することができる。
標的遺伝子を含むゲノムＤＮＡを単離する方法としては、Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Second Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press（1989）やCurrent Protocols in Molecular Biology，John Wiley ＆ Sons（1987－1997）等に記載された公知の方法があげられる。ゲノムDNAライブラリースクリーニングシステム（Genome Systems製）やUniversal GenomeWalker Kits（CLONTECH製）などを用いることにより、標的遺伝子を含むゲノムＤＮＡを単離することもできる。ゲノムＤＮＡの代わりに、標的蛋白質をコードするポリヌクレオチドを用いることもできる。当該ポリヌクレオチドは、ＰＣＲ法で該当するポリヌクレオチドを増幅することにより取得することができる。
標的遺伝子を相同組換えするためのターゲットベクターの作製、及び相同組換え体の効率的な選別は、Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press(1993)；バイオマニュアルシリーズ8，ジーンターゲッティング，ES細胞を用いた変異マウスの作製，羊土社（1995）；等に記載の方法にしたがって行うことができる。ターゲットベクターは、リプレースメント型又はインサーション型のいずれでも用いることができる。選別方法としては、ポジティブ選択、プロモーター選択、ネガティブ選択、又はポリA選択などの方法を用いることができる。
選別した細胞株の中から目的とする相同組換え体を選択する方法としては、ゲノムDNAに対するサザンハイブリダイゼーション法やPCR法等があげられる。
本発明における「浮遊培養」あるいは「浮遊培養法」とは、細胞または細胞の凝集体が培養液に浮遊して存在する状態を維持しつつ培養すること、及び当該培養を行う方法を言う。すなわち浮遊培養は、細胞または細胞の凝集体を培養器材等に接着させない条件で行われ、培養器材等に接着させる条件で行われる培養（接着培養、あるいは、接着培養法）は、浮遊培養の範疇に含まれない。この場合、細胞が接着するとは、細胞または細胞の凝集体と培養器材の間に、強固な細胞－基質間結合（cell-substratum junction）ができることをいう。より詳細には、浮遊培養とは、細胞または細胞の凝集体と培養器材等との間に強固な細胞－基質間結合を作らせない条件での培養をいい、「接着培養」とは、細胞または細胞の凝集体と培養器材等との間に強固な細胞－基質間結合を作らせる条件での培養をいう。
浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞と細胞が面接着(plane attachment）する。浮遊培養中の細胞の凝集体では、細胞－基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。一部の態様では、浮遊培養中の細胞の凝集体では、内在の細胞－基質間結合が凝集体の内部に存在するが、細胞－基質間結合が培養器材等との間にはほとんど形成されないか、あるいは、形成されていてもその寄与が小さい。かかる観点から、「浮遊培養」の一形態には、細胞の凝集体を、細胞の凝集体の足場となる細い針状の器材等に固定し、培養液が満たされた器材の中で培養する培養方法等も挙げられる。当該培養方法としては、日本薬学会 第136年会 29AB-pm009で発表された、株式会社サイフューズ製バイオ3Dプリンタ「レジェノバ(登録商標)」を使用する方法等が挙げられる。
細胞と細胞が面接着するとは、細胞と細胞が面で接着することをいう。より詳細には、細胞と細胞が面接着するとは、ある細胞の表面積のうち別の細胞の表面と接着している割合が、例えば、1%以上、好ましくは3%以上、より好ましくは5%以上であることをいう。細胞の表面は、膜を染色する試薬（例えばDiI）による染色や、細胞接着因子（例えば、E-cadherinやN-cadherin）の免疫染色により、観察できる。
浮遊培養を行う際に用いられる培養器は、「浮遊培養する」ことが可能なものであれば特に限定されず、当業者であれば適宜決定することが可能である。このような培養器としては、例えば、フラスコ、組織培養用フラスコ、ディッシュ、ペトリデッシュ、組織培養用ディッシュ、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マイクロポア、マルチプレート、マルチウェルプレート、チャンバースライド、シャーレ、チューブ、トレイ、培養バック、スピナーフラスコ又はローラーボトルが挙げられる。これらの培養器は、浮遊培養を可能とするために、細胞非接着性であることが好ましい。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等によるコーティング処理、又は、正電荷処理等の表面加工）されていないものなどを使用できる。細胞非接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を低下させる目的で人工的に処理（例えば、MPCポリマー等の超親水性処理、タンパク低吸着処理等）されたものなどを使用できる。スピナーフラスコやローラーボトル等を用いて回転培養してもよい。培養器の培養面は、平底でもよいし、凹凸があってもよい。
一方、接着培養を行う際に用いられる培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理（例えば、基底膜標品、ラミニン、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、マトリゲル、シンセマックス、ビトロネクチン等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等によるコーティング処理、又は、正電荷処理等の表面加工）されたものが挙げられる。
本明細書において、細胞の凝集体（Aggregate）〔細胞塊又は細胞凝集体（Cell aggregate）〕とは、複数の細胞同士が接着して塊を形成しているものであれば特に限定はなく、培地中に分散していた細胞が集合して形成された細胞凝集体であっても、細胞培養により形成されたコロニー由来であっても、別の細胞凝集体から新たに出芽、形成される細胞凝集体であってもよい。細胞凝集体には、胚様体（Embryoid body）、スフェア（Sphere）又はスフェロイド（Spheroid）も包含される。好ましくは、細胞凝集体において、細胞同士は面接着している。一部の態様において、細胞凝集体の一部分あるいは全部において、細胞同士が細胞－細胞間結合（cell-cell junction）又は、細胞接着（cell adhesion）、例えば接着結合(adherence junction)、を形成している場合がある。凝集体には、前記細胞凝集体から得られる派生物質としての細胞集団も含まれる。
「均一な凝集体」とは、複数の凝集体を培養する際に各凝集体の大きさが一定であることを意味し、凝集体の大きさを最大径の長さで評価する場合、均一な凝集体とは、最大径の分散が小さいことを意味する。より具体的には、凝集体の集団全体のうちの75%以上の凝集体が、当該凝集体の集団における最大径の平均値±100%、好ましくは平均値±50%の範囲内、より好ましくは平均値±20%の範囲内であることを意味する。
「均一な凝集体を形成させる」とは、細胞を集合させて細胞の凝集体を形成させ浮遊培養する際に、「一定数の分散した細胞を迅速に凝集」させることで大きさが均一な細胞の凝集体を形成させることをいう。すなわち、多能性幹細胞を迅速に集合させて多能性幹細胞の凝集体を形成させると、形成された凝集体から分化誘導される細胞において上皮様構造を再現性よく形成させることができる。具体的には、無血清培地中で多能性幹細胞を迅速に凝集させて、上皮様構造を有する細胞凝集体を形成することができる（SFEBq法 (Serum-free Floating culture of Embryoid Body-like aggregates with quick reaggregation)）。
当該凝集体を形成させる実験的な操作としては、例えば、ウェルの小さなプレート（例えば、ウェルの底面積が平底換算で0.1～2.0 cm2程度のプレート；96ウェルプレート）やマイクロポアなどを用いて小さいスペースに細胞を閉じ込める方法、小さな遠心チューブを用いて短時間遠心することにより細胞を凝集させる方法などが挙げられる。
ウェルの小さなプレートとして、例えば24ウェルプレート（面積が平底換算で1.88 cm2程度）、48ウェルプレート（面積が平底換算で1.0 cm2程度）、96ウェルプレート（面積が平底換算で0.35 cm2程度、内径6～8 mm程度）、384ウェルプレートが挙げられる。好ましくは、96ウェルプレートが挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを上から見たときの底面の形状としては、多角形、長方形、楕円、真円が挙げられ、好ましくは真円が挙げられる。ウェルの小さなプレートの形状として、ウェルを横から見たときの底面の形状としては、外周部が高く内凹部が低くくぼんだ構造が好ましく、例えば、U底、V底、μ底が挙げられ、好ましくはU底またはV底、最も好ましくはV底が挙げられる。ウェルの小さなプレートとして、細胞培養皿（例えば、60 mm～150 mmディッシュ、カルチャーフラスコ）の底面に凹凸、又は、くぼみがあるもの（例えばEZSPHERE（旭テクノグラス））を用いてもよい。ウェルの小さなプレートの底面は、細胞非接着性の底面、好ましくは前記細胞非接着性コートした底面を用いるのが好ましい。
「分散」とは、細胞や組織を酵素処理や物理処理等の分散処理により、小さな細胞片（2細胞以上100細胞以下、好ましくは50細胞以下）又は単一細胞まで分離させることをいう。一定数の分散した細胞とは、細胞片又は単一細胞を一定数集めたもののことをいう。多能性幹細胞を分散させる方法としては、例えば、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤添加処理が挙げられる。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
本明細書における「組織」とは、形態や性質が異なる複数種類の細胞が一定のパターンで立体的に配置した構造を有する細胞集団の構造体をさす。
本明細書における「網膜組織」とは、生体網膜において各網膜層を構成する視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞、網膜色素上皮細胞、ミューラー細胞、これらの前駆細胞である、神経網膜前駆細胞、又は網膜前駆細胞などの網膜細胞が、少なくとも複数種類（ただし、網膜前駆細胞の場合には、その他の網膜細胞を含まない場合がある）、層状で立体的に配列した組織を意味する。それぞれの細胞がいずれの網膜層を構成する細胞であるかは、公知の方法、例えば細胞マーカーの発現の有無若しくはその程度等により確認できる。
本明細書における「網膜組織」としては、多能性幹細胞を分化誘導することにより得られる網膜組織、又は生体由来網膜組織が挙げられる。具体的には、多能性幹細胞から形成される凝集体を適切な分化誘導条件で浮遊培養することにより得られる、前記凝集体の表面に形成された網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞等を含む上皮組織を有する細胞凝集体もしくはその一部挙げることができる。
本明細書における「網膜組織を含む細胞凝集体」とは、前記網膜組織を含む細胞凝集体であれば特に限定はない。
本明細書における「網膜層」とは、網膜を構成する任意の各層を意味し、具体的には、網膜色素上皮層及び神経網膜層が挙げられ、神経網膜層には外境界膜、視細胞層（外顆粒層）、外網状層、内顆粒層、内網状層、神経節細胞層、神経線維層および内境界膜が含まれる。また、後述する「発生初期段階の網膜組織」から成熟した網膜組織に至るまでの途中段階にある網膜組織においては、神経網膜層は、神経網膜組織中のニューロブラスティックレイヤーと呼ばれる神経網膜前駆細胞を含む層を含んでいる。
本明細書における「網膜前駆細胞（retinal progenitor cell）」とは、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞、網膜色素上皮細胞、ミューラー細胞を含む、網膜組織を構成するいずれの成熟な網膜細胞にも分化しうる前駆細胞をいう。
本明細書における「神経網膜前駆細胞（neural retinal progenitor）」とは、眼杯（optic cup）の内層となる運命の細胞であって、網膜色素上皮を含まない神経網膜層(網膜層特異的神経細胞を含む網膜層)を構成するいずれの成熟な細胞にも分化しうる前駆細胞を挙げることができる。
視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、神経節細胞前駆細胞、網膜色素上皮前駆細胞とは、それぞれ、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞、網膜色素上皮細胞への分化が決定付けられている前駆細胞をいう。ただし、分化段階は連続的であり、例えば視細胞前駆細胞から視細胞へ分化段階が移行する境界を明確に区別することは困難である。そこで、本明細書において、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞、又は網膜色素上皮細胞等という場合、それぞれの前駆細胞を含んでいてもよい。逆に、視細胞前駆細胞、水平細胞前駆細胞、双極細胞前駆細胞、アマクリン細胞前駆細胞、神経節細胞前駆細胞、又は網膜色素上皮細胞前駆細胞等という場合、それぞれが分化した細胞、即ち、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞、又は網膜色素上皮細胞等を含んでいても良い。
本明細書における「網膜層特異的神経細胞」とは、網膜層を構成する細胞であって網膜層に特異的な神経細胞を意味する。網膜層特異的神経細胞としては、双極細胞、神経節細胞、アマクリン細胞、水平細胞、視細胞が挙げられ、視細胞としては、桿体視細胞（Rod photoreceptor cell）及び錐体視細胞（Cone photoreceptor cell）を挙げることができる。また、錐体視細胞としては、S-opsinを発現し青色光を受容するS錐体視細胞、L-opsinを発現し赤色光を受容するL錐体視細胞、及びM-opsinを発現し緑色光を受容するM錐体視細胞を挙げることができる。
本明細書における「網膜細胞」とは、上述の網膜色素上皮細胞、ミューラー細胞、視細胞、水平細胞、双極細胞、アマクリン細胞、神経節細胞及びこれらの前駆細胞、網膜前駆細胞、神経網膜前駆細胞、並びに網膜層特異的神経細胞及び網膜層特異的神経細胞の前駆細胞等を包含する概念である。
上述の網膜組織を構成する細胞は、それぞれに発現するもしくは発現しない網膜細胞マーカーを指標として検出もしくは同定することができる。
網膜細胞マーカーとしては、網膜細胞において優位に発現している遺伝子・タンパク質が挙げられ、それぞれの細胞毎に、以下のとおり例示することができる。あるいは、網膜細胞以外で優位に発現している遺伝子・タンパク質をネガティブマーカーとして用いることもできる。
網膜前駆細胞、神経網膜前駆細胞、視細胞前駆細胞等の網膜細胞のネガティブマーカーとしては、視床下部ニューロンの前駆細胞では発現し網膜前駆細胞では発現しないNKX2.1、視床下部神経上皮で発現し網膜では発現しないSOX1等が挙げられる。
網膜前駆細胞のマーカーとしては、RX（RAXとも言う）及びPAX6が挙げられる。
神経網膜前駆細胞のマーカーとしては、RX、PAX6及びCHX10が挙げられる。
網膜層特異的神経細胞のマーカーとしては、双極細胞で発現するCHX10、PKCα、Goα、VSX1及びL7、神経節細胞で発現するTUJ1及びBRN3、アマクリン細胞で発現するCalretinin及びHPC-1、水平細胞で発現するCalbindin、LIM1等が挙げられる。
また、視細胞前駆細胞及び視細胞で発現するマーカーとしては、CRX、リカバリン（Recoverin）、BLIMP1及びOTX2等が挙げられる。更に、桿体視細胞及び桿体視細胞前駆細胞で発現するマーカーとして、NRL、ロドプシン（Rhodopsin）等が挙げられる。従って、例えばCRX陽性細胞がNRL陽性であることを指標にして、桿体視細胞及び桿体視細胞前駆細胞を同定することができる。錐体視細胞、錐体視細胞前駆細胞及び神経節細胞で発現するマーカーとして、RXR-γが挙げられる。また、錐体視細胞及び錐体視細胞前駆細胞で発現するマーカーとして、TRβ2、又はTRβ1が挙げられる。例えば、錐体視細胞前駆細胞は、TRβ2及びCRX、又はTRβ1及びCRXを共発現していることを指標に同定することができる。また、錐体視細胞前駆細胞はRXR-γ及びCRXを共発現し、NRLを発現していないことを指標に同定することもできる。
また、OC1（ONECUT1/HNF6）及びOC2（ONECUT2）は、錐体視細胞前駆細胞の分化に必要であり、分化の際一過的に発現する因子である。また、神経節細胞の一部、水平細胞、一部のアマクリン細胞でも発現する。例えば、OC1及びOC2を発現する錐体視細胞前駆細胞又は錐体視細胞及び水平細胞の前駆細胞から錐体視細胞前駆細胞又は錐体視細胞及び水平細胞へ分化する際、錐体視細胞前駆細胞又は錐体視細胞ではOC1及びOC2の発現が低下するのに対し、水平細胞ではOC1及びOC2の発現が上昇する。従って、その発現量又は割合を測定することにより、錐体視細胞前駆細胞の分化効率を判定することができる。
また、錐体視細胞及び錐体視細胞前駆細胞が誘導され、桿体視細胞前駆細胞が出現する前の段階の網膜組織であることは、CRX陽性細胞がNRL陰性かつTRβ2陽性であること、又はNRL陰性かつRXR-γ陽性であることを指標に確認することができる。OTX2は視細胞前駆細胞及び視細胞の他、双極細胞でも発現するマーカーであるが、神経網膜組織に含まれるOTX2陽性細胞が、CHX10陰性で、かつNRL陰性であれば、錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞のマーカーとして利用できる。一方、神経網膜組織に含まれるOTX2陽性のうち、NRL陽性細胞は、桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞として同定できる。
更に、S錐体視細胞のマーカーとしてS-opsin、L錐体視細胞のマーカーとしてL-opsin、及びM錐体視細胞のマーカーとしてM-opsinをそれぞれ挙げることができる。
水平細胞、アマクリン細胞及び神経節細胞で共通して発現するマーカーとして、PAX6などが挙げられる。
その他、網膜組織に含まれる網膜細胞のマーカーとして、網膜色素上皮細胞で発現するRPE65、MITF及びPAX6、ミューラー細胞で発現するCRABP及びCRALBPなどが挙げられる。
網膜組織における背側マーカー及び腹側マーカーとは、網膜組織において、それぞれ背側及び腹側に相当する組織で発現する遺伝子・タンパク質を意味する。
背側マーカーとしては、網膜組織のうち、神経網膜組織の背側化領域で発現するTBX5、TBX3、TBX2、COUP-TF II、CYP26A1、CYP26C1及びALDH1A1等のマーカーが挙げられる。このうち、COUP-TF IIは、「最も背側のマーカー」に分類することができ、ALDH1A1も当該領域に近づくにつれ、その発現量が高まる因子である。また、腹側マーカーとしては、神経網膜組織の腹側領域で発現するVAX2、COUP-TF I及びALDH1A3等のマーカーが挙げられる。
生体の神経網膜組織、又は多能性幹細胞より分化誘導された神経網膜組織の浮遊培養において、背側化シグナルを増強することにより、分化誘導される錐体視細胞の割合が増加することは知られていなかったが、本願発明者らは、
１）背側化シグナル伝達物質により背側マーカーであるCYP26A1が陽性の領域（すなわち、CYP26A1の発現が上昇した神経網膜組織）を誘導可能であり、錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の含まれる割合が増大した神経網膜組織を得ることができること、及び、
２）前記１）よりさらに背側に存在し、最も背側のマーカーであるCOUP-TF IIが誘導された神経網膜組織において、錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の含まれる割合がかえって抑制されることを見出した。
一方、２）よりさらに背側に存在する網膜色素上皮では錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞が出現しないことが当業者に知られている。
従って、CYP26A1、COUP-TF II、RPE65又はMITFをマーカーとして確認し、背側マーカーが亢進し、かつ最も背側のマーカーの発現が亢進しない程度に背側化シグナルの強さを適切に調節することにより錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の割合に富む神経網膜を製造することができる。
本明細書における「無血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含まない培地を意味する。本明細書では、精製された血液由来成分や動物組織由来成分（例えば、増殖因子）が混入している培地も、無調整又は未精製の血清を含まない限り無血清培地に含まれる。
本明細書における「無血清条件」とは、無調整又は未精製の血清を含まない条件、具体的には、無血清培地を使用する条件を意味する。
ここで無血清培地は、血清代替物を含有していてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、コラーゲン前駆体、微量元素、2－メルカプトエタノール又は3’-チオールグリセロール、あるいはこれらの均等物などを適宜含有するものを挙げることができる。かかる血清代替物は、例えば、WO98／30679に記載の方法により調製することができる。血清代替物として市販品を利用してもよい。かかる市販の血清代替物としては、例えば、KnockoutTM Serum Replacement（Life Technologies社製：以下、KSRと記すこともある。）、Chemically－defined Lipid concentrated（Life Technologies社製）、GlutamaxTM（Life Technologies社製）、B27（Life Technologies社製）、N2（Life Technologies社製）が挙げられる。
また、無血清培地は、適宜、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2－メルカプトエタノール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。
調製の煩雑さを回避するために、かかる無血清培地として、市販のKSR（ライフテクノロジー（Life Technologies）社製）を適量（例えば、約0.5%から約30%、好ましくは約1%から約20%）添加した無血清培地（例えば、F-12培地とIMDM培地の1：1混合液に10% KSR及び450μM 1－モノチオグリセロールを添加した培地）を使用してもよい。また、KSR同等品として特表2001-508302に開示された培地が挙げられる。
本明細書における「血清培地」とは、無調整又は未精製の血清を含む培地を意味する。当該培地は、脂肪酸又は脂質、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸）、ビタミン、増殖因子、サイトカイン、抗酸化剤、2-メルカプトエタノール、1-モノチオグリセロール、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等を含有してもよい。また、本発明により製造された網膜細胞又は網膜組織を維持する工程において、血清培地を使用することができる（Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012)）。
前記無血清培地又は血清培地に、既知の増殖因子、タンパク質、増殖を促進する添加剤や化学物質等を添加してもよい。既知の増殖因子、タンパク質としては、EGF、FGF、IGF、insulin等を挙げることができる。増殖を促進する添加剤として、N2 supplement（N2, Invitrogen社）、B27 supplement（Invitrogen社）等を挙げることができる。増殖を促進する化学物質としては、レチノイド類（例えば、レチノイン酸またはその誘導体）、タウリン、グルタミン等を挙げることができる。
本明細書において、「ゼノフリー」とは、培養対象の細胞の生物種とは異なる生物種由来の成分が排除された条件を意味する。
本明細書において、「物質Xを含む培地」「物質Xの存在下」とは、外来性（exogenous）の物質Xが添加された培地または外来性の物質Xを含む培地、又は外来性の物質Xの存在下を意味する。すなわち、当該培地中に存在する細胞または組織が当該物質Xを内在的（endogenous）に発現、分泌もしくは産生する場合、内在的な物質Xは外来性の物質Xとは区別され、外来性の物質Xを含んでいない培地は内在的な物質Xを含んでいても「物質Xを含む培地」の範疇には該当しないと解する。
例えば、「背側化シグナル伝達物質を含む培地」とは、外来性の背側化シグナル伝達物質が添加された培地または外来性の背側化シグナル伝達物質を含む培地であり、「背側化シグナル伝達物質の存在下」とは、外来性の背側化シグナル伝達物質の存在下を意味する。また、「BMPシグナル伝達経路阻害物質を含まない培地」とは、外来性のBMPシグナル伝達経路阻害物質が添加されていない培地または外来性のBMPシグナル伝達経路阻害物質を含まない培地である。
本明細書において、「背側化シグナル伝達物質」とは、発生の過程で背側に形成される網膜組織への分化を促進するシグナル伝達物質を意味する。背側化シグナル伝達物質としては、背側化シグナルを伝達するBMPシグナル伝達経路作用物質、BMPの発現を誘導するWntシグナル伝達経路作用物質、及び腹側化シグナルを阻害するソニック・ヘッジホッグ（以下、SHHと記すことがある。）シグナル伝達経路阻害物質を挙げることができる。腹側化シグナルを阻害する物質を腹側化シグナル伝達阻害物質とも称する。
前記BMPシグナル伝達経路作用物質とは、BMPにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。BMPシグナル伝達経路作用物質として、具体的には、BMP2、BMP4もしくはBMP7等のBMP蛋白、GDF7等のGDF蛋白、抗BMP受容体抗体（アゴニスト抗体）、又は、BMP部分ペプチド等を挙げることができる。BMPシグナル伝達経路作用物質として、好ましくはBMP4が挙げられる。
前記Wntシグナル伝達経路作用物質とは、Wntにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。Wntシグナル伝達経路作用物質としては、例えば、Wntファミリーに属するタンパク質（例えば、Wnt1、Wnt3A、Wnt7A、Wnt2B）、Wnt受容体、Wnt受容体アゴニスト、抗Wnt受容体抗体、Wnt部分ペプチド、βカテニンシグナル伝達物質、GSK3β阻害剤（例えば、6-Bromoindirubin-3'-oxime（BIO）、CHIR99021、Kenpaullone）等を挙げることができる。
前記SHHシグナル伝達経路阻害物質とは、SHHにより媒介されるシグナル伝達を阻害し得る物質である。SHHシグナル伝達経路阻害物質としては、SHH受容体アンタゴニスト、SHHドミナントネガティブ体、SHHシグナル伝達経路作用物質に対する抗体、可溶型SHH受容体等を挙げることができる。SHHシグナル伝達経路阻害物質として具体的には、GANT58、GANT61、Jervine、SANT-1、Veratramine、Cyclopamine、Cyclopamine-KAAD（GENES & DEVELOPMENT 16:2743-2748）などが挙げられる。SHHシグナル伝達経路阻害物質として、好ましくはCyclopamine-KAADが挙げられる。
本明細書において、「腹側化シグナル伝達物質」とは、発生の過程で腹側に形成される網膜組織への分化を促進するシグナル伝達物質を意味する。腹側化シグナル伝達物質としては、腹側化シグナルを伝達するSHHシグナル伝達経路作用物質、及び背側化シグナルを阻害するBMPシグナル伝達経路阻害物質を挙げることができる。背側化シグナルを阻害する物質を背側化シグナル伝達阻害物質とも称する。
前記SHHシグナル伝達経路作用物質とは、SHHにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質である。SHHシグナル伝達経路作用物質としては、SHHにより媒介されるシグナル伝達を増強し得る物質であれば特に限定はなく、例えば、Hedgehogファミリーに属する蛋白質（例えば、SHHやIhh）、SHH受容体、SHH受容体アゴニスト、Purmorphamine、又はSAG（Smoothened Agonist；N-Methyl-N'-(3-pyridinylbenzyl)-N'-(3-chlorobenzo[b]thiophene-2-carbonyl)-1,4-diaminocyclohexane）等が挙げられる。SHHシグナル伝達経路作用物質として、好ましくはSAGが挙げられる。
SAGのSHHシグナル伝達増強活性は、当業者に周知の方法、例えばGLI1遺伝子の発現に着目したレポータージーンアッセイにて決定することができる（Oncogene (2007) 26, 5163-5168）。
前記BMPシグナル伝達経路阻害物質とは、BMPにより媒介されるシグナル伝達を阻害し得る物質である。ここでBMPとしては、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7が挙げられる。BMPシグナル伝達経路阻害物質としては、BMPに直接作用する物質（例えば抗体、アプタマー等）、BMPをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、BMP受容体（BMPR）とBMPの結合を阻害する物質（例えば、BMP受容体アンタゴニスト、BMPドミナントネガティブ体、可溶型BMP受容体等）、BMP受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。BMPRとして、ALK2又はALK3を挙げることができる。BMPシグナル伝達経路阻害物質として具体的には、Noggin、Chordin、Dorsomorphin、LDN193189（4-[6-(4-ピペラジン-1-イルフェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル]キノリン）などが挙げられる。BMPシグナル伝達経路阻害物質として、好ましくはLDN193189が挙げられる。
２．網膜組織に含まれる視細胞中の錐体視細胞の割合を増加させる方法（錐体視細胞に富む網膜組織の製造方法）
発生初期段階の網膜組織を、背側化シグナル伝達物質を実質的に含まない培地で培養すると、腹側マーカーの発現上昇が認められ、腹側マーカーであるALDH1A3陽性領域では視細胞前駆細胞及び／又は錐体視細胞前駆細胞の出現が抑制される場合がある。これに対し、背側化シグナル伝達物質が添加された培地で培養すると、上記ALDH1A3陽性領域が減少し、これに伴い視細胞前駆細胞及び／又は錐体視細胞前駆細胞の出現が促進される場合がある。一方で、高活性もしくは高濃度の背側化シグナル伝達物質が添加された培地で培養した場合、強い背側化シグナルにより最も背側のマーカーであるCOUP-TF II及び、神経網膜組織の背側化領域へ近づくほど発現が高まるALDH1A1が誘導され、錐体視細胞前駆細胞もしくは錐体視細胞への分化誘導が抑制され得る。従って、錐体視細胞前駆細胞もしくは錐体視細胞の割合が高い網膜組織へ分化誘導させるためには、背側化シグナルの強度、すなわち背側化の程度を適切に調節する必要がある。
すなわち、本発明の一態様として、発生初期段階から錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階までの網膜組織を、腹側マーカーの発現を抑制する程度の濃度の背側化シグナル伝達物質を含む培地で培養する工程を含む、網膜組織に含まれる視細胞前駆細胞（photoreceptor precursor）及び視細胞(photoreceptor)中の錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の割合を増加させる方法が挙げられる。背側化シグナル伝達物質の濃度は好ましくは、最も背側のマーカーの発現を誘導しない程度の濃度である。
前記「腹側マーカー」としては、具体的にはVAX2、COUP-TF I又はALDH1A3が挙げられる。
上記「最も背側のマーカー」とは、発生の段階で、網膜組織の最も背側領域に存在する細胞において発現するマーカーを意味し、過剰な、又は比較的強力な背側化シグナルにより発現上昇するマーカーとも言える。網膜組織における最も背側のマーカーとしては、具体的には過剰な背側化シグナルにより網膜色素上皮もしくはその前駆細胞へと分化した細胞で発現するRPE65又はMITF、COUP-TF II、好ましくは比較的強力な背側化シグナルにより神経網膜組織で発現するCOUP-TF II等が挙げられる。
ここで「腹側マーカーの発現を抑制する程度の濃度」は、当業者であれば、容易に決定できる。例えば、上記腹側マーカーに対する抗体等を用いる免疫染色等の手法を用い、視細胞前駆細胞が初めに出現する段階から錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階までのいずれかの段階の網膜組織において、例えば錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階の網膜組織において、背側化シグナル伝達物質を添加しない場合に比べ上記腹側マーカーの発現が認められる領域をImageJ等の画像解析ソフトを用いて解析し、適宜、当該発現が抑制されている領域が増大する背側化シグナル伝達物質の濃度を、錐体視細胞の割合を増大させるために適切な濃度として決定すればよい。すなわち、視細胞前駆細胞及び／又は視細胞を含む神経網膜組織において上記腹側マーカーの発現が認められる領域が50%以下、好ましくは20%以下、より好ましくは1%以下、更により好ましくは0.01%以下となるように、添加する背側化シグナル伝達物質の濃度を決定することができる。あるいは、腹側化シグナル伝達物質であるBMPシグナル伝達経路阻害物質により腹側化され、ALDH1A3等の腹側マーカーが高発現した網膜組織を指標とし、これに比べてALDH1A3の遺伝子発現量が50%以下、好ましくは20%以下、より好ましくは5%以下となるように、添加する背側化シグナル伝達物質の濃度を決定することができる。
また、「最も背側のマーカーを誘導しない程度の濃度」は、当業者であれば、適宜決定できる。例えば、上記最も背側のマーカーに対する抗体等を用いる免疫染色等の手法を用い、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階の網膜組織において、上記最も背側のマーカーの発現が認められる領域をImageJ等の画像解析ソフトを用いて解析し、最も背側のマーカーの発現誘導が認められない領域（ここで「発現誘導が認められない」とは、生体の最も背側の神経網膜組織における発現量に比べて1/5以下、好ましくは1/10以下、更に好ましくは1/50以下であることを意味する。）が、神経網膜組織の50%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、更により好ましくは99%以上となるように、背側化シグナル伝達物質の濃度を、適宜決定すればよい。
本発明の一態様として、発生初期段階から錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階までの網膜組織を、背側マーカーの発現を促進する程度の濃度の背側化シグナル伝達物質を含む培地で、培養する工程を含む、網膜組織に含まれる視細胞前駆細胞（photoreceptor precursor）及び視細胞(photoreceptor)中の錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の割合を増加させる方法が挙げられる。
「背側マーカーの発現を促進する程度の濃度」は、当業者であれば、容易に決定できる。例えば、上記背側マーカーのタンパク質又は遺伝子（mRNA）の発現量を解析することで容易に決定できる。具体的には様々な濃度の背側化シグナル伝達物質を培地中へ添加し、免疫染色、又は定量的PCRにより背側の発現量、又は遺伝子発現量が最も高くなる濃度を決定すれば良い。
例えば、CYP26A１及び／又はCYP26C1の発現が最も強く誘導される程度の濃度となるように背側化シグナル伝達物質の濃度を決定すればよい。具体的には上述のBMPシグナル伝達経路阻害物質により腹側化され、CYP26A1の発現が抑制された網膜組織に比べ、CYP26A1の発現量が1.2倍以上、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上となる程度の濃度である。ただし、CYP26A1及び／又はCYP26C1の発現量を基に背側化シグナル伝達物質の濃度を決定する場合、全トランス（all trans）レチノイン酸、9-シスレチノイン酸等のレチノイン酸類は背側化の程度と無関係にこれらの遺伝子発現を過剰に誘導してしまい、背側化シグナル伝達物質の濃度決定を困難にするため、レチノイン酸類が実質的に添加されていない培地を用いて決定することが好ましい。
一方、ALDH1A1の場合、ALDH1A1はCYP26A1陽性領域では弱く発現しており、さらに背側へ近づくにつれ、連続的に発現量が高くなる。即ち、CYP26A1又はCYP26C1陽性領域に比べ、神経網膜組織のうち最も背側であるCOUP-TF II陽性領域でより発現量が高いマーカーである。従ってALDH1A1の発現は高すぎない方が望ましい。具体的には、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階において、ALDH1A1陽性細胞の頻度は約１%以下である。すなわち、当該段階においてALDH1A1の発現が十分に低くなる程度の濃度に背側化シグナル伝達物質の濃度を調整することが望ましい。
ここで「ALDH1A1の発現が十分に低くなる程度の濃度」は、当業者であれば、決定できる。例えば、ALDH1A1に対する抗体等を用いて通常実施される免疫染色等の手法を用い、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階の網膜組織において、ALDH1A1を発現する領域をImageJ等の画像解析ソフトを用いて解析し、当該領域が網膜組織中の神経網膜組織の50%以下、好ましくは20%以下、より好ましくは10%以下、更により好ましくは1%以下となる程度の濃度を決定すればよい。あるいは、かかる網膜組織の遺伝子発現量について、定量的PCR等により測定すればよい。すなわち、例えば0.45 nM～1.35 nMといった比較的高濃度のBMP4を加えると、過剰にALDH1A1の発現が誘導される。従ってALDH1A1の発現量は、好ましくは、1.35 nMのBMP4を添加して分化誘導を行った場合に比べて30%、より好ましくは15%、更により好ましくは10%以下となる程度の濃度に決定すればよい。
本発明の一態様として、「腹側マーカーの発現を抑制し、かつ最も背側のマーカーの発現を誘導しない程度の濃度の背側化シグナル伝達物質」としては、網膜組織に含まれる細胞に対する錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階の網膜組織において、OC2を発現する細胞数の神経網膜組織に含まれる全細胞数に対する割合が、背側化シグナル伝達物質を添加しない場合に比べ、約20%～70%、好ましくは約30%～70%、より好ましくは約50%～65%となる程度（例えば、0.15 nMのBMP4、又は500 nMのCyclopamine-KAADを添加した場合約60%～65%の細胞がOC2を発現する）、又は前記BMPシグナル伝達経路阻害物質を添加した場合に比べ約30%～60%、好ましくは約40%～50%となる程度（例えば、0.15 nMのBMP4、又は500 nMのCyclopamine-KAADを添加した場合約45%～47%の細胞がOC2を発現する）に抑制される濃度の背側化シグナル伝達物質が挙げられる。又は、背側化シグナル伝達物質を添加しない場合、及び／又は前記BMPシグナル伝達経路阻害物質を添加した場合に比べ、OC2陽性細胞のOC2タンパク質の発現量が平均約20%～70%、好ましくは約30%～70%、より好ましくは約30%～40%となる程度（例えば、0.15 nMのBMP4、又は500 nMのCyclopamine-KAADを添加した場合、約34%～36%）に抑制される濃度の背側化シグナル伝達物質が挙げられる。
ここで、神経網膜組織中に含まれるOC2陽性細胞数の割合については、当業者であれば通常実施可能な免疫染色等を抗OC2抗体、DAPI等を用いて実施し、OC2陽性の細胞数、DAPI陽性細胞数等を測定し、神経網膜組織に含まれる割合を同定すればよい。OC2タンパク質の発現量は、当業者であれば通常実施可能な免疫染色等を抗OC2抗体、DAPI等を用いて実施し、抗OC2抗体により染色された領域をImageJ等の画像解析ソフトを用いて解析すれば、OC2陽性細胞のシグナル強度を同定できる。あるいは神経網膜組織中に含まれるOC2陽性細胞数の割合、及び／又はOC2陽性細胞のOC2タンパク質の発現量はOC2タンパク質に対する抗体を用いて通常のフローサイトメトリーを用いた解析により同定してもよい。
また、上記「視細胞前駆細胞が初めに出現する段階」は、当業者であれば、視細胞前駆細胞マーカー、及び／又は錐体視細胞前駆細胞マーカーによる免疫染色及びDAPIによる核染色等により同定できる。具体的には、例えば分化が進行している網膜組織について、パラホルムアルデヒドなどで固定した後、凍結切片を作製する。凍結切片について例えばCRX抗体、TRβ2抗体、RXR-γ抗体等で染色し、同時にDAPIなどを用いて細胞核を染色した後、網膜組織中に初めて視細胞前駆細胞及び／又は錐体視細胞前駆細胞が出現する段階を同定すればよい。
また、上記「錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階」は、当業者であれば、視細胞前駆細胞マーカー、及び／又は錐体視細胞前駆細胞マーカーによる免疫染色及びDAPIによる核染色等により同定できる。
具体的には、例えば、分化が進行している網膜組織を一定期間（例えば1～20日）おきに回収し（例えば培養開始から40日後、50日後、60日後、70日後、80日後）、パラホルムアルデヒドなどで固定した後、凍結切片を作製する。当該凍結切片について例えばCRX抗体、TRβ2抗体、RXR-γ抗体等で染色し、同時にDAPIなどを用いて細胞核を染色した後、神経網膜組織中に含まれる全細胞数に対する錐体視細胞前駆細胞数（即ちCRXおよびRXR-γ、又は、CRXおよびTRβ2を発現する細胞数）の割合を同定する。この時、上記一定期間中に出現する錐体視細胞前駆細胞マーカー陽性細胞の全細胞数に対する割合、すなわち出現率を、複数の時期（タイミング）で求めることにより、錐体視細胞前駆細胞マーカー陽性細胞の出現する割合が最も高い時期を「錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階」として特定できる。
また、特定の期間(例えば1～7日間)、細胞増殖期にある細胞（ここでは増殖能を持つ網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞）へ取り込まれるBrdU、又はEdU等を培養液中へ添加し、BrdU、又はEdU等を取り込んだ細胞が上述の錐体視細胞前駆細胞マーカーを発現する細胞として分化した割合を当業者に周知の免疫染色等によって測定し、当該割合と分化段階の関係（例えば、当該割合が最も高い時期（段階）等）を判定することにより、「錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大に至る段階」を同定することができる。
具体的には、例えば以下の手順で同定することができる：
１）BrdUまたはEdUを、任意の分化段階の網膜組織を培養する培養液中に任意の１日間添加して培養し（例えば培養開始から40日後～41日後、41日後から～42日後、42日後から～43日後、というように、1日おきにBrdUを添加して1日間培養することを培養開始から80日後まで繰り返す）、その直後に回収した網膜組織についてBrdUまたはEdU陽性細胞のうちCRX及びRXR-γ陽性細胞の割合、又はCRX及びTRβ2陽性細胞の割合を測定する工程；
２）測定結果を比較し、BrdUまたはEdU陽性のうち、CRX及びRXR-γ陽性細胞の増加する割合、又はCRX及びTRβ2陽性細胞の増加する割合が最も高くなる網膜組織を同定する工程；及び
３）BrdUまたはEdU陽性のうち、CRX及びRXR-γ陽性細胞の増加する割合、又はCRX及びTRβ2陽性細胞の増加する割合が最も高くなる網膜組織を培養した際にBrdUまたはEdUを培養液中に添加していた期間（例えば、1日間）を、「錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大に至る段階」として同定する工程。
具体的には、「錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階」は、錐体視細胞前駆細胞の出現が認められてから30～50日後、好ましくは30～40日後に相当する。
本明細書において、「発生初期段階」とは、網膜前駆細胞は出現しているが、神経節細胞が出現していない段階を意味する。この段階では、神経網膜前駆細胞が出現していてもよい。すなわち、当該段階においては、RX（RAX）陽性及びPAX6陽性（更にCHX10陽性細胞であってもよい）の細胞が含まれ、TUJ1陽性細胞、BRN3陽性細胞、及びTUJ1、BRN3及びPAX6の少なくとも２種類のマーカーが陽性である細胞は含まれない。「発生初期段階の網膜組織」は網膜前駆細胞及び／又は神経網膜前駆細胞、すなわち視細胞及び神経節細胞に分化し得る細胞が含まれ、神経節細胞が含まれていなければ特に制限はなく、毛様体周縁部構造体を含んでいてもよい。
発生初期段階の網膜組織は、例えば後述する原料製造方法５～７に準じて製造する場合には浮遊培養開始後22日目（d22）～33日目（d33）に相当し、原料製造方法１～４に準じて製造する場合には、浮遊培養開始後12日目（d12）～27日目（d27）に相当する。
「発生初期段階の網膜組織」は、網膜前駆細胞マーカー、神経網膜前駆細胞マーカー及び神経節細胞マーカーの発現状況を確認することにより同定することができる。
発生初期段階の網膜組織には、「眼胞」に相当するもの、又は眼胞からやや分化が進行した、RX陽性、PAX6陽性及びCHX10陽性である神経網膜前駆細胞を含みかつ神経節細胞が存在しない「眼杯の最初期」の網膜組織が包含される。
本発明において、背側化シグナル伝達物質を含む培地で培養する工程（工程（１））は、「発生初期段階」から「錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階」の間の任意の期間に実施されれば良く、この期間内であれば工程（１）を開始する時期や期間に制限はない。工程（１）は、好ましくは発生初期段階から約40日以内に開始され、より好ましくは20日以内、更により好ましくは、発生初期段階に開始される。
発生初期段階の網膜組織としては、多能性幹細胞から分化誘導された、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含み、かつ神経節細胞が出現していない分化段階にある網膜組織が挙げられる。更に、発生初期段階の網膜組織は、視細胞もしくは神経細胞に分化し得る細胞を含み得る。
発生初期段階の網膜組織を製造する方法に特に限定はなく、また、浮遊培養・接着培養のどちらの培養方法であってもよい。当該方法としては、WO2013/077425 (& US2014/341864)、WO2015/025967 (& US2016/251616)、WO2016/063985（& US2017/313976）、WO2016/063986（& US2017/313981）及びWO2017/183732に記載された方法等を挙げることができる。また、当該方法として非特許文献：Proc Natl Acad Sci U S A. 111(23): 8518-8523（2014）、Nat Commun. 5:4047（2014）、Stem Cells.（2017）:35(5), 1176-1188等に記載された方法等を挙げることができる。
具体的には、ES細胞もしくはiPS細胞等の多能性幹細胞からSFEBq法（Nat Commun. 6:6286 (2015)を参照）にて調製された細胞凝集体（細胞塊）を例えば、BMP4等の分化誘導剤の存在下に浮遊培養することにより得られる、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体が挙げられる。
また、発生初期段階の網膜組織は、神経上皮細胞を含む細胞集団から誘導される細胞であってもよく、前記細胞集団は、ES細胞もしくはiPS細胞等の多能性幹細胞から分化誘導するか、成人の網膜に存在する幹細胞を採取しこれを分化誘導して得ることもできる。
発生初期段階の網膜組織は、具体的には、網膜前駆細胞マーカー陽性（好ましくは、RX陽性かつPAX6陽性）の網膜前駆細胞、または神経網膜前駆細胞マーカー陽性（好ましくは、CHX10陽性かつPAX6陽性かつRX陽性）の神経網膜前駆細胞を網膜組織に含まれる全細胞数の30%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上、更により好ましくは99%以上含む網膜組織であり、神経節細胞マーカー陽性（好ましくは、BRN3陽性）の神経節細胞の割合が全細胞数の40％以下、好ましくは20％以下、10％以下、5%以下、より好ましくは１%以下、更に好ましくは0.1％以下、更により好ましくは0.01％以下の網膜組織である。
発生初期段階の網膜組織を背側化シグナル伝達物質の存在下に培養する際に用いられる培地は、背側化シグナル伝達物質の効果を阻害する物質を、前記効果を阻害可能な量含まない限り、特に限定はなく、細胞培養用として市販されている培地に、適宜必要に応じて添加物を加えた培地を用いることができる。当該培地は、好ましくは網膜組織の連続上皮構造を保つことができる培地であり、具体的に使用可能な培地としては、Wnt2bが添加された培地、Neurobasal培地、Neurobasal培地を含む培地等が挙げられ、Wnt2bが添加されたNeurobasal培地でもよい。また、以下に説明する、連続上皮組織維持用培地を使用することができる。
本明細書において、連続上皮組織維持用培地は、網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の細胞分化を抑制し得る濃度のメチル基供与体又はメチル基供与体の基質、及び神経突起伸長を抑制し得る濃度の神経突起伸長抑制剤のうち少なくとも一つを含有する。好ましくは、連続上皮組織維持用培地は、網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の細胞分化を抑制する濃度のメチル基供与体又はメチル基供与体の基質、及び神経突起伸長を抑制する濃度の神経突起伸長抑制剤を含有する。
生体内においてはメチルトランスフェラーゼによりメチルドナーからDNAやヒストンを含むタンパク質へメチル基が移転される。本明細書において、メチル基供与体とは、DNA又はヒストンを含むタンパク質に対し、移転するためのメチル基を供与し得る物質 (メチルドナー)である。また、本明細書において、メチル基供与体の基質とは、前記メチルドナーを生合成するのに必要な基質のことである。具体的には、メチル基供与体としてS-アデノシルメチオニン（S-adenosylmethionine、SAMともいう）、メチル基供与体の基質としてメチオニン、S-メチル-5’-チオアデノシン(S-methyl-5’-thioadenosine、MTAと略すことがある)、ホモシステイン（homocysteine、Hcyと略すことがある）等が挙げられる。本発明においては、好適には、メチオニンが用いられる。
網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の細胞分化を抑制するかどうかは、例えば、網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞を含む発生初期段階の網膜組織に評価対象の物質を作用させ、一定期間培養した後に、網膜組織内の網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の割合を同定するか、網膜組織内の分化細胞、又は分化し増殖を停止した細胞の割合を同定すればよい。具体的には、例えば神経節細胞が出現し始め、一定の期間（例えば5日間～50日間）を経た後、網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の減少率；網膜組織内の分化細胞や増殖を停止している細胞又は最終分化に必要なbHLH型転写因子を発現する細胞の増加率；或いはbHLH型転写因子の発現量を、免疫染色、定量的PCR等により同定すればよい。網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞マーカーとしては、例えば、RX及びPAX6の組み合わせ、RX、PAX6及びCHX10の組み合わせ等が使用できる。また、網膜組織に含まれる分化した細胞のマーカー、分化した前駆細胞のマーカー、又は最終分化に必要なbHLH型転写因子マーカーとしては、例えば、BRN3、CRX、HuNu、Cath5、NeuroM、NGN1、NGN2、ISLET-1（ISL1とも言う）、OLIG2等が使用できる。細胞分化により細胞増殖を停止している細胞のマーカーとしては、例えば、p53、p27、p21等が使用できる。
メチル基供与体の基質としてメチオニンを用いる場合、連続上皮組織維持用培地中のメチオニン濃度は、通常17.24 mg/L 超（好ましくは23.62 mg/L以上、25 mg/L以上、25.75 mg/L以上、26 mg/L以上、26.81 mg/L以上、27 mg/L以上、30mg/L以上）である。連続上皮組織維持用培地中のメチオニン濃度の上限値は、連続上皮組織維持が達成される限り特に制限されないが、通常100 mg/L以下（好ましくは75 mg/L以下）である。連続上皮組織維持用培地中のメチオニン濃度の範囲は、例えば、17.24 mg/L 超100 mg/L以下、好ましくは23.62 mg/L以上75 mg/L以下、25 mg/L以上75 mg/L以下、25.75 mg/L以上75 mg/L以下、26 mg/L以上75 mg/L以下、26.81 mg/L以上75 mg/L以下、27 mg/L以上75 mg/L以下、30 mg/L以上75mg/L以下である。メチオニン以外のメチル基供与体又はその基質を用いる場合には、上記濃度のメチオニンと同等の網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞の細胞分化を抑制する作用を奏する濃度で用いる事が好ましい。
本明細書において、神経突起伸張抑制剤とは神経節細胞の神経突起伸張を抑制する物質であり、具体的には、グルココルチコイドなど神経突起伸張抑制ホルモン、セマフォリン、Nogo、Mag、OMgpタンパク質、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンなど神経突起伸張抑制タンパク質等が挙げられる。グルココルチコイドとしては、例えば、コルチコステロン、コルチゾール、コルチゾン等が挙げられる。神経突起伸張抑制剤は、好ましくはグルココルチコイドであり、より好ましくはコルチコステロンである。
神経突起伸長抑制作用は、例えば網膜組織、または網膜組織に含まれる神経節細胞を評価対象の物質の存在下で接着培養し、伸張した神経突起の長さを画像解析ソフト（例えばImage J）等により計測することにより評価することができる。
神経突起伸張抑制剤としてコルチコステロンを用いる場合、連続上皮組織維持用培地中のコルチコステロン濃度は、網膜組織に含まれる神経節細胞等の神経突起伸張を抑制する濃度であり、通常0.1nM以上（好ましくは、1 nM以上、5 nM以上、10 nM以上、50 nM以上、100 nM以上）である。連続上皮組織維持用培地中のコルチコステロン濃度の上限値は、連続上皮組織維持が達成される限り特に制限されないが、通常10 μM以下（好ましくは5 μM以下、1 μM以下）である。連続上皮組織維持用培地中のコルチコステロン濃度の範囲は、例えば、0.1 nM～10 μM、好ましくは、1 nM～5 μM、コルチコステロン以外の上記神経突起伸張抑制剤を用いる場合には、上記濃度のコルチコステロンと同等の神経突起伸長抑制作用を奏する濃度で用いる事が好ましい。
一態様において、連続上皮組織維持用培地は、上記濃度のメチオニン及びコルチコステロンを含む。一態様において、連続上皮組織維持用培地は、17.24 mg/L 超（好ましくは、23.62 mg/L以上、25 mg/L以上、25.75 mg/L以上、26 mg/L以上、26.81 mg/L以上、27 mg/L以上、30 mg/L以上）のメチオニン及び0.1 nM以上（好ましくは1 nM以上、より好ましくは5 nM以上、更に好ましくは10 nM以上、更に好ましくは50 nM以上、更に好ましくは100 nM以上）のコルチコステロンを含有する。
連続上皮組織維持用培地はさらに酸性アミノ酸、抗酸化剤及び網膜神経細胞保護物質を含有し得るが、各濃度はより低濃度である事が好ましい。
本明細書において、酸性アミノ酸としては、具体的には、グルタミン酸又はアスパラギン酸が挙げられ、それぞれL体とD体が包含される。本明細書において、L体のグルタミン酸はL-グルタミン酸、L体のアスパラギン酸はL-アスパラギン酸、D体のグルタミン酸はD-グルタミン酸、D体のアスパラギン酸はD-アスパラギン酸と表記する。本明細書において、D体とL体を区別しない場合は、「グルタミン酸」又は「アスパラギン酸」と表記する。
連続上皮組織維持用培地中のL-グルタミン酸の濃度は、好ましくは50 μM未満（より好ましくは25 μM以下、更に好ましくは12.5 μM以下、更により好ましくは1 μM以下、とりわけ好ましくは0.1 μM以下）である。一態様において、連続上皮組織維持用培地中のグルタミン酸の濃度は、好ましくは50 μM未満（より好ましくは25 μM以下、更に好ましくは12.5 μM以下、更により好ましくは1 μM以下、とりわけ好ましくは0.1 μM以下）である。
連続上皮組織維持用培地中のL-アスパラギン酸の濃度は、好ましくは50 μM未満（より好ましくは25 μM以下、更に好ましくは12.5 μM以下、更により好ましくは1 μM以下、とりわけ好ましくは0.1 μM以下）である。一態様において、連続上皮組織維持用培地に含まれるアスパラギン酸の濃度は、好ましくは50 μM未満（より好ましくは10μM以下、更に好ましくは1μM以下、更に好ましくは0.1μM以下）である。
好ましい一態様として、連続上皮組織維持用培地は、17.24 mg/L 超（好ましくは、23.62 mg/L以上、25 mg/L以上、25.75 mg/L以上、26 mg/L以上、26.81 mg/L以上、27 mg/L以上、30mg/L以上）のメチオニン及び0.1 nM以上（好ましくは1 nM以上、より好ましくは5 nM以上、更に好ましくは10 nM以上、更に好ましくは50 nM以上、更に好ましくは100 nM以上）のコルチコステロンのうち少なくとも一方（好ましくは両方）を含有し、かつ、L-グルタミン酸の濃度が50 μM未満（より好ましくは25 μM以下、更に好ましくは12.5 μM以下、更により好ましくは1 μM以下、とりわけ好ましくは0.1 μM以下）である。
さらに好ましい態様として、連続上皮組織維持用培地は、17.24 mg/L 超（好ましくは、23.62 mg/L以上、25 mg/L以上、25.75 mg/L以上、26 mg/L以上、26.81 mg/L以上、27 mg/L以上、30mg/L以上）のメチオニン及び0.1 nM以上（好ましくは1 nM以上、5 nM以上、10 nM以上、50 nM以上、100 nM以上）のコルチコステロンのうち少なくとも一方（好ましくは両方）を含有し、L-グルタミン酸の濃度が50μM未満（より好ましくは25μM以下、更に好ましくは12.5μM以下、更により好ましくは1μM以下、とりわけ好ましくは0.1μM以下）であり、且つL-アスパラギン酸の濃度が50μM未満（より好ましくは25μM以下、更に好ましくは12.5μM以下、更により好ましくは1μM以下、とりわけ好ましくは0.1μM以下）である。
本明細書において、抗酸化剤としては、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、システイン等が挙げられる。一態様において、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、及びシステインからなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての抗酸化剤の連続上皮組織維持用培地中の濃度が、以下の範囲内である：
グルタチオン：100 ng/mL以下（好ましくは10 ng/mL以下、より好ましくは1 ng/mL以下、更に好ましくは0.1 ng/mL以下）；
カタラーゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
スーパーオキシドディスムターゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
アルファトコフェロール：50 nM以下（好ましくは5 nM以下、より好ましくは0.5 nM以下、更に好ましくは0.05 nM以下）;及び
システイン：0.26 mM以下（好ましくは0.22 mM以下、より好ましくは0.18 mM以下、更に好ましくは0.1 mM以下）。
一態様において、連続上皮組織維持用培地中の、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、及びアルファトコフェロールからなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての抗酸化剤の濃度は、連続上皮構造に影響を与える程度の抗酸化作用が認められない濃度であり、システインの濃度が0.26 mM以下 （好ましくは0.22 mM以下、より好ましくは0.18 mM以下、更に好ましくは0.1 mM以下）である。その他の抗酸化剤が含まれる場合、その濃度は、好ましくは、上記濃度における上記抗酸化剤と同等の抗酸化作用を奏する濃度以下、又は抗酸化作用が認められない濃度である。抗酸化作用は、例えば、電子スピン共鳴装置（Electron Spin Resonance、ESRともいう）によってフリーラジカルに類する一部の活性酸素を直接的にスピントラップ剤の存在下で測定し、抗酸化作用を評価することができる。活性酸素を測定するその他の様々な方法（例：活性酸素により生成する過酸化脂質の量や、酸化ストレスマーカーとして利用される8－ヒドロキシデオキシグアノシン、8－ニトログアノシンの量等を測定する等）によっても、抗酸化作用を評価することができる。活性酸素量等の測定には、市販されている測定キット（コスモ・バイオ、同仁化学研究所、サーモフィッシャーサイエンティフィック等）を利用してもよい。
本明細書において、網膜神経細胞保護物質としては、プロゲステロン等が挙げられる。一態様において、連続上皮組織維持用培地中のプロゲステロンの濃度は、100 nM以下、好ましくは50nM以下、より好ましくは20 nM（または6.3 μg/mL(20.033708 nM)）以下、更に好ましくは10 nM以下、更に好ましくは3 nM以下の濃度である。一態様において、連続上皮組織維持用培地中のプロゲステロンの濃度は神経節細胞保護作用が認められない濃度である。その他の網膜神経細胞保護物質が含まれる場合、上記濃度のプロゲステロンと同等の網膜神経細胞保護作用を奏する濃度以下、又は網膜神経細胞保護作用が認められない濃度であることが好ましい。網膜神経細胞保護作用は、例えば、網膜組織に含まれる神経節細胞の割合や、アポトーシスマーカーとして知られる切断型カスパーゼ3陽性の神経節細胞の割合を同定し、その増減を同定することにより確認することができる。評価対象の物質が神経節細胞保護作用を示す場合、一定期間当該物質を作用させた網膜組織に含まれる神経節細胞の割合は、同物質を作用させなかった場合に比べ増加し、逆に切断型カスパーゼ3陽性神経節細胞の割合は減少する。神経節細胞の割合は上述した神経節細胞マーカー（例えばBRN3）に対する抗体による免疫組織染色、DAPI染色、PI染色、Hoechst染色等を用いて同定すればよい。
好ましい一態様として、連続上皮組織維持用培地は、17.24 mg/L 超（好ましくは、23.62 mg/L以上、25 mg/L以上、25.75 mg/L以上、26 mg/L以上、26.81 mg/L以上、27 mg/L以上、30mg/L以上）のメチオニン及び0.1 nM以上（好ましくは1 nM以上、より好ましくは5 nM以上、更に好ましくは10 nM以上、更に好ましくは50 nM以上、更に好ましくは100 nM以上）のコルチコステロンの少なくとも一方（好ましくは両方）を含有し、L-グルタミン酸の濃度が50μM未満（より好ましくは25μM以下、更に好ましくは12.5μM以下、更により好ましくは1μM以下、とりわけ好ましくは0.1μM以下）であり、更に、L-アスパラギン酸、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、システイン及びプロゲステロンからなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての化合物の濃度が、以下の範囲内である：
L-アスパラギン酸：50μM未満（より好ましくは25μM以下、更に好ましくは12.5μM以下、更により好ましくは1μM以下、とりわけ好ましくは0.1μM以下）；
グルタチオン：100 ng/mL以下（好ましくは10 ng/mL以下、より好ましくは1 ng/mL以下、更に好ましくは0.1 ng/mL以下）；
カタラーゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
スーパーオキシドディスムターゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
アルファトコフェロール：50 nM以下（好ましくは5 nM以下、より好ましくは0.5 nM以下、更に好ましくは0.05 nM以下）;
システイン：0.26 mM以下（好ましくは0.22 mM以下、より好ましくは0.18 mM以下、更に好ましくは0.1 mM以下）；及び
プロゲステロン：100 nM以下（好ましくは50 nM以下、より好ましくは20 nM以下（または6.3 μg/mL(20.033708 nM)以下）、更に好ましくは10 nM以下、更に好ましくは3 nM以下）。
連続上皮組織維持用培地はさらにヒポキサンチン、チミジン及びビタミンB12を含有し得るが、各濃度はより低濃度である事が好ましい。
一態様において、連続上皮組織維持用培地中のヒポキサンチン濃度は、例えば15 μM未満（好ましくは7.5 μM以下、より好ましくは3.75 μM以下、更に好ましくは1 μM以下、更により好ましくは0.1 μM以下（例えば、0 μM））である。
一態様において、連続上皮組織維持用培地中のチミジン濃度は、1.5 μM未満（好ましくは0.75 μM以下、より好ましくは0.375 μM以下、更に好ましくは0.1 μM以下、更により好ましくは0.01 μM以下（例えば、0 μM））である。
一態様において、連続上皮組織維持用培地中のビタミンB12濃度は、0.5 μM未満（好ましくは0.253 μM以下、より好ましくは0.129 μM以下、更に好ましくは0.005 μM以下）である。
好ましい態様において、連続上皮組織維持用培地中のヒポキサンチン、チミジン及びビタミンB12からなる群から選択される、2又は3の化合物の連続上皮組織維持用培地中の濃度が、上述の範囲内である。
好ましい一態様として、連続上皮組織維持用培地は、17.24 mg/L 超（好ましくは、23.62 mg/L以上、25 mg/L以上、25.75 mg/L以上、26 mg/L以上、26.81 mg/L以上、27 mg/L以上、30mg/L以上）のメチオニン及び0.1 nM以上（好ましくは1 nM以上、より好ましくは5 nM以上、更に好ましくは10 nM以上、更に好ましくは50 nM以上、更に好ましくは100 nM以上）のコルチコステロンのうち少なくとも一方（好ましくは両方）を含有し、かつ、L-グルタミン酸の濃度が50 μM未満（より好ましくは25 μM以下、更に好ましくは12.5 μM以下、更により好ましくは1 μM以下、とりわけ好ましくは0.1 μM以下）であり、L-アスパラギン酸、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、システイン、プロゲステロン、ヒポキサンチン、チミジン及びビタミンB12からなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての化合物の濃度が、以下の範囲内である：
L-アスパラギン酸：50 μM未満（より好ましくは25 μM以下、更に好ましくは12.5 μM以下、更により好ましくは1 μM以下、とりわけ好ましくは0.1 μM以下）；
グルタチオン：100 ng/mL以下（好ましくは10 ng/mL以下、より好ましくは1 ng/mL以下、更に好ましくは0.1 ng/mL以下）；
カタラーゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
スーパーオキシドディスムターゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
アルファトコフェロール：50 nM以下（好ましくは5 nM以下、より好ましくは0.5 nM以下、更に好ましくは0.05 nM以下）;
システイン：0.26 mM以下（好ましくは0.22 mM以下、より好ましくは0.18 mM以下、更に好ましくは0.1 mM以下）；
プロゲステロン：100 nM以下（好ましくは50nM以下、より好ましくは20 nM以下（または6.3 μg/mL(20.033708 nM)以下）、更に好ましくは10 nM以下、更に好ましくは3 nM以下）
ヒポキサンチン：15 μM未満（好ましくは7.5 μM以下、より好ましくは3.75 μM以下、更に好ましくは1 μM以下、更により好ましくは0.1 μM以下（例えば、0 μM））；
チミジン：1.5 μM未満（好ましくは0.75 μM以下、より好ましくは0.375 μM以下、更に好ましくは0.1μM以下、更により好ましくは0.01 μM以下（例えば、0 μM））；及び
ビタミンB12：0.5 μM未満（好ましくは0.253 μM以下、より好ましくは0.129 μM以下、更に好ましくは0.005 μM以下）。
好ましい一態様として、連続上皮組織維持用培地は、以下の組成を有する：
メチオニン：17.24 mg/L 超（好ましくは、23.62 mg/L以上、25 mg/L以上、25.75 mg/L以上、26 mg/L以上、26.81 mg/L以上、27 mg/L以上、30 mg/L以上）；
コルチコステロン：0.1 nM以上（好ましくは1 nM以上、より好ましくは5 nM以上、更に好ましくは10 nM以上、更に好ましくは50 nM以上、更に好ましくは100 nM以上）；
L-グルタミン酸：50 μM未満（より好ましくは25 μM以下、更に好ましくは12.5 μM以下、更により好ましくは1 μM以下、とりわけ好ましくは0.1 μM以下）；
L-アスパラギン酸：50 μM未満（より好ましくは25 μM以下、更に好ましくは12.5 μM以下、更により好ましくは1 μM以下、とりわけ好ましくは0.1 μM以下）；
ヒポキサンチン：15 μM未満（好ましくは7.5 μM以下、より好ましくは3.75 μM以下、更に好ましくは1 μM以下、更により好ましくは0.1 μM以下（例えば、0 μM））；
チミジン：1.5 μM未満（好ましくは0.75 μM以下、より好ましくは0.375 μM以下、更に好ましくは0.1 μM以下、更により好ましくは0.01 μM以下（例えば、0 μM））；及び
ビタミンB12：0.5 μM未満（好ましくは0.253 μM以下、より好ましくは0.129 μM以下、更に好ましくは0.005 μM以下）。
該態様において、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、L-システイン及びプロゲステロンからなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての化合物の濃度が、以下の範囲内である：
グルタチオン：100 ng/mL以下（好ましくは10 ng/mL以下、より好ましくは1 ng/mL以下、更に好ましくは0.1 ng/mL以下）；
カタラーゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
スーパーオキシドディスムターゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
アルファトコフェロール：50 nM以下（好ましくは5 nM以下、より好ましくは0.5 nM以下、更に好ましくは0.05 nM以下）;
システイン：0.26 mM以下（好ましくは0.22 mM以下、より好ましくは0.18 mM以下、更に好ましくは0.1 mM以下）；及び
プロゲステロン：100 nM以下（好ましくは50nM以下、より好ましくは20 nM（6.3 μg/mL）以下、更に好ましくは10 nM以下、更に好ましくは3 nM以下）。
連続上皮組織維持用培地は、市販されている培地を適宜配合して調製することができる。
連続上皮組織維持用培地の調製に使用可能な基礎培地としては、例えば、上述の酸性アミノ酸、抗酸化剤及びプロゲステロン等の網膜神経細胞保護物質のうち少なくとも1つ（例えば、酸性アミノ酸）、好ましくは2つ以上（例えば、酸性アミノ酸とその他のいずれかの物質）、より好ましくは全てを含まないか、上述した濃度範囲内である培地を挙げることができる。該基礎培地の一態様において、ヒポキサンチン、チミジン及びビタミンB12のうち、1つ、好ましくは2つ、より好ましくは3つが上述した濃度範囲内である。該基礎培地の一態様において、ヒポキサンチン及びチミジンが含まれず、ビタミンB12の濃度が上述した濃度範囲内である。
連続上皮組織維持用培地の調製に使用可能な基礎培地としては、メチル基供与体（例:S-アデノシルメチオニン）、メチル基供与体の基質（例：メチオニン、MTA、Hcy）及び神経突起伸長抑制剤（例；コルチコステロン）のうち少なくとも一つの濃度が上述した濃度範囲にある培地が好ましい。当該基礎培地に必要な物質を上述の濃度範囲となるように適宜補充することにより連続上皮組織維持用培地を調製することができる。
連続上皮組織維持用培地の調製に使用可能な基礎培地は、市販の基礎培地から、メーカー等が公表している成分表に基づき、上記選択基準に従って適宜選択すればよい。連続上皮組織維持用培地に使用可能な基礎培地としては、例えば、市販のNeurobasal培地(Neurobasal-A培地、フェノールレッド不含Neurobasal培地等を含む)、Improved MEM Zinc Option培地、MEM、DMEM、またはLeibovitz's L-15、E-MEM、G-MEM等を例示することができる。また、成分を個別にカスタマイズした培地を培地メーカーに注文し、購入することも可能であり、前述の記載に従って、連続上皮組織維持用培地の調製に使用可能な基礎培地用にカスタマイズした培地を用いてもよい。
コルチコステロンを補充するために補助培地を適宜配合してもよい。当該補助培地として、具体的には、B27サプリメント等を例示することができる。連続上皮組織維持用培地の一態様として、具体的には、Neurobasal培地にB27サプリメントを配合した培地を挙げることができる。該培地は適宜、L-グルタミン、タウリン、血清などを含んでいてもよい。
Neurobasal培地は、神経細胞培養用に開発された公知の基礎培地である（J. Neurosci.Res., vol. 35, p. 567-576, 1993）。Neurobasal培地は、当該報告から一部改変されているが、市販のNeurobasal培地として培地メーカーより入手可能である（例えば、サーモフィッシャーサイエンティフィック社製、21103049）。サーモフィッシャーサイエンティフィックより入手可能であるNeurobasal培地（21103049）の組成は、酸性アミノ酸（L-グルタミン酸及びL-アスパラギン酸）、プロゲステロン、ヒポキサンチン及びチミジンを含まず、DMEM/F12と比較してメチオニン濃度が高く（30 mg/L）、システイン濃度が高く（0.26 mM）、ビタミンB12濃度が低い（0.005μM）という特徴を有し、具体的な組成は以下の通りである。
Figure 2023156413000001
Figure 2023156413000002
B27サプリメントは、神経細胞培養用に開発された公知の補助培地である（J. Neurosci. Res., vol. 35, p. 567-576, 1993）。B27サプリメントはNeurobasal培地等の基礎培地に、通常、容量比率で約2%の割合で添加して使用される。コルチコステロンを含むB27サプリメントを、Neurobasal培地と組み合わせることにより、連続上皮組織維持用培地として使用可能である。例えば、上述のメチオニン濃度及びコルチコステロン濃度が達成されるように、メチオニンを含有する基礎培地（Neurobasal培地等）に対して、コルチコステロンを含有するB27サプリメントを添加し、連続上皮組織維持用培地を調製することができる。
B27サプリメント（J. Neurosci. Res., vol. 35, p. 567-576, 1993）は例えば培地メーカー（例：サーモフィッシャーサイエンティフィック、12587010）より購入する事ができ、組成は下記の通りである。
また、別の態様において、連続上皮組織維持用培地は、細胞増殖用基礎培地（例：DMEM/F12混合培地（DMEM:F12=1:1））に対して、Neurobasal培地にB27サプリメントを配合した培地を容量比で1以上 (好ましくは2以上、より好ましくは3以上)の割合で含む培地を含む。
ここで、細胞増殖用基礎培地には特に制限は無く、市販の基礎培地を単独で、又は適宜混合して使用することができる。当該細胞増殖用基礎培地は、適宜添加剤（サプリメント）を含んでいても良く、具体的なサプリメントとして、N2サプリメントを例示することができる。
上記市販のNeurobasal培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社、21103049）にB27サプリメント（サーモフィッシャーサイエンティフィック、12587010）を配合した培地および、Neurobasal培地にB27サプリメントを配合した培地とDMEM/F12混合培地（DMEM:F12=1:1）にN2サプリメントを配合した培地を3：1、2：1又は1：1の割合で混合した培地における、L-メチオニン、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、L-システイン、ヒポキサンチン、チミジン、及びビタミンB12の濃度は、例えば、以下の通りである。
一態様において、表3と同等の濃度のL-メチオニン、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、L-システイン、ヒポキサンチン、チミジン、及びビタミンB12の組成を有する培地は、連続上皮組織維持用培地として使用し得る。ここで、「同等の濃度」とは、各因子の濃度について、独立して、±20%（好ましくは±10%、より好ましくは±5%、更に好ましくは±2.5%、更により好ましくは±1%）の範囲内を包含することを意味する。
一態様において、表3と同等の濃度のL-メチオニン、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、ヒポキサンチン、チミジン、及びビタミンB12の組成を有し、コルチコステロン、グルタチオン、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼ、アルファトコフェロール、L-システイン及びプロゲステロンからなる群から選択される少なくとも1つ、好ましくは複数、より好ましくは全ての化合物の濃度が、以下の範囲内である培地を、連続上皮組織維持用培地として使用し得る：
コルチコステロン：0.1 nM以上（好ましくは1 nM以上、より好ましくは5 nM以上、更に好ましくは10 nM以上、更に好ましくは50 nM以上、更に好ましくは100 nM以上）；
グルタチオン：100 ng/mL以下（好ましくは10 ng/mL以下、より好ましくは1 ng/mL以下、更に好ましくは0.1 ng/mL以下）；
カタラーゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
スーパーオキシドディムスターゼ：100 U/mL以下（好ましくは10 U/mL以下、より好ましくは1 U/mL以下、更に好ましくは0.1 U/mL以下）；
アルファトコフェロール：50 nM以下（好ましくは5 nM以下、より好ましくは0.5 nM以下、更に好ましくは0.05 nM以下）;
システイン：0.26 mM以下（好ましくは0.22 mM以下、より好ましくは0.18 mM以下、更に好ましくは0.1 mM以下）；及び
プロゲステロン：100 nM以下（好ましくは50nM以下、より好ましくは20 nM以下（または6.3 μg/mL(20.033708 nM)以下）、更に好ましくは10 nM以下、更に好ましくは3 nM以下）。
連続上皮組織維持用培地は適宜、L-グルタミン、タウリン、N2等を含んでいても良い。タウリンの濃度は、通常1 μM～1000 μM、好ましくは10 μM～500 μMである。また、N2を含む場合はB27を添加せず、代わりにコルチコステロン等のグルココルチコイドを上述の濃度で添加するのがより好ましい。
連続上皮組織維持用培地は、連続上皮組織を維持できる範囲において、培地として通常含まれ得る、緩衝剤（例えば、HEPES）、塩（例えば、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム等の無機塩）もしくは抗酸化剤(例えば、2－メルカプトエタノール、一態様において抗酸化剤は含まない)等の調整剤、アミノ酸（例えば、非必須アミノ酸、一態様において酸性アミノ酸は含まない）、脂肪酸、糖、ビタミン、脂質もしくはピルビン酸等の栄養剤、抗生物質（例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン）、細胞外マトリクス（例えば、マトリゲル、ラミニン、ラミニンフラグメント、ラミニン511-E8フラグメント）および色素（例えば、フェノールレッド）等から適宜選択される1以上の添加物が含まれ得るが、これらに限定されない。
連続上皮組織維持用培地は、血清培地、無血清培地いずれでもよい。好ましくは血清培地である。血清培地における血清の濃度は、通常0.1～20%（v/v）、好ましくは0.1～12%（v/v）（例、10%（v/v））である。本明細書において、0.1～20%（v/v）の濃度での血清添加による、培地中に含まれる組成の濃度変化については考慮しないものとする。
前記培地はレチノイド類（例えば、レチノイン酸またはその誘導体）を含んでいても含んでいなくても良いが、一態様として、9-シスレチノイン酸を含んでいてもよい。また、レチノイド類、好ましくはALDH1A3により生合成され、錐体視細胞前駆細胞の分化を阻害するレチノイド類を実質的に含まない培地が、より好ましい態様として挙げられる。ALDH1A3により生合成され、錐体視細胞前駆細胞の分化を阻害するレチノイド類としては、具体的に全トランスレチノイン酸（all-trans retinoic acid；atRAともいう)等が挙げられる。
なお、網膜組織における「連続上皮構造」とは、網膜組織が上皮組織に特有の頂端面を持ち、頂端面が神経網膜層を形成する各層のうち、少なくとも視細胞層(外顆粒層)またはニューロブラスティックレイヤー（neuroblastic layer）と概ね平行に、かつ連続的に網膜組織の表面に形成される構造を指す。すなわち、連続上皮構造は、ロゼット様構造でみとめられるような頂端面が分断される構造を持たない。例えば、多能性幹細胞より作製した網膜組織を含む細胞凝集体の場合、凝集体の表面に頂端面が形成され、表面に対して接線方向に10細胞以上、好ましくは30細胞以上、より好ましくは100細胞以上、更に好ましくは400細胞以上の視細胞または視細胞前駆細胞が規則正しく連続して配列する。連続して配列する視細胞または視細胞前駆細胞の数は、細胞凝集体に含まれる神経網膜組織の大きさと相関する。本明細書において、上皮組織に対する接線方向とは、上皮組織において例えば頂端面を形成する一つ一つの細胞が一定方向に並んでいる場合の細胞が並んでいる方向のことをいい、上皮組織（又は上皮シート）に対して平行方向又は横方向のことをいう。
一態様において、神経網膜組織の表面には頂端面が形成され、その頂端面に沿って視細胞または視細胞前駆細胞が規則正しく連続して配列する。
視細胞または視細胞前駆細胞の出現割合が少ない段階の網膜組織（例：発生初期段階の網膜組織）の場合、増殖する神経網膜前駆細胞を含む層は「ニューロブラスティックレイヤー」と呼ばれることが当業者に知られている。また、このような段階の網膜組織の表面には視細胞又は視細胞前駆細胞以外に、極性を持ち、頂端面を形成可能な神経網膜前駆細胞、神経網膜前駆細胞から分裂、増殖する細胞、及び／又は、神経網膜前駆細胞から神経網膜を構成する細胞へと分化する段階の細胞が存在する事がある。この様な状態の網膜組織を、「連続上皮構造」を維持する条件で培養することにより、神経網膜組織の表面に形成される頂端面に沿って、視細胞または視細胞前駆細胞が規則正しく連続して配列する網膜組織が得られる。
一態様において、網膜組織の表面に存在する頂端面の面積は網膜組織の表面の面積に対し、平均で30％以上、好ましくは50％以上、より好ましくは80％以上、更により好ましくは95％以上である。網膜組織の表面に存在する頂端面の面積の割合は、後述する通り、頂端面のマーカーを染色する事で測定可能である。
本明細書において、網膜組織における「ロゼット様構造」とは、中心部の管腔を囲むように放射状又はらせん状に細胞が配列した構造を指す。ロゼット様構造を形成した網膜組織においては、その中心部（管腔）に沿って頂端面及び視細胞、又は視細胞前駆細胞が存在する状態となり、頂端面はロゼット様構造毎に分断されている。
本明細書において、「頂端面」とは、上皮組織において、ムコ多糖に富み（PAS染色陽性）、ラミニンやIV型コラーゲンを多く含む50-100nmの、上皮細胞が産生した層（基底膜）が存在する基底膜側とは反対側に形成される表面（表層面）のことをいう。一態様において、視細胞または視細胞前駆細胞が認められる程度に発生段階が進行した網膜組織においては、外境界膜が形成され、視細胞、視細胞前駆細胞が存在する視細胞層（外顆粒層）に接する面のことをいう。また、このような頂端面は、頂端面のマーカー(例：atypical-PKC（以下aPKCと略す）、E-cadherin、N-cadherin)に対する抗体を用いて、当業者に周知の免疫染色法等で同定することができる。発生初期段階で、視細胞または視細胞前駆細胞が出現していない場合や、視細胞または視細胞前駆細胞が網膜組織の表面を十分に覆うほど出現していない場合でも、上皮組織は極性を持ち、頂端面では上記頂端面のマーカーを発現する。
網膜組織が連続上皮構造を有するかどうかは、網膜組織が有する頂端面の連続性（すなわち、分断されていない形態）により確認する事ができる。頂端面の連続性は、例えば、頂端面のマーカー(例： aPKC、E-cadherin、N-cadherin)、頂端面側に位置する視細胞又は視細胞前駆細胞のマーカー（例：Crxまたはリカバリン）を免疫染色し、取得した画像等について頂端面と視細胞層、および各網膜層の位置関係を解析することにより判定できる。頂端面や視細胞層（外顆粒層）以外の網膜層については、細胞核を染色するDAPI染色、PI染色、Hoechst染色、又は細胞核に局在するマーカータンパク（Rx、Chx10、Ki67、Crx等）等による免疫染色等により同定できる。
ロゼット様構造が生じたか否かについては、細胞凝集体を4％パラホルムアルデヒドで固定するなどした後凍結切片を作製し、頂端面マーカーであるaPKC、E-cadherin、N-cadherinに対する抗体や、核を特異的に染色するDAPIなどを用いて通常実施される免疫染色等によりロゼット様構造の異形成（例：分断された頂端面又は頂端面の細胞凝集体内への侵入）を観察することで決定できる。
本発明の一態様として、連続上皮構造を有する網膜組織を含む凝集体、すなわち網膜組織の表面の少なくとも50％以上（好ましくは60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上）において視細胞又はその前駆細胞が連続して存在する網膜組織を含む凝集体が挙げられる。また、当該凝集体および連続上皮組織維持用培地を含む調製物も本発明の範疇である。
本発明の連続上皮構造を有する網膜組織の一態様として、網膜組織の表面に存在する頂端面の面積が、網膜組織の表面の面積に対し、少なくとも50％以上（好ましくは60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上）である網膜組織を含む凝集体が挙げられる。本発明の一態様として、長軸方向の直径が0.5mm以上（好ましくは0.6mm以上、0.8mm以上、1.0mm以上、1.2mm以上、1.4mm以上、1.6mm以上、1.8mm以上、2.0mm以上）である。連続上皮構造を有する網膜組織を含む凝集体が挙げられる。障害のあるレシピエントの網膜組織の広い範囲を覆うことが可能であるという観点で、移植する網膜組織は大きい方が好ましい。一般に、0.5mm～1.0mmを超える網膜組織は移植する際、ロゼット構造を生じやすい。しかし、本発明により0.5mm～1.0mmを超える網膜組織でもロゼット構造を生じることなく、連続上皮構造を有する網膜組織を含む凝集体を提供することができる。なお、当該網膜組織の構造は後述する「５．錐体視細胞の割合が高い網膜組織」、又は「６．桿体視細胞の割合が高い網膜組織」に記載のとおりである。
ここで、網膜組織の長軸方向の直径とは、例えば、実体顕微鏡を用いて撮影された画像に基づいて測定する場合、網膜組織の外周（輪郭、表面）中の任意の２点を結んだ直線の中で最も長い直線の長さを意味する。なお、網膜組織を含む凝集体の中には、複数の網膜組織が重なりあって存在する場合がある（例：クローバー型）。複数の網膜組織を含むかどうかは当業者であれば容易に判断可能である。この場合、網膜組織の長軸方向の直径とは、凝集体中のそれぞれの網膜組織における長軸方向の直径を意味し、少なくとも１つの網膜組織の長軸方向の直径が0.5mm以上であればよい。好ましくは凝集体中の全ての網膜組織の長軸方向の直径が0.5mm以上である。より具体的には、形状的に見て２つの円又は楕円が重なった点（より具体的には、網膜組織を含む凝集体の外周の連続的な位置情報を仮定的に定めた場合に、当該位置情報を横軸、当該位置における接線の傾きを縦軸にプロットしたときに得られる曲線において、当該曲線の連続性が失われる点）で区切られた外周中の任意の2点を結んだ直線の中で最も長い直線の長さを測定する。さらに、網膜組織を含む凝集体の中には、網膜色素上皮細胞、及び/又は毛様体周辺部を含む場合がある。この場合も凝集体中に複数の網膜組織が存在する場合と同様に、網膜色素上皮および/または毛様体周辺部と網膜組織の接点で区切られた外周中の任意の2点を結んだ直線の中で最も長い直線の長さを測定する。
当該網膜組織におけるRAX、CHX10および／またはCRXが発現する細胞の割合は、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上であることが好ましい。
複数個の網膜組織を含む凝集体の場合、全個数に対する上記条件を満たす網膜組織を含む凝集体の個数の割合が、少なくとも50%以上（好ましくは60%以上、70%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上）であることが好ましい。
上述のいずれかの連続上皮構造を有する網膜組織を含む凝集体は、その表面の頂端面（apical面）が培地側に接する形で形成され得る。
当該凝集体及び連続上皮組織維持用培地を含む調製物に含まれる連続上皮組織維持用培地は、本明細書で定義した連続上皮組織維持用培地である。連続上皮組織を維持できる限り、例えば、抗生物質、防腐剤、安定化剤、保存剤等が含まれていてもよい。
培地に含まれる背側化シグナル伝達物質の濃度は、錐体視細胞前駆細胞の出現を抑制しない程度のBMPシグナル伝達経路活性化作用を呈する濃度であれば良い（好ましい）。錐体視細胞前駆細胞の出現を抑制しない程度の背側化シグナル伝達物質の濃度は、神経網膜組織中に出現する錐体視細胞前駆細胞の割合等により適宜設定できる。具体的には、始めに視細胞前駆細胞が出現してから30～50日後、好ましくは30～40日後の神経網膜組織において、全細胞数のうち平均10%以上、好ましくは13%以上、より好ましくは16%以上が視細胞前駆細胞となる様に設定すればよい。また、具体的には背側化シグナル伝達物質としてBMPシグナル伝達経路作用物質、特にBMP4を用いる場合には、好ましくは0.01 nM～0.90 nM、更に好ましくは0.05 nM～0.45 nMの濃度でBMP4が用いられる。
培地に含まれる背側化シグナル伝達物質の濃度は、網膜色素上皮細胞を出現させない程度のWntシグナル経路活性化作用を呈する濃度でも良い。網膜色素上皮細胞を出現させない程度の背側化シグナル伝達物質の濃度は、具体的には、0.01 nM～0.90 nM、好ましくは0.05 nM～0.45 nMのBMP4と同等のWntシグナル経路活性化作用を奏する濃度が挙げられる。
培地が9-シスレチノイン酸等の外来性のレチノイド類を実質的に含まない場合、培地に含まれる背側化シグナル伝達物質としては、好ましくは0.05 nM～0.15 nM、更に好ましくは0.1 nM～0.15 nMのBMP4が挙げられる。また、Wntシグナル伝達経路作用物質を、好ましくは0.05 nM～0.15 nM、更に好ましくは0.1 nM～0.15 nMのBMP4と同等のBMPシグナル伝達経路活性化作用を奏する濃度で作用させてもよい。
また、培地が9-シスレチノイン酸等のレチノイド類を含む場合、培地に含まれる背側化シグナル伝達物質としては、好ましくは0.15 nM～0.90 nM、更に好ましくは0.15 nM～0.45 nMのBMP4が挙げられる。また、Wntシグナル伝達経路作用物質を好ましくは0.15 nM～0.90 nM、更に好ましくは0.15 nM～0.45 nMのBMP4と同等のBMPシグナル活性化作用を奏する濃度で作用させてもよい。
また、背側化シグナル伝達物質として、腹側化シグナル伝達を阻害するSHHシグナル伝達経路阻害物質、具体的にはCyclopamine-KAADを挙げることができる。培地に含まれるCyclopamine-KAADの濃度は、具体的には0.01 μM～5 μMであり、更に好ましくは0.2 μM～1 μMである。発生初期段階の網膜組織を製造する場合、原料製造方法５～７のようにWntシグナル伝達経路作用物質を含む培地を使用する場合と、Wntシグナル伝達経路作用物質を含む培地を使用しない場合がある。背側化シグナル伝達物質として腹側化シグナル伝達阻害物質を用いる場合、好ましくは、原料製造方法５～７のように前記Wntシグナル伝達経路作用物質を含む培地を使用して調製した発生初期段階の網膜組織を用いることがより好ましい。
また、背側化シグナル伝達物質として、上記BMPシグナル伝達経路作用物質、上記Wntシグナル伝達経路作用物質及び／又は腹側化シグナル伝達を阻害する上記SHHシグナル伝達経路阻害物質を組み合わせて使用してもよい。背側化シグナル伝達物質として、上記腹側化シグナル伝達を阻害するSHHシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合、より高い割合で錐体視細胞前駆細胞を含む網膜組織を調製しようとする場合は、好ましくは上記BMPシグナル伝達経路作用物質及び／又は上記Wntシグナル伝達経路作用物質と組み合わせて使用する。
背側化シグナル伝達物質を含む培地で培養する期間は、背側化シグナル伝達物質非存在下に培養した場合に桿体視細胞前駆細胞が出現する時期まで背側化シグナル伝達物質の効果が継続されれば良く、通常4日以上、好ましくは20日以上、より好ましくは70日以上で適宜設定することができる。具体的には、例えば50日～170日間培養することができる。更に具体的には、70日～100日間培養することができるが、桿体視細胞前駆細胞の出現を抑制するという観点からは添加する期間は長い方が好ましい。
また、錐体視細胞前駆細胞又は錐体視細胞は、L錐体視細胞、M錐体視細胞及びS錐体視細胞へ成熟化させることができる。好ましくは、錐体視細胞前駆細胞又は錐体視細胞を、更に背側化シグナル伝達物質の存在下に培養することにより、L錐体視細胞及びM錐体視細胞に富む神経網膜組織を得ることができ、背側化シグナル伝達物質の存在下、非存在下に関わらず培養することにより、S錐体視細胞に富む神経網膜組織を得ることができる。この時、L錐体視細胞及びM錐体視細胞へ成熟化させるには背側化シグナル伝達物質と同時に甲状腺ホルモンシグナル伝達物質を組み合わせて分化させることがより好ましく、S錐体視細胞へ成熟化させるには甲状腺ホルモンシグナル伝達物質を実質的に含まない培地で分化させることが好ましい。更に好ましくは無血清培地で分化させる。
また、L錐体視細胞又はM錐体視細胞への選択的な分化を誘導するためには、背側化シグナル伝達物質としてBMP4シグナル伝達物質を用いることが好ましく、最終濃度0.01nM以上100nM以下、好ましくは0.05nM以上10nM以下、より好ましくは0.1nM以上1.5nM以下となるように培養液中に添加する。甲状腺ホルモンシグナル伝達物質としてT3を用いるとき、0.01nM以上100nM以下、好ましくは0.5nM以上10nM以下、より好ましくは2nM以上10nM以下の濃度で作用させればよい。甲状腺ホルモンシグナル伝達物質としてT4を用いるとき、上記T3と同等の作用を示すT4の濃度で作用させればよい。背側化シグナル伝達物質と同時に甲状腺ホルモンシグナル伝達物質を組み合わせて培養する期間については特に限定はないが、通常50日間以上、好ましくは70日間以上、より好ましくは100日間以上、更により好ましくは150日間以上を挙げることができる。背側化シグナル伝達物質と同時に甲状腺ホルモンシグナル伝達物質を組み合わせて培養を開始する時期については、好ましくは初めに視細胞前駆細胞が出現してから、100日後以降、好ましくは150日後以降に培養を開始し、初めに視細胞前駆細胞が出現してから通常250日後、好ましくは300日後、より好ましくは400日後以降まで背側化シグナル伝達物質と同時に甲状腺ホルモンシグナル伝達物質を組み合わせて培養する。また、錐体視細胞前駆細胞又は錐体視細胞を、L錐体視細胞又はM錐体視細胞へ成熟化させるには、好ましくは網膜色素上皮と共培養するか、網膜色素上皮を培養した後の調整培地（コンディション培地）を使用する。
逆に、網膜組織中の90％以上、好ましくは99％以上の視細胞前駆細胞又は視細胞（錐体視細胞前駆細胞又は錐体視細胞、桿体視細胞前駆細胞又は桿体視細胞）を、L錐体視細胞、M錐体視細胞及び／又はS錐体視細胞への分化に至らず、視物質等の光応答に必要な分子を発現もしくは産生しない、最終的な成熟化に至らない状態で維持することもできる。視細胞前駆細胞は成熟化に伴い双極細胞へ接続することが知られているため、こうすることで移植する網膜組織内での視細胞前駆細胞と双極細胞との接続を抑制し、網膜組織を移植した際、調製した網膜組織中の視細胞前駆細胞とレシピエントの双極細胞との接続効率を上昇できる。具体的には、グルタミン酸を含まない培地、より好ましくはグルタミン酸もしくはアスパラギン酸を含まない培地、更に好ましくはグルタミン酸、アスパラギン酸等の神経伝達物質を含まない培地で培養することにより、最終的な成熟化に至らない状態を維持することができる。更により好ましくは、血清を含む培地、具体的には5％以上、好ましくは10％以上の血清を含む当該培地としてより具体的には、上記連続上皮組織維持用培地が挙げられる。ここで用いられる血清には特に限定はないが、具体的には、牛胎仔血清（FBS）を挙げることができる。
すなわち、視細胞前駆細胞又は視細胞を含む網膜組織を、神経伝達物質を含まず、血清を含む培地で培養する工程を含む視細胞前駆細胞の最終的な成熟化を抑制する方法もまた、本発明の範疇である。
ここで「最終的な成熟化」とは、一部、好ましくは15％以上、より好ましくは30％以上、更に好ましくは60%以上の視細胞前駆細胞、又は視細胞がシナプス形成した状態、又は視物質等の機能分子を発現している状態を意味する。すなわち、ミューラー細胞が認められる段階までに分化した段階まで成熟化したが、最終的な成熟化には至っていない神経網膜組織とは、好ましくはシナプス形成が生じていない段階、又は視物質等の機能分子を発現していない状態の神経網膜組織である。ここで、視細胞前駆細胞が最終的に成熟化したかどうかはS-opsin、L-opsin、M-opsinなど視細胞特異的視物質や、光刺激応答に必要な機能因子に対する抗体を用いて同定すればよい。すなわち、S-opsin、L-opsin、M-opsin、Rhodopsin、Cone-arrestin、arrestin、CNGA3、CNGA1、G alpha t2、G alpha t1、PDE6c、PDE6a、PDE6b等の機能分子が発現している細胞を最終的に成熟した視細胞として同定できる。また、網膜組織内で視細胞前駆細胞と双極細胞が接触し、神経回路を形成したかどうかについては、視細胞と双極細胞が神経回路を形成した領域で発現するRIBEYE、CtBP2、当該領域の双極細胞で発現するmGluR6、当該領域の視細胞のシナプス終末（synaptic ending）で発現がみとめられるArrestin、Recoverin、錐体特異的Arrestin（Gene symbol;ARR3）、錐体視細胞特異的と言われるPNAや桿体視細胞特異的と言われるELFN1に対する抗体を組み合わせて多重染色し、同定すればよい。あるいは、電子顕微鏡を用いて視細胞のシナプス終末と双極細胞のシナプス構造を観察し、神経回路を形成しているかどうか同定してもよい。
一方、視細胞前駆細胞又は視細胞を含む網膜組織を、血清を含まない培地で培養することにより、L錐体視細胞、M錐体視細胞及び／又はS錐体視細胞を含む完全に成熟化した網膜組織を得ることができる。すなわち、視細胞前駆細胞又は視細胞を含む網膜組織を、血清を含まない培地で培養する工程を含む視細胞前駆細胞又は視細胞の完全な成熟化を促進する方法もまた、本発明の範疇である。
ここで、S-opsin、L-opsin、M-opsin、Rhodopsin、Cone-arrestin、arrestin、CNGA3、CNGA1、G alpha t2、G alpha t1、PDE6c、PDE6a、又はPDE6b等の機能分子が発現している細胞を最終的に成熟化した視細胞として同定できる。すなわち、完全に成熟化した網膜組織は、正常な生体の網膜組織と同様に、これら機能分子の1又は複数、好ましくは３以上を発現する網膜組織である。
L錐体視細胞、M錐体視細胞の最終的な成熟化を促進させる場合には、前記血清を含まない培地は、好ましくは背側化シグナル伝達物質を含む培地である。背側化シグナル伝達物質としては、BMPシグナル伝達経路促進物質が挙げられ、具体的には、BMP2、BMP4、BMP7及びGDF7等のBMPが挙げられる。一方、S錐体視細胞の最終的な成熟化を促進させる場合についても、同様に背側化シグナル伝達物質を含む培地を好ましく使用することができるが、S錐体視細胞の最終的な成熟化を特異的に促進させる場合には、背側化シグナル伝達物質を含まない培地を好ましく使用できる。
L錐体視細胞、M錐体視細胞の最終的な成熟化を促進させる場合には、前記血清を含まない培地は、好ましくは、背側化シグナル伝達物質に加えて、甲状腺ホルモンシグナル伝達物質を含む培地である。甲状腺ホルモンシグナル伝達物質として、具体的にはT3又はT4を挙げることができる。一方、甲状腺ホルモンシグナル伝達物質はS錐体視細胞の最終的な成熟化を阻害するため、S錐体視細胞の最終的な成熟化を促進させる場合については、好ましくは甲状腺ホルモンシグナル伝達物質を実質的に含まない培地を使用する。
ここで、視細胞前駆細胞又は視細胞を含む網膜組織を、血清を含まない培地で培養する期間は、成熟化の度合いをモニターして適宜設定することができる。具体的には、ミューラー細胞が認められる程度に成熟化した分化段階の網膜組織を、血清を含まない培地中で、約20日以上、好ましくは30日以上、より好ましくは60日以上、更に好ましくは100日以上培養することができる。L錐体視細胞、M錐体視細胞の最終的な成熟化を促進させる場合には、0.5nM～３nM、好ましくは1nM～2nMのBMP4に相当する濃度の背側化シグナル伝達物質を含み、場合によっては0～10nMのT3に相当する甲状腺ホルモンシグナル伝達物質を含んでいてもよい、血清を含まない培地中で、約20日以上、好ましくは30日以上、好ましくは30日以上、より好ましくは60日以上、更に好ましくは100日以上培養することができる。
また、背側化シグナル伝達物質として上記Wntシグナル伝達経路作用物質を用いることもできる。この場合、具体的には以下の工程（１）及び（２）を繰り返し、Wntシグナルの強度を調整すればよい：
（１）1～5日間、好ましくは1～3日間、上記Wntシグナル伝達経路作用物質を培地中に加えて培養する；
（２）1～15日間、1～10日間、好ましくは1～7日間又は5～10日間、上記Wntシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない培地で培養する。
すなわち、前記（１）及び（２）を繰り返し実施することにより、0.1～0.45nMのBMPを添加した場合と同程度のBMP4を誘導することができる。
３．網膜組織に含まれる視細胞中の桿体視細胞の割合を増加させる方法（桿体視細胞に富む網膜組織の製造方法）
本発明の一態様として、発生初期段階から錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階までの網膜組織を、背側マーカーの発現を抑制する程度の濃度の腹側化シグナル伝達物質の存在下に培養する工程を含む、網膜組織に含まれる視細胞前駆細胞（photoreceptor precursor）及び視細胞(photoreceptor)中の桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞の割合を増加させる方法が挙げられる。
発生初期段階から錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階までの網膜組織を腹側化シグナル伝達物質の存在下に培養する際に用いられる培地は、腹側化シグナル伝達物質の効果を阻害する物質を、前記効果を阻害可能な量含まない限り、特に限定はなく、前記２と同様、細胞培養に通常用いられる培地を用いて調製することができる。基礎培地としては、例えば、Neurobasal培地、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、MEM培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、Leibovitz’s L-15培地又はこれらの混合培地など、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。具体的に使用可能な培地としては、Wnt2bが添加された培地、Neurobasal培地、Neurobasal培地を含む培地等が挙げられ、Wnt2bが添加されたNeurobasal培地でもよい。
前記培地はレチノイド類（例えば、レチノイン酸またはその誘導体）を含んでいても含んでいなくても良いが、一態様として、全トランスレチノイン酸又は9-シスレチノイン酸を含んでいてもよい。また、レチノイド類を実質的に含まない培地もまた好ましい態様として挙げられる。
培地に含まれる腹側化シグナル伝達物質の濃度は、網膜組織中の錐体視細胞前駆細胞が発生分化に伴い出現する期間において視細胞前駆細胞の出現を抑制できる程度のSHHシグナル伝達経路活性化作用を呈する濃度又はBMPシグナル伝達経路阻害作用を呈する程度の濃度であれば良い。このような濃度は当業者であれば容易に設定できる。具体的には、ALDH1A3の発現を促進させる程度の腹側化シグナル伝達物質の濃度を設定すればよく、通常実施される免疫染色などの手法を用いて、腹側マーカーであるCOUP-TF I、及び／又はALDH1A3を発現する領域が、網膜組織に含まれる細胞に対する錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階の神経網膜組織において全体の60%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、更により好ましくは99%以上となるように濃度を決定すればよい。具体的には、1 nM～10 μM、好ましくは10 nM～500 nMのSAGと同等のSHHシグナル伝達経路活性化作用を奏する濃度、0.1 nM～20 μM、好ましくは30 nM～1 μMのLDN193189と同等のBMPシグナル伝達経路阻害作用を奏する濃度が挙げられる。腹側化シグナル伝達物質として、SHHシグナル伝達経路作用物質、好ましくは1 nM～10 μM、より好ましくは10 nM～500 nMのSAGが挙げられる。
また、腹側化シグナル伝達物質として、背側化シグナル伝達を阻害するBMPシグナル伝達経路阻害物質、具体的にはLDN193189等が挙げられる。培地に含まれるLDN193189の濃度は、具体的には0.1 nM～20 μMであり、好ましくは30 nM～1 μMである。
尚、腹側化シグナル伝達物質としてLDN193189等のBMPシグナル伝達経路阻害物質を使用する場合、桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞に加えて、S錐体視細胞前駆細胞及び／又はS錐体視細胞の分化効率が向上する。すなわち、発生初期段階から錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階までの網膜組織を、背側マーカーの発現を抑制する程度の濃度のBMPシグナル伝達経路阻害物質、具体的には例えばLDN-193189の存在下に培養する工程を含む、網膜組織に含まれる視細胞前駆細胞（photoreceptor precursor）及び視細胞(photoreceptor)中のS錐体視細胞前駆細胞及びS錐体視細胞の割合を増加させる方法もまた、本発明の一態様である。
ここで、錐体視細胞前駆細胞が含まれる割合を低減するという観点からは、BMP4シグナル伝達経路阻害物質より、SHHシグナル伝達経路作用物質を用いるのがより好ましい。
また、腹側化シグナル伝達物質として、上記の腹側化シグナル伝達物質の1又は複数を適宜組合せて用いてもよい。例えば、SHHシグナル伝達経路作用物質及び／又は背側化シグナル伝達を阻害するBMPシグナル伝達経路阻害物質を組み合わせて使用してもよい。
腹側化シグナル伝達物質の存在下に培養する期間は、腹側化シグナル伝達物質非存在下に培養した場合に桿体視細胞前駆細胞が出現する時期まで腹側化シグナル伝達物質の効果が継続されれば良く、通常4日以上、好ましくは20日以上、より好ましくは70日以上で適宜設定することができる。具体的には、例えば50日～170日間培養することができる。更に具体的には、70日～100日間培養することができるが、桿体視細胞前駆細胞の出現を促進させるという観点からは添加する期間は長い方が好ましい。
４．発生初期段階の網膜組織の製造
上記２及び上記３の方法で使用される出発物質となる発生初期段階の網膜組織をヒトiPS細胞等の多能性幹細胞から製造する方法について説明する。
ヒトiPS細胞等の多能性幹細胞は、上述のとおり当業者に周知の方法で入手又は製造し、維持培養及び拡大培養に付すことができる。多能性幹細胞の維持培養・拡大培養は浮遊培養でも接着培養でも実施することができるが、好ましくは接着培養で実施される。多能性幹細胞の維持培養・拡大培養は、フィーダー細胞存在下で実施してもよいしフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）で実施してもよいが、好ましくはフィーダー細胞非存在下で実施される。
維持培養された多能性幹細胞を用いて、当業者に周知の方法で、発生初期段階の網膜組織を製造することができる。当該方法としては、WO2013/077425(& US2014/341864)、WO2015/025967(& US2016/251616)、WO2016/063985、WO2016/063986及びWO2017/183732に記載された方法等を挙げることができる。また、当該方法として非特許文献：Proc Natl Acad Sci U S A. 111(23): 8518-8523（2014）、Nat Commun. 5:4047（2014）、Stem Cells.（2017）:35(5), 1176-1188等に記載された方法等を挙げることができる。
4-1. 原料製造方法１
発生初期段階の網膜組織を製造する好ましい一態様として、WO2015/025967に記載の、以下の工程を含む方法が挙げられる：
（１）多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより細胞の凝集体を形成させる第一工程、
（２）第一工程で形成された凝集体を、SHHシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程。
当該方法で得られる網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体は、上記２及び上記３の方法で使用される出発物質となる発生初期段階の網膜組織として用いることができる。
〔第一工程について〕
第一工程はWO2015/025967 (& US2014/341864)に記載の方法に準じて行うことができる。すなわち、第一工程では、多能性幹細胞を無血清培地中で浮遊培養することにより細胞の凝集体を形成させる。
第一工程において用いられる無血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。例えば、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路阻害物質がいずれも添加されていない無血清培地を使用することができる。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、IMDMとF-12の1:1の混合液に10%KSR、450μM 1-モノチオグリセロール及び１ｘ Chemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地）を使用することが好ましい。血清代替物として、無血清培地に、牛血清アルブミン（BSA）を0.1 mg/mL～20 mg/mL、好ましくは4 mg/mL～6 mg/mL程度の濃度で添加することもできる。また、無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒトES細胞もしくはヒトiPS細胞の場合は、通常約1%～約20%であり、好ましくは約2%～約20%である。
第一工程における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1%から約10%、好ましくは約5%である。
第一工程において用いられ得る多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば96ウェルプレートを用いてヒトＥＳ細胞を浮遊培養する場合、1ウェルあたり約1×103から約1×105細胞、好ましくは約3×103から約5×104細胞、より好ましくは約5×103～約3×104細胞、更により好ましくは約0.9×104～1.2×104細胞となるように調製した液をウェルに添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。
凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい（例えば、SFEBq法）。分散された細胞が、細胞凝集体が形成されるに至るまでの工程は、細胞が集合する工程、及び集合した細胞が細胞凝集体を形成する工程に分けられる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞が集合するまでは、例えば、ヒトES細胞もしくはヒトiPS細胞の場合には、好ましくは約24時間以内、より好ましくは約12時間以内に凝集体を形成させる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞凝集体が形成されるまでの時間は、例えば、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）の場合には、好ましくは約72時間以内、より好ましくは約48時間以内である。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することにより適宜調節することが可能である。
細胞の凝集体が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
〔第二工程について〕
前記第一工程で形成された凝集体を、SHHシグナル伝達経路作用物質を含まずBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、発生初期段階の網膜組織として網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程について説明する。
第二工程において用いられる培地は、例えば、SHHシグナル伝達経路作用物質が添加されておらずBMPシグナル伝達経路作用物質が添加された無血清培地又は血清培地であり、基底膜標品を添加する必要は無い。
かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、IMDMとF-12の1:1の混合液に10% KSR、450 μM1-モノチオグリセロール及び１ｘ Chemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地）を使用することが好ましい。血清代替物として、無血清培地に、BSAを0.1 mg/mL～20mg/mL、好ましくは4 mg/mL～6 mg/mL程度の濃度で添加することもできる。また、無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒトES細胞の場合は、通常約1%～約20%であり、好ましくは約2%～約20%である。
第二工程で用いられる無血清培地は、第一工程で用いた無血清培地がSHHシグナル伝達経路作用物質を含まない限り、当該培地をそのまま用いることもできるし、新たな無血清培地に置き換えることもできる。第一工程で用いた、BMPシグナル伝達経路物質を含まない無血清培地をそのまま第二工程に用いる場合、BMPシグナル伝達経路作用物質を培地中に添加すればよい。
「SHHシグナル伝達経路作用物質を含まない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質を含有しない培地が含まれる。
「SHHシグナル伝達経路作用物質が添加されていない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質が実質的に添加されていない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地、も含まれる。
第二工程で用いられるBMPシグナル伝達経路作用物質としては、例えばBMP2、BMP4もしくはBMP7等のBMP蛋白、GDF7等のGDF蛋白、抗BMP受容体抗体、又は、BMP部分ペプチドなどが挙げられる。BMP2、BMP4及びBMP7は例えばR&D Systemsから、GDF7は例えば和光純薬から入手可能である。BMPシグナル伝達経路作用物質として、好ましくはBMP4を挙げることができる。
第二工程で用いられるBMPシグナル伝達経路作用物質の濃度は、前記第一工程で得られた凝集体に含まれる細胞の、網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばBMP4の場合は、約0.01 nMから約1 μM、好ましくは約0.1 nM～約100 nM、より好ましくは約1 nM～約10 nM、更に好ましくは約1.5 nM (55 ng／mL）の濃度となるように培地に添加する。BMP4以外のBMPシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上記BMP4の濃度と同等のBMPシグナル伝達経路活性化作用を奏する濃度で用いられることが望ましい。
BMPシグナル伝達経路作用物質は、第一工程の浮遊培養開始から約24時間後以降に添加されていればよく、第一工程の浮遊培養開始後数日以内（例えば、15日以内）に培地に添加してもよい。好ましくは、BMPシグナル伝達経路作用物質は、浮遊培養開始後1～15日目、より好ましくは1～9日目、更に好ましくは2～9日目、更に好ましくは3～8日目、より更に好ましくは3～6日目、更により好ましくは6日目に培地に添加する。
BMPシグナル伝達経路作用物質が培地に添加され、第一工程で得られた凝集体に含まれる細胞の網膜細胞への分化誘導が開始された後は、更にBMPシグナル伝達経路作用物質を培地に添加する必要は無く、BMPシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地を用いて培地交換を行ってよい。
あるいは、培地中のBMPシグナル伝達経路作用物質の濃度は、第二工程の期間中変動させてもよい。例えば、第二工程の開始時において、BMPシグナル伝達経路作用物質を上記範囲とし、2～4日につき、40～60%減の割合で、徐々に又は段階的に該濃度を低下させてもよい。
具体的な態様として、浮遊培養開始後（すなわち前記第一工程の開始後）1～9日目、好ましくは2～9日目、更に好ましくは3～8日目、より更に好ましくは3～6日目に、培地の一部又は全部をBMP4を含む培地に交換し、BMP4の終濃度を約1～10 nMに調整し、BMP4の存在下で例えば1～16日間、好ましくは、2～9日間、更に好ましくは6～9日間培養することができる。また、より長期間、具体的には20日以上、30日以上培養することも可能である。すなわち、第二工程において、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で行われる培養は
、第一工程で得られた凝集体が発生初期段階の網膜組織へと分化誘導されるまでの期間適宜続けられ、具体的には、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加後６～１２日間で発生初期段階の網膜組織を得ることができる。
ここにおいて、BMP4の濃度を同一濃度に維持すべく、1もしくは2回程度培地の一部又は全部をBMP4を含む培地に交換することができる。又は前述のとおり、BMP4の濃度を段階的に減じることもできる。
一態様において、BMPシグナル伝達経路作用物質を含む培地での培養を開始後、BMPシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地による培地交換により、培地中のBMPシグナル伝達経路作用物質の濃度を、2～4日につき、40～60%減の割合で、徐々に又は段階的に低下させることができる。
発生初期段階の網膜組織へと分化誘導されたことは、例えば、該組織中の細胞における網膜前駆細胞マーカーや神経網膜前駆細胞マーカーの発現を検出することにより確認することができる。GFP等の蛍光レポータータンパク質遺伝子がRX遺伝子座へノックインされた多能性幹細胞を用いて第一工程により形成された凝集体を、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、発現した蛍光レポータータンパク質から発せられる蛍光を検出することにより、網膜細胞への分化誘導が開始された時期を確認することもできる。
第二工程の実施態様の一つとして、第一工程で形成された凝集体を、網膜前駆細胞マーカーや神経網膜前駆細胞マーカー（例、RX、PAX6、CHX10）を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質を含みSHHシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、発生初期段階の網膜組織として網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程、を挙げることができる。
第二工程において、培地交換操作を行う場合、例えば、元ある培地を捨てずに新しい培地を加える操作（培地添加操作）、元ある培地を半量程度（元ある培地の体積量の40～80%程度）捨てて新しい培地を半量程度（元ある培地の体積量の40～80%）加える操作（半量培地交換操作）、元ある培地を全量程度（元ある培地の体積量の90%以上）捨てて新しい培地を全量程度（元ある培地の体積量の90%以上）加える操作（全量培地交換操作）が挙げられる。
ある時点で特定の成分（例えば、BMP4）を添加する場合、例えば、終濃度を計算した上で、元ある培地を半量程度捨てて、特定の成分を終濃度よりも高い濃度（具体的には終濃度の1.5～3.0倍、例えば終濃度の約2倍の濃度）で含む新しい培地を半量程度加える操作（半量培地交換操作、半量培地交換）を行ってもよい。
ある時点で、元の培地に含まれる特定の成分の濃度を維持する場合、例えば元ある培地を半量程度捨てて、元の培地に含まれる濃度と同じ濃度の特定の成分を含む新しい培地を半量程度加える操作を行ってもよい。
ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、例えば、培地交換操作を、1日に複数回、好ましくは1時間以内に複数回（例えば2～3回）行ってもよい。また、ある時点で、元の培地に含まれる成分を希釈して濃度を下げる場合、細胞または凝集体を別の培養容器に移してもよい。
培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、マイクロピペット、マルチチャネルマイクロピペット、連続分注器などが挙げられる。例えば、培養容器として96ウェルプレートを用いる場合、マルチチャネルマイクロピペットを使ってもよい。
好ましい態様において、第二工程で用いられる培地中のSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度は、SAGのSHHシグナル伝達促進活性換算で700 nM以下、好ましくは300 nM以下、より好ましくは10 nM以下、更に好ましくは0.1 nM以下、更に好ましくは、SHHシグナル伝達経路作用物質を含まない。「SHHシグナル伝達経路作用物質を含まない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質を含有しない培地も含まれる。「SHHシグナル伝達経路作用物質が添加されていない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質が実質的に添加されていない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地も含まれる。
第二工程における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1%から約10%、好ましくは約5%である。
かかる培養により、第一工程で得られた凝集体を形成する細胞から発生初期段階の網膜組織への分化が誘導され得る。発生初期段階の網膜組織として、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体が得られたことは、例えば、網膜前駆細胞のマーカーであるRX、PAX6、又は神経網膜前駆細胞のマーカーであるRX、PAX6、CHX10を発現する細胞が凝集体に含まれていることを検出することにより確認することができる。
第二工程の実施態様の一つとして、第一工程で形成された凝集体を、RX遺伝子を発現する細胞が出現し始めるまでの間、網膜細胞への分化誘導に必要な濃度のBMPシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る工程、を挙げることができる。一態様において、凝集体に含まれる細胞の20%以上（好ましくは、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上）が、RXを発現する状態となるまで、第二工程の培養が実施される。
上記の方法で得られた凝集体は、SHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質のいずれをも含まない無血清培地又は血清培地中で浮遊培養した後に本発明の製造方法の原料となる発生初期段階の網膜組織として使用することができる。該浮遊培養の期間は神経節細胞が出現する迄の期間であれば特に限定されないが、1日～50日間、好ましくは1日～15日間、より好ましくは1日～7日間が挙げられる。
前記浮遊培養において用いられる培地は、例えば、SHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質のいずれもが添加されていない無血清培地又は血清培地である。
「SHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質のいずれをも含まない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質のいずれをも実質的に含まない培地、例えば、網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質を含有しない培地、も含まれる。
「SHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質のいずれもが添加されていない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質のいずれもが実質的に添加されていない培地、例えば、網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地、も含まれる。
かかる培地に用いられる無血清培地又は血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、IMDMとF-12の1:1の混合液に10%KSR、450 μM 1-モノチオグリセロール及び1x Chemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地には、牛血清アルブミン（BSA）を0.1 mg/mL - 20 mg/mL、好ましくは4 mg/mL - 6 mg/mLで添加することもできる。また、無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒトES細胞の場合は、通常約1%から約20%であり、好ましくは約2%から約20%である。また、血清培地調製の煩雑さを回避するには、市販の血清を適量添加した血清培地（例えば、DMEMとF-12の1:1の混合液に血清、N2 supplementが添加された培地）を使用することがより好ましい。血清培地への血清の添加量としては、例えばヒトES細胞の場合は、通常約1%～約20%であり、好ましくは約2%～約20%である。上記培地にはいずれもタウリン等を添加して用いてもよい。
培養温度、CO2濃度、O2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃～約40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1%～約10%、好ましくは約5%である。O2濃度は、約5%以上、例えば約20%～約70%、好ましくは約20%～約60%、より好ましくは約20%～約40%、特に好ましくは約20%である。
上記のとおり、原料製造方法１で得られる網膜組織が、発生初期段階、すなわち、網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞を含み、かつ神経節細胞が出現していない発生初期の分化段階にあることは、RX及びPAX6等の網膜前駆細胞マーカー、CHX10、RX及びPAX6等の神経網膜前駆細胞マーカー、BRN3等の神経節細胞マーカーの少なくとも１つの発現状況を測定することにより同定することができる。すなわち、網膜前駆細胞マーカー及び／又は神経網膜前駆細胞マーカーを発現する細胞が網膜組織に含まれる全細胞のうち30%以上、好ましくは50%以上、より好ましくは80%以上、更に好ましくは90%以上、更により好ましくは99%以上含み、かつ神経節細胞マーカーを発現している細胞が網膜組織に含まれる細胞のうち40%以下、好ましくは20%以下、10％以下、5％以下、1%以下、更に好ましくは0.1%以下、更により好ましくは0.01%以下である分化段階であることを確認することができる。
この時、腹側マーカー及び／又は最も背側のマーカー（例：ALDH1A3及び／又はALDH1A1）の発現については問題とならず、いずれも背側化シグナル伝達経路作用物質によって抑制又は促進され得る分化段階であればよい。
4-2. 原料製造方法２
発生初期段階の網膜組織を製造する好ましい一態様として、WO2016/063985及びWO2017/183732に記載の、以下の工程を含む方法が挙げられる：
（１）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、1）TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はSHHシグナル伝達経路作用物質、並びに2）未分化維持因子を含む培地で培養する第一工程、
（２）第一工程で得られた細胞を浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
（３）第二工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第三工程。
当該方法で得られる網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体は、発生初期段階の網膜組織として上記２及び上記３の方法で使用される出発物質として用いることができる。
〔第一工程について〕
第一工程はWO2016/063985に記載の方法に準じて行うことができる。すなわち、第一工程におけるフィーダー細胞非存在下（以下、フィーダーフリーとも称する）とは、フィーダー細胞を実質的に含まない（例えば、全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が3%以下）の条件を意味する。好ましくは、フィーダー細胞を含まない条件において第一工程が実施される。第一工程において用いられる培地は、フィーダーフリー条件下で、多能性幹細胞の未分化維持培養を可能にする培地（フィーダーフリー培地）であれば、特に限定されないが、好適には、未分化維持培養を可能にするため、未分化維持因子を含む。
未分化維持因子は、多能性幹細胞の分化を抑制する作用を有する物質であれば特に限定はない。当業者に汎用されている未分化維持因子としては、FGFシグナル伝達経路作用物質、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質、insulin等を挙げることができる。FGFシグナル伝達経路作用物質として具体的には、線維芽細胞増殖因子（例えば、bFGF、FGF4やFGF8）が挙げられる。また、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質としては、TGFβシグナル伝達経路作用物質、Nodal/Activinシグナル伝達経路作用物質が挙げられる。TGFβシグナル伝達経路作用物質としては、例えばTGFβ1、TGFβ2が挙げられる。Nodal/Activinシグナル伝達経路作用物質としては、例えばNodal、ActivinA、ActivinBが挙げられる。ヒト多能性幹細胞（ヒトES細胞、ヒトiPS細胞）を培養する場合、第一工程における培地は、好ましくは未分化維持因子として、bFGFを含む。
本発明に用いる未分化維持因子は、哺乳動物由来の未分化維持因子であれば特に限定はないが、好適には培養する細胞と同一種の哺乳動物の未分化維持因子が用いられる。例えば、ヒト多能性幹細胞の培養には、ヒト未分化維持因子（例、bFGF、FGF4、FGF8、EGF、Nodal、ActivinA、ActivinB、TGFβ1、TGFβ2等）が用いられ、単離された未分化維持因子を外来性（又は外因性）に添加することができる。あるいは、第一工程に用いる培地に予め未分化維持因子が添加されていてもよい。
第一工程において用いられる培地中の未分化維持因子濃度は、培養する多能性幹細胞の未分化状態を維持可能な濃度であり、当業者であれば、適宜設定することができる。例えば、具体的には、フィーダー細胞非存在下で未分化維持因子としてbFGFを用いる場合、その濃度は、通常4 ng～500 ng/mL程度、好ましくは10 ng～200 ng/mL程度、より好ましくは30 ng～150 ng/mL程度である。
未分化維持因子を含み、多能性幹細胞を培養するために使用可能なフィーダーフリー培地として、多くの合成培地が開発・市販されており、例えばEssential 8培地（Life Technologies社製）が挙げられる。Essential 8培地は、DMEM/F12培地に、添加剤として、L-ascorbic acid-2-phosphate magnesium (64 mg/L), sodium selenium(14 μg/L), insulin(19.4 mg/L), NaHCO3(543 mg/L), transferrin (10.7 mg/L), bFGF (100 ng/mL)、及び、TGFβファミリーシグナル伝達経路作用物質（TGFβ1 (2 ng/mL)またはNodal (100 ng/mL)）を含む（Nature Methods, 8, 424-429 (2011)）。その他市販のフィーダーフリー培地としては、S-medium（DSファーマバイオメディカル社製）、StemPro (Life Technologies社製)、hESF9 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008 Sep 9;105(36):13409-14）、mTeSR1 (STEMCELL Technologies社製)、mTeSR2 (STEMCELL Technologies社製)、TeSR-E8(STEMCELL Technologies社製)、又はStemFit（味の素社製）が挙げられる。上記第一工程ではこれらを用いることにより、簡便に本発明を実施することが出来る。
第一工程における多能性幹細胞の培養は、浮遊培養及び接着培養の何れの条件で行われてもよいが、好ましくは、接着培養により行われる。
接着培養を行う際に用いられる培養器は、「接着培養する」ことが可能なものであれば特に限定されないが、細胞接着性の培養器が好ましい。細胞接着性の培養器としては、培養器の表面が、細胞との接着性を向上させる目的で人工的に処理された培養器が挙げられ、具体的には前述した内部がコーティング剤で被覆された培養器が挙げられる。コーティング剤としては、例えば、ラミニン[ラミニンα5β1γ1（以下、ラミニン511）、ラミニンα1β1γ1（以下、ラミニン111）等及びラミニン断片（ラミニン511E8等）を含む]、エンタクチン、コラーゲン、ゼラチン、ビトロネクチン（Vitronectin）、シンセマックス（コーニング社）、マトリゲル等の細胞外マトリクス等、又は、ポリリジン、ポリオルニチン等の高分子等が挙げられる。また、正電荷処理等の表面加工された培養容器を使用することもできる。好ましくは、ラミニンが挙げられ、より好ましくは、ラミニン511E-8が挙げられる。ラミニン511E-8は、市販品を購入する事ができる(例：iMatrix-511、ニッピ)。
第一工程において用いられる培地は、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はSHHシグナル伝達経路作用物質を含む。
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とは、TGFβファミリーシグナル伝達経路、すなわちSmadファミリーにより伝達されるシグナル伝達経路を阻害する物質を表し、具体的にはTGFβシグナル伝達経路阻害物質、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質及びBMPシグナル伝達経路阻害物質を挙げることができる。
TGFβシグナル伝達経路阻害物質としては、TGFβに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、TGFβに直接作用する物質（例えば、タンパク質、抗体、アプタマー等）、TGFβをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、TGFβ受容体とTGFβの結合を阻害する物質、TGFβ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質（例えば、TGFβ受容体の阻害剤、Smadの阻害剤等）を挙げることができる。TGFβシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質として、Lefty等が挙げられる。TGFβシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができ、具体的には、SB431542（4[4-(1,3-ベンゾジオキソール-5-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド）、LY-364947（4-[3-(2-ピリジニル)-1H-ピラゾール-4-イル]-キノリン）、SB-505124 （2-(5-ベンゾ[1,3]ジオキソール-5-イル-2-tert-ブチル-3H-イミダゾール-4-イル)-6-メチルピリジン）、A-83-01（3-(6-メチル-2-ピリジニル)-N-フェニル-4-(4-キノリニル)-1H-ピラゾール-1-カルボチオアミド）等が挙げられる。
Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質としては、Nodal又はActivinに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。当該物質として例えば、NodalもしくはActivinに直接作用する物質（例えば抗体、アプタマー等）、NodalもしくはActivinをコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、Nodal／Activin受容体とNodal／Activinの結合を阻害する物質、Nodal／Activin受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質を挙げることができる。Nodal／Activinシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができ、具体的には、SB431542、A-83-01等が挙げられる。また、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質として知られているタンパク質（Lefty、Cerberus等）を使用してもよい。Nodal／Activinシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくは、SB431542、A-83-01又はLeftyである。
BMPシグナル伝達経路阻害物質としては、BMPに起因するシグナル伝達経路を阻害する物質であれば特に限定は無く、上述したものを用いることができる。BMPシグナル伝達経路阻害物質として、当業者に周知の化合物を使用することができ、具体的には、LDN193189、Dorsomorphin等が挙げられる。また、BMPシグナル伝達経路阻害物質として知られるタンパク質（Chordin、Noggin等）を使用してもよい。BMPシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはLDN193189である。
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくは、Lefty、SB431542、A-83-01又はLDN193189である。
作用点が異なる複数種類のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質を組み合わせて用いても良い。組み合わせることにより、凝集体の質を向上する効果が増強されることが期待される。例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質とBMPシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせ、TGFβシグナル伝達経路阻害物質とNodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせ、BMPシグナル伝達経路阻害物質とNodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質との組み合わせが挙げられるが、好ましくはTGFβシグナル伝達経路阻害物質がBMPシグナル伝達経路阻害物質と組み合わせて用いられる。具体的な好ましい組み合わせとしては、SB431542とLDN193189との組み合わせが挙げられる。
SHHシグナル伝達経路作用物質としては、上述したものを用いることができる。SHHシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはSHHタンパク質（Genbankアクセッション番号：NM_000193、NP_000184）、SAG又はPMAである。
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とSHHシグナル伝達経路作用物質とを組み合わせて用いても良い。具体的な組み合わせとしては、例えば、Lefty、SB431542、A-83-01及びLDN193189からなる群から選択されるいずれかのTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質と、SHHタンパク質、SAG及びPMAからなる群から選択されるいずれかのSHHシグナル伝達経路作用物質との組み合わせが挙げられる。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とSHHシグナル伝達経路作用物質とを組み合わせて用いる場合、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質とSHHシグナル伝達経路作用物質の両方を含む培地中で細胞を培養してもよいし、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びSHHシグナル伝達経路作用物質のいずれか一方で細胞を処理した後、いずれか一方又は両方で引き続き細胞を処理してもよい。
TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、SB431542は、通常0.1 μM～200 μM、好ましくは2 μM ～ 50 μMの濃度で使用される。A-83-01は、通常0.05 μM～50 μM、好ましくは0.5 μM～5 μMの濃度で使用される。LDN193189は、通常1 nM～2000 nM、好ましくは10 nM～300 nMの濃度で使用される。Leftyは、通常5 ng/mL～200 ng/mL、好ましくは10 ng/mL～50 ng/mLの濃度で使用される。SHHタンパク質は、通常20 ng/mL～1000 ng/mL、好ましくは50 ng/mL～300 ng/mLの濃度で使用される。SAGは、通常、1 nM～2000 nM、好ましくは10 nM～700 nM、より好ましくは30～600nMの濃度で使用される。PMAは、通常0.002～20μM、好ましくは0.02μM～2 μMの濃度で使用される。一態様において、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、前記濃度のSB431542と同等のTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害活性を有する量で適宜使用することができる。また、一態様において、SHHシグナル伝達経路作用物質は、前記濃度のSAGと同等のSHHシグナル伝達経路活性化作用を奏する濃度で適宜使用することができる。
第一工程において用いられる培地は、血清培地であっても無血清培地であってもよいが、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、好ましくは、無血清培地である。
第一工程において用いられる培地は、化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、含有成分が化学的に決定された培地であってもよい。
第一工程における多能性幹細胞の培養は、浮遊培養及び接着培養のいずれの条件でおこなわれてもよいが、好ましくは、接着培養により行われる。
第一工程におけるフィーダーフリー条件下での多能性幹細胞の培養においては、フィーダー細胞に代わる足場を多能性幹細胞に提供するため、適切なマトリクスを足場として用いてもよい。足場であるマトリクスにより、表面をコーティングした細胞容器中で、多能性幹細胞を接着培養する。
足場として用いることのできるマトリクスとしては、ラミニン (Nat. Biotechnol. 28,611-615(2010))、ラミニン断片(Nat. Commun. 3, 1236 (2012))、基底膜標品(Nat. Biotechnol. 19, 971-974 (2001))、ゼラチン、コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン又はビトロネクチン（Vitronectin）等が挙げられる。
好ましくは、第一工程におけるフィーダーフリー条件下での多能性幹細胞の培養においては、単離されたラミニン511又はラミニン511のE8フラグメント（更に好ましくは、ラミニン511のE8フラグメント）により、表面をコーティングした細胞容器中で、多能性幹細胞を接着培養する。
第一工程における多能性幹細胞の培養時間は、第二工程において形成される凝集体の質を向上させる効果が達成可能な範囲であれば特に限定されないが、通常0．5～144時間である。第一工程における多能性幹細胞の培養時間は、好ましくは1時間以上、2時間以上、6時間以上、12時間以上、18時間以上、又は24時間以上である。第一工程における多能性幹細胞の培養時間は、好ましくは96時間以内、又は72時間以内である。一態様において、第一工程における多能性幹細胞の培養時間の範囲は、好ましくは2～96時間、より好ましくは6～48時間、更に好ましくは12～48時間、より更に好ましくは18～28時間（例、24時間）である。即ち、第二工程開始の0．5～144時間（好ましくは、18～28時間）前に第一工程を開始し、第一工程を完了した後引き続き第二工程が行われる。更なる態様において、第一工程における多能性幹細胞の培養時間の範囲は、好ましくは18～144時間、24～144時間、24～96時間、又は24～72時間である。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びSHHシグナル伝達経路作用物質のいずれか一方で細胞を処理した後、他方で引き続き細胞を処理する場合、それぞれの処理時間が、上述の培養時間の範囲内となるようにすることができる。
第一工程における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1%から約10%、好ましくは約5%である。
好ましい態様において、第一工程により得られる細胞は多能性様性質（pluripotent-like state）が維持された細胞であり、第一工程を通じて多能性様性質が維持される。多能性様性質とは、多能性を含む、多能性幹細胞に共通する多能性幹細胞に特有の形質の少なくとも一部を維持している状態を意味する。多能性様性質には厳密な多能性は要求されない。具体的には、多能性性質（pluripotent state）の指標となるマーカーの全て又は一部を発現している状態が、「多能性様性質」に含まれる。多能性様性質のマーカーとしては、Oct3/4陽性、アルカリフォスファターゼ陽性などが挙げられる。一態様において、多能性様性質が維持された細胞は、Oct3/4陽性である。Nanogの発現量がES細胞もしくはiPS細胞に比べて低い場合であっても「多能性様性質を示す細胞」に該当する。
一態様において、第一工程により得られる細胞は、少なくとも網膜組織、網膜細胞、網膜前駆細胞及び網膜層特異的神経細胞へ分化する能力を有する幹細胞である。
好ましい態様において、ヒト多能性幹細胞（例、iPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はSHHシグナル伝達経路作用物質、並びにbFGFを含有する無血清培地で、接着培養する。
上記の当該接着培養は、好ましくは、ラミニン511又はラミニン511のE8フラグメントで表面をコーティングした細胞容器中で実施される。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189、Chordin、Noggin）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）である。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、更に好ましくはLefty、SB431542、A-83-01、又はLDN193189、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）である。SHHシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはSHHタンパク質、SAG又はPurmorphamine(PMA)、より好ましくはSAGである。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とSHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）とを組み合わせて用いてもよい。培養時間は、0．5～144時間（好ましくは、18～144時間、24～144時間、24～96時間、又は24～72時間（例えば、18～28時間））である。
例えば、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞不在下で、bFGFを含む無血清培地中で維持培養する。当該維持培養は、好ましくは接着培養により行われる。当該接着培養は、好ましくは、ビトロネクチン、ラミニン511又はラミニン511のE8フラグメントで表面をコーティングした細胞容器中で実施される。そして、この培養中へTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はSHHシグナル伝達経路作用物質を添加し、培養を継続する。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、好ましくはTGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、SB431542、A-83-01、Lefty）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）である。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質は、更に好ましくはLefty、SB431542、A-83-01、又はLDN193189、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）である。SHHシグナル伝達経路作用物質は、好ましくはSHHタンパク質、SAG又はPMAである。TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とSHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）とを組み合わせて用いてもよい。添加後、0．5～144時間（好ましくは、18～144時間、24～144時間、24～96時間、又は24～72時間（例えば、18～28時間））培養を継続する。
〔第二工程について〕
第一工程で得られた細胞を培地中で浮遊培養することにより細胞の凝集体を形成させる第二工程について説明する。
第二工程において用いられる培地は血清含有培地又は無血清培地であり得る。化学的に未決定な成分の混入を回避する観点から、本発明においては、無血清培地が好適に用いられる。例えば、BMPシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路阻害物質がいずれも添加されていない無血清培地を使用することができる。調製の煩雑さを回避するには、例えば、市販のKSR等の血清代替物を適量添加した無血清培地（例えば、IMDMとF-12の1：1の混合液に10% KSR、450μM 1-モノチオグリセロール及び1 x Chemically Defined Lipid Concentrateが添加された培地、又は、GMEMに5%～20%KSR、NEAA、ピルビン酸、2-メルカプトエタノールが添加された培地）を使用することが好ましい。無血清培地へのKSRの添加量としては、例えばヒト多能性幹細胞の場合は、通常約1%から約30%であり、好ましくは約2%から約20%である。
凝集体の形成に際しては、まず、第一工程で得られた細胞の分散操作により、分散された細胞を調製する。分散操作により得られた「分散された細胞」とは、例えば7割以上が単一細胞であり2～50細胞の塊が3割以下存在する状態が挙げられる。分散された細胞として、好ましくは、8割以上が単一細胞であり、2～50細胞の塊が2割以下存在する状態が挙げられる。分散された細胞とは、細胞同士の接着（例えば面接着）がほとんどなくなった状態が挙げられる。
第一工程で得られた細胞の分散操作は、前述した、機械的分散処理、細胞分散液処理、細胞保護剤処理を含んでよい。これらの処理を組み合わせて行ってもよい。好ましくは、細胞保護剤処理と同時に、細胞分散液処理を行い、次いで機械的分散処理をするとよい。
細胞保護剤処理に用いられる細胞保護剤としては、FGFシグナル伝達経路作用物質（例、bFGF、FGF4やFGF8等の線維芽細胞増殖因子）、ヘパリン、IGFシグナル伝達経路作用物質（例、インスリン）、血清、又は血清代替物を挙げることができる。また、分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒト多能性幹細胞）の細胞死を抑制するための細胞保護剤として、Rho-associated coiled-coilキナーゼ（ROCK）の阻害剤又はMyosinの阻害剤を添加してもよい。分散により誘導される多能性幹細胞（特に、ヒト多能性幹細胞）の細胞死を抑制し、細胞を保護するために、ROCKの阻害剤又はMyosinの阻害剤を第二工程培養開始時から添加してもよい。ROCK阻害剤としては、Y-27632、Fasudil（HA1077）、H-1152等を挙げることができる。Myosinの阻害剤としてはBlebbistatinを挙げることができる。
細胞分散液処理に用いられる細胞分散液としては、トリプシン、コラゲナーゼ、ヒアルロニダーゼ、エラスターゼ、プロナーゼ、DNase又はパパイン等の酵素類や、エチレンジアミン四酢酸等のキレート剤のいずれかを含む溶液を挙げることができる。市販の細胞分散液、例えば、TrypLE Select (Life Technologies社製)やTrypLE Express (Life Technologies社製)を用いることもできる。
機械的分散処理の方法としては、ピペッティング処理又はスクレーパーでの掻き取り操作が挙げられる。
分散された細胞は上記培地中に懸濁される。
そして、分散された細胞の懸濁液を、上記培養器中に播き、分散させた細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養することにより、複数の細胞を集合させて凝集体を形成する。この際、分散された細胞を、10 cmディッシュのような、比較的大きな培養器に播種することにより、1つの培養器中に複数の細胞の凝集体を同時に形成させてもよいが、こうすると凝集体ごとの大きさにばらつきが生じる。そこで、例えば、96ウェルプレートのようなマルチウェルプレート（U底、V底）の各ウェルに一定数の分散された幹細胞を入れて、これを静置培養すると、細胞が迅速に凝集することにより、各ウェルにおいて1個の凝集体が形成される。この凝集体を複数のウェルから回収することにより、均一な凝集体の集団を得ることができる（例えば、SFEBq法）。
第二工程における細胞の濃度は、細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように適宜設定することができる。例えば96ウェルプレートを用いてヒト細胞（例、第一工程においてヒトiPS細胞から得られた細胞）を浮遊培養する場合、1ウェルあたり約1 x 103から約1 x 105細胞、好ましくは約3 x 103から約5 x 104細胞、より好ましくは約4 x 103から約2 x 104細胞、更に好ましくは、約4 x 103から約1.6 x 104細胞、より更に好ましくは約8 x 103から約1.2 x 104細胞となるように調製した液をウェルに添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。
第二工程における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。CO2濃度は、例えば約1%から約10%、好ましくは約5%である。
第二工程において、培地交換操作を行う場合、例えば、元ある培地を捨てずに新しい培地を加える操作（培地添加操作）、元ある培地を半量程度（元ある培地の体積量の30～90%程度、例えば40～60%程度）捨てて新しい培地を半量程度（元ある培地の体積量の30～90%、例えば40～60%程度）加える操作（半量培地交換操作）、元ある培地を全量程度（元ある培地の体積量の90%以上）捨てて新しい培地を全量程度（元ある培地の体積量の90%以上）加える操作（全量培地交換操作）が挙げられる。
培地交換操作に用いる道具は特に限定されないが、例えば、ピペッター、マイクロピペット、マルチチャンネルマイクロピペット、連続分注器などが挙げられる。例えば、培養容器として96ウェルプレートを用いる場合、マルチチャンネルマイクロピペットを使ってもよい。
細胞の凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、細胞を均一に凝集させるように、用いる細胞によって適宜決定可能であるが、均一な細胞の凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい。分散された細胞が、細胞凝集体が形成されるに至るまでの工程は、細胞が集合する工程、及び集合した細胞が細胞凝集体を形成する工程にわけられる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞が集合するまでは、例えば、ヒト細胞（例、第一工程においてヒトiPS細胞から得られた幹細胞）の場合には、好ましくは約24時間以内、より好ましくは約12時間以内に集合した細胞を形成させる。分散された細胞を播種する時点（すなわち浮遊培養開始時）から細胞凝集体が形成されるまでの時間は、例えば、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）の場合には、好ましくは約72時間以内、より好ましくは約48時間以内である。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心分離条件などを調整することにより適宜調節することが可能である。
細胞の凝集体が形成されたこと、及びその均一性は、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき判断することが可能である。
凝集体が形成された後、そのまま、凝集体の培養を継続してもよい。第二工程における浮遊培養の時間は、通常BMPシグナル伝達経路作用物質が添加されるまで継続されればよく、具体的には、通常12時間～6日間、好ましくは12時間～3日間程度が挙げられる。
第二工程において用いられる培地の一態様として、SHHシグナル伝達経路作用物質を含む培地（WO2016/063985を参照）、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地、又は、Wntシグナル伝達経路阻害物質及びSHHシグナル伝達経路作用物質を含む培地（WO2017/183732を参照）が挙げられる。第一工程において、多能性幹細胞をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はSHHシグナル伝達経路作用物質で処理し、第二工程において、第一工程で得られた細胞をSHHシグナル伝達経路作用物質及び／又は、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む培地（好適には無血清培地）中で浮遊培養に付して凝集体を形成させることにより、凝集体の質が、更に向上し、網膜組織への分化能力が高まる。この質の高い凝集体を用いることにより、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を高効率で誘導することができる。
SHHシグナル伝達経路作用物質としては、上述したものを用いることができる。好ましくは、SHHシグナル伝達経路作用物質はSHHタンパク質、SAG又はPMAである。培地中のSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。SAGは、通常、1 nM～2000 nM、好ましくは10 nM～700 nM、より好ましくは30 nM～600 nMの濃度で使用される。PMAは通常0.002 μM～20 μM、好ましくは0.02 μM～2 μMの濃度で使用される。SHHタンパク質は通常20 ng/mL～1000 ng/mL、好ましくは50 ng/mL～300 ng/mLの濃度で使用される。SHHタンパク質、SAG、PMA以外のSHHシグナル伝達経路作用物質を用いる場合には、上記SAGの濃度と同等のSHHシグナル伝達経路活性化作用を奏する濃度で用いられることが望ましい。
培地中のSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度は、第二工程の期間中変動させてもよい。例えば、第二工程の開始時において、SHHシグナル伝達経路作用物質を上記範囲とし、2～4日間につき、40～60%減の割合で、徐々に又は段階的に該濃度を低下させてもよい。
SHHシグナル伝達経路作用物質を培地に添加するタイミングは、上記効果を達成できる範囲で特に限定されないが、早ければ早い方が効果が高い。SHHシグナル伝達経路作用物質は、第二工程開始から、通常6日以内、好ましくは3日以内、より好ましくは1日以内、更に好ましくは第二工程開始時に、培地に添加される。
Wntシグナル伝達経路阻害物質としては、Wntにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものであれば特に限定されず、例えば、Wnt又はWnt受容体に直接作用する物質（抗Wnt中和抗体、抗Wnt受容体中和抗体等）、Wnt又はWnt受容体をコードする遺伝子の発現を抑制する物質（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等）、Wnt受容体とWntの結合を阻害する物質（可溶型Wnt受容体、ドミナントネガティブWnt受容体等、Wntアンタゴニスト、Dkk1、Cerberus蛋白等）、Wnt受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質[CKI-7（N-(2-アミノエチル)-5-クロロイソキノリン-8-スルホンアミド)、D4476（4-[4-(2,3-ジヒドロ-1,4-ベンゾジオキシン-6-イル)-5-(2-ピリジニル)-1H-イミダゾール-2-イル]ベンズアミド）、IWR-1-endo (IWR1e) （4-[(3aR,4S,7R,7aS)-1,3,3a,4,7,7a-ヘキサヒドロ-1,3-ジオキソ-4,7-メタノ-2H-イソインドール-2-イル]-N-8-キノリニル-ベンズアミド）、並びに、IWP-2（N-(6-メチル-2-ベンゾチアゾリル)-2-[(3,4,6,7-テトラヒドロ-4-オキソ-3-フェニルチエノ[3,2-d]ピリミジン-2-イル)チオ]アセタミド）等の低分子化合物等]等が挙げられる。Wntシグナル伝達経路阻害物質として好ましくはIWR1eが用いられる。
培地中のWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、上述の効果を達成可能な範囲で適宜設定することが可能である。IWR1eは、通常、約0.1 μMから約100 μM、好ましくは約0.3 μMから約30 μM、より好ましくは約1 μMから約10 μM、更に好ましくは約3 μMの濃度となるように培地に添加する。IWR-1-endo以外のWntシグナル伝達経路阻害物質を用いる場合には、上記IWR-1-endoの濃度と同等のWntシグナル伝達経路阻害活性を示す濃度で用いられることが望ましい。
培地中のWntシグナル伝達経路阻害物質質の濃度は、第二工程の期間中変動させてもよい。例えば、第二工程の開始時において、Wntシグナル伝達経路阻害物質を上記範囲とし、2～4日間につき、40～60％減の割合で、徐々に又は段階的に該濃度を低下させてもよい。
Wntシグナル伝達経路阻害物質を培地に添加するタイミングは、上記効果を達成できる範囲で特に限定されないが、早ければ早い方が効果が高い。Wntシグナル伝達経路阻害物質は、第二工程における浮遊培養開始から、通常6日以内、好ましくは3日以内、より好ましくは1日以内、より好ましくは12時間以内、更に好ましくは第二工程における浮遊培養開始時に、培地に添加される。具体的には、例えば、Wntシグナル伝達経路阻害物質を添加した基礎培地の添加や、該基礎培地への一部もしくは全部の培地交換を行う事ができる。第一工程で得られた細胞を、第二工程においてWntシグナル伝達経路阻害物質に作用させる期間は、上記効果を達成できる範囲で特に限定されないが、好ましくは、第二工程における浮遊培養開始時に培地へ添加した後、第二工程終了時まで作用させる。更に、第二工程終了後（すなわち第三工程の期間中）も、継続してWntシグナル伝達経路阻害物質に曝露させることができる。一態様としては、第二工程終了後（すなわち第三工程の期間中）も、継続してWntシグナル伝達経路阻害物質に作用させ、神経上皮組織及び／又は神経組織が形成されるまで作用させても良い。
好ましい態様において、第一工程で得られたヒト細胞（例、第一工程においてヒトiPS細胞から得られた細胞）を、SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、SHHタンパク質）及び／又はWntシグナル伝達経路阻害物質（例、IWR1e）を含む無血清培地中で浮遊培養に付し、凝集体を形成する。SHHシグナル伝達経路作用物質は、好ましくは、浮遊培養開始時から培地に含まれる。培地には、ROCK阻害物質（例、Y-27632）を添加してもよい。培養時間は12時間～6日間、好ましくは12時間～3日間である。形成される凝集体は、好ましくは均一な凝集体である。
例えば、第一工程で得られたヒト細胞（例、第一工程においてヒトiPS細胞から得られた細胞）を回収し、これを、単一細胞、又はこれに近い状態にまで分散し、SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA）及び／又はWntシグナル伝達経路阻害物質（例、IWR1e）を含む無血清培地中で浮遊培養に付す。該無血清培地は、ROCK阻害剤（例、Y-27632）を含んでいても良い。ヒト幹細胞（例、ヒトiPS細胞に由来する幹細胞）の懸濁液を、上述の培養器中に播き、分散させた細胞を、培養器に対して、非接着性の条件下で培養することにより、複数の細胞を集合させて凝集体を形成する。培養時間は12時間～6日間（好ましくは12時間～3日間）である。形成される凝集体は、好ましくは均一な凝集体である。
このようにして、第二工程を実施することにより、第一工程で得られた細胞、又はこれに由来する細胞の凝集体が形成される。第二工程で得られる凝集体は、第一工程において、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及び／又はSHHシグナル伝達経路作用物質で処理しない場合よりも、高い品質を有している。具体的には、丸く、表面が滑らかで、凝集体の内部が密であり、形が崩れていない凝集体の割合に富んだ、凝集体の集団を得ることが出来る。一態様において、第二工程開始から6日目に無作為的に凝集体（例えば、100個以上）を選出した際に、嚢胞化していない凝集体の割合が、例えば70%以上、好ましくは80%以上である。
第二工程で得られる凝集体は、網膜組織へ分化する能力を有する。
好ましい一態様においては、第一工程において、多能性幹細胞をTGFβシグナル伝達経路阻害物質で処理し、かつ、第二工程において、SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、SHHタンパク質）及び／又はWntシグナル伝達経路阻害物質（例、IWR1e）を含む培地で第一工程において得られた細胞の浮遊培養が実施される。ここで好ましくは、TGFβシグナル伝達経路阻害物質としてSB431542又はA-83-01を使用することができる。
また、好ましい一態様においては、第一工程において、多能性幹細胞をBMPシグナル伝達経路阻害物質で処理し、かつ、第二工程において、SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、SHHタンパク質）を含まない培地で第一工程において得られた細胞の浮遊培養が実施される。ここで好ましくは、BMPシグナル伝達経路阻害物質としてLDN193189を使用することができる。
好ましい一態様において、第一工程において、多能性幹細胞（例、ヒト多能性幹細胞）をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）等）；SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）；又はTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とSHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）との組み合わせで処理し、かつ、第二工程において、SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、SHHタンパク質）を含む培地で第一工程において得られた細胞の浮遊培養が実施される。
別の態様において、第一工程において、多能性幹細胞（例、ヒト多能性幹細胞）をTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）等）；SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）；又はTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とSHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）との組み合わせで処理し、かつ、第二工程において、SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、SHHタンパク質）を含まない培地で第一工程において得られた細胞の浮遊培養が実施される。
いずれの態様においても、第二工程の培地は、好ましくは、ROCK阻害剤（例、Y-27632）を含む。
〔第三工程について〕
第二工程で形成された凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養することにより、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得ることができる。当該工程は、上述の原料製造方法１における第二工程に準じて製造することができる。
一態様において、第二工程で培地中に添加するSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度が比較的低濃度（例えば、SAGについては700 nM以下、他のSHHシグナル伝達経路作用物質については、前記濃度のSAGと同等以下のSHHシグナル伝達経路活性化作用を奏する濃度）の場合、培地交換を行う必要はなく、第二工程で用いた培地にBMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）を添加すればよい。一方、SHHシグナル伝達経路作用物質の濃度が比較的高濃度（例えば、SAGについては700 nM超、又は1000 nM以上、他のSHHシグナル伝達経路作用物質については、前記濃度のSAGと同等のSHHシグナル伝達経路活性化作用を奏する濃度）の場合には、BMPシグナル伝達経路作用物質添加時に残存するSHHシグナル伝達経路作用物質の影響を抑制するために、BMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）を含む新鮮な培地に交換することが望ましい。
好ましい態様において、第三工程で用いられる培地中のSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度は、SAGのSHHシグナル伝達促進活性換算で700 nM以下、好ましくは300 nM以下、より好ましくは10 nM以下、更に好ましくは0.1 nM以下、更に好ましくは、SHHシグナル伝達経路作用物質を含まない。「SHHシグナル伝達経路作用物質を含まない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質を実質的に含まない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質を含有し
ない培地も含まれる。「SHHシグナル伝達経路作用物質が添加されていない」培地には、SHHシグナル伝達経路作用物質が実質的に添加されていない培地、例えば、網膜前駆細胞及び網膜組織への選択的分化に不利な影響を与える程度の濃度のSHHシグナル伝達経路作用物質が添加されていない培地も含まれる。
発生初期段階の網膜組織を製造する上での好ましい態様において、第一工程にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例えばSB431542、A-83-01）並びにbFGFを含有する無血清培地で、接着培養し、第二工程にて、細胞をSHHシグナル伝達経路作用物質（例えばSAG、PMA、SHHタンパク質）を含有する無血清培地で浮遊培養し、第三工程にて、凝集体をBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）を含有する無血清培地で浮遊培養する。
また、発生初期段階の網膜組織を製造する上での好ましい態様において、第一工程にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）及びbFGFを含有する無血清培地で、接着培養し、第二工程にて、細胞をSHHシグナル伝達経路作用物質（例えばSAG、PMA）を含有しない又は含有する無血清培地で浮遊培養し、第三工程にて、凝集体をBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）を含有する無血清培地で浮遊培養する。
発生初期段階の網膜組織を製造する上での好ましい態様において、第一工程にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、SHHシグナル伝達経路作用物質（例えばSAG、PMA）並びにbFGFを含有する無血清培地で、好ましくは1日間以上6日間以下、さらに好ましくは2日～4日間、接着培養し、第二工程にて、細胞をSHHシグナル伝達経路作用物質（例えばSAG、PMA）を含有する無血清培地で浮遊培養し、第三工程にて、凝集体をBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）を含有する無血清培地で浮遊培養する。
発生初期段階の網膜組織を製造する上での好ましい態様において、第一工程にて、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例えば、TGFβシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty 、SB431542、A-83-01）、Nodal/Activinシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01）、BMPシグナル伝達経路阻害物質（例、LDN193189）、又はこの組み合わせ（例、SB431542及びLDN193189）等）；SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）；又はTGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質（例、Lefty、SB431542、A-83-01、LDN193189）とSHHシグナル伝達経路作用物質（例、SHHタンパク質、SAG、PMA）との組み合わせ；並びにbFGFを含有する無血清培地で、接着培養し、第二工程にて、第一工程で得られた細胞を、SHHシグナル伝達経路作用物質（例、SAG、PMA、SHHタンパク質）を含む無血清培地中で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させ、第三工程にて、凝集体をBMPシグナル伝達経路作用物質（例えばBMP4）を含有する無血清培地で浮遊培養し、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る。
4-3. 原料製造方法３
発生初期段階の網膜組織を製造する好ましい一態様として、WO2016/063986に記載の、以下の工程を含む方法を挙げることもできる：
（１）多能性幹細胞を、フィーダー細胞非存在下で、未分化維持因子を含む培地で培養する第一工程、
（２）第一工程で得られた多能性幹細胞を、SHHシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養し、細胞の凝集体を形成させる第二工程、及び
（３）第二工程で得られた凝集体を、BMPシグナル伝達経路作用物質の存在下に浮遊培養し、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第三工程。
〔第一工程について〕
第一工程はWO2016/063986に記載の方法に準じて行うことができる。すなわち、第一工程では、ヒト多能性幹細胞、好ましくはヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）もしくはヒト胚性幹細胞（ES細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、未分化維持因子を含む培地で培養する。第一工程におけるフィーダー細胞非存在下（フィーダーフリー）とは、フィーダー細胞を実質的に含まない（例えば、全細胞数に対するフィーダー細胞数の割合が3%以下）の条件を意味する。好ましくは、フィーダー細胞を含まない条件において、第一工程が実施される。
第一工程において用いられる培地は、フィーダーフリー条件下で、多能性幹細胞の未分化維持培養を可能にする培地（フィーダーフリー培地）であれば、特に限定されないが、好適には、未分化維持培養を可能にするため、未分化維持因子を含む。例えば、未分化維持因子を含み、TGFβファミリーシグナル伝達経路阻害物質及びSHHシグナル伝達経路作用物質を含まない培地が挙げられる。
未分化維持因子及びフィーダーフリー培地としては、前記原料製造方法２に記載のものが挙げられる。
第一工程における多能性幹細胞の培養時間は、第二工程において形成される凝集体の質を向上させる効果が達成可能な範囲で特に限定されないが、通常0．5～144時間、好ましくは2～96時間、より好ましくは6～48時間、更に好ましくは12～48時間、より更に好ましくは18～28時間（例、24時間）である。即ち、第二工程開始の0．5～144時間（好ましくは、18～28時間）前に第一工程を開始し、第一工程を完了した後引き続き第二工程が行われる。
第一工程において、適宜培地交換を行ってもよく、一態様として、具体的には1～2日おきに培地交換を行う方法が挙げられる。ここにおいて、例えば、ROCK阻害剤等の細胞保護剤もしくは細胞死抑制剤を含まない培地に培地交換してもよい。
第一工程における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1%から約10%、好ましくは約5%である。
好ましい一態様において、ヒト多能性幹細胞（例、ヒトiPS細胞）を、フィーダー細胞非存在下で、bFGFを含有する無血清培地中で、接着培養する。当該接着培養は、好ましくは、ラミニン511、ラミニン511のE8フラグメント又はビトロネクチンで表面をコーティングした細胞容器中で実施される。当該接着培養は、好ましくは、フィーダーフリー培地としてEssential 8、TeSR培地、mTeSR培地、mTeSR-E8培地、又はStemFit培地、更に好ましくはEssential 8又はStemFit培地を用いて実施される。
〔第二工程について〕
第一工程で得られた多能性幹細胞を、SHHシグナル伝達経路作用物質の存在下で浮遊培養することにより、多能性幹細胞の凝集体を形成させる第二工程は、上記原料製造方法２の第二工程に記載された方法に準じて行えば良い。
〔第三工程について〕
第三工程は、前記原料製造方法１における第二工程、又は前記原料製造方法２における第三工程に準じて行うことができる。
4-4. 原料製造方法４
発生初期段階の網膜組織を製造する好ましい一態様として、WO2013/077425に記載の、以下の工程を含む方法を挙げることもできる：
（１）多能性幹細胞を、Wntシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地中で浮遊培養することにより多能性幹細胞の凝集体を形成させる第一工程、及び
（２）第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程。
原料製造方法４は、WO2013/077425 (& US2014/341864)の記載に準じて実施することができる。
〔第一工程について〕
Wntシグナル伝達経路阻害物質としては、上記したものが挙げられる。
ここで用いられるWntシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体が形成される濃度であればよい。例えばIWR1e等の通常のWntシグナル伝達経路阻害物質の場合は、0.1 μM～100 μM、好ましくは1 μM～10 μM、より好ましくは約3 μMの濃度である。
Wntシグナル伝達経路阻害物質は、浮遊培養開始前に無血清培地に添加されていてもよく、また、浮遊培養開始後数日以内（例えば、5日以内）に無血清培地に添加してもよい。好ましくは、Wntシグナル伝達経路阻害物質は、浮遊培養開始後5日以内、より好ましくは3日以内、最も好ましくは浮遊培養開始と同時に無血清培地に添加する。また、Wntシグナル伝達経路阻害物質を添加した状態で、浮遊培養開始後18日目まで、より好ましくは12日目まで浮遊培養する。
培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は特に限定されるものではないが、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1%から約10%、好ましくは約5%である。
また、多能性幹細胞の濃度は、多能性幹細胞の凝集体をより均一に、効率的に形成させるように当業者であれば適宜設定することができる。凝集体形成時の多能性幹細胞の濃度は、幹細胞の均一な凝集体を形成可能な濃度である限り特に限定されないが、例えば96ウェルプレートを用いてヒトES細胞を浮遊培養する場合、１ウェルあたり約1×103～約5×104細胞、好ましくは約3×103～約3×104細胞、より好ましくは約5×103～約2×104細胞、最も好ましくは9×103細胞前後となるように調製した液を添加し、プレートを静置して凝集体を形成させる。
凝集体を形成させるために必要な浮遊培養の時間は、細胞を迅速に凝集させることができる限り、用いる多能性幹細胞によって適宜決定可能であるが、均一な凝集体を形成するためにはできる限り短時間であることが望ましい（例えば、SFEBq法）。例えば、ヒトES細胞やヒトiPS細胞の場合には、好ましくは24時間以内、より好ましくは12時間以内に凝集体を形成させることが望ましい。この凝集体形成までの時間は、細胞を凝集させる用具や、遠心条件などを調整することで当業者であれば適宜調節することが可能である。
多能性幹細胞の凝集体が形成されたことは、凝集体のサイズおよび細胞数、巨視的形態、組織染色解析による微視的形態およびその均一性、分化および未分化マーカーの発現およびその均一性、分化マーカーの発現制御およびその同期性、分化効率の凝集体間の再現性などに基づき、当業者であれば判断することが可能である。
〔第二工程について〕
第一工程で形成された凝集体を、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養し、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞を含む凝集体を得る第二工程について説明する。
「基底膜標品」としては、その上に基底膜形成能を有する所望の細胞を播種して培養した場合に、上皮細胞様の細胞形態、分化、増殖、運動、機能発現などを制御する機能を有するような基底膜構成成分を含むものをいう。ここで、「基底膜構成成分」とは、動物の組織において、上皮細胞層と間質細胞層などとの間に存在する薄い膜状をした細胞外マトリックス分子をいう。基底膜標品は、例えば基底膜を介して支持体上に接着している基底膜形成能を有する細胞を、該細胞の脂質溶解能を有する溶液やアルカリ溶液などを用いて除去することで作成することができる。好ましい基底膜標品としては、基底膜成分として市販されている商品（例えばMatrigel（以下、マトリゲルという場合もある））や、基底膜成分として公知の細胞外マトリックス分子（例えばラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンなど）を含むものが挙げられる。
Matrigelは、Engelbreth Holm Swarn（EHS）マウス肉腫由来の基底膜調製物である。Matrigelの主成分はIV型コラーゲン、ラミニン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチンであるが、これらに加えてTGF-β、線維芽細胞増殖因子（FGF）、組織プラスミノゲン活性化因子、EHS腫瘍が天然に産生する増殖因子が含まれる。Matrigelの「growth factor reduced製品」は、通常のMatrigelよりも増殖因子の濃度が低く、その標準的な濃度はEGFが<0.5 ng/mL、NGFが<0.2 ng/mL、PDGFが<5 pg/mL、IGF-1が5 ng/mL、TGF-βが1.7 ng/mLである。原料製造方法４では、「growth factor reduced製品」の使用が好ましい。
第二工程における浮遊培養で無血清培地に添加される基底膜標品の濃度としては、神経組織（例えば網膜組織）の上皮構造が安定に維持される限り特に限定されないが、例えばMartigelを用いる場合には、好ましくは培養液の1/20～1/200の容量、より好ましくは1/100前後の容量を挙げることができる。基底膜標品は多能性幹細胞の凝集体の培養開始時に既に培地に添加されていてもよいが、好ましくは、浮遊培養開始後5日以内、より好ましくは浮遊培養開始後2日以内に無血清培地に添加される。
第二工程で用いられる無血清培地は、第一工程で用いた無血清培地をそのまま用いることもできるし、新たな無血清培地に置き換えることもできる。
第一工程で用いた無血清培地をそのまま本工程に用いる場合、「基底膜標品」を培地中に添加すればよい。
第一工程及び第二工程における浮遊培養に用いられる無血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されない。しかしながら、調製の煩雑さを回避する観点から、かかる無血清培地として、市販のKSRを適量添加した無血清培地（GMEM又はDMEM、0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸Mix、1mM ピルビン酸ナトリウム）を使用することが好ましい。無血清培地へのKSRの投与量としては特に限定されず、例えばヒトES細胞の場合は、通常1～20%であり、好ましくは2～20%である。
第二工程における培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定できる。培養温度は特に限定されるものではないが、例えば約30℃から約40℃、好ましくは約37℃である。またCO2濃度は、例えば約1%から約10%、好ましくは約5%である。
第二工程により得られる凝集体は、発生初期段階の網膜組織として使用可能であるが、網膜前駆細胞または神経網膜前駆細胞の含有率を高めるために、基底膜標品を含む無血清培地中で浮遊培養した後に、以下の第三工程を実施し、得られる凝集体を発生初期段階の網膜組織として使用することもできる：
（３）第二工程で培養された凝集体を、血清培地中で浮遊培養する第三工程。
第三工程で用いられる血清培地は、第二工程で培養に用いた無血清培地に血清を直接添加したものを用いてもよいし、新たな血清培地におきかえたものを用いてもよい。
第三工程で培地に添加される血清として、例えば、牛血清、仔牛血清、牛胎仔血清、馬血清、仔馬血清、馬胎児血清、ウサギ血清、仔ウサギ血清、ウサギ胎児血清、ヒト血清など哺乳動物の血清などを用いることが出来る。
血清の添加は、浮遊培養（すなわち第一工程）開始後７日目以降、より好ましくは9日目以降、最も好ましくは12日目に行う。血清濃度については、1～30%、好ましくは3～20%、より好ましくは約10%で添加する。
第三工程で用いられる血清培地は、上述したようなものである限り特に限定されないが、前記無血清培地（GMEM又はDMEM、0.1mM 2-メルカプトエタノール、0.1mM 非必須アミノ酸Mix、1mM ピルビン酸ナトリウム）に血清を添加したものを用いることが好ましい。
また、かかる血清培地に、市販のKSR等の血清代替物を適量添加して使用してもよい。
第三工程において、血清に加えてSHHシグナル伝達経路作用物質を添加することで発生初期段階の網膜組織の製造効率を上昇させることが出来る。
SHHシグナル伝達経路作用物質としては、SHHにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されず、上記したものが挙げられる。
本工程に用いられるSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度は、例えばSAG等の通常のSHHシグナル伝達経路作用物質の場合は、0.1 nM～10 μM、好ましくは10 nM～1 μM、より好ましくは約100 nMの濃度で添加する。
このようにして得られる凝集体を、発生初期段階の網膜組織として使用することもできる。
また、発生初期段階の網膜組織を製造する好ましい一態様として、前記第三工程を実施した後に、以下の第四工程を実施し、得られる眼杯様構造体を発生初期段階の網膜組織として使用することもできる：
（４）第三工程で培養された凝集体を、SHHシグナル伝達経路作用物質とWntシグナル伝達経路作用物質とを含む無血清培地中又は血清培地中で浮遊培養する第四工程。
ここで、SHHシグナル伝達経路作用物質としては、SHHにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されず、上記したものが挙げられる。
ここで用いられるSHHシグナル伝達経路作用物質の濃度は、例えばSAG等の通常のSHHシグナル伝達経路作用物質の場合は、0.1 nM～10 μM、好ましくは10 nM～1 μM、より好ましくは約100 nMの濃度で添加する。
Wntシグナル伝達経路作用物質としては、Wntにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されず、上記したものが挙げられる。
ここで用いられるWntシグナル伝達経路作用物質の濃度は、例えばCHIR99021等の通常のWntシグナル伝達経路作用物質の場合には、0.1 μM～100 μM、好ましくは1 μM～30 μM、より好ましくは約3 μMの濃度で添加する。
SHHシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質は、浮遊培養開始（第一工程開始）後12日目以降25日目以内に添加する。好ましくは、15日目以降18日目以内に添加する。この際、凝集体形成工程で添加されたWntシグナル伝達経路阻害物質を含まない培地を使用することが好ましい。
浮遊培養開始から18日目以降に、凝集体中から、眼杯様構造体が突起状に形成される。上記第四工程により製造される眼杯様構造体もまた、上記２．及び上記３．の方法で使用される出発物質となる発生初期段階の網膜組織として利用可能である。
上記第四工程で得られる凝集体は、SHHシグナル伝達経路作用物質及びWntシグナル伝達経路作用物質のいずれも含まない無血清培地又は血清培地中で１日～２０日間浮遊培養した後に、上記２．及び上記３．で使用される方法の出発物質となる発生初期段階の網膜組織として使用することもできる。本原料製造方法により、網膜組織以外の神経組織が同時に形成される場合もあり、これらは背側化シグナル伝達物質であるWntシグナル伝達経路作用物質等を発現することがある。このため、好ましくは、過剰な背側化シグナル伝達物質であるWntシグナル伝達経路作用物質等による影響を排除するために、凝集体の表面に存在する当該の眼杯様構造体をピンセット、ハサミ、注射針、カミソリ及びそれに類するもの等を用いて凝集体から物理的に切り出すこともできる。
4-5. 原料製造方法５
発生初期段階の網膜組織は、毛様体周縁部構造体を含んでいてもよく、毛様体周縁部構造体を含む発生初期段階の網膜組織は、WO2015/087614 (& US2016/376554)に記載の方法で製造することができる。
具体的には、網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体〔例えば原料製造方法１～４の製造方法においては、浮遊培養開始後約9～60日目、好ましくは9～40日目、更に好ましくは浮遊培養開始後約15～20日目、例えば18日目に相当する細胞凝集体である。〕を、Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養する工程を経て得られる凝集体、又は、更に得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Wntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程を経て得られる毛様体周縁部様構造体を含む凝集体もまた、上記２及び上記３で使用される方法の出発物質となる発生初期段階の網膜組織として使用することができる。
具体的には、例えば下記の方法により調製される、毛様体周縁部構造体を含む凝集体もまた、発生初期段階の網膜組織に含まれる：
（１）網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体を、Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養した後、得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Wntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程を含む、毛様体周縁部様構造体を含む凝集体の製造方法。
「網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体」は、上述の原料製造方法１～４に記載された方法で得ることができる。すなわち、当該細胞凝集体は、それ自体発生初期段階の網膜組織を含む凝集体である。例えば、原料製造方法１における第二工程又は原料製造方法２もしくは３における第三工程において、BMP4等のBMPシグナル伝達経路作用物質の存在下で6～15日間培養することにより発生初期段階の網膜組織、すなわち「網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体」を得ることができる。また、上記「Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養する工程」は、Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で継続して培養することにより（例えば30日間以上）、網膜組織に含まれる細胞のうち50%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、更により好ましくは99%以上がRPE65遺伝子を発現可能な時期まで、すなわち、網膜組織に含まれる細胞のうち上記割合の細胞が網膜色素上皮に分化可能な時期までに開始することが好ましい。具体的には浮遊培養開始後40日、好ましくは30日、より好ましくは20日までに開始する。
このようにして得られる細胞凝集体を、本工程の「網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体」として用いることができる。
まず、「網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体」を、WO2015/087614に記載の方法に準じて、Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養する。ここで、好ましい培養としては、浮遊培養を挙げることができる。
無血清培地としては、基礎培地にN2またはKSRが添加された無血清培地を挙げることができ、より具体的には、DMEM/F-12培地にN2 supplement（N2, Invitrogen社）が添加された無血清培地を挙げることができる。血清培地としては、基礎培地に牛胎児血清が添加された血清培地を挙げることができる。
培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定すればよい。培養温度としては、例えば、約30℃から約40℃の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約37℃を挙げることができる。また、CO2濃度としては、例えば、約1%から約10%の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約5%を挙げることができる。
上記細胞凝集体を、無血清培地又は血清培地中で培養する際、該培地に含められるWntシグナル伝達経路作用物質としては、Wntにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されず、上記のものが挙げられる。
無血清培地又は血清培地に含まれるWntシグナル伝達経路作用物質の濃度としては、CHIR99021等の通常のWntシグナル伝達経路作用物質の場合には、例えば、約0.1 μMから約100 μMの範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約1 μMから約30 μMの範囲を挙げることができる。より好ましくは、例えば、約3 μMの濃度を挙げることができる。
上記「網膜組織を含む細胞凝集体」を、無血清培地又は血清培地中で培養する際、該培地に含められるFGFシグナル伝達経路阻害物質としては、FGFにより媒介されるシグナル伝達を阻害できるものである限り特に限定されない。FGFシグナル伝達経路阻害物質としては、例えば、FGF受容体、FGF受容体阻害剤（例えば、SU-5402、AZD4547、BGJ398）、MAPキナーゼカスケード阻害物質（例えば、MEK阻害剤、MAPK阻害剤、ERK阻害剤）、PI3キナーゼ阻害剤、Akt阻害剤などが挙げられる。
無血清培地又は血清培地に含まれるFGFシグナル伝達経路阻害物質の濃度は、多能性幹細胞の凝集体を形成する細胞の網膜細胞への分化を誘導可能な濃度であればよい。例えばSU-5402の場合、約0.1 μMから約100 μM、好ましくは約1 μMから約30 μM、より好ましくは約5 μMの濃度で添加する。
本明細書において「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養」するとは、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間の全部又はその一部に限り培養することを意味する。つまり、培養系内に存在する前記「網膜組織を含む細胞凝集体」が、RPE65遺伝子を実質的に発現しない細胞から構成されている期間の全部又はその一部（任意な期間）に限り培養すればよく、このような培養を採用することにより、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体を得ることができる。
「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」には、「RPE65遺伝子を発現する細胞が全く出現していない細胞凝集体」及び「RPE65遺伝子を発現する細胞が実質的に出現していない細胞凝集体」が含まれる。「RPE65遺伝子を発現する細胞が実質的に出現していない細胞凝集体」としては、当該細胞凝集体に含まれる網膜組織におけるRPE65陽性細胞の存在割合が約1%以下である細胞凝集体を挙げることができる。
このような特定な期間を設定するには、前記「網膜組織を含む細胞凝集体」を試料として、当該試料中に含まれるRPE65遺伝子の発現有無又はその程度を、通常の遺伝子工学的手法又は生化学的手法を用いて測定すればよい。具体的には例えば、前記「網膜組織を含む細胞凝集体」の凍結切片をRPE65タンパク質に対する抗体を用いて免疫染色する方法を用いてRPE65遺伝子の発現有無又はその程度を調べることができる。
「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間」としては、例えば、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が、Wntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質を含む無血清培地又は血清培地中での前記細胞凝集体の培養開始時よりも減少し、30%から0%の範囲内になるまでの期間を挙げることができる。「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」としては、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が30%から0%の範囲内である細胞凝集体を挙げることができる。
「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間」の日数はWntシグナル伝達経路作用物質及びFGFシグナル伝達経路阻害物質の種類、無血清培地又は血清培地の種類、他の培養条件等に応じて変化するが、例えば、14日間以内を挙げることができる。より具体的には、無血清培地（例えば、基礎培地にN2が添加された無血清培地）が用いられる場合、前記期間として、好ましくは、例えば、10日間以内を挙げることができ、より好ましくは、例えば、２日間から６日間、更に具体的には３日間から5日間を挙げることができる。血清培地（例えば、基礎培地に牛胎児血清が添加された血清培地）が用いられる場合、前記期間として、好ましくは、例えば、12日間以内を挙げることができ、より好ましくは、例えば、6日間から9日間を挙げることができる。
こうして得られた凝集体を、上記２及び上記３で使用される方法の出発物質となる発生初期段階の網膜組織として使用することができる。
次いで、上述のようにして培養して得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、更にWntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で1日間～50日間（「発生初期段階から錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階まで」に相当）、好ましくは1日間～15日間（神経節細胞が出現し始めてから約5日以内に相当）、更に好ましくは1日間～7日間（神経節細胞が出現し始める段階に相当）培養した後に、上記２及び上記３の方法において出発物質となる発生初期段階の網膜組織として使用してもよく、当該培養方法については、WO2015/087614(例えば、段落〔0076〕～〔0079〕)を参照することができる。
4-6. 原料製造方法６
本発明の製造方法の出発物質として使用可能な毛様体周縁部構造体を含む発生初期段階の網膜組織は、WO2013/183774(&US2015/132787)に記載の方法で製造することもできる。
具体的には、網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体を、Wntシグナル伝達経路作用物質を含む無血清培地又は血清培地中で、RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養する工程を経て得られる凝集体、又は、更に得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、Wntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で培養する工程を経て得られる毛様体周縁部様構造体を含む凝集体もまた、発生初期段階の網膜組織である。
ここで原料として用いられる「網膜組織を含む細胞凝集体であり、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が20%以上100%以下である細胞凝集体」、または「Wntシグナル伝達経路作用物質」としては、上記原料製造方法５の場合と同じものが挙げられる。
好ましい培養としては、例えば、浮遊培養を挙げることができる。また、好ましい培地としては、例えば、無血清培地を挙げることができる。
培養温度、CO2濃度等の培養条件は適宜設定すればよい。培養温度としては、例えば、約30℃～約40℃の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約37℃を挙げることができる。また、CO2濃度としては、例えば、約1%～約10%の範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約5%を挙げることができる。
該培地に含められるWntシグナル伝達経路作用物質としては、Wntにより媒介されるシグナル伝達を増強し得るものである限り特に限定されず、上記のものが挙げられる。
また、無血清培地又は血清培地に含まれるWntシグナル伝達経路作用物質の濃度としては、CHIR99021等の通常のWntシグナル伝達経路作用物質の場合には、例えば、約0.1 μM～100 μMの範囲を挙げることができる。好ましくは、例えば、約1 μM～30 μMの範囲を挙げることができる。より好ましくは、例えば、約3μMの濃度を挙げることができる。
FGFシグナル伝達経路阻害物質を含まなくてもよいこと以外は製造方法５と同様にして、当該細胞凝集体を「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間中に限り、培養」する。
好ましい「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間」としては、例えば、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が50%～1%の範囲内である期間を挙げることができる。この場合には、得られる「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」は、前記網膜組織におけるCHX10陽性細胞の存在割合が50%～1%の範囲内である細胞凝集体となる。
「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現するに至るまでの期間」の日数はWntシグナル伝達経路作用物質の種類、無血清培地又は血清培地の種類、他の培養条件等に応じて変化するが、例えば、14日間以内を挙げることができる。より具体的には、無血清培地（例えば、基礎培地にN2が添加された無血清培地）が用いられる場合、前記期間として、好ましくは、例えば、10日間以内を挙げることができ、より好ましくは、例えば、2日間から6日間、更に具体的には3日間から5日間を挙げることができる。血清培地（例えば、基礎培地に牛胎児血清が添加された血清培地）が用いられる場合、前記期間として、好ましくは、例えば、12日間以内を挙げることができ、より好ましくは、例えば、6日間から9日間を挙げることができる。
こうして得られた凝集体を、上記２及び上記３で使用される方法の出発物質となる発生初期段階の網膜組織として使用することができる。次いで、上述のようにして培養して得られた「RPE65遺伝子を発現する細胞が出現していない細胞凝集体」を、そのまま発生初期段階の網膜組織として使用してもよいが、更にWntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で1日間～50日間、好ましくは1日間～15日間、更に好ましくは1日間～7日間培養した後に、発生初期段階の網膜組織を含む凝集体として使用してもよく、当該培養方法については、WO2015/087614(例えば、段落〔0076〕～〔0079〕)を参照することができる。
4-7. 原料製造方法７
発生初期段階の網膜組織は、毛様体周縁部構造体を含んでいてもよく、毛様体周縁部構造体を含む発生初期段階の網膜組織は、WO2015/107738（及び米国特許出願No. 15/112,187）に記載の方法で製造することができる。具体的には、例えば下記の工程を含む方法により調製されるレチノスフェアもまた、上記２及び上記３の製造方法で使用される方法の出発物質となる発生初期段階の網膜組織として使用することができる：
（１）多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体から得られた細胞を浮遊増殖培養し、レチノスフェアを得る工程。
すなわち、「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」は、上記原料製造方法５又は６に従って、製造することができ、これから得られる細胞を分散し、浮遊培養し、レチノスフェアを得ることができる。
当該細胞としては、上記の「多能性幹細胞から分化誘導された毛様体周縁部様構造体を含む細胞凝集体」を分散させて得られた細胞、前記細胞凝集体から分離された毛様体周縁部様構造体を分散させて得られた細胞、又は、前記細胞凝集体から分取された細胞を分散させて得られた細胞を挙げることができる。かかる細胞を増殖因子等の存在下で低密度で浮遊培養すると、１細胞、又は、２から１０細胞程度の少数の細胞に由来する球状の細胞凝集体、すなわちレチノスフェアが形成される。該レチノスフェアの製造方法については、WO2015/107738（及び米国特許出願No. 15/112,187）を参照することができる。
具体的には、分散された細胞を神経細胞培養用添加物及び増殖因子を加えた無血清培地又は血清培地中で浮遊培養することができる。培地として、好ましくは、FGFシグナル伝達経路作用物質及びEGFシグナル伝達経路作用物質からなる群から選ばれる一以上の物質を含む無血清培地又は血清培地を挙げることができる。ここで用いられるFGFシグナル伝達経路作用物質としてはFGF1、bFGF、FGF4、FGF7、FGF8、FGF9等のFGFタンパク質及びFGFシグナルの補助剤としてのheparine等が挙げられ、EGFシグナル伝達経路作用物質としてはEGF、TGF-alpha等が挙げられる。
上記のように製造したレチノスフェアは、網膜組織と同様に網膜前駆細胞又は神経網膜前駆細胞を含むので、本発明の製造方法の原料となる発生初期段階の網膜組織として使用することができる。また、上記工程（１）の後に、BMPシグナル伝達経路作用物質（例、BMP4）を含む無血清培地又は血清培地中で浮遊培養したレチノスフェアも本発明の製造方法の原料となる発生初期段階の網膜組織として使用することができる。次いで、上述のようにして得られたレチノスフェアを、更にWntシグナル伝達経路作用物質を含まない無血清培地又は血清培地中で1日間～50日間、好ましくは1日間～15日間、更に好ましくは1日間～7日間培養した後に得られる細胞凝集体を発生初期段階の網膜組織として使用してもよい。
５．錐体視細胞の割合が高い網膜組織
本発明は、錐体視細胞前駆細胞に富む視細胞前駆細胞、及び／又は錐体視細胞に富む視細胞を含む網膜組織（以下、錐体視細胞の割合が高い網膜組織という）を提供する。すなわち、視細胞前駆細胞及び視細胞中の錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の細胞数が、桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞の細胞数に比べて２倍以上、好ましくは４倍以上、より好ましくは５倍以上である、錐体視細胞前駆細胞に富む視細胞前駆細胞、及び／又は錐体視細胞に富む視細胞を含む網膜組織を提供する。当該網膜組織は、具体的には、CRX陽性かつTRβ2陽性かつNRL陰性の細胞、又はCRX陽性かつRXR-γ陽性かつNRL陰性の細胞の細胞数が、CRX陽性かつNRL陽性の細胞の細胞数の２倍以上、好ましくは４倍以上、より好ましくは５倍以上であり、神経節細胞を含む。
当該網膜組織は、ミューラー細胞が出現している程度の分化段階の網膜組織が含まれる程度にまで分化誘導が進行していてもよい。
すなわち、上記２．に記載の製造方法により得られる網膜組織は、1)網膜組織中にミューラー細胞が認められる程度に分化した網膜組織であって、神経網膜組織に含まれる全細胞数のうち、25%以上、好ましくは30%以上が錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞であり、12%以下、好ましくは10%以下、より好ましくは7%以下が桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞である網膜組織、又は、2)インビトロもしくは移植された生体内において更に成熟化することにより1)の網膜組織になり得る網膜組織が挙げられる。
また、前記1)において、網膜組織中の全視細胞前駆細胞及び全視細胞に含まれる錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の割合は、好ましくは70%以上、より好ましくは80%以上である。ここで、ミューラー細胞は、周知のマーカー、例えばCRABP陽性細胞、及び／又はCRALBP陽性細胞を検出することにより同定することができる。また、上記２．に記載の製造方法により得られる、ミューラー細胞が認められる程度に分化した視細胞前駆細胞を含む神経網膜組織は、PAX6陽性かつCHX10陰性細胞（神経節細胞、水平細胞及び／又はアマクリン細胞）の割合が背側化シグナル伝達物質を作用させない場合に比べ10%以上、好ましくは20%以上少ないという特徴を有する。
本発明の一態様として、上記２．に記載の製造方法により得られる網膜組織は、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階の神経網膜組織において、全細胞数のうち平均10%以上、好ましくは13%以上、より好ましくは16%以上、更により好ましくは17%以上が視細胞前駆細胞もしくは視細胞である。
さらに、上記２．に記載の製造方法により得られる網膜組織は、背側化シグナル伝達物質非存在下、又は腹側化シグナル伝達物質の存在下に培養する場合と比べて、L錐体視細胞及び／又はM錐体視細胞に分化可能な錐体視細胞前駆細胞の割合が高い。
また、上記２．に記載の製造方法において、ALDH1A3の発現を抑制する程度の濃度の背側化シグナル伝達物質の存在下に培養して得られた網膜組織は、神経網膜組織に含まれる全細胞数のうち双極細胞の割合が平均15%以上（作用させない場合の約1.5～2倍）となり、黄斑部と類似した網膜組織である。ここでいう「ALDH1A3の発現を抑制する程度の濃度の背側化シグナル伝達物質存在下に培養する」とは、例えば、浮遊培養開始後、0.1 nM～0.15 nMのBMP4を含む培地で50日間～130日間培養する工程が挙げられる。
また、上記２．に記載の製造方法により得られる網膜組織で、「ミューラー細胞が出現している程度の分化段階の網膜組織」に至る途中段階の網膜組織もまた、錐体視細胞前駆細胞もしくは錐体視細胞の割合が高い、あるいは成熟化により錐体視細胞の割合が高くなる網膜組織であり、本発明の「錐体視細胞の割合が高い網膜組織」に包含される。
具体的には、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階の網膜組織であって、以下（i）～(xi)の少なくとも１つ、好ましくは３以上、更に好ましくは５以上、更に好ましくは全ての特徴を有する網膜組織が挙げられる：
(i) 連続上皮率が50%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは95%以上であり、
(ii) 神経網膜組織中の全細胞数のうち平均10%以上、好ましくは13%以上、より好ましくは16%以上、更により好ましくは17%以上が視細胞前駆細胞もしくは視細胞である；
(iii) 神経網膜組織中の全細胞数に対する錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の割合が、好ましくは8%以上、更により好ましくは10%以上である；
(iv) 神経網膜組織において腹側マーカー（ALDH1A3、COUP-TF-I等）の発現が認められる領域が50%以下、好ましくは20%以下、より好ましくは1%以下、更により好ましくは0.01%以下である；
(v) BMPシグナル伝達経路阻害物質により腹側化され、ALDH1A3等の腹側マーカーが高発現した網膜組織に比べて網膜組織全体のALDH1A3の遺伝子発現量が50%以下、好ましくは20%以下、より好ましくは5%以下である；
(vi) 上記、神経網膜組織のうち最も背側のマーカーが発現誘導されていない領域（即ち、最も背側のマーカーの発現が認められない領域）が、50%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、更により好ましくは99%以上である；
(vii) 上述のBMPシグナル伝達経路阻害物質により腹側化され、CYP26A1の発現が抑制された網膜組織に比べ、CYP26A1の発現量が1.2倍以上、好ましくは1.5倍以上、より好ましくは2倍以上である；
(viii) OC2を発現する細胞数の神経網膜組織に含まれる全細胞数に対する割合が、背側化シグナル伝達物質を添加しない場合に比べ、約20%～70%、好ましくは約30%～70%、より好ましくは約50%～65%である；
(ix) OC2を発現する細胞数の神経網膜組織に含まれる全細胞数に対する割合が、前記BMPシグナル伝達経路阻害物質を添加した場合に比べ約30%～60%、好ましくは約40%～50%となる程度に抑制される；
(x) OC2を発現する細胞数の神経網膜組織に含まれる全細胞数に対する割合が、25%以下、好ましくは17%以下；及び
(xi) 背側化シグナル伝達物質を添加しない場合、又は前記BMPシグナル伝達経路阻害物質を添加した場合に比べ、神経網膜組織中のOC2陽性細胞のOC2タンパク質の発現量が平均約20%～70%、好ましくは約30%～70%、より好ましくは約30～40%である。
尚、上記において「連続上皮率」とは、網膜組織の表面積に対して連続上皮構造を有する部分が占める割合を意味する。
６．桿体視細胞の割合が高い網膜組織
本発明は、桿体視細胞前駆細胞に富む視細胞前駆細胞、及び／又は桿体視細胞に富む視細胞を含む網膜組織（以下、桿体視細胞の割合が高い網膜組織という）を提供する。すなわち、視細胞前駆細胞及び視細胞の細胞数に対して、桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞の細胞数が、40%以上、好ましくは55%以上であり、かつ神経節細胞を有する網膜組織を提供する。換言すると、当該網膜組織において、桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞の細胞数は、錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の細胞数に対して0.6倍以上、好ましくは1.3倍以上である。具体的には、CRX陽性かつNRL陽性の細胞の細胞数が、CRX陽性かつTRβ2陽性かつNRL陰性の細胞の細胞数またはCRX陽性かつRXR-γ陽性かつNRL陰性の細胞の細胞数の0.6倍以上、好ましくは1.3倍以上である。
当該網膜組織の一態様において、当該網膜組織はミューラー細胞が出現している程度にまで分化誘導が進行していてもよい。すなわち、上記３に記載の製造方法により得られる網膜組織は、
1)網膜組織中にミューラー細胞が認められる程度に分化した網膜組織であって、神経網膜組織に含まれる全細胞数のうち、好ましくは13%以上、好ましくは15%以上、より好ましくは17%以上が桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞であり、25%以下、好ましくは21%以下、より好ましくは15%以下が錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞である網膜組織、又は、
2)インビトロもしくは移植された生体内において更に成熟化することにより1)の網膜組織になり得る網膜組織が挙げられる。
また、前記1)において、網膜組織中の全視細胞前駆細胞に含まれる桿体視細胞前駆細胞の割合は、好ましくは40%以上、より好ましくは55%以上である。
尚、ミューラー細胞は、周知のマーカー、例えばCRABP陽性細胞、及び／又はCRALBP陽性細胞を検出することにより同定することができる。
すなわち、本発明の桿体視細胞の割合が高い網膜組織として、
1)網膜組織中にミューラー細胞がみとめられる程度に分化した網膜組織であって、神経網膜組織に含まれる全細胞数のうち、25%以下、好ましくは21%以下、より好ましくは15%以下が錐体視細胞前駆細胞であり、13%以上、好ましくは15%以上、より好ましくは17%以上が桿体視細胞前駆細胞である網膜組織、又は、
2)インビトロもしくは移植された生体内において更に成熟化することにより前記1）の網膜組織になり得る網膜組織
が挙げられる。
また、前記1)の網膜組織中の全視細胞前駆細胞に含まれる桿体視細胞前駆細胞の割合は、好ましくは40%以上、より好ましくは55%以上である。
また、上記３．に記載の製造方法により得られる網膜組織で、「ミューラー細胞が出現している程度の分化段階の網膜組織」に至る途中段階の網膜組織もまた、桿体視細胞の割合が高い、あるいは桿体視細胞の割合が高くなり得る網膜組織であり、本発明の「桿体視細胞の割合が高い網膜組織」に包含される。
具体的には、錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階の網膜組織であって、以下（i）～(v)の少なくとも１つ、好ましくは３以上、更に好ましくは全ての特徴を有する網膜組織を挙げることができる：
(i) 連続上皮率が50%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは95%以上である；
(ii) 網膜組織中の全細胞数の平均10%以下、好ましくは7%以下、より好ましくは6%以下が視細胞前駆細胞及び視細胞である；
(iii) 網膜組織中の全細胞数に対する錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の割合が、6%以下、好ましくは4%以下である；
(iv) 網膜組織において腹側マーカー（ALDH1A3、COUP-TF-I等）の発現が認められる細胞数が、全細胞数の50%以上、好ましくは70%以上、より好ましくは90%以上、更により好ましくは99%以上である；及び
(v) 背側化シグナル伝達物質であるBMPシグナル伝達経路作用物質により背側化され、ALDH1A3等の腹側マーカーが抑制された網膜組織に対して、ALDH1A3の遺伝子発現量が2倍以上、好ましくは5倍以上、より好ましくは20倍以上である。
７．医薬組成物
本発明は、本発明の製造方法により製造される錐体視細胞あるいは桿体視細胞の割合が高い網膜組織の有効量を含む医薬組成物を提供する。
該医薬組成物は、本発明の製造方法により製造される網膜組織の有効量、及び医薬として許容される担体を含む。
医薬として許容される担体としては、生理的な水性溶媒（生理食塩水、緩衝液、無血清培地等）を用いることが出来る。必要に応じて、移植医療において、移植する組織や細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を配合させてもよい。
本発明の医薬組成物は、本発明の製造方法により製造される網膜組織を、適切な生理的な水性溶媒で懸濁することにより、懸濁液として製造することができる。必要であれば、凍結保存剤を添加して、凍結保存し、使用時に解凍し、緩衝液で洗浄し、移植医療に用いても良い。
本発明の製造方法で得られる網膜組織は、医療用途に適した種々の形態をとることができる。シート状、柱状、塊状、栓状などの種々の形状であってもよく、優れた治療効果、簡便性などの観点から、シート状であることが好ましい。
本発明の製造方法で得られる網膜組織を、ピンセット等の器具を用いて適切な大きさに細切し、投与用の網膜組織片を調製することができる。また、シート状に切り出した網膜組織片をシート剤とすることもできる。また、シート剤とする際、本発明の網膜組織の伸展を目的として生体適合性のあるポリマー、モノマー、又はゲルで作製された、適当なシートや網目状のシートを用いてもよい。
すなわち、本発明の網膜組織から切り出された網膜組織片を含む医薬組成物もまた、本発明の範疇である。
本発明の製造方法で得られる網膜組織を、パパイン等のタンパク質分解酵素を含む細胞分散液を用いて分散し、投与用の網膜細胞懸濁液を調製することができる。また、細胞懸濁液に含まれる細胞から、目的とする細胞が発現する抗原タンパク質の特異的抗体、アプタマー、精製用ペプチド、などを用いて有効成分として望ましい細胞を分離して医薬組成物とすることもできる。
すなわち、本発明の網膜組織を分散、及び／又は精製して調製した細胞懸濁液を含む医薬組成物もまた、本発明の範疇である。
８．治療薬及び治療方法
本発明の製造方法により製造される網膜組織は、当該網膜組織、及びそれに含まれる網膜細胞の障害に基づく（起因する）疾患の移植医療に有用である。そこで、本発明は、本発明の製造方法により製造される網膜組織を有効成分として含有する、当該網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬、及び当該治療薬を患者に投与することを含む治療方法を提供する。当該網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬として、或いは、当該網膜組織の損傷状態において、該当する損傷部位に網膜組織を補充するために、本発明の製造方法により製造された網膜組織を用いることが出来る。移植を必要とする、網膜組織の障害に基づく疾患、又は網膜組織が損傷状態にある患者に、本発明の製造方法により製造された網膜組織を移植し、障害を受けた網膜組織自体を補充することにより、網膜組織の障害に基づく疾患、又は網膜組織の損傷状態を治療することが出来る。網膜組織の障害に基づく疾患としては、例えば、網膜変性症、網膜色素変性症、加齢黄斑変性症、有機水銀中毒、クロロキン網膜症、緑内障、糖尿病性網膜症又は新生児網膜症、紫外線や青色光網膜傷害等の網膜光障害などが挙げられる。
本発明の網膜組織のうち、錐体視細胞前駆細胞に富む視細胞前駆細胞を含む網膜組織は、患者の眼における錐体視細胞が多い領域への移植用医薬組成物として有用である。錐体視細胞が多い領域として、具体的にはRod-free zoneを含む領域が挙げられる。Rod-free zoneを含む領域としては、黄斑部（Macular）様構造を有する領域、好ましくは黄斑部が挙げられる。すなわち、錐体視細胞前駆細胞に富む、視細胞を含む本発明の網膜組織は、患者の黄斑部、好ましくは黄斑部のより中心領域（例えば、Fovea）への移植用医薬組成物として有用である。黄斑部への移植が求められる疾患としては、加齢黄斑変性症等において、明所での視力（すなわち日中の視力）が低下している状態、明所での視野狭窄、全盲等の状態が挙げられ、これらを改善もしくは治療するために利用できる。
一方、本発明の網膜組織のうち、桿体視細胞前駆細胞に富む視細胞前駆細胞を含む網膜組織は、患者の眼における桿体視細胞が多い黄斑部の周縁部等の領域、又は当該領域の外縁部位への移植用医薬組成物として有用である。具体的な移植部位としては、黄斑部の周縁部及びその外側が挙げられる。すなわち、桿体視細胞前駆細胞に富む細胞を含む本発明の網膜組織は、患者の黄斑部周縁部及びその外側等への移植用医薬組成物として有用である。黄斑部周縁部及びその外側への移植が求められる疾患としては、加齢黄斑変性症等において、暗所での視力が低下している状態、夜盲等の状態が挙げられ、これらを改善もしくは治療するために利用できる。加齢黄斑変性症等において、暗所での視力が低下している状態、夜盲等の状態といった初期症状を認めない場合であっても、輪状暗点、地図状暗点などを認める場合、網膜組織の変性に対して治療又は予防するために本発明の網膜組織を利用できる。また、桿体視細胞前駆細胞に富む視細胞前駆細胞を含む網膜組織を、黄斑部周縁部又はその外側へ移植することにより、黄斑部への変性領域の浸潤を抑制（すなわち予防）することができる。
移植医療においては、組織適合性抗原の違いによる拒絶がしばしば問題となるが、移植のレシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）を用いることで当該問題を克服できる。即ち、好ましい一態様において、本発明の方法において、多能性幹細胞として、レシピエントの体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、誘導多能性幹細胞）を用いることにより、当該レシピエントについて免疫学的自己の神経組織又は神経系細胞を製造し、これが当該レシピエントに移植される（自家移植）。
また、レシピエントと免疫が適合する（例えば、HLA型やMHC型の一部又は全部が適合する）他者の体細胞から樹立した多能性幹細胞（例、人工多能性幹細胞）から、アロの網膜組織又は網膜細胞を製造し、これが当該レシピエントに移植されてもよい（他家移植）。
９．毒性・薬効評価方法
本発明の製造方法により製造される網膜組織は、網膜組織の障害に基づく疾患の治療薬のスクリーニングや、毒性評価における、疾患研究材料、創薬材料として有用であるので、被検物質の毒性・薬効評価用試薬とすることができる。例えば、網膜組織の障害に基づく疾患、特に遺伝性の障害に基づく疾患のヒト患者から、iPS細胞を樹立し、このiPS細胞を用いて本発明の方法により、本発明の網膜組織を製造する。当該網膜組織は、その患者が患っている疾患の原因となる網膜組織の障害をインビトロで再現し得る。そこで、本発明は、本発明の製造方法により製造される網膜組織に被検物質を接触させ、該物質が該組織に及ぼす影響を検定することを含む、該物質の毒性・薬効評価方法を提供する。
例えば、本発明の製造方法により製造された、特定の障害（例、遺伝性の障害）を有する網膜組織を、被検物質の存在下又は非存在下（ネガティブコントロール）で培養する。そして、被検物質で処理した網膜組織における障害の程度を、ネガティブコントロールと比較する。その結果、その障害の程度を軽減した被検物質を、当該障害に基づく疾患の治療薬の候補物質として、選択することができる。例えば、本発明の製造方法で製造した網膜組織の生理活性(例えば、生存促進、機能向上又は成熟化)をより向上させる被検物質を、医薬品の候補物質として探索することができる。あるいは、網膜組織の障害を有する疾患等の特定の障害を呈する遺伝子変異を有する体細胞から人工多能性幹細胞を調製し、当該細胞を本発明の製造方法で分化誘導させて製造した網膜前駆細胞もしくは網膜層特異的神経細胞に被検物質を添加し、前記障害を呈するか否かを指標として当該障害の治療薬・予防薬として有効な被検物質の候補を探索することができる。
毒性評価においては、本発明の製造方法により製造された網膜組織を、被検物質の存在下又は非存在下（ネガティブコントロール）で培養する。そして、被検物質で処理した網膜組織における毒性の程度を、ネガティブコントロールと比較する。その結果、ネガティブコントロールと比較して、毒性を示した被検物質を、網膜組織に対する毒性を有する物質として判定することが出来る。
すなわち、本発明は、以下の工程を含む、毒性評価方法を包含する。
（工程1）本発明の製造方法により製造された網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被検物質の存在下で培養した後、細胞の傷害の程度を測定する工程、
（工程2）本発明の製造方法により製造された網膜組織を、生存可能な培養条件で、一定時間、被検物質の非存在下又はポジティブコントロールの存在下で培養した後、細胞の傷害の程度を測定する工程、
（工程3）（工程1）及び（工程2）において測定した結果の差異に基づき、工程1における被検物質が有する毒性を評価する工程。
ここで、「被検物質の非存在下」とは、被検物質の代わりに培養液、被検物質を溶解している溶媒のみを添加することを包含する。また、「ポジティブコントロール」とは、毒性を有する既知化合物を意味する。細胞の傷害の程度を測定する方法としては、生存する細胞数を計測する方法、例えば細胞内ATP量を測定する方法、又は、細胞染色（例えば細胞核染色や細胞障害性マーカー）と形態観察により生細胞数を計測する方法等が挙げられる。
(工程3)において、被検物質が有する毒性を評価する方法としては、例えば、(工程1)の測定値と(工程2)におけるネガティブコントロールの測定値を比較し、(工程1)の細胞の傷害の程度が大きい場合に当該被検物質が毒性を有すると判断できる。また、(工程1)の測定値と(工程2)におけるポジティブコントロールの測定値を比較し、(工程1)の細胞の傷害の程度が同等以上の場合に当該被検物質が毒性を有すると判断できる。
得られた網膜組織は、そのまま毒性・薬効評価用試薬として用いてもよい。網膜組織を分散処理（例えば、トリプシン／EDTA処理又はパパイン処理）し、得られた細胞をFACS又はMACSを用いて選別することにより、高純度な網膜前駆細胞（錐体視細胞前駆細胞や桿体視細胞前駆細胞）を得ることも可能である。また、神経網膜組織に含まれる視細胞前駆細胞（S錐体視細胞前駆細胞、L錐体視細胞前駆細胞、M錐体視細胞前駆細胞、又は桿体視細胞前駆細胞）は、最終的な成熟化を経て、視物質を発現する視細胞（S錐体視細胞、L錐体視細胞、M錐体視細胞、又は桿体視細胞）へ分化させ、毒性・薬効評価用試薬として用いてもよい。
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
実施例１（ヒトES細胞を用いた網膜組織を含む細胞凝集体の製造例と網膜組織の切り出し方法）
CRX::VenusノックインヒトES細胞（KhES-1由来；Nakano, T. et al. Cell Stem Cell 2012, 10(6), 771-785）を「Ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559」 「Watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 681-686」に記載の方法に準じて培養した。ヒトES細胞を培養するための培地にはDMEM/F12 培地（Sigma）に20% KSR（KnockoutTM Serum Replacement; Invitrogen）、0.1mM 2-メルカプトエタノール、2mM L-グルタミン、1x 非必須アミノ酸、7.5 ng/mL bFGFを添加した培地を用いた。
網膜組織を含む細胞凝集体は「Kuwahara et al. Nat Commun 2015, 19(6), 6286-」に記載の方法を一部改変して調製した。すなわち、培養された前記ES細胞を、TrypLE Express（Invitrogen）を用いて単一分散した後、単一分散されたヒトES細胞を細胞非接着性の９６ウェルプレート（スミロン スフェロイド プレート、住友ベークライト社）へ１ウェルあたり9 x 103細胞になるように100 μLの無血清培地に浮遊させ、凝集体を速やかに形成させた後、37℃、5%CO2で培養した。その際の無血清培地には、F-12培地とIMDM培地の1:1混合液に10% KSR、450 μM 1-モノチオグリセロール、1x Chemically defined lipid concentrate、5 mg/mL BSA、20 μM Y27632を添加した無血清培地を用いた。浮遊培養開始後6日目に最終濃度1.5 nMのBMP4を添加して浮遊培養を継続した。ウェル内の培養液の半量を3または4日おきに、BMPシグナル伝達経路作用物質を添加していない上記培地に交換した。浮遊培養開始後18日目の網膜組織を含む細胞凝集体を、3μM CHIR99021及び5μM SU5402を含む無血清培地（DMEM/F12培地に、1% N2 supplementが添加された培地）で4日間、すなわち浮遊培養開始後22日目まで浮遊培養した。その後、網膜組織を含む細胞凝集体は適宜解析等に使用するまで浮遊培養を続けた。その間の培養液については下記［１］から［３］に示した血清培地を使用し、5% CO2条件下で培養した。
［１］浮遊培養開始後22日目から38日目まで；DMEM/F12培地に10%牛胎児血清、1% N2 supplement、および100 μMタウリンが添加された培地。
［２］浮遊培養開始後38日目から60日目まで；DMEM/F12培地に10%牛胎児血清、1% N2 supplement、および100μMタウリンが添加された培地と、Neurobasal培地に、10%牛胎児血清、2% B27 supplement、および100μＭタウリンが添加された培地を1:3の比率で混合した培地。
［３］浮遊培養開始後60日目以降；Neurobasal培地に、10%牛胎児血清、2% B27 supplement、および100μＭタウリンが添加された培地。
また、細胞凝集体のうち網膜組織でない部分を、目視で確認した後適宜ピンセットを用いて切除し、大部分が網膜組織である細胞凝集体から網膜組織を切り出すことができるが、実際に、浮遊培養開始後35日目に網膜組織を含む細胞凝集体から網膜組織を切り出した例を図１ａ、ｂに示した。さらに、上記の培養方法に従って培養した網膜組織を含む細胞凝集体を蛍光顕微鏡（Biorevo BZ-9000, Keyence）で観察したところ、浮遊培養開始後42日目までにはほとんど全ての網膜組織でノックインされたCRX::Venusが呈する緑色蛍光を観察できた（図１ｃ、ｄ）。
実施例２
実施例１に記載した方法において、背側化シグナル伝達物質（BMP4またはCyclopamine-KAAD）、または腹側化シグナル伝達物質（LDN193189またはSAG）を下記の通り加えることにより、錐体視細胞前駆細胞または桿体視細胞前駆細胞に富んだ網膜組織を含む凝集体を調製した。
［１］Control群（図２ａ、ｆ、ｋ、ｐ）；実施例１に記載した方法に従い、何も添加せず浮遊培養開始後70日目または75日目まで培養した。
［２］+BMP群（図２ｂ、ｇ、ｌ、ｑ）； 0.15 nMのBMP4を浮遊培養開始後22日目から浮遊培養が終了するまで添加し、浮遊培養開始後70日目または75日目まで培養した。
［３］+Cyclopamine-KAAD群（図２ｃ、ｈ、ｍ、ｒ）；500 nMのCyclopamine-KAADを浮遊培養開始後22日目から浮遊培養が終了するまで添加し、浮遊培養開始後70日目または75日目まで培養した。
［４］+LDN193189群（図２ｄ、ｉ、ｎ、ｓ）；100 nMのLDN193189を浮遊培養開始後22日目から浮遊培養が終了するまで添加し、浮遊培養開始後70 日目または75 日目まで培養した。
［５］+SAG群（図２ｅ、ｊ、ｏ、ｔ）；100 nMのSAGを浮遊培養開始後22日目から浮遊培養が終了するまで添加し、浮遊培養開始後70日目または75日目まで培養した。
以上の条件で培養された網膜組織を含む細胞凝集体を蛍光顕微鏡（Biorevo BZ-9000, Keyence）で観察した。また、これら網膜組織を含む細胞凝集体を4%パラホルムアルデヒドで固定した後凍結切片を調製し、CRX、TRβ2(TRb2)の免疫染色、または細胞核を染色するDAPI染色を行った。その結果、ノックインされたCRX::Venusが呈する緑色蛍光は、+BMP4群、+Cyclopamine-KAAD群、Control群、＋LDN193189群、＋SAG群の順で多くみとめられた（図２ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ）。また、免疫染色した切片を蛍光顕微鏡で観察した結果、Control群の網膜組織に比べ、＋BMP群の網膜組織で視細胞前駆細胞であるCRX陽性細胞が明らかにより多くみとめられた。また、Control群の網膜組織に比べ、+Cyclopamine-KAAD群の網膜組織で若干多くのCRX陽性細胞がみとめられた。一方、+LDN193189群、+SAG群ではControl群（対照群）の網膜組織に比べCRX陽性細胞が少なく、＋SAG群でより少ない結果となった（図２ｆ、ｇ、ｈ、ｉ、ｊ）。
また、浮遊培養開始後70日目または75日目までのCRX陽性細胞には、同時にTRβ2を発現する「発生初期に出現する錐体視細胞前駆細胞」が含まれていた。これら「発生初期に出現する錐体視細胞前駆細胞」は視細胞前駆細胞同様、Control群の網膜組織に比べ、＋BMP群、+Cyclopamine-KAAD群の網膜組織でより多くみとめられた。一方、+LDN193189群、+SAG群ではControl群の網膜組織に比べこれら「発生初期に出現する錐体視細胞前駆細胞」が少ない結果となった（図２ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔ）。
これらのことから、背側化シグナル伝達物質は浮遊培養開始後70日目前後における網膜組織の視細胞前駆細胞、および「発生初期に出現する錐体視細胞前駆細胞」を増加させる作用があることが分かった。逆に、腹側化シグナル伝達物質は浮遊培養開始後70日目前後における網膜組織の視細胞前駆細胞、または「発生初期に出現する錐体視細胞前駆細胞」を減少させる作用があることが分かった。
実施例３
実施例１に記載した方法において、それぞれ背側化シグナル伝達物質（BMP4またはCyclopamine-KAAD）、または腹側化シグナル伝達物質（LDN193189またはSAG）を下記の通り加えることによりミューラー細胞が認められる程度に成熟した分化段階の網膜組織を調製した。
［１］Control群（図３ａ、ｆ、ｋ、ｐ）；実施例１に記載した方法に従い、何も添加せず浮遊培養開始後191日目まで培養した。
［２］+BMP群（図３ｂ、ｇ、ｌ、ｑ）； 0.15 nMのBMP4を浮遊培養開始後22日目から100日目まで添加し、浮遊培養開始後191日目まで培養した。浮遊培養開始後100日目から191日目までは実施例1に記載した培地［３］で培養した。
［３］+Cyclopamine-KAAD群（図３ｃ、ｈ、ｍ、ｒ）；500 nMのCyclopamine－KAADを浮遊培養開始後22日目から100日目まで添加し、浮遊培養開始後191日目まで培養した。浮遊培養開始後100日目から191日目までは実施例1に記載した培地［３］で培養した。
［４］+LDN193189群（図３ｄ、ｉ、ｎ、ｓ）；100 nMのLDN193189を浮遊培養開始後22日目から100日目まで添加し、浮遊培養開始後191日目まで培養した。浮遊培養開始後100日目から191日目までは実施例1に記載した培地［３］で培養した。
［５］+SAG群（図３ｅ、ｊ、ｏ、ｔ）；100 nMのＳＡＧを浮遊培養開始後22日目から100日目まで添加し、浮遊培養開始後191日目まで培養した。浮遊培養開始後100日目から191日目までは実施例１に記載した培地［３］で培養した。
以上の条件で培養された網膜組織を含む細胞凝集体を4%パラホルムアルデヒドで固定した後凍結切片を調製し、CRX遺伝子座にノックインされた蛍光タンパク質Venusに対するGFP抗体、桿体視細胞に特異的に発現するNRLに対する抗体、視細胞のうち、錐体視細胞に特異的に発現するRXR-γ（RXRｇ）に対する抗体を用いた免疫染色、または細胞核を染色するDAPI染色を行った。Control群に比べ+BMP4群では視細胞前駆細胞のうちNRL陽性の桿体視細胞前駆細胞の割合が低下し、桿体視細胞前駆細胞がほとんど存在しない領域がみとめられた（図３ｇ）。逆に、+LDN193189群、+SAG群では視細胞前駆細胞のうちNRL陽性の桿体視細胞前駆細胞の割合がControl群に比べ高まっていた（図３ｉ、ｊ）。このうち、+SAG群ではConrol群に比べ視細胞前駆細胞のうちRXR-γ陽性の錐体視細胞前駆細胞の割合が低く、NRL陽性の桿体視細胞前駆細胞の割合が特に高まっていた（図３ｊ）。
これらのことから、BMPシグナル伝達経路作用物質は、視細胞前駆細胞のうち錐体視細胞前駆細胞の割合を高めることができ、視細胞前駆細胞のうち桿体視細胞前駆細胞をほとんど含まない領域を調製できることがわかった。また、+Cyclopamine-KAAD群は、視細胞前駆細胞のうち錐体視細胞前駆細胞の割合を高められることがわかった。また、視細胞前駆細胞のうち桿体視細胞前駆細胞の割合を若干減少させることがわかった。さらに、CRX::Venus陽性の視細胞前駆細胞を増加させられることがわかった。逆に、+LDN193189群、+SAG群など腹側化シグナル伝達物質を添加した場合には視細胞前駆細胞のうち桿体視細胞前駆細胞の割合を高めることができ、+SAG群ではNRL陽性の桿体視細胞前駆細胞の割合が特に高い網膜組織を調製できることがわかった。
実施例４
実施例２に記載した方法により作製された網膜組織について、4%パラホルムアルデヒドで固定した後凍結切片を調製し、CRX、TRβ2の免疫染色、または細胞核を染色するDAPI染色を行った。網膜組織については実施例２と同様に浮遊培養開始後70～75日のものを使用した。CRX陽性細胞数および、CRX陽性細胞のうち、TRβ2陽性細胞数及びDAPI陽性の細胞数を画像解析ソフト（ImageJ）を用いて測定した結果、何も添加しなかったControl（NUC）群においては約10.6%がCRX陽性細胞であったのに対し、+BMP4群、+Cyclopamine-KAAD群、+LDN193189群、+SAG群ではそれぞれ約17．0%、14.1%、6.8%、5.1%がCRX陽性細胞であった。また、Control（NUC）群においては約6.8%がCRX陽性かつTRβ2陽性細胞であったのに対し、+BMP4群、+Cyclopamine-KAAD群、+LDN193189群、+SAG群ではそれぞれ約10.8%、8.1%、4.5%、3.2%がCRX陽性かつTRβ2陽性細胞であった（図４）。これらのことから、背側化シグナル伝達物質を添加して培養することにより錐体視細胞前駆細胞が増加し、腹側化シグナル伝達物質を添加して培養することにより錐体視細胞前駆細胞が減少することが分かった。
実施例５
実施例２に記載した方法により作製された網膜組織について、4%パラホルムアルデヒドで固定した後凍結切片を調製し、OTX2、OC2、TRβ2の免疫染色、または細胞核を染色するDAPI染色を行った。網膜組織については実施例２と同様に浮遊培養開始後70～75日のものを使用した。画像解析ソフト（ImageJ）を用いて測定した結果、+BMP4群、＋Cyclopamine-KAAD群では、何も添加しなかったControl（NUC）群よりOTX2陽性細胞が多く、+LDN193189群、+SAG群ではControl群よりOTX2陽性細胞が少ない結果となった（図５、画像及びグラフ）。また、OC2陽性細胞の数はControl（NUC）群に比べて+BMP4群、＋Cyclopamine-KAAD群で減少する一方、+LDN193189群で増加することが分かった。具体的には、Control（NUC）群においては約26.4%がOC2陽性細胞であったのに対し、+BMP4群、+Cyclopamine-KAAD群、+LDN193189群、+SAG群ではそれぞれ約16.0%、16.7%、35.1%、27.3%がOC2陽性細胞であった(図５、画像及びグラフ)。また、OC2の発現量（免疫染色された蛍光強度の強さ）もControl（NUC）群に比べ、+BMP4群では平均で約36%、＋Cyclopamine-KAAD群では平均で約64%となり、背側化シグナル伝達物質を添加して培養した網膜組織ではOC2の発現量が低下することが分かった(図５、画像、グラフ)。
実施例６
実施例３に記載した方法により作製された網膜組織について、4%パラホルムアルデヒドで固定した後凍結切片を調製し、GFP（CRX遺伝子座に組み込まれたGFP改変体の蛍光を同定できる。すなわち、CRX陽性細胞と同様の細胞を同定できる）、RXR-γ、NRLの免疫染色、または細胞核を染色するDAPI染色を行った。網膜組織については実施例３とおおよそ同様に浮遊培養開始後191～192日のものを使用した。画像解析ソフト（ImageJ）を用いてGFP陽性細胞（CRX::Venus陽性細胞）及びGFP陽性細胞のうち、RXR-γ陽性かつNRL陰性の錐体視細胞前駆細胞（Cone）数、またはNRL陽性の桿体視細胞前駆細胞（Rod-like）数、及びDAPI陽性の細胞数を、画像解析ソフト（ImageJ）を用いて測定した結果、何も添加しなかったControl（NUC）群においては錐体視細胞前駆細胞（Cone）/桿体視細胞前駆細胞（Rod-like）の割合はそれぞれ約22.7%/約12.8%であったのに対し、+BMP4群、+Cyclopamine-KAAD群、+LDN193189群、+SAG群ではそれぞれ約31.3%/約6.1%、約30.2%/約11.5%、約20.0%/約14.0%、約12.6%/約17.2%が錐体視細胞前駆細胞（Cone）/桿体視細胞前駆細胞（Rod-like）であり、Control（NUC）群に比べ+BMP4群、+Cyclopamine-KAAD群で錐体視細胞前駆細胞（Cone）の割合が増加する一方、Control（NUC）群に比べ+LDN193189群、+SAG群で桿体視細胞前駆細胞（Rod-like）の割合が増加することが分かった（図６）。
実施例７
実施例２に記載した方法により作製された網膜組織について、4%パラホルムアルデヒドで固定した後凍結切片を調製し、GFP（CRX遺伝子座に組み込まれたGFP改変体の蛍光を同定できる。すなわち、CRX陽性細胞と同様の細胞を同定できる）、ALDH1A3の免疫染色、または細胞核を染色するDAPI染色を行った。網膜組織については実施例２と同様に浮遊培養開始後75日のものを使用した。その結果、Control（NUC）群では腹側領域だと考えられるALDH1A3陽性領域が網膜組織中にみとめられ、このような領域では特にGFP陽性細胞、すなわちCRXを発現するCRX::Venus陽性細胞が少なかった。また、+BMP4群では、Control（NUC）群に比べ、全体的にALDH1A3の発現が抑制され、これに伴いCRX::Venus陽性細胞が増加した一方、+LDN193189群、+SAG群ではControl（NUC）群よりALDH1A3陽性領域が増加し、これに伴いCRX::Venus陽性細胞も減少していた (図７、画像)。このことから、CRX陽性又はCRX::Venus陽性の視細胞前駆細胞及び錐体視細胞前駆細胞の分化はALDH1A3陽性領域、すなわち腹側化領域で抑制される一方、ALDH1A3陰性領域、すなわち相対的に背側化された領域で促進されることが分かった。
また、同様の条件で調製した浮遊培養開始後約70-75日目の網膜組織からRNAを抽出後、cDNAを合成して定量的PCRによりALDH1A3の遺伝子発現量を解析した結果、免疫染色で認められたのと同様にControl（NUC）群に比べ+BMP4群でALDH1A3遺伝子の発現量が抑制されていたのに対し、+LDN193189群、+SAG群では発現が促進されていた(図７、グラフ中の白色バー（d70）)。また、培養期間以外は同様の条件で培養した浮遊培養開始後約40～44日目の網膜組織からRNAを抽出後、cDNAを合成して定量的PCRによりALDH1A3の遺伝子発現量を解析した結果、浮遊培養開始後約70日目頃と比べ、浮遊培養開始後約40日目頃ではほとんど発現量に変化はなく、差が認められなかった(図７、グラフ中の黒色バー（d40）)。このため、このようなALDH1A3遺伝子発現は浮遊培養開始後40日目頃から70日目頃まで継続して発現していることが示唆された。
実施例８
実施例２及び実施例７に記載した方法により作製された網膜組織について、4%パラホルムアルデヒドで固定した後凍結切片を調製し、ALDH1A1の免疫染色を行った。網膜組織については実施例２と同様に浮遊培養開始後75日のもの、及び実施例７と同様に培養期間以外は同様の条件で培養した浮遊培養開始後約40日のものを使用した。その結果、浮遊培養開始後約40日目の＋BMP4群でのみはっきりとしたALDH1A1陽性領域（すなわち背側領域）がみとめられたが、浮遊培養開始後約75日目になるといずれの条件でもこのようなはっきりとしたALDH1A1陽性領域はみとめられなくなった（図８－１、画像）。
また、実施例７で用いたのと同様のcDNAを用いて定量的PCRによりALDH1A1の遺伝子発現量を解析した結果、免疫染色で認められたのと同様に浮遊培養開始後約40日目頃のControl（NUC）群に比べ+BMP4群でALDH1A1遺伝子の発現量が促進されていた(図８－２、グラフ中の黒色バー（d40）)。しかしながら、浮遊培養開始後約70日目頃では+BMP4群を含む全ての条件でALDH1A1遺伝子発現が低下傾向を示し、免疫染色の結果と相関していた(図８－２、グラフ中の白色バー（d70）)。このため、ALDH1A1遺伝子の遺伝子発現は視細胞前駆細胞及び錐体視細胞前駆細胞の分化が促進される条件、すなわち、0.15nMのBMP4を添加して培養していても浮遊培養開始後40日目頃から約70日目頃にかけて低下し、ALDH1A1の発現は浮遊培養開始後約70日目頃には、はっきりとは認められなくなることが分かった。
一方、浮遊培養開始後約70日目頃のcDNAを用い、CYP26A1遺伝子発現量を解析した結果、ALDH1A1遺伝子の発現量と類似したパターンを示し、0.15nMのBMP4を添加することによってCYP26A1遺伝子が発現促進されること、LDN-193189を添加することによってCYP26A1遺伝子が発現抑制されることが分かった（図８－３）。
実施例９
実施例１に記載した方法において、背側化シグナル伝達物質（BMP4）を下記の通り加えることにより、網膜組織を含む細胞凝集体を調製した。
［１］+BMP4(0.15nM)群；0.15 nMのBMP4を浮遊培養開始後22日目から浮遊培養が終了するまで添加し、浮遊培養開始後70～75日目まで培養した。
［２］+BMP4(0.45nM)群；0.45 nMのBMP4を浮遊培養開始後22日目から浮遊培養が終了するまで添加し、浮遊培養開始後70～75日目まで培養した。
［３］+BMP4(1.35nM)群；1.35 nMのBMP4を浮遊培養開始後22日目から浮遊培養が終了するまで添加し、浮遊培養開始後70～75日目まで培養した。
このように調製した網膜組織からRNAを抽出後、cDNAを合成して定量的PCRによりALDH1A1の遺伝子発現量を解析した。その結果、0.15nMのBMP4を添加した群（0.15nM群）に比べ、高濃度のBMP4を添加した群（0.45nM群及び1.35nM群）でCRX::Venus陽性細胞がかえって少なくなることがわかった（図９、画像上段）。また、高濃度のBMP4を添加した群（1.35nM群）ではALDH1A1遺伝子発現も有意に高まることが分かった（図９、グラフ）。さらに、1.35 nMのBMP4を用いて調製した網膜組織について、4%パラホルムアルデヒドで固定した後凍結切片を調製し、GFP（CRX遺伝子座に組み込まれたGFP改変体の蛍光を同定できる。すなわち、CRX陽性細胞と同様の細胞を同定できる。）、ALDH1A1に対する抗体を用いて免疫染色、または細胞核を染色するDAPI染色を行った。その結果、ALDH1A1の発現が相対的に高い、さらに背側化された領域ではCRX::Venusの数が少なく、このような領域ではALDH1A3陽性の腹側領域の場合と同様に視細胞前駆細胞の分化が相対的に抑制されていることが分かった（図９、画像下段）。また、画像中のブラケットはALDH1A1の発現が相対的に低い領域を示しており、さらに背側化された領域に比べ、背側領域の中でもこのような相対的に腹側領域に近いと言える領域では逆にCRX::Venusが比較的多くみとめられる傾向にあった。即ち、過剰な濃度のBMP4添加は視細胞前駆細胞の分化をかえって抑制してしまうため、視細胞前駆細胞の分化促進には比較的低濃度（例えば0.05nM～0.25nM）のBMP4により誘導することが望ましいことが分かった。
また、図９の結果と、図８-１、図８-２及び図８-３に示した結果を併せて考えると、図に示した段階までの間に視細胞前駆細胞の分化を促進させるためには、ALDH1A3が抑制され、CYP26A1が誘導されるのが好ましい一方、ALDH1A1発現はBMP4を添加しない場合に比べ高く誘導されても良いが、0.45nM～1.35nMといった高濃度のBMP4による過剰なALDH1A1発現が認められる程度の背側化は好ましくない、即ち、かえって視細胞前駆細胞の分化を抑制させることが分かった。これらのことから、視細胞前駆細胞及び視細胞の分化には、BMP4を用いる場合、比較的低濃度（例えば0.05nM～0.25nM）のBMP4により誘導することが望ましく、BMP4の濃度は、ALDH1A1の発現を指標とし、ALDH1A1の発現が過剰、あるいは強陽性とならない程度に設定できることが分かった。さらに、BMP4により背側化を誘導する際には、ALDH1A3の発現が抑制されていることを確認した上で、ALDH1A1以外の背側マーカー（例えばCYP26A1）の発現が誘導される程度の、適切な濃度（例えば0.05nM～0.25nM）に設定できることが分かった。なお、浮遊培養開始から70日目～75日目までに出現する視細胞前駆細胞、または視細胞は錐体視細胞前駆細胞、または錐体視細胞である。
実施例１０
実施例１及び実施例３に記載した方法と同様の方法により、ミューラー細胞が認められる程度に成熟した分化段階の網膜組織を含む細胞凝集体を調製した。使用した血清培地には、背側化シグナル伝達物質（BMP4またはCyclopamine-KAAD）、または腹側化シグナル伝達物質（LDN193189またはSAG）を添加せず、ミューラー細胞が認められる程度に成熟した分化段階（例えば、培養開始から190日目）の網膜組織を経て、さらに270日目まで培養した。得られた網膜組織を含む細胞凝集体を4%パラホルムアルデヒドで固定した後凍結切片を調製し、視細胞の更なる成熟化に伴って発現するS-Opsin(S-OPN)、LM-Opsin(LM-OPN)、Rhodopsin(RET-P1)、Cone arrestin(ARR3)、錐体視細胞特異的なcyclic nucleotide-gated channel(CNGA3)の免疫染色を行った。その結果、若干のS-opsin発現は認められたが、ほとんど全ての視細胞前駆細胞はS-opsin(S-OPN)、LM-Opsin(LM-OPN)、Rhodopsin(RET-P1)、Cone arrestin(ARR3)を発現せず、生体内と異なり最終的な成熟化が認められないことが分かった（図１０）。
実施例１１
実施例１及び実施例３に記載した方法と同様の方法により、ミューラー細胞が認められる程度に成熟した分化段階の網膜組織を含む細胞凝集体を調製した。使用した血清培地には、実施例３と同様に腹側化シグナル伝達物質（LDN193189）を添加し、ミューラー細胞が認められる程度に成熟した分化段階の網膜組織となるまで、培養開始から190日目頃まで培養した。その後、グルタミン酸を成分として含むDMEM/F12培地に1% N2 supplement、および100μMタウリンが添加されているが、10%牛胎児血清は添加されていない培地により、培養開始からさらに260～338日目まで培養した。得られた網膜組織を含む細胞凝集体を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、凍結切片、またはマルチアングルライトシート蛍光顕微鏡用の網膜組織を含む細胞凝集体試料を調製し、視細胞の更なる成熟化に伴って発現するS-opsin(S-OPN)、Rhodopsin(RET-P1)、Cone arrestin(ARR3)、Rod Arrestin(SAG)、錐体視細胞特異的なcyclic nucleotide-gated channel(CNGA3)、桿体特異的なcyclic nucleotide-gated channel(CNGA1)、錐体視細胞特異的なtransducin alpha subunit(Gat2)、桿体視細胞特異的なtransducin alpha subunit(Gat1)、錐体視細胞特異的なPhosphodiesterase 6C(PDE6c)、桿体視細胞特異的なPhosphodiesterase 6A（PDE6a）の免疫染色を行った（図１１）。その結果、更なる成熟化に伴って発現するこれら機能分子が錐体視細胞（図１１、左上段）又は桿体視細胞（図１１、左下段）で発現しており、最終的な成熟化が促進されていることが分かった。また、マルチアングルライトシート蛍光顕微鏡による観察により、成熟化した視細胞は網膜組織の全体に認められることが分かった（図１１、右）。
実施例１２
実施例１及び実施例３に記載した方法と同様の方法によりミューラー細胞が認められる程度に成熟した分化段階の網膜組織を含む細胞凝集体を調製した。使用した血清培地には、実施例３と同様に背側化シグナル伝達物質（BMP4）を添加し、ミューラー細胞が認められる程度に成熟した分化段階の網膜組織となるまで、培養開始から190日目頃まで培養した。その後、グルタミン酸を成分として含むDMEM/F12培地に1% N2 supplement、および100μMタウリンが添加されているが、10%牛胎児血清は添加されていない培地に、0.15nM BMP4及び2～4nMのＴ３を添加し、培養開始からさらに341～344日目まで培養した。網膜組織を含む細胞凝集体を4%パラホルムアルデヒドで固定した後、凍結切片、またはマルチアングルライトシート蛍光顕微鏡用の網膜組織を含む細胞凝集体試料を調製し、視細胞の更なる成熟化に伴って発現するLM-opsin(LM-OPN)、Cone arrestin(ARR3)、錐体視細胞特異的なcyclic nucleotide-gated channel(CNGA3)、錐体視細胞特異的なtransducin alpha subunit(Gat2)、錐体視細胞特異的なPhosphodiesterase 6C(PDE6c)の免疫染色を行った。その結果、更なる成熟化に伴って発現するこれら機能分子が錐体視細胞で発現しており、最終的な成熟化が促進されていることが分かった（図１２、左上段、および下段）。また、マルチアングルライトシート蛍光顕微鏡による観察により、BMP4及びT3を添加しなかった時（図１２、中央、DMEM/F12(without FBS)）に比べ、BMP4及びT3を加えた時、LM-opsinの発現が促進されることが分かった（図１２、右、DMEM/F12(without FBS) with BMP4/T3）。
実施例１３
実施例１及び実施例３に記載した方法と同様の方法によりミューラー細胞が認められる程度に成熟した分化段階の網膜組織を含む細胞凝集体を調製した。使用した血清培地により、ミューラー細胞が認められる程度に成熟した分化段階の網膜組織となるまで、培養開始から190日目頃まで培養した。その後、実施例１１及び１２に記載した方法と同様な方法で更に成熟化させた。即ち、グルタミン酸を成分として含むDMEM/F12培地に1% N2 supplement、および100μMタウリンが添加されているが、10%牛胎児血清は添加されていない培地に、0～1.35nMのBMP4及び0～8nMのＴ３を添加し、更に成熟化させるための培養を開始してから、さらに30日以上培養した。網膜組織を含む細胞凝集体を回収し、定法に従って定量的PCRを実施し、S-opsin、M-opsin、L-opsinの発現量を確認した。その結果、T3を含まない場合、BMP4の添加の有無にかかわらずS-opsinの発現が促進されていたことから、S錐体視細胞への更なる成熟化、即ち最終的な成熟化が促進されていることが分かった。一方、T3を添加した場合はS-opsinの発現が抑制されており、S錐体視細胞への最終的な成熟化にはT3が抑制的に働くことが分かった。また、T3に加え、BMP4を組み合わせて添加した場合、L及びM-opsinの発現が促進されており、L又はM錐体視細胞への更なる成熟化、即ち最終的な成熟化が促進されていることが分かった（図１３）。
本発明の製造方法により、錐体視細胞に富む網膜組織を製造し、加齢黄斑変性症等の患者の眼の黄斑部への移植用網膜組織を提供すること、及び桿体視細胞に富む網膜組織を製造し、加齢黄斑変性症等の患者の眼の黄斑部周縁部より外側への移植用網膜組織を提供することが可能となる。また、本発明の錐体視細胞に富む網膜組織、及び桿体視細胞に富む網膜組織は、医薬組成物として有用である。
本出願は、日本で出願された特願2017-177187(出願日:2017年9月14日)を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims (67)

  1. 発生初期段階から錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階までの網膜組織を、腹側マーカーの発現を抑制する程度の濃度の背側化シグナル伝達物質を含む培地で培養する工程を含む、網膜組織に含まれる視細胞前駆細胞（photoreceptor precursor）及び視細胞(photoreceptor)中の錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の割合を増加させる方法。
  2. 錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞が、CRX陽性かつRXR-γ陽性、又はCRX陽性かつTRβ2陽性であって、NRL陰性の細胞である、請求項１に記載の方法。
  3. 腹側マーカーがALDH1A3及び／又はCOUP-TF Iである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 背側化シグナル伝達物質の濃度が、最も背側のマーカーの発現は誘導しない程度である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 背側化シグナル伝達物質の濃度が、背側マーカーの発現を促進する程度である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  6. 背側化シグナル伝達物質の濃度が、最も背側のマーカーの発現を誘導しない程度であり且つそれ以外の背側マーカーの発現は促進する程度である、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
  7. 背側マーカーがCYP26A1及び／又はCYP26C1である、請求項５又は６に記載の方法。
  8. 最も背側のマーカーがCOUP-TF IIである、請求項４又は６に記載の方法。
  9. 背側マーカーがALDH1A1である、請求項５又は６に記載の方法。
  10. 背側化シグナル伝達物質の濃度が、1.35 nMのBMP4が促進するALDH1A1の発現量の0.1%以上30%以下のALDH1A1の発現が誘導される程度である、請求項９に記載の方法。
  11. 発生初期段階の網膜組織が、毛様体周縁部様構造体を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  12. 発生初期段階の網膜組織が、視細胞及び神経節細胞に分化し得る細胞を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。
  13. 発生初期段階の網膜組織が、多能性幹細胞由来である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 発生初期段階の網膜組織が、成体組織から得られる神経上皮細胞由来である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
  15. 発生初期段階の網膜組織が、PAX6陽性かつRX陽性の細胞を含むことを特徴とする、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
  16. 発生初期段階の網膜組織が、PAX6陽性、RX陽性かつCHX10陽性の細胞を含むことを特徴とする、請求項１～１５のいずれか１項に記載の方法。
  17. 背側化シグナル伝達物質の存在下に培養する工程が、4日間～170日間継続される、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。
  18. 背側化シグナル伝達物質の存在下に培養する工程が、背側化シグナル伝達物質非存在下に培養した場合に桿体視細胞前駆細胞が出現する時期まで継続される、請求項１７に記載の方法。
  19. 背側化シグナル伝達物質が0.01 nM～0.90 nMのBMP4に相当するBMPシグナルを誘導可能な、BMPシグナル伝達経路作用物質もしくはWntシグナル伝達経路作用物質、又はSHHシグナル伝達経路阻害物質である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
  20. 背側化シグナル伝達物質がBMP4である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  21. BMP4の濃度が、0.05 nM～0.45 nMである請求項２０に記載の方法。
  22. 背側化シグナル伝達物質がCyclopamine-KAADである、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
  23. Cyclopamine-KAADの濃度が、0.01 μM～5 μMである、請求項２２に記載の方法。
  24. Cyclopamine-KAADの濃度が、0.2 μM～1 μMである、請求項２３に記載の方法。
  25. ９－シスレチノイン酸を含まない培地中で実施される、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
  26. 請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法によって得られる、錐体視細胞前駆細胞に富む視細胞前駆細胞、及び／又は錐体視細胞に富む視細胞を含む網膜組織。
  27. 視細胞前駆細胞及び視細胞中の、錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の細胞数が、桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞の細胞数に比べて、２倍以上、好ましくは４倍以上であり、かつ神経節細胞を有する、錐体視細胞前駆細胞に富む視細胞前駆細胞、及び／又は錐体視細胞に富む視細胞を含む網膜組織。
  28. 全視細胞前駆細胞及び全視細胞に含まれる錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞の細胞数が70%以上、好ましくは80%以上である、請求項２６又は２７に記載の網膜組織。
  29. 培養することにより、請求項２６又は２７に記載の網膜組織へ成熟化され得る網膜組織。
  30. 網膜組織の層構造の50%以上が連続上皮構造を形成する、請求項２６～２９のいずれか１項に記載の網膜組織。
  31. 網膜組織の長軸方向の直径が0.6 mm以上である、請求項３０に記載の網膜組織。
  32. 請求項２６～３１のいずれか１項に記載の網膜組織から切り出された網膜組織片を含む、網膜疾患患者の移植を必要とする網膜組織へ移植されるための医薬組成物。
  33. 移植を必要とする網膜組織が、Rod-free zoneを含む領域の組織である、請求項３２に記載の医薬組成物。
  34. Rod-free zoneを含む領域が、黄斑部（Macular）様構造を有する、請求項３３に記載の医薬組成物。
  35. 発生初期段階から錐体視細胞前駆細胞の出現率が極大になる段階までの網膜組織を、少なくとも１日間、腹側マーカーの発現を促進する程度の濃度の腹側化シグナル伝達物質の存在下に培養する工程を含む、網膜組織に含まれる視細胞前駆細胞（photoreceptor precursor）及び視細胞(photoreceptor)中の桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞の割合を増加させる方法。
  36. 桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞が、NRL陽性かつCRX陽性の細胞である、請求項３５に記載の方法。
  37. 腹側マーカーがALDH1A3及び／又はCOUP-TF Iである、請求項３５又は３６に記載の方法。
  38. 発生初期段階の網膜組織が、毛様体周縁部様構造体を含む、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。
  39. 発生初期段階の網膜組織が、視細胞及び神経節細胞に分化し得る細胞を含む、請求項３５～３８のいずれか１項に記載の方法。
  40. 発生初期段階の網膜組織が、多能性幹細胞由来である、請求項３５～３９のいずれか１項に記載の方法。
  41. 発生初期段階の網膜組織が、成体組織から得られる神経上皮細胞を含む細胞由来である、請求項３５～３９のいずれか１項に記載の方法。
  42. 発生初期段階の網膜組織が、PAX6陽性かつRX陽性の細胞を含むことを特徴とする、請求項３５～４１のいずれか１項に記載の方法。
  43. 発生初期段階の網膜組織が、PAX6陽性、RX陽性かつCHX10陽性の細胞を含むことを特徴とする、請求項４２に記載の方法。
  44. 腹側化シグナル伝達物質の存在下に培養する工程が、4日間～170日間継続される、請求項３５～４３のいずれか１項に記載の方法。
  45. 腹側化シグナル伝達物質の存在下に培養する工程が、桿体視細胞前駆細胞が出現する時期まで継続される、請求項４４に記載の方法。
  46. 腹側化シグナル伝達物質が1 nM～10 μMのSAGに相当するSHHシグナル伝達経路促進作用を有する物質、又は0.1 nM～20 μMのLDN193189に相当するBMPシグナル伝達経路阻害作用を有する物質である、請求項３５～４５のいずれか１項に記載の方法。
  47. 腹側化シグナル伝達物質がSAGである、請求項４６に記載の方法。
  48. SAGの濃度が、1 nM～10 μMである、請求項４７に記載の方法。
  49. SAGの濃度が、10 nM～500 nMである、請求項４８に記載の方法。
  50. 腹側化シグナル伝達物質がLDN193189である、請求項４６に記載の方法。
  51. LDN193189の濃度が、0.1 nM～20 μMである、請求項５０に記載の方法。
  52. LDN193189の濃度が、30 nM～1 μMである、請求項５１に記載の方法。
  53. ９－シスレチノイン酸を含まない培地中で実施される、請求項３５～５２のいずれか１項に記載の方法。
  54. 請求項３５～５３のいずれか１項に記載の方法によって得られる、桿体視細胞前駆細胞に富む視細胞前駆細胞、及び／又は桿体視細胞に富む視細胞を含む網膜組織。
  55. 視細胞前駆細胞及び視細胞の細胞数に対して、40%以上、好ましくは55%以上が桿体視細胞前駆細胞及び桿体視細胞であり、かつ神経節細胞を有する、桿体視細胞前駆細胞に富む視細胞前駆細胞、及び／又は桿体視細胞に富む視細胞を含む網膜組織。
  56. 培養することにより、請求項５５に記載の網膜組織へ成熟化され得る網膜組織。
  57. 網膜組織の層構造の50%以上が連続上皮構造を形成する、請求項５４～５６のいずれか１項に記載の網膜組織。
  58. 網膜組織の長軸方向の直径が0.6 ｍｍ以上である、請求項５７に記載の網膜組織。
  59. 請求項５４～５８のいずれか１項に記載の網膜組織から切り出された網膜組織片を含む、網膜疾患患者の移植を必要とする網膜組織へ移植されるための医薬組成物。
  60. 移植を必要とする網膜組織が、桿体視細胞前駆細胞（Rod precursor）及び／又は桿体視細胞の割合が高い黄斑部の周縁部及びその外側を含む領域の組織である、請求項５９に記載の医薬組成物。
  61. 請求項２６～３１のいずれか１項、又は請求項５４～５８のいずれか１項に記載の網膜組織の有効量を、移植を必要とする対象に移植することを含む、網膜細胞もしくは網膜組織の障害に基づく疾患の治療方法。
  62. 請求項２６～３１のいずれか１項、又は請求項５４～５８のいずれか１項に記載の網膜組織の毒性・薬効評価用試薬としての使用。
  63. 錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞を含む網膜組織を、血清を含まない培地で培養する工程を含む、S-opsin、L-opsin及び／又はM-opsinを発現する、完全に成熟化した網膜組織を製造する方法。
  64. 錐体視細胞前駆細胞及び錐体視細胞を含む網膜組織が、請求項２６～３１のいずれか1項に記載の網膜組織である、請求項６３記載の方法。
  65. 血清を含まない培地が、背側化シグナル伝達物質を含む培地である、請求項６３又は６４に記載の方法。
  66. 背側化シグナル伝達物質が、BMPである、請求項６５に記載の方法。
  67. 血清を含まない培地が、更に甲状腺ホルモンシグナル伝達物質を含む培地である、請求項６３～６６のいずれか１項に記載の方法。
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