CN106795494A

CN106795494A - 从干细胞分化为视网膜神经节细胞的方法

Info

Publication number: CN106795494A
Application number: CN201580054677.6A
Authority: CN
Inventors: 朴圣燮; 金志妍
Original assignee: Seoul National University Industry Foundation; Seoul National University Hospital
Current assignee: Kravis therapy
Priority date: 2014-08-27
Filing date: 2015-08-27
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2035-08-27
Also published as: JP2019208500A; EP3186364A1; EP3186364A4; US10570370B2; JP6493938B2; US11168302B2; WO2016032263A1; KR20160025709A; CN106795494B; KR101712556B1; US20200157499A1; US20180016552A1; JP2017528163A

Abstract

提供了通过使干细胞分化为视网膜神经节细胞来制备视网膜神经节细胞的方法，通过该方法分化的视网膜神经节细胞，使用通过该方法分化的视网膜神经节细胞来筛选视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂的方法，包含通过该方法分化的视网膜神经节细胞的用于筛选视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂的试剂盒，包含视网膜神经节细胞的用于治疗青光眼或视神经病变的药物组合物，包括向疑似患有青光眼或视神经病变的个体施用视网膜神经节细胞的步骤来治疗青光眼或视神经病变的方法，以及制备成熟视网膜神经节细胞系的方法。

Description

从干细胞分化为视网膜神经节细胞的方法

发明领域

本发明涉及通过使干细胞分化为视网膜神经节细胞来制备视网膜神经节细胞的方法，通过该方法分化的视网膜神经节细胞，使用通过该方法分化的视网膜神经节细胞来筛选视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂的方法，包含通过该方法分化的视网膜神经节细胞的用于筛选视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂的试剂盒，包含视网膜神经节细胞的用于治疗青光眼或视神经病变的药物组合物，包括向疑似患有青光眼或视神经病变的个体施用视网膜神经节细胞的步骤来治疗青光眼或视神经病变的方法，以及制备成熟视网膜神经节细胞系的方法。

发明背景

失明是缺失视知觉的医学病况。数以千万计的人，占世界人口的0.2％至0.5％，受到失明的影响，并且在个人、社会和经济方面遭受巨大的损失。视网膜青光眼或视神经病变是世界范围内失明的主要原因之一。青光眼是最常见的进行性视神经病变，导致不可逆的失明。大于40岁的人的青光眼的全球患病率高至约2％至3％。在全世界，在2010年估计有六千万人患有青光眼。青光眼的患病数预计在2020年增加到八千万(Quigley HA和BromanAT,Br J Ophthalmol 2006；90:262-267)。在社会上活动频繁的中年一代中青光眼的患病率为2％至3％，并且预计患者的数量将随着人群年龄而显著增加，这将变成社会和经济负担。目前，降低眼内压是临床上应用于青光眼治疗的唯一方法，但已知青光眼患者的很大部分仍然进展到失明。已知降低眼内压是仅能够抑制青光眼进展的保守性方法，并且所述青光眼的治疗是不可能的。

同时，视神经病变通常描述为由不同因素引起的视神经异常，并包括视神经炎、缺血性视神经病变、毒性或缺陷性视神经病变、遗传性视神经病变、视神经萎缩等。其中，干细胞疗法可对由视神经退化和损伤引起的疾病有用。

具体地，青光眼由视网膜神经节细胞(RGC)的退化和损失引起。在通过眼睛之后，光在光感受器细胞中转换成电信号，并且视网膜神经节细胞将这些电信号传导到脑的中央视神经。

另一方面，干细胞/再生疗法可以是青光眼和视神经病变的最好疗法。由单个细胞类型的退化和损失引起的疾病是干细胞疗法的擅长目标。具体地，由于眼睛非常易于手术操作，并且已经建立了多种手术程序，在将干细胞应用至病变处没有困难并且眼睛可以是开发治疗药物的模型。

青光眼和视神经病变的干细胞疗法的目标是：1)用新的RGC替换退化的受损RGC(细胞替换疗法，神经再生)，2)诱导对退化的受损RGC的抗炎症、抗细胞死亡、神经保护和血管保护的治疗效果，作为干细胞疗法的旁分泌效应，以及3)使用用于治疗青光眼的干细胞来选择和开发新药，目前尚未开发出针对青光眼的直接治疗剂。该疗法可导致使用患者来源的多能干细胞的个性化干细胞疗法。视网膜神经节细胞的高效再生在治疗组合物或治疗药物模型的开发中是十分重要的。具体地，问题在于不能在体外制备因疾病而退化或受损的视网膜神经节细胞，因此，不可能使用正常或异常视网膜神经节细胞来开发青光眼或视神经病变的新药。因此，如果从干细胞产生大量视网膜神经节细胞，则可能产生用于视网膜神经节细胞相关疾病如青光眼和视神经病变的疾病模型，因此可以容易地开发针对这些疾病的药物。特别是，产生从患者来源的诱导多能干细胞分化的RGC(iPSC-RGC)使得可能开发能够预防或抑制视神经退化的新药。此外，本发明人在之前的专利中公开了从干细胞分化视网膜细胞的方法(韩国专利第10-1268741号(2013.05.22.)和WO2011/043591(2011.04.14))。然而，根据上述文件中公开的方法，仅约6％的视网膜祖细胞分化为视网膜神经节细胞。因此，仍然需要开发能够最大化分化为视网膜神经节细胞的分化方法。发明公开

技术问题

本发明人试图产生从人胚胎干细胞分化的视网膜神经节细胞，但它们表现不足的分化。因此，本发明人做出很多努力以开发能够从干细胞产生视网膜神经节细胞的新方法。因此，他们开发了在5周时间的短时间段内在化学定义的培养环境下以高产率将人胚胎干细胞分化为视网膜神经节细胞的方法，所述方法没有基因植入或与视网膜组织的共培养。他们发现根据本发明的方法开发的视网膜神经节细胞在数量上是起始人胚胎干细胞的约200倍，并且视网膜神经节干细胞具有出色的神经生理功能，从而完成了本发明。

技术方案

本发明的目的是提供通过将干细胞分化为成熟视网膜神经节细胞来制备成熟视网膜神经节细胞的方法，其包括(a)在包含IGF1R(胰岛素样生长因子-1受体)活化剂和Wnt信号转导途径活化剂的培养基中培养视网膜祖细胞以使它们分化为未成熟的视网膜神经节细胞；以及(b)在通过从步骤(a)的培养基移除Wnt信号转导途径活化剂并向其添加IGF1R活化剂而制备的培养基中培养所述未成熟的视网膜神经节细胞。

本发明的另一目的是提供通过将未成熟的视网膜神经节细胞分化为成熟视网膜神经节细胞来制备成熟视网膜神经节细胞的方法，其包括在含有IGF1R活化剂和Shh(音猬因子)信号转导途径活化剂的培养基中培养未成熟的视网膜神经节细胞。

本发明的又一目的是提供筛选成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂的方法，其包括(a)用死亡抑制剂候选物或增殖促进剂候选物处理通过上述方法获得和分离的成熟视网膜神经节细胞；以及(b)当与非候选物处理组比较，所述候选物抑制成熟视网膜神经节细胞的死亡或促进成熟视网膜神经节细胞的增殖时，确定所述候选物是成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂。

本发明的又一目的是提供根据本发明的上述方法制备的未成熟的视网膜神经节细胞和成熟视网膜神经节细胞。

本发明的又一目的是提供筛选成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂的试剂盒，其包含成熟视网膜神经节细胞。

本发明的又一目的是提供治疗青光眼或视神经病变的药物组合物，其包含成熟视网膜神经节细胞。

本发明的又一目的是提供治疗青光眼或视神经病变的方法，其包括向疑似患有青光眼或视神经病变的个体施用成熟视网膜神经节细胞的步骤。

本发明的又一目的是提供制备成熟视网膜神经节细胞系的方法，其包括(a)在包含IGF1R活化剂和Wnt信号转导途径活化剂的培养基中培养视网膜祖细胞以使它们分化为未成熟的视网膜神经节细胞；以及(b)在通过从步骤(a)的培养基移除Wnt信号转导途径活化剂和向其添加IGF1R活化剂而制备的培养基中培养所述未成熟的视网膜神经节细胞。

有利效果

根据本发明的方法，可以以高产率从干细胞分化为视网膜神经节细胞，并且通过本方法获得的视网膜神经节细胞可以用于诸如青光眼或视神经病变的疾病的治疗剂的选择测试，还可用于细胞疗法。

附图简要说明

图1显示细胞形态学显微照片。

(A)未分化状态的人胚胎干细胞的细胞絮状物(30代)：从第29代细胞培养5天后。细胞呈未分化状态的人胚胎干细胞的典型细胞絮状物，特征为与邻近的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞明确分离并具有光滑的表面和均匀的形态。

(B)悬浮聚集物，其中在从图1(A)的未分化的人胚胎干细胞絮状物分离后所述悬浮聚集物在超低吸附平板培养4天。悬浮聚集物具有球形形态，并且一个悬浮聚集物由约292±53个细胞组成。

(C)至(F)分化为视网膜神经节细胞的细胞形态学显微照片。

(C)诱导分化后第14天的细胞：将悬浮聚集物转移至聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的平板并将它们在其中培养10天后的细胞形态，即，在诱导未分化的人胚胎干细胞的分化之后第14天。观察到细胞从悬浮聚集物分离并经历分化，并且具有分化早期的形态学特征，具有较少的细胞质和既圆又大的细胞核。

(D)诱导分化后第17天的细胞：诱导未分化的人胚胎干细胞的分化之后第17天的细胞形态。细胞分化，伴随活性增殖，处于活性增殖和分化的细胞絮状物形成圆形花状玫瑰花样结构。

(E)诱导分化后第22天的细胞：随着分化进展，细胞变得更富含细胞质，并且它们的细胞核大小比图1(D)中的细胞核更小。观察到细胞絮状物分化为具有短或长神经元轴突的神经元。

(F)诱导分化后第39天的细胞：大部分细胞分化为神经元。随着分化进展至神经元，与图1(E)中诱导分化后第22天的细胞相比，细胞显示相同的细胞结构，但具有成熟的神经元性状。神经细胞体形成多个簇，其通过长神经元轴突彼此连接。

*显微镜视野：(A)至(F)(左侧：40倍放大倍数；右侧：100倍放大倍数)。

图2显示从人新生儿包皮BJ-1成纤维细胞重编程的诱导多能干细胞的特征。

(A)人诱导多能干细胞的相差显微镜图像：从第6代细胞培养6天后的细胞系。干细胞特征为与作为饲养细胞的邻近的小鼠胚胎体细胞明确分离并具有光滑的表面和均匀的形态。(B)和(C)为显示诱导多能干细胞的人胚胎干细胞特征的碱性磷酸酶、Nanog和SSEA-4染色结果。(D)为评估从成纤维细胞生成的诱导多能干细胞的多能性的畸胎瘤测定的结果。在从成纤维细胞生成的诱导多能干细胞植入免疫抑制的SCID小鼠的背部表面之后10周，诱导多能干细胞发育成畸胎瘤，具有三种胚层——外胚层(左侧：神经组织)，中胚层(中间：软骨)和内胚层(右侧：消化系统)，显示多能性。

*比例尺：(A)、(B)、(C):200μm。

图3为显示根据本发明从人多能干细胞分化为视网膜神经节细胞的示意图。参照视网膜神经节细胞的胚胎学发育，在每个阶段考虑化学定义的培养基、细胞体外粘附和分化因子。基于小鼠的胚胎学发育的阶段和期间来计划胚胎学发育的阶段和期间。

图4为显示根据本发明的从人多能干细胞分化为视网膜神经节细胞的示意图，其根据在诱导分化后第14天至第17天处理Wnt3a 3天的方案进行(称为方案A)。该方案为本发明的方案的原型。指出各个分化阶段的细胞类型和分化标志物，并且在图1给出根据该方案分化的细胞的照片。

图5为显示根据本发明的从人多能干细胞分化为视网膜神经节细胞的示意图，其根据在诱导分化后第11天至第14天处理Wnt3a 3天的方案进行(称为方案B)。

图6为显示根据本发明的从人多能干细胞分化为视网膜神经节细胞的示意图，其根据在诱导分化后第11天至第17天处理Wnt3a 6天的方案进行(称为方案C)。

图7显示根据方案A的诱导人胚胎干细胞系H9分化后第17天检查细胞标志物表达的结果。

(A)观察到对视网膜祖细胞标志物Rax和Pax6均为阳性的细胞。视网膜祖细胞具有对这两种标志物为阳性的特征。

(B)观察到未成熟的视网膜神经节细胞的标志物Math5。与全部细胞(DAPI染色的)相比，几乎100％的细胞为Math5阳性的。

(C)在几乎所有细胞观察到视网膜神经节细胞特异性标志物Brn3B。这表明细胞成为视网膜神经节细胞的命运由Math5决定，然后它们开始分化为视网膜神经节细胞。

(D)所有细胞对视网膜神经节细胞特异性标志物之一Brn3A(绿色染色：核染色)和对神经元细胞的细胞质特异的Tuj1(红色染色：也被称为β-微管蛋白III)均为阳性。

(E)约20％的细胞对视网膜神经节细胞亚型的标志物Islet-1(红色：核染色)和神经元轴突特异性标志物NF200(绿色)均为阳性。

*比例尺：A:50μm；B:200μm&50μm；C至E:100μm&50μm。

全部细胞的核染色：DAPI(蓝色染色)。

图8显示根据方案A的诱导人胚胎干细胞系H9分化后第39天检查标志物表达的流式细胞术结果(实验结果)。

图9显示根据方案A的诱导人胚胎干细胞系H9分化后第39天检查细胞标志物表达的结果。

(A)仍然观察到在图7中观察到的视网膜神经节细胞特异性标志物(A)Pax6、(B)Brn3B和(C)Brn3A。

(D)几乎所有细胞对Brn3A(绿色：细胞核)和Tuj1(红色：细胞质染色，轴突和树突均被染色)均为阳性。与图7的第17天的细胞相比，神经元轴突和树突的数量和厚度增加。观察到轴突棘突和环，细胞之间的突触相互作用，以及树突树和棘突。

(E)观察到对Islet-1(红色：细胞核)和NF200(绿色：轴突)均为阳性的细胞。与图7的第17天的细胞相比，轴突的数量增加并观察到成熟形式。

(F)Brn3B(绿色)和Tuj1(红色)：大部分细胞絮状物对视网膜神经节细胞特异性染色Brn3B和Tuj1均为阳性。

(G)Brn3B(绿色)和Thy1.2(红色)：观察到Brn3B的核染色和Thy1.2的细胞质染色，它们是视网膜神经节细胞的特征。

(H)Brn3A(绿色)和Thy1.2(红色)：观察到Brn3B的核染色和Thy1.2的细胞质染色，它们是视网膜神经节细胞的特征。

(I)Map2(绿色)：观察到包括树突的细胞质染色。

(J)通过使抗体与诱导分化后第39天的人胚胎干细胞来源的视网膜神经节细胞的溶解产物反应而获得的免疫印迹结果表明视网膜神经节细胞特异性蛋白。

*比例尺：A至C:50μm；D:200μm,50μm&20μm；E:100μm,50μm&20μm；F:200μm&100μm；G:20μm；H:100μm；I:50μm。

全部细胞的核染色：DAPI(蓝色)。

图10显示根据方案A的诱导人胚胎干细胞系H9分化后第59天检查细胞标志物表达的结果。

(A)观察到对Brn3A(绿色：细胞核)和Tuj1(红色：细胞质染色，轴突和树突均被染色)均为阳性的细胞。与图8的第39天的细胞相比，轴突和树突的数量和厚度增加。

(B)Tuj1：观察到轴突棘突和环，细胞之间的突触相互作用，以及树突树和棘突。

(C)NF200：观察到树突棘突和轴突环。

(D)突触蛋白1：在突触前囊泡中观察到功能成熟斑点和树突形式的参与神经递质释放的代表性蛋白突触蛋白1，表明发生与其他神经元的突触相互作用以传导细胞之间的神经电刺激。

(E)Map2/Vglut1：图(D)的突触蛋白1指示的突触前囊泡的大部分为谷氨酸能囊泡(Vglue1：红色)。观察到Vglut1以及Map2阳性的树突(绿色)的存在。产生谷氨酸能兴奋性神经元。

(E)Map2/Vgat：图(D)的突触蛋白1指示的突触前囊泡的一小部分为GABA能囊泡(Vgat：红色)。观察到Vgat以及Map2阳性的树突(绿色)的存在。

(G)PSD-95/Map2：在突触后囊泡中观察到蛋白形成，并且兴奋性突触标志物PSD-95沿树突分布(Map2)。

(H)突触蛋白1/PSD-95：通过超高分辨率显微镜的生理突触：观察到突触前突触蛋白1与突触后兴奋性PSD-95之间的突触。可通过突触前和突触后囊泡复合体的并置鉴定生理突触。具有引起作为“成熟视网膜神经节细胞”的电生理学特征的自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)的神经递质，指示视网膜神经节细胞的功能成熟。

*比例尺:A:100μm；B:100μm&20μm；C:20μm；D:50μm&20μm；E:20μm；F:20μm；G:50μm&1μm；H:2μm&0.5μm。

细胞的核染色：DAPI(蓝色)。

图11显示根据方案B的诱导人胚胎干细胞系H9分化后第39天检查细胞标志物表达的结果。

(A)Math5

(B)Brn3B

(C)Brn3A

(D),(E)Islet-1(红色：细胞核)和NF200(绿色：轴突)

(F)NF200

(G)Brn3A,Tuj1

(H)Tuj1

(I)突触蛋白1/Tuj1

*比例尺:A至I:50μm.图11H的核染色：DAPI(蓝色)。

图12显示根据方案C的诱导人胚胎干细胞系H9分化后第39天检查细胞标志物表达的结果。

(A)Math5

(B)Pax6

(C)Brn3B

(D)Brn3A

(E)Brn3A,Tuj1

(F)Islet-1(红色：细胞核)和NF200(绿色：轴突)

(G)TrkB：观察到成熟视网膜神经节细胞的神经营养因子受体标志物TrkB的表达。

(H)突触蛋白1/PSD-95

*比例尺:A至H:50μm。

图13显示根据方案A的诱导人胚胎肝细胞系H7分化后第39天检查细胞标志物表达的结果。

(A)Math5

(B)Brn3B

(C)Brn3A

在几乎所有细胞中观察到视网膜神经节细胞的特征标志物。

(D)Brn3A(绿色：细胞核)和Tuj1(红色：细胞质染色，轴突和树突均被染色)。

(E),(F)Islet-1(红色：细胞核)和NF200(绿色：轴突)

(G)突触蛋白1(绿色)，Tuj1(红色)：突触前标志物突触蛋白1沿Tuj1阳性轴突分布。

(H)突触蛋白1/PSD-95：突触前标志物突触蛋白1和突触后标志物PSD-95彼此接近，指示H7细胞系通过方案A分化为具有成熟电生理学功能的“成熟视网膜神经节细胞”，与H9细胞系类似。

*比例尺:A:50μm；B,C:100μm；D:200μm；E:200μm&20μm；F:100μm；G:20μm；H:20μm。

图13(E)的核染色：DAPI(蓝色)。

图14显示根据方案A的诱导人诱导多能干细胞分化后第39天检查细胞标志物表达的结果。

(A)Math5

(B)Pax6

(C)Brn3B

(D)Brn3A

(E)NF200

(F)Brn3A(红色：细胞核)和NF200(绿色：轴突)

(G)Islet-1(红色：细胞核)和NF200(绿色：轴突)：观察到视网膜神经节细胞亚型之一。

(H)NF200,Islet-1

(I)Brn3A,Tuj1

(J)Tuj1:观察到成熟神经元的轴突的分化。

(K)突触蛋白1(绿色)，Tuj1(红色)：突触前标志物突触蛋白1沿Tuj1阳性轴突分布。

(L)突触蛋白1/PSD-95：突触前标志物突触蛋白1和突触后标志物PSD-95彼此接近，表明人诱导多能干细胞通过方案A分化为具有成熟电生理学功能的“成熟视网膜神经节细胞”，与H9细胞系类似。

*比例尺:A至C,E to H,J,L:50μm；D,I:100μm；K:20μm。

图15显示根据方案A的诱导人胚胎干细胞系H9分化后第39天的电生理学分析的结果。

(A)在人胚胎干细胞来源的视网膜神经节细胞中观察到响应于步阶电流注入(pA)的强烈规则尖峰的动作电位序列，指示产生的视网膜神经节细胞获得成熟的电生理学特征。通常，随着神经元成熟，动作电位响应于电流注入从单个短尖峰转变成多个持续尖峰。

(B)人胚胎干细胞来源的视网膜神经节细胞的电压门控钠通道：对从保持电位-80mV阶梯去极化至+40mV的电流响应重叠。通过应用河豚毒素(TTX)完全阻断快速活化和未活化的钠内向电流。

(C)在诱导分化后第39天未与其他视网膜组织共培养的人胚胎干细胞来源的视网膜神经节细胞中检测到自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)，表明在人胚胎干细胞来源的视网膜神经节细胞之间形成功能性兴奋性突触。

图16显示根据方案A的诱导人胚胎干细胞系H9分化后第59天的电生理学分析的结果。

(A)钾电流：4-氨基吡啶(4-AP)阻断钾外向电流的快速活化部分。

(B)在人胚胎干细胞来源的视网膜神经节细胞中观察到响应于步阶电流注入(pA)的强烈规则尖峰的动作电位序列。与诱导分化后第39天的尖峰数量相比，尖峰数量增加。

(C)步阶电流注入(pA)诱发的尖峰的数量的曲线图：尖峰的数量与注入电流的强度成比例地增加。

谷氨酸能突触前囊泡的染色图像(Vglut1)在树突(Map2阳性)中分布。

(E)自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)：AMPA受体拮抗剂CNQX阻断sEPSC的出现。形成谷氨酸能兴奋性突触。

图17显示根据方案B的诱导人胚胎干细胞系H9分化后第96天的电生理学分析的结果。

(A)观察到响应于步阶电流注入(pA)的尖峰动作电位序列。

(B)观察到自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)。AMPA受体拮抗剂CNQX阻断sEPSC的出现。形成谷氨酸能兴奋性突触。

图18显示根据方案C的诱导人胚胎干细胞系H9分化后第66天的电生理学分析的结果。

(A)观察到响应于步阶电流注入(pA)的尖峰动作电位序列。

(B)观察到自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)。形成谷氨酸能兴奋性突触。

图19显示根据方案B的诱导人胚胎干细胞系H9分化后第39天的在供应排除IGF-1、Shh和RA(视黄酸)的分化培养基时成熟视网膜神经节细胞的电生理学分析的结果。

(A)在诱导分化后第96天在人胚胎干细胞来源的视网膜神经节细胞中观察到响应于步阶电流注入(pA)的强烈规则尖峰的动作电位序列。

(B)在诱导分化后第96天在人胚胎干细胞来源的视网膜神经节细胞中观察到自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)。形成谷氨酸能兴奋性突触。

图20显示根据方案A的诱导人诱导多能干细胞分化后第39天的电生理学分析的结果。

(A)在人诱导多能干细胞来源的视网膜神经节细胞中观察到响应于步阶电流注入(pA)的强烈规则尖峰的动作电位序列，表明产生的视网膜神经节细胞获得成熟的电生理学特征。

(B)钾电流：4-氨基吡啶(4-AP)阻断钾外向电流的快速活化部分。

图21显示通过其他Wnt信号转导途径和Shh受体活化剂的人胚胎干细胞来源的视网膜神经节细胞的分化。

除上述不同方法中使用的Wnt3a之外，根据方案A的时间计划表使用2μM Wnt信号转导途径活化剂BIO(6-溴靛玉红-3’-肟)、50ng/mL Norrin、1μM Shh受体活化剂purmorphamine、和500nM视黄酸(RA)诱导分化。在诱导分化后第39天细胞中视网膜神经节细胞标志物Islet-1(红色：细胞核)和NF200(绿色：轴突)的免疫荧光染色结果与Wnt3a和Shh的免疫荧光染色结果一致。

*比例尺:A,C,D:100μm；B:50μm。

图22显示在用于产生视网膜神经节细胞的方案A分化方法中使用的Wnt3a、Shh和RA的效果的分析结果。根据分化计划表处理各个因子，在诱导分化后第39天，使用视网膜神经节细胞特异性标志物进行免疫荧光测定。

*比例尺:50μm。

图23显示在继代培养之后，人多能干细胞来源的视网膜神经节细胞的细胞形态学显微照片。细胞为在细胞系建立之后第16代的细胞，即，从第15代细胞培养3天的细胞。视网膜神经节细胞系的继代培养的细胞显示体外的神经元形态。

(A)用培养基1继代培养的细胞的形态

(B)用培养基2继代培养的细胞的形态

用培养基1和培养基2继代培养的细胞均显示特征为细胞质延长、长神经突(neuritis)和阶段透明细胞体的独特神经元形态。

*左侧：相差显微镜，100倍放大倍数；右侧：200倍放大倍数。

图24显示检查人多能干细胞来源的视网膜神经节细胞系的细胞标志物表达的结果。细胞为细胞系建立后第17代的细胞，并且在第16代细胞传代之后第3天进行免疫荧光染色。在几乎所有细胞中观察到视网膜神经节细胞的特征标志物。

(A)Math5

(B)Brn3B

(C)Brn3A/Tuj1

(D)突触蛋白1/Tuj1

(E)NF200

(F)KI67

(G)Thy1.2

(H)NMDAR1

(I)TrkB

*比例尺:A至I:50μm.核染色：DAPI(蓝色)。

图25显示人多能干细胞来源的视网膜神经节细胞系的细胞内钙的显微镜成像，表明这些细胞具有神经元功能。将第15代的人胚胎干细胞来源的视网膜神经节细胞培养3天。用1μM fluor-4处理细胞并用1mM谷氨酸盐刺激，然后观察时间差异图像。结果是在许多活细胞中检测到钙。从黑(最低)到白(最高)的系列图像光谱代表钙浓度。在人胚胎干细胞来源的视网膜神经节细胞中，细胞质钙响应于谷氨酸盐刺激(箭头)而显著增加。

最佳实施方式

为实现上述目标，本发明的一方面提供通过将干细胞分化为成熟视网膜神经节细胞来制备成熟视网膜神经节细胞的方法，其包括(a)在包含IGF1R(胰岛素样生长因子-1受体)活化剂和Wnt信号转导途径活化剂的培养基中培养视网膜祖细胞以使它们分化为未成熟的视网膜神经节细胞；以及(b)在通过从步骤(a)的培养基移除Wnt信号转导途径活化剂并向其添加IGF1R活化剂而制备的培养基中培养所述未成熟的视网膜神经节细胞。

视网膜是脊椎动物的中央神经系统中研究最深入的器官之一，已经探查详细形态、神经元的突触连接和视网膜神经元的生理学现象数十年。相比之下，视网膜神经元的结构发育及其多种功能机制尚未被澄清。

其中，“视网膜神经节细胞(RGC)”是脊椎动物的视网膜中存在的输出神经元，并且他们的轴突形成视神经并向大脑发送图像。视网膜神经节细胞是神经元，即，作为神经系统的基础单元的神经细胞，并具有多个树突和单个长纤维状轴突。树突互相形成突触，以调节神经元的电活动和传导流入细胞体的电刺激。轴突具有多个含有微粒或囊泡的分支的末端，其响应于神经刺激释放神经递质。突触是神经元之间冲动传导的点。称为神经递质的化学物质穿过突触间隙，并维持神经冲动。在发育期间，从多能视网膜祖细胞产生视网膜神经节细胞。例如，在小鼠中，在胚胎(E)第11.5天开始视网膜神经节细胞的发育并持续至出生后(P)第0天，并在E14.5达到峰值。已知主要扩张期为E14.5至E17.5，其取决于动物而可变，但不限于此。

视网膜神经节细胞功能为将视觉信息从视网膜的多种细胞传导至大脑的视神经中心。穿过眼睛的光在光受体细胞中转化成电信号，并且产生的电信号通过视网膜的多种神经元传导至视网膜神经节细胞。视网膜神经节细胞功能为接收这些信号并将它们传导至大脑的视神经中心。

视网膜神经节细胞的发育受分层基因调控网络调节，并且发育和分化由主要转录因子介导。

视网膜神经节细胞可以根据分化程度划分为未成熟的视网膜神经节细胞和成熟视网膜神经节细胞。

“未成熟的视网膜神经节细胞”是指获得视网膜神经节细胞的细胞形态学特征和蛋白与遗传标志物特征的细胞(Barres,et al.,Neuron.1988；1:791-803.)。“成熟视网膜神经节细胞”是指在获得“未成熟的视网膜神经节细胞”的上述特征之后处于作为神经元的成熟状态的细胞。即，它们具有以下形态学特征：轴突生长、树和环；树突树、分支和环；树突棘突；突触结等，以及作为兴奋性神经特征的突触前或突触后蛋白形态和多种受体的特征蛋白和遗传标志物。“成熟视网膜神经节细胞”的电生理学特征是自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)的形成，表明能够在视网膜神经节细胞之间形成突触连接的功能成熟(PfriegerBarres,Science.1997；277:1684-7.)。

“未成熟的视网膜神经节细胞”是指从视网膜祖细胞分化为视网膜神经节细胞的早期的细胞。这些未成熟的视网膜神经节细胞是注定从视网膜祖细胞成为视网膜神经节细胞的细胞，或注定成为视网膜神经节细胞的细胞，但缺乏成熟视网膜神经节细胞的形态学和生理学特征。在本发明中，未成熟的视网膜神经节细胞和早期视网膜神经节细胞可互换地使用。

“成熟视网膜神经节细胞”是指从视网膜祖细胞分化为视网膜神经节细胞的晚期的视网膜神经节细胞，或已经分化的视网膜神经节细胞。成熟视网膜神经节细胞具有产生高频动作电位的生理学特征和具有长轴突的形态学特征，但不限于此。

可以通过鉴定对各个细胞特异的标志物的表达水平及其形态学和生理学特征(例如，电化学特征)来确定视网膜神经节细胞是未成熟的视网膜神经节细胞还是成熟视网膜神经节细胞。

首先，在视网膜神经节细胞的发育和分化中起重要作用的转录因子如下：参与视网膜神经节细胞的发育的转录因子为ATOH7(Math5)，Brn3家族(Brn3A,Brn3B,and Brn3C)，和Isl1(Islet-1)。

ATOH7，也被称为Math5，是参与决定视网膜祖细胞至视网膜神经节细胞命运的因子，并且对于视网膜神经节细胞的形成十分重要。因此，Math5优选在未成熟的视网膜神经节细胞中表达。

此外，已知在基因网络中ATOH7下游的POU4F2和POU4F1(分别又被称为Brn3B和Brn3A)和Isl1(Islet-1)对于RGC的诞生不是必需的，但已知它们对于RGC分化和存活是必需的。已知它们在视网膜神经节细胞的分化早期表达，也在成熟视网膜神经节细胞中表达。

具体地，Brn3家族参与RGC分化、RGC树突分支和发育期间RGC的轴突投射的调节。在Brn3家族中，Brn3B是在RGC发育早期表达的因子，并且是最早期的RGC标志物之一，在RGC的轴突生长和存活中作为重要因子。

在小鼠中，Brn3A的表达在胚胎(E)第12.5天开始，在大鼠中，Brn3A在92.2％的RGC群体中表达。已知Brn3B在RGC的轴突形成中起作用，而已知Brn3A参与树突形成。

Isl1是在视网膜发育期间表达的同源结构域LIM蛋白。Isl1基因在RGC出生后即刻活化，并且在胚胎(E)第14.5天之前其表达与POU4F2的表达相同。首先，Isl1是RGC分化和存活所必需的因子，并且其表达由ATOH7支配。Isl1表达在完全分开的细胞中在小鼠胚胎(E)第11.5天开始，并且已知Isl1在一些Brn3B阳性RGC细胞中与Brn3B共表达。

上述转录因子在视网膜神经节细胞的生成中起重要作用，因此未成熟的视网膜神经节细胞可表达(1)Math5和/或(2)选自Brn3B、Brn3A和Islet1中的一种，特别是两种和更特别是三种。此外，与视网膜祖细胞中这些标志物基因的表达相比，这些标志物基因的表达可以增加，但不限于此。

此外，未成熟的视网膜神经节细胞可以是表达NF200或/和Tuj1的那些细胞。NF200是被称为神经丝200kDa的蛋白，在视网膜神经节细胞的分化早期表达。还已知Tuj1在视网膜神经节细胞的分化早期表达。因此，这两种基因可用于区分视网膜神经节细胞，具体地，区分未成熟的视网膜神经节细胞和成熟视网膜神经节细胞，但不限于此。此外，对成熟视网膜神经节细胞特异的标志物基因为Thy1.2、TrkB、NMDAR1、Map2、Vglut1、PSD-95、突触小泡蛋白和突触蛋白1。这些基因是已知在成熟视网膜神经节细胞中表达的标志物基因。

因此，成熟视网膜神经节细胞可表达选自Brn3B、Brn3A、Islet-1、NF200、Tuj1、Thy1.2、TrkB、NMDAR1、Map2、Vglut1、PSD-95、突触小泡蛋白和突触蛋白1中的一种，特别是两种，更特别是4、5、6、7、8、9和10种标志物基因。此外，与视网膜祖细胞或未成熟的视网膜神经节细胞相比，成熟视网膜神经节细胞可表现这些基因的高表达，但不限于此。

本发明的方法为能够以高产率使视网膜祖细胞经未成熟的视网膜神经节细胞分化为成熟视网膜神经节细胞的方法，其特征在于在含有Wnt信号转导途径活化剂的培养基中培养视网膜祖细胞以将它们分化为未成熟的视网膜神经节细胞，然后将未成熟的视网膜神经节细胞在不含Wnt信号转导途径活化剂的培养基中培养以将它们分化为成熟视网膜神经节细胞。即，本发明的技术特征是通过在不同的分化阶段用Wnt信号转导途径活化剂处理干细胞来决定干细胞向视网膜神经节细胞的命运，以及通过移除Wnt信号转导途径活化剂来将60％至95％或更多的多种视网膜细胞群体分化为成熟视网膜神经节细胞。本发明首次开发了诱导向成熟视网膜神经节细胞高效分化的方法。

本发明的方法的详细描述在下文给出。

在本发明的方法中，步骤(a)是在含有IGF1R活化剂和Wnt信号转导途径活化剂的培养基中培养视网膜神经节细胞以将它们分化为未成熟的视网膜神经节细胞的步骤。步骤(a)可进行1天至10天，但不限于此。

本文所用的术语“视网膜祖细胞”是指能够分化成为存在于视网膜中的细胞或视网膜色素上皮细胞的多能祖细胞。视网膜祖细胞的特征在于表达选自Rax、Pax6、Chx10、Otx2、Sox2、Lhx2、Six3、Six6和Mitf中的一种、两种或三种或更多种标志物，并且特别地，特征在于表达Rax和Pax6中的一种或两种，但不限于此。

如上文提到的与视网膜发育相关，视网膜祖细胞能够分化成为多种类型的视网膜内细胞(视杆细胞和视锥细胞、视网膜神经节细胞、水平细胞、双极细胞、无长突细胞、米勒胶质细胞等)和视网膜色素上皮，特征为诸如Crx、恢复蛋白、视紫红质、红绿视蛋白(red/green opsin)、蓝视蛋白、外周蛋白2、PDE6B、SAG、Islet1/NF200、Prox1、PKC-a、Hu C/D、GFAP、ZO-1和RPE65的标志物为阳性表达。然而，这些标志物的表达水平和阳性率在视网膜祖细胞中变得比在成熟视网膜细胞或视网膜色素上皮中更弱，但不限于此。

用于将视网膜祖细胞分化为未成熟的视网膜神经节细胞的培养基的特征在于含有IGF1R活化剂和Wnt信号转导途径活化剂。此外，用于将视网膜祖细胞分化为未成熟的视网膜神经节细胞的培养基除IGF1R活化剂和Wnt信号转导途径活化剂之外还可含有，但不限于，BMP(骨形态发生蛋白)信号转导途径抑制剂和FGF(成纤维细胞生长因子)信号转导途径活化剂。此外，培养基可以为除上述材料之外还包含1％B27补充物和1％N2补充物的DMEM/F12培养基，但不限于此。

本文所用的术语“IGF1R活化剂”是指活化酪氨酸激酶受体家族的成员IGF-1(胰岛素样生长因子-1)受体(IGF1R)的物质。活化的IGF1R与胰岛素受体底物(IRS)相互作用。进而，IGF1R活化的IRS充当两条途径的活化剂：由PI3k、Akt和mTOR组成的一条途径；由Raf、MEK和ERK组成的另一条途径(Ryan&Goss,Oncologist.2008；13:16-24)。IGF-1和IGF-2落入IGF1R活化剂的范围。IGF-1具有与胰岛素相似的分子结构，参与细胞生长、细胞增殖、分化和细胞死亡，但不限于此。

在本发明中可以不受限制地使用任意IGF1R活化剂，只要其活化IGF1R。示例为IGF-1或IGF-2，并且特别是IGF-1，但不限于此。

用于将视网膜祖细胞分化为未成熟的视网膜神经节细胞的培养基包含量为具体地0.01ng/mL至100ng/mL，更具体地0.1ng/mL至50ng/mL，更具体地1ng/mL至20ng/mL，和最具体地10ng/mL的IGF1R活化剂。

本文所用的术语“Wnt信号转导途径活化剂”是指活化Wnt信号转导途径的物质，已知Wnt信号转导途径在胚胎发生期间调节多种过程，包括决定细胞命运，组织重建，未分化的细胞的极性、形态、附着和生长，以及维持和增殖。任意活化剂可以不受限制地包括在Wnt信号转导途径中，只要其传导Wnt介导的或β-连环蛋白介导的信号。Wnt信号转导途径是一系列过程，其通过Wnt信号转导途径的第一引发物Wnt与其受体结合开始，或由细胞内Wnt信号转导途径的下游靶标β-连环蛋白的稳定介导。Wnt信号转导途径活化剂为以下，但不特别限于此。

1)通过直接添加Wnt蛋白：Wnt为Wnt信号转导途径的第一引发物，属于分泌糖蛋白家族。已经鉴定出19种Wnt：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11和Wnt16b。

2)通过增加β-连环蛋白的水平：大多数细胞通过增加β-连环蛋白水平而响应于Wnt信号转导途径。即去磷酸化的β-连环蛋白水平的增加(或稳定)表示β-连环蛋白转移入细胞核。

3)通过蓬乱蛋白(dishevelled)的磷酸化或Wnt相关受体即LRP尾的磷酸化。

4)通过使用GSK3(糖原合酶激酶3)抑制剂：锂(Li)、LiCl、二价Zn、BIO(6-溴靛玉红-3’-肟)、SB216763、SB415286、QS11水合物、TWS119、Kenpaullone、alsterpaullone、靛红-3’-肟、TDZD-8和Ro31-8220甲磺酸盐。

5)通过阻断Wnt信号转导途径的负调节剂，例如Axin和APC，或通过使用RNAi。

6)使用Wnt途径的活化剂，例如norrin和R-spondin2：Norrin结合Frizzled4受体，而R-spondin2与Frizzled8和LRP6相互作用。

7)通过基因转移，包括转染：可以使用Wnt超表达构建体或β-连环蛋白超表达构建体。

在本发明中，可以使用Wnt信号转导途径活化剂而不受限制，只要其能够活化Wnt信号转导途径。它们具体为Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、Wnt16b；增加β-连环蛋白水平的物质；GSK3抑制剂，如锂、LiCl、二价锌、BIO、SB216763、SB415286、CHIR99021、QS11水合物、TWS119、Kenpaullone、alsterpaullone、靛红-3’-肟、TDZD-8和Ro 31-8220甲磺酸盐；Axin抑制剂、APC抑制剂、norrin或R-spondin 2，且更具体地Wnt3a、Wnt1、Wnt5a、Wnt11、norrin、LiCl、BIO或SB415286，但不限于此。

除了LiCl、BIO和SB415286，用于诱导视网膜祖细胞分化为未成熟的视网膜神经节细胞的Wnt信号转导途径活化剂可以0.01ng/mL至500ng/mL的量使用，具体地以0.1ng/mL至200ng/mL的量使用，和更具体地以1ng/mL至100ng/mL的量使用。在Wnt信号转导途径活化剂中，培养基中LiCl的含量为0.1mM至50mM，具体地0.5mM至10mM，更具体地1mM至10mM；培养基中BIO的含量为0.1μM至50μM，具体地0.1μM至10μM，更具体地0.5μM至5μM；培养基中SB415286的含量为0.1μM至500μM，具体地1μM至100μM，更具体地5μM至50μM。

本文所用的术语“BMP信号转导途径抑制剂”是指能够抑制BMP信号转导途径的一组物质。BMP属于信号转导途径蛋白，其属于TGF-β(转化生长因子-β)超家族，并且参与胎儿早期分化、胎儿组织形成和成体组织的动态平衡。细胞外分泌的BMP与I型和II型丝氨酸/苏氨酸激酶受体结合，启动BMP信号转导途径。II型受体磷酸化I型受体。然后，磷酸化的I型受体磷酸化细胞内底物Smad蛋白，介导细胞内信号转导途径。由受体调节的Smad蛋白被称为R-Smad(受体调节的Smad)，并且Smad-1、2、3、5和8属于R-Smad。它们可以结合细胞内共同伴侣(Co-Smad)Smad-4。它们迁移入细胞核并在其中累积，在那里它们充当转录因子并参与靶基因表达的调控(Yamamoto&Oelgeschlager,Naturwissenschaften.2004；91:519-34)。BMP信号转导途径抑制剂指这样的物质，其阻断细胞外BMP与细胞表面受体的结合。BMP信号途径抑制剂的实例包括头蛋白(Noggin)、腱蛋白(chordin)、扭曲原肠胚形成(Tsg)、cerberus、coco、gremlin、PRDC(与DAN和Cerberus相关的蛋白)、DAN(在成神经细胞瘤中差异筛选选出的基因aberrative)、dante、卵泡抑素、USAG-1(子宫敏感性相关基因1)、dorsomorphin和硬化蛋白(sclerostin)。通过抑制BMP信号转导，头蛋白在神经诱导和背腹神经外胚层或中胚层中起重要作用。同样，头蛋白结合BMP(BMP-2、BMP-4和BMP-7)，并阻断这些BMP与其受体的结合(Yanagita,Cytokine Growth Factor Rev.2005；16:309-17)。

在本发明中，可以利用任意BMP信号转导途径抑制剂，只要其能够抑制BMP信号转导。其实例可包括头蛋白、腱蛋白、扭曲原肠胚形成(Tsg)、cerberus、coco、gremlin、PRDC、DAN、dante、卵泡抑素、USAG-1(子宫敏感性相关基因1)、dorsomorphin和硬化蛋白，但不限于此。在本发明一实施方案中，使用头蛋白。

在本发明中，用于诱导视网膜祖细胞分化为未成熟的视网膜神经节细胞的培养基中BMP信号转导途径抑制剂的含量为0.01ng/mL至100ng/mL，具体地0.1ng/mL至50ng/mL，更具体地0.5ng/mL至20ng/mL，和最具体地10ng/mL，但不限于此。

本文所用的术语“FGF信号转导途径活化剂”是指能够诱导或促进FGF信号转导的物质。FGF是参与包括细胞增殖和细胞分化在内的有丝分裂、血管生成、骨形态发生和神经诱导的因子。迄今已鉴定出FGF家族的22个成员。FGF受体家族(FGFR)有4个成员。它们的mRNA结合至可选的剪接受体变体以活化FGF受体。活化的FGFR通过细胞质中Ras/Raf/MeK途径介导信号以活化MAP激酶，MAP激酶进而诱导信号转导(Bottcher&Niehrs,EndocrRev.2005；26:63-77)。FGF家族的FGF2也被称为碱性FGF(bFGF)，主要与FGFR 1b、FGFR 1c、FGFR2c、FGFR 3c和FGFR 4Δ结合，并强烈活化FGFR 1c和FGFR 3c。FGFR1c和FGFR 3c的活化剂以及FGF1、FGF4、FGF8、FGF9、FGF17和FGF19可以用作替代物，但不限于此。

在本发明中，可以不受限制地利用任意FGF信号转导途径活化剂剂，只要其能够刺激FGF信号转导。其实力可包括FGFR 1c或FGFR3c的活化剂、FGF1、FGF2、FGF4、FGF8、FGF9、FGF17或FGF19，但不限于此。在本发明一实施方案中，使用FGF2。

在本发明中，用于诱导视网膜祖细胞分化为未成熟的视网膜神经节细胞的培养基中FGF信号转导途径活化剂的含量为0.01ng/mL至100ng/mL，具体地0.1ng/mL至50ng/mL，更具体地1ng/mL至20ng/mL，和最具体地5ng/mL，但不限于此。

此外，步骤(a)的视网膜祖细胞可以通过以下来获得：(a’)在含有以下成分的培养基中培养干细胞以使它们分化成为悬浮聚集形式的眼区前体细胞：IGF1R活化剂、Wnt信号转导途径抑制剂和BMP信号转导途径抑制剂；以及(b’)在通过向步骤(a’)的培养基添加FGF信号转导途径活化剂而制备的培养基中培养悬浮聚集形式的步骤(a’)的眼区前体细胞以使它们分化成为视网膜祖细胞。

可以不受特别限制地使用任意干细胞，只要它们能够分化为视网膜祖细胞，并且干细胞可以选自骨髓干细胞(BMSC)、脐带血干细胞、羊水干细胞、脂肪干细胞、视网膜干细胞(RSC)、视网膜内米勒胶质细胞、胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)和体细胞核移植细胞(SCNT)。

可以通过将这些干细胞在含有IGF1R活化剂、Wnt信号转导途径抑制剂和BMP信号转导途径抑制剂的培养基中培养来使它们分化为眼区前体细胞。在这方面，IGF1R活化剂、BMP信号转导途径抑制剂及其浓度与上述用于诱导分化为未成熟的视网膜神经节细胞的培养基中相同。

本文所用的术语“Wnt信号转导途径抑制剂”是指阻断细胞外Wnt蛋白与膜蛋白Frizzled受体或共受体LRP之间的相互作用或者抑制细胞内Wnt介导的信号转导的因子。在本发明中，可以不受限制地利用任意Wnt信号转导途径抑制剂剂，只要其抑制Wnt介导的信号转导。Wnt信号转导途径抑制剂的实例包括Dkk(Dickkopf)家族(Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3和Dkk-4)，其是共受体LRP的Wnt拮抗剂，Wise，Wnt拮抗剂(sFRP：分泌型Frizzled相关蛋白)家族，Frizzled-CRD结构域，WIF-1(Wnt抑制因子-1)，IWP-2，IWP-3，IWP-4，cerberus，Wnt抗体，显性负作用的Wnt蛋白，Axin的超表达，GSK(糖原合成酶激酶)的超表达，显性负作用的TCF，显性负作用的蓬乱蛋白和酪蛋白激酶抑制剂(CKI-7、D4476等)，但不限于此。在本发明一实施方案中，使用Dkk-1。

此外，除了Wnt信号转导途径抑制剂之外，还可以通过抑制参与Wnt途径的每一成分来抑制Wnt信号转导，例如RNAi。

在培养基中，用于使干细胞经眼区前体细胞分化为视网膜祖细胞的Wnt信号转导途径抑制剂的含量为0.01ng/mL至10,000ng/mL，但不限于此。

本文所用的术语“眼区前体细胞”是指表达在胚胎发育期间前脑神经板的眼区祖细胞中存在的特异标志物(眼区转录因子；Zuber,et al.,Development,2003；130:5155-67)的细胞。眼区前体细胞特征在于表达选自Six3、Rax、Pax6、Otx2、Lhx2和Six6中的一种、两种或三种或更多种标志物，但不限于此。

眼区前体细胞具有悬浮聚集物的形态。在这方面，悬浮聚集物是指胚胎干细胞絮状物在没有饲养小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和血清的非贴壁平板中培养至少1天时所产生的培养基中悬浮的细胞团。取决于所用培养基的组成，眼区前体细胞可以表达眼区转录因子。

此外，步骤(a’)可进行1天至30天，步骤(b’)可进行5天至15天，但不限于此。

在本发明中，其中步骤(b’)的眼区前体细胞的悬浮聚集物在包被有选自以下的细胞外基质的平板上贴壁生长：聚-D-赖氨酸、层粘连蛋白、聚L赖氨酸、基质胶、琼脂、聚鸟氨酸、明胶、胶原蛋白、纤维连接蛋白和玻璃粘连蛋白。

每个贴壁的悬浮聚集物的细胞群是最高效的细胞的数量。眼区前体细胞的悬浮聚集物可以由200个细胞至400个细胞组成，但不限于此。

此外，步骤(a’)的培养基可以是除IGF1R活化剂、Wnt信号转导途径抑制剂和BMP信号转导途径抑制剂之外还包含10％knockout血清替代物和1％B27补充物的DMEM/F12培养基。

此外，步骤(b’)的培养基可以是除上述IGF1R活化剂、Wnt信号转导途径抑制剂、BMP信号转导途径抑制剂和FGF信号转导途径活化剂之外还包含1％B27补充物和1％N2补充物的DMEM/F12培养基。

在本发明的方法中，步骤(b)是培养在步骤(a)中分化的未成熟的视网膜神经节细胞的步骤。未成熟的视网膜神经节细胞可以通过步骤(b)分化为成熟视网膜神经节细胞。

为了高效分化为成熟视网膜神经节细胞，步骤(b)中使用的培养基特征在于不含有步骤(a)的培养基中含有的Wnt信号转导途径活化剂。

更具体地，步骤(b)可以是在通过从步骤(a)的培养基移除BMP信号转导途径抑制剂、FGF信号转导途径活化剂和Wnt信号转导途径活化剂而制备的培养基中培养步骤(a)的细胞的步骤，更具体地，在通过从步骤(a)的培养基移除BMP信号转导途径抑制剂、FGF信号转导途径活化剂和Wnt信号转导途径活化剂并向其添加Shh(音猬因子)信号转导途径活化剂而制备的培养基中。

此外，步骤(b)可包括(i)通过从步骤(a)的培养基移除Wnt信号转导途径活化剂在含有IGF1R活化剂、BMP信号转导途径抑制剂和FGF信号转导途径活化剂的培养基中培养未成熟的视网膜神经节细胞；以及(ii)在通过从步骤(i)的培养基移除BMP信号转导途径抑制剂和FGF信号转导途径活化剂并向其添加Shh(音猬因子)信号转导途径活化剂而制备的培养基中培养未成熟的视网膜神经节细胞。

同时，本文所用的术语“移除”可以解释为使用不包含待移除的对象的培养基。此外，术语“其组成不包含X的培养基”是指不包含X的所有培养基。

此外，培养基可以为除上述物质之外还包含1％B27补充物和1％N2补充物的DMEM/F12培养基，但不限于此。

本文所用的术语“Shh(音猬因子)信号转导途径活化剂”是指诱导或活化Shh信号转导的物质。已知Shh是与胚胎发生期间多种过程的调控相关的信号转导因子，所述过程包括决定细胞命运、极化、形态、增殖和分化(Bertrand&Dahmane,Trends Cell Biol.2006；16:597-605)。Shh信号转导途径涉及两种跨膜蛋白，即Ptc(Patched)和Smo(Smoothened)。在不存在Shh的情况下，Ptc与Smo相互作用并抑制Smo。相反地，在存在Shh的情况下，Shh结合Ptc，Smo不再被抑制，导致细胞质中的Ci/Gli蛋白进入细胞核并作用为靶基因的转录活化剂。对Shh信号转导途径活化剂没有给予具体限定，只要其能增强Shh介导的信号转导途径。Shh信号转导途径活化剂的实例可包括属于刺猬蛋白家族(例如Shh)的蛋白，Ptc对Smo抑制功能的抑制剂，Smo受体活化剂，Shh受体活化剂(例如Hg-Ag，purmorphamine等)，增加Ci/Gli家族水平的物质，Ci/Gli蛋白细胞内降解的抑制剂和通过转染产生的Shh超表达构建体或Ci/Gli超表达构建体。

在本发明中，可以使用任意Shh信号转导途径活化剂，只要其能够活化Shh信号转导途径。其实例可包括Shh，Smo受体活化剂，Ptc对Smo抑制功能的抑制剂，增加Ci/Gli家族水平的物质，Ci/Gli因子细胞内降解的抑制剂，和Shh受体活化剂，Hg-Ag或purmorphamine，但不限于此。Shh信号转导途径活化剂的更具体的实例可包括Shh和purmorphamine。

在本发明中，用于诱导未成熟的视网膜神经节细胞分化为成熟视网膜神经节细胞的培养基中Shh信号转导途径活化剂的含量为0.1ng/mL至5,000ng/mL，具体地1ng/mL至2,500ng/mL，更具体地10ng/mL至1,000ng/mL，和最具体地250ng/mL，但不特别限于此。

步骤(b)可进行1天至200天。

为高效分化为成熟视网膜神经节细胞，方法可以还包括步骤(c)：将步骤(b)中培养的细胞在通过向步骤(b)的培养集中添加RA(视黄酸)而制备的培养基中培养。

本文所用的术语“RA(视黄酸)”是指亲脂性分子维生素A的代谢产物。存在两类RA：全反式视黄酸和9-顺式视黄酸。RA被转移入细胞核，在细胞核内其分别结合RAR(视黄酸受体)和RXR(类视色素X受体)，并参与靶基因转录的调控，但不限于此。

用于本发明的方法的RA可以是反式视黄酸和顺式视黄酸，待使用的RA浓度可以为0.5ng/mL至10,000ng/mL，具体地5ng/mL至5,000ng/mL，更具体地50ng/mL至2,000ng/mL，和更具体地500ng/mL，但不特别限于此。

步骤(c)可进行1天至120天，但不限于此。

本发明的方法可以还包括步骤(d)：在通过从步骤(c)的培养基中移除选自IGF1R活化剂、Shh信号转导途径活化剂和RA中的一种或多种，两种或更多种，或三种，更具体地通过全部移除IGF1R活化剂、Shh信号转导途径活化剂和RA而制备的培养基中培养未成熟的视网膜神经节细胞或成熟视网膜神经节细胞。

根据本发明的实施方案，尽管经历成熟期的未成熟的视网膜神经节细胞在没有IGF1R活化剂、Shh信号转导途径活化剂和RA的培养基中培养，它们显示与在含有所有这些组分的培养基中培养的细胞相当的成熟度。

此外，本发明的方法可以还包括确定在上述步骤之后的所需细胞例如，步骤(a)之后的未成熟的视网膜神经节细胞，是否分化的步骤，或确定步骤(b)、(c)或(d)之后的成熟视网膜神经节细胞是否分化的步骤。

可以通过测量细胞特异性的标志物基因的表达和/或通过鉴定形态学特征和/或生理学特征来确定所需细胞的分化，特别是未成熟的视网膜神经节细胞和成熟视网膜神经节细胞的分化。

可以通过测量标志物基因的mRNA或蛋白的表达水平进行标志物基因表达的测量，并且可以使用多种领域内已知方法进行表达水平的测量。

可以在本发明中不受限制地使用分析标志物基因表达的mRNA水平的任意技术，只要其是领域内公知的分析mRNA的方法。其实例可以包括逆转录酶聚合酶链式反应，竞争性逆转录酶聚合酶链式反应，实时聚合酶链式反应，Rnase保护测定，Northern印迹和DNA芯片测定。

可以在本发明中不受限制地使用分析标志物基因表达的蛋白水平的任意技术，只要其是领域内公知的分析蛋白的方法。其实例可以包括免疫印迹、ELISA、放射免疫测定、放射免疫扩散法、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织染色、免疫沉淀测定、补体结合测定、FACS和蛋白芯片测定。

与分化前的视网膜祖细胞相比，根据本发明的分化的成熟视网膜神经节细胞表现一个或多个以下特征：(1)Brn3B的表达水平增加；(2)Brn3A的表达水平增加；(3)Islet1的表达水平增加；(4)NF200的表达水平增加；(5)TuJ1的表达水平增加；(6)Thy1.2的表达水平增加；(7)TrkB的表达水平增加；(8)NMDAR1的表达水平增加；(9)Map2的表达水平增加；(10)Vglut1的表达水平增加；(11)PSD-95的表达水平增加；(12)突触小泡蛋白的表达水平增加；以及(13)突触蛋白1的表达水平增加。

可以利用针对由基因编码的蛋白的抗体或利用本领域技术人员公知的方法如RT-PCR鉴定基因表达水平的增加或降低。随着它们表现出更多的特征，分化的细胞被定义为更接近成熟视网膜神经节细胞。优选地，成熟视网膜神经节细胞表现一个或多个，具体地2个或更多个，更具体地3个或更多个，更具体地4个或更多个和最具体地5个或更多个特征。优选地，根据本发明的方法分化后，多于大约40％、60％、80％、90％、95％或98％的细胞群具有所期望的特征。更高的比例是更优选的，但不限于此。

本发明的另一方面提供了使未成熟的视网膜神经节细胞分化为成熟视网膜神经节细胞的方法，其包括在含有IGF1R活化剂和Shh信号转导途径活化剂的培养基中培养未成熟的视网膜神经节细胞的步骤。

未成熟的视网膜神经节细胞、IGF1R活化剂、Shh信号转导途径活化剂和成熟视网膜神经节细胞与上文所述相同。

未应用于使未成熟的视网膜神经节细胞分化为成熟视网膜神经节细胞的方法的培养基特征为不包含Wnt信号转导途径活化剂。

在该方法中，IGF1R活化剂可以具体地以0.01ng/mL至100ng/mL的量使用，更具体地以0.1ng/mL至50ng/mL的量使用，更具体地以1ng/mL至20ng/mL的量使用，和最具体地以10ng/mL的量使用，但不特别限于此。

在该方法中，Shh信号转导途径活化剂可以具体地以0.1ng/mL至5,000ng/mL的量使用，更具体地以1ng/mL至2,500ng/mL的量使用，更具体地以10ng/mL至1,000ng/mL的量使用，和最具体地以250ng/mL的量使用，但不特别限于此。

方法可以还包括在通过包含IGF1R活化剂和Shh信号转导途径活化剂的培养基中添加RA(视黄酸)而制备的培养基中培养未成熟的视网膜神经节细胞的步骤。此处，“添加”可以解释为用包含上述物质和之前的培养基组成的新鲜培养基替换之前的培养基，以及向培养基添加物质。

此处，RA与上述相同，并且待使用的RA的浓度可以是0.5nM至10,000nM，更具体地5nM至5,000nM，更具体地50nM至2,000nM，和更具体地500nM，但不特别限于此。

方法可以还包括以下步骤：在通过从上述培养基中移除选自IGF1R活化剂、Shh信号转导途径活化剂和RA中的一种或多种，更具体地通过全部移除IGF1R活化剂、Shh信号转导途径活化剂和RA而制备的培养基中培养未成熟的视网膜神经节细胞或成熟视网膜神经节细胞。

本发明的又一方面提供了根据本发明的上述方法制备的未成熟的视网膜神经节细胞和成熟视网膜神经节细胞。

方法、未成熟的视网膜神经节细胞和成熟视网膜神经节细胞与上述相同。

本发明的又一方面提供了筛选成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂的方法，其包括(a)用成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂候选物或增殖促进剂候选物处理通过上述分化为成熟视网膜神经节细胞的方法获得和分离的成熟视网膜神经节细胞；以及(b)当与非候选物处理组比较，所述候选物抑制成熟视网膜神经节细胞的死亡或促进成熟视网膜神经节细胞的增殖时，确定所述候选物是成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂。

分化为成熟视网膜神经节细胞的方法和成熟视网膜神经节细胞与上述相同。

步骤(a)是用成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂候选物或增殖促进剂候选物处理通过上述分化为成熟视网膜神经节细胞的方法获得和分离的成熟视网膜神经节细胞的步骤。

待被候选物处理的成熟视网膜神经节细胞可以是，但不特别限于此，通过向来自健康人或患者的干细胞应用本发明的方法分化的成熟视网膜神经节细胞。

本文所用术语“成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂”是指能够抑制成熟视网膜神经节细胞的死亡的物质。具体地，死亡抑制剂可包括与未应用死亡诱导条件的细胞相比，能够减少应用成熟视网膜神经节细胞的死亡诱导条件的成熟视网膜神经节细胞的死亡的物质。死亡抑制剂的类型不受特别限制，并且死亡抑制剂包括化合物、蛋白质、肽和核酸。

本文所用术语“成熟视网膜神经节细胞的增殖促进剂”是指能够诱导或促进成熟视网膜神经节细胞的增殖的物质。具体地，增殖促进剂可包括与未应用增殖促进剂的细胞相比，能够增加应用增殖促进剂的成熟视网膜神经节细胞的增殖的物质。增殖促进剂的类型不受特别限制，并且增殖促进剂包括化合物、蛋白质、肽和核酸。

本发明的方法可包括步骤(b)：当与非候选物处理组比较，所述候选物抑制成熟视网膜神经节细胞的死亡或促进成熟视网膜神经节细胞的增殖时，确定所述候选物是成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂。此外，成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂可以是青光眼或视神经病变的治疗剂。

本文所用术语“青光眼”是指伴随视网膜神经节细胞损失的视神经损伤。

本文所用术语“视神经病变”是指由视网膜神经节细胞及其构成视网膜的轴突的逐渐损失引起的视觉障碍导致的疾病。视神经病变包括视神经炎、缺血性视神经病变、毒性或缺陷性视神经病变、遗传性视神经病变、和视神经萎缩。

如上所述，青光眼和视神经病变是伴有视网膜神经节细胞损失的疾病，因此能够抑制视网膜神经节细胞的死亡或促进其增殖的物质可以用作青光眼或视神经病变的治疗剂。

本发明的又一方面提供了筛选成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂的试剂盒，其包括通过上述本发明的方法制备的成熟视网膜神经节细胞。此外，该试剂盒可用于筛选青光眼或视神经病变的治疗剂。

成熟视网膜神经节细胞、死亡抑制剂和增殖促进剂与上述相同。

试剂盒可包括领域内已知的能够筛选视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂的多种工具和/或试剂，以及成熟视网膜神经节细胞。如果需要，试剂盒可以还包括用于混合各种组分的管，带孔板和描述其使用的说明书。

可以用于该方法的实验程序、试剂和反应条件可以是领域内公知的那些，并且对本领域技术人员是显而易见的。

本发明的又一方面提供了用于治疗青光眼或视神经病变的药物组合物，其包含通过上述本发明的方法制备的成熟视网膜神经节细胞。

成熟视网膜神经节细胞、青光眼和视神经病变与上述相同。

用于本发明的治疗组合物，在体外诱导从干细胞如人胚胎干细胞或诱导多能干细胞向成熟视网膜神经节细胞的分化，大量增殖和分化为熟视网膜神经节细胞，然后向具有上述疾病的患者施用。治疗组合物可以配制成领域内通常的剂型，例如可注射制剂。组合物可以利用手术方法直接植入视网膜位置，或者可以通过静脉注射并移至视网膜位置。本发明的治疗组合物还可包含免疫抑制剂以抑制对植入物的免疫排斥反应。组合物还可包含药学上可接受的载体。本发明的治疗组合物的施用剂量可根据患者的严重程度，施用的途径、方法和频率，治疗的时间段，患者的年龄、性别和疾病严重程度而变化，并可以由本领域技术人员根据医学领域公知的多种因素容易地确定。

本发明的又一方面提供了治疗青光眼或视神经病变的方法，其包括向疑似患有青光眼或视神经病变的个体施用通过本发明的方法制备的成熟视网膜神经节细胞的步骤。

方法、成熟视网膜神经节细胞、青光眼和视神经病变与上述相同。

可以向任意动物施用本发明的成熟视网膜神经节细胞，动物可包括家畜，如牛、猪、羊、马、狗、小鼠、大鼠、猫等，以及人和灵长目。

本文所用术语“施用”是指通过合适的途径向疑似患有青光眼或视神经病变的个体引入本发明的组合物，包括分化的细胞的移植。使本发明的组合物能够到达目的组织的任何给药途径都可以用于本发明中。优选视网膜内注射。

本发明的又一方面提供了制备成熟视网膜神经节细胞系的方法，其包括(a)在包含IGF1R(胰岛素样生长因子-1受体)活化剂和Wnt信号转导途径活化剂的培养基中培养视网膜祖细胞以使它们分化为未成熟的视网膜神经节细胞；以及(b)在通过从步骤(a)的培养基移除Wnt信号转导途径活化剂和向其添加IGF1R活化剂而制备的培养基中培养所述未成熟的视网膜神经节细胞。

培养基可以还包含Shh信号转导途径活化剂或RA(视黄酸)或以上二者。

此外，该方法可以还包括分离自包含IGF1R活化剂和Shh信号转导途径活化剂的培养基中培养的细胞，然后在(i)包含L-谷氨酰胺、巯基乙醇、和胰岛素/运铁蛋白/硒-X的培养基,或(ii)包含L-谷氨酰胺、巯基乙醇、FGF2、IGF-1和EGF的培养基中培养细胞。培养基可以是包含L-谷氨酰胺、巯基乙醇、和胰岛素/运铁蛋白/硒-X的IMDM培养基,或包含L-谷氨酰胺、巯基乙醇、FGF2、IGF-1和EGF的IMDM培养基。在本发明的实施方案中，使用包含IMDM、15％FBS、1mM L-谷氨酰胺、0.1mM巯基乙醇、和1％胰岛素/运铁蛋白/硒-X的培养基1,和包含IMDM、15FBS、1mM L-谷氨酰胺、0.1mM巯基乙醇、5ng/mL FGF2、10ng/mL IGF-1和5ng/mL人重组EGF的培养基2。

发明的实施方式

下文中，将参照实施例详细地描述本发明。然而，这些实施例仅为示例目的，本发明不意欲被这些实施例限制。

实施例1：干细胞的培养

<1-1>人胚胎干细胞的培养

人胚胎干细胞(hESC)系H9(WA09，正常核型XX)和H7(WA07，正常核型XX)购自WiCell Research Institute(Madison,WI)。

通过在以下培养基的饲养细胞上培养使人胚胎干细胞发生未分化的增殖(H9细胞：第26-41代；H7细胞：第23-32代)：胚胎干细胞培养基[DMEM/F12(Invitrogen,GrandIsland,NY)液体，20％(v/v)KnockOut血清替代物(Invitrogen,Carlsbad,CA)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巯基乙醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和4ng人重组FGF2(人重组碱性成纤维细胞生长因子,Invitrogen)]，所述饲养细胞例如辐射过的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF,Global Stem,Gaithersburg,MD)或丝裂霉素处理的小鼠胚胎成纤维细胞(EmbryoMax Primary Mouse Embryo Fibroblasts,Millipore,Billerica,MA)。

每天更换培养基，每隔6或7天手动或用胶原酶V(胶原酶IV，Invitrogen)以1:15至1:18的比例对未分化的干细胞(图1A)进行传代，然后转移到新鲜的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞上。在人胚胎干细胞传代期间，用未分化的人胚胎干细胞特有的抗原OCT-4和SSEA-4(Chemicon,Temecula,CA)在固定的时间间隔进行免疫化学染色，以监测分化的程度。去除所发现的已进行分化的细胞。同时，定期用MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza,Rockland,ME)监测胚胎干细胞系中支原体污染物的存在，该污染物能对人胚胎干细胞的分化造成不利影响。

<1-2>人诱导多能干细胞(iPSC)的生成和培养

通过使用附加体质粒载体将干细胞基因(SOX2、KLF4、OCT4、L-MYC、LIN28、和p53的小发夹RNA)转染进BJ1成纤维细胞(新生儿包皮成纤维细胞，ATCC)来制备人诱导多能干细胞(Okita,Natmethod 2011；8:409)。通过在以下培养基的饲养细胞上培养使人诱导多能干细胞发生未分化的增殖(第5-9代)：胚胎干细胞培养基[DMEM/F12(Invitrogen,GrandIsland,NY，USA)液体，20％(v/v)KnockOut血清替代物(Invitrogen,Carlsbad,CA，USA)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巯基乙醇(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)和4ng人重组FGF2(Invitrogen)]，所述饲养细胞例如辐射过的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF,Global Stem,Gaithersburg,MD，USA)或丝裂霉素处理的小鼠SNL细胞(SNL 76/7细胞系,ECACC,Porton Down,UK)。

每天更换培养基，每隔6或7天手动或用胶原酶IV(Invitrogen)以1:12至1:15的比例对未分化的干细胞(图2A)进行传代，然后转移到新鲜的小鼠胚胎成纤维细胞饲养细胞上。在人诱导多能干细胞传代期间，用未分化的人诱导多能干细胞特有的抗原碱性磷酸酶(Sigma-Aldrich)、NANOG(Abcam,Cambridge,MA)和SSEA-4(Chemicon,Temecula,CA)在固定的时间间隔进行免疫化学染色(图2B和2C)，以监测分化的程度。去除经鉴定已进行分化的细胞。为评估未分化的人诱导多能干细胞的多能性，进行畸胎瘤测定。将1×10⁷个人诱导多能干细胞植入免疫抑制的模型rd/SCID小鼠的背部表面之后10周，移除由此形成的畸胎瘤，然后H&E染色(图2D)。

同时，定期用MycoAlert支原体检测试剂盒(Lonza,Rockland,ME)监测人诱导多能干细胞中支原体污染物的存在，该污染物能对人诱导多能干细胞的分化造成不利影响。

实施例2：从人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞向眼区前体细胞的分化

首先，从小鼠胚胎成纤维细胞分离通过实施例1的方法培养的人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞，并分别转移至6孔超低吸附平板(Corning Incorporated,Corning,NY,USA)。

向6孔超低吸附平板中的人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞添加能诱导向眼区前体细胞分化的培养基[DMEM/F12，10％KnockOut血清替代物，1mM L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸，0.1mM巯基乙醇，1％B27补充物(Invitrogen)，1ng/mL重组头蛋白(R&D Systems)，1ng/mL重组Dkk-1(重组Dickkopf-1,R&D Sytstems)和5ng/mL重组IGF-1(重组胰岛素样生长因子-1,R&D Systems)]。在第3天吸去培养基，然后用新鲜培养基替换，培养细胞4天至5天以在培养基中生成悬浮聚集物形式的眼区前体细胞(图1B，3)。

实施例3：从眼区前体细胞向视网膜祖细胞的分化

将实施例2中产生的眼区前体细胞(悬浮聚集物)以每孔53±8个细胞的密度(292±53个细胞/悬浮聚集物)接种至6孔聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的平板(BDBiosciences)，并以每孔30±5个细胞的密度接种至12孔聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的平板，并以每孔12±4个细胞的密度接种至8孔聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的平板，然后提供能诱导向视网膜祖细胞分化的培养基[DMEM/F12(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巯基乙醇(Sigma-Aldrich)，1％B27补充物，1％N2补充物(Invitrogen)，10ng/mL Dkk-1，10ng/mL头蛋白，10ng/mL IGF-1和5ng/mL FGF2](方案A)(图3和4)，培养10天，以产生视网膜祖细胞(图1C)。通过供应本培养基7天进行方案B(图5)和方案C(图6)。

实施例4：从视网膜祖细胞向未成熟的视网膜神经节细胞(RGC)的分化

将实施例3中所产生的视网膜祖细胞在诱导向未成熟的视网膜神经节细胞分化的培养基[DMEM/F12(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巯基乙醇(Sigma-Aldrich)，1％B27补充物(Invitrogen)，1％N2补充物(Invitrogen)，10ng/mL头蛋白，10ng/mL IGF-1，5ng/mL FGF2，50ng/mL重组Wnt3a(重组Wnt3a，R&D Systems)]中培养3天，从而产生未成熟的视网膜神经节细胞(图1D，3至5)。通过供应本培养基6天进行方案C(图6)。

实施例5：从未成熟的视网膜神经节细胞向成熟视网膜神经节细胞的分化：步骤1

通过供应分化培养基[DMEM/F12(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巯基乙醇(Sigma-Aldrich)，1％B27补充物(Invitrogen)，1％N2补充物(Invitrogen)，10ng/mL IGF-1，250ng/ml重组Shh(重组音猬因子氨基末端肽,Shh,R&D Systems)]5天诱导实施例4中产生的未成熟的视网膜神经节细胞分化为成熟视网膜神经节细胞(图1E，3至6)。

实施例6：从未成熟的视网膜神经节细胞向成熟视网膜神经节细胞的分化：步骤2

通过供应分化培养基[DMEM/F12(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巯基乙醇(Sigma-Aldrich)，1％B27补充物(Invitrogen)，1％N2补充物(Invitrogen)，10ng/mL IGF-1，250ng/ml Shh，500nM全反式视黄酸(RA,Sigma-Aldrich)]17天使实施例5中产生的视网膜神经节细胞成熟(图1E，3至6)。在实施例2-6中，每隔2或3天将所有培养基更换成新鲜的培养基，并将细胞在37℃下5％CO₂的环境中培养(图1F，3至6)。本视网膜神经节细胞培养基用于培养细胞直至第120天分化。

实施例7：细胞分化相关标志物的测定

<7-1>细胞分化相关标志物蛋白表达的免疫化学染色和鉴定

利用如下的免疫化学染色法检测实施例3至6中所获得的细胞的分化。

在与用于向视网膜祖细胞、未成熟的视网膜神经节细胞、成熟视网膜神经节细胞分化相同的条件下，在8孔聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白包被的载片(BD Biosciences,Bedford,MA)中培养眼区前体细胞(悬浮聚集物)。用4％多聚甲醛(Sigma-Aldrich)固定每步中充分培养的细胞，之后用含有3％BSA(Jackson Immunoresearch Laboratory,BarHarbor,ME,USA)和0.25％Triton X-100(Sigma-Aldrich)的PBS封闭非特异性反应。

在封闭90分钟之后，在4℃下利用表1中给出的对每个分化步骤的细胞特异的抗体过夜孵育每个分化步骤的载片。在使用前，这些抗体在含有1％BSA和0.25％Triton X-100的PBS溶液中稀释。用PBS将每步载片上培养的细胞洗涤三次，每次5分钟，并用与Cy3偶联的种特异性二抗(1:800,Jackson Immunoresearch Laboratory)或与Alexa488偶联的种特异性二抗(1:500,Invitrogen)在室温下孵育2小时(表1)。适于作为一抗和二抗的标准材料用来检测非特异性染色或抗体间的相互作用。然后，用PBS将细胞洗涤三次，每次5分钟，用DAPI(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)复染并在Vectashield(Vector Laboratories)中封片，随后在落射荧光显微镜(Nikon Eclipse,E800,Tokyo,Japan)和共聚焦显微镜(ZeissLSM510,Carl Zeiss,Inc,Thornwood,NY,USA)下显像。从在400倍放大倍数下随机选择的20个显微镜视野计数500个细胞，并评价对每种抗体的阳性应答。在评价至少三次之后，确定对抗体的阳性应答。

<7-2>细胞分化相关标志物蛋白表达的流式细胞术和鉴定

在诱导分化后第17天和第39天通过0.05％胰蛋白酶(Invitrogen)分离细胞。用Cytofix/Cytoperm缓冲溶液(Biosciences)固定细胞，并用Perm/Wash缓冲溶液(BDBiosciences)洗涤。细胞与一抗在4℃反应30分钟，并与二抗在4℃反应20分钟(表1)。通过FACSCalibur(BDBiosciences)和FlowJo软件(Treestar)分析反应样品。

<7-3>通过免疫印迹的视网膜神经节细胞特异性标志物的鉴定

在诱导分化后第39天用包含蛋白酶抑制剂的蛋白提取缓冲溶液溶解培养的细胞。使用Bradford蛋白测定试剂盒测量总蛋白浓度。将等量的蛋白加样至聚丙烯酰胺凝胶(任意kD Mini-PROTEAN TGX预制聚丙烯酰胺凝,Bio-Rad,Hercules,CA)，然后转移至聚偏氟乙烯膜(Milipore,Billerica,MA)。将该膜与一抗(表1,Brn3B 1:1,000,Brn3A1:1,000,Tuj11:1000,NF200 1:1,000,肌动蛋白1:2,000)和二抗(HRP-偶联的二抗，羊抗小鼠或抗兔IgG,1:2,000稀释,Santa Cruz,CA)反应，然后使用化学发光检测试剂盒(Amersham ECL,GEHealthcare Lifetechnology,Piscataway,NJ)检测反应的蛋白。

表1

*ICF:免疫细胞荧光染色

作为鉴定分化相关的标志物表达的结果，在诱导分化后第17天的实施例4的方案A获得的细胞的标志物的流式细胞术结果(图2A)显示视网膜祖细胞标志物Rax-和Pax6阳性的细胞分别为95.8±1.4％和93.8±0.7％(图7A)。同时，视网膜神经节细胞特异性标志物Math5、Brn3B-和Brn3A阳性的细胞分别为95.2±1.2％、96.8±0.6％和97.5±0.9％。在小鼠中，在视网膜神经节细胞早期表达的Math5已知从胚胎(E)第11天至出生后第1天可检测，并且Brn3B和Brn3A已知在胚胎发育期间视网膜神经节细胞产生的时间可检测并持续它们一生。此外，这些标志物在大多数视网膜神经节细胞中共表达。视网膜神经节细胞亚型的标志物Islet-1可检测为16.4±2.7％。在诱导分化后第17天，免疫荧光染色结果和阳性率与流式细胞术的结果一致。在大多数细胞的核中，Math5和Brn3B被强烈染色(图7B和7C)。Brn3A(核染色)阳性细胞的细胞质对神经元特异性标志物Tuj1为阳性(98.2±0.4％)(表2A，图7D)，指示它们分化为视网膜神经节细胞，其为神经元的一种。对视网膜神经节细胞的轴突中表达的NF200阳性的细胞的约1/5对Islet-1为阳性，Islet-1为视网膜神经节细胞亚型的标志物(表2A，图7E)。全部视网膜神经节细胞的1/3报告为Islet-1阳性视网膜神经节细胞。尚未观察到轴突和树突树、环和棘突的成熟特征。

在诱导分化后第39天实施例6的方案A获得的细胞的标志物的流式细胞术结果(表2B，图8)表明Pax6-阳性细胞为82.3±3.5％。已知Pax6在视网膜祖细胞中表达，并且在分化为视网膜神经节细胞之后也持续表达(图9A)。Math5-,Brn3B(图9B,9F,9G)-,和Brn3A(图9C,9D,9H)-阳性细胞分别为77.3±2.7％,84.7±0.8％,89.9±2.3％。似乎Math5在细胞分化后降低。在诱导分化后第17天Islet-1阳性细胞为16.4±2.7％，并在诱导分化后第39天增加至32.8±7.1％，指示全部视网膜神经节细胞的1/3为Islet-1阳性(图9E)。同时，在诱导分化后第17天细胞增殖标志物KI67-阳性细胞从81.0±3.5％显著降低至18.4±3.5％。免疫荧光染色结果表明，在视网膜神经节细胞中观察到轴突环和棘突，以及树突树、环和棘突，指示成熟(图9F至9I)。该成熟在诱导分化后第59天进一步进展(图10)。

免疫印迹分析的结果也表现视网膜神经节细胞特异性标志物Brn3B和Brn3A以及神经元特异性标志物NF200和Tuj1的强烈表达，与免疫化学染色和流式细胞术结果相同(图9J)。

表2

在根据实施例5和实施例6的方案B(图5)和方案C(图6)的诱导向视网膜神经节细胞的分化后第39天，鉴定标志物蛋白表达。细胞标志物的流式细胞术结果(表3A和3B)表明对视网膜神经节细胞特异性标志物Math5、Brn3B和Brn3A以及神经元轴突和树突标志物Tuj1和NF200阳性的细胞与原型方案A的细胞类似，但亚型标志物Islet-1阳性细胞在方案B和C中降低至12.4±2.5％和7.8±1.6％。另一方面，通过免疫荧光染色检查细胞形态。结果是，与方案A相比，根据方案B分化的细胞显示与根据方案A的细胞类似的轴突和树突阳性率和成熟度，但较低的具有电功能的突触前和突触后囊泡阳性率(图11)。根据方案C分化的细胞表现突触前和突触后囊泡的频繁产生，但相对较低的轴突和树突成熟度(图12)。

表3

除H9之外，人胚胎干细胞系H7和人诱导多能干细胞也根据实施例6的方案A分化为视网膜神经节细胞。在诱导分化后第39天，进行细胞标志物的免疫荧光染色和流式细胞术。结果是，Math5-、Brn3B-和Brn3A-阳性的人胚胎干细胞H7百分比分别为95.0％,90.2％和94.4％，与H9细胞系相同(表4A)。免疫荧光染色结果显示轴突和树突的成熟特征和具有电功能的突触前和突触后囊泡的频繁产生(图13)。

Math5-、Brn3B-和Brn3A-阳性的人诱导多能干细胞百分比分别为73.0％、61.4％和77.0％，比H9细胞系相对较低(表4B)。免疫荧光染色结果显示轴突和树突的成熟特征和具有电功能的突触前和突触后囊泡的频繁产生(图14)。

表4

实施例8：从人多能干细胞分化的视网膜神经节细胞的电生理学性质和功能的测试

通过以1mL/min至1.5mL/min的速率向记录室注入人工脑脊髓液在32±1℃进行完整细胞电压记录和电流钳记录。人工脑脊髓液由125mM NaCl、25mM NaHCO₃、2.5mM KCl、1.25mM NaH₂PO₄、2mMCaCl₂、1mM MgCl₂、20mM葡萄糖、1.2mM丙酮酸盐和0.4mM Na-抗坏血酸组成，并在pH 7.4用95％O₂和5％CO₂饱和。使用具有3.5MΩ至4.5MΩ尖端电阻的贴片吸管。完整细胞配置之后的系列电阻为10MΩ至15MΩ。使用EPC-10放大器(HEKA,Lambrecht-Pfalz,Germany)进行记录，并且在记录时使用包含143mM K-葡萄糖盐、7mM KCl,15mMHEPES、4mM MgATP、0.3mM NaGTP、4mM Na-抗坏血酸和0.1mM EGTA的吸管溶液，并用KOH将pH值调至7.3。在-70mV的保持电位记录自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)。为鉴定自发性突触后电流的模式，向实验室的水浴溶液(Sigma-Aldrich)中注入6-氰基-7-硝基喹喔啉-2,3-二酮(CNQX,50μM),D-(-)-2-氨基-5-膦酰基戊酸(AP5,50μM)和(+)-荷包牡丹碱(50μM)。CNQX阻断AMPA受体，AP5阻断NMDA受体并且荷包牡丹碱阻断GABA受体。Na⁺电流被河豚毒素(TTX,1μM)阻断，并且K⁺电流被4-氨基吡啶(4-AP,1mM)(Sigma-Aldrich)阻断。

<8-1>从人多能干细胞分化的视网膜神经节细胞的电生理学性质的测试

为测试根据本发明分化的人多能干细胞来源的视网膜神经节细胞的电性质，首先评估根据方案A分化的视网膜神经节细胞。在诱导分化后第39天动作电位的评估中，观察到响应于步阶电流注入的强烈规则尖峰的动作电位序列(图15A)。完整细胞贴片钳记录的结果显示电压门控钠通道的存在，其被河豚毒素阻断(图15B)。因此，确认了人多能干细胞来源的视网膜神经节细胞分化为电可兴奋的细胞。在诱导分化后第59天动作电位的评估中，发现响应于步阶电流注入的动作电位比诱导分化后第39天的动作电位更成熟(图16B)。报道了在胚胎发育期间，神经元在数天内发育成熟纤维细胞(firing cell)。在体内发现相同过程(Connors et al.1982；McCormick&Prince,1987)。在根据方案B(图17A)和方案C(图18A)分化的视网膜神经节细胞和人诱导多能干细胞(图20)中也观察到类似结果。根据本发明的方案分化的视网膜神经节细胞显示随时间增加的电成熟和功能。

<8-2>从人多能干细胞分化的视网膜神经节细胞的电生理学功能的测试

根据本发明从人多能干细胞分化的视网膜神经节细胞形成功能性兴奋性突触。突触发生是神经网膜发育中的关键步骤。使用可视化突触前和突触后蛋白定位的超高分辨率显微镜检测人多能干细胞来源的视网膜神经节细胞之间的生理突触的形成。突触被定义为通过MAP2染色检测的树突周围发现的数百纳米直径的区域，其中对突触前和突触后部分特异的蛋白并置。使用针对突触前和突触后蛋白的抗体鉴定突触：使用针对兴奋性谷氨酸能突触后蛋白PSD-95(谷氨酸能突触后密度蛋白95)和突触前蛋白突触蛋白1的抗体。从多能干细胞来源的视网膜神经节细胞产生的PSD-95中心沿树突或在其100nm范围内丰富，并与突触前囊泡突触蛋白1并置，但不重叠(图10G和10H)。还在从另一人胚胎肝细胞系H7(图13G和13H)和人诱导多能干细胞(图14K和14L)来源的视网膜神经节细胞中发现这些，指示人多能干细胞来源的视网膜神经节细胞之间的生理突触的形成。

同时，电生理学地评估细胞之间形成的生理突触。在诱导分化后第39天未与其他视网膜组织共培养的人胚胎干细胞来源的视网膜神经节细胞中检测到自发性兴奋性突触后电流(sEPSC)(图15C)，指示在人胚胎干细胞来源的视网膜神经节细胞之间功能性兴奋性突触的形成。此外，当在诱导分化后第59天评估时，sEPSC的频率和尖峰的深度增加(图16E)，暗示神经元成熟随时间进展。发现sEPSC被CNQX阻断，表明它们是AMPA介导的兴奋性谷氨酸能神经元之一。在根据方案B(图17B)和方案C(图18B)分化的视网膜神经节细胞中观察到类似结果。

实施例9：从人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞向视网膜光受体细胞和视网膜神经节细胞的分化的方案之间的比较

本发明人在之前的专利中公开了从干细胞分化视网膜细胞的方法(韩国专利第10-1268741号(2013.05.22.)和WO2011/043591(2011.04.14))。

根据上述文档中公开的方法，从视网膜祖细胞到光受体细胞的分化最大为约80％。然而，它们到视网膜神经节细胞的分化部分进展至仅约6％。

<9-1>从人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞向视网膜光受体细胞的分化

以与实施例1至3中相同的方式进行从人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞向眼区前体细胞和视网膜祖细胞的分化。

在诱导分化后第13天，通过供应向光受体细胞前体细胞的分化培养基[DMEM/F12(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巯基乙醇(Sigma-Aldrich)，1％B27补充物(Invitrogen)，1％N2补充物(Invitrogen)，10ng/mL头蛋白，10ng/mL IGF-1，5ng/mL FGF2，50ng/mL重组Wnt3a(重组Wnt3a，R&DSystems)]5天，使实施例3中所产生的视网膜祖细胞分化为光受体细胞前体细胞。在诱导分化后第18天，向光受体细胞前体细胞的分化培养基中加入250ng/mL重组Shh(重组音猬因子氨基末端肽，Shh,R&DSystems)，然后使细胞分化5天成为光受体细胞。在诱导分化后第21天，向光受体细胞的培养基中加入500nM视黄酸(RA)，并培养29天以使产生的光受体细胞成熟。在光受体细胞的培养持续至第29天之后的情况下，持续供应包含Wnt3a、Shh和RA的培养基。在通过该方法产生的细胞的免疫荧光结果中，光受体细胞为80％或更多，视网膜神经节细胞为约6％。

<9-2>从人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞向视网膜神经节细胞的分化

以与眼区前体细胞的分化相同的方式进行人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞向视网膜神经节细胞的分化，和以与光受体细胞的分化相同的方式进行向视网膜祖细胞的分化，除了在诱导分化后第14天开始供应50ng/mL重组Wnt3a 3天，然后移除。在移除Wnt3a之后供应Shh和RA。即，在开始分化为视网膜神经节细胞之后，当视网膜神经节细胞分化和成熟时，在每个阶段需要移除了Wnt3a和添加了Shh和RA的培养基。

在通过该方法产生的细胞的免疫荧光结果中，没有观察到光受体细胞相关的标志物Crx和Ret-P1。

实施例10：从未成熟的视网膜神经节细胞向成熟视网膜神经节细胞的分化：步骤2

可以使用实施例6的分化方法使实施例6中获得的成熟视网膜神经节细胞成熟，但它们也可以使用通过在诱导分化后第39天从上述分化培养基中移除IGF-1、Shh和视黄酸而制备的培养基成熟。在诱导分化后第96天进行电生理学分析以评估成熟度(图19)。此外，在诱导分化后第32天以相同方式使视网膜神经节细胞成熟，并且因此，它们表现出与在包含IGF-1、Shh和视黄酸的培养基中培养的细胞相似的成熟度。

实施例11：通过Wnt信号转导途径活化剂和Shh受体活化剂的人胚胎干细胞来源的视网膜神经节细胞的分化

以与实施例1至3中相同的方式进行从人胚胎干细胞或人诱导多能干细胞向眼区前体细胞或视网膜祖细胞的分化。

在诱导分化后第14天，在包含2μM BIO(6-溴靛玉红-3’-肟)或50ng/mL Norrin作为Wnt信号转导途径活化剂代替50ng/mL重组Wnt3a的分化培养基[DMEM/F12(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巯基乙醇(Sigma-Aldrich)，1％B27补充物(Invitrogen)，1％N2补充物(Invitrogen)，10ng/mL头蛋白，10ng/mL IGF-1，5ng/mL FGF2，50ng/mL重组Wnt3a(R&DSystems)]中，使实施例3中所产生的视网膜祖细胞培养并分化为未成熟的视网膜神经节细胞3天。在诱导分化后第17天，在包含1μMpurmorphamine作为Shh受体活化剂代替250ng/mL Shh的分化培养基[DMEM/F12(Invitrogen)，1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen)，0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)，0.1mM巯基乙醇(Sigma-Aldrich)，1％B27补充物(Invitrogen)，1％N2补充物(Invitrogen)，10ng/mL IGF-1，250ng/mL重组Shh(R&D Systems)]中，使因此产生的未成熟的视网膜神经节细胞培养并分化为成熟视网膜神经节细胞5天。在诱导分化后第22天，使用通过向上述分化培养基中添加500nM视黄酸(RA)而制备的培养基使成熟视网膜神经节细胞成熟39天。

使用视网膜神经节细胞标志物Islet-1和NF200进行通过该方法产生的细胞的免疫荧光测定，结果与使用Wnt3a和Shh的结果一致(图21)。

实施例12：在方案A分化方法中使用Wnt3a、Shh和RA的效果

为检查在视网膜神经节细胞的产生期间在方案A分化方法中使用的Wnt3a、Shh和RA各自的效果，根据方案A的分化计划表处理各个因子，并且在诱导分化后第39天，使用视网膜神经节细胞特异性标志物进行免疫荧光测定(图22)。

在诱导分化后第14天至第17天处理1μg/mL Wnt3a拮抗剂Dkk1代替Wnt3a，根据分化时间表处理Shh和RA，然后是免疫荧光测定。结果是，很难产生视网膜神经节细胞，因为没有加入Wnt3a，并且视网膜祖细胞的内源Wnt3a被Dkk1抑制(所有标志物阳性率：小于2％)(图22(A))。

但根据各自的分化计划表处理Shh和RA而不处理Wnt3a时，通过视网膜祖细胞的内源Wnt3a的作用产生少量的视网膜神经节细胞(所有标志物阳性率：约10％至15％)(图22(B))。

当仅处理Wnt3a而不处理Shh和RA时，由于Wnt3a的作用而产生80％或更多的视网膜神经节细胞。然而，由于缺乏Shh，视网膜神经节细胞轴突的直径生长和成束被推迟(参见NF200染色)。此外，由于缺乏RA，没有观察到视网膜神经节细胞的突触发生和树突棘发育(参见TUJ1染色)(图22(C))。

当处理Wnt3a和Shh而不处理RA时，由于Wnt3a的作用而产生80％或更多的视网膜神经节细胞，也观察到Shh的作用。然而，由于缺乏RA，视网膜神经节细胞的突触发生和树突棘发育被抑制(参见TUJ1染色)(图22(D))。

当处理Wnt3a和RA而不处理Shh时，由于Wnt3a的作用而产生80％或更多的视网膜神经节细胞，但由于缺乏Shh，NF200阳性的轴突的直径生长和成束被推迟(参见NF200染色)。

这些结构表明Wnt3a的处理在视网膜神经节细胞的分化中起关键作用。还证实了当根据计划表适当处理RA和Shh时，视网膜神经节细胞可以良好分化。

实施例13：人多能干细胞来源的视网膜神经节细胞的细胞系

从干细胞向成熟器官细胞的分化需要长时间，依赖于专家的时间和努力并需要多种试剂。如果处于分化的最终阶段或中间阶段的细胞被建立为细胞系，可以显著降低这种分化时间。即，如果需要成熟细胞，不是从干细胞诱导分化，而是从建立的细胞系诱导分化，从而在短时间内制备成熟细胞。为此目的，本发明人尝试从最终分化阶段的成熟细胞建立细胞系并最终成功。干细胞的分化伴随着不对称分裂。即，细胞分裂后的两个子细胞具有不同的细胞命运：原始干细胞的一个副本以及编程为分化为非干细胞命运的第二子细胞。本发明的特征在于进行分化的成熟细胞的继代培养，使成熟的分化细胞由于环境改变而死亡和增殖具有干细胞性质的细胞，导致细胞系的建立。具体地，建立同时具有原始分化的细胞和干细胞的性质的中间阶段细胞系是重点。

在诱导分化后第32天和第39天通过0.05％胰蛋白酶(Invitrogen)分离细胞。将获得的细胞以1.5×10⁴至1.6×10⁴/cm²的密度接种在含有一种下述培养基的培养瓶、盘或平板上。下述两种培养基(培养基1和培养基2)在细胞增殖能力，传代次数和时间方面彼此相同。细胞在5％二氧化碳(CO₂)和37℃下培养，每2天至每3天更换下述培养基。每3天至每4天用0.05％胰蛋白酶处理以1:6至1:10的比例对增殖的细胞进行传代。

培养基1:[IMDM(Invitrogen),15％FBS,1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen),0.1mM巯基乙醇(Sigma-Aldrich),1％胰岛素/运铁蛋白/硒-X(Invitrogen)]。

培养基2:[IMDM(Invitrogen),15％FBS,1mM L-谷氨酰胺(Invitrogen),0.1mM巯基乙醇(Sigma-Aldrich),5ng/mL FGF2,10ng/mL IGF-1,5ng/mL人重组EGF(人重组表皮生长因子Peprotech,Rocky Hill,NJ)]。

细胞培养至第20代(p20)，培养基1和培养基2中传代的所有细胞在体外显示神经元形态(图23)。将第15代至第17代(p15至p17)的人多能干细胞来源的视网膜神经节细胞系用于评估它们的细胞特性和神经元功能。通过实施例7的方法进行使用针对视网膜神经节细胞特异性标志物的免疫荧光测定，通过活细胞Ca²⁺成像评估神经元功能。

对于钙成像，用Tyrode's溶液(119mM NaCl,2.5mM KCl,2mMCaCl₂,2mM MgCl₂,25mMHEPES,30mM葡萄糖,pH 7.4)洗涤在18mm盖玻片上培养的细胞两次或三次，然后添加1μMFluo-4-AM(Lifetechnologies,Carlsbad,CA,USA)在37℃培养。在培养15分钟后，用Tyrode's溶液洗涤细胞10分钟。通过使用安装有40倍(1.0NA)油镜和EMCCD(iXon887,AndorTechnologies,Belfast,Northern Ireland)的Olympus IX-71倒置显微镜(Olympus,Tokyo,Japan)每0.5秒获得时间差异图像，持续30分钟。从第10张图像画面，用1mM谷氨酸盐刺激细胞。刺激之后，用Tyrode's溶液浸泡细胞。

免疫荧光测定的结果显示表达神经节细胞特异性标志物Math5(98.9％),Brn3B(52.4％)和Brn3A(99.7％)，还表达功能标志物Thy1.2(86.1％),TrkB(44.0％)和NMDAR-1(97.0％)。还强烈表达神经元标志物Tuj1(100％)和视网膜神经节细胞轴突标志物NF200(98.5％)。同时，还观察到细胞增殖标志物KI67(49.2％)，指示细胞系具有细胞增殖能力(图24)。

通过细胞内钙成像测试视网膜神经节细胞系的神经元功能。用1μM fluor-4处理传代的细胞并用1mM谷氨酸盐刺激。结果是，大部分活细胞表现响应于谷氨酸盐刺激的细胞质钙水平显著增加，指示视网膜神经节细胞系具有神经元功能(图25)。

基于以上描述，本领域技术人员将理解本发明可以不同具体方式实施而不改变其技术精神或基本特征。因此，应理解上述实施方案在所有方面不是限制性的，而是示例性的。本发明的范围由所附权利要求定义而非由之前的描述定义，因此权利要求意欲包括落入权利要求边界和范围内的所有改变和修改，或这些改变和修改的等同物。

Claims

1.制备成熟视网膜神经节细胞的方法，其通过使干细胞分化为成熟视网膜神经节细胞，所述方法包括：

(a)在包含IGF1R(胰岛素样生长因子-1受体)活化剂和Wnt信号转导途径活化剂的培养基中培养视网膜祖细胞以使它们分化为未成熟的视网膜神经节细胞；以及

(b)在其组成与步骤(a)的培养基的组成相比不包含Wnt信号转导途径活化剂的培养基中培养所述未成熟的视网膜神经节细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的培养基包含IGF1R活化剂、BMP(骨形态发生蛋白)信号转导途径抑制剂、FGF(成纤维细胞生长因子)信号转导途径活化剂和Wnt信号转导途径活化剂。

3.如权利要求2所述的方法，其中步骤(b)是在其组成与步骤(a)的培养基的组成相比不包含BMP信号转导途径抑制剂、FGF信号转导途径活化剂和Wnt信号转导途径活化剂，但包含Shh(音猬因子)信号转导途径活化剂的培养基中培养所述未成熟的视网膜神经节细胞。

4.如权利要求3所述的方法，其还包括步骤(c)：在其组成与步骤(b)的培养基的组成相比包含RA(视黄酸)的培养基中培养所述未成熟的视网膜神经节细胞。

5.如权利要求2所述的方法，其中步骤(b)包括：

(i)在其组成与步骤(a)的培养基的组成相比不包含Wnt信号转导途径活化剂的培养基中培养未成熟的视网膜神经节细胞；以及

(ii)在其组成与步骤(i)的培养基的组成相比不包含BMP信号转导途径抑制剂和FGF信号转导途径活化剂，但包含Shh(音猬因子)信号转导途径活化剂的培养基中培养未成熟的视网膜神经节细胞。

6.如权利要求5所述的方法，其还包括步骤(c)：在其组成与步骤(b)-(ii)的培养基的组成相比包含RA(视黄酸)的培养基中培养所述未成熟的视网膜神经节细胞。

7.如权利要求4或6所述的方法，其还包括步骤(d)：在其组成与步骤(c)的培养基的组成相比不包含选自IGF1R活化剂、Shh信号转导途径活化剂和RA中的一种或多种的培养基中培养未成熟的视网膜神经节细胞或成熟视网膜神经节细胞。

8.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)的视网膜祖细胞通过包含以下步骤的方法获得：

(a’)在含有IGF1R活化剂、Wnt信号转导途径抑制剂和BMP信号转导途径抑制剂的培养基中培养干细胞从而使它们分化成为悬浮聚集形式的眼区前体细胞；以及

(b’)在其组成与步骤(a’)的培养基的组成相比包含FGF信号转导途径活化剂的培养基中培养悬浮聚集形式的步骤(a’)的眼区前体细胞，从而使它们分化为视网膜祖细胞。

9.如权利要求8所述的方法，其中步骤(a’)进行1天至30天，步骤(b’)进行5天至15天。

10.如权利要求8所述的方法，其中所述干细胞选自骨髓干细胞(BMS)、脐带血干细胞、羊水干细胞、脂肪干细胞、视网膜干细胞(RSC)、视网膜内米勒胶质细胞、胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)和体细胞核移植细胞(SCNTC)。

11.如权利要求1所述的方法，其中步骤(a)进行1天至10天，步骤(b)进行1天至120天。

12.制备成熟视网膜神经节细胞的方法，其通过将未成熟的视网膜神经节细胞分化为成熟视网膜神经节细胞，所述方法包括在包含IGF1R(胰岛素样生长因子-1受体)活化剂和Shh(音猬因子)信号转导途径活化剂的培养基中培养未成熟的视网膜神经节细胞。

13.如权利要求12所述的方法，其还包括在其组成包含IGF1R活化剂、Shh信号转导途径和RA(视黄酸)的培养基中培养未成熟的视网膜神经节细胞的步骤。

14.如权利要求1或12所述的方法，其中所述IGF1R活化剂为IGF-1或IGF-2。

15.如权利要求1或12所述的方法，其中所述培养基中所述IGF1R活化剂的浓度为0.01ng/mL至100ng/mL。

16.如权利要求1所述的方法，其中所述Wnt信号转导途径活化剂为选自以下的一种或多种：Wnt1、Wnt2、Wnt2b、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt8a、Wnt8b、Wnt9a、Wnt9b、Wnt10a、Wnt10b、Wnt11、和Wnt16b；增加β-连环蛋白水平的物质；GSK3(糖原合酶激酶3)抑制剂，例如锂、LiCl、二价锌、BIO(6-溴靛玉红-3’-肟)、SB216763、SB415286、CHIR99021、QS11水合物、TWS119、Kenpaullone、alsterpaullone、靛红-3’-肟、TDZD-8、和Ro 31-8220甲磺酸盐；Axin抑制剂；APC(腺瘤性息肉病)抑制剂；norrin；以及R-spondin 2。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述培养基中Wnt信号转导途径活化剂的浓度为0.01ng/mL至500ng/mL，但除了步骤(a)中Wnt信号转导途径活化剂中的LiCl、BIO(6-溴靛玉红-3’-肟)和SB415286。

18.如权利要求16所述的方法，其中在所述Wnt信号转导途径活化剂中，所述培养基中LiCl的浓度为0.1mM至50mM，所述培养基中BIO的浓度为0.1μM至50μM，所述培养基中SB415286的浓度为0.1μM至500μM。

19.如权利要求2或8所述的方法，其中所述BMP信号转导途径抑制剂为选自头蛋白、腱蛋白、扭曲原肠胚形成(Tsg)、cerberus、coco、gremlin、PRDC(与DAN和Cerberus相关的蛋白)、DAN(在成神经细胞瘤中畸变的差别筛选选出的基因)、dante、卵泡抑素、USAG-1(子宫敏感性相关基因1)、dorsomorphin和硬化蛋白中的一种或多种。

20.如权利要求2或8所述的方法，其中所述培养基中所述BMP信号转导途径抑制剂的浓度为0.01ng/mL至100ng/mL。

21.如权利要求2或8所述的方法，其中所述FGF信号转导途径活化剂为选自FGF1、FGF2、FGF4、FGF8、FGF9、FGF17和FGF19中的一种或多种。

22.如权利要求2或8所述的方法，其中所述培养基中所述FGF信号转导途径活化剂的浓度为0.01ng/mL至100ng/mL。

23.如权利要求3、5和12中任一权利要求所述的方法，其中所述Shh信号转导途径活化剂为选自Shh、Smo(smoothened)受体活化剂、Ptc(Patched)抑制Smo的抑制剂、增加Ci/Gli家族水平的物质、Ci/Gli蛋白的细胞内降解的抑制剂、以及Shh受体活化剂如Hg-Ag和purmorphamine的一种或多种。

24.如权利要求3、5和12中任一权利要求所述的方法，其中所述培养基中所述Shh信号转导途径活化剂的浓度为0.1ng/mL至5000ng/mL。

25.如权利要求4、6和13中任一权利要求所述的方法，其中所述培养基中RA的浓度为0.5nM至10,000nM。

26.如权利要求8所述的方法，其中所述Wnt信号转导途径抑制剂为选自Dkk-1、Dkk-2、Dkk-3和Dkk-4中的一种或多种。

27.如权利要求8所述的方法，其中所述培养基中所述Wnt信号转导途径抑制剂的浓度为0.01ng/mL至10,000ng/mL。

28.如权利要求1或12所述的方法，其还包括确定所述分化的细胞是否分化为所需的成熟视网膜神经节细胞的步骤。

29.如权利要求28所述的方法，其中通过测量选自以下的一种或多种基因的mRNA或蛋白表达水平来确定向成熟视网膜神经节细胞的分化：Brn3B、Brn3A、Islet-1、NF200、Tuj1、Thy1.2、TrkB、NMDAR1、Map2、Vglut1、PSD-95、突触小泡蛋白和突触蛋白1。

30.如权利要求8所述的方法，其中步骤(b’)中所述悬浮聚集形式的眼区前体细胞在包被有选自以下的细胞外基质的平板上贴壁培养：聚D赖氨酸、层粘连蛋白、聚L赖氨酸、基质胶、琼脂、聚鸟氨酸、明胶、胶原蛋白、纤维连接蛋白和玻璃粘连蛋白。

31.如权利要求8所述的方法，其中步骤(b’)中所述悬浮聚集形式的眼区前体细胞由200个细胞至400个细胞组成。

32.如权利要求8所述的方法，其中步骤(a’)的培养基还包含DMEM/F12、10％KnockOut血清替代物和1％B27补充物。

33.如权利要求1或8所述的方法，其中步骤(b’)、(a)和(b)的培养基还包含DMEM/F12、1％B27补充物和1％N2补充物。

34.如权利要求1或12所述的方法，其中所述未成熟的视网膜神经节细胞表达(i)选自Brn3B、Brn3A、Islet-1、NF200和Tuj1的一种或多种基因，以及(ii)Math5基因。

35.如权利要求1或12所述的方法，其中通过所述方法获得的成熟视网膜神经节细胞占全部细胞的60％至95％或更高。

36.筛选成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂的方法，其包括：

(a)用成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制或增殖促进的候选物处理通过权利要求1或12所述的方法获得的分离的成熟视网膜神经节细胞；以及

(b)当与非候选物处理组比较，所述候选物分别抑制成熟视网膜神经节细胞的死亡或促进成熟视网膜神经节细胞的增殖时，确定所述候选物是成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂。

37.如权利要求36所述的方法，其中成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂为青光眼或视神经病变的治疗剂。

38.通过权利要求1至35中任一权利要求的方法获得的成熟视网膜神经节细胞，其中与分化前的视网膜祖细胞相比，所述细胞表现一种或多种以下特征：

(1)Brn3B的表达水平增加；(2)Brn3A的表达水平增加；(3)Islet-1的表达水平增加；(4)NF200的表达水平增加；(5)TuJ1的表达水平增加；(6)Thy1.2的表达水平增加；(7)TrkB的表达水平增加；(8)NMDAR1的表达水平增加；(9)Map2的表达水平增加；(10)Vglut1的表达水平增加；(11)PSD-95的表达水平增加；(12)突触小泡蛋白的表达水平增加；以及(13)突触蛋白1的表达水平增加。

39.筛选成熟视网膜神经节细胞的死亡抑制剂或增殖促进剂的试剂盒，其包含权利要求38所述的成熟视网膜神经节细胞。

40.如权利要求39所述的试剂盒，其中所述试剂盒用于筛选青光眼或视神经病变的治疗剂。

41.用于治疗青光眼或视神经病变的药物组合物，其包含权利要求38所述的成熟视网膜神经节细胞。

42.治疗青光眼或视神经病变的方法，其包括向疑似患有青光眼或视神经病变的个体施用权利要求38所述的成熟视网膜神经节细胞的步骤。

43.制备成熟视网膜神经节细胞系的方法，其包括：

44.如权利要求43所述的方法，其中步骤(b)的培养基还包含Shh信号转导途径活化剂或RA(视黄酸)或以上二者。

45.如权利要求43或44所述的方法，其还包括分离培养的细胞，然后在(i)包含IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Media)、L-谷氨酰胺、巯基乙醇和胰岛素/运铁蛋白/硒-X的培养基，或(ii)包含IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Media)、L-谷氨酰胺、巯基乙醇、FGF2、IGF-1和EGF的培养基中培养所述细胞。