KR101712556B1

KR101712556B1 - 줄기세포를 망막신경절세포로 분화시키는 방법

Info

Publication number: KR101712556B1
Application number: KR1020140112638A
Authority: KR
Inventors: 박성섭; 김지연
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 서울대학교병원
Priority date: 2014-08-27
Filing date: 2014-08-27
Publication date: 2017-03-08
Also published as: EP3186364A4; US10570370B2; JP6493938B2; EP3186364A1; CN106795494B; KR20160025709A; JP2019208500A; CN106795494A; JP2017528163A; US20200157499A1; US20180016552A1; US11168302B2; WO2016032263A1

Abstract

본 발명은 줄기세포를 망막신경절세포로 분화하여 망막신경절세포를 제조하는 방법, 상기 방법으로 분화된 망막신경절세포, 상기 방법으로 분화된 망막신경절세포를 이용하여 망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질을 스크리닝하는 방법, 상기 방법으로 분화된 망막신경절세포를 포함하는, 망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질을 스크리닝하기 위한 키트, 상기 망막신경절세포를 포함하는 녹내장 또는 시신경병증의 치료용 약학적 조성물, 상기 망막신경절세포를 녹내장 또는 시신경병증 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 녹내장 또는 시신경병증의 치료방법 및 성숙망막신경절세포주를 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

줄기세포를 망막신경절세포로 분화시키는 방법{Method for differentiation into retinal ganglion cells from stem cells}

실명(失明)은 의학적으로 광각이 없는 것을 말하며, 현재 세계적으로 전 인구의 0.2-0.5%인 수천만 명의 환자가 앓고 있는 질환으로, 개인적, 사회적 및 경제적으로 커다란 손실을 가져오고 있다. 전 세계적으로 실명의 가장 큰 원인 중 하나는 망막의 녹내장 및 시신경병증이다. 녹내장은 가장 중요하고 널리 알려진 진행성 시신경의 질환으로, 비가역적으로 실명으로 이어지는 질환이다. 녹내장은 세계적으로 40세 이상 인구의 약 2-3%를 차지하는 매우 높은 유병률의 질환으로 세계적으로 2010년 약 6천만 명의 녹내장 환자가 있으며, 2020년에는 8천만 명의 환자가 있을 것으로 예상되고 있다(Quigley HA and Broman AT, Br J Ophthalmol 2006;90:262-267). 녹내장은 한창 사회적으로 활동하는 중장년층에서 2-3%의 유병률을 보이고, 향후 더욱 심화될 노령화 시대에는 환자 수가 크게 증가할 것으로 예상되며, 이는 중요한 사회경제적 문제점이 될 것이다. 녹내장의 치료에 있어, 현재 안압 조절이 임상에서 적용되는 유일한 치료법이나 상당수 환자는 실명으로 진행하는 것으로 알려져 있다. 또한, 안압하강은 녹내장의 진행을 일부 억제할 수 있는 보존적인 방법일 뿐, 근본적인 치료는 불가능한 것으로 알려져 있다.

한편, 시신경병증은 여러 원인에 의한 시신경의 병증을 총칭하며, 시신경염, 허혈성 시신경병증, 중독-영양시신경병증, 유전성시신경병증, 시신경위축증 등을 포함하는데 특히 이 중 시신경의 퇴행과 손상을 나타내는 질환들이 줄기세포 치료와 관련된다.

구체적으로, 녹내장은 망막신경절세포(retinal ganglion cell, RGC)의 퇴행과 파괴로 발생한다. 망막신경절세포는 눈에 들어온 빛이 광수용체세포(photoreceptor cell)에서 전기적 신호로 바뀐 후, 이 전기적 신호를 받아서 뇌의 시신경중추로 전달한다.

한편, 줄기세포/재생의학은 상기와 같은 녹내장과 시신경병증의 최적의 치료법이 될 수 있다. 단일 종류 세포의 퇴행과 파괴에 의한 질병은 줄기세포 치료의 최적의 후보이다. 특히, 눈은 수술적으로 외부에서 접근하기에 매우 용이한 장기이고 이미 여러 수술방법이 정립되어 있어 줄기세포를 병변 부위에 적용하는데 어려움이 없으며, 또한 치료약제 개발의 모델이 될 수 있다.

녹내장과 시신경병증에서 줄기세포 이용의 목표는 1) 퇴행 및 손상되거나 되어가는 RGC를 새로운 RGC로 대체하고(cell replacement therapy, neuro-regeneration) 2) 줄기세포 치료의 주변분비 효과(paracrine effects)로 항염증, 항세포사멸화, 신경보호, 혈관보호 등으로 퇴행 또는 손상된 RGC의 치료효과를 유도하고, 3) 줄기세포를 이용하여 아직 직접적인 치료제가 없는 녹내장 등의 질환에서 새로운 약제를 선별하여 개발하는 것에 있다. 이러한 치료법은 환자에서 유래된 만능줄기세포를 이용하여 맞춤 줄기세포 치료로 이어질 수 있다. 이러한 치료조성물의 개발이나 치료약물개발 모델의 개발을 위하여 절대적으로 필요한 것은 고효율의 망막신경절세포의 생산이다. 특히, 녹내장과 시신경병증의 경우, 질병에 따른 퇴행이나 손상된 망막신경절세포를 시험관에서 구현할 수 없는 탓에 정상 또는 병변 망막신경절세포를 이용한 새로운 약제의 개발 실험이 불가능한 문제점이 있었다. 따라서, 줄기세포로부터 망막신경절세포를 대량으로 생산할 수 있는 경우, 녹내장과 시신경병증과 같은 망막신경절세포와 관련된 질환의 모델 구축이 가능하게 되고, 이에 대한 약제의 개발이 보다 용이하게 되는 이점을 가질 수 있으며, 특히 환자 유래- 유도만능줄기세포에서 분화시킨 RGC(iPSC-RGC)를 생산하는 경우, 시신경의 퇴행을 예방하고 억제하는 새로운 약제의 개발이 가능하게 될 수 있다. 또한, 본 발명자들은 선행 특허(대한민국등록특허 제10-1268741호(2013.05.22.) 및 국제공개특허 WO2011/043591(2011.04.14.))를 통하여 줄기세포로부터 망막세포를 분화하는 방법을 개시한 바 있으나, 상기 문헌에 개시된 방법에 따르면 망막전구세포에서 망막신경절세포로 분화되기는 하였으나, 그 비율은 약 6%에 불과하였다. 따라서, 망막신경절세포로의 분화를 극대화할 수 있는 분화 방법의 개발이 여전히 요구되었다.

이러한 배경 하에 인간 배아줄기세포로부터 분화된 망막신경절세포를 생산하고자 하는 시도가 있었으나 그 성적은 저조하였으며, 이에 본 발명자들은 줄기세포로부터 망막신경절세포를 생산할 수 있는 방법을 새로이 개발하고자 예의 노력한 결과, 유전자 이식이나 망막조직과의 공배양(coculture) 없이, 화학적으로 규정된(defined) 배양 조건 하에서, 5주간의 짧은 기간 동안 인간 배아줄기세포를 고효율로 망막신경절세포로 분화시키는 방법을 개발하였다. 본 발명의 방법에 따라 개발한 망막신경절세포는, 세포 수에 있어서도 초기 분화유도 시의 인간 배아줄기세포보다 약 200배의 증가를 보이고, 신경생리학적으로 우수한 기능을 보이는 망막신경절세포임을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 (a) 망막기원세포(retinal progenitor cell)를 IGF1R(insulin-like growth factor-1 receptor) 작용제 및 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하여 미성숙망막신경절세포(immature retinal ganglion cell)로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 배지에서 Wnt 신호전달 작용제를 제거하고, IGF1R 작용제를 포함하는 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포를 성숙망막신경절세포(mature retinal ganglion cell)로 분화하여, 성숙망막신경절세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 미성숙망막신경절세포를 IGF1R 작용제 및 Shh(sonic hedgehog) 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 미성숙망막신경절세포를 성숙망막신경절세포로 분화하여, 성숙망막신경절세포를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 기술된 방법으로 수득된, 분리된 성숙망막신경절세포에 성숙망막신경절세포의 사멸억제 또는 증식촉진 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 후보물질 비처리군과 비교하였을 때, 상기 후보물질이 성숙망막신경절세포의 사멸 억제를 높이거나, 성숙망막신경절세포의 증식을 촉진시키는 경우, 성숙망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질로 각각 판정하는 단계를 포함하는, 성숙망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 기술된 본 발명의 방법에 따라 제조된 미성숙망막신경절세포 및 성숙망막신경절세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 성숙망막신경절세포를 포함하는, 성숙망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질을 스크리닝하기 위한 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 성숙망막신경절세포를 포함하는, 녹내장 또는 시신경병증의 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 성숙망막신경절세포를 녹내장 또는 시신경병증 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 녹내장 또는 시신경병증의 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 망막기원세포를 IGF1R 작용제 및 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하여 미성숙망막신경절세포로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 배지에서 Wnt 신호전달 작용제를 제거하고, IGF1R 작용제를 포함하는 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 포함하는, 성숙망막신경절세포주를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하나의 양태로서 (a) 망막기원세포(retinal progenitor cell)를 IGF1R(insulin-like growth factor-1 receptor) 작용제 및 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하여 미성숙망막신경절세포(immature retinal ganglion cell)로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 배지에서 Wnt 신호전달 작용제를 제거하고, IGF1R 작용제를 포함하는 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 포함하는, 줄기세포를 성숙망막신경절세포(mature retinal ganglion cell)로 분화하여, 성숙망막신경절세포를 제조하는 방법을 제공한다.

망막(retina)은 척추동물의 중추 신경계 내에서 가장 잘 연구된 기관으로, 과거 수십 년 동안 이루어진 연구에 의해 세포의 상세한 모양, 신경의 시냅스 연결, 각 망막신경세포들의 생리적 현상이 자세히 규명되었다. 그러나, 이와는 반대로, 망막 신경세포들의 구조의 발생과정 및 이들 세포들의 다양한 기능 기전에 대해서는 아직 많은 부분이 밝혀지지 않고 있다.

그 중 "망막신경절세포(retinal ganglion cell, RGC)"는 척추동물의 망막 내 존재하는 투사 출력(output) 신경세포로 이 세포들의 축삭(axon)은 모여서 시신경을 형성하고, 대뇌까지 투사된다. 망막신경절세포는 신경계의 구성단위인 뉴런(neuron), 즉 신경세포로서 다수의 수상돌기(dendrite)와 1개의 긴 섬유성 축삭을 가진다. 수상돌기는 다른 세포와 접합해 시냅스(synapse)를 이루며 신경세포의 전기활성을 조절해 세포체로 흘러 들어오는 전기적 자극을 전달한다. 축삭(axon)은 말단부위에 많은 가지를 가지며 과립(granule) 이나 소포(vesicle)가 있으며, 이곳에 신경자극에 의해 분비되는 신경전달물질이 함유되어 있다. 뉴런과 뉴런이 접합하여 충동을 전달하는 부분을 시냅스(synapse, 연접)라 하는데, 뉴로트랜스미터(neurotransmitter)라 불리는 화학물질이 시냅스의 갭(gap, 간극)을 통해 지나가고, 신경충동이 유지된다. 발생과정 중 망막신경절세포는 다능성인 망막기원세포(multipotent retinal progenitor cells)에서 생성된다. 그 예로 마우스의 경우, 태생기 11.5일(embryonic day (E) 11.5)부터 시작하여 출생 시까지(postnatal day (P) 0) 생성되며, E14.5에 그 생성이 절정에 이른다. 그 중에서도 주된 생성시기는 E14.5에서 E17.5까지로 알려져 있으며, 각 동물에 따라 시기에 가감이 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 망막신경절세포는 망막의 다양한 세포에서 생성된 시각 정보를 대뇌의 시신경 중추로 전달하는 역할을 수행한다. 눈에 들어온 빛은 광수용체 세포에서 전기적 신호로 바뀌고, 생성된 전기적 신호는 망막의 다양한 신경세포를 거쳐 최종적으로 망막신경절세포로 전달되며, 망막신경절세포는 이 신호를 받아서 뇌의 시신경중추로 전달하는 역할을 수행한다.

망막신경절세포의 발생은 계통적인 유전자 조절 네트워크(hierarchical gene regulatory network)에 의해서 조절되며, 중요 전사인자(transcription factors)들에 의해 생성 및 분화가 이루어진다.

이러한 망막신경절세포는 분화 정도에 따라 미성숙망막신경절세포 및 성숙망막신경절세포로 나눌 수 있다.

상기 "미성숙망막신경절세포"는 망막신경절세포로서의 세포 형태학적인 특성, 단백질 마커 및 유전자 마커의 특성을 획득한 세포를 말한다(Barres, et al, Neuron. 1988;1:791-803.). 상기 "성숙망막신경절세포"는 "미성숙망막신경절세포"의 상기 특성을 모두 지닌 이후의 뉴런(neuron, 신경)으로서의 성숙된 상태를 보이는 세포로 정의된다. 즉, 형태학적으로는 축삭(axon)의 성장, 축삭의 분지화(arbor), 축삭 링, 수상돌기(dendrite)의 분지화, 수상돌기의 계층화(stratification), 수상돌기의 링(ring), 수상돌기의 가시돌기(spiny process), 연접팽대(synaptic bouton) 등을 보이는 것으로 정의한다. 단백질 및 유전자 마커로의 특성으로는 시냅스-전부 소포(presynaptic vesicles) 및 시냅스-후부 소포(postsynaptic vesicles) 단백질의 형성을 보이며, 흥분(excitatory) 신경으로서의 특성을 나타내는 다양한 수용체의 특성을 나타낸다. "성숙망막신경절세포"의 전기생리학적인 특징은 자발적 흥분 시냅스-후부 전류[spontaneous excitatory postsynaptic currents(sEPSCs)]의 형성이며, 이는 망막신경절세포간의 시냅스 연결을 형성될 수 있음을 의미하는 기능적인 성숙을 의미한다(Pfrieger Barres, Science. 1997;277:1684-7.).

상기 "미성숙망막신경절세포"는 망막기원세포에서 망막신경절세포로의 분화 단계에서 초기 단계에 있는 세포를 말한다. 이러한 미성숙망막신경절세포는 망막기원세포에서 망막신경절세포로의 운명이 부여된 세포, 또는 망막신경절세포로의 운명이 부여된 세포로서 성숙망막신경절세포의 형태학적 특성 및 생리학적 특성을 완전히 가지지 않는 세포를 모두 포함한다. 또한, 본 발명에서 미성숙망막신경절세포는 조기망막신경절세포와 혼용된다.

상기 "성숙망막신경절세포"는 망막기원세포에서 망막신경절세포로의 분화 단계에서 후기 단계 또는 이러한 분화 과정이 종결된 망막신경절세포를 말한다. 상기 성숙망막신경절세포는 높은 진동수로 활동 전위(action potential)을 발생시킬 수 있는 생리학적 특성을 가지며, 긴 액손(axon)을 가지는 형태학적 특성이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 미성숙망막신경절세포 및 성숙망막신경절세포는 각각의 세포에 특이적으로 발현하는 마커의 발현 수준, 형태학적 특성 및 생리학적 특성(예, 전기화학적 특성)을 확인함으로써, 망막신경절세포가 미성숙 또는 성숙 중 어디에 위치하는지를 가늠할 수 있다.

먼저, 망막신경절세포의 발생 및 분화에 있어 매우 중요한 역할을 담당하는 전사인자들은 다음과 같다: 망막신경절세포 생성에 관여하는 전사인자로서, ATOH7(Math5), Brn3 패밀리(Brn3A, Brn3B, Brn3C) 및 Isl1(Islet-1)이 있다.

ATOH7은 망막기원세포에 망막신경절세포로의 운명을 부여하는 인자로 망막신경절세포 형성에 필수적 역할을 하며, Math5로도 명명된다. 따라서, 상기 미성숙망막신경절세포는 Math5를 발현함이 바람직하다.

또한, 유전자 네트워크상 ATOH7 하부에 위치하는 POU4F2와 POU4F1(또는 각각 Brn3B와 Brn3A로도 불림) 및 Isl1(Islet-1)은 RGC 탄생에는 요구되지는 않는다고 알려져 있지만, RGC 분화 및 생존에 절대적으로 요구되는 것으로 알려져 있으며, 망막신경절세포의 분화 초기 단계부터 발현하여 성숙망막신경절세포에서도 발현될 수 있는 것으로 알려져 있다.

구체적으로, Brn3 패밀리는 발생 과정 동안 RGC의 분화조절, RGC의 수상돌기의 계층화(stratification) 및 RGC 축삭의 돌출에 관여한다. Brn3 패밀리 중 Brn3B는 RGC 생성 순간 이미 발현되어 있는 인자로서, RGC의 가장 초기 마커 중 하나로, RGC 축삭 성장 및 생존에 중요한 인자로 작용한다.

Brn3A는 마우스 경우 태생기 12.5일(E12.5) 부터 발현이 시작되며, 랫트에서는 RGC 개체수의 92.2%에서 발현된다고 알려져 있다. Brn3B는 RGC 축삭 발생에 작용하는 반면, Brn3A는 수상돌기 형성에 관여하는 것으로 알려져 있다.

Isl1은 LIM 호메오박스(homeobox) 단백질로 망막 발생과정 중 발현된다. Isl1 유전자는 RGC 생성 직후에 활성화되며, 발현은 마우스 태생기 E14.5일 전에는 POU4F2와 동일한 것으로 알려져 있다. 또한, Isl1은 RGC 분화와 생존에 요구되는 인자이며, 발현은 ATOH7의 지배를 받는 것으로 알려져 있다. Isl1은 마우스 태생기 E11.5일에 분열이 끝난 세포에서 처음으로 발현이 시작되며, Brn3B 양성인 RGC의 일부 세포에서 Brn3B와 겹쳐서 발현되는 것으로 보고된 바 있다.

상기와 같은 전사인자들은 망막신경절세포의 생성에 중요한 역할을 수행하므로, 미성숙망막신경절세포는 (1) Math5를 발현하고/하거나, (2) Brn3B, Brn3A 및 Islet1으로 이루어진 군에서 선택된 1개, 구체적으로는 2개, 보다 구체적으로는 3개의 유전자를 발현할 수 있다. 또한, 이러한 마커 유전자의 발현은 망막기원세포에 비하여 발현이 증가되어 있을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 미성숙망막신경절세포는 NF200 또는/및 Tuj1이 발현된 것일 수 있다. 상기 NF200은 뉴로필라멘트 200kDa로 명명되는 단백질로서, 망막신경절세포의 분화 초기부터 발현될 수 있는 것으로 알려져 있다. 또한, Tuj1 역시 망막신경절세포의 분화 초기부터 발현될 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 두 유전자 역시 망막신경절세포, 구체적으로 미성숙망막신경절세포 및 성숙망막신경절세포의 판별에 이용될 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 추가로 성숙망막신경절세포에 특이적인 마커 유전자에는, Thy1.2, TrkB, NMDAR1, Map2, Vglut1, PSD-95, 시냅토피신(Synaptophysin), 시냅신1(Synapsin1) 등이 있다. 상기 유전자들은 성숙망막신경절세포에서 발현되는 것으로 알려진 마커 유전자이다.

따라서, 성숙망막신경절세포는 Brn3B, Brn3A, Islet-1, NF200, Tuj1, Thy1.2, TrkB, NMDAR1, Map2, Vglut1, PSD-95, 시냅토피신(Synaptophysin) 및 시냅신1(Synapsin1)으로 이루어진 군에서 선택된 1개, 구체적으로는 2개, 보다 구체적으로는 3개, 보다 더 구체적으로는 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 및 10개의 마커 유전자를 발현할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 유전자들은 망막기원세포 또는 미성숙망막신경절세포에 비하여 발현이 증가되어 있는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법은 이와 같은 미성숙망막신경절세포, 또는 이를 거쳐 성숙망막신경절세포를 상기 망막기원세포로부터 고효율로 분화시킬 수 있는 방법으로서, 망막기원세포를 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하여 미성숙망막신경절세포로 분화시킨 다음, 이를 Wnt 신호전달 작용제가 없는 배지에서 배양하여 성숙망막신경절세포로 분화를 유도하는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명의 기술적 특징은 줄기세포의 일정 분화시기에 Wnt 신호전달 작용제를 처리하여 망막신경절세포의 운명을 부여하고, 그 다음 Wnt 신호전달 작용제를 제거하여 다양한 망막세포 군 중 60~95% 이상을 성숙망막신경절세포로 제조하는 것을 특징으로 하며, 이러한 성숙망막신경절세포로의 고분화 유도는 본 발명자들이 최초로 개발한 것이다.

본 발명의 방법에 대하여 구체적으로 기술하면 하기와 같다.

구체적으로, 본 발명의 방법에서 상기 (a) 단계는 망막기원세포를 IGF1R 작용제 및 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하여 미성숙망막신경절세포(immature retinal ganglion cell)로 분화시키는 단계이다. 상기 (a) 단계는 1 내지 10일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "망막기원세포(retinal progenitor cell)"는 망막에 존재하는 세포 또는 망막색소상피세포 등으로 분화될 수 있는 다분화능(multipotency)을 가진 기원세포를 말한다. 상기 망막기원세포는 Rax, Pax6, Chx10, Otx2, Sox2, Lhx2, Six3, Six6 및 Mitf으로 이루어진 군에서 선택된 마커가 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상 발현되는 특징, 특히 Rax 및 Pax6가 1개 또는 2개 발현되는 특징을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 망막기원세포는 상기 기술한 바와 같이 망막 발생과정과 관련하여 다양한 종류의 망막 내 세포(간상체 및 원추체 광수용체세포, 망막신경절세포, 수평세포, 두극세포, 무축삭세포, 뮐러아교세포 등)와 망막색소상피세포로 분화할 수 있으며, 그에 따른 발현 특징으로, Crx, 리커버린, 로돕신, 빨강/초록옵신, 파랑옵신, 페리페린2, PDE6B, SAG, Islet1/NF200, Prox1, PKC-a, Hu C/D, GFAP, ZO-1, RPE65 등에 해당하는 마커가 양성을 보일 수 있다. 그러나, 이와 같은 마커들의 발현은 성숙한 망막세포들이나 망막색소상피에서보다 강도가 미약하고, 발현의 양성비율은 낮을 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 망막기원세포를 미성숙망막신경절세포로 분화시키기 위한 배지는 IGF1R 작용제 및 Wnt 신호전달 작용제를 모두 포함하는 것을 특징으로 한다. 또한 구체적으로, 상기 망막기원세포를 미성숙망막신경절세포로 분화시키기 위한 배지는 특별히 이에 제한되지 않으나, IGF1R 작용제 및 Wnt 신호전달 작용제 외에도 BMP(bone morphogenetic protein) 신호전달 억제제 및 FGF(fibroblast growth factor) 신호전달 작용제를 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 배지는 상기 기술한 물질 외에 1% B27 보충제 및 1% N2 보충제(N2 supplement)를 포함하는 DMEM/F12 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "IGF1R 작용제"는 세포막에 존재하는 타이로신 키나제 수용체의 일종인 IGF-1 수용체(insulin-like growth factor-1 receptor, IGF1R)를 활성화시켜, 활성화된 IGF1R이 세포 내에서 인슐린 수용체의 기질(insulin receptor substrate: IRS)들의 결합장소가 되도록 작용하는 물질을 의미한다. IGF1R에 의해 활성화된 IRS은 다시 PI3K, Akt, mTOR로 이루어진 경로와 Raf, MEK, ERK의 경로 등을 활성화시킴으로써 세포에 작용하게 된다(Ryan & Goss, Oncologist. 2008; 13: 16-24). IGF1R 작용제에는, IGF-1, IGF-2 등이 있다. IGF-1은 인슐린과 유사한 분자구조를 지니며 세포성장, 세포증식, 분화, 세포사멸 등에 관여하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 IGF1R 작용제는 IGF1R을 활성화시킬 수 있는 물질이라면 제한없이 사용할 수 있고, 그 예로 IGF-1 또는 IGF-2이 있으며, 구체적으로는 IGF-1이나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 망막기원세포를 미성숙망막신경절세포로 분화시키는 배지에 사용되는 IGF1R 작용제의 농도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 0.01~100 ng/ml이며, 보다 구체적으로는 0.1~50 ng/ml, 보다 더 구체적으로는 1~20 ng/ml이며, 가장 구체적으로는 10 ng/ml이다.

본 발명에서 용어, "Wnt 신호전달 작용제"는 배아 발생기 동안 세포운명 결정, 구조의 재구성, 극성, 형태, 유착 및 성장, 미분화 세포의 유지와 증식 등과 같은 다양한 과정을 조절하는 것으로 알려진 Wnt 신호전달계에서 신호전달을 활성화하는 물질을 의미한다. 이때, Wnt 신호전달 작용제는 Wnt에 의해 매개되는 신호를 전달하거나, 베타-카테닌에 의해 매개되는 신호를 전달할 수 있는 것인 한, 제한 없이 포함될 수 있다. Wnt 신호전달은 Wnt 신호전달 활성화를 유발하는 최초 물질인 Wnt와 그 수용체의 결합에 의해 시작되어 유도되는 반응 및 세포 내 Wnt 신호전달의 하위 효과물질인 베타-카테닌(beta-catenin)의 안정화로 인해 매개되는 일련의 반응을 포함한다. Wnt 신호전달 작용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 다음과 같다.

1) Wnt 단백질의 직접적 첨가: Wnt 신호전달을 유발하는 최초 물질인 Wnt는 분비성 당단백질로 19종류가 알려져 있다: Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16b 등이 있다.

2) 베타-카테닌을 증가시키는 물질: 대부분의 세포는 베타-카테닌 증가에 의해 Wnt 신호전달에 반응한다. 즉, 베타-카테닌의 비인산화형(또는 안정화) 증가는 세포의 핵 내의 베타-카테닌 유입의 증가를 의미한다.

3) Dishevelled의 인산화 또는 Wnt의 보조수용체인 LRP 꼬리의 인산화.

4) GSK3(glycogen synthase kinase 3: 글리코겐 합성효소 키나제 3)의 억제제: 리튬(Li), LiCl, 이가 아연(bivalent Zn), BIO(6-bromoindirubin-3'-oxime), SB216763, SB415286, QS11 수화물(QS11 hydrate), TWS119, 켄폴론(Kenpaullone), 알스터폴론(alsterpaullone), 인디루빈-3-옥심(Indirubin-3′-oxime), TDZD-8, Ro 31-8220 메탄설폰산염(Ro 31-8220 methanesulfonate salt) 등이 있다.

5) Axin, APC 등과 같은 Wnt 신호전달계의 음성적 조절자(negative regulator)를 억제하는 물질이나, RNAi 등이 있다.

6) 노린(Norrin), R-스포딘 2(R-spondin2) 등과 같이 Wnt 신호전달계를 활성화시킬 수 있는 단백질: 노린은 Frizzled 4 수용체와 결합하며, R-스포딘 2는 Frizzled 8 및 LRP6와 반응한다.

7) 트랜스펙션(transfection) 등을 포함하는 유전자 전이(gene transfer): Wnt 과발현 구성물 또는 베타-카테닌 과발현 구성물을 이용할 수 있다.

본 발명에서 상기 Wnt 신호전달 작용제는 Wnt 신호전달을 활성화시킬 수 있는 물질은 제한 없이 사용할 수 있으며, 구체적으로는 Wnt1, Wnt2, Wnt2b, Wnt3, Wnt3a, Wnt4, Wnt5a, Wnt5b, Wnt6, Wnt7a, Wnt7b, Wnt8a, Wnt8b, Wnt9a, Wnt9b, Wnt10a, Wnt10b, Wnt11, Wnt16b; 베타-카테닌을 증가시키는 물질; 리튬, LiCl, 이가 아연, BIO, SB216763, SB415286, CHIR99021, QS11 수화물, TWS119, 켄폴론, 알스터폴론, 인디루빈-3-옥심, TDZD-8 또는 Ro 31-8220 메탄설폰산염인 GSK3 억제제; Axin 억제제, APC 억제제, 노린 또는 R-스폰딘 2이며, 보다 구체적으로는 Wnt3a, Wnt1, Wnt5a, Wnt11, 노린, LiCl, BIO 또는 SB415286이나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 망막기원세포를 미성숙망막신경절세포로 분화시키는 배지에 사용되는 Wnt 신호전달 작용제의 농도는, 상기 Wnt 신호전달 작용제 중 LiCl, BIO 및 SB415286를 제외한 나머지는 0.01~500ng/ml이며, 구체적으로는 0.1~200ng/ml이며, 더 구체적으로는 1~100ng/ml이다. 상기 Wnt 신호전달 작용제 중 LiCl의 배지 내 농도는 0.1~50 mM이고, 구체적으로는 0.5~10 mM이며, 더 구체적으로는 1~10 mM이며; BIO의 배지 내 농도는 0.1~50 μM이고, 구체적으로는 0.1~10 μM이며, 더 구체적으로는 0.5~5 μM이며; SB415286의 배지 내 농도는 0.1~500 μM이고, 구체적으로는 1~100 μM이며, 더 구체적으로는 5~50 μM이다.

본 발명에서 용어, "BMP 신호전달 억제제"는 BMP 신호전달을 억제하는 물질 군을 의미한다. BMP들은 TGF-β(transforming growth factor-β) 슈퍼 패밀리에 속하는 신호전달계 단백질로서 초기 태생기 분화, 태생기 조직형성 및 성인 조직의 항상성 유지 등을 조절한다. 세포 외로 분비된 BMP들은 세포막의 타입 I과 타입 II 세린/쓰레오닌 키나제(serine/threonine kinase) 수용체들에 결합하여 BMP 신호전달을 시작하게 된다. 타입 II 수용체는 타입 I 수용체를 인산화시키고, 인산화된 타입 I 수용체는 세포내의 기질인 스매드(Smad) 단백질을 인산화시켜 세포 내의 신호전달이 이루어진다. 수용체에 의해 조절되는 스매드 단백질을 R-스매드(Receptor regulated Smad)라고 하며, 스매드-1, 2, 3, 5 및 8 들이 R-스매드에 속한다. 이들은 세포 내의 파트너인 Co-스매드(Common partner Smad)인 Smad-4와 결합하여 세포핵 내로 이동하여 전사인자와 결합하여 목표 유전자들의 전사를 조절한다(Yamamoto & Oelgeschlager, Naturwissenschaften. 2004; 91: 519-34). BMP 신호전달 억제제는 세포 외에 존재하는 BMP와 세포표면의 이의 수용체와의 결합을 막는 물질들을 포함한다. 이러한 BMP 신호전달 억제제의 예로는 노긴(Noggin), 코르딘(Chordin), 트위스트 낭배형성 인자(Twisted gastrulation, Tsg), 서버러스(Cerberus), 코코(Coco), 그렘린(Gremlin), PRDC(Protein related to DAN and Cerberus), DAN(differential screening-selected gene aberrative in neuroblastoma), 단테(dante), 폴리스타틴(follistatin), USAG-1(uterine sensitization-associated gene 1), 도조모르핀(dorsomorphin) 또는 스클레로스틴(Sclerostin) 등이 있다. 이 중 노긴은 BMP 신호전달의 활성을 억제하여 신경조직을 유도하고 배쪽의 신경 외배엽이나 중배엽을 등쪽화시킨다. 노긴은 BMP 그룹 중 BMP-2, BMP-4, BMP-7과 결합하여, 상기 BMP가 그들의 수용체에 결합하는 것을 방해할 수 있다(Yanagita, Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16: 309-17).

본 발명에서 상기 BMP 신호전달 억제제는 BMP 신호전달을 억제시킬 수 있는 물질은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로는 노긴, 코르딘, 트위스티드 낭배형성 인자, 서버러스, 코코, 그렘린, PRDC, DAN, 단테(dante), 폴리스타틴(follistatin), USAG-1(uterine sensitization-associated gene 1), 도조모르핀(dorsomorphin) 또는 스클레로스틴이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 노긴을 사용하였다.

본 발명에서 상기 망막기원세포를 미성숙망막신경절세포로 분화시키는 배지에 사용되는 BMP 신호전달 억제제의 농도는 0.01~100 ng/ml이며, 구체적으로는 0.1~50 ng/ml이며, 더 구체적으로는 0.5~20 ng/ml이며, 가장 구체적으로는 10 ng/ml이나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "FGF 신호전달 작용제"는 FGF 신호전달을 유도 혹은 촉진할 수 있는 물질을 의미한다. 상기 FGF는 세포증식, 세포분화 등을 비롯해 분열 촉진 인자, 혈관 생성 인자, 뼈 형성 인자 및 신경 영양 인자 등으로 작용하는 물질로서, FGF 패밀리는 지금까지 22 종류가 알려져 있다. 이들은 4 종류의 FGF 수용체들(FGFR) 각각의 mRNA가 선택적으로 짜깁기된 다양한(alternatively spliced) 형태의 수용체와 결합하여 FGFR을 활성화시킨다. 활성화된 FGFR은 세포질 내 Ras, Raf, Mek 등의 단계별 반응을 통해 MAP 키나제를 활성화시키고, 활성화된 MAP 키나제에 의해 신호전달이 유도될 수 있음이 알려져 있다(Bottcher & Niehrs, Endocr Rev. 2005;26:63-77). FGF 패밀리 중 FGF2는, basic FGF(bFGF)라고도 불리며, 주로 FGFR 1b, FGFR 1c, FGFR 2c, FGFR 3c, FGFR 4Δ를 활성화시키며, 특히 FGFR 1c, FGFR 3c를 강력히 활성화시킨다. FGFR 1c, FGFR 3c를 활성화시키는 작용제와 FGF1, FGF4, FGF8, FGF9, FGF17, FGF19 등이 대체물질로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 FGF 신호전달 작용제는 FGF 신호전달을 활성화 시킬 수 있는 물질이라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로 FGFR 1c 또는 FGFR 3c를 활성화시키는 물질, FGF1, FGF2, FGF4, FGF8, FGF9, FGF17 또는 FGF19 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 실시예에서는 FGF2를 사용하였다.

또한, 본 발명에서 상기 망막기원세포를 미성숙망막신경절세포로 분화시키는 배지에 사용되는 FGF 신호전달 작용제의 농도는 0.01~100 ng/ml이며, 구체적으로는 0.1~50 ng/ml이며, 더 구체적으로는 1~20 ng/ml이며, 가장 구체적으로는 5 ng/ml이나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 (a) 단계의 망막기원세포는 (a') 줄기세포를 IGF1R 작용제, Wnt 신호전달 억제제 및 BMP 신호전달 억제제를 포함하는 배지에서 배양하여 부유 응집체 형태의 안구영역전구체(eye field precursor)로 분화시키는 단계; 및 (b') 상기 (a') 단계의 부유 응집체 형태의 안구영역전구체를 (a') 단계의 배지에 추가로 FGF 신호전달 작용제를 첨가한 배지에서 배양하여 망막기원세포(retinal progenitor cell)로 분화시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것일 수 있다.

망막기원세포로 분화될 수 있는 상기 줄기세포는, 망막기원세포로 분화될 수 있는 줄기세포라면 그 종류에 특별히 제한되지 않으나, 골수줄기세포(bone marrow stem cell, BMS), 제대혈줄기세포(cord blood stem cell), 양수줄기세포(amniotic fluid stem cell), 지방줄기세포(fat stem cell), 망막줄기세포(retinal stem cell, RSC), 망막 내 뭘러아교세포, 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도 전분화능 줄기세포(induced pluipotent stem cell, iPSC) 및 체세포핵치환줄기세포(somatic cell nuclear transfer cell, SCNT)로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

이러한 줄기세포는 IGF1R 작용제, Wnt 신호전달억제제 및 BMP 신호전달 억제제를 포함하는 배지에서 배양함으로써, 안구영역전구체로 분화될 수 있다. 여기서, 상기 IGF1R 작용제, BMP 신호전달 억제제 및 이의 사용 농도의 경우, 앞서 설명한 미성숙망막신경절세포로 분화시키는 배지에 적용되는 내용과 같다.

본 발명에서 용어, "Wnt 신호전달 억제제"는 세포 외에 존재하는 Wnt 단백질과 세포막에 존재하는 Frizzled 수용체나 보조수용체인 LRP 사이의 결합을 방해하거나, 세포 내에서 Wnt에 의해 매개되는 신호전달을 억제하는 등으로 Wnt에 의한 신호전달을 억제하는 물질을 의미한다. Wnt 신호전달 억제제는, Wnt에 의해 매개되는 신호전달을 억제할 수 있는 것인 한 특별히 한정되지 않는다. Wnt 신호전달 억제제의 예로는, 보조수용체인 LRP의 억제제의 일종인 Dkk(Dickkopf) 패밀리(Dkk-1, Dkk-2, Dkk-3 및 Dkk-4), Wise, Wnt 수용체 억제제(sFRP: secreted Frizzled-related protein) 패밀리, Frizzled의 CRD 결합 도메인(Frizzled-CRD domain)，WIF-1(Wnt inhibitory factor-1), IWP-2, IWP-3, IWP-4, 서버러스, Wnt 항체, 도미넌트 네가티브 Wnt 단백질, Axin의 과발현, GSK(글루코겐 합성효소 키나제)의 과발현, 도미넌트 네가티브 TCF, 도미넌트 네가티브 Dishevelled 또는 카제인 키나제 억제제(CKI-7, D4476 등) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는 Dkk-1을 사용하였다.

또한, 본 발명에서는 상기 Wnt 신호전달 억제제 이외에 RNAi와 같이 Wnt 신호전달계에 관여하는 각각의 구성요소를 억제하는 방법을 통해 Wnt 신호전달을 억제할 수도 있다.

상기 줄기세포를 안구영역전구체를 거쳐 망막기원세포로 분화시키기 위해 사용되는 Wnt 신호전달 억제제의 배지 내 농도는 0.01 내지 10,000ng/ml일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "안구영역전구체(eye field precursor)"는 태아발생기 분화과정에서 전뇌 신경판의 안구영역(eye field)을 구성하는 기원세포에 특이적인 마커들(eye field transcription factors; Zuber, et al., Development. 2003; 130: 5155-67)을 발현하는 기원세포를 의미한다. 상기 안구영역전구체는 Six3, Rax, Pax6, Otx2, Lhx2 및 Six6으로 이루어진 군에서 선택된 마커들이 1개 이상, 2개 이상 또는 3개 이상 발현되는 특징을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 안구영역전구체는 부유 응집체 형태를 가지는데, 여기서 부유 응집체란 배아줄기세포들의 집락을 마우스 섬유아세포(MEF) 영양세포주와 혈청의 공급 없이 비접착성의 배양기에서 최소 1일 동안 배양했을 때 형성되는 배지 내에 떠있는 세포 덩어리를 말한다. 공급되는 배지의 조성에 따라 안구영역 전사인자를 발현하는 안구영역전구체의 성격을 가질 수 있다.

또한, 상기 (a') 단계는 1일 내지 30일 동안 수행되고, 상기 (b') 단계는 5일 내지 15일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 (b') 단계에서 부유 응집체 형태의 안구영역전구체는 폴리-디-라이신, 라미닌, 폴리-L-라이신, 매트리젤(matrigel), 아가(agar), 폴리오르니틴(polyornithine), 젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin) 및 비트로넥틴(vitronectin)으로 이루어진 군에서 선택되는 세포 외 기질(extracellular matrix)로 코팅된 플레이트에 접착된 상태로 배양되는 것일 수 있다.

상기 플레이트에 접착시키는 부유 응집체 당 세포수는 최적의 효율을 나타낼 수 있는 세포수일 수 있으며, 200 내지 400개의 세포로 이루어진 부유 응집체 형태의 안구영역전구체일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 상기 (a') 단계의 배지는 IGF1R 작용제, Wnt 신호전달 억제제 및 BMP 신호전달 억제제 외에도 10% 넉아웃 혈청 대체제 및 1% B27 보충제(B27 supplement)를 추가로 포함하는 DMEM/F12 배지일 수 있다.

한편, 상기 (b') 단계의 배지는 상기 기술된 IGF1R 작용제, Wnt 신호전달 억제제, BMP 신호전달 억제제 및 FGF 신호전달 작용제 외에도 1% B27 보충제 및 1% N2 보충제(N2 supplement)를 추가로 포함하는 DMEM/F12 배지일 수 있다.

본 발명의 방법에서, (b) 단계는 상기 (a) 단계에서 분화된 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계로서, (b) 단계를 통하여 미성숙망막신경절세포가 성숙망막신경절세포로 분화될 수 있다.

성숙망막신경절세포로의 고효율 분화를 위하여, (b) 단계에서 사용하는 배지는 (a) 단계의 배지에 포함되어 있던 Wnt 신호전달작용제가 포함되지 않은 것을 특징으로 한다.

보다 구체적으로, 상기 (b) 단계는 상기 기술된 (a) 단계의 배지에 포함되어 있던 BMP 신호전달 억제제, FGF 신호전달 작용제 및 Wnt 신호전달 작용제를 제거한 배지에서 상기 (a) 단계를 거친 세포를 배양하는 단계, 보다 구체적으로 상기 기술된 (a) 단계의 배지에 포함되어 있던 BMP 신호전달 억제제, FGF 신호전달 작용제 및 Wnt 신호전달 작용제를 제거하고, Shh(sonic hedgehog) 신호전달 작용제를 추가로 첨가한 배지에서 세포를 배양하는 단계일 수 있다.

또한, 상기 (b) 단계는 (i) 상기 (a) 단계의 배지에서 Wnt 신호전달 작용제를 제거하여, IGF1R 작용제, BMP 신호전달 억제제 및 FGF 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계; 및 (ii) 상기 (i) 단계의 배지에서 BMP 신호전달 억제제 및 FGF 신호전달 작용제를 제거하고, Shh 신호전달 작용제를 추가로 첨가한 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

한편, 상기에서 기술되고 본 발명에서 사용되는 용어 "제거"라 함은 제거의 대상이 되는 물질을 포함시키지 않은 배지를 사용한다는 의미로 해석될 수 있는 것이다.

또한, 상기 배지는 상기 기술한 물질 외에 1% B27 보충제 및 1% N2 보충제(N2 supplement)를 포함하는 DMEM/F12 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "Shh(sonic hedgehog) 신호전달 작용제"는 Shh 신호전달을 유도 또는 촉진시키는 물질을 말한다. Shh는 배아 발생기 동안 세포운명 결정, 극성, 형태, 증식, 분화 등과 같은 다양한 과정을 조절하는 신호전달 물질로 알려져 있다(Bertrand & Dahmane, Trends Cell Biol. 2006; 16: 597-605). Shh 신호전달은 세포막에 존재하는 Ptc(Patched)와 Smo(Smoothened) 단백질에 의해 전달되는 것으로 알려져 있다. Shh가 없는 경우, Ptc는 Smo와 결합하여 Smo를 억제한다. 반면에 Shh가 존재하는 경우, Shh가 Ptc와 결합하면, Ptc에 의한 Smo의 억제작용이 풀리면서 세포질 내 존재하는 Ci/Gli 단백질이 핵내로 유입되어 목표 유전자들의 전사 활성화 인자로 작용하게 된다. Shh 신호전달 작용제는, Shh에 의해 매개되는 신호전달을 증강할 수 있는 것인 한, 특별히 한정되지 않는다. Shh 신호전달 작용제로서는, 예를 들면, 헤지호그 패밀리에 속하는 단백질(예를 들면, Shh), Ptc에 의한 Smo 억제작용의 억제제, Smo 수용체의 활성화 물질, Shh 수용체 작용제(예를 들면, Hg-Ag, 퍼모파민(Purmorphamine)), Ci/Gli 단백질 패밀리를 증가시키는 물질, Ci/Gli 단백질의 세포내 분해억제제, 트랜스펙션 등을 이용한 Shh 과발현 구성물 또는 Ci/Gli 과발현 구성물 등을 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 상기 Shh 신호전달 작용제는 Shh 신호전달을 활성화시킬 수 있는 물질은 제한 없이 사용할 수 있으며, 그 예로는 Shh, Smo 수용체의 활성화 물질, Ptc에 의한 Smo 억제 작용의 억제제, Ci/Gli 단백질 패밀리를 증가시키는 물질, Ci/Gli 단백질의 세포 내 분해 억제제 또는 Shh 수용체 작용제인 Hg-Ag 또는 퍼모파민 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 Shh 신호전달 작용제의 보다 구체적인 예로는 Shh 또는 퍼모파민을 들 수 있다.

본 발명에서, 상기 미성숙망막신경절세포를 성숙망막신경절세포로 분화시키는 배지에 사용되는 Shh 신호전달 작용제의 농도는 0.1~5,000 ng/ml이며, 구체적으로는 1~2,500 ng/ml이며, 더 구체적으로는 10~1,000 ng/ml이며, 가장 구체적으로는 250 ng/ml이나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

이러한 (b) 단계는 1 내지 120일 동안 수행될 수 있다.

성숙망막신경절세포로의 고효율 분화를 위하여, 상기 방법은 (c) 상기 (b) 단계의 배지에서 추가로 RA(retinoic acid)를 포함하는 배지에서 상기 (b) 단계에서 배양된 세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "RA(retinoic acid)"는 친유성(lipophilic) 분자이며 비타민 A의 대사산물로 알려져 있는 물질이다. RA는 트란스형 레티노산(all-trans retinoic acid)과 시스형 레티노산(9-cis retinoic acid) 형태가 존재하며 이들은 핵 내로 유입된 후 각각 RARs(Retinoic Acid Receptors)과 RXR(Retinoid X Receptor) 수용체와 결합하여 목표 유전자의 전사를 조절하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법에 사용하는 상기 RA는 트란스형 레티노산 또는 시스형 레티노산을 사용할 수 있으며, 이때 사용하는 RA의 농도는 0.5~10,000nM, 구체적으로는 5~5,000nM이며, 더 구체적으로는 50~2,000nM, 더욱 더 구체적으로는 500 nM일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

이러한 (c) 단계는 1 내지 120일 동안 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명의 방법은 (d) 상기 (c) 단계의 배지에서 IGF1R 작용제, Shh 신호전달 작용제 및 RA로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 성분, 보다 구체적으로는 IGF1R 작용제, Shh 신호전달 작용제 및 RA를 모두 제거한 배지에서 미성숙망막신경절세포 또는 성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면 성숙이 진행된 미성숙망막신경절세포의 경우, 이를 IGF1R 작용제, Shh 신호전달 작용제 및 RA를 모두 제거한 배지에서 배양하여 성숙시키는 경우에도 상기 성분을 모두 포함하는 배지에서 배양한 경우와 동등한 정도의 성숙도를 보임을 확인하였다.

또한, 본 발명의 방법은 상기 기술한 단계 수행 후 목적하는 세포, 예컨대 (a) 단계 수행 후 미성숙망막신경절세포의 분화 여부를 판정하거나, (b), (c) 또는 (d) 단계 수행 후 성숙망막신경절세포의 분화 여부를 판정하는 단계를 포함할 수 있다.

목적하는 세포, 구체적으로 미성숙망막신경절세포 및 성숙망막신경절세포의 분화 여부는 상기 세포에 특이적인 마커 유전자의 발현을 측정하고/하거나, 형태학적 특성을 확인하고/하거나, 생리학적 특성을 확인하여 수행될 수 있다.

이러한 마커 유전자의 발현 측정은 상기 마커 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 측정함으로써 수행할 수 있으며, 이러한 발현 수준 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

상기 마커 유전자의 mRNA 수준에서의 발현 여부는 mRNA를 확인하기 위한 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 그 예로 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩을 이용하여 판별할 수 있다.

또한 마커 유전자의 단백질 수준에서의 발현 여부는 단백질을 확인하기 위한 당업계에 공지된 방법을 제한 없이 사용할 수 있으나, 그 예로 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석법 또는 단백질 칩을 이용하여 판별할 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 분화시킨 성숙망막신경절세포는 분화 전 단계인 망막기원세포와 비교하여 하기의 특징들 중 하나 이상을 나타낼 수 있다.

(1) Brn3B 발현 증가; (2) Brn3A 발현 증가; (3) Islet1 발현 증가; (4) NF200 발현 증가; (5) TuJ1 발현 증가; (6) Thy1.2 발현 증가; (7) TrkB 발현 증가; (8) NMDAR1 발현 증가; (9) Map2 발현 증가; (10) Vglut1 발현 증가; (11) PSD-95 발현 증가; (12) Synaptophysin 발현 증가; 및 (13) Synapsin1 발현 증가.

상기 유전자의 발현의 증가 또는 감소의 확인은 상기 유전자가 코딩하는 단백질에 대한 항체를 사용하거나 또는 RT-PCR 등의 당업자에게 잘 알려진 방법에 의해 수행될 수 있다. 상기의 특성을 많이 가질수록 성숙망막신경절세포로 특정할 수 있는데, 성숙망막신경절세포는 상기 특성 중 1개 이상, 구체적으로는 2개 이상, 보다 구체적으로는 3개 이상, 보다 더 구체적으로는 4개 이상, 가장 구체적으로는 5개 이상을 갖는 세포임이 바람직하다. 본 발명의 방법으로 분화시킨 세포의 약 40%, 60%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 이상이 목적하는 특성을 갖는 세포인 것이 바람직하며, 상기 비율이 증가할수록 더욱 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 미성숙망막신경절세포를 IGF1R 작용제 및 Shh 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 미성숙망막신경절세포를 성숙망막신경절세포로 분화시키는 방법을 제공한다.

상기 미성숙망막신경절세포, IGF1R 작용제, Shh 신호전달 작용제 및 성숙망막신경절세포에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 성숙망막신경절세포로 분화시키는 방법에 적용되지 않는 배지는 Wnt 신호전달 작용제를 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 방법에서 IGF1R 작용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로 0.01~100 ng/ml이며, 보다 구체적으로는 0.1~50 ng/ml, 보다 더 구체적으로는 1~20 ng/ml이며, 가장 구체적으로는 10 ng/ml의 농도로 사용될 수 있다.

또한, 상기 방법에서 Shh 신호전달 작용제는 특별히 이에 제한되지 않으나, 0.1~5,000 ng/ml이며, 구체적으로는 1~2,500 ng/ml이며, 더 구체적으로는 10~1,000 ng/ml이며, 가장 구체적으로는 250 ng/ml의 농도로 사용될 수 있다.

또한, 상기 배지는 상기 기술한 물질 외에 1% B27 보충제 및 1% N2 보충제 (N2 supplement)를 포함하는 DMEM/F12 배지일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 방법은 상기 IGF1R 작용제 및 Shh 신호전달 작용제를 포함하는 배지에 RA(retinoic acid)가 추가로 첨가된 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 여기서, 첨가라 함은 배지에 물질을 더하는 의미 외에도 기존 배지 조성에 상기 물질을 포함한 배지로 기존 배지를 교체하였다는 의미로도 해석될 수 있는 것이다.

여기서, RA에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같으며, 사용하는 RA의 농도는 0.5~10,000nM, 구체적으로는 5~5,000nM이며, 더 구체적으로는 50~2,000nM, 더욱 더 구체적으로는 500 nM일 수 있으나, 특별히 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 방법은 상기 기술한 배지에서 IGF1R 작용제, Shh 신호전달 작용제 및 RA로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 성분, 보다 구체적으로는 IGF1R 작용제, Shh 신호전달 작용제 및 RA를 모두 제거한 배지에서 미성숙망막신경절세포 또는 성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 기술된 본 발명의 방법에 따라 제조된 미성숙망막신경절세포 및 성숙망막신경절세포를 제공한다.

상기 방법, 미성숙망막신경절세포 및 성숙망막신경절세포에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명은 또 하나의 양태로서 (a) 상기 기술된 성숙망막신경절세포로 분화시키는 방법으로 수득된, 분리된 성숙망막신경절세포에 성숙망막신경절세포의 사멸억제 또는 증식촉진 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 후보물질 비처리군과 비교하였을 때, 상기 후보물질이 성숙망막신경절세포의 사멸 억제를 높이거나, 성숙망막신경절세포의 증식을 촉진시키는 경우, 성숙망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질로 각각 판정하는 단계를 포함하는, 성숙망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 성숙망막신경절세포로 분화시키는 방법 및 성숙망막신경절세포에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 (a) 단계는 본 발명에 따른 성숙망막신경절세포로 분화시키는 방법에 따라 수득된, 분리된 성숙망막신경절세포에 성숙망막신경절세포의 사멸억제 또는 증식촉진 후보물질을 처리하는 단계이다.

상기 후보물질의 처리 대상이 되는 성숙망막신경절세포는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 정상인 또는 환자에서 유래된 줄기세포에 본 발명의 방법을 적용하여 분화시킨 성숙망막신경절세포일 수 있다.

본 발명에서 용어, "성숙망막신경절세포의 사멸억제물질"은 성숙망막신경절세포의 사멸을 억제할 수 있는 물질을 의미한다. 구체적으로, 상기 사멸억제물질은 성숙망막신경절세포의 사멸유도 조건에 적용되었을 때, 적용하지 않은 경우와 비교하여 성숙망막신경절세포의 사멸 정도를 감소시킬 수 있는 물질을 포함한다. 이러한 사멸억제물질은 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 화합물, 단백질, 펩타이드 또는 핵산 등을 모두 포함한다.

본 발명에서 용어, "성숙망막신경절세포의 증식촉진물질"은 성숙망막신경절세포의 증식을 유도 또는 촉진시킬 수 있는 물질을 의미한다. 구체적으로, 상기 증식촉진물질은 성숙망막신경절세포에 적용되었을 때, 적용하지 않은 경우와 비교하여 성숙망막신경절세포의 증식 정도를 증가시킬 수 있는 물질을 포함한다. 이러한 증식촉진물질은 그 종류가 특별히 제한되지 않으며, 화합물, 단백질, 펩타이드 또는 핵산 등을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 방법은 (b) 후보물질 비처리군과 비교하였을 때, 상기 후보물질이 성숙망막신경절세포의 사멸 억제를 높이거나, 성숙망막신경절세포의 증식을 촉진시키는 경우, 성숙망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질로 각각 판정하는 단계를 포함한다. 또한, 상기 성숙망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질은 녹내장 또는 시신경병증의 치료제일 수 있다.

본 발명에서 용어, "녹내장"은 망막신경절세포의 손실을 동반한 시신경 손상을 가지는 질환을 말한다.

본 발명에서 용어, "시신경병증"은 망막을 구성하는 신경절세포와 축삭이 점진적으로 소실되어 그에 따라 시야 장애가 발생하는 질환을 말한다. 상기 시신경병증은 시신경염, 허혈성 시신경병증, 중독-영양시신경병증, 유전성시신경병증 및 시신경위축증을 포함한다.

상기에서 기술한 바와 같이, 녹내장 및 시신경병증은 망막신경절세포의 손실을 동반하는 질환이므로, 망막신경절세포의 사멸을 억제하거나 증식을 촉진할 수 있는 물질은 녹내장 또는 시신경병증의 치료제로서 사용될 수 있다.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 기술된 본 발명에 따른 방법으로 생성된 성숙망막신경절세포를 포함하는, 성숙망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질을 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다. 또한, 상기 키트는 녹내장 또는 시신경병증의 치료제 스크리닝용일 수 있다.

상기 성숙망막신경절세포, 사멸억제물질 및 증식촉진물질에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 키트는 성숙망막신경절세포 외에 망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질을 스크리닝할 수 있는 당업계에 공지된 다양한 도구 및/또는 시약을 포함할 수 있다. 상기 키트는 필요에 따라 각 성분들을 혼합하는데 사용될 튜브, 웰 플레이트, 사용방법을 개시한 지시자료 등을 추가로 포함할 수 있다.

상기 방법들에서 이용될 수 있는 실험과정, 시약 및 반응조건은 기존에 당업계에 통상적으로 알려진 것들을 이용할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명한 일이다.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 기술된 본 발명의 방법에 따라 생성된 성숙망막신경절세포를 포함하는, 녹내장 또는 시신경병증의 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 성숙망막신경절세포, 녹내장 및 시신경병증에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 상기 치료용 조성물은 체외에서 줄기세포, 예컨대 인간 배아줄기세포 또는 유도만능줄기세포로부터 성숙망막신경절세포로의 분화를 유도하여 성숙망막신경절세포를 대량 증식 및 분화시킨 후, 이를 상기 질환을 갖는 환자에게 투여하기 위한 것으로서, 당업계에 일반적인 제형, 예컨대, 주사제의 형태로 제조될 수 있으며, 외과수술적으로 망막부위에 직접 이식하거나, 정맥에 투여된 후 망막부위로 이동할 수 있다. 본 발명의 치료용 조성물은 이식시 면역 거부 반응이 일어나지 않도록 면역반응 억제제를 추가로 포함할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 치료용 조성물의 투여량은 환자의 중함 정도, 투여 경로, 투여 방법, 투여 횟수, 치료기간, 환자의 나이 및 성, 및 질병의 정도에 따라 변할 수 있으며, 이는 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명은 또 하나의 양태로서, 상기 기술된 본 발명의 방법에 따라 생성된 성숙망막신경절세포를 녹내장 또는 시신경병증 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 녹내장 또는 시신경병증의 치료방법을 제공한다.

상기 방법, 성숙망막신경절세포, 녹내장 및 시신경병증에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 성숙망막신경절세포의 투여는 임의의 동물에 적용가능하며, 동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개, 쥐, 랫트 및 고양이 등의 가축을 포함한다.

본 발명에서 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 녹내장 또는 시신경병증 의심 개체에게 본 발명의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 분화된 세포의 이식을 포함한다. 본 발명의 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있으며, 바람직하게는 망막 내 조직에 투여될 수 있다.

본 발명은 또 하나의 양태로서, (a) 망막기원세포(retinal progenitor cell)를 IGF1R(insulin-like growth factor-1 receptor) 작용제 및 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하여 미성숙망막신경절세포(immature retinal ganglion cell)로 분화시키는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 배지에서 Wnt 신호전달 작용제를 제거하고, IGF1R 작용제를 포함하는 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 포함하는, 성숙망막신경절세포주를 제조하는 방법을 제공한다.

상기 배지는 추가로 Shh 신호전달 작용제, RA(retinoic acid) 또는 둘 다를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 방법은 상기 IGF1R 작용제 및 Shh 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양한 세포를 분리한 다음, 이를 (i) 엘-글루타민, 머캅토에탄올 및 인슐린/트랜스페린/셀레늄-X(Insulin/Transferrin/Selenium-X)를 포함하는 배지, 또는 (ii) 엘-글루타민, 머캅토에탄올, FGF2, IGF-1 및 EGF를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 배지는 보다 구체적으로 엘-글루타민, 머캅토에탄올 및 인슐린/트랜스페린/셀레늄-X(Insulin/Transferrin/Selenium-X)를 포함하는 IMDM 배지 또는 엘-글루타민, 머캅토에탄올, FGF2, IGF-1 및 EGF를 포함하는 IMDM 배지일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 IMDM, 15% FBS, 1 mM의 엘-글루타민, 0.1 mM의 머캅토에탄올, 1% 인슐린/트랜스페린/셀레늄-X 배지(배양액1) 및 IMDM, 15% FBS, 1 mM의 엘-글루타민, 0.1 mM의 머캅토에탄올, 5 ng/mL의 FGF2, 10 ng/mL의 IGF-1, 5 ng/mL의 인간 재조합 EGF 배지(배양액2)를 사용하였다.

본 발명의 방법에 따르면 줄기세포로부터 망막신경절세포를 고효율로 분화시킬 수 있어서, 상기 방법에 의해 수득된 망막신경절세포를 녹내장 또는 시신경병증과 같은 질환의 치료제 선별 실험 및 세포치료제로서 사용할 수 있는 이점을 지닌다.

도 1은 세포 형태학적 사진이다.
(A)는 미분화 상태의 인간 배아줄기세포의 세포집락 (계대수 30): 계대수 29로부터 계대 배양되어 배양된 5일 후의 세포주이다. 미분화 상태의 특징인 주변의 영양공급자세포인 마우스 배아섬유아세포와의 격리가 잘 이루어져 있으며, 편평한 표면을 지닌, 균일한 모양을 보이는 전형적인 미분화 상태의 인간 배아줄기세포 집락을 보이고 있다.
(B)는 부유응집체로서, 도1(A)의 미분화 상태의 인간 배아줄기세포 집락으로부터 분리되어 저접촉판에서 4일 배양된 부유응집체이다. 떠있는 둥근 공모양의 부유 응집체 형태를 보여주고 있다. 상기 부유응집체 1개당 약 292 ± 53여개의 세포로 구성되어 있다.
(C)~(F)는 망막신경절세포로 분화되고 있는 세포 형태학적 사진이다.
(C)는 분화 유도 14일: 폴리-디-라이신/라미닌 플레이트에 옮겨 심어진 부유 응집체의 배양 10일 후, 즉, 미분화 상태의 인간 배아줄기세포로부터의 분화유도 14일 후의 세포 모양이다. 부유 응집체 형태에서 세포들이 분리되어 분화가 유도되고 있는 세포들이 관찰되고 있다. 적은 세포질과 둥글고 큰 핵으로 구성된 세포로 분화의 초기단계의 모양을 보이고 있다.
(D)는 분화 유도 17일: 미분화 상태의 인간 배아줄기세포로부터의 분화유도 17일 후의 세포 모양이다. 활발한 세포증식과 동시에 분화가 일어나고 있으며, 다수의 둥근 꽃 모양의 로젯(rosette) 형태의 세포군집들을 중심으로 세포증식과 분화가 일어나고 있다.
(E)는 분화유도 22일: 도 1(D)의 세포보다 세포질은 풍부하고, 상대적으로 핵의 크기는 감소한 분화가 진행된 세포의 형태를 띄고 있다. 크고 작은 신경축삭을 지닌 신경세포로의 분화된 형태를 보이는 집락들이 관찰된다.
(F) 분화유도 39일: 대다수의 세포가 신경세포로 분화되어 있다. 도 1(E)의 분화유도 22일의 세포와 비교하였을 때, 세포수의 충실도는 동일하나, 신경세포로의 분화가 진행되었고, 성숙한 신경세포 모양의 형태를 보인다. 신경 세포체들이 다수의 세포집락(cluster)을 형성하고 있으며, 이들은 긴 축삭으로 연결되어 있다.
* 현미경시야: (A) ~ (F) (좌: 40배; 우: 100배).
도 2는, 인간 신생아포피에서 유래한 BJ1 섬유아세포를 역분화시켜서 생성한 유도만능줄기세포의 특성을 확인한 도이다.
(A)는 유도 생성된 인간 유도만능줄기세포의 위상차 현미경 이미지이다: 계대수 6로부터 계대 배양되어 배양된 6일 후의 세포주이다. 주변의 영양공급자세포인 마우스 배아체세포주와 잘 격리되어 있으며, 편평한 표면을 지닌, 균일한 모양을 보인다. (B)와 (C)는 유도된 유도만능줄기세포의 인간배아줄기세포의 특성을 보여주는 알칼라인 포스파타제, Nanog 및 SSEA-4 염색 결과이다. (D) 섬유아세포로부터 유도 생성된 유도만능줄기세포의 전분화능 평가를 위한 기형종 실험결과이다. 면역억제 SCID 마우스의 등부위에 섬유아세포로부터 유도 생성된 유도만능줄기세포를 이식한 후 10주 후 평가한 기형종으로 외배엽(좌측: 신경조직), 중배엽(중앙부: 연골조직), 내배엽(우측: 소화기 조직)의 3배엽 모두로 분화되어 전분화능을 지닌 것으로 확인되었다.
* 스케일 바: (A), (B), (C): 200 μm.
도 3은, 본 발명에 따른 인간 만능줄기세포로부터 망막신경절세포로의 분화 모식도를 나타낸 도이다. 망막신경절세포의 태생학적 발달 단계를 참고하여 단계별로 화학적으로 규명된 배지, 세포의 시험관 내 접착상태, 분화 인자들로 구성하였다. 태생학적 발달단계의 시기 및 기간은 마우스를 기준으로 기획하였다.
도 4는, 본 발명에 따른 인간 만능줄기세포로부터 망막신경절세포로의 분화 모식도를 나타낸 것으로, Wnt3a를 분화 14일에서 17일까지 3일 동안 처리한 프로토콜(프로토콜 A로 명명)에 대한 것으로 본 발명의 프로토콜들 중 원형(프로토타입: prototype)이다. 분화시기에 따른 세포의 종류 및 분화 표지자를 표시하였으며, 본 프로토콜에 의해 분화한 세포 사진을 도 1에 나타내었다.
도 5는, 본 발명에 따른 인간 만능줄기세포로부터 망막신경절세포로의 분화 모식도를 나타낸 것으로, Wnt3a를 분화 11일에서 14일까지 3일 동안 처리한 프로토콜(프로토콜 B로 명명)에 대한 것이다.
도 6은, 본 발명에 따른 인간만능줄기세포로부터 망막신경절세포로의 분화 모식도를 나타낸 것으로, Wnt3a를 11일에서 17일까지 6일 동안 처리한 프로토콜(프로토콜 C로 명명)에 대한 것이다.
도 7은, 인간 배아줄기세포의 H9 세포주에 프로토콜 A에 따른 방법을 적용하여 분화시킨 17일째의 세포의 표지자 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
(A) 망막기원세포의 표지자인 Rax와 Pax6가 동시에 염색된 세포가 관찰된다. 망막기원세포는 두 표지자에 동시에 염색되는 특성을 지닌다.
(B) 미성숙 망막신경절세포의 표지자인 Math5가 관찰된다. 전체세포(DAPI 염색됨)와 비교시 거의 100%의 세포가 Math5 양성을 보이고 있다.
(C) 망막신경절세포의 특이적인 표지자인 Brn3B가 거의 모든 세포에서 관찰된다. Math5에 의해 망막신경절세포로의 운명이 결정된 후 망막신경절세포로의 분화가 진행되기 시작함을 의미한다.
(D) 망막신경절세포의 특이적인 표지자인 중 하나인 Brn3A(녹색염색: 세포핵 염색)와 신경세포의 세포질에 특이적으로 염색되는 Tuj1(적색염색: beta-tubulin III라고도 함)이 동시 염색되는 세포가 모든 세포에서 관찰된다.
(E) 망막신경절세포의 아류형의 표지자인 Islet-1(적색: 세포핵 염색)과 신경세포 축삭에 특이적으로 염색되는 NF200(녹색)이 동시 염색되는 세포가 약 20%에서 관찰된다.
* 스케일 바: A: 50 μm; B: 200 μm & 50 μm; C ~ E: 100 μm & 50 μm.
전체 세포의 핵 염색: DAPI (청색염색).
도 8은, 인간 배아줄기세포의 H9 세포주에 프로토콜 A에 따른 방법을 적용하여 분화시킨 39일째의 세포의 표지자 발현을 유세포 분석으로 확인한 결과를 나타낸 도이다 (실험결과 예).
도 9는, 인간 배아줄기세포의 H9 세포주에 프로토콜 A에 따른 방법을 적용하여 분화시킨 39일째의 세포의 표지자 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
(A) 도 7에서 관찰되었던 망막신경절세포의 표지자들인 (A) Pax6, (B) Brn3B, (C) Brn3A가 계속 관찰된다.
(D) Brn3A(녹색: 세포핵)와 Tuj1(적색: 세포질 염색으로 축삭과 수상돌기가 동시에 염색됨)가 동시 염색되는 세포가 모든 세포에서 관찰된다. 도 7의 17일째 세포에 비해 신경세포 축삭 및 수상돌기가 더 많아지고 굵어진 형태를 보인다. 축삭의 가시돌기, 축삭 링 및 세포간의 접속 연결과 수상돌기의 분지화 및 가시돌기가 관찰된다.
(E) Islet-1(적색: 세포핵)과 NF200(녹색: 축삭)이 동시 염색되는 세포가 관찰된다. 도7의 17일째 세포에 비해 신경세포 축삭의 수가 많아지고 성숙한 형태를 보인다.
(F) Brn3B(녹색) Tuj1(적색): 대다수의 세포군락이 Brn3B와 Tuj1의 염색에 동시 양성이다. 망막신경절세포의 특이적 염색이다.
(G) Brn3B(녹색)와 Thy1.2(적색): 망막신경절세포의 특징인 Brn3B 핵염색과 Thy1.2의 세포질 염색을 나타낸다.
(H) Brn3A(녹색)와 Thy1.2(적색): 망막신경절세포의 특징인 Brn3A 핵염색과 Thy1.2의 세포질 염색을 나타낸다.
(I) Map2(녹색): 신경세포의 수상돌기를 포함하는 세포질 염색을 나타낸다.
(J) 분화 39일째 인간 배아줄기세포 유래-망막신경절세포의 용해물을 항체들과 반응시킨 웨스턴 블롯 분석결과로 망막신경절세포에 특이적인 단백질들을 나타내고 있다.
* 스케일 바: A ~ C: 50 μm; D: 200 μm, 50 μm & 20 μm; E: 100 μm, 50 μm & 20 μm; F: 200 μm & 100 μm; G: 20 μm; H: 100 μm; I: 50 μm.
전체 세포의 핵 염색: DAPI(청색).
도 10은, 인간 배아줄기세포의 H9 세포주에 프로토콜 A에 따른 방법을 적용하여 분화시킨 59일째의 세포의 표지자 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
(A) Brn3A(녹색: 세포핵)와 Tuj1(적색: 세포질 염색으로 축삭과 수상돌기가 동시에 염색됨)가 동시 염색되는 세포가 관찰된다. 도 8의 39일째 세포에 비해 신경세포 축삭 및 수상돌기가 더 많아지고 굵어진 형태를 보인다
(B) Tuj1: 축삭의 가시돌기, 축삭 링 및 세포간의 접속연결과, 수상돌기의 분지화 및 가시돌기가 관찰된다.
(C) NF200: 수상돌기의 가시돌기, 축삭 링이 관찰된다.
(D) Synapsin1: 시냅스-전부의 소포(presynaptic vesicles)내 뉴로트란스미터의 대표적인 단백인 Synapsin1이 수상돌기를 따라 기능적으로 성숙한 형태인 반점(puncta) 형태로 관찰된다. 이는 다른 신경세포와 접합해 시냅스를 이루며 세포간에 전기적 자극을 전달할 수 있음을 나타낸다.
(E) Map2/Vglut1: 도 (D)의 Synapsin1으로 표현된 시냅스-전부의 소포의 대다수가 글루타메이트성(glutamatergic) 소포(Vglut1: 적색)임을 나타낸다. Map2로 염색된 수상돌기(녹색)를 따라 Vglut1이 존재함을 보여준다. 글루타메이트성 특성을 지닌 흥분성 뉴런이 생성되었음을 나타낸다.
(F) Map2/Vgat: 도 (D)의 Synapsin1으로 표현된 시냅스전부의 소포의 아주 일부분만이 가바성(GABAergic) 소포(Vgat: 적색)임을 나타낸다. Map2로 염색된 수상돌기(녹색)를 따라 Vgat가 존재한다.
(G) PSD-95/Map2: 시냅스-후부의 소포(postsynaptic vesicles)내 단백질의 형성을 보이며, 흥분성(excitatory) 신경으로서의 특성을 나타내는 PSD-95가 수상돌기(Map2)를 따라 분포한다.(H) Synapsin1/PSD-95: 초해상도 현미경(super resolution microscopy)에 의한 물리적(physical) 시냅시스: 시냅스-전부의 소포인 Synapsin1과 흥분성 시냅스-후부 소포인 PSD-95가 연접해 있음을 나타낸다. 물리적 시냅시스는 시냅스전부 소포와 시냅스후부 소포의 복합체가 인접해 있음으로 확인할 수 있다. "성숙망막신경절세포"의 전기생리학적인 특징인 자발적 흥분 시냅스-후부 전류 [spontaneous excitatory postsynaptic currents(sEPSCs)]를 가능하게 하는 뉴로트란스미터가 형성되어 있으며, 이는 망막신경절세포의 기능적인 성숙을 의미한다.
* 스케일 바: A: 100 μm; B: 100 μm & 20 μm; C: 20 μm; D: 50 μm & 20 μm; E: 20 μm; F: 20 μm; G: 50 μm & 1 μm; H: 2 μm & 0.5 μm.
세포의 핵 염색: DAPI(청색).
도 11은, 인간 배아줄기세포의 H9 세포주에 프로토콜 B에 따른 방법을 적용하여 분화시킨 39일째의 세포의 표지자 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
(A) Math5
(B) Brn3B
(C) Brn3A
(D), (E) Islet-1(적색: 세포핵)과 NF200(녹색: 세포 축삭)
(F) NF200
(G) Brn3A, Tuj1
(H) Tuj1
(I) Synapsin1/Tuj1
* 스케일 바: A~ I: 50 μm. 도 H의 핵 염색: DAPI(청색).
도 12는, 인간 배아줄기세포의 H9 세포주에 프로토콜 C에 따른 방법을 적용하여 분화시킨 39일째의 세포의 표지자 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
(A) Math5
(B) Pax6
(C) Brn3B
(D) Brn3A
(E) Brn3A, Tuj1
(F) Islet-1(적색: 세포핵)과 NF200(녹색: 세포 축삭)
(G) TrkB: 성숙 망막신경절세포의 neurotrophin 수용체 표지자인 TrkB의 발현을 보이고 있다.
(H) Synapsin1/PSD-95
* 스케일 바: A~ H: 50 μm.
도 13은, 인간 배아줄기세포의 H7 세포주에 프로토콜 A에 따른 방법을 적용하여 분화시킨 39일째의 세포의 표지자 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
(A) Math5
(B) Brn3B
(C) Brn3A
망막신경절세포의 특징적 표지자들이 거의 모든 세포들에서 관찰된다.
(D) Brn3A(녹색: 세포핵)와 Tuj1(적색: 세포질 염색으로 축삭과 수상돌기가 동시에 염색됨)
(E), (F) Islet-1(적색: 세포핵)과 NF200(녹색: 세포 축삭)
(G) Synapsin1(녹색), Tuj1(적색): Tuj1으로 염색된 축삭을 따라 시냅스-전부의 소포 표지자인 Synapsin1이 분포되어 있다.
(H) Synapsin1/PSD-95: 시냅스-전부의 소포 표지자인 Synapsin1과 시냅스-후부 소포 표지자인 PSD-95가 근접해 있다. H9 세포주와 마찬가지로 프로토콜 A에 의해 H7 세포주가 성숙된 전기생리학적인 기능을 지닌 "성숙망막신경절세포"로 분화되었음을 나타낸다.
* 스케일 바: A: 50 μm; B, C: 100 μm; D: 200 μm; E: 200 μm & 20 μm; F: 100 μm; G: 20 μm; H: 20 μm.
도 13 (E)의 핵 염색: DAPI(청색).
도 14는, 인간 유도만능줄기세포에 프로토콜 A에 따른 방법을 적용하여 분화시킨 39일째의 세포의 표지자 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
(A) Math5
(B) Pax6
(C) Brn3B
(D) Brn3A
(E) NF200
(F) Brn3A(적색: 세포핵)과 NF200(녹색: 세포 축삭)
(G) Islet-1(적색: 세포핵)과 NF200(녹색: 세포 축삭): 망막신경절세포의 아형 중 하나를 보여준다.
(H) NF200, Islet-1
(I) Brn3A, Tuj1
(J) Tuj1: 성숙된 신경세포의 축삭으로 분화되었음을 보여준다.
(K) Synapsin1(녹색), Tuj1(적색): Tuj1으로 염색된 축삭을 따라 시냅스-전부의 소포 표지자인 Synapsin1이 분포되어 있다.
(L) Synapsin1/PSD-95: 시냅스-전부의 소포 표지자인 Synapsin1과 시냅스-후부의 소포 표지자인 PSD-95가 근접해 있다. H9 세포주와 마찬가지로 프로토콜 A에 의해 인간 유도만능줄기세포주가 성숙된 전기생리학적인 기능을 지닌 "성숙망막신경절세포"로 분화되었음을 나타낸다.
* 스케일 바: A~C, E~H, J, L: 50 μm; D, I: 100 μm; K: 20 μm.
도 15는, 인간 배아줄기세포의 H9 세포주에 프로토콜 A에 따른 방법을 적용하여 분화시킨 39일째의 전기생리학적 분석 결과를 나타낸 도이다.
(A) 인간 배아줄기세포유래-망막신경절세포에서 단계별 전류 주입(pA)에 반응하여 활동전위가 열차 형태의 강력하고 규칙적인-스파이킹(regular-spiking)을 보인다. 이는 생성된 망막신경절세포가 성숙한 전기생리학적 특성을 획득하였음을 나타낸다. 일반적으로 뉴런은 성숙할수록 주입한 전류에 대한 활동전위(action potential) 반응이 한 개의 짧은 스파이킹에서 지속적인 여러 개의 활동전위 스파이킹으로 진행한다.
(B) 인간 배아줄기세포유래-망막신경절세포의 전압-개폐 소디움 통로(Voltage-gated sodium channels): -80 mV to +40 mV의 고정전압에서 단계적 탈분극 반응에 대한 전류반응이 중첩되었다. 급속-활성화와 비활성화 내향 소디움 전류(fast-activating and inactivating inward sodium currents)는 테트로도톡신(tetrodotoxin, TTX)에 의해 완전히 차단되었다.
(C) 자발적 흥분 시냅스후부 전류(sEPSCs)가 인간 배아줄기세포 유래-망막신경절세포에서 분화유도 39일만에 다른 망막조직과의 공배양없이 검출되었다. 이는 인간 배아줄기세포 유래-망막신경절세포간의 기능적인 흥분성 시냅스가 형성되었음을 나타낸다.
도 16은, 인간 배아줄기세포의 H9 세포주를 프로토콜 A에 따른 방법을 적용하여 분화시킨 59일째의 전기생리학적 분석 결과를 나타낸 도이다.
(A) 포타슘 전류: 4-aminopyridine(4-AP)에 의해 외향적 포타슘 전류의 급속-활성화 분획이 억제되었다.
(B) 인간 배아줄기세포유래-망막신경절세포에서 단계별 전류 주입(pA)에 반응하여 활동전위가 열차 형태의 강력하고 규칙적인-스파이킹을 보인다. 분화 39일에 비해 스파이크 수가 증가되었다.
(C) 단계별 전류 주입(pA)에 대한 스파이크 수에 대한 그래프: 단계적으로 주입한 전류 강도에 비례해 스파이크 수가 증가함을 보인다.
(D) 수지돌기(dendrite: Map2 염색)에 분포한 글루타메이트성 시냅스-전부의 소포(Vglut1) 염색 이미지
(E) 자발적 흥분 시냅스-후부 전류(sEPSCs): AMPA 수용체에 대한 억제제인 CNQX에 의해 sEPSCs가 소멸되었다. 글루타메이트성인 흥분성 시냅스가 형성되었음을 나타낸다.
도 17은, 프로토콜 B에 따른 방법에 의해 분화된 인간 배아줄기세포 H9 세포주의 분화 96일째 전기생리학적 분석 결과를 나타낸 도이다.
(A) 단계별 전류 주입(pA)에 의한 열차 형태의 활동전위 스파이킹을 보인다.
(B) 자발적 흥분 시냅스-후부 전류(sEPSCs)를 보인다. AMPA 수용체에 대한 억제제인 CNQX에 의해 sEPSCs가 소멸되었다. 글루타메이트성인 흥분성 시냅스가 형성되었음을 나타낸다.
도 18은, 프로토콜 C에 따른 방법에 의해 분화된 인간 배아줄기세포 H9 세포주의 분화 66일째 전기생리학적 분석 결과를 나타낸 도이다.
(A) 단계별 전류 주입(pA)에 의한 열차 형태의 활동전위 스파이킹을 보인다.
(B) 자발적 흥분 시냅스-후부 전류(sEPSCs)를 보인다. 글루타메이트성인 흥분성 시냅스가 형성되었음을 나타낸다.
도 19는, 프로토콜 B에 따른 방법에 의해 39일까지 분화된 인간 배아줄기세포를 분화 39일 이후에 분화배양액에서 IGF-1, Shh 및, RA(Retinoic acid)를 제거한 배양액을 공급하면서 성숙시킨 망막신경절세포의 전기생리학적 분석 결과를 나타낸 도이다.
(A) 분화 96일째의 인간 배아줄기세포유래-망막신경절세포에서 단계별 전류 주입(pA)에 반응하여 활동전위가 열차 형태의 강력하고 규칙적인-스파이킹(regular-spiking)을 보인다.
(B) 분화 96일째의 인간 배아줄기세포유래-망막신경절세포에서 자발적 흥분 시냅스-후부 전류(sEPSCs)를 보인다. 글루타메이트성인 흥분성 시냅스가 형성되었음을 나타낸다.
도 20은, 프로토콜 A에 따른 방법에 의해 분화된 인간 유도만능줄기세포의 분화 39일째 전기생리학적 분석 결과를 나타낸 도이다.
(A) 인간 유도만능줄기세포유래-망막신경절세포에서 단계별 전류 주입(pA)에 반응하여 활동전위가 열차 형태의 강력하고 규칙적인-스파이킹(regular-spiking)을 보인다. 이는 생성된 망막신경절세포가 성숙한 전기생리학적 특성을 획득하였음을 나타낸다.
(B) 포타슘 전류: 4-aminopyridine(4-AP)에 의해 외향적 포타슘 전류의 급속-활성화 분획이 억제되었다.
도 21은, 기타 Wnt 신호전달 작용제와 Shh 수용체 작용제에 의한 인간 배아줄기세포 유래-망막신경절세포의 분화를 나타낸 도이다.
상기 분화법에 사용한 Wnt3a 이외의 Wnt 신호전달 작용제인 BIO(6-bromoindirubin-3'-oxime) 2 μM과 노린(Norrin) 50 ng/mL, 그리고 Shh 수용체 작용제인 Purmorphamine 1μM 및 레티노익산(RA) 500 nM을 사용해 프로토콜 A법 시간 스케줄을 적용하여 분화시켰다. 분화 39일째의 면역형광 염색한 결과 망막신경절세포 단백표지자인 Islet-1(적색: 세포핵)과 NF200(녹색: 세포 축삭)는 Wnt3a와 Shh을 사용한 분화결과와 동일한 결과를 보였다.
* 스케일 바: A, C, D: 100 μm; B: 50 μm.
도 22는, 인간 만능줄기세포유래-망막신경절세포주의 계대배양한 세포의 형태를 확인한 결과이다. 세포주 확립 후 계대배양 수 16(passage number 16)의 세포이며, 계대배양 수 15에서 패시지한 후 3일 경과시의 세포다. 망막신경절세포주의 계대배양한 세포는 시험관 안에서(in vitro) 신경세포의 형태를 보인다.
(A) 배양액1로 계대배양한 세포의 형태.
(B) 배양액2로 계대배양한 세포의 형태.
배양액1 및 배양액2로 계대배양한 세포 모두, 신경세포의 특징적인 세포질의 연장(elongation), 긴 신경돌기(neuritis)와 위상이 밝은 세포체(phase bright soma)를 지닌 뚜렷한 신경세포의 형태를 보인다.
* 좌측도면: 위상차현미경 100배; 우측도면: 200배.
도 23는, 인간 만능줄기세포유래-망막신경절세포주의 세포의 단백질 표지자 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다. 세포주 확립 후 계대배양 수 17(passage number 17)의 세포이며, 계대배양 수 16에서 패시지한 후 3일 경과시 면역형광염색법을 시행하였다. 망막신경절세포의 특징적 표지자들이 거의 모든 세포들에서 관찰된다.
(A) Math5
(B) Brn3B
(C) Brn3A/Tuj1
(D) Synapsin1/Tuj1
(E) NF200
(F) KI67
(G) Thy1.2
(H) NMDAR1
(I) TrkB
* 스케일 바: A ~ I: 50 μm. 핵 염색: DAPI(청색).
도 24는, 인간 만능줄기세포유래-망막신경절세포주가 신경적 기능을 지니고 있음을 세포 내 칼슘 이미지(calcium image) 분석에 의해 확인한 결과 도이다. 인간 배아줄기세포유래-망막신경세포절세포주의 계대배양수 15세포를 패시지 후 3일간 배양하였다. 1 uM의 fluor-4를 처리하고 1 mM 글루타메이트(glutamate)로 자극을 준 후 연속 촬영시, 다수의 살아있는 세포에서 칼슘(calcium) 반응이 관찰되었다. 흑색(최저)에서 백색(최고)의 세포의 연속이미지 스펙트럼은 칼슘의 농도를 나타낸다. 인간 배아줄기세포유래-망막신경세포절세포주의 세포는 글루타메이트 자극에 반응하여 세포질 내 칼슘이 상당량 증가한다(화살표 머리).

이하 본 발명을 하기 예에 의해 상세히 설명한다. 다만, 하기 예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 하기 예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 줄기세포의 배양

<1-1> 인간 배아줄기세포의 배양

인간 배아줄기세포주(human embryonic stem cell: hESC)인 H9(WA09, 정상핵형 XX)와 H7(WA07, 정상핵형, XX)을 WiCell 연구기관(WiCell Research Institute, Madison, WI)에서 구입하였다.

미분화 상태의 인간 배아줄기세포주를 유지하고 증식시키기 위해(H9 세포주: 계대수 26 ~ 41; H7 세포주: 계대수 23 ~ 32), 인간 배아줄기세포를 방사선이 조사된 마우스 배아섬유아세포주(mouse embryonic fibroblasts, MEF, Global Stem, Gaithersburg, MD) 또는 마이토마이신이 처리된 마우스 배아섬유아세포주(EmbryoMax Primary Mouse Embryo Fibroblasts, Millipore, Billerica, MA) 등의 영양공급자세포(feeder cells) 위에서 하기와 같은 배양액으로 증식시켰다: 배아줄기세포 배양액 [DMEM/F12(Invitrogen, Grand Island, NY)액, 20%(v/v) 넉아웃 혈청 대체제(KnockOut serum replacement, Invitrogen, Carlsbad, CA), 1 mM의 엘-글루타민(L-glutamine, Invitrogen), 0.1 mM의 비필수 아미노산(nonessential amino acids, Invitrogen), 0.1 mM의 머갑토에탄올(mercaptoethanol, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 4 ng/ml 인간 재조합 FGF2(human recombinant basic fibroblast growth factor, Invitrogen)].

상기 배양액을 매일 교체하였으며, 미분화상태의 줄기세포(도 1A)를 유지하기 위해 배양세포를 1:15 ~ 1:18의 비율로 6일 ~ 7일마다 수기법이나 콜라제나제 V(collagenase IV, Invitrogen) 처리로 계대배양(passage)한 후, 새로운 마우스 배아섬유아세포주 영양공급자세포에 상기 인간 배아줄기세포를 옮겨주었다. 이때, 인간 배아줄기세포의 계대배양 시, 미분화된 인간 배아줄기세포의 특이적 항원인 Oct4와 SSEA-4(Chemicon, Temecula, CA)에 대한 면역화학염색법을 주기적으로 수행하여 분화 정도를 측정하였으며, 분화된 세포는 제거하였다. 한편, 인간 배아줄기세포의 분화에 원치 않는 영향을 줄 수 있는 마이코플라즈마 감염 여부를 감시하기 위해서, 마이코얼러트 마이코플라즈마 검출 키트(MycoAlert mycoplasma detection kit, Cambrex, Rockland, ME)를 사용해 배아줄기세포주의 마이코플라즈마 감염을 주기적으로 검사, 확인하였다.

<1-2> 인간 유도만능줄기세포(induced pluipotent stem cell, iPSC)의 생성 및 배양

인간 유도만능줄기세포는 BJ1 섬유아세포(신생아 포피, ATCC) 에 에피좀 플라즈미드 벡터(episomal plasmid vectors)를 이용하여 줄기세포유전자(SOX2, KLF4, OCT4, L-MYC, LIN28, 및 small hairpin RNA for p53)를 형질도입시켜 만들었다(Okita, Nat method 2011;8:409). 미분화 상태의 인간 유도만능줄기세포를 유지하고 증식시키기 위해(계대수 5 ~ 9), 인간 유도만능줄기세포를 방사선이 조사된 마우스 배아섬유아세포주(MEF, Global Stem, Gaithersburg, MD, USA) 또는 마이토마이신이 처리된 마우스 SNL 세포(SNL 76/7 cell line, ECACC, Porton Down, UK) 등의 영양공급자세포 위에서 하기와 같은 배양액으로 증식시켰다: 배아줄기세포 배양액 [DMEM/F12(Invitrogen, Grand Island, NY, USA)액, 20%(v/v) 넉아웃 혈청 대체제(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1 mM의 엘-글루타민(Invitrogen), 0.1 mM의 비필수 아미노산(Invitrogen), 0.1 mM의 머갑토에탄올(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 4 ng/ml 인간 재조합 FGF2(Invitrogen)].

상기 배양액을 매일 교체하였으며, 미분화상태의 줄기세포(도 2A)를 유지하기 위해, 배양세포는 1:12 ~ 1:15의 비율로 6일 ~ 7일마다 수기법이나 콜라제나제 IV(Invitrogen) 처리로 계대 배양한 후, 새로운 마우스 배아섬유아세포주 영양공급자세포에 상기 인간 유도만능줄기세포를 옮겨주었다. 이때, 인간 유도만능줄기세포의 계대 배양 시, 미분화된 인간 유도만능줄기세포의 특이적 항원인 알칼라인 포스파타제(Sigma-Aldrich), NANOG(Abcam, Cambridge, MA) 및 SSEA-4(Chemicon, Temecula, CA)(도 2B, C)에 대한 면역화학염색법을 주기적으로 수행하여 분화 정도를 측정하였으며, 분화된 세포는 제거하였다. 또한 생성된 미분화 인간 유도만능줄기세포에 대한 전분화능(pluripotency) 평가를 위해 기형종(teratoma) 형성 실험을 시행하였다. 면역이 억제된 마우스 모델인 rd/SCID 마우스에 등쪽에 인간 유도만능줄기세포를 1x10⁷를 이식한 후 10 주 후 형성된 종양을 제거하여 H&E 염색을 시행하였다(도 2D).

한편, 인간 유도만능줄기세포의 분화에 원치 않는 영향을 줄 수 있는 마이코플라즈마 감염 여부를 감시하기 위해서, 마이코얼러트 마이코플라즈마 검출 키트(MycoAlert mycoplasma detection kit, Cambrex, Rockland, ME)를 사용해 인간 유도만능줄기세포의 마이코플라즈마 감염을 주기적으로 검사, 확인하였다.

실시예 2: 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포로부터 안구영역전구체로의 분화

먼저, 실시예 1의 방법으로 배양된 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포를 마우스 배아섬유아세포로부터 분리하여 6-웰 저접촉판(ultra-low attachment plates, Corning Incorporated, Corning, NY, USA)으로 각각 옮겨주었다.

상기 6-웰 저접촉판으로 옮긴 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포에 안구영역전구체 유도 배양액 [DMEM/F12, 10% 넉아웃 혈청 대체제, 1 mM의 엘-글루타민, 0.1 mM의 비필수 아미노산, 0.1 mM의 머캅토에탄올, 1% B27 보충제(B27 supplement, Invitrogen), 1 ng/mL 재조합 노긴(recombinant noggin; R&D Systems), 1 ng/mL의 재조합 Dkk-1(recombinant Dickkopf-1, R&D Sytstems), 5 ng/mL의 재조합 IGF-1(recombinant insulin-like growth factor-1, R&D Systems)을 공급한 후, 3일째에 흡입하여 버리고 새 배양액으로 교체하는 형식으로 4 ~ 5 일간 배양하여 배양액 내에서 부유하는 공모양의 부유 응집체 형태로 존재하는 안구영역전구체(eye field precursor)를 수득하였다(도 1B, 3).

실시예 3: 안구영역전구체로부터 망막기원세포로의 분화

상기 실시예 2에서 생성된 안구영역전구체(부유 응집체 형태)를, 6웰 폴리-디-라이신/라미닌 플레이트(poly-D-lysine/laminin-coated plate, BD Biosciences)에 53 ± 8개씩(292 ± 53 세포/부유 응집체), 12-웰 폴리-디-라이신/라미닌 플레이트에는 30 ± 5 개씩, 8-웰 폴리-디-라이신/라미닌 플레이트에는 12 ± 4 개씩 심은 후, 망막기원세포 유도 배양액 [DMEM/F12(Invitrogen), 1 mM의 엘-글루타민(Invitrogen), 0.1 mM의 비필수 아미노산(Invitrogen), 0.1 mM의 머캅토에탄올(Sigma-Aldrich), 1% B27 보충제, 1% N2 보충제(Invitrogen), 10 ng/mL의 Dkk-1, 10 ng/mL의 노긴, 10 ng/mL의 IGF-1, 5 ng/mL의 FGF2]을 10일간(프로토콜 A)(도 3, 4) 공급하면서 배양하여 망막기원세포(retinal progenitor cell)로 분화시켰다(도 1C). 프로토콜 B(도 5)와 C(도 6)는 본 단계에서 배지를 7일간 공급하였다.

실시예 4: 망막기원세포로부터 미성숙 망막신경절세포(immature retinal ganglion cells: RGC)로의 분화

상기 실시예 3에서 생성된 망막기원세포에 미성숙 망막신경절세포 분화 배양액 [DMEM/F12(Invitrogen), 1 mM의 엘-글루타민(Invitrogen), 0.1 mM의 비필수 아미노산(Invitrogen), 0.1 mM의 머캅토에탄올(Sigma-Aldrich), 1% B27 보충제(Invitrogen), 1% N2 보충제(Invitrogen), 10 ng/mL의 노긴, 10 ng/mL의 IGF-1, 5 ng/mL의 FGF2, 50 ng/ml의 재조합 Wnt3a(recombinant Wnt3a, R&D Systems)]을 3일간 공급(프로토콜 A와 B)하면서 배양하여 미성숙 망막신경절세포로 분화시켰다(도 1D, 3 ~ 5). 프로토콜 C는 본 단계에서 배지를 6일간 공급하였다(도 6).

실시예 5: 미성숙 망막신경절세포로부터 성숙 망막신경절세포로의 분화: 1단계

상기 실시예 4에서 생성된 미성숙 망막신경절세포로에 분화배양액 [DMEM/F12(Invitrogen), 1 mM의 엘-글루타민(Invitrogen), 0.1 mM의 비필수 아미노산(Invitrogen), 0.1 mM의 머캅토에탄올(Sigma-Aldrich), 1% B27 보충제(Invitrogen), 1% N2 보충제(Invitrogen), 10 ng/mL의 IGF-1, 250 ng/mL의 재조합 Shh(recombinant Sonic Hedgehog amino terminal peptide, Shh, R&D Systems)]를 5일간 공급하면서 배양하여 성숙 망막신경절세포로 분화시켰다(도 1E, 3 ~ 6).

실시예 6: 미성숙 망막신경절세포로부터 성숙 망막신경절세포로의 분화: 2 단계

상기 실시예 5에서 생성한 망막신경절세포에 분화배양액 [DMEM/F12(Invitrogen), 1 mM의 엘-글루타민(Invitrogen), 0.1 mM의 비필수 아미노산(Invitrogen), 0.1 mM의 머캅토에탄올(Sigma-Aldrich), 1% B27 보충제(Invitrogen), 1% N2 보충제(Invitrogen), 10 ng/mL의 IGF-1, 250 ng/mL의 Shh, 500 nM의 올-트란스-레티노산(all-trans retinoic acid, RA, Sigma-Aldrich)]을 17일 이상 공급하면서 배양하여 망막신경절세포로의 분화를 성숙시켰다. 상기 실시예 2 내지 6의 모든 배양액은 2 ~ 3일마다 교체하였고, 상기 세포들은 5% 이산화탄소(CO₂), 37℃에서 배양하였다(도 1F, 3 ~ 6). 본 망막신경절세포 배양액으로 분화 120일째까지도 배양할 수 있었다.

실시예 7: 세포분화 관련 표지자 발현 조사

<7-1> 면역화학염색 및 세포분화 관련 표지자 단백질 발현 확인

상기 실시예 3 내지 6에서 얻은 세포의 분화를 확인하기 위해 하기와 같이 면역화학염색법을 수행하였다.

안구영역전구체(부유 응집체 형태)를 폴리-디-라이신/라미닌이 코팅된 8-웰 슬라이드(BD Biosciences, Bedford, MA)에서 망막기원세포, 미성숙 망막신경절세포 및 성숙 망막신경절세포로의 배양조건과 동일하게 배양하였다. 각 단계별로 배양이 완료된 세포들을 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde, Sigma-Aldrich)로 고정한 후, 3% BSA(Jackson Immunoresearch Laboratory, Bar Harbor, ME, USA)와 0.25% 트리톤-엑스-100(Triton X-100, Sigma-Aldrich)이 함유된 PBS로 비특이적 반응을 차단시켰다.

90분의 차단과정 후, 각 단계의 슬라이드를 표 1과 같은 분화 유도된 세포 단계의 특이 항체들과 함께 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 상기 항체들은 1% BSA와 0.25% 트리톤X-100이 함유된 PBS 용액에 희석하여 사용하였다. 슬라이드에서 배양된 각 단계의 세포들을 PBS로 각각 5분간 3회 세척한 후, Cy3(1:800, Jackson Immunoresearch Laboratory) 또는 Alexa488(1:500, Invitrogen)이 결합된 종-특이 이차항체(표 1)와 실온에서 2시간 동안 반응시켰다. 일차항체와 이차항체에 대한 적절한 기준 물질을 이용해 비특이적 염색이나 항체간 상호반응 여부를 확인하였다. 이 후, 상기 세포들을 PBS로 각각 5분씩 3회 세척한 후, DAPI(4',6-diamidino-2 phenylindole)를 포함하는 벡타쉴드(Vectashield, Vector Laboratories)로 핵 염색을 수행한 후, 형광현미경(epifluorescence microscope, Nikon Eclipse, E800, Tokyo, Japan)과 공초점 현미경(Zeiss LSM510, Carl Zeiss, Inc, Thornwood, NY, USA)으로 관찰하였다. 각 항체에 대한 양성 반응은 400배에서 무작위적으로 20 시야를 추출한 후 500개의 세포를 계수한 후 평가하였으며, 양성 비율에 대한 판정은 최소 3회 이상 각 항체를 평가한 후 실시하였다.

<7-2> 유세포분석 및 세포분화 관련 표지자 단백질 발현 확인

세포는 분화 17일과 39일에 0.05% 트립신(Invitrogen)으로 해리시켰다. 세포는 Cytofix/Cytoperm 완충액(Biosciences)으로 고정하였고, Perm/Wash 완충액(BD Biosciences)을 사용하여 세척하였다. 세포는 일차항체로 4 ℃에서 30 분간, 2차 항체로 4 ℃에서 20 분간 반응시켰다(표 1). 반응 검체는 FACSCalibur(BD Biosciences)와 FlowJo software로 분석하였다(Treestar).

<7-3> 웨스턴블럿에 의한 망막신경절세포의 특이적 표지자 확인

분화 39일에 배양된 세포를 프로테아제 억제제가 첨가된 단백질 추출 완충액에서 용해시켰다. 총 단백질 농도는 브래드포드 단백 분석 키트를 사용하여 측정하였다. 동량의 단백질을 폴리아크릴아마이드 젤(Any kD Mini-PROTEAN TGX precast polyacrylamide gels, Bio-Rad, Hercules, CA)에 적재한 후 폴리비닐리덴 디플로라이드 막(polyvinylidene difluoride membrane, Milipore, Billerica, MA)에 전달하였다. 이 막을 1차 항체(표 1, Brn3B 1:1,000, Brn3A 1:1,000, Tuj1 1:1000, NF200 1:1,000, Actin 1:2,000)와 2차 항체(HRP-conjugated secondary antibody, Goat anti-mouse or anti-rabbit IgG, diluted 1:2,000, Santa Cruz, CA)와 반응시킨 후, Chemiluminscence 분석키트(Amersham ECL, GE Healthcare Life technology, Piscataway, NJ)를 사용해 반응 단백을 검출하였다.

면역형광분석에 사용된 항체
Antibody	Species	Dillution for ICF *	Supplier	Catalogue No .
Brn3A	Rabbit	1:500	gift from Eric Turner	N/A
Brn3B	Rabbit	1:500	gift from Eric Turner	N/A
Islet-1	Mouse	1:10	DSHB	40.2D6
KI67	Mouse	1:200	Vector Laboratories	vp-k452
Map2	Mouse	1:1,000	Sigma-Aldrich	M1406
Map2	Rabbit	1:500	Milipore	AB5622
Math5	Rabbit	1:500	Abcam	ab78046
Nanog	Rabbit	1:500	Abcam	ab80892
Neurofilament-200	Rabbit	1:1,000	Sigma-Aldrich	N4142
NMDAR1	Mouse	1:250	BD Biosciences	556308
Pax6	Mouse	1:1	DSHB	PAX6
PSD-95	Mouse	1:500	NeuroMab	75-028
Rax	Rabbit	1:250	Abcam	ab23340
SSEA4	Mouse	1:100	Chemicon	MAB4304
Synapsin1	Rabbit	1:500	Stressgen	VAP-SV060E
Thy-1.2	Mouse	1:250	eBioscience	14-0903-81
TrkB	Mouse	1:100	Santa Cruz	sc-136991
β-tubulin(Tuj1)	Mouse	1:1,000	Covance	MMS-435P
Vgat	Rabbit	1:1,000	Synaptic Systems	131 003
Vglut1	Rabbit	1:1,000	Synaptic Systems	135 303
Anti-mouse Alexa Fluor 488	Goat	1:500	Molecular Probes	A11029
Anti-rabbit Alexa Fluor 488	Goat	1:500	Molecular Probes	A11034
Anti-mouse Cy3	Goat	1:800	Jackson Laboratory	115-165-062
Anti-rabbit Cy3	Goat	1:800	Jackson Laboratory	111-165-045
Anti-mouse R-Phycoerythrin	Goat	1:800	Jackson Laboratory	115-116-146
Anti-rabbit R-Phycoerythrin	Goat	1:800	Jackson Laboratory	115-116-144

*ICF: Immunocytofluorescence staining

세포분화 관련 표지자 발현 조사 결과, 상기 실시예 4의 프로토콜 A방법에 의해 분화 17일째 생성된 세포표지자의 유세포 분석 결과(표 2A)는 망막기원세포의 표지자인 Rax가 95.8 ± 1.4%, Pax6가 93.8 ± 0.7%로 나타났다(도 7A). 한편, 망막신경절세포 특이적 표지자인 Math5, Brn3B 및 Brn3A가 각각 95.2 ± 1.2%, 96.8 ± 0.6%, 및 97.5 ± 0.9%로 검출되었다. 망막신경절세포 초기에 발현되는 Math5는 마우스인 경우 태생기 11일 에서 생후 1일까지 검출되는 것으로 보고되고 있고, Brn3B 및 Brn3A는 태생기 발생과정 중에 망막신경절세포 생성시부터 나타나 일생 동안 유지되는 것으로 알려져 있다. 또한 이들 표지자는 대부분의 망막신경절세포에서 동시에 발현된다. 망막신경절세포의 아형 표지자인 Islet-1은 16.4 ± 2.7%로 검출되었다. 분화 17일째 면역형광 염색결과 양성율은 유세포 분석 결과와 동일하였다. Math5와 Brn3B는 대부분의 세포 핵에서 강하게 염색되었다(도 7B, C). Brn3A(핵 염색)에 양성인 세포의 세포질은 신경세포의 특이적 표지자인 Tuj1(98.2 ± 0.4%)에 염색되어(표 2A, 도 7D), 신경세포의 한 종류인 망막신경절세포로의 분화가 이루어졌음이 확인되었다. 망막신경절세포의 아형의 표지자인 Islet-1는 망막신경절세포의 축삭에 발현되는 NF200가 양성인 세포의 약 1/5에서 염색되었다(표 2A, 도 7E). Islet-1 양성인 망막신경절세포는 전체 망막신경절세포의 1/3 정도를 차지하는 것으로 보고되고 있다. 세포 축삭 및 수지돌기에서 분지화, 링 형성, 가시돌기 등의 성숙은 아직 관찰되지 않았다.

상기 실시예 6의 프로토콜 A방법에 의해 분화 39일째 생성된 세포표지자의 유세포분석 결과(표 2B, 도 8), Pax6가 82.3 ± 3.5%로 나타났다. Pax6는 망막기원세포뿐만 아니라 망막신경절세포로 분화 후에도 계속적으로 발현되는 것으로 알려져 있다(도 9A). Math5, Brn3B(도 9B, F, G) 및 Brn3A(도 9C, D, H)가 각각 77.3 ± 2.7%, 84.7 ± 0.8%, 89.9 ± 2.3%로 검출되었다. Math5는 세포 분화가 진행되어 감소하는 것으로 파악된다. Islet-1은 분화 17일째의 16.4 ± 2.7%에서 분화 39일째는 32.8 ± 7.1%로 증가되어, 전체 생성 분화된 망막신경절세포의 약 1/3을 차지하게 되었다(도 9E). 한편 세포 증식 표지자인 KI67은 분화 17일째 81.0 ± 3.5%에서 18.4 ± 3.5%로 현격히 감소되었다. 면역형광염색 결과, 생성된 망막신경절세포의 축삭의 링 형성, 가시돌기 및 수지돌기의 분지화, 링 형성, 가시돌기 등이 관찰되어 성숙도가 진행되었음이 확인되었고(도 9F ~ I), 이러한 성숙은 분화 59일째와 한층 더 진행되었다(도 10).

웨스턴블럿 분석에서도 면역화학염색 및 유세포 분석에서 확인한 망막신경절세포의 특이적 표지자인 Brn3B, Brn3A 및 신경세포 특이적 표지자인 NF200, Tuj1이 강하게 발현되어 있음이 확인되었다(도 9J).

프로토콜 A에 따른 분화 17일 및 39일째의 H9 유래 RGC에 대한 유세포 분석 결과
A) Day 17			B) Day 39
Marker	Mean, %(n=3)	SEM	Marker	Mean, %(n=3)	SEM
Brn3A	97.5	0.9	Brn3A	89.9	2.3
Brn3B	96.8	0.6	Brn3B	84.7	0.8
Islet-1	16.4	2.7	Islet-1	32.8	7.1
KI67	81.0	3.5	KI67	18.4	3.5
Math5	95.2	1.2	Math5	77.3	2.7
NF200	98.3	0.4	NF200	96.5	0.9
Pax6	93.8	0.7	Pax6	82.3	3.5
Tuj1	98.2	0.4	Tuj1	94.7	2.5
Rax	95.8	1.4

상기 실시예 5 및 6의 프로토콜 B(도 5)와 프로토콜 C 법(도 6)에 의해 실시한 망막신경절세포로의 분화에도 39일째에 세포의 단백발현 표지자를 확인하였다. 생성된 세포 표지자의 유세포분석 결과(표 3A 및 B), 망막신경절세포의 특성을 나타내는 Math5, Brn3B 및 Brn3A 및 신경세포로서의 축삭 및 수지돌기를 나타내는 Tuj1과 NF200의 양성률은 원형 프로토콜인 프로토콜 A와 유사하였으나, 아형의 표지자인 Islet-1의 양성률이 각각 12.4 ± 2.5% 와 7.8 ± 1.6%로 감소되었음이 관찰되었다. 한편, 면역형광염색법으로 세포형태를 분석한 결과, 프로토콜 A에 비해, 프로토콜 B는 세포 축삭 및 분화돌기의 양성률 및 성숙도는 유사하나, 전기적 기능을 담당하는 시냅스-전부 및 -후부의 단백 소포의 양성률이 저하되어 있었다(도 11). 프로토콜 C는 시냅스-전부 및 -후부의 단백 소포의 생성은 왕성하나, 상대적으로 축삭 및 수지돌기의 성숙이 저하되어 있었다(도 12).

프로토콜 B 및 C에 따른 분화 39일째의 H9 유래 RGC에 대한 유세포 분석 결과
A) Protocol B			B) Protocol C
Marker	Mean, %(n=3)	SEM	Marker	Mean, %(n=3)	SEM
Brn3A	89.8	5.0	Brn3A	91.6	1.0
Brn3B	83.3	1.5	Brn3B	86.0	2.4
Islet-1	12.4	2.5	Islet-1	7.8	1.6
KI67	15.0	1.0	KI67	15.9	4.7
Math5	93.6	1.1	Math5	91.0	1.9
NF200	89.6	3.8	NF200	94.1	1.7
Pax6	80.1	4.7	Pax6	75.7	3.9
Tuj1	94.1	1.8	Tuj1	95.6	0.5

인간 배아줄기세포 세포주인 H9 이외의 세포주인 H7과 인간 유도만능줄기세포에서 상기 실시예 6의 프로토콜 A법에 의한 망막신경절세포로의 분화를 실시하였다. 분화 39일째 생성된 세포표지자의 면역형광 염색결과 및 양성율유세포분석 결과에서, 인간 배아줄기세포 H7의 Math5, Brn3B 및 Brn3A는 각각 95.0%, 90.2% 및 94.4%로 H9 세포주와 동일한 양성률도 검출되었다(표 4A). 세포의 면역형광염색 결과 신경세포로서의 축삭 및 분화돌기의 성숙을 보이고 있었으며, 전기적 기능을 담당하는 시냅스-전부 및 -후부의 단백 소포의 생성도 왕성하였다(도 13).

인간 유도만능줄기세포에서는, Math5, Brn3B 및 Brn3A는 각각 73.0%, 61.4% 및 77.0%로 H9 세포주보다는 다소 감소된 양성율을 보였으나(표 4B), 면역형광염색 결과, 신경세포로서의 축삭 및 분화돌기는 성숙된 양상을 보였으며, 전기적 기능을 담당하는 시냅스-전부 및 -후부의 단백 소포의 생성도 왕성하였다(도 14).

프로토콜 A에 따른 분화 39일째의 H7 및 iPSC 유래 RGC에 대한 유세포 분석 결과
A) H7 derived-RGCs		B) iPSC derived-RGCs
Marker	Mean, %(n=2)	Marker	Mean, %(n=2)
Brn3A	94.4	Brn3A	77.0
Brn3B	90.2	Brn3B	61.4
Islet-1	17.8	Islet-1	12.0
KI67	29.1	KI67	25.4
Math5	95.0	Math5	73.0
NF200	95.5	NF200	87.5
Pax6	87.8	Pax6	56.2
Tuj1	90.5	Tuj1	89.0

실시예 8: 인간 만능줄기세포로부터 분화된 망막신경절세포의 전기생리학적 특성 및 기능평가

온세포 전압 클램프 기록(whole-cell voltage recordings)과 전류 클램프(current-clamp) 기록은 기록 챔버를 인공뇌척수용액으로 1분당 1 ~ 1.5 mL씩 관류하면서 32 ± 1 ℃에서 실시하였다. 인공뇌척수용액은 125 mM NaCl, 25 mM NaHCO₃, 2.5 mM KCl, 1.25 mM NaH₂PO₄, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 20 mM glucose, 1.2 mM pyruvate와 0.4 mM Na-ascorbate 조성으로 구성하였으며 pH 7.4에서 95% O₂와 5% CO₂포화시켰다. 패치 파이펫은 3.5 ~ 4.5 MΩ의 팁 저항을 지닌 것을 사용하였다. 온세포 구성 이후의 연속 저항(series resistance) 은 10 MΩ 에서 15 MΩ 사이였다. 기록은 EPC-10 amplifier(HEKA, Lambrecht-Pfalz, Germany)를 사용하여 실시하였고, 기록시 파이펫 용액은 143 mM K-gluconate, 7 mM KCl, 15 mM HEPES, 4 mM MgATP, 0.3 mM NaGTP, 4 mM Na-ascorbate와 0.1 mM EGTA로 조성하였으며 pH는 KOH를 사용하여 7.3에 맞췄다. 자발적 흥분 시냅스-후부 전류 [spontaneous excitatory postsynaptic currents(sEPSCs)]는 고정전압 -70 mV에서 기록하였다. 자발적 시냅스-후부 전류의 성상 규명을 위해 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione(CNQX, 50 μM), D-(-)-2-amino-5-phosphonopentanoic acid(AP5, 50 μM)와(+)-Bicuculline(50 μM)를 실험 챔버의 배스 용액에 공급하였다(Simga-Aldrich). CNQX는 AMPA 수용체, AP5는 NMDA 수용체, Bicuculline은 GABA 수용체를 각각 차단한다. Na+ 전류는 tetrodotoxin(TTX, 1 uM)로, K+ 전류는 4-aminopyridine(4-AP, 1 mM)(Simga-Aldrich) 차단제를 사용하여 확인하였다.

<8-1> 인간 만능줄기세포부터 분화된 망막신경절세포의 전기생리학적 특성평가

본 연구 발명으로 분화된 인간 만능줄기세포-유래 망막신경절세포의 전기적 특성을 평가를 위해, 먼저 프로토콜 A법에 의해 분화된 망막신경절세포를 평가하였다. 분화 39일째 실시한 활동전위평가에서 단계적 전류 주입에 반응하여 활동전위열차 형태의 강력하고 규칙적인 스파이킹이 관찰되었다(도 15A). 온세포 패치 클램프 기록결과 전압-개폐 소디움 통로가 존재함이 확인되었고, 이는 테트로도톡신(tetrodotoxin)에 의해 억제되었다(도 15B). 그러므로, 인간 만능줄기세포-유래 망막신경절세포는 전기적 흥분성 세포로 분화됨이 확인되었다. 또한 분화 59일째 활동전위평가에서는 단계적 전류주입에 반응하여 활동전위가 분화 39일째보다 더 성숙되어 있음이 평가되었다(도 16B). 태생학적 발생단계에 있어서 신경세포는 시간이 지날수록 성숙한 전기적인 점화가 가능한 세포로 발달하는 것으로 보고되어 있다. 이는 생체 내에서 관찰되는 것과 동일한 현상이다(Connors et al. 1982; McCormick & Prince, 1987). 프로토콜 B(도 17A 와 C(도 18A) 및 인간 유도만능줄기세포(도 20)에 의해서 분화된 망막신경절세포에서도 유사한 결과를 확인되었는데, 본 발명 프로토콜에 의해 분화된 망막신경절세포는 시간이 지날수록 전기적 성숙도 및 기능이 증가함이 확인되었다.

<8-2> 인간 만능줄기세포부터 분화된 망막신경절세포의 전기생리학적 기능평가

본 발명에 따라 인간 만능줄기세포로부터 분화된 망막신경절세포는 기능적인 흥분성 시냅스를 형성한다. 시냅스형성은 신경 네트워크 형성에 매우 중요한 단계이다. 인간 만능줄기세포 유래-망막신경절세포 간의 물질적 시냅스 형성은 초해상도 현미경을 이용해 시냅스-전부와 -후부의 소포 단백질의 위치로 확인되었다. 시냅시스는 Map2 항체 염색으로 검출되는 수상돌기 근처에서 발견되는 시냅스-전부와 -후부 구역이 수백 나노미터(nanometer) 내에 위치하는 것으로 정의한다. 시냅스-전부와 -후부 단백 소포에 대한 항체가 시냅시스를 검출하기 위해 사용되었다: 흥분성 글루타메이트성 시냅스-후부 단백소포인 PSD-95(glutamatergic postsynaptic density 95)와 시냅스-전부 단백소포인 시냅신1(synapsin1)에 대한 항체가 사용되었다. 만능줄기세포-유래 망막신경절세포에서 생성된 PSD-95는 수상돌기를 따라 바로 위치하거나 또는 100-nm 이내의 범위에 위치하였고, 시냅스-전부 소포인 시냅신1과 겹치지 않고, 나란히 놓인 상태로 위치하였다(도 10G, H). 이는 또 다른 인간 배아줄기세포의 세포주인 H7(도 13G, H) 및 인간 유도만능줄기세포(도 14K, L)에서 유래한 망막신경절세포 모두에서 확인되었는데, 이 현상은 인간 만능줄기세포 유래-망막신경절세포 간에 물리적 시냅스를 형성하고 있음을 입증하는 현상이다.

한편, 물리적으로 입증된 세포간의 시냅스를 전기생리학적으로 평가하였다. 자발적 흥분 시냅스-후부 전류(sEPSCs)가 인간 배아줄기세포 유래-망막신경절세포에서 분화유도 39일만에 다른 망막조직과의 공배양없이 검출되었다(도 15C). 이는 인간배아줄기세포 유래-망막신경절세포간의 기능적인 흥분성 시냅스가 형성되었음을 나타낸다. 또한 분화 59일(도 16E)에 평가한 sEPSCs는 빈도와 스파이킹의 깊이가 더 증가되었음이 확인되었고, 이는 신경분화로의 성숙도가 시간이 지날수록 더욱 진행되었음을 입증하는 현상이다. 생성된 sEPSCs 는 CNQX에 의해 차단되는 것이 확인되어, 이는 AMPA 수용체에 의한 흥분성 글루타메이트성 신경 세포의 한 종류임을 제시하는 현상이다. 프로토콜 B(도 17B)와 C(도 18B)에 의해서 분화된 망막신경절세포에서도 유사한 결과를 확인하였다.

실시예 9: 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포로부터 망막 광수용체세포로의 분화 및 망막신경절세포로의 분화 프로토콜의 비교

본 발명자들은 선행 특허(대한민국등록특허 제10-1268741호(2013.05.22.) 및 국제공개특허 WO2011/043591(2011.04.14.))를 통하여 줄기세포로부터 망막세포를 분화하는 방법을 개시한 바 있다.

상기 문헌에 개시된 방법에 의한 분화는 상기 문헌에 개시된 방법에 따르면 망막전구세포에서 광수용체세포의 분화가 극대화되었고, 그 비율은 약 80% 정도다. 망막신경절세포로의 분화도 일부 진행되기는 하였으나, 그 비율은 약 6%에 불과하였다.

<9-1> 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포로부터 망막 광수용체세포로의 분화

인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포로부터 안구영역전구체, 망막기원세포로의 분화는 상기 실시예 1~3과 동일하게 실시하였다.

분화 13일째, 상기 실시예 3에서 생성된 망막기원세포에 광수용체전구체 분화 배양액 [DMEM/F12(Invitrogen), 1 mM의 엘-글루타민(Invitrogen), 0.1 mM의 비필수 아미노산(Invitrogen), 0.1 mM의 머캅토에탄올(Sigma-Aldrich), 1% B27 보충제(Invitrogen), 1% N2 보충제(Invitrogen), 10 ng/mL의 노긴, 10 ng/mL의 IGF-1, 5 ng/mL의 FGF2, 50 ng/ml의 재조합 Wnt3a(recombinant Wnt3a, R&D Systems)]을 5일간 공급하면서 배양하여 광수용체전구체로 분화시켰다. 분화 18일째, 상기 광수용체전구체 배양액에 250 ng/mL의 재조합 Shh(recombinant Sonic Hedgehog amino terminal peptide, Shh, R&D Systems)]를 첨가하여 5일간 공급하면서 배양하여 광수용체세포로 분화시켰다. 분화 21일째, 상기 광수용체세포 배양액에 레티노익 산(RA) 500 nM을 첨가하여 29일까지 배양하여 생성된 광수용체세포를 성숙시켰다. 29일 이후의 광수용체세포의 유지 배양을 계속하는 경우에도 Wnt3a, Shh 및 RA이 첨가된 배양액을 계속적으로 공급하였다. 상기 배양법으로 생성된 세포를 면역형광법으로 분석시 광수용체세포 80% 이상, 망막신경절세포는 6% 정도로 확인되었다.

<9-2> 인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포로부터 망막 신경절세포로의 분화

인간 배아줄기세포 또는 인간 유도만능줄기세포로부터 망막신경절세포로의 분화는 안구영역전구체, 망막기원세포로의 분화는 광수용체세포로의 분화와 동일하나, 분화 14일째, 50 ng/ml의 재조합 Wnt3a를 3일 동안만 공급하고, 그 이후에는 제거하는 것이다. 또한, Shh 와 RA는 Wnt3a 제거 후 단계별로 공급한다. 즉, 망막신경절세포로의 분화가 시작된 이후 망막신경절세포로의 분화진행 및 성숙 시에는 Wnt3a는 제거하고, Shh 와 RA가 단계별 주입된 배양액이 필요하다.

상기 배양법으로 생성된 세포를 면역형광법으로 분석한 결과, 광수용체세포 관련 표지자인 Crx 와 Ret-P1은 관찰되지 않았다.

실시예 10: 미성숙 망막신경절세포로부터 성숙 망막신경절세포로의 분화: 2 단계

실시예 6로 생성된 성숙 망막신경절세포를 실시예 6의 분화배양액으로 성숙시킬 수도 있으나, 또한 분화 39일 이후부터 상기 분화배양액에서 IGF-1, Shh 및, 레티노익산을 제거한 배양액을 공급하면서 망막신경절세포를 성숙시킬 수도 있다. 분화 96일째의 전기생리학적 분석을 실시하여 성숙도를 평가하였다(도 19). 또한, 분화 32일부터 상기와 같이 망막신경절세포를 성숙시켰고, 그 결과 IGF-1, Shh 및 레티노익산을 모두 포함하는 배양액을 사용한 경우와 성숙도가 유사한 결과를 나타냄을 확인하였다.

실시예 11: 기타 Wnt 신호전달 작용제와 Shh 수용체 작용제에 의한 인간 배아줄기세포 유래-망막신경절세포의 분화

분화 14일째, 상기 실시예 3에서 생성된 망막기원세포에 분화배양액 [DMEM/F12(Invitrogen), 1 mM의 엘-글루타민(Invitrogen), 0.1 mM의 비필수 아미노산(Invitrogen), 0.1 mM의 머캅토에탄올(Sigma-Aldrich), 1% B27 보충제(Invitrogen), 1% N2 보충제(Invitrogen), 10 ng/mL의 노긴, 10 ng/mL의 IGF-1, 5 ng/mL의 FGF2, 50 ng/ml의 재조합 Wnt3a(recombinant Wnt3a, R&D Systems)]에서 50 ng/ml의 재조합 Wnt3a 대신 Wnt 신호전달 작용제인 BIO(6-bromoindirubin-3'-oxime) 2 μM 또는 노린(Norrin) 50 ng/mL을 첨가한 후, 3일간 공급하면서 배양하여 미성숙망막신경절세포로 분화시켰다. 분화 17일째, 생성된 미성숙망막신경절세포에 분화배양액 [DMEM/F12(Invitrogen), 1 mM의 엘-글루타민(Invitrogen), 0.1 mM의 비필수 아미노산(Invitrogen), 0.1 mM의 머캅토에탄올(Sigma-Aldrich), 1% B27 보충제(Invitrogen), 1% N2 보충제(Invitrogen), 10 ng/mL의 IGF-1, 250 ng/mL의 재조합 Shh (R&D Systems)]에서 250 ng/mL의 Shh 대신 Shh 수용체 작용제인 Purmorphamine 1μM을 첨가한 후 5일간 공급하면서 배양하여 성숙망막신경절세포로 분화시켰다. 분화 22일째, 상기 성숙망막신경절세포 배양액에 레티노익 산(RA) 500 nM을 첨가하여 39일까지 배양하여 생성된 성숙망막신경절세포를 성숙시켰다.

상기 배양법으로 생성된 세포의 평가를 면역형광법으로 망막신경절세포 단백질 표지자인 Islet1과 NF200를 사용하여 실시하였고, Wnt3a 및 Shh를 사용한 결과와 동일한 결과를 취득하였다(도 21).

실시예 12: 인간 만능줄기세포-유래 망막신경절세포의 세포주

줄기세포에서 각 장기의 성숙 세포로의 분화는 긴 시간이 소요되어, 전문가들의 많은 시간과 노력, 시약 등이 들어간다. 만약 분화의 최종, 또는 중간 단계의 세포를 세포주로 만들 수 있다면 이러한 분화유도 시간을 대폭 줄일 수 있다. 즉 분화하여 성숙한 세포를 만들 경우 줄기세포주로부터가 아니라, 제작된 세포주로부터 분화를 유도하여, 짧은 시간에 성숙 세포를 제작할 수 있다. 본 연구자는 이러한 목적으로 분화의 거의 최종 단계의 성숙한 세포로부터 세포주 제작을 시도하여 성공하였다. 줄기세포의 분화는 비대칭 세포분열(asymmetric division)로 진행된다. 즉 세포분열 후 생성되는 두 개의 딸세포가 각각 다른 세포운명을 가지고 있어, 한 세포는 원래의 줄기세포의 복제품이고, 다른 딸 세포는 줄기세포의 성향을 버리고 분화로 진행하는 세포이다. 본 연구진의 발명은 분화성숙한 세포들을 2차 배양을 하면. 성숙한 분화 세포는 환경의 변화로 사멸하고, 그 안에 있던 줄기세포의 성향을 갖는 세포들이 증식하여 세포주로 되게 하는 것이다. 특히 원래의 분화된 세포의 성향과 줄기세포의 성향을 동시에 갖는 분화 중간 단계의 세포주를 제작한 것은 중요한 발명이다.

세포는 분화 32일 또는 39일에 0.05% 트립신(Invitrogen)으로 해리시켰다. 습득된 세포를 다음의 배양액들 중 한 종류의 배양액을 첨가하여 각각 1.5 ~ 1.6x10⁴/cm²씩 배양 플라스크, 접시 또는 플레이트에 심어주었다. 하기의 두 배양액(배양액1, 배양액2) 모두 세포의 증식능력, 계대배양 횟수 및 주기, 특성 등은 동일하였다. 세포는 5% 이산화탄소(CO₂), 37 ℃에서 하기 배양액들을 각각 2 ~ 3일마다 교체하며 배양하였으며, 배양 증식된 세포는 1:6 ~ 1:10의 비율로 3 ~ 4일마다 0.05% 트립신 처리로 계대배양(passage)하였다.

배양액1: [IMDM(Invitrogen), 15% FBS, 1 mM의 엘-글루타민(Invitrogen), 0.1 mM의 머캅토에탄올(Sigma-Aldrich), 1% Insulin/Transferrin/Selenium-X(Invitrogen)].

배양액2: [IMDM(Invitrogen), 15% FBS, 1 mM의 엘-글루타민(Invitrogen), 0.1 mM의 머캅토에탄올(Sigma-Aldrich), 5 ng/mL의 FGF2, 10 ng/mL의 IGF-1, 5 ng/mL의 인간 재조합 EGF(human recombinant Epidermal growth factor Peprotech, Rocky Hill, NJ)].

세포는 계대배양수 20(passage number 20: p20)까지 배양 실시하였고, 배양액1 및 배양액2로 계대배양한 세포 모두 시험관 안에서(in vitro) 신경세포의 형태를 보였다(도 22). 계대배양수 15 ~ 17(p15 ~ p17) 에서 인간 만능줄기세포유래-망막신경절세포주의 세포 특성 및 신경적 기능 평가를 실시하였다. 망막신경절세포에 특이적인 단백표지자 항체에 의한 면역형광염색을 상기 실시예 7의 방법으로 측정하였고, 신경적 기능 평가는 살아있는 세포에서의 칼슘 이미지(Live Cell Ca²⁺imaging) 분석을 통해 평가하였다.

칼슘 이미지 분석은 18mm coverslip에 배양된 세포를 Tyrode's 용액(119 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 2 mM MgCl₂, 25 mM HEPES, 30 mM glucose, pH 7.4)으로 2~3회 세척 후, 1μM Fluo-4-AM(Life technologies, Carlsbad, CA, USA) 염료를 첨가하여 37℃에서 배양하였다. 15분간 배양 후 Tyrode's 용액으로 10분간 세척하였다. 시간차 이미지는 a 40 x(1.0 NA) oil lens 가 장착된 Olympus IX-71 inverted microscope(Olympus, Tokyo, Japan)와 EMCCD(iXon887, Andor Technologies, Belfast, Northern Ireland) 로 30분 동안 0.5초마다 얻었다. 10번째 이미지 프레임부터 세포를 1mM 글루타메이트로 10초간 자극하였다. 자극 후 세포는 Tyrode's 용액으로 계속 관류하였다.

면역형광염색결과 신경절세포의 특이적인 표지자인, Math5(98.9 %), Brn3B(52.4 %), 및 Brn3A(99.7 %)가 모두 발현되고 있음이 입증되었으며, 기능 표지자인, Thy1.2(86.1 %), TrkB(44.0 %), NMDAR-1(97.0 %) 표지자도 발현하고 있었다. 또한 신경세포의 특이적인 표지자인 Tuj1(100 %), 망막신경절세포의 축삭 표지자인 NF200(98.5%)도 강하게 발현되고 있었다. 한편, 세포 증식 표지자인 KI67(49.2 %) 평가되어 세포 증식능을 지닌 세포주로서 평가되었다(도 23).

세포 내 칼슘이미지는 망막신경절세포 세포주의 신경기능 시험결과. 계대배양한 세포에 1uM의 fluor-4 를 처리하고 1mM 글루타메이트로 자극을 준 결과, 다수의 살아있는 세포에서 glutamate 자극에 반응하여 세포질 내 칼슘이 상당량 증가됨이 확인되었다. 이는 망막신경절세포 세포주가 신경기능을 지니고 있음을 나타내는 현상이다(도 24).

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims

(a) 망막기원세포(retinal progenitor cell)를 IGF-1 또는 IGF-2인 IGF1R(insulin-like growth factor-1 receptor) 작용제, 및 Wnt3a, LiCl, BIO(6-bromoindirubin-3'-oxime), SB216763, SB415286, CHIR99021, TWS119, 켄폴론(kenpaullone), 알스터폴론(alsterpaullone), 인디루빈-3-옥심(indirubin-3-oxime), TDZD-8, Ro 31-8220 메탄설폰산염(Ro 31-8220 methanesulfonate salt), 및 노린(norrin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하여 미성숙망막신경절세포(immature retinal ganglion cell)로 분화시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 배지에서 상기 Wnt 신호전달 작용제를 제거하고, IGF-1 또는 IGF-2인 IGF1R 작용제를 포함하는 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 포함하는,
줄기세포를 성숙망막신경절세포(Mature retinal ganglion cell)로 분화하여, 성숙망막신경절세포를 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 배지는, IGF-1 또는 IGF-2인 IGF1R 작용제, 노긴(Noggin)인 BMP(bone morphogenetic protein) 신호전달 억제제, FGF(fibroblast growth factor)2인 FGF 신호전달 작용제 및 Wnt3a, LiCl, BIO(6-bromoindirubin-3'-oxime), SB216763, SB415286, CHIR99021, TWS119, 켄폴론(kenpaullone), 알스터폴론(alsterpaullone), 인디루빈-3-옥심(indirubin-3-oxime), TDZD-8, Ro 31-8220 메탄설폰산염(Ro 31-8220 methanesulfonate salt), 및 노린(norrin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 것인, 방법.
제2항에 있어서,
상기 (b) 단계는, 상기 (a) 단계의 배지에서 상기 BMP 신호전달 억제제, 상기 FGF 신호전달 작용제 및 상기 Wnt 신호전달 작용제를 제거하고, Shh(sonic hedgehog) 또는 퍼모파민(purmorphamine)인 Shh 신호전달 작용제를 추가로 첨가한 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 것인, 방법.
제3항에 있어서, 상기 방법은
(c) 상기 (b) 단계의 배지에서 추가로 RA(retinoic acid)를 포함하는 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제2항에 있어서, 상기 (b) 단계는,
(i) 상기 (a) 단계의 배지에서 상기 Wnt 신호전달 작용제를 제거하여, IGF-1 또는 IGF-2인 IGF1R 작용제, 노긴(Noggin)인 BMP 신호전달 억제제 및 FGF2인 FGF 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계; 및
(ii) 상기 (i) 단계의 배지에서 상기 BMP 신호전달 억제제 및 상기 FGF 신호전달 작용제를 제거하고, Shh(sonic hedgehog) 또는 퍼모파민(Purmorphamine)인 Shh 신호전달 작용제를 추가로 첨가한 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 포함하는, 방법.
제5항에 있어서,
상기 방법은 (c) 상기 (b)-(ii) 단계의 배지에서 추가로 RA(retinoic acid)를 포함하는 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제4항 또는 제6항에 있어서,
상기 방법은 (d) 상기 (c) 단계의 배지에서 IGF-1 또는 IGF-2인 IGF1R 작용제, Shh(sonic hedgehog) 또는 퍼모파민(Purmorphamine)인 Shh 신호전달 작용제 및 RA로 이루어진 군으로부터 선택된 1 이상의 성분을 제거한 배지에서 미성숙망막신경절세포 또는 성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계의 망막기원세포는
(a') 줄기세포를 IGF-1 또는 IGF-2인 IGF1R 작용제, Dkk-1, Dkk-2, Dkk-3 및 Dkk-4로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 Wnt 신호전달 억제제 및 노긴(Noggin)인 BMP 신호전달 억제제를 포함하는 배지에서 배양하여 부유 응집체 형태의 안구영역전구체(eye field precursor)로 분화시키는 단계; 및
(b') 상기 (a') 단계의 부유 응집체 형태의 안구영역전구체를 (a') 단계의 배지에 추가로 FGF2인 FGF 신호전달 작용제를 첨가한 배지에서 배양하여 망막기원세포(retinal progenitor cell)로 분화시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것인, 방법.
제8항에 있어서,
상기 (a') 단계는 1일 내지 30일 동안 수행되고, 상기 (b') 단계는 5일 내지 15일 동안 수행되는 것인, 방법.
제8항에 있어서,
상기 줄기세포는 골수줄기세포(bone marrow stem cell, BMS), 제대혈줄기세포(cord blood stem cell), 양수줄기세포(amniotic fluid stem cell), 지방줄기세포(fat stem cell), 망막줄기세포(retinal stem cell, RSC), 망막 내 뭘러아교세포, 배아줄기세포(embryonic stem cell, ESC), 유도 전분화능 줄기세포(induced pluipotent stem cell, iPSC) 및 체세포핵치환줄기세포(somatic cell nuclear transfer cell, SCNT)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계는 1 내지 10일 동안 수행되며, 상기 (b) 단계는 1 내지 120일 동안 수행되는 것인, 방법.
미성숙망막신경절세포(immature retinal ganglion cell)를 IGF-1 또는 IGF-2인 IGF1R(insulin-like growth factor-1 receptor) 작용제, 및 Shh(sonic hedgehog) 또는 퍼모파민(Purmorphamine)인 Shh 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는, 미성숙망막신경절세포를 성숙망막신경절세포로 분화하여, 성숙망막신경절세포를 제조하는 방법.
제12항에 있어서,
상기 방법은 상기 IGF-1 또는 IGF-2인 IGF1R 작용제, 및 Shh(sonic hedgehog) 또는 퍼모파민(Purmorphamine)인 Shh 신호전달 작용제를 포함하는 배지에 RA(retinoic acid)가 추가로 첨가된 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
삭제
제1항에 있어서,
상기 (a) 및 (b) 단계의 배지 내 IGF1R 작용제의 농도는 0.01 내지 100ng/ml인 것인, 방법.
제12항에 있어서,
상기 배지 내 IGF1R 작용제의 농도는 0.01 내지 100ng/ml인 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 단계에서 상기 Wnt 신호전달 작용제 중 LiCl, BIO (6-bromoindirubin-3'-oxime) 및 SB415286을 제외한 나머지 Wnt 신호전달 작용제의 배지 내 농도는 0.01 내지 500 ng/ml인 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 Wnt 신호전달 작용제 중 LiCl의 배지 내 농도는 0.1 내지 50 mM이고, BIO의 배지 내 농도는 0.1 내지 50 μM이고, SB415286의 배지 내 농도는 0.1 내지 500 μM인 것인, 방법.
삭제
제2항 또는 제8항에 있어서,
상기 배지 내 BMP 신호전달 억제제의 농도는 0.01 내지 100ng/ml인 것인, 방법.
삭제
제2항 또는 제8항에 있어서,
상기 배지 내 FGF 신호전달 작용제의 농도는 0.01 내지 100ng/ml인 것인, 방법.
삭제
제3항, 제5항 또는 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배지 내 Shh 신호전달 작용제의 농도는 0.1 내지 5000ng/ml인 것인, 방법.
제4항, 제6항 또는 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 배지 내 RA의 농도는 0.5 내지 10,000nM인 것인, 방법.
삭제
제8항에 있어서,
상기 배지 내 Wnt 신호전달 억제제의 농도는 0.01 내지 10,000ng/ml인 것인, 방법.
제1항 또는 제12항에 있어서,
상기 방법은 분화된 세포가 목적하는 성숙망막신경절세포로 분화되었는지 여부를 판정하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제28항에 있어서,
상기 성숙망막신경절세포로 분화되었는지 여부는 Brn3B, Brn3A, Islet-1, NF200, Tuj1, Thy1.2, TrkB, NMDAR1, Map2, Vglut1, PSD-95, Synaptophysin 및 Synapsin1으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현 여부를 측정함으로써 수행되는 것인, 방법.
제8항에 있어서,
상기 (b') 단계에서 부유 응집체 형태의 안구영역전구체는 폴리-디-라이신, 라미닌, 폴리-L-라이신, 매트리젤(matrigel), 아가(agar), 폴리오르니틴(polyornithine), 젤라틴, 콜라겐, 피브로넥틴(fibronectin) 및 비트로넥틴(vitronectin)으로 이루어진 군에서 선택되는 세포 외 기질(extracellular matrix)로 코팅된 플레이트에 접착된 상태로 배양되는 것인, 방법.
제8항에 있어서,
상기 (b') 단계에서 부유 응집체 형태의 안구영역전구체는 200 내지 400개의 세포로 구성된 부유 응집체 형태인 것인, 방법.
제8항에 있어서,
상기 (a') 단계의 배지는 DMEM/F12, 10% 넉아웃 혈청 대체제 및 1% B27 보충제(B27 supplement)를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제1항에 있어서,
상기 (a) 및 (b) 단계의 배지는 DMEM/F12, 1% B27 보충제 및 1% N2 보충제(N2 supplement)를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제8항에 있어서,
상기 (b') 단계의 배지는 DMEM/F12, 1% B27 보충제 및 1% N2 보충제(N2 supplement)를 추가로 포함하는 것인, 방법.
제1항 또는 제12항에 있어서,
상기 미성숙망막신경절세포는 (i) Brn3B, Brn3A, Islet-1, NF200 및 Tuj1으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자 및 (ii) Math5 유전자를 발현하는 것인, 방법.
제1항 또는 제12항에 있어서,
상기 방법에 의해 수득된 성숙망막신경절세포는 전체 세포 중 60 - 95 % 이상을 차지하는 것인, 방법.
(a) 망막기원세포(retinal progenitor cell)를 IGF-1 또는 IGF-2인 IGF1R(insulin-like growth factor-1 receptor) 작용제; 및 Wnt3a, LiCl, BIO(6-bromoindirubin-3'-oxime), SB216763, SB415286, CHIR99021, TWS119, 켄폴론(kenpaullone), 알스터폴론(alsterpaullone), 인디루빈-3-옥심(indirubin-3-oxime), TDZD-8, Ro 31-8220 메탄설폰산염(Ro 31-8220 methanesulfonate salt), 및 노린(norrin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하여 미성숙망막신경절세포(immature retinal ganglion cell)로 분화시키는 단계;
(b) 상기 (a) 단계의 배지에서 상기 Wnt 신호전달 작용제를 제거하고, IGF-1 또는 IGF-2인 IGF1R 작용제를 포함하는 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하여 성숙망막신경절세포를 수득하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계에서 수득된 분리된 성숙망막신경절세포에 성숙망막신경절세포의 사멸억제 또는 증식촉진 후보물질을 처리하는 단계; 및
(d) 후보물질 비처리군과 비교하였을 때, 상기 후보물질이 성숙망막신경절세포의 사멸 억제를 높이거나, 성숙망막신경절세포의 증식을 촉진시키는 경우, 성숙망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질로 각각 판정하는 단계를 포함하는,
성숙망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질을 스크리닝하는 방법.
제37항에 있어서, 상기 성숙망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질은 녹내장 또는 시신경병증의 치료제인 것인, 방법.
(a) 미성숙망막신경절세포(immature retinal ganglion cell)를 IGF-1 또는 IGF-2인 IGF1R(insulin-like growth factor-1 receptor) 작용제 및 Shh(sonic hedgehog) 또는 퍼모파민(Purmorphamine)인 Shh(sonic hedgehog) 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하여 성숙망막신경절세포를 수득하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득된 분리된 성숙망막신경절세포에 성숙망막신경절세포의 사멸억제 또는 증식촉진 후보물질을 처리하는 단계; 및
(c) 후보물질 비처리군과 비교하였을 때, 상기 후보물질이 성숙망막신경절세포의 사멸 억제를 높이거나, 성숙망막신경절세포의 증식을 촉진시키는 경우, 성숙망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질로 각각 판정하는 단계를 포함하는,
성숙망막신경절세포의 사멸억제물질 또는 증식촉진물질을 스크리닝하는 방법.
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(a) 망막기원세포(retinal progenitor cell)를 IGF-1 또는 IGF-2인 IGF1R(insulin-like growth factor-1 receptor) 작용제, 및 Wnt3a, LiCl, BIO(6-bromoindirubin-3'-oxime), SB216763, SB415286, CHIR99021, TWS119, 켄폴론(kenpaullone), 알스터폴론(alsterpaullone), 인디루빈-3-옥심(indirubin-3-oxime), TDZD-8, Ro 31-8220 메탄설폰산염(Ro 31-8220 methanesulfonate salt), 및 노린(norrin)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 Wnt 신호전달 작용제를 포함하는 배지에서 배양하여 미성숙망막신경절세포(immature retinal ganglion cell)로 분화시키는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 배지에서 상기 Wnt 신호전달 작용제를 제거하고, IGF-1 또는 IGF-2인 IGF1R 작용제를 포함하는 배지에서 미성숙망막신경절세포를 배양하는 단계를 포함하는,
성숙망막신경절세포주를 제조하는 방법.
제42항에 있어서,
상기 (b) 단계의 배지는 추가로 Shh(sonic hedgehog) 또는 퍼모파민(Purmorphamine)인 Shh 신호전달 작용제, RA(retinoic acid) 또는 둘 다를 포함하는 것인, 방법.
제42항 또는 제43항에 있어서,
상기 (b) 단계에서 배양한 세포를 분리한 다음, 이를 (i) IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Media), 엘-글루타민, 머캅토에탄올 및 인슐린/트랜스페린/셀레늄-X(Insulin/Transferrin/Selenium-X)를 포함하는 배지, 또는 (ii) IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Media), 엘-글루타민, 머캅토에탄올, FGF2, IGF-1 및 EGF를 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.