KR20170072941A - 망막 조직의 제조 방법 - Google Patents

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야스시 히라미네
요시키 사사이
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고쿠리쓰 겐큐 가이하쓰 호징 리가가쿠 겐큐소
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Abstract

본 발명은 망막 세포 또는 망막 조직의 제조 방법을 제공하며, 방법은 하기 단계 (1)-(3) 을 포함한다: (1) 인간 만능줄기세포를 피더 세포의 부재 하에 미분화 유지 인자를 포함하는 배양 배지에서 배양하는 제 1 단계; (2) 제 1 단계에서 수득한 만능줄기세포를 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성제의 존재 하에 현탁 배양하여, 세포 응집체를 형성시키는 제 2 단계; 및 (3) 제 2 단계에서 수득한 응집체를 BMP 시그널 전달 경로 활성제의 존재 하에 현탁 배양하여, 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는 응집체를 수득하는 제 3 단계.

Description

망막 조직의 제조 방법 {PRODUCTION METHOD FOR RETINAL TISSUE}
본 발명은 만능줄기세포로부터 망막 세포 또는 망막 조직을 제조하는 방법에 관한 것이다.
만능줄기세포로부터 망막 조직과 같은 신경 조직을 제조하는 방법으로서, 무혈청 배지에 만능줄기세포의 균일한 응집체를 형성시키고, 이것을 현탁 배양하고, 목적하는 신경 세포로의 만능줄기세포의 분화를 유도하기에 적절한 분화 유도 인자 등의 존재 하에, 분화 유도용 배양 배지에서 현탁 배양하는 것을 포함하는, 신경 조직의 방법이 보고되었다 (특허문헌 1 및 비특허문헌 1). 예를 들어, 만능줄기세포로부터 다층의 망막 조직을 수득하는 방법 (비특허문헌 2 및 특허문헌 2), 및 Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지에 만능줄기세포의 균일한 응집체를 형성시킨 후, 이것을 기저막 제제의 존재 하에 현탁 배양한 다음, 이것을 혈청-함유 배지에 현탁 배양하는 것을 포함하는 다층의 망막 조직을 수득하는 방법 (비특허문헌 3 및 특허문헌 3) 이 알려져 있다. 또한, 만능줄기세포를 시상하부 조직으로 분화 유도하는 방법 (특허문헌 4 및 비특허문헌 4), 및 만능줄기세포를 신경 전구 세포로 분화 유도하는 방법 (비특허문헌 5 및 6) 이 또한 보고되었다.
이들 제조 방법의 출발 재료인 만능줄기세포는, 특히 영장류 만능줄기세포의 경우, 피더 세포의 존재 하에 미분화 상태 유지 인자를 첨가하여 미분화 상태를 유지하도록 배양하였다. 최근, 미분화 상태를 유지하는 배양이 개선되었고, 영장류 만능줄기세포를, 피더 세포의 부재 하에 (피더-프리) 미분화 상태 유지 인자를 첨가하여 영장류 만능줄기세포를 배양하는 방법이 보고되었다 (비특허문헌 7, 비특허문헌 8 및 비특허문헌 9). 이 방법으로 피더-프리 배양된 만능줄기세포를 출발 재료로서 사용하는 망막 세포 또는 망막 조직을 안정적으로 제조하는 방법이 요구되고 있다.
특허문헌 1 : WO 2009/148170 특허문헌 2 : WO 2011/055855 특허문헌 3 : WO 2013/077425 특허문헌 4 : WO 2013/065763
비특허문헌 1 : Cell Stem Cell, 3, 519-32 (2008) 비특허문헌 2 : Nature, 472, 51-56 (2011) 비특허문헌 3 : Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012) 비특허문헌 4 : Nature, 480, 57-62 (2011) 비특허문헌 5 : Nature Biotechnology, 27(3), 275-80 (2009) 비특허문헌 6 : Proc Natl Acad Sci USA, 110(50), 20284-9 (2013) 비특허문헌 7 : Nature Methods, 8, 424-429 (2011) 비특허문헌 8 : Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 비특허문헌 9 : In Vitro Cell Dev Biol Anim., 46, 247-58 (2010)
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 피더 세포의 부재 하에 미분화 상태를 유지하여 배양 또는 제조된 만능줄기세포로부터 망막 세포 또는 망막 조직을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 앞서 언급한 과제를 해결하기 위하여 집중적인 연구를 수행하였으며, 피더 세포의 부재 하에 미분화 상태를 유지하면서, 만능줄기세포 (특히 인간 iPS 세포) 를 배양하고, 수득한 만능줄기세포를 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하는 배지에 현탁 배양함으로써, 표면이 매끄럽고, 내부가 조밀한, 미분화 상태를 유지하는 구형 세포 응집체를 높은 효율로 형성할 수 있다는 것을 발견했다. 또한, 이 고품질의 세포 응집체를 사용하여, 망막 세포 또는 망막 조직을 높은 효율로 유도할 수 있다는 것을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 이하에 관한 것이다.
[1] 하기 단계 (1) - (3) 을 포함하는, 망막 세포 또는 망막 조직의 제조 방법:
(1) 인간 만능줄기세포를 피더 세포의 부재 하에 미분화 상태 유지 인자를 포함하는 배지에 배양하는 제 1 단계,
(2) 제 1 단계에서 수득한 만능줄기세포를 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 2 단계, 및
(3) 제 2 단계에서 수득한 응집체를 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는 응집체를 수득하는 제 3 단계.
[2] [1] 에 있어서, 제 2 단계에서, 제 1 단계에서 수득한 세포를 분산시키고, 분산시킨 세포를 현탁 배양하는 제조 방법.
[3] [1] 또는 [2] 에 있어서, 미분화 상태 유지 인자가 FGF 시그널 전달 경로 활성 물질인 제조 방법.
[4] [3] 에 있어서, FGF 시그널 전달 경로 활성 물질이 bFGF 인 제조 방법.
[5] [1] - [4] 중 어느 하나에 있어서, 제 2 단계에서, 배지 중 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질의 농도가 10 nM 내지 700 nM 에서의 SAG 의 소닉 헤지호그 시그널 전달 활성에 상응하는 농도인 제조 방법.
[6] [1] - [5] 중 어느 하나에 있어서, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질이 SAG, 퍼모파민 또는 Shh 인 제조 방법.
[7] [1] - [6] 중 어느 하나에 있어서, BMP 시그널 전달 경로 활성 물질이 BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF7 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질인 제조 방법.
[8] [6] 에 있어서, BMP 시그널 전달 경로 활성 물질이 BMP4 인 제조 방법.
[9] [1] - [8] 중 어느 하나에 있어서, 제 3 단계에서, 제 2 단계의 시작 2 일 내지 9 일째에 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질이 배지에 첨가되는 제조 방법.
[10] [1] - [9] 중 어느 하나에 있어서, 제 3 단계에서, 응집체가 700 nM 에서의 SAG 의 소닉 헤지호그 시그널 전달 활성에 상응하는 농도 이하에서 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하는 배지에서 배양되는 제조 방법.
[11] [1] - [10] 중 어느 하나에 있어서, 제 1 단계가 접착 배양 방법으로 수행되는 제조 방법.
[12] [1] - [11] 중 어느 하나에 있어서, 만능줄기세포가 유도 만능줄기세포인 제조 방법.
[13] [1] - [12] 중 어느 하나에 있어서, 균일한 응집체가 제 2 단계에서 형성되는 제조 방법.
[14] [1] - [13] 중 어느 하나에 있어서, 제 3 단계에서 수득한 응집체가 망막 전구 세포, 신경 망막 전구 세포, 광수용체 전구 세포, 광수용체 세포, 간상 광수용체 세포, 원추 광수용체 세포, 수평 세포, 아마크린 세포, 개재뉴런, 신경절 세포, 망막 색소 상피 세포, 및 모양체 주연부 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포를 포함하는 제조 방법.
[15] [1] - [14] 중 어느 하나에 있어서, 현탁 배양이 기저막 제제의 부재 하에 수행되는 제조 방법.
[16] [1] - [15] 중 어느 하나의 방법으로 제조된 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능 평가용 시약.
[17] [1] - [15] 중 어느 하나의 방법으로 제조된 망막 세포 또는 망막 조직에 시험 물질을 접촉시키고, 물질이 세포 또는 조직에 미치는 영향을 검출하는 것을 포함하는, 시험 물질의 독성 효능 평가 방법.
[18] [1] - [15] 중 어느 하나의 방법으로 제조된 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는, 망막 조직의 장애로 인한 질환을 치료하기 위한 의약.
[19] [18] 에 있어서, 망막 세포가 망막 전구 세포 및/또는 망막층 특이적 뉴런인 의약.
[20] [1] - [15] 중 어느 하나의 방법으로 제조된 망막 세포 또는 망막 조직의 유효량을 이식을 필요로 하는 대상에 이식하는 것을 포함하는, 망막 조직의 장애로 인한 질환의 치료 방법.
[21] 망막 조직의 장애로 인한 질환의 치료에서의 사용을 위한 [1] - [15] 중 어느 하나의 방법으로 제조된 망막 세포 또는 망막 조직.
[22] [1] - [15] 중 어느 하나의 방법으로 제조된 망막 세포 또는 망막 조직을 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물.
본 발명에 따르면, 피더 세포의 부재 하에 배양된 만능줄기세포로부터, 고품질의 세포 응집체, 뿐만 아니라 망막 세포 및 망막 조직이 높은 효율로 제조될 수 있다.
도 1 은 비교예 1 및 실시예 1 의 배양 조건, 및 응집체의 명시 야상 (A-D)을 나타낸다.
도 2 는 실시예 1 의 배양 조건, 및 망막 조직 마커 (Chx10, Rx) 에 대한 응집체의 면역조직화학 염색상 (A-D) 을 나타낸다.
도 3 은 실시예 2 의 배양 조건 및 응집체의 명시 야상 (A-D) 을 나타낸다.
도 4 는 실시예 2 (BMP4 처리 안함) 의 배양 조건, 및 응집체 모폴로지의 수준을 정량화한 그래프를 나타낸다.
도 5 는 실시예 3 의 배양 조건, 및 망막 조직 마커 (Chx10, Rx) 에 대한 응집체의 면역조직화학 염색상 (A-D) 을 나타낸다.
도 6 은 실시예 4 의 배양 조건에서 제조한 망막 조직의, 망막 조직 마커에 대한 면역 염색상을 나타낸다.
도 7 은 실시예 5 의 배양 조건에서 제조한 망막 조직의, 망막 조직 마커에 대한 면역 염색상을 나타낸다.
도 8 은 실시예 6 의 배양 조건에서 제조한 응집체의 명시 야상 (A-C), 및 망막 조직 마커 (Chx10) 에 대한 면역 염색상 (D-F) 을 나타낸다.
도 9 는 실시예 7 의 배양 조건에서 제조한 응집체의 명시 야상 (A-D), 및 망막 조직 마커 (Chx10) 에 대한 면역 염색상 (E) 을 나타낸다.
도 10 은 실시예 8 의 배양 조건에서 제조한 응집체의 명시 야상 (A, B), 및 망막 조직 마커 (Chx10, Rx) 에 대한 면역 염색상 (C, D) 을 나타낸다.
1. 정의
본 발명에서, "줄기세포" 는 분화 능력 및 분화 능력을 유지한 증식 능력 (특히 자기 복제 능력) 을 갖는 미분화 세포를 의미한다. 줄기세포에는, 분화 능력에 따라, 만능줄기세포 (pluripotent stem cell), 다능성줄기세포 (multipotent stem cell), 단능성줄기세포 (unipotent stem cell) 등의 아집단이 포함된다. 만능줄기세포는 인비트로에서 배양될 수 있고, 3 배엽 (외배엽, 중배엽, 내배엽) 및/또는 배외 조직 유래의 조직에 속하는 임의의 세포 계통으로 분화할 수 있는 능력 (만능성 (pluripotency)) 을 갖는 줄기세포를 지칭한다. 다능성줄기세포란, 모든 종류는 아니지만, 복수 유형의 조직 또는 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 줄기세포를 의미한다. 단능성줄기세포는 특정 조직 또는 세포로 분화할 수 있는 능력을 갖는 줄기세포를 의미한다.
만능줄기세포는, 수정란, 클론 배아, 배아줄기세포, 조직내 줄기세포, 체세포 등으로부터 유도될 수 있다. 만능줄기세포의 예는 배아줄기세포 (ES 세포), EG 세포 (Embryonic germ cell), 유도 만능줄기세포 (iPS 세포) 등을 포함한다. 간엽줄기세포 (MSC) 에서 얻은 뮤즈 세포 (Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell), 및 생식 세포 (예를 들어, 정소) 로부터 생산된 GS 세포도 만능줄기세포에 포함된다. 배아줄기세포는 1981 년에 처음으로 수립되었고, 1989 년 이후 녹아웃 마우스 생성에도 응용되고 있다. 1998 년에는 인간 배아줄기세포가 수립되었고, 재생 의학에도 이용되고 있다. ES 세포는, 내부 세포 덩어리를 피더 세포 또는 또는 LIF 함유 배지에서 배양함으로써 생산될 수 있다. ES 세포의 생산 방법은, 예를 들어, WO 96/22362, WO 02/101057, US 5,843,780, US 6,200,806, US 6,280,718 등에 기재되어 있다. 배아줄기세포는, 소정 기관에서 입수 가능하며, 또한 시판 제품을 구입할 수도 있다. 예를 들어, 인간 배아줄기세포인 KhES-1, KhES-2 및 KhES-3 은, 교토대학교의 프론티어 의학 연구소 (Institute for Frontier Medical Sciences) 에서 입수 가능하다. 마우스 배아줄기세포인, EB5 세포는 Incorporated Administrative Agency RIKEN 에서 입수 가능하고, 마우스 배아줄기세포인 D3 세포주는 ATCC 에서 입수 가능하다.
ES 세포 중 하나인 핵이식 ES 세포 (ntES 세포) 는, 체세포의 핵을 핵을 없앤 난자에 이식함으로써 클론 배아로부터 수립될 수 있다.
EG 세포는, 시원생식세포를 mSCF, LIF 및 bFGF 함유 배지에서 배양함으로써 생산될 수 있다 (Cell, 70: 841-847, 1992).
본 발명에서 "유도 만능줄기세포" 는 체세포를 공지된 방법 등에 의해 재프로그래밍하여 만능성을 갖도록 유도한 세포이다. 구체적으로는, Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog, Sall4, lin28, Esrrb 등을 포함하는 재프로그래밍 유전자로 이루어진 군으로부터 선택되는 복수의 유전자의 조합의 발현에 의해 섬유아세포 또는 말초혈액단핵세포 등과 같은 분화한 체세포를 재프로그래밍하여 만능성을 갖도록 유도한 세포이다. 재프로그래밍 인자의 바람직한 조합의 예는 (1) Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 Myc (c-Myc 또는 L-Myc), 및 (2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 및 L-Myc (Stem Cells, 2013; 31:458-466) 를 포함한다.
유도 만능줄기세포는 2006 년에 Yamanaka et al. 에 의해 마우스 세포에서 수립되었다 (Cell, 2006, 126(4), pp.663-676). 2007 년에, 유도 만능줄기세포는, 인간 섬유아세포에서도 수립되었고, 배아줄기세포와 마찬가지로 만능성 및 자기 복제 능력을 갖는다 (Cell, 2007, 131(5), pp.861-872; Science, 2007, 318(5858), pp.1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp.101-106). 유전자 발현에 의한 직접 재프로그래밍을 기반으로 하는 생산 방법 이외에, 유도 만능줄기세포는 또한 화합물의 첨가 등에 의해 체세포로부터 수득될 수 있다 (Science, 2013, 341, pp. 651-654).
또, 수립된 유도 만능줄기세포, 및, 예를 들어, 교토대학교교에 의해 수립된 인간 유도만능세포주, 예컨대 201B7 세포, 201B7-Ff 세포, 253G1 세포, 253G4 세포, 1201 C1 세포, 1205D1 세포, 1210B2 세포 또는, 1231A3 세포 등은 교토대학교 및 iPS Academia Japen, Inc. 에서 입수 가능하다. 수립된 유도 만능줄기세포로서, 예를 들어, 교토대학교에 의해 수립된 Ff-I01 세포 및 Ff-I14 세포는 교토대학교에서 입수 가능하다.
유도 만능줄기세포를 수득하기 위해 사용되는 체세포는 특별히 제한되지 않지만, 조직 유래 섬유아세포, 혈구계 세포 (예를 들어, 말초혈액단핵세포, T 세포), 간세포, 췌장 세포, 장 상피 세포, 평활근 세포 등을 언급할 수 있다.
유도 만능줄기세포가 여러 종류의 유전자의 발현에 의한 재프로그래밍에 의해 생산되는 경우, 유전자 발현을 위한 수단은 특별히 제한되지 않는다. 앞서 언급한 수단의 예는 바이러스 벡터 (예를 들어, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 센다이바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터) 를 사용하는 감염 방법, 플라스미드 벡터 (예를 들어, 플라스미드 벡터, 에피솜 벡터) 를 사용하는 유전자 이식 방법 (예를 들어, 인산 칼슘 방법, 리포펙션방법, 레트로넥틴 방법, 전기천공 방법), RNA 벡터를 사용하는 유전자 이식 방법 (예를 들어, 인산 칼슘법, 리포펙션방법, 전기천공 방법), 단백질의 직접 주입에 의한 방법 등을 포함한다.
유도 만능줄기세포는 피더 세포 존재 하에 또는 피더 세포 부재 하 (피더-프리) 에서 생산될 수 있다. 피더 세포의 존재 하에 생산되는 경우, 유도 만능줄기세포는 미분화 상태 유지 인자의 존재 하에 공지된 방법으로 생산될 수 있다. 피더 세포의 부재 하에 유도 만능줄기세포를 생산하는데 사용되는 배지는 특별히 제한되지 않지만, 공지된 배아줄기세포 및/또는 유도 만능줄기세포를 위한 유지 배지, 및 피더-프리 하에 유도 만능줄기세포를 수립하기 위한 배지가 사용될 수 있다. 피더-프리 조건 하에 유도 만능줄기세포를 수립하기 위한 배지의 예는 Essential 8 배지나, TeSR 배지, mTeSR 배지, mTeSR-E8 배지, StemFit 배지 등과 같은 피더-프리 배지를 포함한다. 예를 들어, 피더 세포의 부재 하에 체세포에 센다이바이러스 벡터를 사용하여 Oct3/4, Sox2, Klf4, 및 Myc 의 4 인자를 유전자 도입하여 유도 만능줄기세포가 생산될 수 있다.
본 발명에 사용되는 만능줄기세포는 바람직하게는 ES 세포 또는 유도 만능줄기세포며, 더 바람직하게는 유도 만능줄기세포이다.
다능성줄기세포로서, 조혈줄기세포, 신경줄기세포, 망막줄기세포, 간엽줄기세포 등과 같은 조직줄기세포 (조직내 줄기세포, 조직-특이적 줄기세포 또는 체질줄기세포라고도 지칭됨) 가 언급될 수 있다.
유전자 조작 만능줄기세포는, 예를 들어, 상동 재조합 기술을 사용하여 생산될 수 있다. 조작되는 염색체 상의 유전자의 예는 세포 마커 유전자, 조직 적합성 항원 유전자, 신경 세포의 장애로 인한 질환 관련 유전자 등을 포함한다. 염색체 상의 표적 유전자는 Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1994); Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995); 등에 기재된 방법을 사용하여 조작될 수 있다.
구체적으로는, 예를 들어, 조작되는 타겟 유전자 (예를 들어, 세포 마커 유전자, 조직 적합성 항원 유전자, 질환 관련 유전자 등) 를 포함하는 게놈 DNA 를 단리하고, 단리된 게놈 DNA 를 사용하여 타겟 유전자를 상동 재조합하기 위한 타겟 벡터가 생산된다. 생산된 타겟팅 벡터를 타겟 유전자 사이에서 상동 재조합을 나타낸 줄기세포 및 세포에 도입하고, 타겟팅 벡터를 선택함으로써, 염색체상에 조작된 유전자를 갖는 줄기세포를 생산할 수 있다.
타겟 유전자를 포함하는 게놈 DNA 를 단리하는 방법의 예는 Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley ＆ Sons (1987－1997) 등에 기재된 공지된 방법을 포함한다. 게놈 DNA 라이브러리 스크리닝 시스템 (Genome Systems 사제), Universal GenomeWalker Kits (CLONTECH 사제) 등을 사용하여 타겟 유전자를 포함하는 게놈 DNA 를 단리할 수도 있다. 타겟 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA 대신 사용될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 PCR 방법으로 해당하는 폴리뉴클레오티드를 증폭시킴으로써 수득될 수 있다.
표적 유전자의 상동 재조합에 사용되는 타겟팅 벡터의 생산, 및 상동 재조합체의 효율적인 선별은 Gene Targeting, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1993); Biomanual Series 8, Gene Targeting, Making of Mutant Mouse using ES cell, YODOSHA CO., LTD. (1995); 등에 기재된 방법에 따라 수행될 수 있다. 타겟팅 벡터로서, 대체 유형 또는 삽입 유형 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 선별 방법으로서, 포지티브 선별, 프로모터 선별, 네거티브 선별, 폴리A 선별 등의 방법이 사용될 수 있다.
선별한 세포주로부터 목적하는 상동 재조합체를 선별하는 방법의 예는 게놈 DNA 에 대한 Southern 하이브리다이제이션 방법, PCR 방법 등을 포함한다.
본 발명에서 "포유 동물" 은 설치류, 유제류, 육식류, 영장류 등을 포함한다. 설치류는 마우스, 래트, 햄스터, 기니 피그 등을 포함한다. 유제류는 돼지, 소, 염소, 말, 양 등을 포함한다. 육식류는 개, 고양이 등을 포함한다. 본 발명에서 "영장류" 는 영장류에 속하는 포유 동물을 의미하며, 영장류는 여우원숭이, 로리스, 투파이 등의 원원류, 및 원숭이, 유인원, 인간 등의 진원류를 포함한다.
본 발명에 사용하는 만능줄기세포는 인간 만능줄기세포, 더 바람직하게는 인간 유도 만능줄기세포 (iPS 세포) 또는 인간 배아 줄기세포 (ES 세포) 이다.
본 발명에서 "현탁 배양" 또는 "현탁 배양 방법" 은 세포 또는 세포 응집체가 배양 배지에 현탁된 상태를 유지하면서 배양하는 것 및 배양을 수행하는 방법을 의미한다. 즉, 현탁 배양은 세포 또는 세포 응집체가 배양 용기 등에 접착되지 않는 조건 하에 수행되고, 배양 용기 등에 대한 접착을 허용하는 조건 하에 수행되는 배양 (접착 배양 또는 접착 배양 방법) 은 현탁 배양의 범주에 포함되지 않는다. 이 경우, 세포의 접착은 세포 또는 세포 응집체와 배양 용기의 사이에 강한 세포-기질 접합이 형성됨을 의미한다. 더 상세하게는, 현탁 배양은 세포 또는 세포 응집체와 배양 용기 사이에 강한 세포-기질 접합이 형성되지 않는 조건 하의 배양을 지칭하고, 접착 배양은 세포 또는 세포 응집체와 배양 용기의 사이에 강한 세포-기질 접합이 형성되는 조건 하의 배양을 지칭한다.
현탁 배양 중의 세포 응집체에서, 평면 세포-세포 접착이 형성된다. 현탁 배양 중의 세포 응집체에서, 세포-기질 접합은 배양 용기 등에 의해 거의 형성되지 않으며, 형성되더라도, 그 기여는 작다. 일부의 구현예에서, 내인성 세포-기질 접합이 응집체 내부에 존재하지만, 세포-기질 접합은 배양 용기 등에 의해 거의 형성되지 않으며, 형성되더라도, 그 기여는 작다.
평면 세포-세포 접착 (평면 부착) 은 세포가 평면을 통해 다른 세포에 부착된다는 것을 의미한다. 더 구체적으로는, 평면 세포-세포 접착은, 예를 들어, 세포 표면적의, 1% 이상, 바람직하게는 3% 이상, 더 바람직하게는 5% 이상의 세포가 다른 세포의 표면에 접착하는 것을 의미한다. 세포 표면은, 막을 염색하는 시약 (예를 들어, DiI) 에 의한 염색, 세포 접착 분자 (예를 들어, E-카데린 및 N-카데린) 의 면역 염색에 의해 관찰될 수 있다.
현탁 배양을 수행할 때에 사용하는 배양 용기는 "현탁 배양" 을 가능하게 하는 한 특별히 제한되지 않으며, 당업자는 적절히 결정할 수 있다. 이러한 배양 용기의 예는 플라스크, 조직 배양 플라스크, 배양 디쉬 (디쉬), 페트리 디쉬, 조직 배양 디쉬, 멀티디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로웰 플레이트, 마이크로포어, 멀티플레이트, 멀티웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 삼각 플라스크, 스피너 플라스크, 롤러 보틀을 포함한다. 현탁 배양을 가능하게 하기 위해, 이들 배양 용기는 바람직하게는 세포 비접착성이다. 유용한 세포 비접착성 배양 용기는 표면이 세포와 접착성을 향상시키기 위해 인공적으로 처리한 (예를 들어, 기저막 제제, 라미닌, 엔탁틴, 콜라겐, 젤라틴 등의 세포외 매트릭스에 의한 표면 처리, 또는, 폴리리신, 폴리오르니틴 등의 중합체에 의한 코팅 처리, 또는 양전하 처리 등) 배양 용기를 포함한다. 세포 비접착성 배양 용기로서, 표면이 세포에 대한 접착성을 감소시키기 위해 인공적으로 처리된 (예를 들어, MPC 중합체 등에 의한 초친수성 처리, 단백질 저흡착 처리 등) 배양 용기 등이 사용될 수 있다. 스피너 플라스크, 롤러 보틀 등을 사용하는 롤러 배양이 수행될 수 있다. 배양 용기의 배양면은 평평한 바닥일 수 있거나 오목부 및 볼록부를 가질 수 있다.
접착 배양에 사용되는 배양 용기는 "접착 배양" 이 수행될 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 당업자는 배양 스케일, 배양 조건 및 배양 기간에 따라 적합한 배양 용기를 적절하게 선택할 수 있다. 이러한 배양 용기의 예는 플라스크, 조직 배양 플라스크, 배양 디쉬 (디쉬), 조직 배양 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로-웰 플레이트, 멀티-플레이트, 멀티-웰 플레이트, 챔버 슬라이드, 샬레, 튜브, 트레이, 배양 백, 마이크로캐리어, 비즈, 스택 플레이트, 스피너 플라스크 및 롤러 보틀을 포함한다. 접착 배양을 가능하게 하기 위해, 이들 배양 용기는 바람직하게는 세포 접착성이다. 세포 접착성 배양 용기는 표면이 세포와 접착성을 향상시키기 위해 인공적으로 처리된 배양 용기를 포함하며, 구체적으로는 표면-가공된 배양 용기, 또는, 내부가 코팅제로 코팅된 배양 용기가 언급될 수 있다. 코팅제의 예는 라미닌 [라미닌 α5β1γ1 (이하, 라미닌 511), 라미닌 α1β1γ1 (이하, 라미닌 111) 등 및 라미닌 단편 (라미닌 511E8 등) 을 포함], 엔탁틴, 콜라겐, 젤라틴, 비트로넥틴, Synthemax (Corning Incorporated), Matrigel 등의 세포외 매트릭스, 또는 폴리리신, 폴리오르니틴 등의 중합체를 포함한다. 표면-가공된 배양 용기의 예는 양전하 처리 등으로 표면-가공된 배양 용기를 포함한다.
본 발명에서 세포 배양에 사용되는 배지는 기초 배지로서 동물 세포 배양에 일반적을 사용되는 배지로부터 제조될 수 있다. 기초 배지의 예는 동물 세포 배양에 사용될 수 있는 배지, 예컨대 BME 배지, BGJb 배지, CMRL1066 배지, Glasgow MEM (GMEM) 배지, Improved MEM Zinc Option 배지, IMDM 배지, Medium199 배지, Eagle MEM 배지, αMEM 배지, DMEM 배지, F－12 배지, DMEM/F12 배지, IMDM/F12 배지, Ham 배지, RPMI1640 배지, Fischer's 배지, 및 이들의 혼합 배지 등을 포함한다.
본 발명에서 "무혈청 배지" 는 미조정 또는 미정제 혈청을 포함하지 않는 배지를 의미한다. 본 발명에서, 또한, 정제된 혈액 유래 성분 및 동물 조직 유래 성분 (예를 들어, 성장 인자) 을 포함하는 배지는 그 안에 미조정 또는 미정제 혈청이 포함되지 않는 한 무혈청 배지에 포함된다.
무혈청 배지는 혈청 대체물을 포함할 수 있다. 혈청 대체물의 예는 알부민, 트랜스페린, 지방산, 콜라겐 전구체, 미량 원소, 2－머캡토에탄올 또는 3' 티올글리세롤, 또는 이들의 등가물 등을 적절히 포함하는 것을 포함한다. 이러한 혈청 대체물은, 예를 들어, WO98/30679 에 기재된 방법으로 제조될 수 있다. 또한, 혈청 대체물은 시판 제품일 수 있다. 이러한 시판 혈청 대체물의 예는 Knockout™ Serum Replacement (Life Technologies, 현 ThermoFisher 사제: 이하 때때로 KSR 로 표시됨), 화학적으로 정의된 지질 농축물 (Life Technologies 사제), Glutamax™ (Life Technologies 사제), B27 (Life Technologies 사제), N2 서플리먼트 (Life Technologies 사제) 를 포함한다.
현탁 배양에 사용되는 무혈청 배지는 적절히 지방산 또는 지질, 아미노산(예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2－머캡토에탄올, 피루브산, 완충제, 무기염 등을 포함할 수 있다.
복잡한 제조를 피하기 위해, 시판 KSR (라이프 테크놀로지 (Life Technologies 사제) 적당량 (예를 들어, 약 0.5% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 1% 내지 약 20%) 을 첨가한 무혈청 배지가 이러한 무혈청 배지 (예를 들어, 10% KSR, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물 (CDLC) 및 450 μM 1－모노티오글리세롤을 첨가한 F－12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물의 배지) 로서 사용될 수 있다. KSR 동등품으로서, JP-A-2001－508302 에 개시된 배지가 언급될 수 있다.
본 발명에서 "혈청 배지" 는 미조정 또는 미정제 혈청을 포함하는 배지를 의미한다. 배지는 지방산 또는 지질, 아미노산 (예를 들어, 비필수 아미노산), 비타민, 성장 인자, 사이토카인, 항산화제, 2－머캡토에탄올, 1－모노티오글리세롤, 피루브산, 완충제, 무기염 등을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 의해 제조된 신경 조직 (예를 들어, 망막 조직) 을 유지하는 단계 (성숙 배양으로도 지칭됨) 에서, 혈청 배지가 사용될 수 있다.
본 발명에서, 배양은 바람직하게는 제노-프리 조건으로 수행된다. "제노-프리" 는 배양되는 세포와 상이한 종으로부터 유래한 성분을 제거하는 조건을 의미한다.
본 발명에서, "물질 X 를 포함하는 배지" 및 "물질 X 의 존재 하" 는 외인성 물질 X 가 첨가된 배지 또는 외인성 물질 X 를 포함하는 배지, 또는 외인성 물질 X 의 존재 하를 의미한다. 즉, 배지에 존재하는 세포 또는 조직이 물질 X 를 내인성으로 발현, 분비 또는 생산하는 경우, 내인성 물질 X 는 외인성 물질 X 와 구별되며, 외인성 물질 X 를 포함하지 않는 배지는 내인성 물질 X 를 포함하고 있더라도 "물질 X 를 포함하는 배지" 의 범주에는 해당하지 않는 것으로 이해된다.
예를 들어, "소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하는 배지" 는 외인성 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질이 첨가된 배지 또는 외인성 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하는 배지이다.
본 발명에서, 피더 세포는 줄기세포를 배양할 때 공존하는 줄기세포 이외의 세포를 지칭한다. 만능줄기세포의 미분화 상태 유지 배양에 사용되는 피더 세포의 예는 마우스 섬유아세포 (MEF 등), 인간 섬유아세포, SNL 세포 등을 포함한다. 피더 세포로서, 성장 억제 처리한 피더 세포가 바람직하다. 성장 억제 처리의 예는 성장 억제제 (예를 들어, 마이토마이신 C) 처리, 감마선 조사, UV 조사 등을 포함한다. 만능줄기세포의 미분화 상태 유지 배양에 사용되는 피더 세포는 체액성 인자 (바람직하게는 미분화 상태 유지 인자) 의 분비 또는 세포 접착용의 스캐폴드 (세포외 기질) 의 생산에 의해, 만능줄기세포의 미분화를 유지하는데 기여한다.
본 발명에서, 피더 세포의 부재 (피더-프리) 는 피더 세포의 부재 하에 배양하는 것을 의미한다. 피더 세포 부재는, 예를 들어, 피더 세포를 첨가하지 않은 조건, 또는 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는 조건 (예를 들어, 전세포수에 대한 피더 세포수의 비율 3% 이하) 을 의미한다.
본 발명에서, 세포의 "응집체" 는 배지에 분산된 세포를 집합시켜 형성된 덩어리로서, 세포가 서로 접착되어 있는 덩어리를 지칭한다. 세포 덩어리, 배아체, 구체, 회전 타원체도 세포 응집체에 포함된다. 바람직하게는, 평면 세포-세포 접착이 세포 응집체에 형성된다. 일부의 구현예에서, 세포는 때때로 집합체의 일부 또는 전부에서 세포-세포 접합 및/또는 세포 접착, 예를 들어, 접착 접합을 형성한다. 본 발명에서 "응집체" 는 구체적으로는 상기 언급한 본 발명 [1] 의 제 2 단계에서 생산된 응집체 (현탁 배양 시작 시에 분산된 세포에 의해 형성됨), 및 상기 언급한 본 발명 [1] 의 제 3 단계에서 생산된 응집체 (만능줄기세포로부터 분화 유도된 망막 세포를 포함함) 를 포함하고, "응집체" 는 또한 상기 언급한 본 발명 [1] 의 제 2 단계 시작 시 (즉, 현탁 배양 시작 시) 이미 형성된 응집체를 포함한다. 제 2 단계에서 형성된 세포 응집체는 "배아체 (EB)" 를 포함한다.
본 발명에서, "균일한 응집체" 는 복수의 응집체를 배양할 때 각 응집체의 크기가 일정하다는 것을 의미하고, 응집체의 크기를 최대 직경의 길이로 평가할 때 최대 직경의 길이의 편차가 작음을 의미한다. 더 구체적으로는, 전체 응집체 집단의 응집체의 75% 이상이 응집체 집단의 최대 직경의 평균 ± 100%, 바람직하게는 평균 ± 50%, 더 바람직하게는 평균 ± 20% 이내인 것을 의미한다.
본 발명에서, "균일한 응집체를 형성" 은 세포를 집합시켜 세포 응집체를 형성시키고 응집체를 현탁 배양할 때, "주어진 수의 분산된 세포를 신속히 응집" 시켜 크기가 균일한 세포 응집체를 형성시키는 것을 의미한다.
분산은 세포 또는 조직을 효소 처리, 물리적 처리 등의 분산 처리에 의해 작은 세포 덩어리 (2 세포 이상 및 100 세포 이하, 바람직하게는 50 세포 이하) 또는 단일 세포로 분리시키는 것을 지칭한다. 주어진 수의 분산된 세포는 특정수의 세포 덩어리 또는 단일 세포의 집합체이다.
만능줄기세포의 분산 방법의 예는 기계적 분산 처리, 세포 분산액 처리, 및 세포 보호제 첨가 처리를 포함한다. 이들 처리가 조합으로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 세포 분산액 처리를 실시한 다음, 기계적 분산 처리를 수행한다.
기계적 분산 처리 방법으로서, 피펫팅 처리 또는 스크레이퍼에 의한 스크래핑 (scraping) 조작이 언급될 수 있다.
세포 분산액 처리에 사용되는 세포 분산액으로서, 예를 들어, 트립신, 콜라게나제, 히알루로니다제, 엘라스타제, 프로나제, DNase 또는 파파인 등의 효소, 에틸렌디아민테트라아세트산 등의 킬레이트제 중 어느 하나를 포함하는 용액이 언급될 수 있다. 시판 세포 분산액, 예컨대 TrypLE Select (Life Technologies 사제) 및 TrypLE Express (Life Technologies 사제) 를 사용할 수도 있다.
만능줄기세포를 분산할 때, 세포 보호제로 처리함으로써, 만능줄기세포의 세포 사멸이 억제될 수 있다. 세포 보호제 처리에 사용되는 세포 보호제로서, FGF 시그널 전달 경로 활성 물질, 헤파린, IGF 시그널 전달 경로 활성 물질, 혈청, 또는 혈청 대체물이 언급될 수 있다. 분산에 의해 유도되는 세포 사멸 (특히, 인간 만능줄기세포의 세포 사멸) 을 억제하기 위해서, 분산 시에, Rho-연관 코일드-코일 키나아제 (ROCK) 저해 물질 또는 미오신 저해 물질이 첨가될 수 있다. ROCK 저해 물질로서, Y-27632, 파수딜 (HA1077), H-1152 등이 언급될 수 있다. 미오신 저해 물질로서, 블레비스타틴이 언급될 수 있다. 바람직한 세포 보호제로서, ROCK 저해 물질이 언급될 수 있다.
예를 들어, 만능줄기세포를 분산시키는 방법은 예를 들어 만능줄기세포의 콜로니를 세포 보호제로서 ROCK 저해 물질의 존재 하에 세포 분산액 (TrypLE Select)으로 처리하고, 피펫팅에 의해 이를 추가로 분산시키는 방법을 포함한다.
본 발명의 제조 방법에서, 만능줄기세포를 신속히 집합시켜 만능줄기세포 응집체를 형성시키는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로 만능줄기세포 응집체가 형성되는 경우, 상피형 구조가 형성된 응집체로부터 분화 유도되는 세포에서 우수한 재현성으로 형성될 수 있다. 응집체를 형성하는 실험적인 조작의 예는 작은 웰을 갖는 플레이트 (예를 들어, 웰의 베이스 면적이 평저 환산으로 약 0.1 - 2.0 ㎠ 인 플레이트), 마이크로포어 등을 사용하여 작은 스페이스에 세포를 가두는 방법, 작은 원심 튜브를 사용하여 단시간에 원심분리하여 세포를 응집시키는 방법을 포함한다. 작은 웰을 갖는 플레이트로서, 예를 들어, 24 웰 플레이트 (면적이 평저 환산으로 약 1.88 ㎠), 48 웰 플레이트 (면적이 평저 환산으로 약 1.0 ㎠), 96 웰 플레이트 (면적이 평저 환산으로 약 0.35 ㎠, 내부 직경 약 6~8 mm), 및 384 웰 플레이트가 언급될 수 있다. 바람직한 것은 96 웰 플레이트이다. 작은 웰을 갖는 플레이트의 형상으로서, 웰을 위에서 보았을 때의 저면의 형상은, 예를 들어, 다각형, 장방형, 타원, 진원이며, 바람직하게는 진원이다. 작은 웰을 갖는 플레이트의 형상으로서, 웰을 옆에서 보았을 때의 저면의 형상은, 평저 구조 또는 외주부가 높고 내부 오목부가 낮은 구조일 수 있다. 저면의 형상은 예를 들어 U-바닥, V-바닥, M-바닥이며, 바람직하게는 U-바닥 또는 V-바닥, 더 바람직하게는 V-바닥이다. 작은 웰을 갖는 플레이트로서, 세포 배양 디쉬 (예를 들어, 60 mm - 150 mm 디쉬, 배양 플라스크) 의 저면에 요철, 또는 움푹한 곳이 있는 것을 사용할 수도 있다. 작은 웰을 갖는 플레이트의 저면은 바람직하게는 세포 비접착성 저면, 바람직하게는 앞서 언급한 세포 비접착성 코팅 저면이다.
만능줄기세포 응집체, 또는 만능줄기세포를 포함하는 세포 집단의 응집체의 형성, 및 그 균일성은 응집체 덩어리의 크기 및 그 안의 세포수, 거시적 모폴로지, 조직 염색 분석에 의한 미시적 모폴로지 및 그 균일성 등을 기반으로 결정될 수 있다. 또한, 응집체 중 상피형 구조의 형성, 및 그 균일성은, 응집체의 거시적 모폴로지, 조직 염색 분석에 의한 미시적 모폴로지 및 그 균일성, 분화 및 미분화 마커의 발현 및 그 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그 동기성, 응집체간 분화 효율의 재현성 등을 기반으로 결정될 수 있다.
본 발명에서 "조직" 은 균인한 모폴로지 또는 특성을 갖는 한 가지 종류의 세포, 또는 상이한 모폴로지 또는 특성을 갖는 복수 유형의 세포가 일정한 패턴으로 입체적으로 배열된 구조를 갖는 세포 집단의 구조체를 지칭한다.
본 발명에서, "신경 조직" 은 발생기 또는 성체기의 대뇌, 중뇌, 소뇌, 척수, 망막, 말초 신경, 전뇌, 후뇌, 종뇌, 간뇌 등을 포함하는 신경 세포로 구성된 조직을 지칭한다. 신경 조직은 때때로 층 구조를 갖는 상피 구조 (신경 상피)를 형성하며, 세포 응집체 내의 신경 상피의 양은 광학 현미경을 사용하는 명시야 관찰에 평가될 수 있다.
본 발명에서, "신경 세포" 는 외배엽 유래 조직 중 상피계 세포 이외의 세포를 지칭한다. 즉, 신경 전구 세포, 뉴런 (뉴런 세포), 교세포, 신경 줄기세포, 뉴런 전구 세포, 교세포 전구 세포 등의 세포를 포함한다. 신경 세포는 또한 하기 언급한 망막 조직을 구성하는 세포 (망막 세포), 망막 전구 세포, 망막층 특이적 뉴런, 신경 망막 세포 및 망막 색소 상피 세포를 포함한다. 신경 세포는 네스틴, TuJ1, PSA-NCAM, N-카데린 등을 마커로서 사용하여 확인될 수 있다.
뉴런 (또는 뉴런 세포) 는 신경 회로를 형성하고 시그널 전달에 기여하는 기능 세포이며, TuJ1, Dcx, HuC/D 등의 미성숙 뉴런 마커 및/또는 Map2, NeuN 등의 성숙 뉴런 세포 마커의 발현을 사용하여 확인될 수 있다.
신경 교세포로서, 성상교세포, 희돌기교세포, 뮐러 글리아 등을 언급할 수 있다. 성상교세포 마커로서, GFAP 를 언급할 수 있고; 희돌기교세포 마커로서, O4 를 언급할 수 있고, 뮐러 글리아 마커로서 CRALBP 등을 언급할 수 있다.
신경 줄기세포는 뉴런 및 신경 교세포로의 분화능 (다능성), 및 다능성을 유지하는 증식 능력 (때때로 자기-재생 능력으로도 지칭됨) 을 갖는 세포이다. 신경 줄기세포 마커로서, 네스틴, Sox2, Musashi, Hes 패밀리, CD133 등을 언급할 수 있지만; 그러나, 이들 마커는 일반적으로 전구 세포에 대한 마커이며 신경 줄기세포 특이적 마커로 고려되지 않는다. 신경 줄기세포의 수는 신경구 분석, 클론 분석에 의해 평가될 수 있다.
뉴런 전구 세포는 증식 능력을 갖는 세포로서, 뉴런을 생산하며 신경 교세포를 생산하지 않는 세포이다. 뉴런 전구 세포의 마커로서, Tbr2, Tα1 등을 언급할 수 있다. 대안적으로, 미성숙 뉴런 마커 (TuJ1, Dcx, HuC/D) 양성 및 성장 마커 (Ki67, pH3, MCM) 양성의 세포가 뉴런 전구 세포로서 확인될 수도 있다.
신경 교세포 전구 세포는 증식 능력을 갖는 세포로서, 신경 교세포를 생산하며, 뉴런을 생산하지 않는다.
신경 전구 세포는 신경 줄기세포, 뉴런 전구 세포 및 신경 교세포 전구 세포를 포함하는 전구 세포의 집합체이며, 증식 능력 및 뉴런- 및 교세포- 생산능력을 갖는다. 신경 전구 세포는 네스틴, GLAST, Sox2, Sox1, Musashi, Pax6 등을 마커로서 사용하여 확인될 수 있다. 대안적으로, 신경 세포 마커 양성 및 성장 마커 (Ki67, pH3, MCM) 양성의 세포가 신경 전구 세포로서 확인될 수도 있다.
본 발명에서, "망막 조직" 은 생체 망막에서 각 망막층을 구성하는 광수용체 세포, 광수용체 전구 세포, 간상 광수용체 세포, 원추 광수용체 세포, 개재뉴런, 수평 세포, 양극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포 (신경절 세포), 망막 색소 상피 세포 (RPE), 모양체 주연부 세포, 이들의 전구 세포, 및 망막 전구 세포 등의 세포의, 한 종류 또는 적어도 둘 이상 종류가 층으로 입체적으로 배열된 조직을 의미한다. 각각의 세포로 구성되는 망막층은 공지된 방법, 예를 들어 세포 마커의 발현 유무 또는 그 수준 등에 의해 확인될 수 있다.
본 발명에서, "망막층" 은 망막을 구성하는 각 층을 의미한다. 이들의 구체적인 예는 망막 색소 상피층, 광수용체층, 외부 경계막, 외핵층, 외부 망상층, 내핵층, 내부 망상층, 신경절 세포층, 신경 섬유층 및 내부 경계막을 포함한다.
본 발명에서, "망막 전구 세포" 는 광수용체 세포, 수평 세포, 양극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포, 망막 색소 상피 세포 등을 포함하는 임의의 성숙 망막 세포로 분화할 수 있는 전구 세포를 지칭한다.
본 발명에서, "신경 망막 전구 세포" 는 광수용체 세포, 수평 세포, 양극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포 등을 포함하는 성숙 망막 세포 중 어느 하나 또는 복수로 분화할 수 있는 전구 세포를 지칭한다. 일반적으로는, 신경 망막 전구 세포는 망막 색소 상피 세포로 분화하지 않는다.
광수용체 전구 세포, 수평 세포 전구 세포, 양극 세포 전구 세포, 아마크린 세포 전구 세포, 망막절 세포 전구 세포 및 망막 색소 상피 전구 세포는 각각 광수용체 세포, 수평 세포, 양극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포 및 망막 색소 상피 세포로 분화하는 전구 세포를 지칭한다.
본 발명에서, "망막층 특이적 뉴런" 은 망막층을 구성하는 세포이며, 망막층에 특이적인 신경 세포 (뉴런) 다. 망막층 특이적 뉴런의 예는 양극 세포, 망막 신경절 세포, 아마크린 세포, 수평 세포, 광수용체 세포, 망막 색소 상피 세포, 간상 세포 및 원추 세포를 포함한다.
본 발명에서 "망막 세포" 는 앞서 언급한 망막 전구 세포 및 망막층 특이적 뉴런을 포함한다.
망막 세포 마커의 예는 망막 전구 세포에서 발현되는 Rx (Rax 로도 지칭), PAX6 및 Chx10, 시상하부 뉴런의 전구 세포에서 발현되지만 망막 전구 세포에서는 발현되지 않는 Nkx2.1, 시상하부 신경 상피에서 발현되지만 망막에서는 발현되지 않는 Sox1, 광수용체 세포의 전구 세포에서 발현되는 Crx, Blimp1 등을 포함한다. 망막층 특이적 뉴런의 마커의 예는, 양극 세포에서 발현되는 Chx10, PKCα 및 L7, 망막 신경절 세포에서 발현되는 TuJ1 및 Brn3, 아마크린 세포에서 발현되는 칼레티닌, 수평 세포에서 발현되는 칼빈딘, 성숙 광수용체 세포에서 발현되는 로돕신 및 레코베린, 간상 세포에서 발현되는 Nrl 및 로돕신, 원추 세포에서 발현되는 Rxr-감마 및 S-옵신, 망막 색소 상피 세포에서 발현되는 RPE65 및 Mitf, 모양체 주연부에서 발현되는 Rdh10 및 SSEA1 등을 포함한다.
2. 망막 세포 또는 망막 조직의 제조 방법
본 발명의 제조 방법은, 하기 단계 (1) - (3) 을 포함하는, 망막 세포 또는 망막 조직의 제조 방법이다:
(1) 인간 만능줄기세포를 피더 세포의 부재 하에 미분화 상태 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 제 1 단계,
(2) 제 1 단계에서 수득한 만능줄기세포를, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질의 존재 하에서 현탁 배양하여, 세포 응집체를 형성시키는 제 2 단계, 및
(3) 제 2 단계에서 수득한 응집체를, 분화 유도 인자의 존재 또는 부재 하에 현탁 배양하여, 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는 응집체를 수득하는 제 3 단계.
단계 (1) 에서, 인간 만능줄기세포를 피더 세포의 부재 하에 및 미분화 상태 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양한다.
단계 (1) 의 인간 만능줄기세포로서, 인간 유도 만능줄기세포 또는 인간 배아줄기세포 (ES 세포) 가 언급될 수 있다.
유도 만능줄기세포의 제조 방법은 특별히 제한되지 않으며, 앞서 언급한 바와 같은 당업자에게 익히 공지된 방법으로 제조될 수 있다. 피더-프리 조건에서 유도 만능줄기세포 제조 단계 (즉, 체세포를 재프로그래밍해 만능줄기세포를 수립하는 단계) 를 수행하는 것이 또한 바람직하다.
배아줄기세포 (ES 세포) 의 제조 방법은 특별히 제한되지 않으며, 앞서 언급한 당업자에게 익히 공지된 방법으로 제조될 수 있고, 피더-프리 조건에서 배아줄기세포 (ES 세포) 제조 단계를 수행하는 것이 또한 바람직하다.
단계 (1) 에서 사용되는 만능줄기세포를 수득하기 위한 유지 배양 또는 증식 배양은 앞서 언급한 당업자에게 익히 공지된 방법으로 수행될 수 있다. 앞서 언급한 만능줄기세포의 유지 배양 또는 증식 배양은 접착 배양 또는 현탁 배양으로 수행될 수 있고, 바람직하게는 접착 배양으로 수행된다. 앞서 언급한 만능줄기세포의 유지 배양 및 증식 배양 단계는 피더 존재 하에 또는 피더-프리 조건 하에 수행될 수 있지만, 바람직하게는 피더-프리 하에 수행된다.
단계 (1) 에서 피더 세포의 부재 (피더-프리) 는 피더 세포를 실질적으로 포함하지 않는 (예를 들어, 전세포수에 대한 피더 세포수의 비율이 3% 이하) 조건을 의미한다. 바람직하게는, 단계 (1) 은 피더 세포를 포함하지 않는 조건 하에 수행된다.
단계 (1) 에서 사용되는 배지는 피더-프리 조건 하에, 만능줄기세포의 미분화 상태를 유지하는 배양을 가능하게 하는 배지 (피더-프리 배지) 이면, 특별히 제한되지 않는다. 바람직하게는, 미분화 상태 유지 배양을 가능하게 하기 위해, 미분화 상태 유지 인자를 포함한다. 예를 들어, 미분화 상태 유지 인자를 포함하고, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 및 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하지 않는 배지이다.
미분화 상태 유지 인자는 만능줄기세포의 분화를 억제하는 작용을 갖는 물질이면 특별히 제한되지 않는다. 당업자에 의해 널리 사용되는 미분화 상태 유지 인자의 예는 프라임드 만능줄기세포 (Primed pluripotent stem cells) (예를 들어, 인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 의 경우, FGF 시그널 전달 경로 활성 물질, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 활성 물질, 인슐린 등을 포함한다. FGF 시그널 전달 경로 활성 물질로서, 섬유아세포 증식 인자 (예를 들어, bFGF, FGF4, FGF8) 가 구체적으로 언급될 수 있다. 또, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 활성 물질로서, TGFβ 시그널 전달 경로 활성 물질, Nodal/액티빈 시그널 전달 경로 활성 물질이 언급될 수 있다. TGFβ 시그널 전달 경로 활성 물질로서, 예를 들어 TGFβ1, TGFβ2 가 언급될 수 있다. Nodal/액티빈 시그널 전달 경로 활성 물질로서, Nodal, 액티빈 A, 액티빈 B 가 언급될 수 있다. 인간 만능줄기세포 (인간 ES 세포, 인간 iPS 세포) 를 배양하는 경우, 단계 (1) 에서의 배지는 바람직하게는 미분화 상태 유지 인자로서 bFGF 를 포함한다.
본 발명에서 사용되는 미분화 상태 유지 인자는 일반적으로 포유 동물의 미분화 상태 유지 인자이다. 포유 동물은 예를 들어 앞서 언급한 것들이다. 미분화 상태 유지 인자가 포유 동물 종 간에 교차 반응성을 가질 수 있기 때문에, 배양하는 만능줄기세포의 미분화 상태가 유지될 수 있는 한 임의의 포유 동물의 미분화 상태 유지 인자가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 배양하는 세포와 동일한 종의 포유 동물의 미분화 상태 유지 인자가 사용된다. 예를 들어, 인간 만능줄기세포의 배양에, 인간 미분화 상태 유지 인자 (예를 들어, bFGF, FGF4, FGF8, EGF, Nodal, 액티빈 A, 액티빈 B, TGFβ 1, TGFβ 2 등) 가 사용된다. 여기서, "인간 단백질 X" 는 단백질 X 가 인간 인비보에서 자연적으로 발현된 단백질 X의 아미노산 서열을 가짐을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 미분화 상태 유지 인자는 바람직하게는 단리된다. "단리됨" 은 목적으로 하는 성분 또는 세포 이외의 인자를 제거하는 조작이 수행되었으며, 성분 또는 세포가 더 이상 자연 발생 상태로 존재하지 않음을 의미한다. 따라서, "단리된 단백질 X" 는 배양되는 세포 또는 조직으로부터 생산되고, 세포 조직 또는 배지에 포함된 내인성 단백질 X 를 포함하지 않는다. "단리된 단백질 X" 의 순도 (총 단백질 중량에 대한 단백질 X 의 중량의 백분율) 는 일반적으로 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 99% 이상, 더욱 바람직하게는 100% 이다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명은 단리된 미분화 상태 유지 인자를 제공하는 단계를 포함한다. 한 구현예에서, 단계 (1) 에 사용되는 배지에 단리된 미분화 상태 유지 인자를 외인성으로 첨가하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 미분화 상태 유지 인자는 단계 (1) 에서 사용되는 배지에 미리 첨가될 수 있다.
단계 (1) 에서 사용되는 배지 중 미분화 상태 유지 인자의 농도는 배양되는 만능줄기세포의 미분화 상태를 유지할 수 있는 농도이며, 당업자에 의해 적절히 결정될 수 있다. 예를 들어, 피더 세포의 부재 하에 미분화 상태 유지 인자로서 bFGF 가 사용되는 경우, 그 농도는 일반적으로 약 4 ng - 500 ng/mL, 바람직하게는 10 ng - 200 ng/mL, 더 바람직하게는 약 30 ng - 150 ng/mL 이다.
피더-프리 배지로서, 많은 합성 배지가 개발되었고, 시판되며, 예를 들어 Essential 8 배지가 언급될 수 있다. Essential 8 배지는 첨가제로서 L-아스코르브산-2-포스페이트 마그네슘 (64 mg/l), 소듐 셀레늄 (14 μg/l), 인슐린 (19.4 mg/l), NaHCO3 (543 mg/l), 트랜스페린 (10.7 mg/l), bFGF (100 ng/mL), 및 TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 활성 물질 (TGFβ1 (2 ng/mL) 또는 Nodal (100 ng/mL)) 를 포함하는 DMEM/F12 배지이다 (Nature Methods, 8, 424-429 (2011)). 시판 피더-프리 배지의 예는 Essential 8 (Life Technologies 사제), S-medium (DS Pharma Biomedical 사제), StemPro (Life Technologies 사제), hESF9 (Proc Natl Acad Sci USA. 2008 Sep 9; 105(36):13409-14), mTeSR1 (STEMCELL Technologies 사제), mTeSR2 (STEMCELL Technologies 사제) 및 TeSR-E8 (STEMCELL Technologies 사제) 을 포함한다. 그 밖에, 피더-프리 배지로서, StemFit (Ajinomoto Co., Inc. 사제) 이 언급될 수 있다. 앞서 언급한 단계 (1) 에서 이들을 사용하여, 간편하게 본 발명을 수행할 수 있다.
접착 배양에 사용되는 배양 용기는 "접착 배양" 이 수행될 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않지만, 세포 접착성 배양 용기가 바람직하다. 세포 접착성 배양 용기는 배양 용기의 표면이 세포 접착성을 향상시키기 위해 인공적으로 처리된 배양 용기, 구체적으로는, 앞서 언급한 표면-처리된 배양 용기, 내부가 코팅제로 코팅된 배양 용기를 포함한다. 코팅제의 예는 라미닌 [라미닌 α5β1γ1 (이하, 라미닌 511), 라미닌 α1β1γ1 (이하, 라미닌 111) 등 및 라미닌 단편 (라미닌 511E8 등) 포함], 엔탁틴, 콜라겐, 젤라틴, 비트로넥틴, Synthemax (Corning Incorporated), Matrigel 등과 같은 세포외 매트릭스, 또는 폴리리신, 폴리오르니틴 등과 같은 중합체 등을 포함한다. 표면이 양전하 처리 등으로 처리된 배양 용기를 사용할 수도 있다. 라미닌이 바람직하고, 라미닌 511E-8 이 더 바람직하다. 라미닌 511E-8 은 시판 제품일 수 있다 (예를 들어, iMatrix-511, Nippi).
단계 (1) 에서 사용되는 배지는 혈청-함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있지만, 화학적으로 정의되지 않은 성분에 의한 오염을 방지 하기 위해, 바람직하게는 무혈정 배지이다.
화학적으로 정의되지 않은 성분에 의한 오염을 방지하기 위해, 단계 (1) 에서 사용되는 배지는 그 성분이 화학적으로 정의된 배지일 수 있다.
단계 (1) 에서, 만능줄기세포는 현탁 배양 및 접착 배양, 바람직하게는 접착 배양의 임의의 조건 하에 배양될 수 있다.
단계 (1) 에서 피더-프리 조건 하의 만능줄기세포의 배양에서, 앞서 언급한 피더-프리 배지가 배지로서 사용될 수 있다.
단계 (1) 에서 피더-프리 조건 하의 만능줄기세포 배양에 있어, 피더 세포에 대신 만능줄기세포에 스캐폴드를 제공하기 위해 적절한 매트릭스를 스캐폴드로서 사용할 수 있다. 스캐폴드로서 표면이 매트릭스로 코팅된 세포 용기에서 만능줄기세포를 접착 배양한다.
스캐폴드로서 이용가능한 매트릭스로서, 라미닌 (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)), 라미닌 단편 (Nat Commun 3, 1236 (2012)), 기저막 제제 (Nat Biotechnol 19, 971-974 (2001)), 젤라틴, 콜라겐, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 엔탁틴, 비트로넥틴 등이 언급될 수 있다.
"라미닌" 은 α, β, γ 사슬로 이루어진 헤테로 3량체 분자이며, 상이한 서브유닛 사슬 조성을 갖는 동형을 포함하는 세포외 매트릭스 단백질이다. 구체적으로는, 라미닌은 5종의 α 사슬, 4종의 β 사슬 및 3종의 γ 사슬의 헤테로 3량체의 조합으로 약 15 종의 동형을 갖는다. α 사슬 (α1 - α5), β 사슬 (β1 - β4) 및 γ 사슬 (γ1 - γ4) 의 각각의 숫자를 조합하여 라미닌의 명칭을 결정한다. 예를 들어, α5 사슬, β1 사슬, γ1 사슬의 조합을 갖는 라미닌은 라미닌 511 로 명명된다. 본 발명에서, 라미닌 511 이 바람직하게는 사용된다 (Nat Biotechnol 28, 611-615 (2010)).
본 발명에서 사용되는 라미닌은 일반적으로 포유 동물의 라미닌이다. 포유 동물로서, 앞서 언급한 것들을 열거할 수 있다. 제노-프리 조건을 달성하기 위해, 배양되는 세포와 동일한 종의 포유 동물의 라미닌이 바람직하게는 사용된다. 예를 들어, 인간 라미닌 (바람직하게는, 인간 라미닌 511) 이 인간 만능줄기세포의 배양에 사용된다.
본 발명에서 사용되는 라미닌 단편은 만능줄기세포에 대한 접착성을 가지며, 피더-프리 조건에서 만능줄기세포의 유지 배양을 가능하게 하는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는, E8 단편이다. 라미닌 E8 단편은 라미닌 511 을 엘라스타제로 소화시켜 수득한 단편 중에서 강한 세포 접착 활성을 갖는 단편으로서 확인되었다 (EMBO J., 3:1463-1468, 1984, J. Cell Biol., 105:589-598, 1987). 본 발명에서, 라미닌 511 의 E8 단편이 바람직하게는 사용된다 (Nat Commun 3, 1236 (2012), Scientific Reports 4, 3549 (2014)). 본 발명에서 사용되는 라미닌 E8 단편은 라미닌의 엘라스타제 소화 산물일 필요는 없으며, 재조합체일 수 있다. 미확인 성분에 의한 오염을 방지하기 위해, 본 발명에서 재조합 라미닌 단편이 바람직하게는 사용된다. 라미닌 511 의 E8 단편은 시판되며, 예를 들어 Nippi, Inc. 등으로부터 구입 가능하다.
본 발명에서 사용되는 라미닌 또는 라미닌 단편은 바람직하게는 단리된다.
본 발명에서 "기저막 제제" 는 기저막을 형성할 수 있는 목적하는 세포가 그 위에 플레이팅되고 배양되는 경우, 상피 세포의 그것과 유사한 세포 모폴로지, 분화, 성장, 운동, 기능 발현 등을 제어하는 기능을 갖는 기저막 구성 성분을 포함하는 것을 지칭한다. 예를 들어, 본 발명에 의해 제조된 신경 세포 및 신경 조직은 분산될 수 있고, 추가 접착 배양이 수행될 때 기저막 제제의 존재 하에 배양될 수 있다. 여기서, "기저막 구성 성분" 은 동물의 조직에서 상피 세포층과 간질세포층 사이에 존재하는 얇은 막 형태의 세포외 매트릭스 분자를 지칭한다. 기저막 제제는, 예를 들어, 기저막을 통해 지지체 상에 접착하고 있는 기저막을 형성할 수 있는 세포를, 세포의 지질을 용해시킬 수 있는 용액, 알칼리 용액 등에 의해 지지체로부터 제거하여 제조될 수 있다. 기저막 제제의 예는 기저막 제제로서 시판되는 제품 (예를 들어, Matrigel™ (Corning Incorporated 사제: 이하 때때로 Matrigel 로 지칭)), Geltrex™ (Life Technologies 사제), 및 기저막 성분으로 공지된 세포외 매트릭스 분자 (예를 들어, 라미닌, IV형 콜라겐, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸, 엔탁틴 등) 를 포함한다.
Matrigel™ 은 Engelbreth Holm Swarn (EHS) 마우스 육종에서 추출한 기저막 제제이다. Matrigel™ 의 주성분은 IV형 콜라겐, 라미닌, 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 및 엔탁틴이다. 이외에, TGF-β, FGF, 조직 플라스미노겐 활성제 및 EHS 종양에서 자연적으로 생산되는 성장 인자가 포함된다. Matrigel™ 의 "성장 인자 감소 제품" 은 일반적인 Matrigel™ 보다 낮은 성장 인자 농도를 가지며, 이들의 표준 농도는 EGF 의 경우 ＜0.5 ng/ml, NGF 의 경우 ＜0.2 ng/ml, PDGF 의 경우 ＜5 pg/ml, IGF1 의 경우 5 ng/ml, TGFβ 의 경우 1.7 ng/ml 이다.
미확인 성분의 오염을 방지하기 위해, 바람직하게는 단리된 라미닌 또는 라미닌 단편이 본 발명에서 사용된다.
바람직하게는, 단계 (1) 에서 피더-프리 조건에서의 만능줄기세포 배양에서, 인간 만능줄기세포는 단리된 라미닌 511 또는 라미닌 511 의 E8 단편 (더 바람직하게는, 라미닌 511 의 E8 단편) 으로 코팅된 표면을 갖는 세포 용기에서 접착 상태로 배양된다.
단계 (1) 에서 만능줄기세포의 배양 시간은 단계 (2) 에서 형성되는 응집체의 품질을 향상시키는 효과가 달성될 수 있는 한 특별히 제한되지 않으며, 일반적으로 0.5 - 144 시간, 바람직하게는 2 - 96 시간, 더 바람직하게는 6 - 48 시간, 더욱 바람직하게는 12 - 48 시간, 보다 더욱 바람직하게는 18 - 28 시간 (예를 들어, 24 시간) 이다. 즉, 단계 (2) 시작 0.5 - 144 시간 (바람직하게는, 18 - 28 시간) 전에 제 1 단계가 시작되며, 단계 (1) 의 종료 시 단계 (2) 가 연속적으로 수행된다.
단계 (1) 에서, 배지는 적절하게 교환될 수 있으며, 한 구현예는 구체적으로 1 - 2 일 마다 배지 교환을 포함하는 방법을 포함한다. 여기에서, 예를 들어, 배지는 하기 언급한 세포 보호제 또는 세포 사멸 억제제, 예컨대 ROCK 저해제 등을 포함하지 않는 배지로 교환될 수 된다.
단계 (1) 에서의 배양 온도, CO2 농도와 같은 배양 조건은 적절하게 결정될 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는, 예를 들어, 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
한 바람직한 구현예에서, 인간 만능줄기세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 는 피더 세포의 부재 하에 bFGF 를 포함하는 무혈청 배지에서 접착된 상태로 배양된다. 접착 배양은 바람직하게는 라미닌 511, 라미닌 511 의 E8 단편 또는 비트로넥틴으로 코팅된 표면을 갖는 세포 용기에서 수행된다. 접착 배양은 바람직하게는 피더-프리 배지로서 Essential 8, TeSR 배지, mTeSR 배지, mTeSR-E8 배지, 또는 StemFit 배지, 더 바람직하게는 Essential 8 또는 StemFit 배지를 사용하여 수행된다.
한 바람직한 구현예에서, 인간 만능줄기세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 는 피더 세포의 부재 하에 bFGF를 포함하는 무혈청 배지에서 현탁 배양된다. 현탁 배양에서, 인간 만능줄기세포는 인간 만능줄기세포 응집체를 형성할 수 있다.
단계 (1) 에서 수득한 만능줄기세포를 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 만능줄기세포 응집체를 형성하는 단계 (2) 를 설명한다.
단계 (2) 에서 사용되는 배지는 앞서 언급한 정의 부분에 기재한 바와 같은 한 특별히 제한되지 않는다. 단계 (2) 에서 사용되는 배지는 혈청-함유 배지 또는 무혈청 배지일 수 있다. 화학적으로 미정의된 성분의 오염을 방지하기 위해, 바람직하게는 무혈청 배지가 본 발명에서 사용된다. 예를 들어, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지가 사용될 수 있다. 복잡한 제조를 피하기 위해, 예를 들어, KSR 등의 시판 혈청 대체물 적당량을 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, 10% KSR, 450 μM 1－모노티오글리세롤 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 IMDM 및 F－12 의 1:1 혼합물의 배지, 또는 5% - 20% KSR, NEAA, 피루브산, 2-머캡토에탄올을 첨가한 GMEM 배지) 가 바람직하게는 사용된다. 무혈청 배지에 첨가되는 KSR 의 양은 인간 ES 세포의 경우 일반적으로 약 1% 내지 약 30%, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다.
응집체의 형성을 위해, 먼저, 단계 (1) 에서 수득한 만능줄기세포의 분산 조작이 수행된다. 분산 조작으로 수득한 "분산된 세포" 는 예를 들어 70% 이상의 세포가 단일 세포이고, 30% 이하의 세포가 2 - 50 세포의 덩어리인 상태를 지칭한다. 바람직하게는, 분산된 세포로서, 80% 이상이 단일 세포이고, 20% 이하의 세포가 2 - 50 세포의 덩어리인 상태가 언급될 수 있다. 분산된 세포는 세포의 상호 접착 (예를 들어, 평변 부착) 이 거의 없는 상태를 지칭한다. 본 구현예의 일부에서, 분산된 세포는 세포-세포 접합 (예를 들어, 접착 결합) 이 거의 없는 상태를 지칭한다.
단계 (1) 에서 수득한 만능줄기세포의 분산 조작은 앞서 언급한 기계적 분산 처리, 세포 분산액 처리, 및 세포 보호제 첨가 처리를 포함할 수 있다. 이들 처리는 조합으로 수행될 수 있다. 바람직하게는, 세포 분산액 처리를 세포 보호제 첨가 처리와 동시에 수행한 다음, 기계적 분산 처리를 수행한다.
세포 보호제 첨가 처리에 사용되는 세포 보호제로서, FGF 시그널 전달 경로 활성 물질, 헤파린, IGF 시그널 전달 경로 활성 물질, 혈청, 및 혈청 대체물이 언급될 수 있다. 또한, 분산에 의해 유도되는 만능줄기세포의 세포 사멸 (특히, 인간 만능줄기세포의 세포 사멸) 을 억제하고, 세포를 보호하기 위해서, Rho-연관 코일드 코일 (coiled-coil) 키나아제 (ROCK) 저해제 또는 미오신 저해제가 첨가될 수 있다. 분산에 의해 유도되는 만능줄기세포 (특히, 인간 만능줄기세포) 의 세포 사멸을 억제하기 위해, Rho-관련 코일드-코일 키나아제 (ROCK) 저해 물질 또는 미오신 저해제가 제 2 단계 배양 초기부터 첨가될 수 있다. ROCK 저해 물질로서, Y-27632, 파수딜 (HA1077), H-1152 등이 언급될 수 있다. 미오신 저해제로서, 블레비스타틴이 언급될 수 있다.
세포 분산액 처리에 사용되는 세포 분산액으로서, 트립신, 콜라게나제, 히알루로니다제, 엘라스타제, 프로나제, DN아제 또는 파파인 등과 같은 효소, 에틸렌디아민테트라아세트산 등과 같은 킬레이트제 중 어느 하나를 포함하는 용액이 언급될 수 있다. 시판 세포 분산액, 예컨대 TrypLE Select (Life Technologies 사제) 및 TrypLE Express (Life Technologies 사제) 가 또한 사용될 수 있다.
기계적 분산 처리 방법으로서, 피펫팅 처리 또는 스크레이퍼에 의한 스크래핑 (scraping) 이 언급될 수 있다.
분산된 세포는 앞서 언급한 배지에 현탁된다.
이어서, 분산된 만능줄기세포의 현탁액을 앞서 언급한 배양 용기에 시딩하고, 분산된 만능줄기세포를 배양 용기에 비접착성인 조건 하에서 배양함으로써, 복수의 세포를 집합시켜 응집체를 형성한다.
이 경우, 분산된 만능줄기세포를, 10 cm 디쉬와 같은, 비교적 큰 배양 용기에 시딩함으로써, 하나의 배양 용기에 복수의 세포 응집체를 동시에 형성시킬 수 있다. 그러나, 이 경우 응집체의 크기가 달라진다. 따라서, 예를 들어, 96-웰 마이크로 플레이트와 같은 멀티웰 플레이트 (U-바닥, V-바닥) 의 각 웰에 소정량의 분산된 만능줄기세포를 위치시키고, 정치 배양을 수행함으로써, 세포를 급속하게 응고시켜, 각 웰에 하나의 응집체를 형성한다. 응집체를 복수의 웰로부터 회수함으로써, 균일한 응집체의 집단이 수득될 수 있다.
단계 (2) 에서 만능줄기세포의 농도는 세포 응집체를 보다 균일하게 및 효율적으로 형성하도록 적절히 설정될 수 있다. 예를 들어, 인간 세포 (예를 들어, 단계 (1) 에서 수득한 인간 iPS 세포) 가 96-웰 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 현탁 배양되는 경우, 웰 당, 약 1 x 103 내지 약 1 x 105 세포, 바람직하게는 약 3 x 103 내지 약 5 x 104 세포, 더 바람직하게는 약 4 x 103 내지 약 2 x 104 세포, 더욱 바람직하게는 약 4 x 103 내지 약 1.6 x 104 세포, 보다 더욱 바람직하게는 약 8 x 103 내지 약 1.2 x 104 세포를 달성하기 위해 제조된 액체를 웰에 첨가하고, 플레이트를 정치시켜 응집체를 형성시킨다.
단계 (2) 에서의 배양 온도, CO2 농도 등과 같은 배양 조건은 적절히 결정될 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는, 예를 들어, 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
단계 (2) 에서, 배지 교환 조작이 수행되는 경우, 기존 배지를 버리지 않고 새로운 배지를 첨가하는 조작 (배지 첨가 조작), 기존 배지의 약 절반량 (약 30 - 90%, 예를 들어, 기존 배지의 부피의 40 - 60%) 을 버리고 새로운 배지의 약 절반량 (30~90%, 예를 들어, 기존 배지의 부피의 약 40~60%) 을 첨가하는 조작 (절반-배지 교환 조작), 및 기존 배지의 약 전량 (기존 배지의 양의 90% 이상) 을 버리고 새로운 배지의 약 전량 (기존 배지의 양의 90% 이상) 을 첨가하는 조작 (전량-배지 교환 조작) 이 언급될 수 있다.
어떤 시점에서 특정 성분 (예를 들어, 분화 유도 인자) 이 첨가되는 경우, 예를 들어, 최종 농도를 계산하고, 기존 배지의 약 절반량을 버리고, 특정 성분을 최종 농도보다 높은 농도 (구체적으로는 최종 농도의 1.5 - 3.0 배, 예를 들어, 최종 농도의 약 2배) 로 포함하는 새로운 배지의 약 절반량을 첨가하는 조작 (절반-배지 교환 조작) 이 수행될 수 있다.
어떤 시점에서 기존 배지에 포함되는 특정 성분의 농도가 유지되는 경우, 예를 들어, 기존 배지의 약 절반량을 버리고, 기존 배지에서와 동일한 농도로 특정 성분을 포함하는 새로운 배지의 약 절반량을 첨가하는 조작이 수행될 수 있다.
기존 배지에 포함된 성분의 농도가 특정 시점에서의 희석에 의해 감소되는 경우, 예를 들어, 배지 교환 조작이 하루에 여러 번, 바람직하게는 1 시간 이내에 복수 회 (예를 들어, 2 - 3 회) 수행될 수 있다. 또한, 기존 배지에 포함된 성분의 농도가 특정 시점에서의 희석에 의해 감소되는 경우, 세포 또는 응집체는 또 다른 배양 용기로 옮겨질 수 있다.
배지 교환 조작에 사용하는 도구는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 피펫터, 마이크로피펫 (PIPETMAN), 멀티채널 마이크로피펫 (MULTICHANNEL PIPETMAN), 연속 디스펜서 등이 언급될 수 있다. 예를 들어, 96-웰 플레이트가 배양 용기로서 사용되는 경우, 멀티채널 마이크로피펫 (MULTICHANNEL PIPETMAN) 이 사용될 수 있다.
세포 응집체의 형성에 필요한 현탁 배양 시간은 사용하는 만능줄기세포 에 따라 적절하게 결정될 수 있으며, 세포를 균일하게 응집시킬 수 있다. 균일한 세포 응집체를 형성하기 위해, 가능한 짧게 하는 것이 바람직하다. 분산된 세포가 세포 응집체를 형성하는 단계는 세포가 집합하는 단계, 및 집합한 세포로부터 세포 응집체를 형성하는 단계로 나눌 수 있다. 인간 만능줄기세포 (예, 인간 iPS 세포) 의 경우, 분산된 세포를 시딩 (즉, 현탁 배양 시작 시) 하여 세포를 집합시키는 단계에서, 예를 들어, 집합된 세포는 바람직하게는 약 24 시간 이내, 더 바람직하게는 약 12 시간 이내에 형성된다. 인간 만능줄기세포 (예를 들어, iPS 세포) 의 경우, 분산된 세포를 시딩하는 시점 (즉, 현탁 배양의 시작 시) 으로부터 세포 응집체가 형성될 때까지의 시간은, 예를 들어, 바람직하게는 약 72 시간 이내, 더 바람직하게는 약 48 시간 이내이다. 세포 응집체 형성 시간은 세포 응집 도구, 원심분리 조건 등을 조정함으로써 적절하게 조정될 수 있다.
세포 응집체의 형성 및 그 균일성은 응집체의 크기 및 세포수, 거시적 모폴로지, 조직 염색 분석에 의한 미시적 모폴로지 및 그 균일성, 분화- 및 미분화-마커의 발현 및 그 균일성, 분화 마커의 발현 제어 및 그 동시성, 응집체간의 분화 효율의 재현성 등을 기반으로 결정될 수 있다.
응집체 형성 후, 응집체는 그대로 연속적으로 배양될 수 있다. 단계 (2) 에서 현탁 배양 시간은 일반적으로 약 12 시간 - 6 일, 바람직하게는 약 12 시간 - 48 시간이다.
단계 (2) 에서 사용되는 배지는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함한다. 단계 (1) 에서, 만능줄기세포는 피더-프리 조건 하에 유지 배양되고; 제 2 단계에서, 제 1 단계에서 수득한 만능줄기세포는 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하는 배지 (바람직하게는, 무혈청 배지) 에서 현탁 배양되어 응집체의 품질을 향상시키고, 둥글고, 표면이 매끄러워, 형태가 무너지지 않은, 내부가 조밀한, 미분화 특성을 유지한 세포 응집체를 고효율로 형성할 수 있다.
소닉 헤지호그 (이하, Shh 로도 표기함) 시그널 전달 경로 활성 물질은 Shh 에 의해 매개되는 시그널 전달을 향상시킬 수 있는 물질이다. Shh 시그널 전달 경로 활성 물질의 예는 헤지호그 패밀리 (예를 들어, Shh 및 Ihh) 에 속하는 단백질, Shh 수용체, Shh 수용체 작용제, 퍼모파민 (PMA; 9-시클로헥실-N-[4-(4-모르폴리닐)페닐]-2-(1-나프탈레닐옥시)-9H-푸린-6-아민), SAG (Smoothened Agonist; N-메틸-N'-(3-피리디닐벤질)-N'-(3-클로로벤조[b]티오펜-2-카르보닐)-1,4-디아미노시클로헥산) 등을 포함한다. Shh 시그널 전달 경로 활성 물질로서, 바람직한 것은, 예를 들어, SAG, 퍼모파민 (PMA) 및 Shh 단백질 (Genbank 수탁 번호: NM_000193 및 NP_000184) 이고, 더 바람직한 것은, 예를 들어, SAG 이다. 배지 중 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질의 농도는 앞서 언급한 효과를 달성할 수 있는 범위 내에서 적절히 결정될 수 있다. SAG 는 일반적으로 1 - 2000 nM, 바람직하게는 10 nM - 1000 nM, 바람직하게는 10 nM - 700 nM, 30 nM - 700 nM, 50 nM - 700 nM, 더 바람직하게는 100 nM - 600 nM, 더욱 바람직하게는 100 nM - 500 nM 의 농도로 사용된다. SAG 이외의 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 사용하는 경우, 앞서 언급한 농도의 SAG 와 동등한 Shh 시그널 전달 촉진 활성을 부여하는 농도로 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들어, PMA 의 경우, 일반적으로 0.002 - 20 μM, 바람직하게는 0.02 - 2 μM, 더욱 바람직하게는 약 0.2 μM 에 상응하고, Shh 단백질의 경우, 예를 들어, 농도는 일반적으로 약 10 - 1000 ng/ml, 바람직하게는 약 10 - 300 ng/ml 에 상응한다.
배지 중 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질의 농도는 단계 (2) 의 기간 동안 변화될 수 있다. 예를 들어, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질은 단계 (2) 의 시작 시 앞서 언급한 범위 내로 제공되고, 농도는 점차적으로 또는 단계적으로 2 - 4 일 마다 40 - 60% 의 비율로 감소될 수 있다.
소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질을 배지에 첨가하는 시기는 앞서 언급한 효과가 제공될 수 있는 한 특별히 제한되지 않지만, 조기에 첨가될 때 보다 높은 효과를 얻을 수 있다. 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질은 단계 (2) 시작부터, 일반적으로 3 일 이내, 바람직하게는 2 일 이내, 더 바람직하게는 1 일 이내, 더욱 바람직하게는 단계 (2) 시작 시에, 배지에 첨가된다.
바람직한 구현예에서, 단계 (2) 에서, 단계 (1) 에서 수득한 인간 만능줄기세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 를 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질 (예를 들어, SAG, Shh 단백질, PMA) 을 포함하는 무혈청 배지에서 현탁 배양하여 응집체를 형성한다. 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질은 바람직하게는 현탁 배양 시작 시부터 배지에 포함된다. ROCK 저해 물질 (예를 들어, Y-27632) 가 배지에 첨가될 수도 있다. 배양 시간은 12 시간 - 6 일, 바람직하게는 12 시간 - 48 시간이다. 형성된 응집체는 바람직하게는 균일한 응집체이다.
예를 들어, 단계 (1) 에서 수득한 인간 만능줄기세포 (예를 들어, 인간 iPS 세포) 를 회수하여, 단일 세포 또는 그에 가까운 상태로 분산시키고, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질 (예를 들어, SAG, Shh 단백질, PMA) 을 포함하는 무혈청 배지에 현탁시키고, 현탁 배양한다. 무혈청 배지는 ROCK 저해제 (예를 들어, Y-27632) 를 포함할 수 있다. 인간 만능줄기세포 (예를 들어, iPS 세포) 의 현탁액을 앞서 언급한 배양 용기에 시딩하고, 분산된 만능줄기세포를 배양 용기 에 비접착성인 조건 하에 배양함으로써, 복수의 만능줄기세포를 집합시켜 응집체를 형성한다. 배양 기간은 12 시간 - 6 일, 바람직하게는 12 시간 - 48 시간이다. 형성된 응집체는 바람직하게는 균일한 응집체이다.
이러한 방식으로 단계 (2) 를 수행함으로써, 단계 (1) 에서 수득한 만능줄기세포, 또는 이로부터 유래한 세포 응집체가 형성된다. 본 발명은 또한 이러한 응집체의 제조 방법을 제공한다. 단계 (2) 에서 수득한 응집체는, 단계 (2) 에서 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질에 의한 처리를 수행하지 않고 형성한 것보다 높은 품질을 갖는다. 구체적으로는, 표면이 매끄럽고, 내부가 조밀하고, 형태가 무너지지 않은 구형 세포 응집체의 비율이 보다 높은 응집체의 집단을 수득할 수 있다. 한 구현예에서, 제 2 단계의 시작으로부터 6 일째에 무작위로 응집체 (예를 들어, 100 개 이상의 응집체) 를 선택했을 때, 무너지지 않은 응집체 및/또는 비-낭성 응집체 비율의 합은, 예를 들어 30% 이상, 바람직하게는 50% 이상이다.
단계 (2) 에서 수득한 응집체는 각종 분화 세포 및 분화 조직으로 분화하는 능력을 갖는다. 한 구현예에서, 단계 (2) 에서 수득한 응집체는, 신경 세포 (예를 들어, 망막 세포) 또는 신경 조직 (예를 들어, 망막 조직) 으로 분화하는 능력을 갖는다. 한 구현예에서, 단계 (1) 에서 수득되고, 적어도 신경 세포 또는 신경 조직 (바람직하게는, 망막 조직, 망막 전구 세포, 또는 망막층 특이적 뉴런) 으로 분화하는 능력을 갖는 줄기세포 (바람직하게는, 적어도 신경 세포 또는 신경 조직 (바람직하게는, 망막 조직, 망막 전구 세포, 또는 망막층 특이적 뉴런) 으로 분화하는 능력을 갖는 Oct3/4 양성 줄기세포) 를 단계 (2) 에서 사용함으로써, 적어도 신경 세포 또는 신경 조직 (바람직하게는, 망막 조직, 망막 전구 세포, 또는 망막층 특이적 뉴런) 으로 분화하는 능력을 갖는 줄기 세포 (예를 들어, Oct3/4 양성 줄기세포) 를 포함하는 응집체를 수득할 수 있다. 단계 (2) 에서 수득한 응집체를 적절한 분화 조건 하에 배양함으로써, 각종 분화 세포 및 분화 조직 (예를 들어, 망막 세포 등과 같은 신경 세포, 망막 조직 등과 같은 신경 조직) 이 높은 효율로 유도될 수가 있다.
한 구현예에서, 단계 (2) 에서 수득한 응집체는 단계 (1) 에서 수득한 만능줄기세포와 신경 세포 또는 신경 조직 (바람직하게는, 망막 세포 또는 망막 조직) 사이의 중간 단계의 세포에 해당하는 세포를 포함한다. 이들 세포는 만능성 상태 마커 Oct3/4, 외배엽 마커 (Sox1, Sox2, N-카데린, TP63), 신경 외배엽 마커 (Sox1, Sox2, 네스틴, N-카데린, Otx2) 및 앞서 언급한 신경 세포 마커 중 어느 하나를 발현한다. 즉, 한 구현예에서, 단계 (2) 에서 수득한 응집체는 만능성 상태 마커 Oct3/4, 외배엽 마커 (Sox1, Sox2, N-카데린, TP63), 신경 외배엽 마커 (Sox1, Sox2, 네스틴, N-카데린, Otx2) 및 앞서 언급한 신경 세포 마커 중 어느 하나를 발현하는 세포의 혼합물을 포함한다. 즉, 단계 (2) 에서 수득한 응집체는 적어도 신경 세포 또는 신경 조직 (바람직하게는, 망막 세포 또는 망막 조직), 및/또는 신경 세포 또는 신경 조직 (바람직하게는, 망막 세포 또는 망막 조직) 의 전구 세포로 분화하는 능력을 갖는 줄기세포를 포함한다. 또한, 전구 세포는 공지된 적절한 배양 조건 하에 배양될 때 앞서 언급한 신경 세포 마커 (바람직하게는, 망막 세포 마커) 를 발현하는 능력을 나타내는 것을 특징으로 한다. 따라서, 한 구현예에서, 단계 (2) 에서 수득한 응집체는 적어도 신경 세포 또는 신경 조직 (바람직하게는, 망막 세포 또는 망막 조직), 및/또는 신경 세포 또는 신경 조직 (바람직하게는, 망막 세포 또는 망막 조직) 의 전구 세포로 분화하는 능력을 갖는 Oct3/4 양성 줄기세포를 포함한다. 단계 (2) 에서 수득한 응집체에 포함된 세포의 일부가 앞서 언급한 신경 조직 마커를 발현할 수 있다. 한 구현예에서, 단계 (2) 에서 수득한 응집체는 전세포 중 50% 이상, 예를 들어, 70% 이상의 비율로 Oct3/4 양성 세포를 포함할 수 있다.
단계 (2) 에서, 배지 교환 조작을 수행하는 경우, 예를 들어, 기존 배지를 버리지 않고 새로운 배지를 첨가하는 조작 (배지 첨가 조작), 거의 절반량 (약 30 - 90%, 예를 들어, 기존 배지 부피의 약 40 - 60%) 의 기존 배지를 버리고 거의 절반량 (약 30 - 90%, 예를 들어, 기존 배지 부피의 약 40 - 60%) 의 새로운 배지를 첨가하는 조작 (절반-배지 교환 조작), 및 거의 전량 (기존 배지 양의 90% 이상) 의 기존 배지를 버리고 거의 전량 (기존 배지 양의 90% 이상) 의 새로운 배지를 첨가하는 조작 (전체량 배지 교환 조작) 이 언급될 수 있다.
특정 시점에 특정 성분 (예를 들어, 분화 유도 인자) 을 첨가하는 경우, 예를 들어, 최종 농도를 계산하고, 거의 절반량의 기존 배지를 버리고, 특정 성분을 최종 농도보다 높은 농도 (구체적으로는 최종 농도의 1.5 - 3.0 배, 예를 들어, 최종 농도의 약 2배) 로 포함하는 새로운 배지의 거의 절반량을 첨가하는 조작 (절반 배지 교환 조작) 을 수행할 수 있다.
특정 시점에 기존 배지에 포함된 특정 성분의 농도를 유지하는 경우, 예를 들어, 거의 절반량의 기존 배지를 버리고, 특정 성분을 기존 배지 중 농도와 동일한 농도로 포함하는 새로운 배지의 거의 절반량을 첨가하는 조작을 수행할 수 있다.
특정 시점에, 기존 배지에 포함된 성분의 농도를 희석에 의해 감소시키는 경우, 예를 들어, 배지 교환 조작을, 하루에 복수회, 바람직하게는 1 시간 이내에 복수회 (예를 들어, 2 - 3 회) 수행할 수 있다. 또한, 특정 시점에, 기존 배지 중 포함된 성분의 농도를 희석에 의해 감소시키는 경우, 세포 또는 응집체를 다른 배양 용기로 옮길 수 있다.
배지 교환 조작에 사용하는 도구는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 피펫터, 마이크로피펫 (PIPETMAN), 멀티채널 마이크로피펫 (MULTICHANNEL PIPETMAN), 연속 디스펜서 등이 언급될 수 있다. 예를 들어, 배양 용기로서 96-웰 플레이트를 사용하는 경우, 멀티채널 마이크로피펫 (MULTICHANNEL PIPETMAN) 을 사용할 수 있다.
망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는 응집체가 단계 (2) 에서 수득한 응집체로부터 유도되는 단계 (3) 을 설명한다.
단계 (2) 에서 수득한 응집체를 적절한 분화 유도 인자의 존재 하 또는 부재 하 (바람직하게는 존재 하) 에 현탁 배양함으로써, 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는 응집체를 수득할 수 있다.
현탁 배양에 의해 세포 응집체를 망막 세포 또는 망막 조직으로 유도하는 방법으로서, 많은 방법이 보고되었다. 예를 들어, [Nature, 472, 51-56 (2011), Cell Stem Cell, 10(6), 771-775 (2012)] 등에 기재되어 있는 방법이 알려져 있지만, 이것에 한정되지 않는다.
분화 유도 인자의 부재 하에 망막 세포 또는 망막 조직을 제조하는 방법으로, 단계 (2) 에서 수득한 응집체를 혈청-함유 배지 또는 무혈청 배지에서 망막 세포를 포함하는 신경 세포로의 자발적 분화 유도를 포함하는 방법을 언급할 수 있다. 앞서 언급한 혈청-함유 배지 또는 무혈청 배지로서, 미분화 상태 유지 인자를 포함하지 않는 혈청-함유 배지 또는 무혈청 배지를 언급할 수 있다. 신경 세포로의 분화의 과정 동안 생산되는 망막 세포가 선택 및 단리될 수 있다. 선택 및 단리를 위해, FACS 또는 MACS 가 사용될 수 있다. 또한, 망막을 쉽게 생산하는 만능줄기세포가 단계 (1) 에서 출발 물질로서 사용될 수 있다.
바람직하게는, 단계 (2) 에서 수득한 응집체를 적절한 분화 유도 인자의 존재 하에 현탁 배양하여 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는 응집체를 수득한다.
여기서 사용되는 분화 유도 인자는 망막 세포 또는 망막 조직으로의 분화를 유도하는 활성을 갖는 인자이면 특별히 제한되지 않는다. 이들의 예는 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질, 기저막 제제, Wnt 시그널 전달 경로 저해 물질, TGFβ 패밀리 시그널 전달 경로 저해 물질 등을 포함한다. 분화 유도 인자에 대한 응답은 세포의 종류 및 분화 상태 (능력 또는 잠재력) 에 따라 다르고, 분화 유도 과정 에 있어서도, 분화 유도 인자의 농도나 첨가 시기에 따라 분화 유도 인자의 효과가 다를 수 있다. 또한, 동일한 효과를 나타내는 분화 유도 인자의 최적 농도가 동물종에 따라 다르다는 것이 알려져 있으며, 예를 들어, 마우스 세포와 인간 세포 중에, 일반적으로 인간 세포의 최적 농도가 보다 높다는 것이 알려져 있다 (특히, 외배엽, 내배엽에서). 만능줄기세포를 특정 세포 또는 조직으로 분화 유도하는 방법에 대한 많은 보고가 있으며, 목적하는 세포 또는 조직에 적합한 분화 유도 인자 또는 분화 유도 방법을 선택할 수 있다.
바람직하게는, BMP 시그널 전달 경로 활성 물질이 분화 유도 인자로서 사용된다. 즉, 단계 (2) 에서 수득한 응집체를 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는 응집체를 수득한다.
BMP 시그널 전달 경로 활성 물질은 BMP 에 의해 매개되는 시그널 전달 경로를 향상시킬 수 있는 물질이다. BMP 시그널 전달 경로 활성 물질의 예는 BMP2, BMP4, BMP7 등과 같은 BMP 단백질, GDF 7 등과 같은 GDF 단백질, 항-BMP 수용체 항체, BMP 부분 펩티드 등을 포함한다. BMP2 단백질, BMP4 단백질 및 BMP7 단백질은 예를 들어 R＆D Systems 으로부터 입수 가능하고, GDF7 단백질은 예를 들어 Wako Pure Chemical Industries, LTD. 로부터 입수 가능하다. BMP 시그널 전달 경로 활성 물질은 바람직하게는 BMP4 이다.
본 발명에 사용되는 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 는 일반적으로 포유 동물의 분화 유도 인자이다. 포유 동물의 예는 상기 언급된 것들을 포함한다. 분화 유도 인자는 포유 동물 종간 교차 반응성을 가질 수 있으므로, 배양된 만능줄기세포의 분화 유도가 달성될 수 있는 한, 임의의 포유 동물의 미분화 상태 유지 인자가 또한 사용될 수 있다. 바람직하게는, 배양되는 세포와 동일한 종의 포유 동물 분화 유도 인자가 사용된다. 예를 들어, 인간 만능줄기세포의 망막 조직 또는 망막 세포로의 분화가 유도될 때, 인간 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 가 바람직하게 사용된다.
본 발명에 사용하는 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 는 바람직하게는 단리된다. 따라서, 한 구현예에서, 본 발명은 단리된 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 를 제공하는 단계를 포함한다. 또한, 한 구현예에서, 단계 (3) 에서 사용되는 배지에 단리된 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 를 외인성으로 첨가하는 단계를 포함한다.
한 구현예에서, 단계 (3) 에서 사용되는 배지는 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 가 첨가된 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 이다. 이러한 배지는 기저막 제제를 포함할 수 있거나 포함하지 않을 수 있다. 기저막 제제로서, 앞서 언급한 것들이 사용될 수 있다. 기저막 제제를 첨가하는 경우, 그 농도는, 예를 들어, Matrigel 를 사용하는 경우 부피 농도로 0.1 내지 10%, 더 바람직하게는 0.5% 내지 2%이다. 화학적으로 미확인된 물질에 의한 오염을 방지하기 위해, 기저막 제제가 첨가되지 않는다.
이러한 배지에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지는, 앞서 언급한 같은 것인 한 특별히 제한되지 않는다. 복잡한 제조를 피하기 위해, 예를 들어, KSR 등의 시판 혈청 대체물 적당량을 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, 10% KSR, 450 μM 1－모노티오글리세롤 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 IMDM 및 F－12 의 1:1 혼합물의 배지, 또는, 5% - 20% KSR, NEAA, 피루브산, 2-머캡토에탄올을 첨가한 GMEM 의 배지) 가 바람직하게는 사용된다. 무혈청 배지에 첨가되는 KSR 의 양은 인간 ES 세포의 경우 일반적으로 약 1% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다.
단계 (3) 에서 사용되는 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 로서, 단계 (2) 에서 사용되는 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 가 바로 사용될 수도 있거나, 새로운 배지 (바람직하게는 무혈청 배지) 로 교체될 수 있다. 단계 (2) 에서 사용되는 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 를 포함하지 않는 무혈청 배지가 바로 단계 (3) 에 사용하는 경우, 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 가 배지에 첨가될 수 있다.
한 구현예에서, 단계 (2) 에서 배지에 첨가된 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질의 농도가 비교적 낮은 경우 (예를 들어, SAG 의 경우 700 nM 이하, 및 다른 Shh 시그널 전달 결로 활성 물질의 경우 앞서 언급한 농도에서 SAG 의 농도 이하의 Shh 시그널 전달 경로 활성을 부여하는 농도), 배지 교환을 불필요하고, 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 가 단계 (2) 에서 사용되는 배지에 첨가될 수 있다. 한편, Shh 시그널 전달 경로 활성 물질의 농도가 비교적 높은 경우 (예를 들어, SAG 의 경우 700 nM 초과, 또는 1000 nM 이상, 및 다른 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질의 경우 앞서 언급한 농도에서 SAG 의 농도 이하의 Shh 시그널 전달 촉진 활성을 부여하는 농도), 분화 유도 인자가 첨가될 때 배지를 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 를 포함하는 새로운 배지로 교환하여 잔존하는 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질의 영향을 억제하는 것이 바람직하다.
바람직한 양태에서, 단계 (3) 에서 사용되는 배지 중 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질의 농도는, SAG 의 Shh 시그널 전달 촉진 활성에 관하여 계산될 때, 700 nM 이하, 바람직하게는 300 nM 이하, 더 바람직하게는 10 nM 이하, 더욱 바람직하게는 0.1 nM 이하, 더욱 바람직하게는 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하지 않는다. "Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하지 않는" 배지는 또한 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 실질적으로 포함하지 않는 배지, 예를 들어, 망막 세포 및 망막 조직으로의 선택적 분화에 불리한 영향을 주는 농도로 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하지 않는 배지를 포함한다. "Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하지 않는" 배지는 또한 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질이 실질적으로 첨가되어 있지 않은 배지, 예를 들어, 망막 세포 및 망막 조직으로의 선택적 분화에 불리한 영향을 주는 농도로 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질이 첨가되어 있지 않은 배지를 포함한다.
배지 중 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP 시그널 전달 경로 활성 물질) 의 농도는 만능줄기세포 또는 이로부터 유래한 세포 응집체의 망막 세포로의 분화를 유도할 수 있는 농도일 수 있다. 예를 들어, 인간 BMP4 의 경우, 약 0.01 nM 내지 약 1 μM, 바람직하게는 약 0.1 nM 내지 약 100 nM, 더 바람직하게는 약 1 nM 내지 약 10 nM, 더욱 바람직하게는 약 1.5 nM (55 ng/ml) 의 농도로 배지에 첨가된다. BMP4 이외의 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 사용하는 경우, 앞서 언급한 농도에서 상기 BMP4 의 그것과 동등한 BMP 시그널 전달 촉진 활성을 나타낸다 농도로 사용되는 것이 바람직하다.
배지 중 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 의 농도는 단계 (3) 의 기간 동안 변화될 수 있다. 예를 들어, 단계 (3) 의 시작 시, 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 는 앞서 언급한 범위 내로 제공되고, 농도는 2 - 4 일 마다 40 - 60% 의 비율로 점진적으로 또는 단계적으로 감소될 수 있다.
분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 는 단계 (2) 의 현탁 배양 시작으로부터 약 24 시간 후 또는 그 후에 첨가될 수 있고, 현탁 배양 시작 후 몇 일 이내 (예를 들어, 15 일 이내) 에 배지에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 는 현탁 배양 시작으로부터 1 일 내지 15일 이내에, 더 바람직하게는 1 일 내지 9 일 이내에, 더욱 바람직하게는 3 일 내지 8 일 이내에, 보다 더 바람직하게는 3 일 내지 6 일 이내에 배지에 첨가된다.
분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 를 배지에 첨가하고 응집체의 망막 세포 로의 분화 유도가 시작된 후에는, 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 를 배지에 첨가할 필요가 없으며, 배지를 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 를 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지로 교환할 수 있다. 한 구현예에서, 응집체의 신경 세포로의 분화 유도가 시작된 후, 각각 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 를 포함하지 않는, 무혈청 배지 또는 혈청 배지로의 배지 교환에 의해, 배지 중 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 의 농도를 2 - 4 일 마다, 40 - 60% 의 비율로 점진적으로 또는 단계적으로 감소시킨다. 그 결과, 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 의 농도는 단계 희석될 수 있고, 분화 유도 인자의 효과 및 작용 지속 시간을 제한할 수 있다.
구체적인 구현예에서, 현탁 배양 시작 후 (즉, 앞서 언급한 단계 (2) 의 시작 후) 1 - 9 일째에, 바람직하게는 2 - 8일째에, 더욱 바람직하게는 3 또는 4 일째에, 배지를 BMP4 를 포함하는 배지로 부분적으로 또는 전체적으로 교환하여, BMP4 의 최종 농도를 약 1 - 10 nM 로 조정하고, 세포를 BMP4 의 존재 하에 약 1 - 12 일, 바람직하게는 2 - 9 일, 더욱 바람직하게는 2 - 5 일 동안 배양할 수 있다. BMP4 의 농도를 동일한 수준으로 유지하기 위해, 배지는 BMP4 를 포함하는 배지로 1 또는 2 회 부분적으로 또는 완전히 교환될 수 있다. 대안적으로, 앞서 언급한 바와 같이, BMP4 의 농도는 단계적으로 감소될 수도 있다.
망막 세포로의 분화 유도가 개시된 세포는, 예를 들어, 세포 중 망막 전구 세포 마커 유전자 (예를 들어, Rx 유전자 (별칭 Rax), Pax6 유전자, Chx10 유전자)의 발현을 검출함으로써 확인될 수 있다. GFP 등의 형광 리포터 단백질 유전자가 Rx 유전자 좌위에 녹킹된 만능줄기세포를 사용하여 단계 (2) 에서 형성된 응집체를, 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도에서 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 의 존재 하에 현탁 배양하고, 발현된 형광 리포터 단백질로부터 방출되는 형광을 검출함으로써, 망막 세포로의 분화 유도가 개시되었던 시점을 확인할 수 있다. 단계 (3) 의 한 구현예로서, 단계 (2) 에서 형성된 응집체를, 망막 전구 세포 마커 유전자 (예를 들어, Rx 유전자, Pax6 유전자, Chx10 유전자) 를 발현 세포가 출현하기 시작할 때까지, 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도에서 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 를 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 현탁 배양함으로써, 망막 전구 세포를 포함하는 응집체를 수득한다.
단계 (3) 에서, 배지 교환 조작을 수행하는 경우, 예를 들어, 배지 첨가 조작, 절반 배지 교환 조작 및 전량 배지 교환 조작이 언급될 수 있다.
특정 시점에 특정 성분 (예를 들어, 분화 유도 인자) 을 첨가하는 경우, 예를 들어, 최종 농도를 계산하고, 기존 배지의 거의 절반량을 버리고, 특정 성분을 최종 농도보다 높은 농도 (구체적으로는 최종 농도의 1.5 - 3.0 배, 예를 들어, 최종 농도의 약 2 배) 로 포함하는 새로운 배지의 거의 절반량을 첨가하는 조작 (절반 배지 교환 조작) 을 수행할 수 있다.
특정 시점에 기존 배지에 포함된 특정 성분의 농도를 유지하는 경우, 예를 들어, 기존 배지의 거의 절반량을 버리고, 특정 성분을 기존 배지 중 농도와 동일한 농도로 포함하는 새로운 배지의 거의 절반량을 첨가하는 조작을 수행할 수 있다.
특정 시점에, 기존 배지에 포함된 성분의 농도를 희석에 의해 감소시키는 경우, 예를 들어, 배지 교환 조작을, 하루에 복수회, 바람직하게는 1 시간 이내에 복수회 (예를 들어, 2 - 3 회) 수행할 수 있다. 또한, 특정 시점에, 기존 배지 중 포함된 성분의 농도를 희석에 의해 감소시키는 경우, 세포 또는 응집체를 다른 배양 용기로 옮길 수 있다.
배지 교환 조작에 사용하는 도구는 특별히 제한되지 않으며, 예를 들어, 피펫터, 마이크로피펫 (PIPETMAN), 멀티채널 마이크로피펫 (MULTICHANNEL PIPETMAN), 연속 디스펜서 등이 언급될 수 있다. 예를 들어, 배양 용기로서 96 웰 플레이트를 사용하는 경우, 멀티채널 마이크로피펫 (MULTICHANNEL PIPETMAN) 을 사용할 수 있다.
단계 (3) 에서의 배양 온도, CO2 농도 등과 같은 배양 조건은 적절히 결정될 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는, 예를 들어, 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는 약 5% 이다.
이러한 배양에 의해, 단계 (2) 에서 수득한 응집체를 형성하는 세포의 망막 전구 세포로의 분화를 유도함으로써, 망막 전구 세포를 포함하는 응집체를 수득할 수 있다. 본 발명은 또한 이러한 망막 전구 세포를 포함하는 응집체의 제조 방법을 제공한다. 망막 전구 세포를 포함하는 응집체는, 예를 들어, 응집체 중, 망막 전구 세포의 마커인 Rx, PAX6 또는 Chx10 을 발현하는 세포의 존재를 검출함으로써 확인될 수 있다. 단계 (3) 의 한 구현예는 단계 (2) 에서 형성된 응집체를 Rx 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 시작할 때까지, 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도에서 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질 (예를 들어, BMP4) 을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 현탁 배양함으로써, 망막 전구 세포를 포함하는 응집체를 수득하는 단계이다. 한 구현예에서, 응집체에 포함된 세포의 20% 이상 (바람직하게는, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상) 이 Rx 를 발현할 때까지, 단계 (3) 의 배양이 수행된다.
수득한 망막 전구 세포를 포함하는 응집체는 그대로 독성 또는 효능 평가용 시약으로 사용될 수 있다. 망막 전구 세포를 포함하는 응집체를 분산 처리 (예를 들어, 트립신/EDTA 처리 또는 파파인 처리) 하고, 수득한 세포를 FACS 또는 MACS 를 사용하여 선별함으로써, 고순도의 망막 전구 세포를 수득할 수도 있다.
뿐만 아니라, 망막 조직을 포함하는 응집체를 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에 연속 배양하여, 망막 조직에 포함되는 망막 세포 (예를 들어, 망막 전구 세포) 를 더욱 분화시킴으로써, 신경 상피 구조형 망막 조직을 제조할 수 있다.
이러한 배지에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지는 앞서 언급한 바와 같은 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 10% 소 태아 혈청, N2 서플리먼트, 100 μM 타우린, 및 500 nM 레티노산을 첨가한 DMEM－F12 배지인 혈청-함유 배지, 또는 KSR 등의 시판 혈청 대체물 적당량을 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, 10% KSR, 450 μM 1－모노티오글리세롤 및 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 IMDM 및 F－12 의 1:1 혼합물의 배지) 등을 언급할 수 있다.
망막 전구 세포로부터 망막 조직을 유도하기 위한 배양 기간은 목적하는 망막층 특이적 뉴런에 따라 다르며, 예를 들어 약 7 일 내지 약 200 일이다.
망막 조직은 응집체의 표면을 덮고 있다. 현탁 배양 종료 후, 응집체를 파라-포름알데하이드 용액 등의 고정액으로 고정할 수 있고, 동결 절편을 제작한 다음, 층 구조를 갖는 망막 조직의 형성을 면역 염색 등에 의해 확인할 수 있다. 망막 조직이 각 층이 상이한 세포 (광수용체 세포, 수평 세포, 양극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포) 로 구성되어 있기 때문에, 이들 세포에서 발현되는 앞서 언급한 마커에 대한 항체를 사용하여 면역 염색법에 의해 층 구조의 형성을 확인할 수 있다. 한 구현예에서, 망막 조직은 Rx- 또는 Chx10-양성 신경 상피 구조이다.
응집체의 표면에 존재하는 망막 조직을 핀셋 등을 사용하여 응집체로부터 물리적으로 절단할 수 있다. 이 경우, 각 응집체의 표면에 망막 조직 이외의 신경 조직이 형성될 수 있기 때문에, 응집체로부터 절단한 신경 조직의 일부를 하기 언급한 면역 염색 등으로 확인함으로써, 조직이 망막 조직임을 확인할 수 있다.
한 구현예에서, 단계 (3) 에서 수득한 응집체는 망막 조직을 포함하며, 비신경 두부 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는다. 망막 조직을 포함하고 비신경 두부 외배엽을 실질적으로 포함하지 않는 응집체에서, 예를 들어, 앞서 언급한 응집체 동결 절편의 면역 염색상에서, Rx-양성의 조직이 관찰되고, 그 외측에는 Rx-음성의 조직이 관찰되지 않는다.
단계 (3) 의 한 구현예는 단계 (2) 에서 형성된 응집체를 Rx 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 시작할 때까지, 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도에서 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 현탁 배양하고, 후속적으로 망막 전구 세포를 포함하는 응집체를 망막 조직이 형성될 때까지 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 현탁 배양함으로써, 망막 조직을 포함하는 응집체를 수득하는 단계이다. 망막 전구 세포를 포함하는 응집체를 망막 조직이 형성될 때까지 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 후속적으로 현탁 배양할 때, 망막 전구 세포를 유도하기 위해, 배지 중 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질의 농도는, 각각 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지로의 배지 교환에 의해, 2 - 4 일에 마다 40 - 60% 의 비율로 점진적으로 또는 단계적으로 감소시킬 수 있다. 한 구현예에서, 응집체에 포함된 세포의 20% 이상 (바람직하게는, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상) 이 Chx10 를 발현할 때까지, 망막 전구 세포 포함 응집체의 현탁 배양이 수행된다.
단계 (3) 의 한 구현예에서, 단계 (2) 에서 수득한 응집체, 또는 단계 (2) 에서 수득한 응집체를 앞서 언급한 방법으로 현탁 배양한 응집체를 접착 배양하여 접착 응집체를 형성시킬 수 있다. 접착 응집체를, Rx 유전자를 발현하는 세포가 출현하기 시작할 때까지, 망막 세포로의 분화 유도에 필요한 농도에서 분화 유도 인자 (예를 들어, BMP4) 를 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 접착 배양하여, 망막 전구 세포를 포함하는 접착 응집체를 수득한다. 망막 전구 세포를 포함하는 응집체를 망막 조직이 형성될 때까지 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 접착 상태로 배양함으로써, 망막 조직을 포함하는 접착 응집체를 수득한다. 한 구현예에서, 세포의 10% 이상 (바람직하게는, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상) 이 Chx10 을 발현할 때까지, 망막 전구 세포를 포함하는 접착 응집체의 접착 배양을 수행한다.
본 발명의 방법으로, 만능줄기세포로부터 망막 세포 및 망막 조직을 고효율로 수득할 수 있다. 본 발명의 방법으로 수득한 망막 조직이 망막층의 각각에 특이적인 뉴런 (신경세포) 을 포함하기 때문에, 광수용체 세포, 수평 세포, 양극 세포, 아마크린 세포, 망막 신경절 세포 또는 이들의 전구 세포 등의 망막 조직을 구성하는 각종 세포를 수득할 수도 있다. 수득한 망막 조직으로부터 어떤 세포를 수득했는지는 자체 공지된 방법, 예를 들어, 세포 마커의 발현으로 확인할 수 있다.
수득한 망막 조직을 포함하는 응집체는 독성 또는 효능 평가용 시약으로 바로 사용될 수도 있다. 망막 조직을 포함하는 응집체를 분산 처리 (예를 들어, 트립신/EDTA 처리) 하고, 수득한 세포를 FACS 또는 MACS 를 사용하여 선별함으로써, 고순도의 망막 조직 구성 세포, 예를 들어 고순도의 광수용체 세포를 수득할 수도 있다.
본 발명의 제조 방법으로 수득한 망막 조직을 포함하는 세포 응집체로부터, 하기 단계 (A) 및 단계 (B) 에 의해, 모양체 주연부형 구조를 제조할 수 있다.
모양체 주연부형 구조는 모양체 주연부와 유사한 구조를 지칭한다. "모양체 주연부 (CMZ)" 의 예는 망막의 조직 줄기세포 (망막줄기세포) 를 포함하는 영역인, 생체 망막에서 망막 조직 (구체적으로는, 신경 망막) 과 망막 색소 상피의 경계 영역에 존재하는 조직을 포함한다. 모양체 주연부는 모양체연 (ciliary margin) 및 망막연 (retinal margin) 으로도 지칭되며, 모양체연 및 망막연은 동등한 조직이다. 모양체 주연부는 망막 조직에 대한 망막 전구 세포나 분화 세포의 공급, 망막 조직 구조의 유지 등에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 모양체 주연부의 마커 유전자의 예는 Rdh10 유전자 (양성), Otx1 유전자 (양성), Zic1 유전자 (양성) 등을 포함한다.
단계 (A) 는 Chx10 양성 세포가 망막 조직의 20% 이상 및 100% 이하의 비율로 존재하는 본 발명의 제조 방법 2 에 의해 수득한 망막 조직을 포함하는 세포 응집체를 RPE65 유전자 발현 세포가 출현하기 전까지의 기간 동안만 Wnt 시그널 전달 경로 활성 물질 및/또는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 배양하는 것을 포함한다.
여기서, 단계 (A) 의 바람직한 배양으로서, 현탁 배양이 언급될 수 있다.
단계 (A) 에서 사용하는 무혈청 배지로서, N2 또는 KSR 을 첨가한 기초 배지인 무혈청 배지를 언급할 수 있다. 더 구체적으로는, N2 서플리먼트 (N2, Life Technologies 사제) 를 첨가한 DMEM/F12 배지인 무혈청 배지를 언급할 수 있다. 혈청-함유 배지로서, 소 태아 혈청을 첨가한 기초 배지인 혈청-함유 배지를 언급할 수 있다.
배양 온도, CO2 농도와 같은 단계 (A) 의 배양 조건은 적절하게 설정될 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 40℃, 바람직하게는 약 37℃ 이다. CO2 농도는, 예를 들어, 약 1% 내지 약 10%, 바람직하게는, 예를 들어, 약 5% 이다.
단계 (A) 에서, 앞서 언급한 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 를 배지에서 배양할 때, 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에 포함되는 Wnt 시그널 전달 경로 활성 물질은 Wnt 에 의해 매개되는 시그널 전달을 향상시킬 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. Wnt 시그널 전달 경로 활성 물질의 구체적인 예는 Wnt 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, Wnt1, Wnt3a, Wnt7a), Wnt 수용체, Wnt 수용체 작용제, GSK3 저해제 (예를 들어, 6-브로모인디루빈-3'-옥심 (BIO), CHIR99021, 켄폴론) 등을 포함한다.
단계 (A) 에서 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에 포함되는 Wnt 시그널 전달 경로 활성 물질의 농도는 CHIR99021 등의 일반적인 Wnt 시그널 전달 경로 활성 물질의 경우 예를 들어 약 0.1 μM 내지 약 100 μM 의 범위, 바람직하게는, 예를 들어, 약 1 μM 내지 약 30 μM 의 범위, 더 바람직하게는, 예를 들어, 약 3 μM 이다.
단계 (A) 에서 앞서 언급한 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 를 배지에서 배양할 때, 무혈청 배지 또는 혈청 배지에 포함되는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질은 FGF 에 의해 매개되는 시그널 전달을 저해할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. FGF 시그널 전달 경로 저해 물질의 예는 FGF 수용체, FGF 수용체 저해제 (예를 들어, SU-5402, AZD4547, BGJ398), MAP 키나아제 캐스케이드 저해 물질 (예를 들어, MEK 저해제, MAPK 저해제, ERK 저해제), PI3 키나아제 저해제, Akt 저해제 등을 포함한다.
단계 (A) 에서 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에 포함된 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질의 농도는 오직 응집체의 모양체 주연부형 구조로의 분화가 유도될 수 있는 농도일 필요가 있다. 예를 들어, SU-5402 의 경우, 약 0.1 μM 내지 약 100 μM, 바람직하게는 약 1 μM 내지 30 μM, 더 바람직하게는 약 5 μM 의 농도로 배지에 첨가된다.
단계 (A) 에서 "RPE65 유전자 발현 세포가 출현하기 전까지의 기간 동안만 배양" 은 RPE65 유전자 발현 세포가 출현하기 전 기간의 전부 또는 일부 동안 배양하는 것을 의미한다. 즉, 배양 시스템에서 앞서 언급한 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 가 RPE65 유전자를 실질적으로 발현하지 않는 세포로 구성되는 기간 (임의의 기간) 의 전부 또는 그 일부 동안의 배양이 충분하다. 이러한 배양을 이용함으로써, RPE65 유전자 발현 세포가 출현하지 않는 세포 응집체를 수득할 수 있다.
이러한 특정 기간을 결정하기 위해, 앞서 언급한 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 를 샘플로 사용하고, 일반적인 유전자 공학 방법 또는 생화학적 방법으로 시료 중 포함된 RPE65 유전자의 발현 유무 또는 그 수준을 측정할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 앞서 언급한 "망막 조직을 포함하는 세포 응집체" 의 동결 절편을 RPE65 단백질에 대한 항체를 사용하는 면역 염색 방법에 적용하여 RPE65 유전자의 발현의 유무 또는 그 수준을 검사할 수 있다.
단계 (A) 에서 "RPE65 유전자 발현 세포가 출현하기 전까지의 기간" 으로서, 예를 들어, 상기 언급한 망막 조직에 존재하는 Chx10 양성 세포의 비율이 Wnt 시그널 전달 경로 활성 물질 및/또는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청 배지에서 상기 언급한 세포 응집체의 배양 시작 시보다 감소하여, 30% 내지 0% 의 범위 이내가 되는 기간을 언급할 수 있다. "RPE65 유전자 발현 세포가 출현하지 않는 세포 응집체" 로서, Chx10 양성 세포가 조직의 30% 내지 0% 이내의 비율로 상기 언급한 망막 조직에 존재하는 세포 응집체가 언급될 수 있다.
단계 (A) 에서 "RPE65 유전자 발현 세포가 출현하기 전까지의 기간" 의 일수는 Wnt 시그널 전달 경로 활성 물질 및/또는 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질의 종류, 무혈청 배지 또는 혈청 배지의 종류, 다른 배양 조건 등에 따라 다르지만, 예를 들어, 14일 이내이다. 보다 구체적으로는, 무혈청 배지 (예를 들어, N2 를 첨가한 기초 배지인 무혈청 배지) 가 사용되는 경우, 상기 언급한 기간은 바람직하게는, 예를 들어, 10 일 이내, 더 바람직하게는, 예를 들어, 3 일 내지 6 일이다. 혈청-함유 배지 (예를 들어, 소 태아 혈청을 첨가한 기초 배지인 혈청-함유 배지) 가 사용되는 경우, 상기 언급한 기간은 바람직하게는, 예를 들어, 12 일 이내, 더 바람직하게는, 예를 들어, 6 일 내지 9 일이다.
이어서, 단계 (B) 로서, 상기 언급한 바와 같은 배양에 의해 수득한 "RPE65 유전자 발현 세포가 출현하지 않는 세포 응집체" 를 각각 Wnt 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 배양한다.
단계 (B) 에서 바람직한 배양으로서, 현탁 배양이 언급될 수 있다.
단계 (B) 에서의 무혈청 배지로서, N2 또는 KSR 을 첨가한 기초 배지인 배지를 언급할 수 있다. 혈청-함유 배지로서, 소 태아 혈청을 첨가한 기초 배지인 배지를 언급할 수 있다. 더 구체적으로는, 소 태아 혈청을 첨가한 DMEM/F12 배지인 혈청-함유 배지를 언급할 수 있다.
단계 (B) 에서의 상기 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지는 공지된 성장 인자, 성장을 촉진하는 첨가제 및 화학 물질 등을 포함할 수 있다. 공지된 성장 인는 EGF, FGF, IGF, 인슐린 등을 포함한다. 성장을 촉진하는 첨가제의 예는 N2 서플리먼트 (Life Technologies 사제), B27 서플리먼트 (Life Technologies 사제), KSR 등을 포함한다. 성장을 촉진하는 화학 물질의 예는 레티노이드 (예를 들어, 레티노산) 및 타우린을 포함한다.
단계 (B) 에서 바람직한 배양 기간은, 예를 들어, 배양 동안 앞서 언급한 망막 조직에 존재하는 Chx10 양성 세포의 비율이, 각각 Wnt 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서의 앞서 언급한 세포 응집체의 배양 시작 시보다 증가하여, 30% 이상에 도달하는 배양 기간이다.
단계 (B) 에서의 배양 온도, CO2 농도 등의 배양 조건은 적절하게 설정될 수 있다. 배양 온도는, 예를 들어, 약 30℃ 내지 약 40℃ 의 범위, 바람직하게는, 예를 들어, 약 37℃ 이다. CO2 농도는, 예를 들어, 약 1% 내지 약 10% 의 범위, 바람직하게는, 예를 들어, 약 5% 이다.
단계 (B) 에서 "모양체 주연부형 구조를 포함하는 세포 응집체" 가 수득될 때까지의 앞서 언급한 배양 일수는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지의 종류, 다른 배양 조건 등에 따라 다르며, 예를 들어, 100 일 이내이다. 상기 배양 일수는 바람직하게는, 예를 들어, 20 일 내지 70 일, 더 바람직하게는, 예를 들어, 30 일 내지 60 일이다.
앞서 언급한 단계 (A), (B) 에 의해 제조된 "모양체 주연부형 구조를 포함하는 세포 응집체" 에서, 망막 색소 상피 및 망막 조직 (구체적으로는, 신경 망막) 은 모양체 주연부형 구조에 인접하여 동일한 세포 응집체 내에 존재한다. 구조 는 현미경 관찰 등에 의해 확인될 수 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 투명도가 높은 망막 조직과 색소 침착을 보이는 망막 색소 상피 사이에 형성되는, 망막 측이 두껍고 망막 색소 상피 측이 얇은 상피 구조로서 모양체 주연부형 구조의 존재를 현미경 관찰에 의해 확인할 수 있다. 또한, 응집체의 동결 절편의 면역 염색에 의해, Rdh10 양성, Otx1 양성, 또는 Zic1 양성을 확인함으로써, 모양체 주연부형 구조의 존재를 확인할 수 있다.
본 발명의 제조 방법 등으로 수득한 망막 조직을 포함하는 세포 응집체로부터 하기 단계 (C) 에 의해 망막 색소 상피 세포를 제조할 수 있다. 하기 단계 (C) 에 의해 수득한 망막 색소 상피 세포로부터 하기 단계 (D) 에 의해 망막 색소 상피 시트를 제조할 수 있다.
본 발명에서 "망막 색소 상피 세포" 는 생체 내 망막의 신경 망막 조직의 외부에 존재하는 상피 세포를 의미한다. 망막 색소 상피 세포인지 여부는 당업자에 의해 예를 들어 세포 마커 (RPE65 (성숙 망막 색소 상피 세포), Mitf (유년 또는 성숙 망막 색소 상피 세포) 등) 의 발현, 멜라닌 과립의 존재, 다각형의 특징적인 세포 모폴로지 등을 기반으로 확인될 수 있다.
우선, 단계 (C) 에서, 본 발명의 제조 방법 2 로 수득한 망막 조직을 포함하는 세포 응집체를, BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하지 않으나 Wnt 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 현탁 배양하여, 망막 색소 상피 세포를 포함하는 응집체를 수득한다.
단계 (C) 에서 사용하는 무혈청 배지로서, N2 또는 KSR 을 첨가한 기초 배지인 무혈청 배지를 언급할 수 있다. 보다 구체적으로는, N2 서플리먼트 (Life Technologies 사제) 를 첨가한 DMEM/F12 배지인 무혈청 배지를 언급할 수 있다. 혈청 배지로서, 소 태아 혈청을 첨가한 기초 배지인 혈청 배지가 언급될 수 있다.
단계 (C) 에서 사용되는 무혈청 배지는 앞서 언급한 Wnt 시그널 전달 경로 활성 물질 이외에, 앞서 언급한 Nodal/액티빈 시그널 전달 경로 활성 물질, 및/또는 앞서 언급한 FGF 시그널 전달 경로 저해 물질을 포함할 수 있다.
단계 (C) 에서 바람직한 배양은, 예를 들어, 현탁 배양이다.
단계 (C) 에서 수득한 응집체를 분산하고, 수득한 세포를 접착 상태로 배양하는 단계 (D) 를 설명한다.
단계 (D) 는 단계 (C) 의 시작 후, 60 일 이내, 바람직하게는 30 일 이내, 더 바람직하게는 3 일 째에 수행된다.
단계 (D) 에서 접착 배양에 사용되는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지로서, 앞서 언급한 배지가 언급될 수 있다. 복잡한 제조를 피하기 위해, KSR 등의 시판 혈청 대체물 적당량을 첨가한 무혈청 배지 (예를 들어, 1/2 x N2 서플리먼트, 1/2 x B27 서플리먼트 및 100 μM 2-머캡토에탄올을 첨가한 DMEM/F-12 및 Neurobasal 의 1:1 혼합물의 배지) 가 바람직하게는 사용된다. 무혈청 배지에 첨가되는 KSR 의 양은, 예를 들어, 인간 iPS 세포 유래 세포의 경우, 일반적으로 약 1% 내지 약 20%, 바람직하게는 약 2% 내지 약 20% 이다.
단계 (D) 에서, 앞서 언급한 ROCK 저해 물질을 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다.
단계 (D) 에서, Wnt 시그널 전달 경로 활성 물질, FGF 시그널 전달 경로 저해 물질, 액티빈 시그널 전달 경로 활성 물질 및 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 물질을 추가로 포함하는 무혈청 배지 또는 혈청-함유 배지에서 세포를 배양하는 것이 더 바람직하다.
액티빈 시그널 전달 경로 활성 물질은 액티빈에 의해 매개되는 시그널을 향상시킬 수 있는 물질이다. 액티빈 시그널 전달 경로 활성 물질의 예는 액티빈 패밀리에 속하는 단백질 (예를 들어, 액티빈 A, 액티빈 B, 액티빈 C, 액티빈 AB 등), 액티빈 수용체, 액티빈 수용체 작용제를 포함한다.
단계 (D) 에서 사용되는 액티빈 시그널 전달 경로 활성 물질의 농도는 망막 색소 상피 세포의 균일한 시트를 효율적으로 형성할 수 있는 한 임의의 농도일 수 있다. 예를 들어, 재조합 인간/마우스/래트 액티빈 A (R&D systems, ＃338-AC) 는 약 1 ng/ml 내지 약 10 μg/ml, 바람직하게는 약 10 ng/ml 내지 약 1 μg/ml, 더 바람직하게는 약 100 ng/ml 의 농도로 첨가된다.
액티빈 시그널 전달 경로 활성 물질은 예를 들어 단계 (D) 의 시작으로부터 18 일 이내, 바람직하게는 6 일째에 첨가된다.
단계 (D) 에서, 접착 배양은 바람직하게는 표면이 배양 기질로 처리된 배양 용기에서 수행된다. 단계 (D) 에서 배양 용기를 처리하는데 사용되는 배양 기질로서, 응집체 유래 세포의 접착 배양 및 망막 색소 상피 시트의 형성을 가능하게 하는 세포 배양 기질이 언급될 수 있다.
3. 독성 또는 효능 평가 방법
본 발명의 제조 방법으로 제조된 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 광수용체 세포, 망막 전구 세포, 망막층 특이적 뉴런) 는 망막 조직 또는 망막 세포의 장애로 인한 질환의 치료를 위한 의약의 스크리닝 또는 독성 평가에서 질환 연구 또는 약물 발견 물질로서 유용하기 때문에, 시험 물질의 독성 또는 효능 평가용 시약으로서 사용될 수 있다. 예를 들어, iPS 세포는 망막 조직의 장애로 인한 질환, 특히 유전성의 질환을 가진 인간 환자로부터 제조되며, iPS 세포를 사용하여, 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 광수용체 세포, 망막 전구 세포, 망막층 특이적 뉴런) 가 본 발명의 방법으로 제조된다. 망막 조직 또는 망막 세포는 환자의 질환을 야기하는 망막 조직의 장애를 인비트로에서 재현할 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 제조 방법으로 제조된 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 광수용체 세포, 망막 전구 세포, 망막층 특이적 뉴런) 에 시험 물질을 접촉시키고, 물질이 세포 또는 조직에 미치는 영향을 검출하는 것을 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능 평가 방법을 제공한다.
예를 들어, 본 발명의 제조 방법으로 제조된 특정의 장애 (예를 들어, 유전성 장애) 를 갖는 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 광수용체 세포, 망막 전구 세포, 망막층 특이적 뉴런) 를 시험 물질의 존재 또는 부재 (음성 대조군) 하에 배양한다. 이어서, 시험 물질로 처리한 망막 조직 또는 망막 세포의 장애의 정도를 음성 대조군의 그것과 비교한다. 그 결과, 그 장애의 정도를 감소시킨 시험 물질을 장애로 인한 질환의 치료를 위한 의약의 후보 물질로서 선택할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 제조 방법으로 제조한 망막 세포의 생리학적 활성 (예를 들어, 생존 촉진 또는 성숙) 을 향상시키는 시험 물질을 의약품의 후보 물질로서 탐색할 수 있다. 대안적으로는, 본 발명의 제조 방법에 따르면, 망막 세포는, 망막 등에서의 장애와 동반되는 질환과 같은 특정 장애를 일으키는 유전자 변이를 갖는 체세포의 분화를 유도함으로써 제조된다.
시험 물질을 첨가한 망막 세포가 앞서 언급한 장애를 나타내는지 여부를 지표로 하여, 장애의 치료 약물 또는 예방 약물로서 효과적인 시험 물질의 후보를 탐색할 수 있다.
독성 평가를 위해, 본 발명의 제조 방법으로 제조된 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 광수용체 세포, 망막 전구 세포, 망막층 특이적 뉴런) 는 시험 물질의 존재 또는 부재 (음성 대조군) 하에 배양된다. 이어서, 시험 물질로 처리한 망막 조직 또는 망막 세포에서의 독성의 정도를 음성 대조군과 비교한다. 그 결과, 음성 대조군에 비해 독성을 나타낸 시험 물질을 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 광수용체 세포, 망막 전구 세포, 망막층 특이적 뉴런) 에 대해 독성을 갖는 물질로서 판단할 수 있다.
즉, 본 발명은, 하기 단계를 포함하는 독성 평가 방법을 포함한다:
(단계 1) 본 발명의 제조 방법으로 제조된 망막 조직 또는 망막 세포를, 생존 배양 조건 하에 일정 시간 동안 시험 물질의 존재 하에 배양하고, 세포 손상의 정도를 측정하는 단계,
(단계 2) 본 발명의 제조 방법으로 제조된 망막 조직 또는 망막 세포를, 생존 배양 조건 하에 일정 시간 동안 시험 물질의 부재 하에 또는 양성 대조군의 존재 하에 배양하고, 세포 손상의 정도를 측정하는 단계, 및
(단계 3) (단계 1) 및 (단계 2) 에서 측정한 결과의 차이에 근거해, 단계 1에서의 시험 물질의 독성을 평가하는 단계.
본원에 사용된 바와 같이, "시험 물질의 부재 하에" 는 시험 물질을 첨가하는 대신에 시험 물질을 용해시키는데 사용된 용매 또는 배양 배지만을 첨가하는 것을 포함한다. 또한, "양성 대조군" 은 독성을 갖는 공지된 화합물을 의미한다.
세포 손상의 정도를 측정하는 방법의 예는, 생균수를 측정 하는 방법, 예를 들어 세포내 ATP 량의 측정 방법, 또는, 세포 염색 (예를 들어, 핵 염색) 및 모폴로지 관찰에 의한 생균수의 측정 등을 포함한다.
단계 3 에서, 시험 물질의 독성을 평가하는 방법으로서, 단계 1 에서의 측정 값과 단계 2 에서의 음성 대조군의 측정 값을 비교하고, 단계 1 에서의 세포 손상 정도가 높을 때, 시험 물질이 독성을 갖는다고 판단할 수 있다. 또한, 단계 1 에서의 측정 값과 단계 2 에서의 양성 대조군의 측정 값을 비교하고, 단계 1 에서의 세포 손상 정도가 같거나 그 이상일 때, 시험 물질이 독성을 갖는다고 판단할 수 있다.
4. 약학 조성물
본 발명은 본 발명의 제조 방법으로 제조된 망막 조직 또는 망막 세포(예를 들어, 광수용체 세포, 망막 전구 세포, 망막층 특이적 뉴런) 의 유효량을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
약학 조성물은 본 발명의 제조 방법으로 제조된 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 광수용체 세포, 망막 전구 세포, 망막층 특이적 뉴런) 의 유효량, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함한다.
약학적으로 허용되는 담체로서, 생리학적 수성 용매 (식염수, 완충액, 무혈청 배지 등) 가 사용될 수 있다. 필요한 경우, 이식 치료에서, 이식될 조직 또는 세포를 포함하는 의약이 통상적으로 사용되는 보존제, 안정화제, 환원제 등장화제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 본 발명의 제조 방법 1 또는 2 에 의해 제조된 망막 조직 또는 망막 세포를 적절한 생리학적 수성 용매에 현탁시켜 현탁액으로 제조될 수 있다. 필요한 경우, 조성물에 동결 보존제를 첨가하여, 동결 보존하고, 사용시 해동시키고, 완충액으로 세척하여, 이식 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 제조 방법으로 수득된 망막 조직을 핀셋 등을 사용하여 적절한 크기로 절단하여 시트 제제를 수득할 수 있다.
본 발명의 제조 방법으로 수득한 세포를 분화 유도를 위한 단계 (3) 에서 접착 배양하여 시트형 세포를 형성하여 시트 제제를 수득할 수도 있다.
본 발명의 약학 조성물은 신경 조직 또는 신경 세포 (예를 들어, 망막 조직, 망막 전구 세포, 망막층 특이적 뉴런) 의 장애로 인한 질환을 위한 치료 약물로서 유용하다.
5. 치료 약물
본 발명의 제조 방법으로 제조된 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 광수용체 세포, 망막 전구 세포, 망막층 특이적 뉴런) 는 망막 조직 또는 망막 세포의 장애로 인한 질환의 이식 치료에 유용하다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 제조 방법으로 제조된 망막 조직 또는 망막 세포 (예를 들어, 광수용체 세포, 망막 전구 세포, 망막층 특이적 뉴런) 를 포함하는, 망막 조직 또는 망막 세포의 장애로 인한 질환을 치료하기 위한 의약을 제공한다. 본 발명의 제조 방법으로 제조된 망막 조직 또는 망막 세포 (망막 전구 세포, 망막층 특이적 뉴런 포함) 는 망막 조직 또는 망막 세포의 장애로 인한 질환을 치료하기 하기 위한 의약으로서 사용될 수 있거나, 망막 조직의 손상된 상태에서 해당 손상 부위를 보완하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 제조 방법으로 제조된 망막 조직 또는 망막 세포를 이식을 필요로 하는, 망막 조직 또는 망막 세포의 장애로 인한 질환, 또는 망막 조직의 손상된 상태를 갖는 환자에게 이식하여, 망막 조직 또는 망막 세포의 장애가 있는 망막 조직 자체를 보완함으로써, 망막 조직 또는 망막 세포의 장애로 인한 질환을 치료할 수 있다. 망막 조직 또는 망막 세포의 장애로 인한 질환의 예는 망막 변성증, 망막 색소 변성증, 노화관련 황반변성증, 유기 수은 중독, 클로로킨 망막증, 녹내장, 당뇨병성 망막증, 신생아 망막증 등을 포함한다.
이식 치료에서, 조직 적합성 항원의 차이로 인한 거부가 종종 문제가 된다. 그러나, 문제점은 이식 받는 사람의 체세포로부터 확립된 만능줄기세포 (예를 들어, 유도 만능줄기세포) 를 사용함으로써 해결될 수 있다. 즉, 바람직한 구현예에서, 이식 받는 사람의 체세포로부터 확립된 만능줄기세포 (예를 들어, 유도 만능줄기세포) 가 본 발명의 방법에서 만능줄기세포로서 사용되며, 이식 받는 사람에 대해 면역학적으로 자기 자신인 신경 조직 또는 신경 세포가 제조되고, 이식 받는 사람에게 이식된다.
또한, 이식 받는 사람과 면역학적으로 적합한 (예를 들어, HLA 유형 및 MHC 유형 적합) 다른 사람의 체세포로부터 확립된 만능줄기세포 (예를 들어, 유도 만능줄기세포) 로부터 동종 신경 조직 또는 신경 세포를 제조하여, 이식 받는 사람에게 이식될 수 있다.
[실시예]
하기 실시예 및 약리학적 예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것은 아니다.
비교예 1: 단계 2 에서 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 사용하지 않는 인간 iPS 세포로부터의 분화의 예
인간 iPS 세포 (1231A3 균주, 교토대학교에서 입수) 를 "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 조건 하에 배양했다. 피더-프리 배지로서, StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용했고, 피더-프리 스캐폴드로서, Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
구체적인 유지 배양 조작으로서, 먼저 서브컨플루언트 (subconfluent) 인간 iPS 세포 (1231A3 균주) 를 PBS 로 세척하고, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 단일 세포에 분산시켰다. 그 후, 앞서 언급한 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 Laminin 511-E8 로 코팅한 플라스틱 배양 디쉬에 시딩하고, Y27632 (ROCK 저해 물질, 10 μM) 의 존재 하에, StemFit 배지에서 피더-프리 배양했다. 앞서 언급한 플라스틱 배양 디쉬로서 6-웰 플레이트 (Iwaki 사제, 세포 배양용, 배양 면적 9.4 ㎠) 를 사용한 경우, 앞서 언급한 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포의 플레이트 세포수는 6 × 103 으로 조정했다. 시딩 1 일 후에, Y27632 를 포함하지 않는 StemFit 배지의 전량을 교환했다. 그 후, 배지의 전량을 1 - 2 일에 1 회 Y27632 를 포함하지 않는 StemFit 으로 교환했다. 그 후, 시딩 6 일 후에, 서브컨플루언트 (배양 영역의 60% 가 세포로 덮임) 가 될 때까지 배양했다.
상기 서브컨플루언트 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 조작에 의해 단일 세포에 추가로 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96 웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE) 에서 무혈청 배지 100 ㎕ 에 웰 당 1.2×104 세포로 현탁시키고, 37℃, 5% CO2 에서 현탁 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 10% KSR, 450 μM 1－모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물을 사용했다. 현탁 배양 시작 시 (현탁 배양 시작 후 0 일째에, 단계 2 시작), 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM) 를 첨가했다. 현탁 배양 시작 후 2 일째까지, 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 및 단계 3 시작). 현탁 배양 시작 후 3 일째에, Y27632 를 포함하지 않는 무혈청 배지 (50 ㎕) 를 첨가했다.
현탁 배양 시작 후 6 일째에, 배지의 절반량을 Y27632 를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하거나 포함하지 않는 배지로 교환하여, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도를 1.5 nM (55 ng/ml, 도 1B) 로 조정하거나 외인성의 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 배지를 수득했다 (도 1A). 절반 배지 교환 조작으로서, 배양 용기 중 배지의 부피 절반, 즉 75 ㎕ 를 버리고, 상기 새로운 무혈청 배지 (75 ㎕) 를 첨가하여 배지 총량이 150 ㎕ 가 되도록 조정했다. 그 후, 2 - 4 일에 1 회, 배지의 절반량을 Y27632 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 교환했다. 현탁 배양 시작 후 19 일 후, 이렇게 제조한 세포 응집체를 도립현미경 (KEYENCE 사제 BIOREVO) 으로 명시야 관찰했다 (도 1A, B). 그 결과, 인간 재조합 BMP4 를 첨가한 조건 (도 1B), 인간 재조합 BMP4 를 첨가하지 않은 조건 (도 1A) 모두, 세포 응집체의 90% 이상이 붕괴하고, 신경 조직의 형성 효율이 나쁜 것으로 밝혀졌다.
실시예 1: 단계 1 에서 피더-프리 배지로서 StemFit 을 사용하여 배양한 인간 iPS 세포로부터, 단계 2 에서 Shh 전달 경로 활성 물질을 사용하여 제조한 세포 응집체, 신경 조직 및 망막 조직의 형성예
인간 iPS 세포 (1231A3 균주, 교토대학교에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 조건 하에 배양했다. 피더-프리 배지로서, StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용했고, 피더-프리 스캐폴드로서, Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다. 유지 배양은 비교예 1 에 기재한 방법에 따라 수행했다.
이렇게 제조한 서브컨플루언트 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 조작에 의해 단일 세포에 추가로 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96 웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE) 에서 무혈청 배지 100 ㎕ 에 웰 당 1.2×104 세포로 현탁시키고, 37℃, 5% CO2 에서 현탁 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 10% KSR, 450 μM 1－모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물을 사용했다. 현탁 배양 시작 시 (현탁 배양 시작 후 0 일째, 단계 2 시작), Shh 시그널 전달 경로 활성 물질로서 Y27632 (최종 농도 20 μM) 및 SAG (300 nM) 를 상기 무혈청 배지에 첨가했다. 현탁 배양 시작 후 2 일째까지, 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 시작). 현탁 배양 시작 후 3 일째에, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않는 무혈청 배지 (50 ㎕) 를 첨가했다. 현탁 배양 시작 후 6 일째에, 배지의 절반량을 Y27632 를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하거나 포함하지 않는 배지로 교환하여, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도를 1.5 nM (55 ng/ml, 도 1D) 로 조정하거나 외인성 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 배지를 수득했다 (도 1C). 절반 배지 교환 조작으로서, 배양 용기 중 배지의 부피 절반, 즉 75 ㎕ 를 버리고, 상기 새로운 무혈청 배지 (75 ㎕) 를 첨가하여 배지 총량이 150 ㎕ 가 되도록 조정했다. 그 후, 2 - 4 일에 1 회, 배지의 절반량을 Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 교환했다. 현탁 배양 시작 후 19 일째에, 이렇게 제조한 세포 응집체를 도립현미경 (KEYENCE 사제 BIOREVO) 으로 명시야 관찰했다 (도 1C, D). 그 결과, 인간 재조합 BMP4 를 첨가한 조건 (도 1D), 인간 재조합 BMP4 를 첨가하지 않은 조건 (도 1C) 모두 세포 응집체가 유지되었고, 신경 상피 구조가 관찰되었다. 즉, Shh 시그널 전달 경로 활성 물질의 첨가는 우수한 형태의 응집체를 제공하고, 신경 조직 형성 효율을 향상시키는 것으로 밝혀졌다 (도 1A－D). 이 결과로부터, 단계 2 의 현탁 배양 시작 시 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가함으로써, 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포로부터 신경 조직을 효율적으로 제조할 수 있다는 것을 발견했다.
상기 현탁 배양 시작 후 19 일째의 세포 응집체를 각각 4% 파라-포름알데하이드로 고정하여 동결 절편을 수득했다. 이들 동결 절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha 사제, 양), 또는, 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx항체, TAKARA 사제, 기니피그) 에 대해 면역 염색을 실시했다. 면역 염색 분석에 있어 상기 마커의 양성 여부를 판정할 때, 백그라운드보다 2 배 이상 높은 형광 강도를 양성으로 취했다. 그 결과, 현탁 배양 0 일째에 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가하고, 현탁 배양 6 일째에 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가하지 않은 조건 하에서, 전체 세포 중 Rx-양성 세포의 비율이 3% 미만이고, Chx10-양성 세포의 비율 또한 3% 미만인 것을 발견하였다 (도 2A, C). 한편, 현탁 배양 0 일째에 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가하고, 현탁 배양 6 일째에 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가하는 조건 하에서, 전체 세포 중 Rx-양성 세포의 비율이 60% 이상이고, 전체 세포 중 Chx10-양성 세포의 비율 또한 60% 이상인 것을 발견하였다 (도 2B, D). 뿐만 아니라, 연속 절편의 분석으로부터, Chx10-양성 세포의 높은 (95% 이상) 비율을 갖는 신경 조직에서, Rx 또한 강하게 양성인 것으로 나타났다 (도 2B, D). 이 결과로부터, 단계 2 의 현탁 배양 시작 시 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가하고, 단계 3 의 현탁 배양 동안 분화 유도 물질로서 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가함으로써, 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포 (이하, 때때로 피더-프리 인간 iPS 세포로 지칭함) 로부터 망막 조직을 효율적으로 제조할 수 있다는 것을 발견했다.
실시예 2: 단계 1 에서 피더-프리 배지로서 Essential 8 을 사용한 인간 iPS 세포로부터, 현탁 배양 시작 시 Shh 전달 경로 활성 물질을 사용한 신경 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (1231A3 균주, 교토대학교에서 입수) 를 "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 조건 하에 배양했다. 피더-프리 배지로서, Essential 8 배지 (Life Technologies 사제) 를 사용했고, 피더-프리 스캐폴드로서, Laminin 511-E8 ((Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
구체적인 유지 배양 조작으로서, 먼저 서브컨플루언트 인간 iPS 세포 (1231A3 균주) 를 PBS 로 세척하고, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 단일 세포에 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 Laminin 511-E8 로 코팅한 플라스틱 배양 디쉬에 시딩하고, Y27632 (ROCK 저해 물질, 10 μM) 의 존재 하에, Essential 8 배지에서 피더-프리 배양했다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서 6-웰 플레이트 (Iwaki 사제, 세포 배양용, 배양 면적 9.4 ㎠) 를 사용한 경우, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포의 플레이트 세포수는 6 × 103 으로 조정했다. 시딩 1 일 후에, 배지의 전량을 Y27632 를 포함하지 않는 Essential 8 로 교환했다. 그 후, 1 - 2 일에 1 회, 배지의 전량을 Y27632 를 포함하지 않는 Essential 8 로 교환했다. 그 후, 시딩 6 일 후에, 서브컨플루언트 (배양 영역의 60% 가 세포로 덮임) 가 될 때까지 배양했다.
이렇게 제조한 서브컨플루언트 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 조작에 의해 단일 세포에 추가로 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE) 의 웰 당 1.2×104 세포로 무혈청 배지 100 ㎕ 에 현탁시켰다. 그 후, 37℃, 5% CO2 에서 세포를 현탁 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 10% KSR, 450 μM 1－모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물을 사용했다. 현탁 배양 시작 시 (현탁 배양 시작 후 0 일째, 단계 2 시작), Y27632 (최종 농도 20 μM) 를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다 (도 3A-D). 이들 중, 특정 조건 하에, Shh 시그널 전달 경로 활성 물질로서 SAG (300 nM) 및 Y27632 (최종 농도 20 μM) 를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다 (도 3C, D). 현탁 배양 시작 후 2 일째까지, SAG 를 첨가한 조건 및 첨가하지 않은 조건 둘 다에서 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 시작). 현탁 배양 시작 후 3 일째에, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않는 무혈청 배지 (50 ㎕) 를 첨가했다. 현탁 배양 시작 후 6 일째에, 배지의 절반량을 Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하거나 포함하지 않는 배지로 교환하여, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도를 1.5 nM 로 설정하거나 (도 3B, D), 외인성 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 배지를 수득했다 (도 3A, C). 그 후, 2 - 4 일에 1 회, 배지의 절반량을 Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 교환했다. 현탁 배양 시작 후 18 일째에, 이렇게 제조한 세포 응집체를, 도립현미경 (KEYENCE 사제 BIOREVO) 으로 명시야 관찰했다 (도 3A-D). 그 결과, 현탁 배양 시작 시 SAG 를 첨가하지 않고 현탁 배양 동안 BMP4 를 첨가하지 않은 조건 (조건 1, 도 3A), 및 현탁 배양 시작 시 SAG 를 첨가하지 않고 현탁 배양 동안 BMP4 를 첨가한 조건 (조건 2, 도 3B) 모두, 세포 응집체의 80% 이상이 붕괴하고, 신경 조직의 형성 효율이 나쁜 것으로 밝혀졌다. 한편, 현탁 배양 시작 시 SAG 를 첨가하고 현탁 배양 동안 BMP4 를 첨가하지 않은 조건 (조건 3, 도 3C), 및, 현탁 배양 시작 시 SAG 를 첨가하고 현탁 배양 동안 BMP4 를 첨가한 조건 (조건 4, 도 3D) 하에서, 세포 응집체가 유지되고, 신경 상피 구조가 효율적으로 형성되는 것을 발견했다.
뿐만 아니라, 현탁 배양 시작 후 18 일째에 복수의 응집체 형태가 관찰되었고, 양호한 형태 (도 4 검은색 막대, 양호한 응집체, 많은 신경 상피 포함), 중간 수준의 형태 (도 4 회색 막대, 양호한 응집체이나 신경 상피의 비율이 낮음), 나쁜 형태 (도 4 흰색 막대, 응집체 붕괴, 신경 상피를 포함하지 않음) 로 분류하고 정량화했다. 그 결과, 조건 1 (도 3A) 하에서, 양호한 형태의 비율은 3% 미만이었고, 나쁜 형태의 비율은 71% 였다 (도 4, 대조군). 그에 반해, 조건 3 (도 3C) 하에서, 양호한 형태의 비율은 93% 였고, 나쁜 형태의 비율은 6% 였다 (도 4, SAG).
이들의 결과로부터, Essential 8 배지에서 배양한 피더-프리 인간 iPS 세포 에 있어서, 현탁 배양 시작 시 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가함으로써, 신경 조직 형성의 효율이 향상되는 것을 발견했다.
실시예 3: 단계 1 에서 피더-프리 배지로서 Essential 8 을 사용한 인간 iPS 세포로부터, 현탁 배양 시작 시 Shh 전달 경로 활성 물질을 사용한 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (201B7 균주, 교토대학교에서 입수) 를 "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 하에 배양했다. 피더-프리 배지로서, Essential 8 배지 (Life Technologies 사제) 를 사용했고, 피더-프리 스캐폴드로서, Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
구체적인 유지 배양 조작으로서, 먼저 서브컨플루언트 인간 iPS 세포 (201B7 균주) 를 PBS 로 세척하고, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 단일 세포에 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를, Laminin 511-E8 로 코딩한 플라스틱 배양 디쉬에 시딩하고, Y27632 (ROCK 저해 물질, 10 μM) 의 존재 하에, Essential 8 배지에서 피더-프리 배양했다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서 6-웰 플레이트 (Iwaki 사제, 세포 배양용, 배양 면적 9.4 ㎠) 를 사용한 경우, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 위한 플레이트 세포수 6 × 103 으로 조정했다. 시딩 1 일 후에, 배지의 전량을 Y27632 를 포함하지 않는 Essential 8 배지로 교환했다. 그 후, 1 - 2 일에 1 회, 배지의 전량을 Y27632 를 포함하지 않는 Essential 8 배지로 교환했다. 그 후, 시딩 6 일 후에, 서브컨플루언트 (배양 면적의 60% 가 세포로 덮임) 가 될 때까지 세포를 배양했다.
이렇게 제조한 서브컨플루언트 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 조작에 의해 단일 세포에 추가로 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE) 의 웰 당 1.2×104 세포로 무혈청 배지 100 ㎕ 에 현탁시켰다. 그 후, 37℃, 5% CO2 에서 세포를 현탁 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 10% KSR, 450 μM 1－모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 무혈청 배지를 사용했다. 현탁 배양 시작 시 (현탁 배양 시작 후 0 일째, 단계 2 시작), 상기 무혈청 배지에 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질로서 SAG (최종 농도 300 μM), 및 Y27632 (20 μM) 를 첨가한 무혈청 배지를 사용했다 (도 5 A-D). 현탁 배양 시작 후 2 일째에, 세포 응집체가 형성되었다. 현탁 배양 시작 후 3 일째에, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않는 무혈청 배지 (50㎕) 를 첨가했다. 현탁 배양 시작 후 6 일째에, 배지의 절반량을 Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하거나 포함하지 않는 배지로 교환하여, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도를 1.5 nM (55 ng/ml) 로 조정하였다. 그 후, 배지의 절반량을 2 - 4 일에 1 회, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 교환했다. 이렇게 제조한 세포 응집체를, 현탁 배양 시작 후 18 일째에, 도립현미경 (KEYENCE 사제 BIOREVO) 으로 명시야 관찰했다. 그 결과, 신경 상피가 형성되었음을 발견했다.
현탁 배양 시작 후 18 일째의 세포 응집체를 4% 파라-포름알데하이드로 고정하여 동결 절편을 제조했다. 이러한 동결 절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha, 양), 또는, 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, TAKARA 사제, 기니피그) 에 대해 면역 염색을 실시했다. 그 결과, 현탁 배양 0 일째에 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가하고, 현탁 배양 6 일째에 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가하지 않은 조건 하에, 전세포 중 Rx-양성 세포의 비율이 3% 이하, 전세포 중 Chx10-양성 세포의 비율 또한 3% 이하인 것을 발견하였다 (도 5A, C). 한편, 현탁 배양 0 일째에 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가하고, 현탁 배양 6 일째에 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가한 조건 하에, 전세포 중 Rx-양성 세포의 비율이 40% 이상, 전세포 중 Chx10-양성 세포의 비율 또한 40% 이상인 것을 발견하였다 (도 5B, D). 뿐만 아니라, 연속 절편의 분석으로부터, 높은 (95% 이상) 비율의 Chx10-양성 세포를 갖는 신경 조직 에서, Rx 또한 강하게 양성인 것으로 나타났다 (도 5B, D). 이 결과로부터, 단계 2 의 현탁 배양 시작 시 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가하고, 단계 3 의 현탁 배양 동안 분화 유도 물질로서 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가하는 것으로, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 망막 조직을 효율적으로 제조할 수 있음을 발견했다.
실시예 4: 단계 2 에서 Shh 전달 경로 활성 물질을 사용하고, 단계 3 에서 BMP4 를 사용한, 인간 iPS 세포로부터의 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (1231A3 균주, 교토대학교에서 입수) 를, "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서, StemFit 배지 (AK03, Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용했고, 피더-프리 스캐폴드로서, Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
구체적인 유지 배양 조작으로서, 먼저 서브컨플루언트 인간 iPS 세포 (1231A3 균주) 를 PBS 로 세척하고, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 단일 세포에 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 Laminin 511-E8 로 코팅한 플라스틱 배양 디쉬에 시딩하고, Y27632 (ROCK 경로 저해 물질, 10 μM) 의 존재 하에, StemFit 배지에서 피더-프리 배양했다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서 6-웰 플레이트 (Iwaki 사제, 세포 배양용, 배양 면적 9.4 ㎠) 를 사용한 경우, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포의 플레이트 세포수는 6 × 103 으로 조정했다. 시딩 1 일 후에, 배지를 Y27632 를 포함하지 않는 StemFit 배지로 교환했다. 그 후, 1 - 2 일에 1 회, 배지를 Y27632 를 포함하지 않는 StemFit 배지로 교환했다. 그 후, 시딩 6 일 후에, 서브컨플루언트 (배양 면적의 60% 가 세포로 덮임) 가 될 때까지 배양했다.
상기 서브컨플루언트 인간 iPS 세포를, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 단일 세포에 분산시킨 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE) 의 웰 당 1.2×104 세포로 무혈청 배지 100 ㎕ 에 현탁시키고, 37℃, 5% CO2 에서 현탁 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 10% KSR, 450 μM 1－모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 F－12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 무혈청 배지를 사용했다. 현탁 배양 시작 시 (현탁 배양 시작 후 0 일째, 단계 2 시작) 에, 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM) 및 SAG (최종 농도 300 nM) 를 첨가했다. 현탁 배양 시작 후 2 일째까지, 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 시작).
여기서, 단계 3 으로서, 하기 조건 1 및 조건 2 하에 배양을 실시했다.
조건 1 (+BMP, d3) 에서, 현탁 배양 시작 후 3 일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM 가 되도록, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50 ㎕) 를 첨가했다 (배지 총량 150 ㎕). 현탁 배양 시작 후 6 일째에, 배지의 절반량을 Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 교환했다.
조건 2 (+BMP, d6) 에서, 현탁 배양 시작 후 3 일째에, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지 (50 ㎕) 를 첨가했다. 현탁 배양 시작 후 6 일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM 가 되도록, 배지의 절반량을 Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지로 교환했다.
조건 1 및 조건 2 하에 세포의 현탁 배양 시작 후 6 일째 또는 그 이후에, 2 - 4 일에 1 회, 배지의 절반량을 Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 교환했다. 현탁 배양 시작 후 18 일째에, 도립현미경으로 형태를 관찰했다. 조건 1 및 조건 2 하에 세포 응집체가 유지되고, 신경 조직이 형성되었음을 발견했다.
출발 물질로서 피더-프리 iPS 세포로부터 단계 2 에서 SAG 를 첨가하여 제조한, 현탁 배양 시작 후 18 일째의 세포 응집체를, 4% 파라-포름알데하이드로 고정하여 동결 절편을 제조했다. 이러한 동결 절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha, 양), 또는, 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 사제, 기니피그) 에 대해 면역 염색을 실시했다. 이들의 면역 염색된 절편을 도립 형광 현미경을 사용하여 관찰했다. 그 결과, 조건 1 및 조건 2 하의 세포 모두에 대해, 전세포 중 Rx-양성 세포의 비율이 약 40%, 전세포 중 Chx10-양성 세포의 비율 또한 약 40% 인 것을 발견했다 (도 6). 뿐만 아니라, 연속 절편의 분석으로부터, 높은 비율의 Chx10-양성 세포 (약 95%) 를 갖는 신경 조직에서 Rx 또한 강하게 양성인 것을 발견했다. 이 결과로부터, 단계 2 에서 SAG 를 첨가하고, 단계 3 에서 현탁 배양 시작 후 3 일 또는 6 일째에 분화 유도 물질로서 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가함으로써, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 망막 조직을 효율적으로 제조할 수 있음을 발견했다.
실시예 5: 단계 2 에서 600 nM Shh 전달 경로 활성 물질을 사용하고, 단계 3에서 BMP4 를 사용한, 인간 iPS 세포로부터의 망막 조직의 제조예
실시예 4 에 기재된 방법에 따라 제조한 피더-프리 인간 iPS 세포 (1231A3 균주) 를 TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 단일 세포에 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE) 의 웰 당 1.2 × 104 세포로 무혈청 배지 100 ㎕ 에 현탁시키고, 37℃, 5% CO2 에서 현탁 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 10% KSR, 450 μM 1－모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 무혈청 배지를 사용했다. 현탁 배양 시작 시 (현탁 배양 시작 후 0 일째, 단계 2 시작), 상기 무혈청 배지에 Y27632 (최종 농도 20 μM) 및 SAG (최종 농도 600 nM) 를 첨가했다. 현탁 배양 시작 후 2 일째까지, 세포 응집체가 형성되었다 (단계 2 종료, 단계 3 시작).
여기서, 단계 3 으로서, 하기 조건 1 및 조건 2 하에 배양을 실시했다.
조건 1 (+BMP, d3) 에서, 현탁 배양 시작 후 3 일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM 가 되도록, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50 ㎕) 를 첨가했다 (배지 총량 150 ㎕). 현탁 배양 시작 후 6 일째에, 배지의 절반량을 Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 배지로 교환했다.
조건 2 (+BMP, d6) 에서, 현탁 배양 시작 후 3 일째에, Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지 (50 ㎕) 를 첨가했다. 현탁 배양 시작 후 6 일째에, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도가 1.5 nM가 되도록, 배지의 절반량을 Y27632 를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지로 교환했다.
조건 1 및 조건 2 하에 세포의 현탁 배양 시작 후 6 일째 또는 그 이후에, 2 - 4 일에 1 회, 배지의 절반량을 Y27632, SAG 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 교환했다. 현탁 배양 시작 후 18 일째에, 도립현미경으로 형태를 관찰했다. 조건 1 및 조건 2 하에, 세포 응집체가 유지되고, 신경 조직이 형성되었음을 발견했다.
출발 물질로서 피더-프리 iPS 세포로부터 단계 2 에서 SAG 를 첨가하여 제조한, 현탁 배양 시작 후 18 일 째의 세포 응집체를, 4% 파라-포름알데하이드로 고정하여 동결 절편을 제조했다. 이러한 동결 절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha, 양), 또는, 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 사제, 기니피그) 에 대해 면역 염색을 실시했다. 이들의 면역 염색된 절편을 도립 형광 현미경을 사용하여 관찰했다. 그 결과, 조건 1 및 조건 2 하의 세포 모두에 대해, 전세포 중 Rx-양성 세포의 비율이 약 40%, 전세포 중 Chx10-양성 세포의 비율 또한 약 40% 인 것을 발견했다 (도 7). 뿐만 아니라, 연속 절편의 분석으로부터, 높은 비율의 Chx10-양성 세포를 갖는 (약 95%) 신경 조직에서 Rx 또한 강하게 양성인 것으로 나타났다. 이 결과로부터, 단계 2 에서 600 nM SAG 를 첨가하고, 단계 3 에서 현탁 배양 시작 후 3 일 또는 6 일째에 분화 유도 물질로서 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가함으로써, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 망막 조직을 효율적으로 제조할 수 있음을 발견했다.
실시예 6: 단계 2 에서 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질로서 SAG, 퍼모파민, 재조합 Shh 단백질을 사용한, 인간 iPS 세포로부터의 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (201B7 균주, 교토대학교에서 입수) 를 "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서, Stem Fit 배지 (AK-03; Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용했고, 피더-프리 스캐폴드로서, Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
구체적인 유지 배양 조작으로서, 먼저 서브컨플루언트 iPS 세포 (201B7 균주) PBS 로 세척하고, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 단일 세포에 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를, Laminin 511-E8 로 코팅한 플라스틱 배양 디쉬에 시딩하고, Y27632 (ROCK 경로 저해 물질, 10 μM) 의 존재 하에, Stem Fit 배지에서 피더-프리 배양했다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서 6-웰 플레이트 (Iwaki 사제, 세포 배양용, 배양 면적 9.4 ㎠) 를 사용한 경우, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포의 플레이트 세포수는 1.3 × 104 로 조정했다. 시딩 1일 후에, 배지의 전량을 Y27632 를 포함하지 않는 Stem Fit 배지로 교환했다. 이후, 1 - 2 일에 1 회, 배지의 전량을 Y27632 를 포함하지 않는 Stem Fit 배지로 교환했다. 그 후, 시딩 6 일 후에, 서브컨플루언트 (배양 면적의 60% 가 세포로 덮임) 가 될 때까지 배양했다.
이렇게 제조한 서브컨플루언트 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 조작에 의해 단일 세포에 추가로 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (SUMILON SPHEROID V-바닥 플레이트 PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE) 의 웰 당 1.0 × 104 세포로 무혈청 배지 100 ㎕ 에 현탁시켰다. 그 후, 37℃, 5% CO2 에서 현탁 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 10% KSR, 450 μM 1－모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 무혈청 배지를 사용했다. 현탁 배양 시작 시 (현탁 배양 시작 후 0 일째, 단계 2 시작), Shh 시그널 전달 경로 활성 물질로서 Y27632 (최종 농도 20 μM) 를 첨가한, SAG (최종 농도 30 nM), 퍼모파민 (Wako 사제, 최종 농도 0.2 μM), 또는 인간 재조합 Shh (R&D 사제, Recombinant N-Terminus, 최종 농도 50 ng/ml) 를 추가로 첨가한 상기 무혈청 배지를 사용했다 (도 8). 현탁 배양 시작 후 2 일째에, 세포 응집체가 형성되었다. 현탁 배양 시작 후 3 일째에, Y27632, SAG, 퍼모파민 및 재조합 Shh 를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50 ㎕) 를 첨가하여 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도를 1.5 nM (55 ng/ml) 로 조정했다. 현탁 배양 시작 후 6 일째에, 배지의 절반량을 Y27632, SAG, 퍼모파민, Shh 단백질 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로 교환했다. 그 후, 2 - 4 일에 1 회, 배지의 절반량을 Y27632, SAG, 퍼모파민, Shh 단백질 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 교환했다. 이렇게 제조한 세포 응집체를 현탁 배양 시작 후 18 일째에, 도립현미경 (KEYENCE 사제 BIOREVO) 으로 명시야 관찰했다. 신경 상피가 형성되었음을 발견하였다.
현탁 배양 시작 후 18 일 째의 세포 응집체를 4% 파라-포름알데하이드로 고정하여 동결 절편을 제조했다. 이러한 동결 절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha, 양) 에 대해 면역 염색을 실시했다. 그 결과, 현탁 배양 0 일째에 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질로서 SAG, PMA 또는 Shh를 첨가하고, 현탁 배양 3 일째에 BMP4 를 첨가한 조건에서, 전세포 중 Chx10-양성 세포의 비율도 30% 이상인 것을 발견했다 (도 8, D - F). 이들 결과로부터, 단계 2 의 현탁 배양 시작 시 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질로서 SAG, 퍼모파민 및 재조합 Shh 중 어느 하나를 첨가하고, 단계 3의 현탁 배양 동안 분화 유도 물질로서 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가함으로써, 피더-프리 배양한 인간 iPS 세포로부터 망막 조직을 효율적으로 제조할 수 있음을 발견했다.
실시예 7: 단계 2 에서 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질로서 SAG, 퍼모파민, 재조합 Shh 단백질을 사용하고 단계 3 에서 BMP4 를 사용한, 인간 iPS 세포로부터의 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (1231A3 균주, 교토대학교에서 입수) 를 "Scientific Reports, 4, 3594 (2014)" 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서, Stem Fit 배지 (AK-03; Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용했고, 피더-프리 스캐폴드로서, Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
실시예 6 에 기재된 방법으로 제조한 서브컨플루언트 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 조작에 의해 단일 세포에 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (SUMILON SPHEROID V-바닥 플레이트 PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE) 의 웰 당 1.0 × 104 세포로 무혈청 배지 100 ㎕ 에 현탁시켰다. 그 후, 37℃, 5% CO2 에서 현탁 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 10% KSR, 450 μM 1－모노티오글리세롤, 1 x화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 무혈청 배지를 사용했다. 현탁 배양 시작 시 (현탁 배양 시작 후 0 일째, 단계 2 시작), Shh 시그널 전달 경로 활성 물질로서 Y27632 (최종 농도 20 μM) 을 첨가한, 및 SAG (최종 농도 30 nM), 퍼모파민 (PMA, Wako 사제, 최종 농도 0.2 μM), 또는 인간 재조합 Shh (R&D 사제, Recombinant N-Terminus, 최종 농도 300 ng/ml) 를 첨가한 상기 무혈청 배지, 또는 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하지 않는 무혈청 배지를 사용했다 (도 9). 현탁 배양 시작 후 2 일째에, 세포 응집체가 형성되었다. 현탁 배양 시작 후 3 일째에, Y27632, SAG, 퍼모파민 및 재조합 Shh 를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하는 배지 (50 ㎕) 를 첨가하여 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도를 1.5 nM (55 ng/ml) 로 조정했다. 현탁 배양 시작 후 6 일째에, 배지의 절반량을 Y27632, SAG, 퍼모파민, Shh 단백질 및 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로 교환했다. 그 후, 2 - 4 일에 1 회, 배지의 절반량을 Y27632, SAG, 퍼모파민, Shh 단백질, 및, 인간 재조합 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 교환했다. 이렇게 제조한 세포 응집체를, 현탁 배양 시작 후 18 일째에, 도립현미경 (KEYENCE 사제 BIOREVO) 으로 bright field obsevation했다. 그 결과, 단계 2 에서 외인성 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가하지 않은 조건에서 세포 응집체가 성장하지 않았고, 신경 상피가 형성되지 않은 반면 (도 9: 대조군), 단계 2 에서 SAG, PMA 또는 재조합 Shh 단백질을 첨가한 조건에서는 세포 응집체가 성장했고, 신경 상피가 형성되었음 (도 9: SAG, PMA, Shh) 을 발견하였다.
현탁 배양 시작 후 18 일째의 세포 응집체를, 4% 파라-포름알데하이드로 고정하여 동결 절편을 제조했다. 이러한 동결 절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha, 양) 에 대해 면역 염색을 실시했다. 그 결과, 현탁 배양 0 일째에 PMA 를 첨가하고, 현탁 배양 3 일째에 BMP4 를 첨가한 조건에서, 전세포 중 Chx10-양성 세포의 비율이 60% 이상임을 발견하였다 (도 9 하단 PMA). 또한, 현탁 배양 0 일째에 SAG 또는 Shh를 첨가한 조건에서도, 세포 응집체에 Chx10-양성 세포가 포함되어 있음을 발견했다. 이들의 결과로부터, 단계 2 의 현탁 배양 시작 시 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질로서 SAG, 퍼모파민 및 재조합 Shh 중 어느 하나를 첨가하고, 단계 3 의 현탁 배양 동안 분화 유도 물질로서 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가함으로써, 피더-프리 인간 iPS 세포로부터 망막 조직을 제조할 수 있음을 발견했다.
실시예 8: 센다이바이러스를 사용하여 수립한 인간 iPS 세포를, 피더-프리 배양하고, 현탁 배양 시작 시 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 사용하고, 단계 3 에서 BMP4 를 사용한, 망막 조직의 제조예
인간 iPS 세포 (DSPC-3 균주, Sumitomo Dainippon Pharma Co., Ltd. 에서 수립) 는 시판 센다이바이러스 벡터 (Oct3/4, Sox2, KLF4, c-Myc 의 4 인자, DNAVEC (현 ID Pharma) 사제 CytoTune 키트), StemFit 배지 (AK03; Ajinomoto Co., Inc. 사제), 및 Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용하여, Life Technologies 의 공개 프로토콜 (iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit, Publication Number MAN0009378, Revision 1.0), 및 교토대학교의 공개 프로토콜 (establishment·maintenance culture of human iPS cells under feeder-free, CiRA_Ff-iPSC_protocol_JP_v140310, http://www.cira.kyoto-u.ac.jp/j/research/protocol.html) 에 기재되어 있는 방법을 기반으로 수립했다.
인간 iPS 세포 (DSPC-3 균주) 를 Scientific Reports, 4, 3594 (2014) 에 기재된 방법에 따라 피더-프리 배양했다. 피더-프리 배지로서, Stem Fit 배지 (Ajinomoto Co., Inc. 사제) 를 사용했고, 피더-프리 스캐폴드로서, Laminin 511-E8 (Nippi, Inc. 사제) 를 사용했다.
구체적인 유지 배양 조작으로서, 먼저 서브컨플루언트 인간 iPS 세포를 PBS 로 세척하고, TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 단일 세포에 분산시켰다. 그 후, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 Laminin 511-E8 로 코팅한 플라스틱 배양 디쉬에 시딩하고, Y27632 (ROCK 경로 저해 물질, 10 μM) 의 존재 하에, Stem Fit 배지에서 피더-프리 배양했다. 상기 플라스틱 배양 디쉬로서 6-웰 플레이트 (Iwaki 사제, 세포 배양용, 배양 면적 9.4 ㎠) 를 사용한 경우, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포의 플레이트 세포수는 1.3 × 104 로 조정했다. 시딩 1 일 후에, 배지의 전량을 Y27632 를 포함하지 않는 Stem Fit 배지로 교환했다. 그 후, 1 - 2 일에 1 회, 배지의 전량을 Y27632 를 포함하지 않는 Stem Fit 배지로 교환했다. 그 후, 시딩 6 일 후에, 서브컨플루언트 (배양 면적의 60% 가 세포로 덮임) 가 될 때까지 배양했다.
이렇게 제조한 서브컨플루언트 인간 iPS 세포를 TrypLE Select (Life Technologies 사제) 를 사용하여 세포 분산액으로 처리하고, 피펫팅 조작에 의해 단일 세포에 추가로 분산시키고, 상기 단일 세포에 분산된 인간 iPS 세포를 비세포-접착성 96-웰 배양 플레이트 (SUMILON SPHEROID V-바닥 플레이트 PrimeSurface 96V-바닥 플레이트, SUMITOMO BAKELITE) 의 웰 당 1.2×104 세포로 무혈청 배지 100 ㎕ 에 현탁시켰다. 그 후, 세포를 37℃, 5% CO2 에서 현탁 배양했다. 이를 위한 무혈청 배지 (gfCDM+KSR) 로서, 10% KSR, 450 μM 1－모노티오글리세롤, 1 x 화학적으로 정의된 지질 농축물을 첨가한 F-12 배지 및 IMDM 배지의 1:1 혼합물인 무혈청 배지를 사용했다. 현탁 배양 시작 시 (현탁 배양 시작 후 0 일째, 단계 2 시작), Y27632 를 첨가한 (최종 농도 20 μM), 및 외인성 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질로서 SAG 를 추가로 첨가한 (최종 농도 300 nM), 또는 SAG 를 보충하지 않은 (최종 농도 0 nM) 상기 무혈청 배지를 사용했다 (도 10). 현탁 배양 시작 후 2 일째에, 세포 응집체가 형성되었다. 현탁 배양 시작 후 3 일째에, Y27632 및 SAG 를 포함하지 않고, 인간 재조합 BMP4 (R&D 사제) 를 포함하거나 포함하지 않는 배지 (50 ㎕) 를 첨가하여, 외인성 인간 재조합 BMP4 의 최종 농도를 1.5 nM (55 ng/ml) 또는 0 nM 로 조정했다. 현탁 배양 시작 후 6 일째에, 배지의 절반량을 Y27632, SAG 및 BMP4 를 포함하지 않는 무혈청 배지로 교환했다. 그 후, 2 - 4 일에 1 회, 배지의 절반량을 Y27632, SAG 및 BMP4 를 포함하지 않는 상기 무혈청 배지로 교환했다. 이렇게 제조한 세포 응집체를, 현탁 배양 시작 후 22 일째에, 도립현미경 (KEYENCE 사제 BIOREVO) 으로 명시야 관찰했다. 그 결과, Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가하지 않은 조건에서 세포 응집체의 형성 효율이 나쁜 것으로 밝혀졌다 (도 10, 대조군). 한편, 현탁 배양 시작 시 SAG 를 첨가한 조건에서 세포 응집체가 유지되고, 신경 상피가 형성되는 것으로 밝혀졌다 (도 10, SAG 300 nM).
현탁 배양 시작 후 22 일째의 세포 응집체를 4% 파라-포름알데하이드로 고정하여 동결 절편을 제조했다. 이러한 동결 절편을 망막 조직 마커 중 하나인 Chx10 (항-Chx10 항체, Exalpha, 양), 또는 망막 조직 마커 중 하나인 Rx (항-Rx 항체, Takara 사제, 기니피그) 에 대해 면역 염색을 실시했다. 그 결과, 현탁 배양 0 일째에 SAG 를 첨가하고, 현탁 배양 3 일째에 BMP4 를 첨가한 조건에서, 전세포 중 Rx-양성 세포의 비율이 약 10% 이고, 전세포 중 Chx10-양성 세포의 비율 또한 약 10% 인 것을 발견했다 (도 10). 뿐만 아니라, 연속 절편의 분석으로부터, Chx10-양성 세포의 신경 조직에서, Rx 또한 강하게 양성인 것을 발견했다 (도 10). 이러한 결과로부터, 단계 2 의 현탁 배양 시작 시 Shh 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가하고, 단계 3 의 현탁 배양 동안 분화 유도 물질로서 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질을 첨가함으로써, 센다이바이러스를 사용하여 수립한 피더-프리 인간 iPS 세포로부터도 망막 조직을 제조할 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
[산업상의 이용 가능성]
본 발명의 제조 방법에 따르면, 피더 세포의 부재 하에, 만능줄기세포의 분화를 유도하여 망막 조직을 제조할 수 있다. 본 발명의 제조 방법은 망막 조직을 사용하여 의약품 후보 화합물, 그 외 화학 물질의 독성 또는 효능 평가나, 망막 조직 이식 치료용 이식 재료에 대한 응용을 위한, 시험이나 치료에 사용하기 위한 재료되는 망막 조직을 제조할 수 있는 점으로 유용하다.
특허, 특허 출원 명세서 및 과학 문헌을 포함하는, 본원에 인용된 임의의 문헌에 개시된 내용은, 본원에 개시된 정도로, 그 전체가 참조로 포함된다.
본 출원은, 일본에서 출원된 특허 출원 No. 2014-217868 (출원일: 2014 년 10 월 24 일) 에 기초하며, 그 내용은 본원에 모두 포함된다.

Claims (22)

  1. 하기 단계 (1) - (3) 을 포함하는, 망막 세포 또는 망막 조직의 제조 방법:
    (1) 인간 만능줄기세포를 피더 세포의 부재 하에 및 미분화 상태 유지 인자를 포함하는 배지에서 배양하는 제 1 단계,
    (2) 제 1 단계에서 수득한 만능줄기세포를 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 세포 응집체를 형성시키는 제 2 단계, 및
    (3) 제 2 단계에서 수득한 응집체를 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질의 존재 하에 현탁 배양하여 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는 응집체를 수득하는 제 3 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 2 단계에서, 제 1 단계에서 수득한 세포를 분산시키고, 분산시킨 세포를 현탁 배양하는 제조 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 미분화 상태 유지 인자가 FGF 시그널 전달 경로 활성 물질인 제조 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, FGF 시그널 전달 경로 활성 물질이 bFGF 인 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 단계에서, 배지 중 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질의 농도가 10 nM 내지 700 nM 에서의 SAG 의 소닉 헤지호그 시그널 전달 활성에 상응하는 농도인 제조 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질이 SAG, 퍼모파민 또는 Shh 인 제조 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, BMP 시그널 전달 경로 활성 물질이 BMP2, BMP4, BMP7 및 GDF7 로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 단백질인 제조 방법.
  8. 제 6 항에 있어서, BMP 시그널 전달 경로 활성 물질이 BMP4 인 제조 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 단계에서, 제 2 단계의 시작 후 2 내지 9 일째에 BMP 시그널 전달 경로 활성 물질이 배지에 첨가되는 제조 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 단계에서, 응집체가 700 nM 에서의 소닉 헤지호그 시그널 전달 활성에 상응하는 농도 이하에서 소닉 헤지호그 시그널 전달 경로 활성 물질을 포함하는 배지에서 배양되는 제조 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 단계가 접착 배양 방법으로 수행되는 제조 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 만능줄기세포가 유도 만능줄기세포인 제조 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 균일한 응집체가 제 2 단계에서 형성되는 제조 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 단계에서 수득한 응집체가, 망막 전구 세포, 신경 망막 전구 세포, 광수용체 전구 세포, 광수용체 세포, 간상 광수용체 세포, 원추 광수용체 세포, 수평 세포, 아마크린 세포, 개재뉴런, 신경절 세포, 망막 색소 상피 세포, 및 모양체 주연부 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 세포를 포함하는 제조 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 현탁 배양이 기저막 제제의 부재 하에 수행되는 제조 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능 평가용 시약.
  17. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 망막 세포 또는 망막 조직에 물질을 접촉시키고, 물질이 세포 또는 조직에 미치는 영향을 검출하는 것을 포함하는, 시험 물질의 독성 또는 효능 평가 방법.
  18. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 망막 세포 또는 망막 조직을 포함하는, 망막 조직의 장애로 인한 질환을 치료하기 위한 의약.
  19. 제 18 항에 있어서, 망막 세포가 망막 전구 세포 및/또는 망막층 특이적 뉴런인 의약.
  20. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 망막 세포 또는 망막 조직의 유효량을 이식을 필요로 하는 대상에게 이식하는 것을 포함하는, 망막 조직의 장애로 인한 질환의 치료 방법.
  21. 망막 조직의 장애로 인한 질환의 치료에서의 사용을 위한 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 망막 세포 또는 망막 조직.
  22. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 망막 세포 또는 망막 조직을 활성 성분으로서 포함하는 약학 조성물.
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