JP6778181B2 - 網膜神経節細胞およびその前駆体 - Google Patents

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Description

関連出願
本願は「RETINAL GANGLION CELLS AND PROGENITORS THEREOF」と題する２０１４年９月５日出願の米国仮出願第６２／０４６，１６５号の利益を主張し、その内容全体は参照によって本明細書に組み込まれる。
網膜疾患は、分裂終了ニューロン細胞の喪失による失明を多くの場合にもたらす。網膜疾患には、緑内障、網膜色素変性症、錐体杆体ジストロフィー、網膜変性、糖尿病網膜症、黄斑変性、レーバー先天性黒内障、およびスターガルト病がある。特に、緑内障は網膜神経節（ＲＧ）細胞の損傷または変性を包含する。
網膜神経節（ＲＧ）細胞の潜在的な補充ソースは多能性幹細胞などの幹細胞である。初期の研究は、マウス胚性幹細胞からの網膜前駆体細胞のインビトロ作製（Ikeda et al. PNAS 102(32): 11331-11336, 2005）、生後第１日のマウス網膜からの網膜前駆体細胞の作製（Klassen et al. Invest. Ophthal. Vis. Sci. 45(11): 4167-4175, 2004）、網膜変性のＲＣＳラットモデルにおける骨髄間葉系幹細胞のインプラント（Inoue et al. Exp. Eye Res. 8(2): 234-241, 2007）、網膜前駆体細胞を生ずるためのヒト線維芽細胞からの人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）の分化（Lamba et al. PLoS ONE 5(1): e8763.doi: 10.1371/journal.pone.0008763）、ならびにＨ１ヒト胚性幹細胞株からのアマクリン細胞、光受容体、双極細胞、および水平細胞を包含する網膜前駆体細胞の産生（Lamba et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 10(34): 12769-12774, 2006）を報告している。
これらの最近の研究において、未成熟および成熟網膜細胞は異なる細胞型の混合集団として作製されており、網膜神経節細胞と思われるものは集団の小さいパーセンテージに相当した。その上に、ニューロフィラメント、Ｔｕｊ１、およびＨｕＣ／Ｄを包含する特定の細胞型を同定するために用いられるマーカーは、網膜神経節（ＲＧ）細胞および／またはそれらの前駆体に特異的ではない。これらの研究の１つはＢｒｎ３発現に基づいて細胞を同定し、わずかな細胞しかこのマーカーを発現しないということを見いだした。従って、これらのアプローチのいずれも、網膜神経節（ＲＧ）細胞またはＲＧ前駆体細胞の均質またはほぼ均質な集団を生じなかった。これらのアプローチのいずれも、例えばスクリーニングアッセイなどのインビトロ方法にまたはインビボ方法に有用であるために十分な数のＲＧ細胞またはＲＧ前駆体細胞を生じなかった。
ＲＧ細胞が単離され得るドナー由来組織の供給（例えば死体、胎児組織、および生体動物）は限られている。初代ＲＧ細胞を培養しようという試みはせいぜい約２週間もつ培養物をもたらし、その後には成熟ＲＧ細胞は生存不能であった。初代ＲＧ前駆体細胞の単離は報告されていない。
多能性幹細胞はインビトロでいつまでも増殖培養および拡大培養され得、ヒト治療のための非ドナー由来細胞の潜在的に無尽蔵のソースを提供する。多能性幹細胞から成熟ＲＧ細胞（成熟ＲＧ細胞の均質またはほぼ均質な集団を包含する）ならびに／または初期および／もしくは後期ＲＧ前駆体細胞（ＲＧ前駆体細胞の均質またはほぼ均質な集団を包含する）への分化は、網膜疾患のインプラントおよび処置またはスクリーニングアッセイなどのインビトロ使用のための非ドナー由来細胞の潤沢な供給を提供し得る。成熟ＲＧ細胞の高度に精製された集団は以前には得られておらず、十分な数または純度のＲＧ前駆体細胞の集団もまた以前には得られていない。本発明は、従来技術の方法および組成物の少なくともこれらの限界を克服する。
本発明は、特に、ＲＧ前駆体細胞および／または成熟ＲＧ細胞を含む組成物または調製物、ならびにかかる細胞およびかかる調製物を調製するための方法を提供する。驚くべきことに、本発明のＲＧ前駆体細胞および成熟ＲＧ細胞は、初代神経節細胞と比較してより良好な同化および遊走特性ならびにより長い生存時間をインビボで見せることが見いだされた。
ある種の態様において、本発明は、複数のＲＧ前駆体細胞と、ＲＧ前駆体細胞の生存性を維持することに好適な培地とを含む網膜神経節（ＲＧ）前駆体細胞の実質的に純粋な調製物を提供する。かかる培地は、グルコース、インスリン、フォルスコリンなどのｃＡＭＰレベルを増大させる因子、ならびに毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）などの神経栄養因子を含み得る。
ある種の態様において、本発明は、少なくとも５０％のＲＧ前駆体細胞を含有する複数の細胞と、ＲＧ前駆体細胞の生存性を維持することに好適な培地とを含むＲＧ前駆体細胞の調製物を提供する。
ある種の態様において、本発明はＲＧ前駆体細胞の調製物を提供し、多能性幹細胞、眼領域前駆体細胞、光受容体前駆体細胞、成熟光受容体、および／またはアマクリン細胞などのＲＧ前駆体細胞でない細胞を実質的に不含の複数のＲＧ前駆体細胞を含む。いくつかの態様において、調製物は、１０％未満のＲＧ前駆体細胞でない細胞、さらにはより好ましくは５％、２％、１％、０．１％未満、またはさらには０．０１％未満のそれらの細胞を包含する。いくつかの態様において、調製物はＲＧ細胞（すなわち成熟ＲＧ細胞）を実質的に不含であり得る。それらの調製物のいずれかは、ＲＧ前駆体細胞の生存性を維持することに好適な培地をさらに含む。
いくつかの態様において、調製物は成熟ＲＧ細胞とＲＧ前駆体との混合物を含み得るが、多能性幹細胞、眼領域前駆体細胞、光受容体前駆体細胞、成熟光受容体、および／またはアマクリン細胞などの他の細胞型を欠き得る。
ある種の態様において、本発明は、哺乳動物患者への使用に好適であるＲＧ前駆体細胞の医薬調製物を提供し、複数のＲＧ前駆体細胞と、哺乳動物患者への移植のためにＲＧ前駆体細胞の生存性を維持するための医薬的に許容される担体とを含む。
ある種の態様において、本発明は、少なくとも１０９個のＲＧ前駆体細胞と、ＲＧ前駆体細胞と適合性の、解凍後のかかる細胞の生存性を維持できる極低温保存剤系とを含む極低温細胞調製物を提供する。
ＲＧ前駆体細胞を含む調製物のいくつかの態様において、調製物中の細胞の少なくとも７０％は免疫細胞化学的にＭａｔｈ５（＋）であり、さらにはより好ましくは調製物中の細胞の少なくとも８０％、９０％、９５％、または９８％は免疫細胞化学的にＭａｔｈ５（＋）である。いくつかの態様において、調製物中の細胞はＢｒｎ３ａ（＋）でもまたある。いくつかの態様において、調製物中の細胞はＢｒｎ３ｂ（＋）でもまたある。いくつかの態様においては、調製物中の細胞はＩｓｌ１（＋）でもまたある。いくつかの態様においては、調製物中の細胞はＢｒｎ３ａ（＋）およびＢｒｎ３ｂ（＋）でもまたある。いくつかの態様においては、調製物中の細胞はＢｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、およびＩｓｌ１（＋）でもまたある。
ＲＧ前駆体細胞を含むいくつかの調製物においては、調製物中の細胞の少なくとも７０％が免疫細胞化学的にＭａｔｈ５（＋）およびＢｒｎ３ａ（＋）（すなわちＭａｔｈ５およびＢｒｎ３ａについて陽性）であり、さらにはより好ましくは調製物中の細胞の少なくとも８０％、９０％、９５％、または９８％は免疫細胞化学的にＭａｔｈ５（＋）およびＢｒｎ３ａ（＋）である。いくつかの態様において、調製物中の細胞はＢｒｎ３ｂ（＋）でもまたある。いくつかの態様においては、調製物中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％が免疫細胞化学的にＭａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、およびＢｒｎ３ｂ（＋）である。いくつかの態様において、調製物中の細胞はＩｓｌ１（＋）でもまたある。いくつかの態様において、調製物中の細胞の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％は免疫細胞化学的にＭａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、およびＩｓｌ１（＋）である。いくつかの態様においては、細胞の３０％、２０％、１０％、５％、１％未満がＴｈｙ１を発現するか、または細胞のいずれも発現しない。ＲＧ前駆体細胞はＴｕｊ１をもまた発現し得る。
ＲＧ前駆体細胞を含むいくつかの調製物においては、調製物中の細胞の少なくとも５０％、６０％、または７０％が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ａ（＋）および／またはニューロフィラメント（＋）であり、さらにはより好ましくは調製物中の細胞の少なくとも８０％、９０％、９５％、または９８％が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ａ（＋）および／またはニューロフィラメント（＋）である。いくつかの態様において、調製物中の細胞の少なくとも５０％、６０％、または７０％は免疫細胞化学的にＢｒｎ３ａ（＋）およびニューロフィラメント（＋）であり、さらにはより好ましくは調製物中の細胞の少なくとも８０％、９０％、９５％、または９８％が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ａ（＋）およびニューロフィラメント（＋）である。いくつかの態様において、調製物中の細胞はＴｈｙ１（＋）でもまたある。いくつかの態様において、調製物中の細胞の少なくとも５０％、６０％、または７０％は免疫細胞化学的にＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、およびＴｈｙ１（＋）である。ＲＧ前駆体細胞はＴｕｊ１をもまた発現し得る。
ＲＧ前駆体細胞は増殖性である。いくつかの態様においては、ＲＧ前駆体細胞の調製物中の細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％が増殖性である。
ある種の態様において、ＲＧ前駆体細胞はＨＬＡ遺伝子型的に同一であり、好ましくはゲノム的に同一である。
ある種の態様において、ＲＧ前駆体細胞は、７ｋｂ、７．５ｋｂ、８ｋｂ、８．５ｋｂ、９ｋｂ、９．５ｋｂ、１０ｋｂ、１０．５ｋｂ、１１ｋｂ、１１．５ｋｂ、またはさらには１２ｋｂよりも長い平均末端制限断片長（ＴＲＦ）を有する。
ある種の態様において、ＲＧ前駆体細胞はヒト患者への投与に好適である。
ある種の態様において、ＲＧ前駆体細胞は獣医学的な非ヒト患者への投与に好適である。
上の調製物の好ましい態様において、ＲＧ前駆体細胞は哺乳動物多能性幹細胞、特にヒト多能性幹細胞に由来し、好ましくは胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群から選択される。
ある種の態様において、ＲＧ前駆体細胞は普通の多能性幹細胞ソースから分化する。
ある種の態様において、ＲＧ前駆体細胞は、高眼内圧緑内障マウスもしくはラットモデル系のまたは視神経（ＯＮ）挫滅損傷マウスモデル系の硝子体または網膜下腔に移植され得、神経節細胞層まで遊走し、モデル系のいずれかにおいてパターンＥＲＧ（網膜電図法）の応答および視力を改善するであろう。ある種の態様において、ＲＧ細胞およびＲＧ前駆体細胞は視神経を再生し得る。
ある種の態様において、ＲＧ前駆体細胞およびＲＧ細胞は１つ以上のニューロン保護因子を分泌し、それによってニューロン保護を提供する。かかるニューロン保護は視神経損傷または緑内障の動物モデルを用いて測定され得る。
ある種の態様において、ＲＧ前駆体細胞の生存性を維持することに好適な培地は、培養培地、極低温保存剤、およびヒト患者の注射に好適な生体適合性の注射媒体からなる群から選択される。
ある種の態様において、ＲＧ前駆体細胞調製物は発熱性物質およびマイトジェン（mycogen）不含である。
本発明の別の側面は、哺乳動物患者への使用に好適であるＲＧ細胞の医薬調製物を提供し、多能性幹細胞由来ＲＧ細胞を含み、調製物中の細胞はニューロフィラメントおよび／またはＢｒｎ３ａについて免疫細胞化学的に陽性であり、それゆえにいくつかの場合にはニューロフィラメント（＋）Ｂｒｎ３ａ（＋）であり得る。ＲＧ細胞はＴｕｊ１（＋）であり得、それらは任意にＴｈｙ１（＋）でもまたあり得る。医薬調製物は、哺乳動物患者への移植のために、ＲＧ細胞の生存性を維持するための医薬的に許容される担体をさらに含み得る。
本発明の別の側面は、哺乳動物患者への使用に好適であるＲＧ細胞の医薬調製物を提供し、多能性幹細胞由来ＲＧ細胞（調製物中の細胞は免疫細胞化学的にニューロフィラメント（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、およびＴｕｊ１（＋）、ならびに任意にＴｈｙ１（＋）である）と、哺乳動物患者への移植のために、ＲＧ細胞の生存性を維持するための医薬的に許容される担体とを含む。
本発明の別の側面は、哺乳動物患者への使用に好適であるＲＧ細胞の医薬調製物を提供し、多能性幹細胞由来ＲＧ細胞（細胞の７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには９８％超は免疫細胞化学的にニューロフィラメント（＋）およびＢｒｎ３ａ（＋）である）と、哺乳動物患者への移植のために、ＲＧ細胞の生存性を維持するための医薬的に許容される担体とを含む。いくつかの場合には、調製物中の細胞の５０％、６０％、または７０％超が免疫細胞化学的にＴｈｙ１（＋）である。いくつかの態様においては、細胞の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、またはさらには９８％が免疫細胞化学的にＴｕｊ１（＋）である。
いくつかの態様において、ＲＧ細胞の医薬調製物中の細胞は分裂不活性（または分裂終了）であり、それらが非増殖性であるということを意味している。これは、当分野において公知の増殖アッセイ、例えばトリチウム化チミジン取り込みアッセイを用いて判定され得る。いくつかの態様においては、調製物中の細胞の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％超が分裂不活性である。
いくつかの態様において、ＲＧ細胞の医薬調製物中の細胞はＲＧ前駆体クラスよりも多数の樹状突起および／または複雑な樹状突起を含む。いくつかの態様においては、調製物中の細胞の５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９８％超が（前駆体クラスと比較して）より多数の樹状突起および／またはより複雑な樹状突起を含む。それゆえに、成熟ＲＧ細胞は、ＲＧ前駆体細胞と比較して、増大した数の一次樹状突起ならびに／または二次、三次、およびより高いレベルの増大した樹状突起分岐、ならびに／または増大した樹状突起合計長を見せる。例えば、ＲＧ細胞はＲＧ前駆体細胞よりも細胞あたりの基準で２〜５倍多い樹状突起を有し得る（例えば、ＲＧ細胞は４〜５つの樹状突起を細胞あたり有し得、ＲＧ前駆体細胞は１〜２つの樹状突起を細胞あたり有し得る）。
本発明のなお別の側面は、網膜色素上皮細胞、光受容体前駆体細胞、および／または光受容体細胞と一緒にＲＧ前駆体細胞および／またはＲＧ細胞と、哺乳動物患者への移植のために、ＲＧ前駆体細胞および／またはＲＧ細胞の生存性を維持するための医薬的に許容される担体とを含む医薬調製物を提供する。調製物は双極細胞および／またはアマクリン細胞をもまた包含し得る。細胞の調製物は、細胞懸濁液として（一緒に混ざって、または細胞の別々の用量が併せて送達されるキットの形態でいずれかで）、例えばシートまたは単層もしくは多層細胞グラフトを包含する３次元構造として（任意に、生体適合性のマトリックスもしくは固体支持体上に配置されて）提供され得る。多層細胞グラフトのケースでは、ＲＰＥ細胞は、単層、好ましくは極性のある単層として提供され得る。それゆえに、いくつかの態様において、ＲＧ細胞および／またはＲＧ前駆体細胞は、ＲＰＥ細胞、光受容体細胞、または光受容体前駆体細胞を包含する他の神経網膜感覚細胞と一緒に用いられる。
本発明のさらに別の側面は、患者の網膜神経節細胞の喪失または機能不全によって引き起こされる疾患および障害を処置するための方法を提供し、本明細書に記載されるような医薬調製物、例えばＲＧ前駆体細胞もしくはＲＧ細胞または両方の調製物を投与することを含む。調製物は、例えば患者の眼の網膜下腔、患者の硝子体などに局所注射されるか、または全身的にもしくは細胞が存続し得る他の体腔部に送達され得る。
網膜神経節細胞の喪失によって引き起こされる疾患または障害は、緑内障、視神経損傷、虚血性視神経症、視神経炎、糖尿病網膜症、遺伝性神経節変性、および遺伝性網膜ジストロフィーを包含する。
それゆえに、対象の網膜神経節細胞の喪失または機能不全によって引き起こされる疾患または障害の処置のための医薬の製造への、本明細書に記載されるおよび／または本明細書に記載される方法を用いて作られるＲＧ前駆体細胞集団のいずれかの使用もまた提供される。対象の網膜神経節細胞の喪失または機能不全によって引き起こされる疾患または障害を処置する方法への使用のための、本明細書に記載されるおよび／または本明細書に記載される方法を用いて作られるＲＧ前駆体細胞集団のいずれかもまた提供される。
同様に、対象の網膜神経節細胞の喪失または機能不全によって引き起こされる疾患または障害の処置のための医薬の製造への、本明細書に記載されるおよび／または本明細書に記載される方法を用いて作られるＲＧ細胞集団のいずれかの使用もまた提供される。対象の網膜神経節細胞の喪失または機能不全によって引き起こされる疾患または障害を処置する方法への使用のための、本明細書に記載されるおよび／または本明細書に記載される方法を用いて作られるＲＧ細胞集団のいずれかもまた提供される。
ある種の態様において、本発明はＲＧ細胞を生ずる方法を提供し、
（ａ）眼領域前駆体細胞を、好ましくは細胞クラスターとして、好ましくは低接着または非接着条件下で、神経節細胞培地によって、細胞クラスターがＲＧ前駆体細胞を含む個体の細胞スフィアを形成するために十分な時間培養し、
（ｂ）培養物中の細胞の大多数がＢｒｎ３ａ（＋）および／またはニューロフィラメント（＋）（好ましくはＢｒｎ３ａ（＋）およびニューロフィラメント（＋））およびＴｕｊ１（＋）および任意にまたＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされるＲＧ細胞になるまで、細胞スフィアを網膜神経節細胞分化培地によって接着条件下で、好ましくは（バイオマテリアルスキャホールドなどの）マトリックス上で培養する、
ステップを含む。
ある種の態様において、本発明は、眼領域前駆体細胞を、好ましくは細胞クラスターとして、好ましくは低接着または非接着条件下で、神経節細胞培地によって、細胞クラスターがＲＧ前駆体細胞を形成するために十分な時間培養することを含む方法を提供する。ＲＧ前駆体細胞は、任意に、培養物中の細胞の大多数がＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、およびＴｕｊ１（＋）、および任意にＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされるＲＧ細胞になるまで、網膜神経節細胞分化培地によって接着条件下で、好ましくは（バイオマテリアルスキャホールドなどの）マトリックス上で培養され得る。
いくつかの態様において、眼領域前駆体細胞はＰａｘ６（＋）およびＲｘ１（＋）ならびにＯｃｔ４（−）およびＮａｎｏｇ（−）としてキャラクタリゼーション、例えば免疫細胞化学的にキャラクタリゼーションされ、さらにはより好ましくは、Ｓｉｘ３（＋）、Ｓｉｘ６（＋）、Ｌｈｘ２（＋）、Ｔｂｘ３（＋）、Ｓｏｘ２（＋）、Ｏｔｘ２（＋）、およびネスチン（＋）としてもまたキャラクタリゼーションされ、例えば、免疫染色および／もしくはフローサイトメトリーまたは細胞のマーカー発現をキャラクタリゼーションするために用いられる他の標準的なアッセイによって判定され得る。
いくつかの態様において、ＲＧ前駆体細胞は、Ｍａｔｈ５（＋）として、またはＭａｔｈ５（＋）およびＢｒｎ３ａ（＋）として、またはＭａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、およびＢｒｎ３ｂ（＋）として、またはＭａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、およびＩｓｌ１（＋）として、またはＢｒｎ３ａ（＋）およびニューロフィラメント（＋）として、またはＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、およびＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ、例えば、免疫染色および／もしくはフローサイトメトリーまたは細胞のマーカー発現をキャラクタリゼーションするために用いられる他の標準的なアッセイによって判定され得る。
ある種の態様において、接着条件は細胞が接着し得る表面を有する培養系を包含し、これは接着材料を包含し、これは、単に例示すると、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル樹脂、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタラート、セルロース、ガラス繊維、セラミック粒子、バイオマテリアルスキャホールド、ポリ−Ｌ−乳酸、デキストラン、不活性金属繊維、シリカ、ナトロンガラス、ホウケイ酸ガラス、キトサン、またはヘチマの１つ以上を含み得る。いくつかの態様において、接着材料は静電的に帯電している。ある種の態様において、バイオマテリアルスキャホールドは、細胞外マトリックス、例えば（コラーゲンＩＶ型もしくはＩ型などの）コラーゲン、８０４Ｇ由来マトリックス、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コンドロネクチン、ラミニン、またはマトリゲル（商標）である。他の態様において、バイオマテリアルはゼラチン、アルギン酸、ポリグリコリド、フィブリン、または自己組織化ペプチドである。
ある種の態様において、ＲＧ前駆体細胞、および結果としてＲＧ細胞は、胚性幹細胞または人工多能性幹細胞などの多能性幹細胞に由来する。
好ましい態様において、ＲＧ前駆体細胞のもたらされる調製物は多能性幹細胞を実質的に不含で提供される。すなわち、調製物中の細胞の１０％未満が多能性幹細胞であり、さらにはより好ましくは調製物中の細胞の５％、２％、１％、０．１％未満、またはさらには０．０１％未満が多能性幹細胞である。
好ましい態様において、ＲＧ前駆体細胞のもたらされる調製物は眼領域前駆体細胞を実質的に不含で提供される。すなわち、調製物中の細胞の１０％未満、さらにはより好ましくは５％、２％、１％、０．１％未満、またはさらには０．０１％未満が眼領域前駆体細胞である。
好ましい態様において、ＲＧ前駆体細胞のもたらされる調製物の細胞構成要素は、他の細胞型に関して少なくとも５０％純粋であり（すなわち、調製物中の細胞の少なくとも５０％がＲＧ前駆体細胞である）、好ましくは、調製物中の細胞の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％がＲＧ前駆体である。
ある種の態様において、方法は、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を極低温保存するさらなるステップを包含する。細胞は、好ましくは、凍結された細胞の解凍（および解凍された細胞そのもの）と適合性である極低温保存剤中で凍結され、任意に細胞を洗浄して極低温保存剤を除去した後に、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞は少なくとも２５％の細胞生存率（例えば培養効率に基づく）、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、またはさらには少なくとも９０％の細胞生存率を保持する。
ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞は極低温保存され得る。いくつかの態様において、ＲＧ前駆体細胞はスフィアとして極低温保存される。
ある種の態様において、神経節細胞培地は、Neurobasal（商標）培地（Life Technologies）などの基本培地（または同様の成分を含む他の培地）、Ｄ−グルコース、ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質、GlutaMAX（商標）、N2サプリメント（Invitrogen）、B27サプリメント（またInvitrogenから）、フォルスコリン、ＢＤＮＦ、およびＣＮＴＦを含み得る。B27サプリメントは、特にＳＯＤ、カタラーゼ、および他の抗酸化剤（ＧＳＨ）、ならびにユニークな脂肪酸、例えばリノール酸、リノレン酸、リポ酸を含有する。N2サプリメントは例えば次のカクテルと取りかえられ得る：トランスフェリン（１０ｇ／Ｌ）、インスリン（５００ｍｇ／Ｌ）、プロゲステロン（０．６３ｍｇ／Ｌ）、プトレシン（１６１１ｍｇ／Ｌ）、およびセレナイト（０．５２ｍｇ／Ｌ）。
前述の側面および態様のある種の態様において、ＲＧ前駆体細胞は、多能性幹細胞のソース、例えばＯｃｔ４、アルカリホスファターゼ、Ｓｏｘ２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、およびＴＲＡ−１−８０を発現する多能性幹細胞（例えば胚性幹（ＥＳ）細胞株または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞株だが、これに限定されない）から、さらにはより好ましくは普通の多能性幹細胞ソースから分化させられる。
前述の側面および態様のある種の態様において、ＲＧ前駆体細胞は、７ｋｂ、７．５ｋｂ、８ｋｂ、８．５ｋｂ、９ｋｂ、９．５ｋｂ、１０ｋｂ、１０．５ｋｂ、１１ｋｂ、１１．５ｋｂ、またはさらには１２ｋｂよりも長い平均末端制限断片長（ＴＲＦ）を有する。
前述の側面および態様のある種の態様において、調製物はヒト患者への投与に好適であり、より好ましくは発熱性物質不含および／または非ヒト動物産物を不含である。
前述の側面および態様のある種の態様において、調製物は、犬、猫、または馬などだがこれに限定されない獣医学的な非ヒト哺乳動物への投与に好適である。
１つの側面において、本開示はＲＧ前駆体細胞を生ずる方法を提供し、多能性幹細胞を順次（ｉ）網膜誘導（ＲＩ）培地、（ｉｉ）神経分化（ＮＤ）培地、および（ｉｉｉ）神経節細胞（ＧＣ）培地によって培養することを含む。
多能性幹細胞はヒトであり得る。いくつかの態様において、多能性幹細胞はヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞であり得る。多能性幹細胞は未分化状態において、フィーダーフリーおよび／またはゼノフリー条件下で、任意にマトリックスの存在下で培養され得る。多能性幹細胞は未分化状態において、マトリゲル（商標）を含む基質などだがこれに限定されない基質上で、任意にmTESR1培地によって培養され得る。
分化は、多能性幹細胞を網膜誘導培地によって培養することによって始まる。網膜誘導培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＤＭＥＭ／高グルコース、もしくはＤＭＥＭ／ノックアウトなどの基本培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２の構成要素を含む培地もしくはＤＭＥＭ／高グルコースの構成要素を含む培地もしくはＤＭＥＭ／ノックアウトの構成要素を含む培地を含み得る。
網膜誘導培地はＤ−グルコースを含み得る。
神経分化培地はＤ−グルコースを含み得る。Ｄ−グルコースは０〜１０ｍｇ／ｍｌの間、２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌ、３〜６ｍｇ／ｍｌ、４〜５ｍｇ／ｍｌ、または約４．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
網膜誘導培地は１つ以上の抗生物質を含み得る。抗生物質は、ペニシリンおよびストレプトマイシンいずれかまたは両方を、任意に約０〜１００単位／ｍｌまたは約１００単位／ｍｌのペニシリンおよび任意に約０〜１００μｇ／ｍｌまたは約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの濃度で包含し得る。
網膜誘導培地は１つ以上の血清サプリメントを含み得る。網膜誘導培地はN2サプリメントを含み得る。N2サプリメントは約０．１から５％または約０．１から２％または約１％（体積／体積またはｖ／ｖ）の濃度で存在し得る。
網膜誘導培地はB-27サプリメントを含み得る。B-27サプリメントは約０．０５〜２．０％または約０．２％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し得る。
網膜誘導培地は、非必須アミノ酸または最小必須培地（ＭＥＭ）非必須アミノ酸を含み得る。非必須アミノ酸またはＭＥＭ非必須アミノ酸はストックからの１×濃度で存在し得、ストックは典型的には１００×と考えられる。グリシンの終濃度（ストックの１×濃度で）は約０．１ｍＭであり、それゆえにストックは１０ｍＭグリシンである。ストックは典型的にはＬ−アラニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−プロリン、およびＬ−セリンをもまた包含する。
網膜誘導培地はインスリンを含み得る。インスリンはヒトであり得る。インスリンは約５〜５０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
網膜誘導培地はＢＭＰシグナル伝達阻害剤を含み得る。ＢＭＰシグナル伝達阻害剤はＮｏｇｇｉｎポリペプチド、ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ−１９３１８９、およびそのいずれかの組み合わせからなる群から選択され得る。
網膜誘導培地はＮｏｇｇｉｎポリペプチドを含み得る。Ｎｏｇｇｉｎポリペプチドは約５〜１００ｎｇ／ｍｌの間または約１０〜１００ｎｇ／ｍｌまたは約１０〜５００ｎｇ／ｍｌまたは約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。いくつかの態様において、Ｎｏｇｇｉｎポリペプチドは約１０〜５００ｎｇ／ｍｌで存在する。
網膜誘導培地は、全体的にまたは部分的に、フレッシュな網膜誘導培地と毎日取りかえられ得る。いくつかの場合には、細胞は２×１０４／ｃｍ２から６×１０４／ｃｍ２の範囲の密度で生育される。
網膜誘導培地の存在下における培養は約４〜６日間、または約４日間、約５日間、または約６日間起こり得る。
神経分化培地は、Neurobasal（商標）培地（Life Technologies）などの基本培地、またはNeurobasal（商標）培地の構成要素を含む基本培地を含み得る。
神経分化培地はＤ−グルコースを含み得る。Ｄ−グルコースは０〜１０ｍｇ／ｍｌの間、２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌ、３〜６ｍｇ／ｍｌ、４〜５ｍｇ／ｍｌ、または約４．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
神経分化培地は１つ以上の抗生物質を含み得る。抗生物質は、ペニシリンおよびストレプトマイシンいずれかまたは両方を、任意に０〜１００単位／ｍｌの間または約１００単位／ｍｌのペニシリンおよび任意に０〜１００μｇ／ｍｌの間または約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの濃度で包含し得る。
神経分化培地は１つ以上の血清サプリメントを含み得る。神経分化培地はN2サプリメントを含み得る。N2サプリメントは約０．１から５％または０．１からは２％または約１％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し得る。
神経分化培地はB-27サプリメント（Life Technologies）を含み得る。B-27サプリメントは約０．０５から５．０％、約０．５から２．０％、または約２％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し得る。
神経分化培地は非必須アミノ酸もしくはＭＥＭ非必須アミノ酸またはグルタミンもしくはGlutaMAX（商標）を含み得る。非必須アミノ酸またはＭＥＭ非必須アミノ酸はストックの約１×濃度で存在し得、ストックは約２００ｍＭである（１００×と考えられる）。GlutaMAX（商標）は２ｍＭまたはストックの１×希釈で存在し得る（２００ｍＭである１００×ストック溶液を用いる）。
神経分化培地はＢＭＰシグナル伝達阻害剤を含み得る。ＢＭＰシグナル伝達阻害剤は、Ｎｏｇｇｉｎポリペプチド、ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ−１９３１８９、およびそのいずれかの組み合わせからなる群から選択され得る。
神経分化培養培地はＮｏｇｇｉｎポリペプチドを含み得る。Ｎｏｇｇｉｎポリペプチドは約１０から１０００ｎｇ／ｍｌの間、または約１０から５００ｎｇ／ｍｌ、または１０から１００ｎｇ／ｍｌ、または約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
神経分化培地の存在下における培養は約８〜１２日間、または約９〜１０日間、または約９日間起こり得る。神経分化培地は、全体的にまたは部分的に、毎日、または２日毎、または３日毎に交換され得る。
神経節細胞培地は、Neurobasal（商標）培地（Life Technologies）などの基本培地、またはNeurobasal（商標）培地の構成要素を含む培地を含み得る。
神経節細胞培地はＤ−グルコースを含み得る。神経分化培地はＤ−グルコースを含み得る。Ｄ−グルコースは０〜１０ｍｇ／ｍｌ、２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌ、３〜６ｍｇ／ｍｌ、４〜５ｍｇ／ｍｌ、または約４．５ｍｇ／ｍｌの間の濃度で存在し得る。
神経節細胞培地は１つ以上の抗生物質を含み得る。抗生物質は、ペニシリンおよびストレプトマイシンいずれかまたは両方を、任意に０〜１００単位／ｍｌの間または約１００単位／ｍｌのペニシリンおよび任意に０〜１００μｇ／ｍｌの間または約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの濃度で包含し得る。
神経節細胞培地は１つ以上の血清サプリメントを含み得る。神経節細胞培地はN2サプリメントを含み得る。N2サプリメントは約０．１から５％または０．１から２％または約１％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し得る。
神経節細胞培地はB-27サプリメント（調合番号０８００８５−ＳＡ）（Life Technologies）を含み得る。B-27サプリメント（調合番号０８００８５−ＳＡ）は約０．０５から５．０％、約１．５から２．５％、または約２％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し得る。
神経節細胞培地はGlutaMAX（商標）を含み得る。GlutaMAX（商標）はストックの１×希釈で存在し得る（２００ｍＭである１００×ストック溶液を用いる）。
神経節細胞培地はフォルスコリン、ＢＤＮＦ、およびＣＮＴＦの１つ、２つ、または全てを含み得る。フォルスコリンは１〜２０μＭまたは１〜１０μＭまたは約５μＭの濃度で存在し得る。ＢＤＮＦは１〜２００ｎｇ／ｍｌまたは５〜５０ｎｇ／ｍｌまたは５〜２５ｎｇ／ｍｌまたは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。ＣＮＴＦは１〜２００ｎｇ／ｍｌまたは５〜５０ｎｇ／ｍｌまたは５〜２５ｎｇ／ｍｌまたは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。ＢＤＮＦはヒトＢＤＮＦであり得る。ＣＴＮＦはヒトＣＴＮＦであり得る。
神経節細胞培地の存在下における培養は約４０〜５０日間または約４５日間起こり得る。神経節細胞培地は、全体的にまたは部分的に、毎日、または２日毎、または３日毎、またはより頻繁でなく交換され得る。
方法によって生じたＲＧ前駆体細胞は培養物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％を含み得、任意に、かかる培養物は１週間、２週間、または２週間超増殖培養され得る（３週間、４週間、またはより長くを包含する）。
ＲＧ前駆体細胞はマーカーＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｉｓｌ１、ニューロフィラメント、およびＴｈｙ１の１つ以上を発現し得、それゆえに、Ｍａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、Ｉｓｌ１（＋）、ニューロフィラメント（＋）、および／またはＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体細胞はマーカーＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、およびＩｓｌ１の１つ以上を発現し得、それゆえに、Ｍａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、および／またはＩｓｌ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体細胞はマーカーＢｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、およびＴｈｙ１の１つ以上を発現し得、それゆえに、Ｂｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、および／またはＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体はＰａｘ６および／またはＲｘ１を発現し得ず、それゆえに、Ｐａｘ６（−）および／またはＲｘ１（−）としてキャラクタリゼーションされ得る。ある種のＲＧ前駆体細胞はＭａｔｈ５および／またはＢｒｎ３ｂを発現し得ず、それゆえに、Ｍａｔｈ５（−）および／またはＢｒｎ３ｂ（−）としてキャラクタリゼーションされ得る。
ＲＧ前駆体細胞は、Ｍａｔｈ５（＋）、またはＭａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、またはＭａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、またはＭａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、Ｉｓｌ１（＋）、またはＢｒｎ３ａ（＋）、またはニューロフィラメント（＋）、またはＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、またはＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、Ｔｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体はＰａｘ６および／またはＲｘ１を発現し得ず、それゆえに、Ｐａｘ６（−）および／またはＲｘ１（−）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体細胞はＴｕｊ１（＋）であり得る。ＲＧ前駆体細胞は増殖性であり得る。
ＲＧ前駆体細胞は極低温保存され得る。ＲＧ前駆体細胞はヒトであり得る。
方法は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）分化培地の存在下における爾後の培養ステップをさらに含み得る。これは中間の極低温保存ステップなしに起こり得るか、またはＲＧ前駆体細胞の極低温保存および解凍の後に起こり得る。
ＲＧＣ分化培地は、基本培地、例えばNeurobasal（商標）培地（Life Technologies）、またはNeurobasal（商標）培地の構成要素を含む培地を含み得る。
ＲＧＣ分化培地はＤ−グルコースを含み得る。神経分化培地はＤ−グルコースを含み得る。Ｄ−グルコースは０〜１０ｍｇ／ｍｌの間、２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌ、３〜６ｍｇ／ｍｌ、４〜５ｍｇ／ｍｌ、または約４．５ｍｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
ＲＧＣ分化培地は１つ以上の抗生物質を含み得る。抗生物質は、ペニシリンおよびストレプトマイシンいずれかまたは両方を、任意に０〜１００単位／ｍｌの間または約１００単位／ｍｌのペニシリンおよび任意に０〜１００μｇ／ｍｌの間または約１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの濃度で包含し得る。
ＲＧＣ分化培地は１つ以上の血清サプリメントを含み得る。ＲＧＣ分化培地はB-27サプリメント（調合０８００８５−ＳＡ）を含み得る。B-27サプリメントは約０．０５から５．０％、約１．５から２．５％、または約２％（ｖ／ｖ）の濃度で存在し得る。
ＲＧＣ分化培地はGlutaMAX（商標）を含み得る。GlutaMAX（商標）はストックの１×希釈で存在し得る。
ＲＧＣ分化培地はレチノイン酸を含み得る。レチノイン酸は約０．５〜２０μＭ、約０．５〜１０μＭ、約１〜５μＭ、または約２μＭの濃度で存在し得る。
ＲＧＣ分化培地は、フォルスコリン、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ｃＡＭＰ、およびＤＡＰＴの全てを包含する１つ以上を含み得る。ＲＧＣ分化培地はＢＤＮＦおよびＣＮＴＦの１つまたは両方を含み得る。ＲＧＣ分化培地は、フォルスコリン、ｃＡＭＰ、およびＤＡＰＴ、または他のＮｏｔｃｈ経路阻害剤もしくはＮｏｔｃｈ阻害剤（例えば、Ｎｏｔｃｈブロック抗体または抗体断片、Ｎｏｔｃｈの負の制御領域の抗体または抗体断片、アルファ−セクレターゼ阻害剤、ガンマ−セクレターゼ阻害剤、ステープルドペプチド、低分子ブロッカー、ならびにｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、およびｍｉＲＮＡ）の全てを包含する１つ以上を含み得る。フォルスコリンは１〜２０μＭまたは１〜１０μＭまたは約５μＭの濃度で存在し得る。ＢＤＮＦは１〜２００ｎｇ／ｍｌまたは５〜５０ｎｇ／ｍｌまたは５〜２５ｎｇ／ｍｌまたは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。ＣＮＴＦは１〜２００ｎｇ／ｍｌまたは５〜５０ｎｇ／ｍｌまたは５〜２５ｎｇ／ｍｌまたは約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。ＢＤＮＦはヒトＢＤＮＦであり得る。ＣＴＮＦはヒトＣＴＮＦであり得る。ｃＡＭＰは１〜５００ｎｇ／ｍｌまたは１０〜２５０ｎｇ／ｍｌまたは５〜１５０ｎｇ／ｍｌまたは約１００ｎｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。ＤＡＰＴは１〜１００μＭまたは１〜５０μＭまたは１〜２０μＭ、または約１０μＭの濃度で存在し得る。
ＲＧＣ分化培地はインスリンを含み得る。インスリンはヒトであり得る。インスリンは約５〜５０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌの濃度で存在し得る。
ＲＧＣ分化培地の存在下における培養は、約１〜４週間または約２〜４週間または約２〜３週間または約２週間起こり得る。ＲＧＣ分化培地は、全体的にまたは部分的に、毎日、または２日毎、または３日毎、またはより頻繁でなく交換され得る。
方法によって生じたＲＧ細胞は培養物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％を含み得、任意に、かかる培養物は１週間、２週間、または２週間超増殖培養され得る（３週間、４週間、またはより長くを包含する）。
ＲＧ細胞はマーカーＢｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、Ｔｕｊ１、およびＴｈｙ１の１つ以上を発現し得、それゆえに、Ｂｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、Ｔｕｊ１（＋）、および／またはＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ細胞は、Ｂｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）として、またはＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、Ｔｈｙ１（＋）として、またはＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、Ｔｈｙ１（＋）として、またはＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、Ｔｕｊ１（＋）として、またはＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、Ｔｕｊ１（＋）、Ｔｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ細胞は分裂終了であり得、ＲＧ前駆体細胞よりも多数の、長い、および／または複雑な樹状突起を含み得る。
ＲＧ細胞は極低温保存され得る。ＲＧ細胞はヒトであり得る。
別の側面において、本開示はＲＧ前駆体細胞を生ずる方法を提供し、眼領域前駆体細胞を神経節細胞培地によって培養することを含む。
眼領域前駆体細胞は細胞の集団として提供され得、その少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％が眼領域前駆体細胞である。眼領域前駆体細胞は、Ｐａｘ６（＋）およびＲｘ１（＋）、ならびに任意にＳｉｘ３（＋）、Ｓｉｘ６（＋）、Ｌｈｘ２（＋）、および／またはＴｂｘ３（＋）でもまたあり得る。眼領域前駆体細胞はＳｏｘ２（＋）でもまたあり得る。眼領域前駆体細胞はネスチン（＋）であり得る。眼領域前駆体細胞はＯｔｘ２（＋）でもまたあり得る。
眼領域前駆体は多能性幹細胞のインビトロ分化によって得られる。いくつかの態様において、多能性幹細胞はＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり得る。多能性幹細胞はフィーダーフリーおよび／またはゼノフリー条件下で培養され得る。
眼領域前駆体細胞の培養は約５〜４５日間または約５〜２０日間または約３５〜４５日間起こり得る。神経節細胞培地および神経節細胞培地の培養パラメータは上に記載されている通りであり得る。
方法によって生じたＲＧ前駆体細胞は培養物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％を含み得、任意に、かかる培養物（かかる％のＲＧ前駆体細胞を含む）は１週間、２週間、または２週間超増殖培養され得る（３週間、４週間、またはより長くを包含する）。
ＲＧ前駆体細胞の表現型は上に記載されている通りである。それゆえに、例として、ＲＧ前駆体細胞はマーカーＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｉｓｌ１、ニューロフィラメント、およびＴｈｙ１の１つ以上を発現し得、それゆえに、Ｍａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、Ｉｓｌ１（＋）、ニューロフィラメント（＋）、および／またはＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体細胞はマーカーＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、およびＩｓｌ１の１つ以上を発現し得、それゆえに、Ｍａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、および／またはＩｓｌ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体細胞はマーカーＢｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、およびＴｈｙ１の１つ以上を発現し得、それゆえに、Ｂｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、および／またはＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体はＰａｘ６またはＲｘ１を発現し得ず、それゆえに、Ｐａｘ６（−）および／またはＲｘ１（−）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体細胞は増殖性であり得る。他の表現型は上に記載されている。
ＲＧ前駆体細胞は極低温保存され得る。ＲＧ前駆体細胞はヒトであり得る。
別の側面において、本開示はＲＧ細胞を生ずる方法を提供し、眼領域前駆体細胞を神経節細胞培地および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）分化培地によって順次培養することを含む。
眼領域前駆体細胞は細胞の集団として提供され得、その少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％が眼領域前駆体細胞である。眼領域前駆体細胞はＰａｘ６（＋）およびＲｘ１（＋）、ならびに任意にＳｉｘ３（＋）、Ｓｉｘ６（＋）、Ｌｈｘ２（＋）、および／またはＴｂｘ３（＋）でもまたあり得る。眼領域前駆体細胞はＳｏｘ２（＋）でもまたあり得る。眼領域前駆体細胞はネスチン（＋）であり得る。眼領域前駆体細胞はＯｔｘ２（＋）でもまたあり得る。
眼領域前駆体は多能性幹細胞のインビトロ分化によって得られる。いくつかの態様において、多能性幹細胞はＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり得る。多能性幹細胞はフィーダーフリーおよび／またはゼノフリー条件下で培養され得る。
神経節細胞培地および神経節細胞培地の培養パラメータは上に記載されている通りであり得る。ＲＧＣ分化培地およびＲＧＣ分化培地の培養パラメータは上に記載されている通りであり得る。
方法によって生じたＲＧ細胞は培養物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％を含み得、任意に、かかる培養物（かかる％のＲＧ細胞を含む）は１週間、２週間、または２週間超増殖培養され得る（３週間、４週間、またはより長くを包含する）。
ＲＧ細胞の表現型は上に記載されている通りである。それゆえに、例として、ＲＧ細胞はマーカーＢｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、Ｔｕｊ１、およびＴｈｙ１の１つ以上を発現し得、それゆえに、Ｂｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、Ｔｕｊ１（＋）、および／またはＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ細胞は分裂終了であり得る。ＲＧ細胞はＲＧ前駆体細胞よりも複雑な樹状突起、長い樹状突起、および／または多くの樹状突起を有し得る。他の表現型は上に記載されている。
ＲＧ細胞は極低温保存され得る。ＲＧ細胞はヒトであり得る。
別の側面において、本開示はＲＧ細胞を生ずる方法を提供し、ＲＧ前駆体細胞を網膜神経節細胞（ＲＧＣ）分化培地によって培養することを含む。
ＲＧ前駆体細胞は細胞の集団として提供され得、その少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％がＲＧ前駆体細胞である。ＲＧ前駆体細胞はマーカーＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｉｓｌ１、ニューロフィラメント、およびＴｈｙ１の１つ以上を発現し得、それゆえに、Ｍａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、Ｉｓｌ１（＋）、ニューロフィラメント（＋）、および／またはＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体細胞はマーカーＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、およびＩｓｌ１の１つ以上を発現し得、それゆえに、Ｍａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、および／またはＩｓｌ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体細胞はマーカーＢｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、およびＴｈｙ１の１つ以上を発現し得、それゆえに、Ｂｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、および／またはＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体はＰａｘ６またはＲｘ１を発現し得ず、それゆえに、Ｐａｘ６（−）および／またはＲｘ１（−）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体は多能性幹細胞のインビトロ分化によって得られる。いくつかの態様において、多能性幹細胞はＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞であり得る。多能性幹細胞はフィーダーフリーおよび／またはゼノフリー条件下で培養され得る。
ＲＧＣ分化培地およびＲＧＣ分化培地の培養パラメータは上に記載されている通りであり得る。
方法によって生じたＲＧ細胞は培養物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％を含み得、任意に、かかる培養物（かかる％のＲＧ細胞を含む）は１週間、２週間、または２週間超増殖培養され得る（３週間、４週間、またはより長くを包含する）。
ＲＧ細胞はマーカーＢｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、Ｔｕｊ１、およびＴｈｙ１の１つ以上を発現し得、Ｂｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、Ｔｕｊ１（＋）、およびＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。
ＲＧ細胞は極低温保存され得る。ＲＧ細胞はヒトであり得る。
別の側面において、本開示は、例えば先行するパラグラフに記載されている、本明細書に記載される方法を用いて生じたＲＧ前駆体細胞を含む組成物を提供する。
別の側面において、本開示は、任意にヒトであるＲＧ前駆体細胞を含む組成物を提供する。
ＲＧ前駆体細胞は組成物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％を含み得る。
ＲＧ前駆体細胞はマーカーＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、Ｉｓｌ１、ニューロフィラメント、およびＴｈｙ１の１つ以上を発現し得、それゆえに、Ｍａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、Ｉｓｌ１（＋）、ニューロフィラメント（＋）、および／またはＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体細胞はＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、およびＩｓｌ１を発現し得、それゆえに、Ｍａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、およびＩｓｌ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体細胞はＢｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、およびＴｈｙ１を発現し得、それゆえに、Ｂｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、およびＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。ＲＧ前駆体細胞の他の表現型は上に記載されている。
ＲＧ前駆体細胞は極低温保存され得る。ＲＧ前駆体細胞はヒトであり得る。
別の側面において、本開示はその必要がある個体の処置の方法を提供し、ＲＧ前駆体細胞を含む組成物（例えば、本明細書に記載される組成物、または本明細書に記載される方法を用いて生じた組成物）を前記の個体に投与することを含む。
組成物は眼、硝子体、網膜下腔に、または静脈内投与され得る。ＲＧ前駆体細胞はヒトであり得る。
別の側面において、本開示は、本明細書に、例えば先行するパラグラフに記載される方法に従って生じたＲＧ細胞を含む組成物を提供する。
方法によって生じたＲＧ細胞は組成物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％を含み得、任意に、かかる組成物（かかる％のＲＧ細胞を含む）は培養物中で１週間、２週間、または２週間超増殖培養され得る（３週間、４週間、またはより長くを包含する）。
ＲＧ細胞はマーカーＢｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、Ｔｕｊ１、およびＴｈｙ１の１つ以上を発現し得、それゆえに、Ｂｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、Ｔｕｊ１（＋）、および／またはＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされ得る。
ＲＧ細胞は極低温保存され得る。ＲＧ細胞はヒトであり得る。
別の側面において、本開示はその必要がある個体の処置の方法を提供し、ＲＧ細胞を含む組成物、例えば本明細書に、例えば先行するパラグラフに記載される組成物または本明細書に、例えば先行するパラグラフに記載される方法によって生じた組成物を、前記の個体に投与することを含む。
組成物は眼、硝子体、網膜下腔に、または静脈内投与され得る。
別の態様において、本発明は、マウス線維芽細胞フィーダープラットフォーム上で生育していない細胞を起源とするヒト起源のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞、好ましくは非ドナー由来ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の、実質的に純粋な調製物を対象とする。例えば、調製物は８５％〜９５％純粋であり得る。ある態様において、本発明は、マウス線維芽細胞フィーダープラットフォームに由来する細胞の必要を省いたヒト起源のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の実質的に純粋な調製物を調製する方法を対象とする。フィーダー系を本発明の方法と取りかえることは、例えば７５％から１００％または８５％から９５％のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞のより高い均質性を生ずる。フィーダーフリー幹細胞の分化は外因性の誘導因子の導入の不在下でもまた起こり得、これは従来技術からの実質的な改善である。しかしながら、分化に必須ではないものの、Ｎｏｇｇｉｎポリペプチドの任意の追加は幹細胞の分化を加速させ得る。
別の態様において、分化方法はフィーダーフリーおよびゼノフリーである。それゆえに、いくつかの態様においては、ヒト細胞は非ヒト種に由来するいずれかの培地構成要素の不在下で培養される。
図１ＡおよびＢ．ヒトＥＳ細胞のインビトロ分化の間の遺伝子発現。（図１Ａ）インビトロ細胞分化の第９日、第１１日、および第１３日における眼領域前駆体マーカーＰａｘ６およびＲｘ１のフローサイトメトリー分析。図１Ｂ．ＥＳ細胞（各ペアの第１のバー）および眼領域前駆体（各ペアの第２のバー）のＥＳ細胞多能性マーカーの定量ＲＴ−ＰＣＲ分析。 図２ＡおよびＢ．フローサイトメトリー分析は、Ｐａｘ６およびＲｘ１（図２Ａ）、ならびにＯｔｘ２、Ｓｏｘ２、およびネスチン（図２Ｂ）の発現を示した。 図３ＡおよびＢ．網膜神経節細胞（ＲＧＣ）分化に必須である転写因子の発現。（図３Ａ）培養の第３５日のＥＳ細胞（各バーペアの第１のバー）および網膜神経節細胞（ＲＧＣ）前駆体（各バーペアの第２のバー）によるＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、およびＩｓｌ−１の発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。（図３Ｂ）免疫染色およびフローサイトメトリーによるＭａｔｈ５、Ｐａｘ６、およびＢｒｎ３ａの発現の定量。 図４．ＥＳ細胞（各三つ組の第１のバー）、初期網膜神経節細胞（ＲＧＣ）前駆体（各三つ組の第２または真中のバー）、および後期網膜神経節細胞（ＲＧＣ）前駆体（各三つ組の第３または最後のバー）のＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、およびＢｒｎ３ｂの発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析。 図５．ＥＳ細胞由来成熟網膜神経節細胞（ＲＧＣ）のＴｈｙ１の発現。左パネル、Ｔｈｙ１の免疫染色。右パネル、フローサイトメトリーによるＴｈｙ１の発現の定量。
図６ＡおよびＢ．分化ヒトＥＳ細胞由来網膜神経節細胞。（図６Ａ）ＥＳ細胞由来網膜神経節細胞の形態。（図６Ｂ）細胞はＢｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、およびＴｕｊ１を発現した。 図７．レーザー光凝固を包含する緑内障ラットモデルの動物研究の概略図。眼のマイクロビーズ注射を包含する別の動物緑内障モデルが下に記載されている。 図８．コントロール（高ＩＯＰ＋ＰＢＳ）、細胞処置（高ＩＯＰ＋細胞）、および正常ラットにおける眼内圧（ＩＯＰ）上昇の５週間後の網膜神経節細胞（ＲＧＣ）の生存の定量。 図９．多能性幹細胞から網膜神経節前駆体細胞および網膜神経節細胞までの分化の時系列。 図１０．マイクロビーズ（ＭＢ）マウス緑内障モデルの眼内圧（ＩＯＰ）に及ぼすＲＧＣ前駆体の効果。ＭＢ処置は片眼注射からなった（２μｌの１５μｍマイクロビーズ、５×１０６／μ１）。反対側の眼は内部コントロールとして用いられた。細胞処置は硝子体注射による２μｌのＲＧＣＰ（３００，０００細胞）からなった。硝子体注射によって２μｌの媒体を受けたマウスをコントロールとして用いた。ＭＢが第０日に注射され、ＲＧＣＰまたは基剤注射が第７日に実施され、第２８または５６日に（４および８週間）マウスは屠殺された。ＲＧＣ、ＲＧＣおよび網膜の機能（ｐＳＴＲおよびＥＲＧ。Fortune et al. IVOS, 2004, 45: 1854-1862、Smith et al. Doc Ophthalmol, 2014, 128: 155-168)）、ならびに視覚挙動（視運動）を評価した。ＩＯＰの統計的有意差は実験群間で観察されず、移植されたＲＧＣＰがＩＯＰに影響せずにむしろ別のメカニズムによって働いているということを示した。
図１１．移植された網膜神経節細胞前駆体（ＲＧＣＰ）の同化。移植されたＲＧＣＰはＲＧＣマーカーＴｕｊ−１を発現し（左下）、ＭＢ処置マウスの網膜に同化し、さらなる分化によって、伸長した長い神経突起を形成した（視神経乳頭に向かう。下の中央）。 図１２．ホスト網膜神経節層への移植された網膜神経節細胞前駆体（ＲＧＣＰ）の同化。 図１３ＡおよびＢ．ＭＢ処置マウスのＲＧＣ喪失の定量。図１３Ａは、ＥＳＣ−ＲＧＣＰの移植が、ＲＧＣＰ注射（黒色のバー）の４（左）および８（右）週間後の緑内障マウスにおいてホストＲＧＣの生存を支持するということを示している。白色のバーはＰＢＳ注射を受けたマウスに相当する。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図１３Ｂは網膜神経節層がサンプリングされた箇所を示している。楕円はＲＧＣＰ移植のエリアに相当する。重要なことに、ホスト網膜神経節層は注射の部位から離れた箇所でサンプリングされ、なおＲＧＣ喪失の弱まりがＲＧＣＰ注射の結果として観察された。これは、傍分泌メカニズムが、移植された細胞が内因性の元来の網膜神経節層の生存を促進する能力に包含され得るということを示唆している。 図１４Ａ〜Ｄ．ＲＧＣＰの移植は緑内障マウスのｐＳＴＲ振幅を向上させる。ｐＳＴＲはＲＧＣ機能の尺度である。図１４Ａは、ｐＳＴＲ記録の代表的な波形を正常マウス（ＭＢなし）、シャム処置マウス（ＭＢおよび基剤が注射された）、およびＥＳＣ−ＲＧＣ処置マウス（ＭＢおよびＰＳＣ−ＲＧＣＰが注射された）について示している。図１４Ｂは、注射の４週間後の正常（正常）、ＲＧＣＰ移植（ＭＢ＋ＲＧＣＰ）、または基剤注射（ＭＢ＋基剤）緑内障マウスからのｐＳＴＲ振幅の定量を示している。ＰＢＳ注射を受けた緑内障の眼は正常のベースラインから有意に減縮したｐＳＴＲ振幅を示し、一方で、ＲＧＣＰ注射を受けたものはベースラインと比較してｐＳＴＲ振幅の有意な低減を示さなかった。図１４Ｃはこれらの３つの実験群（正常、ＭＢ＋基剤、およびＭＢ＋ＲＧＣＰ）の相対的なｐＳＴＲ振幅を示しており、シャム処置およびＲＧＣＰ処置マウスの間の相対的な振幅の差が有意であるということを示している。図１４ＤはＯＫＲによる視覚コントラスト感度の定量を示しており、注射の８週間後に、基剤注射した眼と比較してＲＧＣＰ移植された眼の有意に向上した視覚コントラスト感度を示している。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。ＮＳ：非有意な差。 視神経挫滅モデルの概略図。
１６Ａ〜Ｊ．視神経損傷したマウスにおけるＲＧＣＰ再定着、分化、およびシナプス形成。図１６Ａ〜Ｃは、視神経損傷の３週間後のマウスからとられたＴｕｊ１免疫標識した網膜フラットマウント中のグラフトされたＲＧＣＰ（ＧＦＰ＋）の落射蛍光写真である。図１６ＡはＧＦＰ染色を示しており、図１６ＢはＴｕｊ１染色を示しており、図１６ＣはＧＦＰおよびＴｕｊ１染色を示している。ほぼ全てのＧＦＰ＋細胞はＴｕｊ１について陽性に免疫標識されており、多くは長い神経突起を持っている。図１６Ｄ〜Ｅは、ｈＥＳＣ由来ＲＧＣＰ移植を受けたマウスのＴｕｊ１免疫標識された網膜フラットマウントを記録した３Ｄライトシート顕微鏡法の動画からとられた写真である。ＧＦＰ＋ＲＧＣＰ由来細胞はＲＧＣマーカー（Ｔｕｊ１）と共局在し（図１６Ｄ。ＤＡＰＩによって対比染色されている）、神経節細胞層（ＧＣＬ）に再定着した（図１６Ｅ）。ＩＮＬ：内顆粒層。図１６Ｆ〜Ｊは、網膜切片（図１６Ｆ、Ｈ〜Ｊ）またはフラットマウント（図１６Ｇ）からとられた代表的な落射蛍光共焦点写真であり、これらはポストシナプスマーカーのＰＳＤ９５（図１６Ｉ）および／またはプレシナプスマーカーのシナプトタグミン（Ｓｙｎｔ）（図１６Ｆ。ＧＦＰ、Ｓｙｎｔ、およびＤＡＰＩを染色された）によって免疫標識された。矢印は陽性の免疫標識を示す細胞のスポットエリアを指している。図１６Ｊのオーバーレイ写真は、ＧＦＰ＋細胞上へのプレおよびポストシナプスマーカーの共局在を明らかにしており、グラフトされた細胞による機能的なシナプスの形成を示唆している。 表１．ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Neurobasal（商標）培地（Life Technologies）、N2サプリメント、およびB27サプリメントの構成要素。
本発明は網膜神経節（ＲＧ）細胞およびＲＧ前駆体細胞を作製するための方法を提供する。それらの方法は、多能性幹細胞および眼領域（ＥＦ）前駆体を包含するより初期の前駆体からのインビトロ分化を包含する。本明細書において提供される方法は、出発材料として前述の前駆体（幹細胞を包含する）集団のいずれかを用い得る。
本発明は、ＲＧ細胞およびＲＧ前駆体細胞をインビトロで初代の眼領域（ＥＦ）前駆体（すなわち、対象から得られるＥＦ前駆体細胞）から作製することをさらに企図する。
インビボまたはインビトロの網膜神経発生はいくつもの発生ステージを経て起こり、そのそれぞれは表現型的に（例えば、マーカー発現プロファイルによって）および／または機能的に定められ得る。インビトロの多能性幹細胞はＥＦ前駆体に分化し、これは翻ってＲＧ前駆体細胞に分化し、これは初期ＲＧ前駆体細胞および後期ＲＧ前駆体細胞を含み得、これは翻って成熟ＲＧ細胞（本明細書においてはＲＧ細胞と言われる）に分化する。ＲＧ前駆体細胞のうち、初期ＲＧ前駆体細胞は後期ＲＧ前駆体細胞に分化し得る。後期ＲＧ前駆体細胞は成熟ＲＧ細胞に分化し得る。初期ＲＧ前駆体細胞は成熟ＲＧ細胞に直接分化し得る。本明細書において提供される方法はＲＧ細胞およびＲＧ前駆体細胞を効率的に作製する。
多能性幹細胞からＲＧ前駆体細胞およびＲＧ細胞への発生の全般的な発生経路が図９に概略図的に例示されている。発生の各ステージのマーカー発現プロファイルもまた示されている。
本明細書において用いられる前駆体細胞は、分裂性のままであり、より多くの前駆体細胞を生じ得るかまたは最終運命の細胞系譜に分化し得る細胞を言う。用語の前駆体（progenitor）および前駆体は（precursor）交換可能に用いられる。それらのステージのそれぞれの細胞は本明細書においてより詳細に論じられる。
本明細書において提供されるＲＧ前駆体およびＲＧ細胞は種々のインビボおよびインビトロの方法に用いられ得る。例えば、ＲＧ前駆体細胞は網膜の状態を処置するためにインビボで用いられ得、緑内障、例えば開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、正常眼圧緑内障、先天性緑内障、色素緑内障、続発緑内障、偽落屑緑内障、外傷性緑内障、血管新生緑内障、および虹彩角膜内皮症候群、ならびに視神経損傷、任意に自己免疫疾患、外傷、ウイルス感染、および虚血再灌流損傷、任意に卒中に随伴する虚血再灌流損傷に随伴する視神経損傷、糖尿病網膜症、または眼への血液供給を損なう他の状態を包含するが、これに限定されない。
本発明は、さらに、本明細書に記載される方法によって得られるＲＧ前駆体細胞およびＲＧ細胞を提供する。ＲＧ前駆体細胞およびＲＧ細胞は、多能性幹細胞またはそれらの分化した子孫、例えば眼領域前駆体細胞のインビトロ分化によって得られる。眼領域前駆体細胞そのものは多能性幹細胞のインビトロ分化から得られるか、またはそれらは対象から得られた初代の眼領域前駆体であり得る。
本発明は、初代のソースからは到達されたことがないかまたは到達不可能であるＲＧ前駆体細胞の集団およびＲＧ細胞の集団を提供する。これらの集団はそれらの細胞の内容が均質またはほぼ均質であり得る。例えば、かかる集団中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％がＲＧ前駆体細胞であり得る。別の例として、かかる集団中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％がＲＧ細胞であり得る。これらの集団中のこれらの細胞は単一のハプロタイプであり得る。例えば、それらはＨＬＡマッチングし得る。これらの集団中のこれらの細胞は遺伝子的に同一であり得る。本発明はさらにＨＬＡタイピングしたＲＧ前駆体細胞のバンクを提供する。かかる細胞は種々のヒト対象に用いられ得る。
加えて、本明細書において提供される方法は、さもなければ初代のソースからは可能でないであろう多数のＲＧ前駆体細胞およびＲＧ細胞を作製するために用いられ得る。例えば、方法は１０８個のＲＧ前駆体細胞または１０８個のＲＧ細胞を出発の１００万個の多能性細胞あたり生じ得る。
分化（非幹）細胞の型
眼領域前駆体細胞（ＥＦ前駆体細胞）。ＥＦ前駆体細胞は、最小限にはＰａｘ６（＋）およびＲｘ１（＋）の細胞として定められる。それらはＳｉｘ３（＋）、Ｓｉｘ６（＋）、Ｌｈｘ２（＋）、およびＴｂｘ３（＋）でもまたあり得る。これらのマーカーの全ては転写因子である。ＥＦ前駆体細胞はネスチン（＋）および／またはＳｏｘ２（＋）および／またはＯｔｘ２（＋）でもまたあり得る。ＥＦ前駆体細胞はＯｃｔ４およびＮａｎｏｇを発現しない（すなわちそれらはＯｃｔ４（−）およびＮａｎｏｇ（−）である）。ＥＦ前駆体細胞は多能性幹細胞のインビトロ分化によって形成され得る。かかる分化は網膜誘導（ＲＩ）培地の存在下で起こり得、ＮｏｇｇｉｎポリペプチドまたはＮｏｇｇｉｎ様化合物などの外因性の因子の存在または不在下で起こり得る。
網膜神経節（ＲＧ）前駆体細胞。本発明の分化方法は、ＲＧ発生が以前に可能であったよりもさらに解析されることを可能にし、それによって２つのＲＧ前駆体ステージを明らかにした。ＥＦ前駆体細胞から発生する第１のステージは初期ＲＧ前駆体細胞ステージである。これらの細胞は、Ｍａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、およびＩｓｌ１の１つ以上または全ての発現（すなわちＭａｔｈ５（＋）および／もしくはＢｒｎ３ａ（＋）および／もしくはＢｒｎ３ｂ（＋）および／もしくはＩｓｌ１（＋））ならびにＰａｘ６およびＲｘ１の発現なしまたは検出不可能な発現（すなわちＰａｘ６（−）およびＲｘ１（−））によって定められる。それらのＲＧ前駆体はＭａｔｈ５（＋）、またはＭａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、またはＭａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、またはＭａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、Ｉｓｌ１（＋）であり得る。それらの初期ＲＧ前駆体細胞はさらに後期ＲＧ前駆体細胞に分化する。それらの細胞は、Ｂｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、およびＴｈｙ１の１つ以上または全ての発現（すなわちＢｒｎ３ａ（＋）および／もしくはニューロフィラメント（＋）および／もしくはＴｈｙ１（＋））ならびにＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３ｂ、およびＩｓｌ１の発現なしまたは検出不可能な発現（すなわちＭａｔｈ５（−）、Ｂｒｎ３ｂ（−）、およびＩｓｌ１（−））によって定められる。それらのＲＧ前駆体はＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、およびＴｈｙ１（＋）であり得る。それらの後期ＲＧ前駆体細胞はそれからＲＧ細胞に分化する。例えばＲＧＣ分化培地によって培養されたときに、初期ＲＧ前駆体細胞はＲＧ細胞に直接分化もまたし得る。ＲＧ前駆体細胞は増殖性である。
網膜神経節（ＲＧ）細胞。ＲＧ細胞は、最小限にはニューロフィラメント、Ｔｕｊ１、Ｔｈｙ１、およびＢｒｎ３ａの１つ以上または全ての発現（すなわち、ニューロフィラメント（＋）および／またはＴｕｊ１（＋）および／またはＴｈｙ１（＋）および／またはＢｒｎ３ａ（＋））によって定められる。ＲＧ細胞はＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、Ｔｕｊ１（＋）、および任意にＴｈｙ１（＋）であり得る。ＲＧ細胞は分裂終了である。ＲＧ細胞はＲＧ前駆体細胞よりも多くの樹状突起、複雑な樹状突起、および長い樹状突起を有し得る。
培養方法
多能性幹細胞維持培養。多能性幹細胞はフィーダーフリー系によって任意にマトリックス上で維持、それゆえに増殖培養され得る。好適なマトリックスは、ラミニン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、コラーゲン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、ヘパラン硫酸、マトリゲル（商標）（Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウス肉腫細胞からの可溶性調製物）、CellStart（ヒト基底膜抽出物）、またはそのいずれかの組み合わせを含むかまたはそれからなるものを包含するが、これに限定されない。いくつかの態様において、マトリックスはマトリゲル（商標）を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。マトリゲル（商標）はBD Biosciencesなどの市販のソースから利用可能である。組換えヒトラミニンを包含するラミニンはマトリゲル（商標）の代替として用いられ得る。
例示的な方法において、多能性幹細胞はそれらの未分化状態においてフィーダーフリー条件下でマトリゲル（商標）またはラミニン上で維持される。細胞は典型的には約８０〜９０％コンフルエンシー時に継代または凍結される。継代は酵素的（例えばディスパーゼ）または非酵素的（例えば、ＰＢＳ系解離緩衝液、Invitrogen）手段を用いて実施され得る。いくつかの態様において、多能性幹細胞はゼノフリー条件下で培養され得、いくつかの場合には、N2血清サプリメントなどだがこれに限定されない血清サプリメントの存在下における培養を包含し得る。
多能性幹細胞分化培養。多能性幹細胞は直接分化させられ得、ＲＧ細胞またはＲＧ前駆体細胞へのそれらの分化が、例えば胚様体（ＥＢ）では起こり得る非神経節細胞系譜への分化を包含しないということを意図する。それゆえに、本明細書において提供される方法はＥＢ形成を要求せず、好ましくはそれを回避する。これは従来技術の方法からの改善である。
ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞は、ニューロスフィアの形成を包含する懸濁培養によって、またはマトリゲル（商標）もしくはラミニンなどだがこれに限定されないマトリックスに接着して作製され得る。
次は、多能性幹細胞をＲＧ前駆体細胞およびＲＧ細胞に分化させるための例示的なプロセスである。
多能性幹細胞は、多能性幹細胞を網膜誘導（ＲＩ）培地および神経分化（ＮＤ）培地によって培養することによって先ずＥＦ前駆体細胞に分化させられる。
ＲＩ培地が、約１５〜２０％コンフルエンシーである多能性幹細胞に第０日に追加される。ＲＩ培地は、基本培地、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥＭ／Ｆ１２の構成要素を含む培地、Ｄ−グルコース、ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質、N2サプリメントおよびB27サプリメントなどの１つ以上の血清サプリメント、非必須アミノ酸、インスリン、および任意にＮｏｇｇｉｎポリペプチドまたはＮｏｇｇｉｎ様因子などの外因性の分化因子を、下に記載されるように含む。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２、N2サプリメント、およびB27サプリメントの構成要素は表１に提供されている。
ＲＩ培地による培養は約５日間起こり得る。完全な培地交換が第１〜４日に実施される。
約４日後に（例えば、第４、５、または６日またはそのあたりに）、培地は神経分化（ＮＤ）培地に交換される。ＮＤ培地は、基本培地、例えばNeurobasal（商標）培地（Life Technologies）またはNeurobasal（商標）培地の構成要素を含む培地、Ｄ−グルコース、ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質、GlutaMAX（商標）、N2サプリメントおよびB27サプリメントなどの１つ以上の血清サプリメント、非必須アミノ酸、ならびに任意にＮｏｇｇｉｎポリペプチドまたはＮｏｇｇｉｎ様因子などの外因性の分化因子を、下に記載されるように含む。
Neurobasal（商標）培地（Life Technologies）の構成要素は表１に提供されている。
GlutaMAX（商標）はＬ−アラニル−Ｌ−グルタミンであり、これはＬ−グルタミンの安定化された形態である。これは培養物中においてより少ない分解を経験し、それによって、長期培養物に起こり得るアンモニア蓄積を低減する。
細胞はさらに約８日間（第６〜１３日）ＮＤ培地によって培養される。培地は定期的に交換される（例えば、約２日毎）。この培養期間の間に、細胞はコロニーとして生育し、辺縁の細胞はフラットで大きくなり、一方で、より中央に位置した細胞はより小さく、コンパクトな細胞クラスターを形成する。
約第１０〜１１日に細胞はＰａｘ６を発現し始め、次に第１２日にＲｘ１発現の開始がある（図１Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲ分析はＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ発現の喪失を示した（図１Ｂ）。第１３日に、フローサイトメトリーによって定量すると９０％超の細胞がＰａｘ６およびＲｘ１を共発現し（図２Ａ）、細胞の９９％超がネスチン、Ｏｔｘ２、およびＳｏｘ２を発現する（図２Ｂ）。これらの結果は多能性幹細胞がＥＦ前駆体細胞に分化したということを示している。
約第１４日に（例えば、第１１、１２、１３、１４、または１５日またはそのあたりに）、培地は神経節細胞（ＧＣ）培地に交換される。ＧＣ培地は、基本培地、例えばNeurobasal（商標）培地（Life Technologies）またはNeurobasal（商標）培地の構成要素を含む培地、Ｄ−グルコース、ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの１つ以上の抗生物質、GlutaMAX（商標）、N2サプリメントおよびB27サプリメント（調合０８００８５−ＳＡ）などの１つ以上の血清サプリメント、ならびにフォルスコリン、ＢＤＮＦ、およびＣＮＴＦの全てを包含する１つ以上を含む。細胞はＧＣ培地によって約第２０日まで培養されることを継続する。
約第２０日に、細胞はセルスクレーパーを用いて生育表面から取られ、ＧＣ培地中で機械的にクラスターに破砕される。細胞クラスターは１００ｍｍ超低接着培養皿に移入される。細胞クラスターは丸まり、この懸濁培養物中に個体のスフィアを形成する。ＧＣ培地は３日毎に交換される。約第３５日に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、およびＩｓｌ１の発現の強い上方制御を示した（図３Ａ）。フローサイトメトリーは、＞９９％の細胞が転写因子Ｍａｔｈ５およびＢｒｎ３ａを発現したということを示した。約９４％のＭａｔｈ５（＋）細胞はＰａｘ６について陰性に染色した（図３Ｂ）。これらの結果は初期ＲＧ前駆体細胞の存在を示している。
約第３６〜６０日の間に、神経スフィアはＧＣ培地によって培養され、約３〜４日毎の培地交換がある。
約第６０日に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはＢｒｎ３ａの継続した発現を示した。Ｍａｔｈ５およびＢｒｎ３ｂの発現レベルは非常に下方制御されていた（図４）。フローサイトメトリーは、細胞の９５．３％がＢｒｎ３ａおよびニューロフィラメントを共発現したということを示した（データは示さない）。これらの結果は後期ＲＧ前駆体細胞の存在を示している。
ＲＧ細胞を形成するためのＲＧ前駆体細胞の分化．ＲＧ前駆体細胞はAccutase（登録商標）細胞剥離溶液を用いて単細胞に解離させられる。細胞は網膜神経節細胞（ＲＧＣ）分化培地によって約１０〜４０／ｃｍ２の密度でポリ−Ｄ−リジン／ラミニンコーティングプレート上にプレーティングされる。ＲＣＧ分化培地は、基本培地、例えばNeurobasal（商標）培地（Life Technologies）またはNeurobasal（商標）培地の構成要素を含む培地、Ｄ−グルコース、ペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質、GlutaMAX（商標）、B27サプリメント（調合０８００８５−ＳＡ）などの１つ以上の血清サプリメント、インスリン、ＢＤＮＦおよびＣＮＴＦの１つまたは両方、ならびにフォルスコリン、ｃＡＭＰ、およびＤＡＰＴ、または他のＮｏｔｃｈ阻害剤の全てを包含する１つ以上を含む。Neurobasal（商標）培地の構成要素は表１に提供されている。培地は約２日毎に交換された。
２週間後に、細胞の約７２％はＴｈｙ１について陽性に染色した（図５）。細胞は樹状突起および軸索を有した（図６Ａ）。免疫染色はＢｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、およびＴｕｊ１の発現を示した（図６Ｂ）。これらの結果はＲＧ細胞の存在を示している。
ＲＧ前駆体およびＲＧ細胞の極低温保存．初期ＲＧ前駆体細胞、後期ＲＧ前駆体細胞およびＲＧ細胞は、Cryostor CS10などのアニマルフリーの極低温保存緩衝液中でニューロスフィアとして凍結／極低温保存され得る。
細胞培養培地
本発明の態様において、細胞は種々の細胞培養培地によって保存、増殖、または分化する。それらの培地は下により詳細に記載される。
網膜誘導（ＲＩ）培地。網膜誘導（ＲＩ）培地は多能性幹細胞をＥＦ前駆体細胞に分化させるために用いられる。網膜誘導（ＲＩ）培地は、基本培地、例えばＤＭＥＭ／Ｆ１２またはＤＭＥＭ／Ｆ１２の構成要素（表１に示されている）を含む培地、Ｄ−グルコース（任意に０〜１０ｍｇ／ｍｌの間、２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌ、３〜６ｍｇ／ｍｌ、４〜５ｍｇ／ｍｌ、または約４．５ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（任意に０〜１００単位／ｍｌの間または約１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（任意に０〜１００μｇ／ｍｌの間または約１００μｇ／ｍｌ）などの１つ以上の抗生物質、N2サプリメント（任意に約０．１から５％または約０．１から２％または約１％で（ｖ／ｖ）およびB27サプリメント（任意に約０．０５〜２．０％または約０．２％（ｖ／ｖ）などの１つ以上の血清サプリメント、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（任意に、ストックから作られる約１×濃度、およそ０．１ｍＭグリシン）、ならびに任意にインスリン（任意に５〜５０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌ）を含む。ＲＩ培地はＮｏｇｇｉｎポリペプチドを約５〜１００ｎｇ／ｍｌの間または約１０〜１００ｎｇ／ｍｌまたは約１０〜５００ｎｇ／ｍｌまたは約５０ｎｇ／ｍｌの濃度で含み得る。網膜誘導培地はＢＭＰシグナル伝達阻害剤を含み得、任意にＮｏｇｇｉｎポリペプチド、ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、ＬＤＮ−１９３１８９、およびそのいずれかの組み合わせからなる群から選択される。ＲＩ培地はインスリン、Ｎｏｇｇｉｎポリペプチド、またはインスリンおよびＮｏｇｇｉｎポリペプチドを包含し得る。
Ｎｏｇｇｉｎポリペプチドは必要でないが、Ｎｏｇｇｉｎポリペプチドが存在するときにはＥＦ前駆体細胞への増大した分化（ＥＦ転写因子の増大した発現によって示される）が観察される。Ｎｏｇｇｉｎポリペプチドは同様の活性を有する他の部分によって置換され得、ＳＢ４３１５４２を包含するがこれに限定されない。
Ｎｏｇｇｉｎポリペプチドは分泌性のＢＭＰ阻害剤であり、これは報告によればＢＭＰ２、ＢＭＰ４、およびＢＭＰ７に高い親和性で結合してＴＧＦβファミリーの活性をブロックする。ＳＢ４３１５４２は、報告によれば、ＡＣＴＲＩＢ、ＴＧＦβＲ１、およびＡＣＴＲＩＣ受容体のリン酸化をブロックすることによってＴＧＦβ／アクチビン／Ｎｏｄａｌを阻害する低分子である。ＳＢ４３１５４２は、アクチビンおよびＮａｎｏｇによって媒介される多能性ネットワークを不安定化し、内因性のアクチビンおよびＢＭＰシグナルをブロックすることによって、ＢＭＰによって誘導される栄養膜、中胚葉、および内肺葉細胞運命を抑制すると考えられている。
前述の活性の１つ以上を有する薬剤は、例えば開示される方法の文脈で用いられると、ＮｏｇｇｉｎポリペプチドおよびＳＢ４３１５４２の１つまたは両方の機能を代替または増強し得るということが予想される。例えば、Ｎｏｇｇｉｎポリペプチドおよび／または低分子ＳＢ４３１２５４２は、次の３つの標的エリアのいずれかまたは全てに影響する１つ以上の阻害剤によって代替または増強され得る。１）受容体へのリガンドの結合を防止すること、２）受容体の活性化をブロックすること（例えばｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）、および３）ＳＭＡＤ細胞内蛋白質／転写因子の阻害。例示的な潜在的に好適な因子は、天然の分泌性のＢＭＰ阻害剤Ｃｈｏｒｄｉｎ（これはＢＭＰ４をブロックする）およびＦｏｌｌｉｓｔａｔｉｎ（これはアクチビンをブロックする）、ならびにそのアナログまたはミメティックを包含する。Ｎｏｇｇｉｎポリペプチドの効果をミミックし得る追加の例示的な因子は、ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、および／またはＢＭＰ７を隔離するであろうドミナントネガティブ受容体またはブロック抗体の使用を包含する。加えて、受容体リン酸化をブロックすることに関して、ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ（または化合物Ｃ）は幹細胞に及ぼす同様の効果を有すると報告されている。ＳＭＡＤ蛋白質の阻害は、ＳＩＳ３（６，７−ジメトキシ−２−（（２Ｅ）−３−（１−メチル−２−フェニル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−３−イル−プロプ−２−エノイル））−１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、Ｓｍａｄ３特異的阻害剤、ＳＩＳ３）などの可溶性の阻害剤、阻害剤ＳＭＡＤ（例えば、ＳＭＡＤ６、ＳＭＡＤ７、ＳＭＡＤ１０）の１つ以上の過剰発現、または受容体ＳＭＡＤ（ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、ＳＭＡＤ８／９）の１つのＲＮＡｉを用いてもまた達成され得る。神経前駆体を作製することに好適であると予想される因子の別の組み合わせは、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、ＧＳＫ３阻害剤（ＣＨＩＲ９９０２１）、化合物Ｅ（γセクレターゼ阻害剤ＸＸＩ）、およびＴＧＦβ阻害剤ＳＢ４３１５４２のカクテルを含み、これは神経堤幹細胞を作製することに有効であることが以前に示されている（Li et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 May 17; 108(20):8299-304）。追加の例示的な因子は、ＳＢ４３１５４２の誘導体、例えば１つ以上の追加されるかまたは異なる置換基、アナログ的な官能基などを包含し、且つ１つ以上のＳＭＡＤ蛋白質に及ぼす同様の阻害効果を有する分子を包含し得る。好適な因子または因子の組み合わせは、例えば、多能性細胞を前記の因子（単数または複数）と接触させることと、ＥＦ前駆体細胞表現型の採択、例えば特徴的な遺伝子発現（本明細書に記載されるマーカーの発現、ＥＦ前駆体細胞プロモーターに連結されたレポーター遺伝子の発現、または同類を包含する）、または網膜神経前駆体細胞、ＲＧ前駆体細胞、もしくはＲＧ細胞などの本明細書において開示される細胞型を形成する能力をモニターすることとによって同定され得る。
好ましくは、細胞は、神経分化培地による培養に先立って網膜誘導培地によって処置または培養される。
神経分化（ＮＤ）培地。神経分化（ＮＤ）培地は多能性幹細胞を眼領域（ＥＦ）前駆体細胞に分化させるために用いられる。ＮＤ培地は、基本培地、例えばNeurobasal（商標）培地（Life Technologies）または表１に提供されているNeurobasal（商標）培地の構成要素を含む培地、Ｄ−グルコース（任意に０〜１０ｍｇ／ｍｌの間、２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌ、３〜６ｍｇ／ｍｌ、４〜５ｍｇ／ｍｌ、または約４．５ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（任意に０〜１００単位／ｍｌの間または約１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（任意に０〜１００μｇ／ｍｌの間または約１００μｇ／ｍｌ）などの１つ以上の抗生物質、GlutaMAX（商標）（任意に１×、およそ２ｍＭ）、N2サプリメント（任意に０．１〜５％ｖ／ｖまたは０．１〜２％ｖ／ｖ。１％ｖ／ｖを包含する）およびB27サプリメント（任意に０．０５〜２％ｖ／ｖ。２％ｖ／ｖを包含する）などの１つ以上の血清サプリメント、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液（任意にストック溶液から１×濃度、またはおよそ０．１ｍＭの終濃度）、ならびに任意にＮｏｇｇｉｎポリペプチド（任意に１０〜５００ｎｇ／ｍｌ。５０ｎｇ／ｍｌを包含する）を含む。
神経節細胞（ＧＣ）培地。神経節細胞（ＧＣ）培地は、多能性幹細胞を網膜神経節（ＲＧ）前駆体細胞に分化させるために、より具体的には眼領域前駆体細胞を網膜神経節（ＲＧ）前駆体細胞に分化させるために用いられる。ＧＣ培地は、基本培地、例えばNeurobasal（商標）培地（Life Technologies）または表１に提供されるNeurobasal（商標）培地の構成要素を含む培地、Ｄ−グルコース（任意に０〜１０ｍｇ／ｍｌの間、２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌ、３〜６ｍｇ／ｍｌ、４〜５ｍｇ／ｍｌ、または約４．５ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（任意に０〜１００単位／ｍｌの間または約１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（任意に０〜１００μｇ／ｍｌの間または約１００μｇ／ｍｌ）などの１つ以上の抗生物質、GlutaMAX（商標）（任意に１×またはおよそ２ｍＭ）、N2サプリメント（任意に０．１〜５％ｖ／ｖまたは０．１〜２％ｖ／ｖ。１％ｖ／ｖを包含する）およびB27サプリメント（調合０８００８５−ＳＡ）（任意に０．５〜２％ｖ／ｖ。２％ｖ／ｖを包含する）などの１つ以上の血清サプリメント、ならびにフォルスコリン（任意に１〜２０μＭ。５μＭを包含する）、ＢＤＮＦ（任意に１〜２００ｎｇ／ｍｌ。１０ｎｇ／ｍｌを包含する）、およびＣＮＴＦ（任意に１〜２００ｎｇ／ｍｌ。１０ｎｇ／ｍｌを包含する）の１つ以上を含む。
網膜神経節細胞（ＲＧＣ）分化培地。ＲＧＣ分化培地は、多能性幹細胞を網膜神経節（ＲＧ）細胞に分化させるために、より具体的にはＲＧ前駆体細胞をＲＧ細胞に分化させるために用いられる。ＲＧＣ分化培地は、基本培地、例えばNeurobasal（商標）培地（Life Technologies）または表１に提供されるNeurobasal（商標）培地の構成要素を含む培地、Ｄ−グルコース（任意に０〜１０ｍｇ／ｍｌの間、２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌ、３〜６ｍｇ／ｍｌ、４〜５ｍｇ／ｍｌ、または約４．５ｍｇ／ｍｌ）、ペニシリン（任意に０〜１００単位／ｍｌの間または約１００単位／ｍｌ）およびストレプトマイシン（任意に０〜１００μｇ／ｍｌの間または約１００μｇ／ｍｌ）などの１つ以上の抗生物質、B-27サプリメント（調合０８００８５−ＳＡ）などの１つ以上の血清サプリメント（任意に約０．０５から５．０％、約１．５から２．５％、または約２％（ｖ／ｖ）で）、GlutaMAX（商標）（任意に１×または約２ｍＭ）、ならびにフォルスコリン（任意に１〜２０μＭ。５μＭを包含する）、ＢＤＮＦ（任意に１〜２００ｎｇ／ｍｌまたは５〜５０ｎｇ／ｍｌまたは５〜２５ｎｇ／ｍｌまたは約１０ｎｇ／ｍｌ）、ＣＮＴＦ（任意に１〜２００ｎｇ／ｍｌまたは５〜５０ｎｇ／ｍｌまたは５〜２５ｎｇ／ｍｌまたは約１０ｎｇ／ｍｌ）、ｃＡＭＰ（任意に１〜５００ｎｇ／ｍｌまたは１０〜２５０ｎｇ／ｍｌまたは５〜１５０ｎｇ／ｍｌまたは約１００ｎｇ／ｍｌ）、ＤＡＰＴ（任意に１〜１００μＭまたは１〜２０μＭ）、および任意にレチノイン酸（任意に０．５〜２０μＭまたは１〜５μＭ）の全てを包含する１つ以上を含む。ＢＤＮＦはヒトＢＤＮＦであり得る。ＣＴＮＦはヒトＣＴＮＦであり得る。ＲＧＣ分化培地はＢＤＮＦおよびＣＮＴＦの１つまたは両方を含み得る。ＲＧＣ分化培地は、フォルスコリン、ｃＡＭＰ、およびＤＡＰＴ、または他のＮｏｔｃｈ阻害剤の全てを包含する１つ以上を含み得る。ＲＧＣ分化培地は、ヒトインスリンを包含するインスリンを含み得る（任意に約５〜５０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌ）。
ＤＭＥＭ／Ｆ１２、Neurobasal（商標）培地（Life Technologies）、N2血清サプリメント、ならびにB27血清サプリメントおよびB27血清サプリメント（調合０８００８５−ＳＡ）の構成要素は表１に提供されている。本発明が、これらの特定の培地およびサプリメント、またはそれらの構成要素を含むか、本質的にそれらからなるか、もしくはそれらからなる培地もしくはサプリメントの使用を企図するということは理解されるべきである。
細胞調製物およびその純度
本明細書において用いられる用語の調製物は、特に細胞調製物に関しては、用語の集団および組成物と交換可能に用いられる。簡略のために、側面および態様は調製物の観点で記載され得るが、かかる記載が等しく集団および組成物にも当てはまるということは理解されるべきである。調製物が他の非細胞置換物を含み得るということは理解されるべきである。
本開示を通して用いられる細胞調製物の純度のレベルは、調製物中の細胞の総数に対して相対的に、所望の細胞型の１つ以上のマーカー（本願において同定されるマーカーまたは当分野において公知の他のものを包含する）を発現する調製物中の細胞の割合として定量され得る。純度は、関心の１つ以上のマーカーを発現する細胞および／または発現しない細胞を検出し数え上げることによって判定され得、任意に総細胞数を数え上げる。細胞を数え上げるために用いられ得る例示的な方法は、限定なしに、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学、インシチュハイブリダイゼーション、および当分野において公知の他の好適な方法を包含する。典型的には、かかる分析は調製物中の生存不能細胞を除外する。
本明細書において用いられる細胞の大多数は少なくとも５０％を意味し、態様に依存して、細胞の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または約１００％を包含し得る。
本開示は、開示される方法が多能性幹細胞などだがこれに限定されない前駆体細胞を直接分化させる能力に基づいて、種々の細胞集団の実質的に純粋な（または均質な）調製物を提供する。本明細書において用いられる指向的な分化は、前駆体細胞集団が、部分的にはかかる前駆体細胞に提供される因子または他の刺激によって、所望の系譜にまたはそれに向かって分化し、それによって、他の望まれない、それゆえに潜在的に混入して来る系譜への分化を回避するということを意図する。本明細書において提供される方法は、胚様体（ＥＢ）を作製することなしに、例えば多能性幹細胞から眼領域前駆体への分化を駆動する。ＥＢは下に記載されるように３次元の細胞クラスターであり、これは胚性幹（ＥＳ）細胞を包含するがこれに限定されない多能性幹細胞の分化の間に形成し得、且つ典型的には前駆体を包含する中胚葉、外胚葉、および内肺葉系譜の細胞を含有する。ＥＢの３次元的性質は、非ＥＢ系の本明細書に記載される方法において起こるものとは異なる、異なる細胞−細胞相互作用および異なる細胞−細胞シグナル伝達を包含する環境を作り出し得る。加えて、ＥＢ内の細胞は、周囲の培地中に存在する分化因子などの外因的に追加される薬剤の同様の用量を全てが受け得ず、これはＥＢの発生の間に種々の分化イベントおよび決定をもたらし得る。
対照的に、前駆体細胞を培養する本発明の培養方法はＥＢ形成を要求せず、好ましくはそれを回避する。代わりに、それらの方法は、かかる培地中の因子を包含する周囲の培地との等しい接触を細胞に提供する条件下で細胞を培養する。例として、細胞は、培養表面に接着した単層またはほぼ単層として生育し得る。
前駆体細胞の全てまたは大多数がそれらの周囲の培地、それゆえにかかる培地中の因子とおよそ等しい程度に接触する能力は、それらの前駆体細胞が同様の時間に同様の程度に分化することをもたらす。前駆体細胞の集団のこの同様の分化時系列は、かかる細胞が同調しているということを示している。いくつかの場合には、細胞は細胞周期同調もまたされ得る。かかる同調性は、それらの細胞構成が均質またはほぼ均質である細胞の集団をもたらす。例として、本明細書に記載される方法は、細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または約１００％が関心の特定の細胞である細胞集団を生じ得る。関心の細胞は表現型的に、例えば細胞内または細胞外マーカー発現によって定められ得る。関心の細胞は眼領域前駆体細胞、ＲＧ前駆体細胞（初期または後期にかかわらない）、またはＲＧ細胞であり得る。
本明細書において用いられる「細胞の実質的に純粋な調製物」は、細胞が少なくとも６０％純粋である細胞の調製物を言う。それゆえに、調製物中の細胞の少なくとも６０％が特定の細胞型の１つ以上のマーカーを発現する（本願において同定されるマーカーまたは当分野において公知の他のものを包含する）。細胞は少なくとも６５％純粋または少なくとも７０％純粋であり得る。細胞は約７０％超純粋であり得る（少なくとも７５％、８０％、８５％、または９０％純粋を包含する）。
それゆえに、例えば「ＲＧ細胞の実質的に純粋な調製物」は、調製物中の細胞の少なくとも６０％がＲＧ細胞の１つ以上のマーカーを発現する（本願において同定されるマーカーまたは当分野において公知の他のものを包含する）細胞の調製物を言う。調製物中の細胞の少なくとも７０％はＲＧ細胞の１つ以上のマーカーを発現し得、このケースでは、調製物は７０％純粋である。調製物中の細胞の少なくとも８５％はＲＧ細胞の１つ以上のマーカーを発現し得、このケースでは、調製物は８５％純粋である。調製物中の細胞の少なくとも９５％はＲＧ細胞の１つ以上のマーカーを発現し得、このケースでは、調製物は９５％純粋である。いくつかの態様において、調製物は約８５％から９５％純粋であり得る。
別の例として、「ＲＧ前駆体細胞の実質的に純粋な調製物」は、調製物中の細胞の少なくとも６０％がＲＧ前駆体細胞の１つ以上のマーカー（本願において同定されるマーカーまたは当分野において公知の他のものを包含する）を発現する細胞の調製物を言う。調製物中の細胞の少なくとも７０％はＲＧ前駆体細胞の１つ以上のマーカーを発現し得、このケースでは、調製物は７０％純粋である。調製物中の細胞の少なくとも８５％はＲＧ前駆体細胞の１つ以上のマーカーを発現し得、このケースでは、調製物は８５％純粋である。調製物中の細胞の少なくとも９５％はＲＧ前駆体細胞の１つ以上のマーカーを発現し得、このケースでは、調製物は９５％純粋である。いくつかの態様において、調製物は約８５％から９５％純粋であり得る。
本開示のある種の態様において、ＲＧ前駆体細胞およびＲＧ細胞を包含するがこれに限定されない細胞は、７ｋｂ、７．５ｋｂ、８ｋｂ、８．５ｋｂ、９ｋｂ、９．５ｋｂ、１０ｋｂ、１０．５ｋｂ、１１ｋｂ、１１．５ｋｂ、またはさらには１２ｋｂよりも長い平均末端制限断片長（ＴＲＦ）を有する。平均末端制限断片長（ＴＲＦ）を測定するための方法は当分野において公知である。例えばKimura et al. Nat. Protocol, 5(9): 1596-1607, 2010参照。
発生ステージの関数としての細胞マーカー発現
Ｐａｘ６、Ｒｘ１、Ｓｉｘ３、Ｓｉｘ６、Ｌｈｘ２、Ｔｂｘ３、Ｓｏｘ２、Ｃｈｘ１０、Ｍａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａおよびＢｒｎ３ｂを包含するＢｒｎ３、Ｉｓｌ１、ニューロフィラメント、Ｔｕｊ１、Ｔｈｙ１、ネスチン、Ｏｔｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４などだがこれに限定されないマーカーの発現が、蛋白質および／またはｍＲＮＡで評価され得る（Fischer AJ, Reh TA, Dev Neurosci. 2001:23(4-5):268-76、Baumer et al., Development. 2003 Jul;130(13):2903-15、Swaroop et al., Nat Rev Neurosci. 2010 Aug; 11(8):563-76、Agathocleous and Harris, Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2009. 25:45-69、Beby F, Lamonerie T, Exp. Eye Res. 2013; 111, 9-16参照。そのそれぞれはその全体が参照によってここに組み込まれる）。
マーカーは、一般的には、例えば文脈が別様に示すところを除き、ヒトである。細胞マーカーは従来の免疫細胞化学的方法または従来のＰＣＲ方法を用いて同定され得、それらの手法は当業者に周知である。
多能性幹細胞
本明細書において用いられる用語「多能性幹細胞」は、（ａ）免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植されたときにテラトーマを誘導でき、（ｂ）３つの胚葉全ての細胞型（例えば、外胚葉、中胚葉、および内肺葉細胞型）に分化でき、（ｃ）多能性の１つ以上のマーカー（例えば、Ｏｃｔ４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３表面抗原、ＳＳＥＡ−４表面抗原、ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、ＳＯＸ２、ＲＥＸ１など）を発現する細胞である。ある種の態様において、多能性幹細胞は、ＯＣＴ−４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、およびＴＲＡ−１−８１からなる群から選択される１つ以上のマーカーを発現する。
多能性幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞、胚由来幹細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、胚性癌（ＥＣ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、および刺激惹起性多能性獲得（ＳＴＡＰ）細胞を包含する。例示的な多能性幹細胞は当分野において公知の方法のいずれかの種類を用いて作製され得る。当分野において認められるであろう通り、胚様体はとりわけＥＳ細胞またはＥＧ細胞から形成され得る。当分野においてまた認められるであろう通り、ＥＳ細胞は胚の破壊なしに作製され得る。例えば、ＥＳ細胞は非胚である単為発生卵（卵細胞）から作製され得、ＥＳ細胞は生存不能である（例えば、インプラントをできない）ように故意に操作されたものを包含する生存不能胚から作製され得、ＥＳ細胞は生存不能胚を包含する胚の単一の割球から作製され得る。
多能性幹細胞は、寿命、多能性、および／もしくはホーミングを増大させるように、ならびに／または同種免疫反応を防止もしくは低減するように、ならびに／または多能性幹細胞の分化した子孫に所望の因子を送達するように、ならびに／または多能性幹細胞の分化した子孫において所望の因子を発現するように改変され得、遺伝子改変を包含する。
多能性幹細胞はいずれかの種からであり得る。ＥＳ細胞およびｉＰＳ細胞を包含する多能性幹細胞の種々の型が、マウス、ヒト、および他のソースから作製されて来た。従って、本方法に用いられる多能性幹細胞は、限定なしに、ヒト、非ヒト霊長類、げっ歯類（マウス、ラット）、有蹄類（ウシ、羊など）、犬（飼育下および野生の犬）、猫（飼育下および野生の猫、例えばライオン、虎、チーター）、ウサギ、ハムスター、ヤギ、象、パンダ（ジャイアントパンダを包含する）、ブタ、アライグマ、馬、シマウマ、海棲哺乳動物（イルカ、鯨など）、および同類を包含するいずれかの種から得られる。ある種の態様において、種は絶滅危惧種である。ある種の態様において、種は現在絶滅種である。
胚性幹（ＥＳ）細胞。胚性幹細胞は、それらのソースまたはそれらを生ずるために用いられる特定の方法にかかわらず、（ｉ）全ての３つの胚葉の細胞に分化することができ、（ｉｉ）少なくともＯｃｔ４およびアルカリホスファターゼを発現し、（ｉｉｉ）免疫不全動物に移植されたときにはテラトーマを生ずることができる細胞である。用語は、細胞株として連続継代されたものを包含するヒト胚盤胞または桑実胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来する細胞、精子と卵細胞との人為的融合、精子による卵細胞の受精、体細胞核移植（ＳＣＮＴ）などの核移植、単為発生、雄性発生によって、またはクロマチンのリプログラミングとリプログラミングされたクロマチンの細胞への爾後の組み込みとによって生じた接合体、（例えば卵割ステージまたは桑実胚ステージ胚の）割球、または胚盤胞ステージの哺乳動物胚に由来する細胞を包含する。
用語のＥＳ細胞は、細胞が胚の破壊によって作製されたということを言わんとするものではなく、それを意味すると推量されるべきではない。反対に、ヒト胚などの胚の破壊なしにＥＳ細胞を作製するために種々の方法が利用可能であり、用いられ得る。例として、ＥＳ細胞は、着床前診断（ＰＧＤ）のための割球の採取と同様の様式で、胚に由来する単一の割球から作製され得る。かかる細胞株の例はＮＥＤ１、ＮＥＤ２、ＮＥＤ３、ＮＥＤ４、ＮＥＤ５、およびＮＥＤ７を包含する。用いられ得る例示的なヒト胚性幹細胞株はＭＡ０９細胞である。ＭＡ０９細胞の単離および調製はKlimanskaya, et al. (2006) Human Embryonic Stem Cell Lines Derived from Single Blastomeres. Nature 444: 481-485、およびChung et al. (2008) Human Embryonic Stem Cell Lines Generated without Embryo Destruction, Cell Stem Cell, 2(2): 113-117に以前に記載されている。これらの株の全ては胚の破壊なしに作製された。
用いられ得る追加のＥＳ細胞は、限定なしに、ＭＡ０１、ＭＡ０９、ＡＣＴ−４、ＭＡ１４２、ＭＡ１４３、ＭＡ１４４、ＭＡ１４５、ＭＡ１４６、ＭＡ１２６（ＮＥＤ１）、ＭＡ１２７、（ＮＥＤ２）、ＭＡ１２８、（ＮＥＤ３）、ＭＡ１２９、（ＮＥＤ４）、ＮＥＤ７、Ｎｏ．３、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１４、およびＡＣＴ３０−ＥＳ細胞などのヒトＥＳ細胞を包含する。
参照はＮＩＨヒト胚性幹細胞レジストリにもまたされ得る。本開示に従って用いられるヒトＥＳ細胞は当分野において公知のＧＭＰ標準に従って誘導および維持され得る。
本明細書において言及されるＥＳ細胞は、マウス、非ヒト霊長類の複数の種、およびヒトを包含する種々の種から誘導されており、胚由来幹細胞は数多くの追加の種から作製されている。
人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞．人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）は、因子（本明細書においてはリプログラミング因子と言われる）の組み合わせを発現することによる体細胞のリプログラミングによって作製される細胞である。
ｉＰＳ細胞は、実質的にいずれかの発生ステージのいずれかの体細胞を出発点として用いて作製され得る。例えば、細胞は胚、胎児、新生児、若齢、または成体ドナーからであり得る。いくつかの場合には、細胞は新生児、若齢、もしくは成体ドナーからであるか、または羊水から得られ、それゆえに胚または胎児の破壊を要求しない。用いられ得る例示的な体細胞は、線維芽細胞、例えば皮膚サンプルまたは生検から得られる皮膚線維芽細胞、滑膜組織からの滑膜細胞、包皮細胞、頬細胞、および肺線維芽細胞を包含する。ある種の態様において、体細胞は線維芽細胞ではない。
ある種の態様においては、少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つ、または少なくとも４つのリプログラミング因子が体細胞内で発現されて、体細胞を首尾よくリプログラミングする。リプログラミング因子はＯｃｔ４（場合によってはＯｃｔ３／４と言われる）、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、Ｋｌｆ４、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８から選択され得るが、これらはあまり限定されない。いくつかの態様において、リプログラミング因子はＯｃｔ４（場合によってはＯｃｔ３／４と言われる）、ＳＯＸ２、ｃ−Ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の組み合わせ、またはＯｃｔ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、およびＬｉｎ２８の組み合わせを包含する。
リプログラミング因子は種々の方法のいずれかを用いて体細胞内に導入され得、限定なしに、インテグレーションベクター、非インテグレーションベクター（例えば、Yu et al., Science. 2009 May 8;324(5928):797-801に記載されているものなどのエピソーマルプラスミド）、化学的手段、蛋白質導入、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、カチオン性両親媒性物質、脂質二重層との融合、界面活性剤透過処理など）、またはその組み合わせを包含する。加えて、リプログラミング因子の発現は、リプログラミング因子の発現を誘導する少なくとも１つの薬剤、例えば有機低分子薬剤と体細胞を接触させることによって誘導され得る。
インテグレーションウイルスベクターを用いるＯｃｔ３／４、ＳＯＸ２、ｃ−ｍｙｃ、およびＫｌｆ４の発現は、マウス体細胞をリプログラミングするために十分であることが示されている。インテグレーションウイルスベクターを用いるＯｃｔ３／４、ＳＯＸ２、ＮＡＮＯＧ、およびＬｉｎ２８の発現は、ヒト体細胞をリプログラミングするために十分であることが示されている。
ｉＰＳ細胞はセルバンクから得られる。ｉＰＳ細胞は、具体的には、組織マッチングしたＲＧ細胞またはＲＧ前駆体細胞を作製する目的で、特定の患者またはマッチングしたドナーからの材料を用いて作製され得る。ｉＰＳ細胞は意図されるレシピエントにおいて実質的に免疫原性ではない細胞から生じ得、例えば、自家細胞からまたは意図されるレシピエントと組織適合性の細胞から生じ得る。
刺激惹起性多能性獲得（ＳＴＡＰ）細胞。刺激惹起性多能性獲得（ＳＴＡＰ）細胞は、低ｐＨ暴露などの準致死的な刺激によって体細胞をリプログラミングすることによって生ずる多能性幹細胞である。リプログラミングは体細胞への核移植またはその遺伝子操作を要求しない。Obokata et al., Nature, 505:676-680, 2014の参照がされ得る。
成体幹細胞。「成体幹細胞」は成体組織から単離される多能性細胞を言い、骨髄幹細胞、臍帯血幹細胞、および脂肪幹細胞を包含し得、ヒト起源である。
重要なことに、本発明の方法はＥＢ分化ステップを使用していない（すなわち、分化は多能性幹細胞から網膜神経節細胞までＥＢの形成なしに起こる）。本明細書において論じられるように、かかる分化プロセスには思いがけない利点がある。
「胚様体」は、多能性幹細胞（例えばｉＰＳＣまたはＥＳＣ）を包含する細胞の塊またはクラスターを言い、これは、多能性幹細胞を非接着条件下で、例えば低接着基質上でまたは「ハンギングドロップ」によって培養することによって形成され得る。それらの培養物中で、多能性細胞は、胚様体と命名された細胞の塊またはクラスターを形成し得る。その全体が参照によってここに組み込まれるItskovitz-Eldor et al., Mol Med. 2000 Feb;6(2): 88-95参照。典型的には、胚様体は最初に多能性細胞の中実の塊またはクラスターとして形成し、経時的に、胚様体のいくつかは液で満たされた内腔を包含するようになり、後者の前者は文献では「単純」ＥＢ、後者は「嚢胞状」胚様体と言われる。
適用および使用
スクリーニングアッセイ
本発明は、眼領域前駆体細胞から網膜神経節系譜に向かう分化を調節する種々の薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。これは、眼領域前駆体細胞からの培養によって作製され得るＲＧ前駆体細胞を支持および／またはレスキューする治療薬剤を発見するためにもまた用いられ得る。
本発明は、ＲＧ前駆体細胞の分化を調節する種々の薬剤をスクリーニングするための方法を提供する。これは、ＲＧ前駆体細胞からの培養によって作製される成熟ＲＧ細胞を支持および／またはレスキューする治療薬剤を発見するためにもまた用いられ得る。
本発明の目的には、「薬剤」は、生物系または化学系化合物、例えば単純もしくは複雑な有機もしくは無機分子、ペプチド、蛋白質（例えば抗体）、ポリヌクレオチド（例えばアンチセンス、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ））、またはリボザイムを包含することが意図されるが、これらに限定されない。さまざまな化合物例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドなどのポリマー、ならびに種々のコア構造に基づく合成有機化合物が合成され得、それらもまた用語「薬剤」に包含される。加えて、種々の天然のソースは、植物または動物抽出物および同類などのスクリーニングのための化合物を提供し得る。常に明確に書かれはしないが、薬剤が、単独で、または本発明のスクリーニングによって同定される薬剤と同じかもしくは異なる生物活性を有する別の薬剤との組み合わせで用いられるということは理解されるべきである。
スクリーニング方法をインビトロで行うために、細胞の単離された集団が本明細書に記載されるように得られる。薬剤がＤＮＡまたはＲＮＡ以外の組成物、例えば上に記載されている低分子であるときには、薬剤は直接に細胞に追加されるか、または追加のための培養培地に追加され得る。当業者に明らかである通り、経験的に決定され得る「有効」量が追加されなくてはならない。薬剤がポリヌクレオチドであるときには、これは遺伝子銃またはエレクトロポレーションの使用によって直接に追加され得る。代替的に、これは、遺伝子送達基剤または上に記載されている他の方法を用いて細胞内に挿入され得る。薬物または他の薬剤の主張する活性を確認するために、正および負のコントロールがアッセイされ得る。
薬物スクリーニング
本発明の別の側面は、上昇したＩＯＰ、グルタミン酸毒性、または元来の網膜神経節細胞およびそれらの前駆体の機能喪失もしくは細胞死を引き起こし得る他の環境的もしくは遺伝学的条件の効果いずれかから神経節を保護することができる薬物を同定するためのアッセイの開発および使用に関する。保護は、例えばそれらの種々の効果に対する神経節の感度を低減することによって達成され得る。他の態様においては、アッセイは、元来の網膜神経節細胞および／またはそれらの前駆体の増殖を促進するおよび／または元来の網膜神経節前駆体から成熟網膜神経節細胞への分化／成熟を誘導し得る薬剤を同定するために用いられ得る。これらのアッセイによって試験され得る薬剤は、低分子（例えば、有機化合物は１０，０００原子質量単位（ａｍｕ）未満の分子量を有する）、蛋白質およびペプチド、核酸などを包含するが、これに限定されない。試験されるべき薬剤は、例えば細菌、酵母、もしくは他の生物によって生ずるか（例えば天然産物）、化学的に生ずるか（例えば、ペプチドミメティックを包含する低分子）、または組換え的に生じ得る。
例えば、アッセイは、化合物が培養中の網膜神経節細胞（例えば、本明細書において提供される方法を用いて多能性幹細胞、眼領域前駆体、またはＲＧ前駆体細胞の分化によって誘導され得る）をグルタミン酸によって誘導される毒性から保護する能力を評価し得る。種々のアッセイフォーマットが用をなし、本開示に照らして、本明細書に明白に記載されてはいないものもやはり当業者には理解されるであろう。化合物および天然の抽出物のライブラリーを試験する多くの薬物スクリーニングプログラムにおいては、所与の時間内に調査される化合物の数を最大化するためにハイスループットアッセイが望ましい。試験薬剤の保護活性の検出および定量は、例えばアポトーシスのマーカーの相対的変化を検出することによって実施され得る。保護性である薬剤は、コントロールの未処置細胞に対して相対的に、上昇したグルタミン酸レベルなどの神経毒性条件下でアポトーシスのマーカーの発現の率／レベルの減少を生ずるはずである。薬剤の有効性は、試験化合物の種々の濃度を用いて得られるデータから用量反応曲線を作成することによって評価され得る。コントロールアッセイもまた比較のためのベースラインを提供するために実施され得る。コントロールアッセイでは、アポトーシスの程度が試験化合物の不在下で定量化され得る。一般的に、反応物が混ぜられ得る順序は変えられ得、同時に混ぜられ得るということは理解されるであろう。
感覚神経網膜構造
ＲＧ前駆体細胞および任意にそれから分化したＲＧ細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞、光受容体細胞、およびＲＧ前駆体またはＲＧ細胞そのものを包含する感覚神経網膜構造を作製するために用いられ得る。例えば、本発明は、ＲＧ細胞またはＲＧ前駆体細胞、ＲＰＥ細胞、および光受容体細胞（または光受容体前駆体細胞）からなる多層細胞構造の作製を企図する。それらの構造は薬物スクリーニングに、疾患のモデルとして、または医薬調製物に用いられ得る。後者のケースでは、医薬調製物はＲＰＥ−光受容体−ＲＧグラフトであり得、これは「パッチ」のようにインプラントされ得る生体適合性の固体支持体またはマトリックス（好ましくは生体吸収性マトリックスまたは支持体）上に配置され得る。
ＲＧ細胞またはＲＧ前駆体細胞が網膜神経前駆体（例えばＣｈｘ１０（＋）細胞）から光受容体と一緒に作製され得、それらの細胞がＲＰＥ細胞層（例えば単層）と一緒に移植され得るということがさらに企図される。
さらに例示すると、細胞のための生体適合性の支持体は網膜前駆体細胞のための生分解性ポリエステルフィルム支持体であり得る。生分解性ポリエステルは、網膜前駆体細胞の増殖および分化を支持するための基質またはスキャホールドとしての使用に好適ないずれかの生分解性ポリエステルであり得る。ポリエステルは、薄いフィルム、好ましくはマイクロテクスチャー加工したフィルムを形成することができるべきであり、組織または細胞移植に用いられる場合には生分解性であるべきである。本発明への使用に好適な生分解性ポリエステルは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリラクチド、ポリヒドロキシアルカノアート、ホモポリマーおよびコポリマー両方、例えばポリヒドロキシ酪酸（ＰＨＢ）、ポリヒドロキシ酪酸ｃｏ−ヒドロキシバレラート（ＰＨＢＶ）、ポリヒドロキシ酪酸ｃｏ−ヒドロキシヘキサノアート（polyhydroxybutyrate co-hydroxyhexanote）（ＰＨＢＨｘ）、ポリヒドロキシ酪酸ｃｏ−ヒドロキシオクタノアート（polyhydroxybutyrate co-hydroxyoctonoate）（ＰＨＢＯ）およびポリヒドロキシ酪酸ｃｏ−ヒドロキシオクタデカノアート（ＰＨＢＯｄ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリエステルアミド（ＰＥＡ）、脂肪族コポリエステル、例えばポリブチレンサクシナート（ＰＢＳ）およびポリブチレンサクシナート／アジパート（ＰＢＳＡ）、芳香族コポリエステルを包含する。ブロック、分岐、またはランダムの高および低分子量ポリエステル両方、置換および無置換ポリエステル、ならびにポリエステル混合物およびブレンドが用いられ得る。好ましくは、生分解性ポリエステルはポリカプロラクトン（ＰＣＬ）である。
ある種の態様において、生体適合性の支持体はポリ（ｐ−キシリレン）ポリマー、例えばパリレンＮ、パリレンＤ、パリレンＣ、パリレンＡＦ−４、パリレンＳＦ、パリレンＨＴ、パリレンＶＴ−４、およびパリレンＣＦ、最も好ましくはパリレンＣである。
ポリマー製支持体は、典型的には公知の手法を用いて薄いフィルムに形成され得る。フィルム厚は、有利には約１ミクロンから約５０ミクロン、好ましくは約５ミクロン厚である。フィルムの表面は平滑であり得るか、またはフィルム表面は部分的にまたは完全にマイクロテクスチャー加工され得る。好適な表面テクスチャーは例えば微小溝または微小柱を包含する。フィルムはインプラントに好適な形状を形成するために裁断および成形され得る。
ＲＰＥ、光受容体細胞または光受容体前駆体細胞、ならびにＲＧ前駆体細胞および／またはＲＧ細胞は、生体適合性のスキャホールドを形成するために、直接に、一緒に、または順次フィルム上にプレーティングされ得る（例えば、ＲＰＥ層の後に光受容体細胞または光受容体前駆体細胞が形成される）。代替的に、ポリマーフィルムは、好適なコーティング材料、例えばポリ−Ｄ−リジン、ポリ−Ｌ−リジン、フィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＶ、ビトロネクチン、およびマトリゲル（商標）によってコーティングされ得る。細胞はいずれかの所望の密度にプレーティングされ得るが、ＲＰＥ細胞の単一の層（ＲＰＥ単層）が好ましい。
治療的使用
例示的な態様において、細胞は、その必要があるラット、例えば高眼内圧ラット、または疾患の他の動物モデルに移植され得、視覚機能に及ぼすもたらされる効果が視運動反応試験、ＥＲＧ（網膜電図法）、輝度閾値記録、および／または視覚中枢血流アッセイによって検出され得る。
本明細書において用いられる疾患の「徴候」は、広く、患者の検査によって発見可能な疾患を示すいずれかの異常を言う。疾患の主観的目安である症状とは対照的に、疾患の客観的目安である。
本明細書において用いられる疾患の「症状」は、広く、患者によって経験される疾患を示すいずれかの病的現象または構造、機能、もしくは感覚の正常からの逸脱を言う。
本明細書において用いられる「治療（therapy）」、「治療（therapeutic）」、「処置する（treating）」、「処置する（treat）」、または「処置」は、広く、疾患を処置すること、疾患もしくはその臨床的な症状の発生を阻止もしくは低減すること、および／または疾患を緩和し、疾患もしくはその臨床的な症状の後退を引き起こすことを言う。治療は、疾患、疾患の徴候、および／または症状の予防、防止、処置、治癒、救済、低減、軽減、および／またはその緩和を提供することを包摂する。治療は、進行中の疾患徴候および／または症状がある患者の徴候および／または症状の軽減を包摂する。治療は「予防」および「防止」をもまた包摂する。予防は、患者の疾患の処置の爾後に起こる疾患を防止すること、または患者の疾患の発生率または重度を低減することを包含する。用語「低減された」は、治療の目的のためには、広く、徴候および／または症状の臨床的な有意な低減を言う。治療は、再発または反復性の徴候および／もしくは症状を処置することを包含する。治療は、徴候および／または症状の出現をいつでも妨げることと、存在している徴候および／または症状を低減することと、存在している徴候および／または症状を無くすこととを包摂するが、これに限定されない。治療は、慢性疾患（「維持」）および急性疾患を処置することを包含する。例えば、処置は、再発または徴候および／もしくは症状の反復を処置または防止することを包含する。
いくつかの態様において、処置は、安定なもしくは改善した暗所閾値電位（scoptic threshold response）、安定なもしくは改善した視運動性反射（ＯＫＲ）、安定なもしくは改善した視覚誘発電位（ＶＥＰ）、および／または安定なもしくは改善した視力（例えばＥＲＧによって測定される）によって示され得る。安定なまたは改善したレベルは、処置前のレベルに対して相対的、または反対側の眼などの無処置のコントロールに対して相対的である。いくつかの場合には、これらの機能または応答の１つ以上が処置の不在下では経時的に悪化するであろうということと、本発明の移植される細胞がその悪化を妨害、低減、または限定し得るということとが理解されるべきである。それゆえに、いくつかの場合には、機能または応答はコントロールに対して相対的に安定なままであり、一方で、他の場合にはそれは改善し、両方の状況とも対象にとって有益であると考えられ、それゆえに処置と見なされる。
これらおよび他の態様において、対象はその網膜神経節細胞層にとっての基礎的な利益を経験し得る。例えば、元来のＲＧ細胞層はコントロールと比較して改善した生存または低減された細胞喪失を経験し得る。なお他の態様において、対象は視神経の軸索の増大した形成を経験し得る。
本発明は、この処置の必要がある患者のＲＧ細胞を取りかえるかまたは修復するための方法をもまた提供し、本発明のＲＧ前駆体細胞もしくはそれに由来するＲＧ細胞またはその組み合わせを包含する医薬調製物を患者に投与することを含む。本明細書に記載されるように、医薬調製物は細胞の懸濁液、またはインビトロで移植可能な組織に形成される細胞であり得る。多くの場合に、細胞は眼内注射によって投与されるであろう（硝子体注射および網膜下注射を包含する）。それゆえに、細胞は有疾患または変性網膜の網膜下腔に眼内投与され得る。しかしながら、ＲＧ前駆体細胞はニューロン保護効果をもまた有するので、細胞は、局所だが網膜の外に（例えば硝子体内に）、または体の他の部分へのデポットもしくは全身送達によって投与され得る。
本発明の医薬調製物は、網膜変性関連疾患を包含する視覚系の悪化をもたらす多種多様な疾患および障害に用いられ得る。かかる疾患および障害は加齢によって引き起こされ得、その結果、悪化の実質的なソースとして同定可能である損傷または疾患の不在があるように見える。当業者は、かかる疾患状態を診断および／またはかかる損傷の公知の徴候を検査するための立証された方法を理解するであろう。加えて、文献は動物の視覚系の側面の加齢性の減退または悪化の情報に事欠かない。用語「網膜変性関連疾患」は、先天または生後の網膜変性または異常からもたらされるいずれかの疾患を言うことを意図される。網膜変性関連疾患の例は、網膜異形成症、加齢黄斑変性、糖尿病網膜症、網膜色素変性症、先天性網膜ジストロフィー、レーバー先天性黒内障、網膜剥離、緑内障、視神経症、および外傷を包含する。
加えてまたは代替的に、感覚神経網膜などの視覚系構成要素の悪化は、視覚系そのもの（例えば眼）、頭部もしくは脳、またはより一般的に体の損傷、例えば外傷によって引き起こされ得る。ある種のかかる損傷は加齢性の損傷であることが公知であり、すなわちそれらの見込みまたは頻度は年齢によって増大する。かかる損傷の例は網膜裂孔、黄斑円孔、網膜上膜、および網膜剥離を包含する。そのそれぞれはいずれかの年齢の動物において起こり得るが、さもなければ健康な高齢の動物を包含する高齢の動物において起こる見込みがより高いか、または起こる。他の場合には、視覚系構成要素の悪化が虚血および／または再灌流損傷によってより高い頻度で起こり得る。
視覚系またはその構成要素の悪化は疾患によってもまた引き起こされ得る。疾患には、視覚系に影響する種々の加齢性疾患が包含される。かかる疾患は、若年者よりも高齢の動物においてより高い見込みおよび／または頻度で起こる。例えば感覚神経網膜層を包含する視覚系に影響し、その悪化を引き起こし得る疾患の例は、種々の形態の網膜炎、視神経炎、黄斑変性、増殖性もしくは非増殖性の糖尿病網膜症、糖尿病黄斑浮腫、進行性網膜萎縮症、進行性網膜変性、突発性後天性網膜変性、免疫介在性網膜症、網膜異形成症、脈絡網膜炎、網膜虚血、網膜出血（網膜前、網膜内、および／または網膜下）、高血圧性網膜症、網膜炎症、網膜浮腫、網膜芽細胞腫、または網膜色素変性症である。
前述の疾患のいくつかは、伴侶動物などのある種の動物、例えば犬および／または猫に特異的である傾向がある。疾患のいくつかは総称的に挙げられており、すなわち網膜炎または網膜出血の多くの型があり得る。それゆえに、疾患のいくつかは１つの特異的な病因によって引き起こされるのではなく、疾患の型または結果をより描写している。視覚系の１つ以上の構成要素の減退または悪化を引き起こし得る疾患の多くは、動物の視覚系に及ぼす一次および二次両方またはより遠隔の効果を有し得る。
有利には、本発明の医薬調製物はいくつもの状態を処置または改善するために用いられ得、虚血再灌流損傷、網膜血管疾患、視神経損傷（自己免疫、外傷、および／またはウイルス系にかかわらない）、緑内障（型にかかわらない）、糖尿病網膜症（低酸素性および血管新生系にかかわらない）、遺伝性神経節変性、および遺伝性視神経症（例えばレーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）またはレーベル視神経萎縮症）を包含するが、これに限定されない。
１つの側面において、細胞は、処置の必要がある患者の前述の状態のいずれかの症状を処置または軽減し得る。細胞は患者にとって自家または同種であり得る。さらなる側面において、本発明の細胞は他の処置との組み合わせで投与され得る。
本発明のＲＧ前駆体細胞は変性疾患の処置に使用を見いだす。細胞は、それらが意図される眼の部位、例えば網膜の神経節細胞層に生着または遊走し、機能的に不完全なエリアを再構成または再生することを可能にする様式で投与される。
遺伝子操作されたＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞もまた、遺伝子産物を変性の部位に標的化するために用いられ得、例えば、分泌性の生物活性蛋白質、ペプチド、もしくは核酸（例えばＲＮＡ干渉分子またはアプタマー）、または同類をコードする１つ以上の遺伝子によって操作され得る。それらの遺伝子産物は、元来の変性して行くニューロンをレスキューする生存促進因子、グラフトされた細胞の生存および部位特異的ニューロンへの分化を促進または神経伝達物質（単数または複数）を送達して、機能的な回復を可能にするように自己分泌様式で作用し得る因子を包含し得る。例えば、１つ以上の生物活性分子（単数または複数）は、抗血管新生抗体および分子、抗血管新生抗体スキャホールド、可溶性の受容体、免疫経路分子を標的化および阻害または調節する薬剤、成長因子阻害剤、成長因子、神経栄養因子、血管新生因子、神経伝達物質、ホルモン、酵素、抗炎症性因子、または他の治療蛋白質を包含し得る。種々の態様において、かかる分子は、Ｃ３ａ阻害剤、Ｃ３ｂ阻害剤、免疫経路分子を標的化および阻害または調節する他の薬剤、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＮＴ−４、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、Ａｘｏｋｉｎｅ、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、インスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦＩ）、インスリン様成長因子ＩＩ（ＩＧＦＩＩ）、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子アルファ．（ＴＧＦ−アルファ）、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−ベータ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、グリア由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ミッドカイン、チルホスチン（tryophotin）、アクチビン、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、インターロイキン、骨形成蛋白質、マクロファージ炎症性蛋白質、ヘパリン硫酸、ａｍｐｈｉｒｅｇｕｌｉｎ、レチノイン酸、腫瘍壊死因子．アルファ．、線維芽細胞成長因子受容体、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＰＥＤＦ、ＬＥＤＧＦ、ＮＴＮ、Ｎｅｕｂｌａｓｔｉｎ、ニューロトロフィン、リンホカイン、ＶＥＧＦ阻害剤、ＰＤＧＦ阻害剤、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）阻害剤、Ｔｉｅ２、ＣＤ５５、Ｃ５９、ＶＥＧＦおよびＰＤＧＦに同時に結合する二重特異性分子、ならびに潜在的な標的組織に及ぼす治療に有用な効果を有すると予想される他の薬剤を包含するが、これに限定されない。ある種の好ましい態様において、組換え操作されたＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞は１つ以上の組換え成長因子およびニューロトロフィン、例えばＦＧＦ２、ＮＧＦ、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、および脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）を発現するように操作され、これらの因子は、細胞死のプロセスを有意に遅くするということが網膜変性のモデルにおいて示されている。成長因子または成長因子の組み合わせを合成するように操作されたＲＧ前駆体および／またはＲＧ細胞を用いる治療は、ニューロン保護因子の持続的送達を保証するのみならず、損傷した網膜をもまた再構築し得る。
ある種の態様において、ＲＧ前駆体またはＲＧ細胞を操作するために用いられる遺伝子構築物は、神経節細胞死および／または緑内障を促進する条件、例えば上昇した眼内圧（ＩＯＰ）、グルタミン酸の上昇したレベルなどに対して感受性である転写および／または翻訳コントロールエレメント（例えば、エンハンサーまたはプロモーター）を包含し得る。上昇したＩＯＰに対して感受性の例示的なプロモーターは、マトリックスＧｌａ蛋白質（ＭＧＰ）遺伝子からのプロモーターである（例えば、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるGonzalez et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, May 2004, 45(5): 1389参照）。選択的な標的化は、キチナーゼ３様１（「Ｃｈ３Ｌ１」）遺伝子の５’プロモーター領域を用いて、ＴＭの最外部の前および後部を特異的に指向する発現によってもまた達成されている（Liton et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005, 46: 183。参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。さらに、小柱網の数多くの遺伝子プロファイリング研究が発表されており、小柱網細胞選択的なプロモーターの追加の代替的な構成を提供している（Gonzalez et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2000, 41:3678-3693、Wirtz et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2002, 43:3698、Tomarev et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003, 44:2588-2596、Liton et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005, 46:183、Liton et al., Mol Vis. 2006, 12:774、Fan et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2008, 49:1886、Fuchshofer et al., Exp Eye Res. 2009, 88: 1020、Paylakhi et al., Mol Vis. 2012, 18:241、およびLiu et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2013, 54:6382。そのそれぞれはその全体が参照によって本明細書に組み込まれる）。
本発明の方法において、移植されるべき細胞は、ヒト投与のための十分に無菌の条件下で調製された等張性の賦形剤を含むいずれかの生理的に許容される賦形剤によってレシピエントに移入される。薬用製剤の一般的原則については、読者はCell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press, 1996を参照されたい。細胞の賦形剤および組成物のいずれかの付随する要素の選択は、投与に用いられる経路およびデバイスに従って適用されるであろう。細胞は注射、カテーテル、または同類によって導入され得る。細胞は液体窒素温度で凍結され、長時間保存され得、解凍時の使用ができる。凍結される場合に、細胞は１０％のＤＭＳＯ、５０％のＦＣＳ、４０％のＲＰＭＩ１６４０培地中で保存され得る。好ましい態様において、細胞はCryostor CS10などのアニマルフリー極低温保存緩衝液中で保存されるであろう。
本発明の医薬調製物は、任意に、所望の目的のための説明書のある好適な容器内にパッケージングされる。かかる製剤は、網膜分化および／または栄養因子のカクテルを、ＲＧ前駆体またはＲＧ細胞との組み合わせに好適な形態で含み得る。かかる組成物は、動物への移入に適当な好適な緩衝液および／または賦形剤をさらに含み得る。かかる組成物はさらにグラフトされるべき細胞をもまた含み得る。
医薬調製物
ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞は医薬的に許容される担体と調合され得る。例えば、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞は単独でまたは医薬製剤の構成要素として投与され得る。対象化合物は、医療への使用にとっていずれかの好都合なやり方での投与のために調合され得る。投与に好適な医薬調製物は、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を、１つ以上の医薬的に許容される無菌の等張性の水性もしくは非水性溶液（例えば平衡塩溶液（ＢＳＳ））、分散液、懸濁液、もしくはエマルション、または使用の直前に無菌の注射可能な溶液または分散液に水戻しされ得る無菌の粉末との組み合わせで含み得、これは抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、溶質、または懸濁もしくは粘稠薬剤を含有し得る。例示的な医薬調製物は、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞をALCON（登録商標）BSS PLUS（登録商標）（各ｍｌ中に、水中の塩化ナトリウム７．１４ｍｇ、塩化カリウム０．３８ｍｇ、塩化カルシウム二水和物０．１５４ｍｇ、塩化マグネシウム六水和物０．２ｍｇ、二塩基リン酸ナトリウム０．４２ｍｇ、重炭酸ナトリウム２．１ｍｇ、デキストロース０．９２ｍｇ、グルタチオンジスルフィド（酸化型グルタチオン）０．１８４ｍｇ、塩酸および／または水酸化ナトリウム（ｐＨをおよそ７．４に調整するため）を含有する平衡塩溶液）との組み合わせで含む。
投与されるときに、本開示への使用のための医薬調製物は発熱性物質不含の生理的に許容される形態であり得る。
ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を含む調製物は懸濁液、ゲル、コロイド、スラリー、または混合物によって移植され得る。さらに、調製物は望ましくは網膜または脈絡膜損傷の部位への送達のためにカプセル化されるか、または粘稠な形態で硝子体液中に注射され得る。また、注射時に、極低温保存したＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞は、網膜下注射による投与のための所望のオスモラリティおよび濃度を達成するために平衡塩溶液によって再懸濁もされ得る。調製物は、疾患によって完全に喪失しなかった黄斑辺縁部のエリアに投与され得、これは投与された細胞の接着および／または生存を促進し得る。例えば緑内障動物モデルを包含するいくつかの場合には、ＲＧ前駆体および／またはＲＧ細胞は硝子体内投与される。
ＲＧ前駆体細胞および／またはＲＧ細胞は本明細書に記載されるように凍結（極低温保存）され得る。解凍時に、かかる細胞の生存率は少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または約１００％であり得る（例えば、解凍後に集められた細胞の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは約１００％が生存可能であるか、または最初に凍結された細胞数の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは約１００％が解凍後に生存可能な状態で集められる）。
ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞は、眼内注射に好適な医薬的に許容される眼用基剤または製剤に調合され、送達され得る。いくつかの場合には、調製物は、細胞が例えば前眼房、後眼房、硝子体、房水、硝子体液、角膜、虹彩／毛様体、水晶体、脈絡膜、網膜、強膜、脈絡膜上腔（suprachoridal space）、結膜、結膜下腔、強膜外隙、角膜腔隙（intracorneal space）、角膜上隙（epicorneal space）、毛様体扁平部、手術誘発性の無血管領域、または黄斑のような眼の患部に浸透することを可能にするために十分な時間、眼の表面と接触して維持されるように設計される。
ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞は細胞のシートに含有され得る。例えば、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を含む細胞のシートは、細胞の無傷のシートが取り外され得る基質、例えば、温度応答性ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＰＮＩＰＡＡｍ）をグラフトした表面などの温度応答性ポリマー上でＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を培養することによって調製され得、この上で細胞は培養温度においては接着および増殖し、それから温度シフトによって表面の特徴が変改され、細胞の培養されたシートの取り外しを引き起こす（例えば、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）よりも下まで冷却することによる。例えば、da Silva et al., Trends Biotechnol. 2007 Dec; 25(12):577-83、Hsiue et al., Transplantation 2006 Feb 15; 81(3):473-6、Ide, T. et al. (2006); Biomaterials 27, 607-614、Sumide, T. et al. (2005), FASEB J. 20, 392-394、Nishida, K. et al. (2004), Transplantation 77, 379-385、およびNishida, K. et al. (2004), N. Engl. J. Med. 351, 1187-1196参照。そのそれぞれは参照によってその全体が本明細書に組み込まれる）。細胞のシートは移植に好適な基質、例えばシートがホスト生物に移植されたときにインビボで崩壊し得る基質に接着され得、例えば、細胞を移植に好適な基質上で培養すること、または細胞を別の基質（例えば温度応答性ポリマー）から移植に好適な基質上に取り外すことによって調製される。移植に好適な例示的な基質はゼラチンを含み得る（上記のHsiue et al.参照）。移植に好適な代替的な基質は、フィブリン系マトリックスおよび他を包含する。細胞のシートは、網膜変性の疾患の防止または処置のための医薬の製造に用いられ得る。
細胞のシートは、例えばＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞のシートの移植の中心窩下膜切除術を包含する外科手術または他の侵襲的治療に関係して、その必要がある眼に導入され得る。従って、細胞のシートは、中心窩下膜切除術に関係して、移植のための医薬の製造に用いられ得る。
本明細書に記載される方法に従って投与される調製物の体積は、投与モード、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の数、患者の年齢および体重、ならびに処置されようとする疾患の型および重度などの因子に依存し得る。例えば硝子体内注射によってなど、製剤を眼に局所投与するときには、製剤は最小体積が送達され得るように十分に濃縮されているべきである。例えば、注射によって投与される場合に、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の医薬調製物の体積は約１、１．５、２、２．５、３、４、もしくは５ｍｌ、または約１〜２ｍｌであり得る。例えば、注射によって投与される場合に、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の医薬調製物の体積は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１００、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、または２００μＬ（マイクロリットル）であり得る。例えば、本開示の調製物の体積は約１０〜５０、２０〜５０、２５〜５０、または１〜２００μＬであり得る。本開示の調製物の体積は約１０、２０、３０、４０、５０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、もしくは２００μＬ、またはより高くあり得る。
注射の濃度は有効且つ非毒性であるいずれかのレベルであり得、本明細書に記載される因子に依存する。患者の処置のためのＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の医薬調製物は少なくとも約１０３細胞／ｍｌの用量で調合され得、少なくとも約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または１０１０個のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞／ｍｌを包含する。医薬調製物は、少なくとも約１×１０３、２×１０３、３×１０３、４×１０３、５×１０３、６×１０３、７×１０３、８×１０３、９×１０３、１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、または９×１０４個のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞をμＬあたり含み得る。調製物は２０００個のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞をμＬあたり含み得、５０μＬあたり１００，０００個のＲＧ前駆体細胞もしくはＲＧ細胞、または９０μＬあたり１８０，０００個のＲＧ前駆体細胞もしくはＲＧ細胞を包含する。
ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の医薬調製物は少なくとも約１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、または９，０００個のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を含み得る。ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の医薬調製物は少なくとも約１×１０４、２×１０４、３×１０４、４×１０４、５×１０４、６×１０４、７×１０４、８×１０４、９×１０４、１×１０５、２×１０５、３×１０５、４×１０５、５×１０５、６×１０５、７×１０５、８×１０５、９×１０５、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、または９×１０１０個のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を含み得る。ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の医薬調製物は少なくとも約１×１０２〜１×１０３、１×１０２〜１×１０４、１×１０４〜１×１０５または、１×１０３〜１×１０６個のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を含み得る。ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の医薬調製物は少なくとも約１０，０００、２０，０００、２５，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１２５，０００、１５０，０００、１７５，０００、１８０，０００、１８５，０００、１９０，０００、または２００，０００個のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を含み得る。例えば、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の医薬調製物は、少なくとも約２０，０００〜２００，０００個のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を少なくとも約５０〜２００μＬの体積中に含み得る。さらに、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の医薬調製物は、約５０，０００個のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を１５０μＬの体積に、約２００，０００個のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を１５０μＬの体積に、または少なくとも約１８０，０００個のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を少なくとも約１５０μＬの体積に含み得る。
前述の医薬調製物および組成物において、ＲＧ前駆体細胞もしくはＲＧ細胞の数またはＲＧ前駆体細胞もしくはＲＧ細胞の濃度は、生存可能細胞を計数し、生存不能細胞を除外することによって判定され得る。例えば、生存不能なＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞は、生体染色色素（例えばトリパンブルー）を排除しないことによって、または機能アッセイ（例えば、培養基質に接着する能力など）を用いて検出され得る。加えて、ＲＧ前駆体細胞もしくはＲＧ細胞の数またはＲＧ前駆体細胞もしくはＲＧ細胞の濃度は、１つ以上のＲＧ前駆体細胞もしくはＲＧ細胞マーカーを発現する細胞を計数することおよび／またはＲＧ前駆体細胞もしくはＲＧ細胞以外の細胞型を示す１つ以上のマーカーを発現する細胞を除外することによって判定され得る。
網膜変性を処置する方法はさらに免疫抑制剤の投与を含み得る。用いられ得る免疫抑制剤は、抗リンパ球グロブリン（ＡＬＧ）ポリクローナル抗体、抗胸腺細胞グロブリン（ＡＴＧ）ポリクローナル抗体、アザチオプリン、BASILIXIMAB（登録商標）（抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体）、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、DACLIZUMAB（登録商標）（抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体）、エベロリムス、ミコフェノール酸、RITUXIMAB（登録商標）（抗ＣＤ２０抗体）、シロリムス、およびタクロリムスを包含するが、これに限定されない。免疫抑制剤は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／ｋｇで投与され得る。免疫抑制剤が用いられるときには、それらは全身または局所投与され得、それらは、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の投与に先立って、それと同時に、またはその後に投与され得る。免疫抑制治療は、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の投与後に数週間、数ヶ月、数年、またはいつまでも継続し得る。例えば、患者は、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の投与後に５ｍｇ／ｋｇシクロスポリンを６週間投与され得る。
網膜変性の処置の方法は、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞の単一の用量の投与を含み得る。代替的に、本明細書に記載される処置の方法は、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞が何らかの期間に渡って複数回投与される治療のクールを含み得る。例示的な処置のクールは毎週、隔週、毎月、年四回、年二回、または毎年の処置を含み得る。代替的に、処置は複数の用量が最初に投与され（例えば、第１週は毎日投与）、爾後に、より少ないかまたはより頻繁でない投与が必要とされる複数相で進み得る。
眼内注射を包含する注射によって投与される場合には、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞は患者の一生を通して定期的に１回以上送達され得る。例えば、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞は年に１回、６〜１２ヶ月毎に１回、３〜６ヶ月毎に１回、１〜３ヶ月毎に１回、または１〜４週間毎に１回送達され得る。代替的に、ある種の状態または障害にとっては、より頻繁な投与が望ましくあり得る。インプラントまたはデバイスによって投与される場合には、ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞は、処置されようとする特定の患者および障害または状態の必要に応じて、患者の一生を通して１回または定期的に１回以上投与され得る。同様に、経時的に変化する治療レジメンが企図される。例えば、出だしにはより頻繁な処置が必要とされ得る（例えば、毎日または毎週の処置）。経時的に、患者の状態が改善すると、より頻繁でない処置が必要とされ得るか、またはさらにはいかなるさらなる処置も必要とされ得い。
本明細書に記載される方法は、対象の網膜電図の応答、視運動視力閾値、または輝度閾値を測定することによって処置または防止の有効性をモニターするステップをさらに含み得る。方法は、細胞の免疫原性、あるいは細胞の遊走または眼における同化もしくは生存をモニターすることによって処置あるいは防止の有効性をモニターすることをもまた含み得る。
ＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞は、網膜変性を処置するための医薬の製造に用いられ得る。本開示は、失明の処置へのＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を含む調製物の使用をもまた包摂する。例えば、ヒトＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を含む調製物は、網膜損傷および失明をもたらすいくつもの視覚を変改する病気、例えば虚血再灌流損傷、網膜血管疾患、視神経損傷（自己免疫、外傷、および／またはウイルス系にかかわらない）、緑内障（型にかかわらない）、糖尿病網膜症（低酸素性および血管新生系にかかわらない）、および（レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）またはレーベル視神経萎縮症などの）遺伝性視神経症に随伴する網膜変性を処置するために用いられ得る。いくつかの態様において、ヒトＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を含む調製物は、単独でまたは他の療法（例えば、ＲＰＥ細胞および／または光受容体細胞集団などの他の細胞治療）と一緒に、黄斑変性（加齢黄斑変性、例えばウェット型の加齢黄斑変性およびドライ型の加齢黄斑変性を包含する）、網膜色素変性症、およびスターガルト病（黄色斑眼底）、鳥目、および色盲を処置するために用いられ得る。調製物は少なくとも約５，０００〜５００，０００個のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞を含み得る（例えば１００，０００個のＲＧ前駆体細胞またはＲＧ細胞）。
ＲＧ前駆体細胞およびＲＧ細胞いずれかまたは両方が用いられ得る。ヒト細胞はヒト患者および動物モデルまたは動物患者に用いられ得る。例えば、ヒト細胞は網膜変性のマウス、ラット、猫、犬、または非ヒト霊長類モデルにおいて試験され得る。加えて、ヒト細胞は、獣医学医療などのその必要がある動物を処置するために治療に用いられ得る。
ここで定める通り、単数形は例示的な目的のために提供されるが、語の複数版にもまた当てはまり得る。
本発明の種々の付番した態様が下に記載される。
１． 複数のＲＧ前駆体細胞と、
ＲＧ前駆体細胞の生存性を維持することに好適な培地と、
を含み、
調製物中の細胞の９０％超が免疫細胞化学的にＭａｔｈ５（＋）ならびに任意にＭａｔｈ５（＋）およびＢｒｎ３ａ（＋）である、
ＲＧ前駆体細胞の実質的に純粋な調製物。
２． 調製物中の細胞の９９％超が免疫細胞化学的にＭａｔｈ５（＋）ならびに任意にＭａｔｈ５（＋）およびＢｒｎ３ａ（＋）である、態様１のＲＧ前駆体細胞の実質的に純粋な調製物。
３． 調製物中の細胞の９９％超が免疫細胞化学的にＰａｘ６（−）およびＲｘ１（−）である、態様１または２のＲＧ前駆体細胞の実質的に純粋な調製物。
４． 調製物中の細胞が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ｂ（＋）および／またはＩｓｌ１（＋）である、態様１、２、または３のＲＧ前駆体細胞の実質的に純粋な調製物。
５． 複数のＲＧ前駆体細胞と、
ＲＧ前駆体細胞の生存性を維持することに好適な培地と、
を含み、
調製物中の細胞の９０％超が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ａ（＋）およびニューロフィラメント（＋）である、
ＲＧ前駆体細胞の実質的に純粋な調製物。
６． 調製物中の細胞がＴｈｙ１（＋）である、態様５のＲＧ前駆体細胞の実質的に純粋な調製物。
７． 少なくとも５０％のＲＧ前駆体細胞を含有する複数の細胞と、
ＲＧ前駆体細胞の生存性を維持することに好適な培地と、
を含み、
ＲＧ前駆体細胞が免疫細胞化学的にＭａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、および任意にＩｓｌ１（＋）である、
ＲＧ前駆体細胞の調製物。
８． 少なくとも５０％のＲＧ前駆体細胞を含有する複数の細胞と、
ＲＧ前駆体細胞の生存性を維持することに好適な培地と、
を含み、
ＲＧ前駆体細胞が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、および任意にＴｈｙ１（＋）である、
ＲＧ前駆体細胞の調製物。
９． 多能性幹細胞、成熟光受容体、および／またはアマクリン細胞を実質的に不含の複数のＲＧ前駆体細胞と、
ＲＧ前駆体細胞の生存性を維持することに好適な培地と、
を含み、
ＲＧ前駆体細胞が免疫細胞化学的にＭａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、および任意にＩｓｌ１（＋）である、
ＲＧ前駆体細胞の調製物。
１０． 多能性幹細胞、成熟光受容体、および／またはアマクリン細胞を実質的に不含の複数のＲＧ前駆体細胞と、
ＲＧ前駆体細胞の生存性を維持することに好適な培地と、
を含み、
ＲＧ前駆体細胞が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、および任意にＴｈｙ１（＋）である、ＲＧ前駆体細胞の調製物。
１１． （ａ）複数のＲＧ前駆体細胞（調製物中の細胞の９０％超が免疫細胞化学的にＭａｔｈ５（＋）ならびに任意にＭａｔｈ５（＋）およびＢｒｎ３ａ（＋）である）と、
（ｂ）哺乳動物患者への移植のために、ＲＧ前駆体細胞の生存性を維持するための医薬的に許容される担体と、
を含む、
哺乳動物患者への使用に好適であるＲＧ前駆体細胞の医薬調製物であって、。
１２． 調製物中の細胞の９９％超が免疫細胞化学的にＭａｔｈ５（＋）ならびに任意にＭａｔｈ５（＋）およびＢｒｎ３ａ（＋）である、態様１１の医薬調製物。
１３． 調製物中の細胞の９９％超が免疫細胞化学的にＰａｘ６（−）およびＲｘ１（−）である、態様１１または１２の医薬調製物。
１４． 調製物中の細胞が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ｂ（＋）および／またはＩｓｌ１（＋）である、態様１１、１２、または１３の医薬調製物。
１５． （ａ）複数のＲＧ前駆体細胞（調製物中の細胞の９０％超が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ａ（＋）およびニューロフィラメント（＋）である）と、
（ｂ）哺乳動物患者への移植のために、ＲＧ前駆体細胞の生存性を維持するための医薬的に許容される担体と、
を含む、
哺乳動物患者への使用に好適であるＲＧ前駆体細胞の医薬調製物。
１６． 調製物中の細胞が免疫細胞化学的にＴｈｙ１（＋）である、態様１５の医薬調製物。
１７． （ａ）複数のＲＧ前駆体細胞（調製物中の細胞の９０％超が免疫細胞化学的にＭａｔｈ５（＋）ならびに任意にＭａｔｈ５（＋）およびＢｒｎ３ａ（＋）である）と、
（ｂ）解凍時のＲＧ前駆体細胞の生存性と適合性の極低温保存剤系と、
を含む、少なくとも１０９個のＲＧ前駆体細胞を含む極低温細胞調製物。
１８． 調製物中の細胞の９９％超が免疫細胞化学的にＭａｔｈ５（＋）ならびに任意にＭａｔｈ５（＋）およびＢｒｎ３ａ（＋）である、態様１７の極低温細胞調製物。
１９． 調製物中の細胞の９９％超が免疫細胞化学的にＰａｘ６（−）およびＲｘ１（−）である、態様１７または１８の極低温細胞調製物。
２０． 調製物中の細胞が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ｂ（＋）および／またはＩｓｌ１（＋）である、態様１７、１８、または１９の極低温細胞調製物。
２１． （ａ）複数のＲＧ前駆体細胞（調製物中の細胞の９０％超が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ａ（＋）およびニューロフィラメント（＋）である）と、
（ｂ）解凍時のＲＧ前駆体細胞の生存性と適合性の極低温保存剤系と、
を含む、
少なくとも１０９個のＲＧ前駆体細胞を含む極低温細胞調製物。
２２． 調製物中の細胞が免疫細胞化学的にＴｈｙ１（＋）である、態様２１の極低温細胞調製物。
２３． ＲＧ前駆体細胞が多能性幹細胞に由来する、態様１〜２２のいずれか１つの調製物。
２４． 多能性幹細胞がヒト胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群から選択される、態様２３の調製物。
２５． ＲＧ前駆体細胞がヒト細胞である、先行する態様のいずれか１つの調製物。
２６． ＲＧ前駆体細胞がＨＬＡ遺伝子型的に同一である、先行する態様のいずれか１つの調製物。
２７． ＲＧ前駆体細胞がゲノム的に同一である、先行する態様のいずれか１つの調製物。
２８． ＲＧ前駆体細胞が８ｋｂよりも長い平均末端制限断片長（ＴＲＦ）を有する、先行する態様のいずれか１つの調製物。
２９． ＲＧ前駆体細胞が増大した細胞生存およびニューロン保護活性を有する、先行する態様のいずれか１つの調製物。
３０． ヒト患者への投与に好適である、態様１１〜１６のいずれか１つの調製物。
３１． 獣医学的な非ヒト患者への投与に好適である、態様１１〜１６のいずれか１つの調製物。
３２． ＲＧ前駆体細胞が普通の多能性幹細胞ソースに由来する、態様２３または２４の調製物。
３３． ＲＧ前駆体細胞の生存性を維持することに好適な培地が、培養培地、極低温保存剤、およびヒト患者の注射に好適な生体適合性の注射媒体からなる群から選択される、態様１〜１０のいずれか１つの調製物。
３４． ＲＧ前駆体細胞が、視神経挫滅モデルマウスの硝子体腔内に移植されたときに、外側の有核層まで遊走し、マウスのパターンＥＲＧの応答を改善および／または視神経再生を向上させる、先行する態様のいずれか１つの調製物。
３５． 調製物が発熱性物質およびマイトジェン（mycogen）不含である、態様１１〜１６のいずれか１つの調製物。
３６． ＲＧ前駆体細胞が１つ以上のニューロン保護因子を分泌する、先行する態様のいずれか１つの調製物。
３７． （ａ）多能性幹細胞由来ＲＧ細胞（細胞の６０％超が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、およびＴｕｊ１（＋）である）と、
（ｂ）幹細胞由来ＲＧ細胞の生存性を維持することに好適な培地と、
を含む、
多能性幹細胞由来ＲＧ細胞の実質的に純粋な調製物。
３８． 調製物中の細胞がＴｈｙ１（＋）である、態様３７の実質的に純粋な調製物。
３９． 細胞の約７０％が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、およびＴｕｊ１（＋）である、態様３７または３８の実質的に純粋な調製物。
４０． （ａ）多能性幹細胞由来ＲＧ細胞（調製物中の細胞の６０％超が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、およびＴｕｊ１（＋）である）と、
（ｂ）哺乳動物患者への移植のために、ＲＧ細胞の生存性を維持するための医薬的に許容される担体と、
を含む、
哺乳動物患者への使用に好適であるＲＧ細胞の医薬調製物。
４１． 調製物中の細胞がＴｈｙ１（＋）である、態様４０の医薬調製物。
４２． 細胞の約７０％が免疫細胞化学的にＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、およびＴｕｊ１（＋）である、態様４０の医薬調製物。
４３． 態様１１〜１６のいずれか１つのＲＧ前駆体細胞の医薬調製物もしくは態様４０のＲＧ細胞の医薬調製物または両方を患者に有効量で投与することを含む、患者のＲＧ細胞の喪失によって引き起こされる疾患または障害を処置する方法。
４４． 細胞の調製物が患者の網膜下腔に注射される、態様４３の方法。
４５． 細胞の調製物が硝子体内注射される、態様４３の方法。
４６． 眼領域前駆体細胞を、好ましくは細胞クラスターとして、好ましくは低接着または非接着条件下で、神経節細胞培地によって、細胞クラスターがＭａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、および任意にＩｓｌ１（＋）、またはＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、および任意にＴｈｙ１（＋）としてキャラクタリゼーションされるＲＧ前駆体細胞を含む個体の細胞スフィアを形成するために十分な時間培養するステップを含み、
眼領域前駆体細胞は、Ｐａｘ６（＋）およびＲｘ１（＋）ならびにＯｃｔ４（−）およびＮａｎｏｇ（−）としてキャラクタリゼーションされ、好ましくはＳｉｘ３（＋）、Ｓｉｘ６（＋）、Ｌｈｘ２（＋）、Ｔｂｘ３（＋）、Ｓｏｘ２（＋）、Ｏｔｘ２（＋）、およびネスチン（＋）としてもまたキャラクタリゼーションされ、これは免疫染色および／またはフローサイトメトリーによって判定される、
ＲＧ前駆体細胞を生ずる方法。
４７． 眼領域前駆体細胞が多能性幹細胞に由来する、態様４６の方法。
４８． 多能性幹細胞が胚性幹細胞または人工多能性幹細胞、任意にヒト胚性幹細胞またはヒト人工多能性幹細胞である、態様４７の方法。
４９． ＲＧ前駆体細胞が実質的に多能性幹細胞を不含で提供される、態様４６または４７の方法。
５０． ＲＧ前駆体細胞が、他の細胞型に関して少なくとも５０％純粋、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％純粋である、態様４６〜４９のいずれか１つの方法。
５１． ＲＧ前駆体細胞を極低温保存するさらなるステップを包含する、態様４６〜５０のいずれか１つの方法。
５２． （ａ）フィーダーフリー系によって多能性幹細胞を培養して、１つ以上の眼領域前駆体細胞を生ずること、
（ｂ）前記の１つ以上の眼領域前駆体細胞を培養して、Ｍａｔｈ５（＋）、Ｂｒｎ３ａ（＋）、Ｂｒｎ３ｂ（＋）、および任意にＩｓｌ１（＋）、またはＢｒｎ３ａ（＋）、ニューロフィラメント（＋）、および任意にＴｈｙ１（＋）であるＲＧ前駆体細胞を生ずること、
を含む、
多能性幹細胞由来ＲＧ前駆体細胞の実質的に純粋な培養物を調製するための方法。
５３． 神経節細胞培地によって眼領域（ＥＦ）前駆体細胞を培養することを含む、ＲＧ前駆体細胞を生ずる方法。
５４． ＥＦ前駆体細胞がＰａｘ６（＋）およびＲｘ１（＋）である、態様５３の方法。
５５． ＥＦ前駆体細胞がＳｉｘ３（＋）、Ｓｉｘ６（＋）、Ｌｈｘ（＋）、Ｔｂｓ（＋）である、態様５３または５４の方法。
５６． ＥＦ前駆体細胞がＳｏｘ２（＋）である、態様５３〜５５のいずれか１つの方法。
５７． ＥＦ前駆体細胞が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または約１００％のＥＦ前駆体細胞である細胞の集団として提供される、態様５３〜５６のいずれか１つの方法。
５８． 神経節細胞培地がNeurobasal（商標）培地などの基本培地を含む、態様５３〜５７のいずれか１つの方法。
５９． 神経節細胞培地がＢＤＮＦを含む、態様５３〜５８のいずれか１つの方法。
６０． ＢＤＮＦがヒトである、態様５９の方法。
６１． ＢＤＮＦが約１〜２００ｎｇ／ｍｌ、５〜５０ｎｇ／ｍｌ、もしくは約５〜２５ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、態様５９または６０の方法。
６２． 神経節細胞培地がＣＮＴＦを含む、態様５３〜６１のいずれか１つの方法。
６３． 前記のＣＮＴＦがヒトである、態様６２の方法。
６４． 前記のＣＮＴＦが約１〜２００ｎｇ／ｍｌ、５〜５０ｎｇ／ｍｌ、もしくは約５〜２５ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、態様６３の方法。
６５． 神経節細胞培地がフォルスコリンを含む、態様５３〜６４のいずれか１つの方法。
６６． 前記のフォルスコリンが約１〜２０μＭもしくは約１〜１０μＭ、または約５μＭの濃度で存在する、態様６５の方法。
６７． 神経節細胞培地が約０〜１０ｍｇ／ｍｌの間のＤ−グルコース、約２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌの間のＤ−グルコース、約３〜６ｍｇ／ｍｌの間のＤ−グルコース、約４〜５ｍｇ／ｍｌの間のＤ−グルコース、または約４．５ｍｇ／ｍｌのＤ−グルコースを含む、態様５３〜６６のいずれか１つの方法。
６８． 神経節細胞培地が１つ以上の抗生物質を含む、態様５３〜６７のいずれか１つの方法。
６９． １つ以上の抗生物質が、ペニシリンおよびストレプトマイシンからなる群から、任意に約０〜１００単位／ｍｌのペニシリンおよび約０〜１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの濃度で選択される、態様６８の方法。
７０． 神経節細胞培地がN2サプリメントを含む、態様５３〜６９のいずれか１つの方法。
７１． N2サプリメントが約０．１から５％または約１％の濃度で存在する、態様７０の方法。
７２． 神経節細胞培地がB-27サプリメント（調合０８００８５−ＳＡ）を含む、態様５３〜７１のいずれか１つの方法。
７３． B-27サプリメント（調合０８００８５−ＳＡ）が約０．０５〜５．０％もしくは約１．５〜２．５％、または約２．０％の濃度で存在する、態様７２の方法。
７４． 神経節細胞培地がグルタミンまたはGlutaMAX（商標）を含む、態様５３〜７３のいずれか１つの方法。
７５． 眼領域前駆体細胞が多能性幹細胞に由来する、態様５３〜７４のいずれか１つの方法。
７６． 多能性幹細胞がヒトＥＳ細胞またはヒトｉＰＳ細胞である、態様７５の方法。
７７． 多能性幹細胞がフィーダーフリーおよび／またはゼノフリー条件下で培養される、態様７５または７６の方法。
７８． 培養が約５〜４５日間起こる、態様５３〜７７のいずれか１つの方法。
７９． 培養が約５〜２０日間起こる、態様７８の方法。
８０． 培養が約３５〜４５日間起こる、態様７８の方法。
８１． 細胞を極低温保存することをさらに含む、態様７９または８０の方法。
８２． 細胞を網膜神経節細胞分化培地によって培養することによって網膜神経節（ＲＧ）細胞を生ずることをさらに含む、態様５３〜８０のいずれか１つの方法。
８３． 網膜神経節細胞分化培地がNeurobasal（商標）培地を含む、態様８２の方法。
８４． 網膜神経節細胞分化培地が、約０〜１０ｍｇ／ｍｌの間のＤ−グルコース、約２．５〜７．５ｍｇ／ｍｌの間のＤ−グルコース、約３〜６ｍｇ／ｍｌの間のＤ−グルコース、約４〜５ｍｇ／ｍｌの間のＤ−グルコース、または約４．５ｍｇ／ｍｌのＤ−グルコースを含む、態様８２または８３の方法。
８５． 網膜神経節細胞分化培地が１つ以上の抗生物質を含む、態様８２〜８４のいずれか１つの方法。
８６． 抗生物質が、ペニシリンおよびストレプトマイシンからなる群から、任意に約０〜１００単位／ｍｌの間のペニシリンおよび約０〜１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの濃度で選択される、態様８５の方法。
８７． 網膜神経節細胞分化培地がインスリン、ＢＤＮＦ、およびＣＮＴＦの１つ以上または全てを含む、態様８２〜８６のいずれか１つの方法。
８８． 網膜神経節細胞分化培地がインスリンを含む、態様８７の方法。
８９． インスリンがヒトインスリンである、態様８８の方法。
９０． インスリンが約５〜５０μｇ／ｍｌまたは約２０μｇ／ｍｌの濃度で存在する、態様８８または８９の方法。
９１． 網膜神経節細胞分化培地がＢＤＮＦを含む、態様８７〜９０のいずれか１つの方法。
９２． ＢＤＮＦがヒトである、態様９１の方法。
９３． ＢＤＮＦが約１〜２００ｎｇ／ｍｌ、５〜５０ｎｇ／ｍｌ、もしくは約５〜２５ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、態様９１または９２の方法。
９４． 網膜神経節細胞分化培地がＣＮＴＦを含む、態様８７〜９３のいずれか１つの方法。
９５． ＣＮＴＦがヒトである、態様９４の方法。
９６． ＣＮＴＦが約１〜２００ｎｇ／ｍｌ、５〜５０ｎｇ／ｍｌ、もしくは約５〜２５ｎｇ／ｍｌ、または約１０ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する、態様９３または９４の方法。
９７． 網膜神経節細胞分化培地がフォルスコリン、ｃＡＭＰ、およびＤＡＰＴの１つ以上または全てを含む、態様８２〜９６のいずれか１つの方法。
９８． 網膜神経節細胞分化培地がフォルスコリンを含む、態様９７の方法。
９９． 前記のフォルスコリンが約１〜２０μＭ、もしくは約１〜１０μＭ、または約５μＭの濃度で存在する、態様９８の方法。
１００． 網膜神経節細胞分化培地がｃＡＭＰを含む、態様９７の方法。
１０１． ｃＡＭＰが約５〜２００ｎｇ／ｍｌの間の濃度で存在する、態様１００の方法。
１０２． 網膜神経節細胞分化培地がＤＡＰＴを含む、態様９７の方法。
１０３． ＤＡＰＴが約１〜５０μＭの間の濃度で存在する、態様１０２の方法。
１０４． 網膜神経節細胞分化培地がB-27サプリメント（調合０８００８５−ＳＡ）を含む、態様８２〜１０３のいずれか１つの方法。
１０５． B-27サプリメント（調合０８００８５−ＳＡ）が約０．０５〜５．０％、約０．０５〜２．５％、または約２％の濃度で存在する、態様１０４の方法。
１０６． 網膜神経節分化培地がグルタミンまたはGlutaMAX（商標）を含む、態様８２〜１０５のいずれか１つの方法。
１０７． 網膜神経節分化培地がレチノイン酸を含む、態様８２〜１０６のいずれか１つの方法。
１０８． レチノイン酸が約１〜５０ｍＭ、約５〜４０ｍＭ、約１０〜３０ｍＭ、または約２０ｍＭの濃度で存在する、態様１０７の方法。
１０９． 細胞が網膜神経節細胞分化培地によって約７〜６０日間もしくは約１４〜３５日間または約２４日間培養される、態様８２〜１０６のいずれか１つの方法。
１１０． 網膜神経節前駆体細胞が培養物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％を含む、態様５３〜８０のいずれか１つの方法。
１１１． 網膜神経節前駆体細胞がマーカーＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、およびＩｓｌ１の１つ以上または全てを発現する、態様１１０の方法。
１１２． 網膜神経節前駆体細胞の少なくとも９０％、９４％、９６％、９８％、または９９％がＭａｔｈ５および任意にＢｒｎ３ａを発現する、態様１１１の方法。
１１３． 網膜神経節前駆体細胞がＰａｘ６（−）およびＲｘ１（−）である、態様１１１または１１２の方法。
１１４． 網膜神経節前駆体細胞の少なくとも９０％、９２％、または９４％がＰａｘ６（−）およびＲｘ１（−）である、態様１１３の方法。
１１５． 網膜神経節前駆体細胞がＢｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、およびＴｈｙ１の１つ以上または全てを発現する、態様５２〜８０のいずれか１つの方法。
１１６． 前記の網膜神経節前駆体細胞の少なくとも９０％、９２％、または９４％がＢｒｎ３ａおよびニューロフィラメントを発現する、態様１１５の方法。
１１７． 網膜神経節前駆体細胞がＭａｔｈ５（−）および／またはＢｒｎ３ｂ（−）である、態様１１５または１１６の方法。
１１８． 網膜神経節前駆体細胞を網膜神経節細胞に分化させることをさらに含む、態様５２〜８０のいずれか１つの方法。
１１９． 態様５２〜１１８のいずれか１つの方法に従って生じた網膜神経節前駆体細胞または網膜神経節細胞を含む組成物。
１２０． 網膜神経節前駆体細胞または網膜神経節細胞を含む組成物。
１２１． 前記の網膜神経節前駆体細胞が前記の組成物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または約１００％を含む、態様１１９または１２０の組成物。
１２２． 前記の網膜神経節細胞が前記の組成物中の細胞の少なくとも５０％、少なくとも６０％、または少なくとも７０％を含む、態様１１９または１２０の組成物。
１２３． 網膜神経節前駆体細胞がマーカーＭａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、およびＩｓｌ１の１つ以上または全てを発現する、態様１１９〜１２２のいずれか１つの組成物。
１２４． 網膜神経節前駆体の少なくとも９０％、９４％、９６％、９８％、または９９％がＭａｔｈ５および任意にＢｒｎ３ａを発現する、態様１２３の組成物。
１２５． 網膜神経節前駆体細胞がＰａｘ６（−）およびＲｘ１（−）である、態様１２３または１２４の組成物。
１２６． 網膜神経節前駆体細胞の少なくとも９０％、９２％、または９４％がＰａｘ６（−）およびＲｘ１（−）である、態様１２５の組成物。
１２７． 網膜神経節前駆体細胞がＢｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、およびＴｈｙ１の１つ以上または全てを発現する、態様１１９〜１２２のいずれか１つの組成物。
１２８． 網膜神経節前駆体細胞の少なくとも９０％、９２％、または９５％がＢｒｎ３ａおよびニューロフィラメントを発現する、態様１２７の組成物。
１２９． 網膜神経節前駆体細胞がＭａｔｈ５（−）およびＢｒｎ３ｂ（−）である、態様１２７または１２８の組成物。
１３０． 網膜神経節細胞がＢｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、およびＴｕｊ１の１つ以上または全てを発現する、態様１１９〜１２２のいずれか１つの組成物。
１３１． 網膜神経節前駆体細胞が極低温保存される、態様１１９〜１２９のいずれか１つの組成物。
１３２． 網膜神経節前駆体細胞の約８０〜９０％の間が解凍後に回復される、態様１３１の組成物。
１３３． 態様１１９〜１２０のいずれか１つの組成物または態様１３１もしくは１３２の組成物を、解凍後に前記の個体に投与することを含む、その必要がある個体の処置の方法。
１３４． 組成物が眼、網膜下腔、または硝子体内に投与される、態様１３３の方法。
１３５． 眼領域前駆体細胞を神経節細胞培地によって培養することが、（ｉ）眼領域前駆体細胞を破砕して細胞クラスターを得ることと、（ｉｉ）細胞クラスターを低接着条件下でプレーティングしてスフィアを形成することとを含む、態様５２〜８０および８２〜１１７のいずれか１つの方法。
１３６． ステップ（ｉ）が、低接着プレート上で細胞を培養することを含む、態様１３５の方法。
１３７． 破砕が機械的または酵素的破壊によって実施される、態様１３５または１３６の方法。
１３８． 細胞を網膜神経節細胞分化培地によって培養することが、細胞を単細胞に解離させることと、スフィアをマトリゲル（商標）、ラミニン、またはコラーゲン上にプレーティングすることとを含む、態様１３５〜１３７のいずれか１つの方法。
１３９． 解離した細胞をラミニン上にプレーティングすることを含む、態様１３８の方法。
１４０． 解離した細胞をポリ−Ｄ−リジン／ラミニンコーティングプレート上にプレーティングすることをさらに含む、態様１３８の方法。
１４１． 解離した細胞がｃｍ２あたり１０〜４０細胞の密度でプレーティングされる、態様１３９または１４０の方法。
次は本発明を例示するための例であり、本発明の範囲を限定すると見なされるべきではない。
例１．多能性幹細胞からのＲＧ前駆体細胞およびＲＧ細胞産生
１．ヒト胚性幹細胞をフィーダーフリー条件下でmTESR1培地（Stem Cell Technology）によってマトリゲル（商標）（BD Biosciences）上で培養する。８０〜９０％のコンフルエンス時には、細胞は継代または凍結されることを必要とする。幹細胞の継代は酵素的（例えばディスパーゼ）または非酵素的（例えば、ＰＢＳ系細胞解離緩衝液、Invitrogen）手法を用いて実施する。
２．直接分化方法を網膜ニューロン／前駆体の作製のために用いる。胚様体ステップはない。
３．第０日：細胞分化を１５〜２０％コンフルエンスにおいて誘導する。培地を網膜誘導（ＲＩ）培地に交換する：４．５ｍｇ／ｍｌのＤ−グルコース、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１％のN2サプリメント（Invitrogen）（０．１〜２％）、０．２％のB27サプリメント（０．０５〜２％）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、５０ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎ（１０〜５００ｎｇ／ｍｌ）、および２０μｇ／ｍｌヒトインスリン（５〜５０μｇ／ｍｌ）を補ったＤＭＥＭ／Ｆ１２。
４．第１日〜第４日：毎日、完全な培地交換。
５．第５日：細胞培養物は第５日に８０〜９０％コンフルエンスになる。培地を神経分化（ＮＤ）培地に交換する：４．５ｍｇ／ｍｌのＤ−グルコース、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１×GlutaMAX（商標）、１％のN2サプリメント（Invitrogen）（０．１〜２％）、２％のB27サプリメント（０．５〜２％）、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、および５０ｎｇ／ｍｌのＮｏｇｇｉｎ（１０〜５００μｇ／ｍｌ）を補ったNeurobasal（商標）培地（Life Technologies）。
６．第６日〜第１３日：細胞をＮＤ培地によって維持する。培地を２日毎に交換する。細胞のコロニーはＮＤ培地によって生育することを継続する。辺縁の細胞はフラットで大きくなり、一方で中央の細胞はより小さく、コンパクトな細胞クラスターを形成する。第１０〜１１日に、細胞はＰＡＸ６を発現し始め、次に第１２日にＲｘ１発現の開始がある（図１Ａ）。ＲＴ−ＰＣＲはＯｃｔ４およびＮａｎｏｇ発現の喪失を示した（図１Ｂ）。第１３日に、フローサイトメトリーによって定量すると９０％超の細胞はＰａｘ６およびＲｘ１を共発現している（図２Ａ）。細胞の９９％超がＯｔｘ２、ネスチン、およびＳｏｘ２を発現している（図２Ｂ）。これらの結果は、それらが眼領域前駆体細胞になるということを示している。
７．第１４日〜第１９日：第１５日に培地を神経節細胞（ＧＣ）培地に交換する：４．５ｍｇ／ｍｌのＤ−グルコース、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１×GlutaMAX（商標）、１％のN2サプリメント（０．１〜２％）、２％のB27サプリメント（調合番号０８００８５−ＳＡ）（０．５〜２％）、５μＭフォルスコリン（１〜２０μＭ）、１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ（１〜２００ｎｇ／ｍｌ）、および１０ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦ（１〜２００ｎｇ／ｍｌ）を補った神経基本培地。
８．第２０日〜第３５日：第２０日に、細胞を生育表面から取り、ＧＣ培地中で機械的にクラスターに破砕する。細胞クラスターを１００ｍｍ超低接着培養皿に移入する。細胞クラスターは丸まり、懸濁培養物中に個体のスフィアを形成する。培地を３日毎に交換する。第３５日に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、Ｍａｔｈ５、Ｂｒｎ３ａ、Ｂｒｎ３ｂ、およびＩｓｌ１の発現の強い上方制御を示した（図３Ａ）。フローサイトメトリーは、＞９９％の細胞が転写因子Ｍａｔｈ５およびＢｒｎ３ａを発現しているということを示した。約９４％のＭａｔｈ５陽性細胞がＰＡＸ６について陰性に染色した（図３Ｂ）。
９．第３６日〜第６０日：神経スフィア培養物をＧＣ培地によって維持し、培地を３〜４日毎に交換する。第６０日に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲはＢｒｎ３ａの継続した発現を示した。Ｍａｔｈ５およびＢｒｎ３ｂの発現レベルは非常に下方制御されていた（図４）。フローサイトメトリーは、細胞の９５．３％がＢｒｎ３ａおよびニューロフィラメントを共発現しているということを示した。
１０．ＲＧ前駆体細胞からＲＧ細胞への分化：
ａ．Accutase（登録商標）細胞解離緩衝液を用いて細胞を単細胞に解離させる。細胞をポリ−Ｄ−リジン／ラミニンコーティングプレート上に１０〜４０／ｃｍ２の密度でＲＧＣ分化培地によってプレーティングする：４．５ｍｇ／ｍｌのＤ−グルコース、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１×GlutaMAX（商標）、２％のB27サプリメント（調合番号０８００８５−ＳＡ。ＧＣ培地と同じ）、５μＭフォルスコリン、１０ｎｇ／ｍｌのＢＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍｌのＣＮＴＦ、１００ｎｇ／ｍｌのｃＡＭＰ、１〜５０μＭのＤＡＰＴ、２μＭレチノイン酸、および２０μｇ／ｍｌヒトインスリンを補った神経基本培地。半分の培地を２日毎に交換する。
ｂ．２週間後に、細胞の約７２％はＴｈｙ１について陽性に染色した（図５）。細胞は樹状突起および軸索を有した（図６Ａ）。免疫染色はＢｒｎ３ａ、ニューロフィラメント、およびＴｕｊ１の発現を示した（図６Ｂ）。
例２．緑内障の実験モデルにおけるＲＧ前駆体細胞（レーザー光凝固を用いる）
図７に略示されているように、緑内障の実験動物モデルを用いてインビボのＲＧ前駆体細胞の効果を研究した。このモデル系では、慢性の眼内圧（ＩＯＰ）上昇を小柱網レーザー光凝固によって３月齢の雄Ｂｒｏｗｎ−Ｎｏｒｗａｙラットに誘導した。５μｌのＰＢＳ中に懸濁した２×１０５個のＲＧ（初期）前駆体細胞を翌日に硝子体腔部に注射した。ＰＢＳをコントロールの眼球に注射した。全てのラットはTonoLabによる明暗期ＩＯＰ測定を週あたり２回受けた（処置の２週間前から処置の５週間後まで）。シクロスポリンＡを処置の１週間前から処置の５週間後まで水によって投与した。処置の５週間後に、網膜神経節（ＲＧ）細胞のトポグラフィー定量をＲｂｐｍｓ免疫組織化学を用いて実施した。コントロールの眼では２７．３％のＲＧ細胞の平均の細胞喪失があり、一方で、細胞処置群では有意により少ないＲＧ細胞死があり、平均１３．５％であった（図８）。この結果は、緑内障ラットモデルのＲＧ前駆体細胞処置によるＲＧ細胞死のレスキューを示唆している。
例３：ヒトＲＧ前駆体細胞およびＲＧ細胞の極低温保存
初期ＲＧ前駆体細胞（例１のステップ８）および後期ＲＧ前駆体細胞（例２のステップ９）は、Cryostor CS10などのアニマルフリー極低温保存緩衝液、または９０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯなどの別の極低温保存緩衝液中のニューロスフィアとして凍結され得る。ＲＧ細胞も同じくこれらの緩衝液中で極低温保存され得る。
例４：緑内障実験モデル（マイクロビーズ（ＭＢ）注射）におけるｈＥＳＣおよび／またはｉＰＳＣに由来するＲＧＣＰの移植
ｈＥＳＣおよびｉＰＳＣからのＲＧＣＰの作製
ｈＥＳＣ株ＧＦＰ−Ｈ１（ＷＡ０１でＮＩＨ登録されている。インビボにおける容易な同定のためにＧＦＰを発現する）およびｉＰＳＣ株ＨＡ１（ゲノムインテグレーションなしでｍＲＮＡによって作製されている３１）は、以前に報告されているように維持する３１。本明細書に記載されるように定型的および継続的に実施されるプロセスにおいては、これらの細胞を先ずＥＦＰに分化させ、次に、ＥＦＰをマトリゲル上にプレーティングし直し、本明細書に記載される条件下で培養することによって、異なる発生ステージのＲＧＣＰの作製をする。分化プロセスの間に、ＥＦＰ遺伝子（Ｐａｘ６、Ｒｘ１、ネスチン、およびＳｏｘ２）の発現をモニターする。インビボ移植前に、後期ステージＲＧＣＰ（ニューロフィラメント＋Ｂｒｎ３ａ＋Ｍａｔｈ５−）を収集し、Accutase（登録商標）を用いて単細胞懸濁液に解離させる。
緑内障マウスへのＲＧＣＰ移植
成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスが、ＰＢＳ（コントロールとして）または高眼圧（緑内障）を誘導すると以前に記載されたマイクロビーズいずれかの前眼房注射を受けた２９。正常なＩＯＰを有するＰＢＳ注射したコントロールをレシピエントマウスの群に追加して、グラフトされたＲＧＣＰの生存が緑内障疾患プロセスによって影響されるかどうかを検討した。
ＰＢＳまたはマイクロビーズ注射の７日後に、ＧＦＰ−ｈＥＳＣまたはＨＡ１−ｉＰＳＣ由来ＲＧＣＰ（１００，０００細胞／μｌ）または基剤コントロール溶液を、正常ＩＯＰ（ＰＢＳ注射）および緑内障（マイクロビーズ注射）マウス両方に硝子体内注射した。この時点は、移植が、疾患の症状を現す患者の臨床像とより良く整合するように選択した。他の報告と一致して９、予備的な研究においては、グラフトされた細胞は、免疫特権部位と考えられるマウスの眼において免疫抑制剤の不在下で移植の８週間後まで生存するということが観察された（図１３、１４、および１６）。
網膜のＲＧＣの電気的活性をモニターするｐＳＴＲを４および８週間の時点で測定し、ベースライン値を得るために第１の測定がマイクロビーズ注射の１〜２日前からとられた。コントロールおよび緑内障マウスをｐＳＴＲ試験を用いて４および８週間に分析した。
移植されたＲＧＣＰの治療有効性を評価するために用いられた別の試験は視運動性反射（ＯＫＲ）である。ＯＫＲは、流れて行く縞パターンを眼および頭部の動きによってトラッキングすることによって視力およびコントラスト感度を測定する。緑内障マウスは、ＯＫＲアッセイにおいて、低下した視力なしに劇的に減少して行く視覚コントラスト感度を見せる。これらの観察はヒト患者において見られるものと一致している３７，３８。ベースラインＯＫＲはマイクロビーズ注射の１〜２日前に記録し、視覚機能および網膜形態の変化の継続的な評価のために、ＰＢＳまたはマイクロビーズ注射の８週間後にＯＫＲを評価した。
グラフトされた細胞の生存を維持するために免疫抑制が必要とされるかどうかを試験するために、免疫抑制剤シクロスポリンＡによる処置に付したマウスを研究する。マウスのこの群は、移植の１日前に出発する飲み水中のシクロスポリンＡの毎日処置を屠殺まで受ける。
移植されたＲＧＣＰの治療有効性を評価するために用いられる別の試験は視覚誘発電位（ＶＥＰ）である。ＶＥＰは、視覚刺激に応答して皮質によって生ずる総体的な電気シグナルを測定する。緑内障マウスは、長引くＮ１潜時および減縮したＰ１−Ｎ１振幅をＶＥＰにおいて見せる。これらの観察はヒト患者において見られるものと一致している３７，３８。ベースラインＶＥＰはマイクロビーズ注射の１〜２日前に記録する。
全ての実験群において、視覚機能および網膜形態の変化の継続的な評価のために、ＶＥＰおよびＳＤ−ＯＣＴをＰＢＳまたはマイクロビーズ注射の４、８、および１２週間後に評価する。ｐＳＴＲおよびＯＫＲをＰＢＳまたはマイクロビーズ注射の１２週間後まで分析する。ＰＢＳまたはマイクロビーズ注射の１２週間後に、最後のＶＥＰ、ＯＫＲ、ｐＳＴＲ、およびＳＤ−ＯＣＴ評価の後にマウスを屠殺する。網膜および視神経切片を以前に記載されたように調製する２９。網膜切片をＴｕｊ１またはＢｒｎ３ｂなどのＲＧＣ特異的マーカーに対する抗体によって免疫標識し、核マーカーＤＡＰＩによって対比染色して、ホストのＲＧＣ形態および網膜層状構造を明らかにする。腫瘍形成を生体動物のＳＤ−ＯＣＴによってモニターし、網膜切片で検査する。軸索の計数を記載されているように視神経切片に実施して２９、ＲＧＣＰ移植後の軸索変性／保護を測定する。
これらの後期の時点のグラフトされた細胞の生存を、ＩＯＰ上昇ありまたはなしのマウス（ＰＢＳ注射対マイクロビーズ注射）で評価し、免疫抑制を受けることありまたはなしのマウスの群間でもまた比較する。
加えて、臨床的に適用可能な非侵襲的イメージング技術のスペクトラルドメイン光干渉トモグラフィー（ＳＤ−ＯＣＴ）を用いて網膜形態をモニターし、これは潜在的な腫瘍形成ならびに神経節細胞層（ＧＣＬ）および神経線維層（ＮＦＬ）厚の測定を包含する。他では、生体の緑内障マウスにおける神経節細胞複合体（ＧＣＣ）層（これはＧＣＬおよびＮＦＬを包含する）の薄化の定量のためのＳＤ−ＯＣＴの首尾良い適用を報告しており３０、緑内障の患者において見られるものと一致する発見である。
統計分析
データは平均±標準偏差として表し、Windows向けのGraphPad Prism 5.01（GraphPad Software Inc）によって分析する。対応のあるＡＮＯＶＡおよびMann-Whineyを統計分析に用いる。差はｐ＜０．０５で有意と考える。
結果
先の例によって明証されたように、ＲＧＣＰの高度に均質な（＞９５％）集団を作製するためのヒトＰＳＣの確かな分化を可能にする新規の手順が、本開示に従って開発された。その上に、かかるＲＧＣＰを緑内障マウスに移植したときには、免疫組織化学、ｐＳＴＲ、およびＯＫＲによって測定された有意に改善したＲＧＣの生存（図１３Ａ）および機能（図１４Ａ〜Ｄ）が観察された。これらのデータは、移植されたＲＧＣＰが緑内障において視覚を保つことができるということを示している。
例５：ＲＧＣＰ移植後のＲＧＣ様細胞のキャラクタリゼーション
例５は、（１）緑内障マウス網膜への移植後にＲＧＣ様細胞に分化するＲＧＣＰのパーセンテージ、（２）免疫組織化学およびＲＮＡシーケンシング（ＲＮＡ−ｓｅｑ）を用いるヒトＥＳＣおよびｉＰＳＣ由来ＲＧＣ様細胞の形態的および分子的特性を調べ、（３）それらの細胞の遺伝子プロファイルを分析する。
緑内障マウスへのＲＧＣＰ移植と、ＲＧＣ様細胞へのＲＧＣＰ分化のパーセンテージの定量
ＲＧＣＰは例１および４に記載されているようにＧＦＰ＋ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣから作製される。成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスがマイクロビーズの前眼房注射を受けて、この緑内障モデルに高眼圧を誘導した２９。マイクロビーズ注射の７日後に、ＧＦＰ−ｈＥＳＣまたはＨＡ１−ｉＰＳＣ由来ＲＧＣＰ（１００，０００細胞／μｌ）を、シクロスポリン−Ａの毎日処置ありまたはなしの緑内障マウスに硝子体内注射する。予備的な分析はシクロスポリン−Ａの不在下でＲＧＣＰの生存および分化のいずれかの異常を検出しなかったが、細胞表現型およびトランスクリプトームの比較は、グラフトされたＲＧＣＰに及ぼす免疫抑制剤の効果に関して追加の情報を提供する。ＲＧＣＰ分化を定量的に評価するために、網膜フラットマウントを移植の３週間後に収集し、ＲＧＣ特異的マーカー、例えばＢｒｎ３ｂおよびＴｕｊ１について免疫標識する。グラフトされたＲＧＣＰはＧＦＰ発現またはヒト特異的ミトコンドリア抗体によって同定する。グラフトされた細胞（ＧＦＰ＋）およびＲＧＣ様細胞（ＧＦＰ＋／Ｂｒｎ３ｂ＋）をそれぞれ計数し、ＲＧＣ様細胞（ＧＦＰ＋／Ｂｒｎ３ｂ＋）になるグラフトされたＲＧＣＰのパーセンテージを計算する。他の網膜細胞マーカーの免疫検出（例えば、アマクリン細胞、双極細胞、光受容体、およびミュラー細胞）をもまた以前に記載されたように実施して９，２８，３９、グラフトされたＲＧＣＰが他の網膜細胞型に発生するかどうかを判定する。シナプトタグミン、ＰＳＤ−９５、ＧｌｕＲ２／３などのプレおよびポストシナプスマーカーの免疫標識をもまた実施し、プレ（例えばシナプトタグミン）およびポスト（例えばＰＳＣ９５）シナプスマーカーの共局在は機能的なシナプスの形成を示唆する４０，４１。
ＲＧＣ分化のゲノムワイドな徴候のベリフィケーション
グラフトされたＲＧＣＰを（細胞分化を可能にするために）移植の３週間後に、それらのＧＦＰ発現に基づいてＦＡＣＳによってマウス網膜から単離する。トータルＲＮＡを、単離されたＧＦＰ＋ＲＧＣＰならびに培養されたＥＦＰ（Ｐａｘ６＋、Ｒｘ１＋、ネスチン＋、およびＳｏｘ２＋発現によってベリフィケーションされる）およびＲＧＣＰ（ニューロフィラメント＋／Ｂｒｎ３ａ＋／Ｍａｔｈ５−）から抽出する。４つの注射された網膜から容易に単離され得る約４０，０００個のグラフトされた細胞は、ＲＮＡのこの分析に要求される量を提供するために十分である。簡略には、ＲＮＡ−ＳｅｑのライブラリーをIllumina Truseqキットｖ２を用いて作製し、Illumina HiSeqによってシーケンシングした。配列をヒトトランスクリプトームに対してアラインメントして、アラインメントしたＢＡＭファイルを生じ、公知の遺伝子および転写物をCufflinksアルゴリズムを用いて定量する。遺伝子および公知の転写物の差次的発現を遺伝子アノテーションによって判定する。GSEAアルゴリズムによるGene Set Enrichment AnalysisおよびIngenuity Pathway Analysisを実施する。関心の候補転写物をｑＰＣＲによってベリフィケーションする。グラフトされたＲＧＣＰ、ならびにＥＳＣおよびｉＰＳＣ由来培養物から直接とられたＥＦＰおよびＲＧＣＰから得られたデータを比較する。ＲＧＣ系譜のアイデンティティに対応する遺伝子の発現（例えば、ＰＯＵ、Ｉｓｌｅｔ１、Ｉｓｌｅｔ２、Ｔｈｙ１．１）４２を、細胞がＥＦＰからＲＧＣＰに分化する際、および移植されたＲＧＣＰの分化によってインビボで生ずるＲＧＣ様細胞においてもまたモニターする。光受容体特異的マーカーなどの他の網膜細胞遺伝子の発現もまたＲＧＣＰおよびＲＧＣ様細胞においてモニターする。
統計分析
データは平均±標準偏差として表し、Windows向けのGraphPad Prism 5.01（GraphPad Software Inc）によって分析する。対応のあるＡＮＯＶＡおよびMann-Whineyを統計分析に用いる。差はｐ＜０．０５で有意と考える。
例６：ＲＧＣＰの移植
例６は、ＲＧＣＰの移植が、移植された細胞から成熟ＲＧＣへの分化と脳に接続する視神経への長い軸索伸長とによって、視覚喪失を逆行させるか、または機能を取り戻すかどうかを調べる。
視神経挫滅損傷したマウスへのＲＧＣＰ移植
ＲＧＣＰは例１および４に記載されているようにＧＦＰ＋ｈＥＳＣまたはｉＰＳＣから作製した。ＧＦＰ＋ｈＥＳＣ−ＲＧＣＰは、移植後のｈＥＳＣ−ＲＧＣＰの運命をそれらのＧＦＰ発現によって追跡することがより容易であったので用いた。成体Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスが、以前に記載されたように、全ての視神経軸索の完全な損傷に至る視神経挫滅損傷を受けた２２。ＧＦＰ＋ｈＥＳＣ−ＲＧＣＰ（１００，０００細胞／μｌ）または基剤コントロール溶液を、損傷の７日後にそれらのマウスに硝子体内注射した。マウスは損傷の８週間後に屠殺した。
網膜フラットマウントおよび縦方向の視神経切片をＲＧＣの生存、分化、および神経成長の定量のために次のように調製した。（１）ＲＧＣの生存および分化を分析するために、網膜フラットマウントをＴｕｊ１によって免疫標識して内因性の（ホスト）および新しい（ＧＦＰ＋）ＲＧＣを同定した。生存しているホストＲＧＣ（Ｔｕｊ１＋のみ）の数および新しく作製されたＲＧＣ（ＧＦＰ＋／Ｔｕｊ１＋）の数を記録した。ＲＧＣマーカーＴｕｊ１を発現する移植された（ＧＦＰ＋）細胞のパーセンテージを計算した（計数したＧＦＰ＋／Ｔｕｊ１＋細胞を総ＧＦＰ＋細胞によって除算することによる）。他の網膜細胞マーカーの免疫検出をもまた実施して、グラフトされたＲＧＣＰが追加の細胞型に発生するかどうかを判定した。（２）軸索の生存および再成長を評価するために、縦方向の視神経切片をニューロフィラメント蛋白質に対する一次抗体によって染色して内因性の軸索を明らかにし、一方で、新しい軸索はＧＦＰ標識によって同定した。
ホスト軸索の全てが損傷の４週間後までに挫滅部位を越えて損傷および変性していることと、再生して来る軸索のみが挫滅部位の後ろに見いだされるということとが予想される。この目的で、縦方向の神経切片中の新しいＧＦＰ＋軸索の数およびそれが進んだ距離を定量した。新しい軸索が脳の中枢標的に達したかどうかを判定するために、マウス脳切片を収集した。外側膝状体および上丘を包含する視索および視神経の中枢標的に見いだされるＧＦＰ＋軸索の数を記録した。その上に、シナプトフィジンおよびＰＳＤ９５などのシナプスマーカーの免疫標識を脳切片に実施して、ＧＦＰ＋軸索がシナプスを発達させ、プレシナプスマーカーを発現するかどうかを判定した。
他のマウスは損傷の４、８、および１２週間後に屠殺する。ＲＧＣＰ移植の潜在的な機能的な利益を、ＶＥＰ、ｐＳＴＲ、およびＯＫＲを損傷の１〜２日前および屠殺前に記録することによって評価する。ＳＤ−ＯＣＴをもまた実施して、生体マウスの網膜形態をモニターする。
統計分析
データは平均±標準偏差として表し、Windows向けのGraphPad Prism 5.01（GraphPad Software Inc）によって分析する。対応のあるＡＮＯＶＡおよびMann-Whineyを統計分析に用いる。差はｐ＜０．０５で有意と考える。
結果
視神経損傷の３週間後に、ＧＦＰ＋細胞はホスト網膜に再定着し、長い神経突起を伸長させた。移植した細胞のほぼ全て（＞９５％）がＴｕｊ１＋ＲＧＣに分化した（図１６Ａ〜Ｃ）。共焦点およびライトシート顕微鏡法両方を用いて、グラフトされたＲＧＣＰが神経節細胞層に同化し（図１６Ｄ〜Ｅ）、プレおよびポストシナプスマーカーの共局在によって明証される機能的なシナプスを発達させる（図１６Ｆ〜Ｊ）ことが観察された。これらのデータは、ｈＥＳＣ由来ＲＧＣＰが、視神経損傷マウスへの移植後にＲＧＣ様細胞に分化し、ホスト網膜に同化し、機能的なシナプスを発達させ、喪失した細胞を代替し得るということを支持している。
結論
研究および治療のためにヒト網膜神経節細胞前駆体（ＲＧＣＰ）の純粋な再生可能な集団を提供することに際しての限界を克服するために、ヒト多能性幹細胞（ＰＳＣ）から網膜ニューロンへの確かな分化のための明確な方法が開発された。この方法は複数のｈＥＳＣおよびｉＰＳＣ株（胚盤胞または単一の割球からの５つのｈＥＳＣ株、エピソーマルベクターまたはｍＲＮＡリプログラミングによって得られた６つのｉＰＳＣ株）を用いて実施されて、ＲＧＣＰの高度に均質な（＞９５％）集団を作製した。この方法は全てのそれらの株の網膜分化プロセスを同調させることができ、一貫してＰＳＣから眼領域前駆体（ＥＦＰ、図２）１６〜１８、初期ＲＧＣＰ（Ｍａｔｈ５＋、図３Ｂおよび４）１９〜２１、および後期ＲＧＣＰ（Ｍａｔｈ５−／Ｔｈｙ１．１＋、図３Ｂ、４、および５）への段階的な分化に至り、これはインビトロおよびインビボにおける成熟ＲＧＣの作製に至った（図１３Ａ、１４Ａ〜Ｂ、および１６Ａ〜Ｊ）。
これらの細胞の治療能力を試験するための予備的な研究では、ＧＦＰ＋ｈＥＳＣ−ＲＧＣＰを人工緑内障のマウスの硝子体に注射した。ＲＧＣＰ移植を受けた緑内障マウスにおいて、有意に改善したＲＧＣ生存が観察され（図１３Ａ、下パネル）、ＲＧＣ機能の尺度である陽性の暗所閾値電位（ｐＳＴＲ）の増大した振幅を伴った（図１４Ａ〜Ｃ）。
重度の視神経症におけるＲＧＣＰの治療能力をさらに立証するために、かかる細胞が視神経挫滅損傷モデルにおいて喪失したＲＧＣを代替し新しい軸索を形成する能力を分析した。結果は、移植された細胞の全てがＴｕｊ１＋ＲＧＣに分化し、細胞注射の３週間後に確かな遊走、同化、および新しい神経突起の形成を示したということを明らかにした（図１６Ａ〜Ｊ）。
これらの組み合わされた結果は、ヒトＰＳＣ−ＲＧＣＰが緑内障治療に用いられ得、視神経症の他の形態の処置にもまた用いられ得るということを示している。
表１
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Claims (12)

  1. ヒト網膜神経節（ＲＧ）前駆体細胞の調製物を生ずる方法であって、
    ヒト眼領域前駆体細胞を、細胞クラスターとして、低接着または非接着条件下で、細胞培地中で培養し、ヒトＲＧ前駆体細胞を含む細胞スフィア細胞を形成させることを含み、
    ここでヒト眼領域前駆体細胞が、Ｐａｘ６（＋）、Ｒｘ１（＋）、Ｏｃｔ４（−）およびＮａｎｏｇ（−）であり、かつ
    細胞培地が、フォルスコリン、ＢＤＮＦおよびＣＮＴＦの１以上を含む、
    前記方法。
  2. ヒト網膜神経節（ＲＧ）前駆体細胞の調製物を生ずる方法であって、
    （ａ）ヒト眼領域前駆体細胞をヒトＲＧ前駆体細胞へ分化させるために、細胞培地中でヒト眼領域前駆体細胞を培養すること；
    （ｂ）工程（ａ）から細胞クラスターを得ること；および
    （ｃ）細胞クラスターを低接着または非接着条件下で、細胞培地中で培養し、ヒトＲＧ前駆体細胞を含む細胞スフィア細胞を形成させることを含み、
    ここでヒト眼領域前駆体細胞が、Ｐａｘ６（＋）、Ｒｘ１（＋）、Ｏｃｔ４（−）およびＮａｎｏｇ（−）であり、かつ
    細胞培地が、フォルスコリン、ＢＤＮＦおよびＣＮＴＦの１以上を含む、
    前記方法。
  3. ヒト眼領域前駆体細胞が、Ｓｉｘ３（＋）、Ｓｉｘ６（＋）、Ｌｈｘ２（＋）、Ｔｂｘ３（＋）、Ｓｏｘ２（＋）、Ｏｔｘ２（＋）およびネスチン（＋）である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 多能性幹細胞をフィーダーフリー条件下で培養して眼領域前駆体細胞を生ずることをさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法によって生ずる複数の細胞を含む、組成物。
  6. その少なくとも５０％が、免疫組織化学的な判定において、
    （ｉ）Ｂｒｎ３ａ、およびニューロフィラメント、
    （ｉｉ）Ｍａｔｈ５、およびＢｒｎ３ａ、または
    （ｉｉｉ）Ｔｈｙ１
    を発現する複数のヒト細胞を含み、
    ここで複数のヒト細胞は、ニューロスフィアとして形成され、
    ニューロスフィアは、ヒト網膜神経節（ＲＧ）細胞および／またはヒトＲＧ前駆体細胞を含む、
    細胞の組成物。
  7. （ａ）細胞の生存性を維持することに好適な培地をさらに含み、
    （ｂ）組成物が、多能性幹細胞、成熟光受容体、および／またはアマクリン細胞を実質的に含まない、
    請求項６（ｉｉ）に記載の組成物。
  8. 組成物が、哺乳動物患者への使用に好適である医薬調製物であり、哺乳動物患者への移植のために、細胞の生存性を維持するための医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項５に記載の組成物。
  9. 組成物が、極低温細胞調製物であり、任意に最初に凍結された細胞数の少なくとも８０％が解凍後に回復される、請求項５に記載の組成物。
  10. 複数の細胞が、インビトロの多能性幹細胞に由来する、請求項５〜９のいずれか一項に記載の組成物。
  11. 免疫組織化学的な判定において、
    （ｉ）複数の細胞中の少なくとも７５％、８５％、または９５％の細胞が、Ｂｒｎ３ａ、およびニューロフィラメントを発現する、
    （ｉｉ）複数の細胞中の少なくとも７５％、８５％、９５％、または９９％の細胞が、Ｍａｔｈ５、およびＢｒｎ３ａを発現する、または
    （ｉｉｉ）複数の細胞中の少なくとも７５％の細胞が、Ｔｈｙ１を発現する、
    請求項５に記載の組成物。
  12. 患者に調製物を投与すること、または患者に解凍後の調製物を投与することを含む、それを必要とする哺乳動物患者の処置の方法における使用のための、請求項５〜１１のいずれか一項に記載の組成物。
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