KR20100097726A - 전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절 - Google Patents

전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절 Download PDF

Info

Publication number
KR20100097726A
KR20100097726A KR1020107014920A KR20107014920A KR20100097726A KR 20100097726 A KR20100097726 A KR 20100097726A KR 1020107014920 A KR1020107014920 A KR 1020107014920A KR 20107014920 A KR20107014920 A KR 20107014920A KR 20100097726 A KR20100097726 A KR 20100097726A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cells
progenitor cells
cell
progenitor
medium
Prior art date
Application number
KR1020107014920A
Other languages
English (en)
Inventor
피터 고쉬
Original Assignee
프로테오바이오엑티브스 피티와이 엘티디
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from AU2007906607A external-priority patent/AU2007906607A0/en
Application filed by 프로테오바이오엑티브스 피티와이 엘티디 filed Critical 프로테오바이오엑티브스 피티와이 엘티디
Publication of KR20100097726A publication Critical patent/KR20100097726A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0226—Physiologically active agents, i.e. substances affecting physiological processes of cells and tissue to be preserved, e.g. anti-oxidants or nutrients
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/02—Preservation of living parts
    • A01N1/0205—Chemical aspects
    • A01N1/021—Preservation or perfusion media, liquids, solids or gases used in the preservation of cells, tissue, organs or bodily fluids
    • A01N1/0221—Freeze-process protecting agents, i.e. substances protecting cells from effects of the physical process, e.g. cryoprotectants, osmolarity regulators like oncotic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0655—Chondrocytes; Cartilage
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0663—Bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSC)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/90—Polysaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells

Abstract

본 발명은, 전구 세포의 동결보존을 향상시키는 것을 포함하여, 전구 세포의 생육성을 향상시키기 위한, 전구 세포와 조합한 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 용도에 관한 것으로, 신규 조성물, 방법 및 용도를 제공한다. 본 발명은 또한 전구 세포의 증식 및 분화를 조절하기 위한, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 용도에 관한 것이다.

Description

전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절 {PROTECTION OF PROGENITOR CELLS AND REGULATION OF THEIR DIFFERENTIATION}
본 발명은, 전구세포의 생존을 향상시키기 위해 전구세포와 조합된 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 용도에 관한 것으로, 전구세포의 동결보존의 향상을 포함하며, 새로운 조성물, 방법 및 용도를 제공한다. 본 발명은 또한, 전구세포의 증식 및 분화를 조절하는 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 용도에 관한 것이다.
인간 전구세포는 성체의 기관 및 조직을 구성하는, 다양한 모든 타입의 성숙 세포를 생성하는 미성숙 세포이다. 전구세포로부터 특수화된 성숙 세포로의 전이는 '분화'라 불리는 방식에 의한다.
체내의 전구세포는 그의 환경으로부터의 다양한 자극에 반응하여 다양한 분화 경로를 취한다. 유사하게, 연구실 내의 전구세포는 상이한 조합의 생화학 물질에 노출됨으로써 상이한 경로를 따라 분화하도록 자극될 수 있다. 적절한 자극에 의하여, 전구세포는 여러 조직 중에서, 혈액 세포, 골, 연골, 지방, 혈관 또는 심근으로 분화될 수 있다. 이 때문에, 많은 조직 및 기관의 재생과 재성장을 위한 치료의 주성분으로서 전구세포의 용도가 큰 관심을 받고 있다.
전구세포는 배아 내에 존재하며, 배아 내보다 상대적으로 훨씬 적은 수지만, 골수, 지방, 피부 및 치수와 같은 성체 조직 내에도 존재한다. 성체 전구세포의 두 가지 타입으로는, 새로운 골수 및 혈액 세포를 생성하는 조혈 세포와, 실질 장기(solid organ) 및 골, 심장 및 연골과 같은 조직을 생성하는 비-조혈 세포가 있다. 조혈 타입의 성체 전구세포는 골수로부터 용이하게 얻을 수 있으며, 임상적으로 이미 사용되고 있다. 그러나, 충분한 수의 비-조혈 타입의 성체 전구세포를 얻는 것과 연구실 내에서 성장시키는 것이 어렵기 때문에 상기 세포와 관련된 기술은 개발이 훨씬 미숙하다.
전구세포를 치료에서 이용하기 위해서는, 전구세포를 사용하기 전에 성공적으로 보관할 수 있어야 한다. 전구세포는 효과적으로 보존되고 그의 생존이 유지되는 방식으로 보관되어야 한다. 일반적으로 전구세포는 보관을 위해 동결보존되고, 사용하기 전에 해동된다.
세포 배양의 냉동 보존(-100℃ 미만으로 보관)은 세포에 영양분을 공급하고 돌보는데 관련된 수고와 비용을 들일 필요없이, 백업을 유지하기 위하여 또는 세포를 확보하기 위하여 널리 사용된다. 성공적인 냉동 방법은 배양의 적절한 처리, 제어된 냉동, 적절한 보관 및 적합한 동결보존제, 이 네 가지의 결정적 부분에 의존한다. 마지막 사항은 특히 중요하며, 적절한 시약은 세포의 생존을 유지하는데 도움을 줄 수 있다.
임상 설정에 있어서, 동결보존 후, 세포가 계속 생존하는 것이 특히 중요하며, 생포 생존의 증가는 치료의 효과를 극대화한다.
또한, 전구세포가 치료학적으로 유효하기 위해서는 전구세포가 요구되는 세포 타입으로 분화되어야 한다. 따라서, 전구세포가 반드시 요구되는 세포 타입으로 분화되도록 하는 전구세포 분화의 유효한 조절제를 개발하는 것이 필요하다.
더욱이, 전구세포 증식의 유효한 조절제도 개발할 필요가 있다. 전구세포는 주로 시험관내 및 생체내에서 증식하는 것이 바람직하다.
따라서, 동결보존 동안 전구세포를 보호하고, 그의 생존을 증대시키고, 분화 및/또는 증식을 조절할 수 있는 시약(들)이 필요하다.
본 발명의 요약
본 발명자들은 이번에 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편이 전구세포의 생존을 향상시킬 수 있음을 밝혔다. 특히, 본 발명자들은 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편이 전구세포의 동결보존을 향상시킬 수 있음을 밝혔다.
또한, 본 발명자들은 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편이 전구세포의 증식을 조절할 수 있음을 밝혔다.
또한, 본 발명자들은 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편이 전구세포의 분화를 조절할 수 있음을 밝혔다. 조절은 상향 조절 또는 하향 조절일 수 있다. 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편은 연골세포, 골아세포 및 지방세포로의 분화를 조절할 수 있다. 특히, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편은 연골 생성을 유도할 수 있다.
이러한 사실은 동결보존 후, 전구세포의 생존을 향상시키거나 증대시키기 위해 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편이 전구세포와 조합되어 사용될 수 있으며, 시험관내 및 생체내에서의 방법 및 사용에 있어서 전구세포와 조합되어 사용될 수 있음을 의미한다.
이와 같은 예기치 않은 발견은 새로운 다수의 응용에 있어서, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편의 사용가능성을 시사한다. 예를 들면, 분화, 특히 연골 생성을 조절함으로써 특히, 연골 및 추간판을 재건하고, 관절의 퇴행을 예방하고, 무혈성 결합 조직의 재생을 향상시키는 것이 가능하다. 본 발명 이전에, 폴리설페이트화 폴리사카라이드가 전구세포의 분화, 특히 연골 생성을 조절할 수 있다는 것은 공지되지 않았다. 더욱이, 증식을 조절함으로써, 시험관내 및 생체내 모두에서 전구세포의 생성을 조절하는 것이 가능하다. 골관절염(OA) 치료 자체와 관련하여 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 용도가 공개되었지만, 폴리설페이트화 폴리사카라이드가 전구세포와 관련하여 유익한 동결보존 성질을 가지거나, 상기세포의 분화 및/또는 세포 증식을 조절할 수 있다는 것은 이전에 알려지지 않았다. 따라서, 상기 사실은 이전에는 고려되지 않았던 새로운 치료 방안을 제시한다.
본원에서 사용되는 "생물학적 활성 분자 단편"은 전체-길이 분자에서 특정 활성, 즉 예로, 생존을 증대시키고, 세포 분화 조절 및/또는 세포 증식을 조절할 수 있는 활성을 가지는 본 발명의 분자의 일부분을 의미한다.
따라서, 일례로, 본 발명은 전구세포와 함께 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
다른 일례로, 본 발명은 전구세포, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편과 함께 담체 배지를 포함하는 조성물을 제공한다.
담체 배지는 배양 배지, 바이오지지체, 동결보존 배지, 생리학적 배지 및/또는 약리학적으로 허용 가능한 담체일 수 있다.
다른 일례로, 본 발명은 전구세포 및 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편과 함께 동결보존 배지를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 조성물을 시험관내 및 생체내 모두에서 사용될 수 있다.
조성물은 다수의 전구세포를 함유할 수 있다. 다른 일례로 본 발명은 약 1000 내지 약 1×1010의 전구세포를 함유한다. 다른 일례로, 본 발명은 약 1×105 내지 약 1×109의 세포를 함유한다. 다른 일례로 본 발명은 약 100,000 내지 약 5×108의 전구세포를 함유한다. 다른 일례로 본 발명은 약 500,000 내지 약 2×108의 전구세포, 약 1×106 내지 약 2×108의 전구세포, 또는 약 1×106 내지 약 1×108의 전구세포를 함유한다. 또 다른 일례로, 조성물은 약 1×106, 2×106, 3×106, 4×106, 5×106, 6×106, 7×106, 8×106, 9×106, 1×107, 2×107, 3×107, 4×107, 5×107, 6×107, 7×107, 8×107, 9×107, 1×108, 2×108, 3×108, 4×108, 5×108, 6×108, 7×108, 8×108 또는 9×108의 전구세포를 함유한다. 또 다른 일례로, 조성물은 약 1×108의 전구세포를 함유한다.
일례로, 조성물 내의 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 조성물 내의 세포 수에 의존한다. 따라서, 일례로, 조성물 내의 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 500ng/ml/밀리온 세포 - 10mg/ml/밀리온 세포, 또는 500ng/ml/밀리온 세포 - 2000㎍/ml/밀리온 세포 , 1㎍/ml/밀리온 세포 - 1000㎍/ml/밀리온 세포, 또는 1㎍/ ml/밀리온 세포 - 500㎍/ml/밀리온 세포이다.
다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 500ng - 10㎍/ml/밀리온 세포; 1㎍ - 10㎍/ml/밀리온 세포; 1㎍ - 8㎍/ml/밀리온 세포; 1㎍ - 6㎍/ml/밀리온 세포; 1㎍ - 5㎍/ml/밀리온 세포; 1㎍ - 3㎍/ml/밀리온 세포; 2㎍ - 6㎍/ml/밀리온 세포; 2.5㎍ - 5㎍/ml/밀리온 세포; 또는 3㎍ - 5㎍/ml/밀리온 세포의 범위이다. 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 1㎍ - 100㎍/ml/밀리온 세포; 1㎍ - 50㎍/ml/밀리온 세포; 1㎍ - 20㎍/ml/밀리온 세포; 1㎍ - 15㎍/ml/밀리온 세포; 10㎍ - 100㎍/ml/밀리온 세포; 20㎍ - 100㎍/ml/밀리온 세포; 또는 50㎍ - 100㎍/ml/밀리온 세포의 범위이다. 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 1㎍ - 1000㎍/ml/밀리온 세포; 100㎍ - 800㎍/ml/밀리온 세포; 100㎍ - 600㎍/ml/밀리온 세포; 100㎍ - 500㎍/ml/밀리온 세포; 200㎍ - 500㎍/ml/밀리온 세포의 범위이다. 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 250㎍ - 500㎍/ml/밀리온 세포의 범위이다.
일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 500ng, 1㎍, 2㎍, 2.5㎍, 5㎍, 10㎍, 15㎍, 20㎍, 30㎍, 40㎍, 50㎍, 60㎍, 70㎍, 80㎍, 90㎍, 100㎍, 150㎍, 200㎍, 250㎍, 300㎍, 350㎍, 400㎍, 450㎍, 500㎍, 550㎍, 600㎍, 650㎍, 700㎍, 750㎍, 800㎍, 850㎍, 900㎍, 950㎍, 1000㎍, 1050㎍, 1100㎍, 1150㎍, 1200㎍, 1250㎍, 1300㎍, 1350㎍, 1400㎍, 1450㎍, 1500㎍, 1550㎍, 1600㎍, 1650㎍, 1700㎍, 1750㎍, 1800㎍, 1850㎍, 1900㎍, 1950㎍ 또는 2000㎍/ml/밀리온 세포를 포함한다. 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 200㎍/ml/밀리온 세포, 250㎍/ml/밀리온 세포, 300㎍/ml/밀리온 세포, 400㎍/ml/밀리온 세포 또는 500㎍/ml/밀리온 세포를 포함한다. 또 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 250㎍/ml/밀리온 세포 또는 500㎍/ml/밀리온 세포이다.
또한, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 조성물 내의 세포 수에 의존한다. 따라서, 본 발명의 다른 일례로, 조성물 내의 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 500ng/ml - 10mg/ml; 500ng/ml - 2000㎍/ml; 1㎍/ml - 1000㎍/ml; 또는 1㎍/ml - 500㎍/ml이다.
다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 500ng - 10㎍/ml; 1㎍ - 10㎍/ml; 1㎍ - 8㎍/ml; 1㎍ - 6㎍/ml; 1㎍ - 5㎍/ml; 1㎍ - 3㎍/ml; 2㎍ - 6㎍/ml; 2.5㎍ - 5㎍/ml; 또는 3㎍ - 5㎍/ml의 범위이다. 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 1㎍ - 100㎍/ml; 1㎍ - 50㎍/ml; 1㎍ - 20㎍/ml; 1㎍ - 15㎍/ml; 10㎍ - 100㎍/ml; 20㎍ - 100㎍/ml; 또는 50㎍ - 100㎍/ml의 범위이다. 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 1㎍ - 1000㎍/ml; 100㎍ - 800㎍/ml; 100㎍ - 600㎍/ml; 100㎍ - 500㎍/ml; 또는 200㎍ - 500㎍/ml의 범위이다. 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 1mg - 1000㎍/ml; 100㎍ - 800㎍/ml; 100㎍ - 600㎍/ml; 100㎍ - 500㎍/ml; 또는 200㎍ - 500㎍/ml의 범위이다. 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 250㎍ - 500㎍/ml이다.
또한, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 500ng, 1㎍, 2㎍, 2.5㎍, 5㎍, 10㎍, 15㎍, 20㎍, 30㎍, 40㎍, 50㎍, 60㎍, 70㎍, 80㎍, 90㎍, 100㎍, 150㎍, 200㎍, 250㎍, 300㎍, 350㎍, 400㎍, 450㎍, 500㎍, 550㎍, 600㎍, 650㎍, 700㎍, 750㎍, 800㎍, 850㎍, 900㎍, 950㎍, 1000㎍, 1050㎍, 1100㎍, 1150㎍, 1200㎍, 1250㎍, 1300㎍, 1350㎍, 1400㎍, 1450㎍, 1500㎍, 1550㎍, 1600㎍, 1650㎍, 1700㎍, 1750㎍, 1800㎍, 1850㎍, 1900㎍, 1950㎍, 또는 2000㎍/ml을 포함한다. 또한, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 200㎍/ml, 250㎍/ml, 300㎍/ml, 400㎍/ml 또는 500㎍/ml을 포함한다. 또한, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도는 250㎍/ml - 500㎍/ml을 포함한다.
또한, 조성물은 총 함량이 1mg, 2mg, 3mg, 4mg, 5mg, 6mg, 7mg, 8mg, 9mg, 10mg, 15mg, 20mg, 25mg, 30mg, 35mg, 40mg, 45mg, 50mg, 55mg, 60mg, 70mg, 80mg, 90mg, 또는 100mg인 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 함유한다. 또한, 조성물은 총 함량이 15-70mg, 20-60mg, 또는 25-50mg인 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 함유한다.
또 다른 일례는 약 1x106 - 1x108의 전구세포 및 25-50mg의 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 포함한다. 또 다른 일례는 1x108의 전구세포 및 25-50 mg/ml의 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 포함한다.
또 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드는, 생물학적 구획 내의 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도가 0.01 내지 100 ㎍/ml 생물학적 배지, 예를 들면 0.1 내지 50㎍/ml 생물학적 배지, 0.1 내지 10 ㎍/ml 생물학적 배지, 1 내지 10 ㎍/ml 생물학적 배지, 2 내지 8 ㎍/ml, 4 내지 6 ㎍/ml 생물학적 배지 또는 4, 5 또는 6 ㎍/ml 생물학적 배지가 되게 하는 양으로 투여될 수 있다.
생물학적 구획은 추간판, 근육, 윤활 관절(synovial joints), 활막 내 조직(반월판, 윤활막), 활막 외 조직(캡슐), 건 내, 건 외, 심장, 심장막, 심근 및/또는 지방 조직내, 인대 내, 인대 외, 피내, 피하, 복막내, 정맥내, 동맥내와 같은 신체 부위를 의미한다. 생물학적 배지는 생물학적 구획에 의존한다. 생물학적 배지는 혈액, 혈청, 혈장, 활액, 복막액(peritoneal fluid), 장막액(serous fluid) 또는 지방 조직을 포함한다. 따라서, 다른 일례로서 예를 들면 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 윤활 관절 내의 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도가 1 ml 활액 당 1 내지 10 ㎍가 되게 하는 양으로 투여될 수 있다.
담체 배지
조성물은 담체 배지를 함유할 수 있다. 일례로, 담체 배지는 수용액일 수 있다. 배지는 정상 생리학적 구조 및 특히 환경적 삼투압, pH, 형질막 및 세포내 기관들의 보전성 및 유동성에 관한 세포의 기능을 보존하는 추가적 성분을 선택적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 적합한 담체는 통상적으로 단독으로 사용되고, 예를 들면 물, 염류, 수성 덱스트로오스, 락토오스, 링거 용액(Ringer's solution), 크렙 포유류 링거 용액(Krebs mammalian Ringer solution), 얼 용액(Earles's solution), 게이 용액(Gey's solution), 심 용액(Simm's solution), 티로드(Tyrode) 용액, 하이알루로난, 완충 생리식염수(PBS), 로케 용액(Locke's solution), 행크스 용액(Hank's solution), 클라크 및 럽(Clark and Lubs) 완충액, 완충액; MES-NaOH, HEPES-NaOH, TRICINE-NaOH, EPPS-NaOH, BICINE-NaOH로 구성된 완충액, 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄-HCl, 글리신-NaOH, 증탄산나트륨-CO2 ,탄산나트륨-중탄산염, 나트륨 카코딜레이트, 나트륨 수소 말레에이트-NaOH; 이글 배지(Eagle's medium), 둘베코 배지(Dulbecco's medium) 또는 완충액, 맥코이 배지(McCoy's medium), 클릭 배지(Click's medium), 에임 배지(Ames' medium), 알파 MEM, DMEM, 햄의 F12, 햄의 F10, RPMI-1640CMRL 1066 및 1415 NCTC 135와 같은 배양 배지; 스템라인(Stemline)® 및 메가셀(Megacell)®과 같은 시판 전문 세포주 배지 또는 프로프리즈(Profreeze)® 및 크리오스토(CryoStor)®와 같은 시판용 동결보존제와 조합되어 사용되는 것들을 포함한다.
따라서, 일례로 담체 배지는 추가로 하기 성분 중 하나 이상을 선택적으로 포함할 수 있는 수성 배지이다.
-유기 및/또는 무기염;
-완충액;
-BSA 또는 트랜스페린(transferin)과 같은 단백질;
-인슐린 유사 성장 인자, 인슐린, 섬유아세포 유사 성장 인자를 포함하는 성장 인자 및 사이토카인; BMP-TGF-베타 슈퍼패밀리(예: BMP-2, BMP-7, BMP-8, TGF 베타 ) 및 섬유아세포 성장 인자 패밀리, IGF, FGF, EGF, PDGF, VEGF;
-FBS, 신생 송아지, 기타 모든 포유류종을 포함하는 동물 혈청;
-프로프리즈® 및 크리오스토®와 같은 동결보존제;
-디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 트레할로오스, 수크로오스 및 기타 당 또는 디메틸아세트아미드와 같은 동결보존제;
-탄수화물;
-비타민/보조 인자;
-호르몬;
-항생제;
-접착 인자;
-아미노산;
-덱스트란과 같은 혈장 확장제;
-인간 및 기타 포유류 모두의 혈장;
-혈장 대체제;
-천연 또는 가교된 하이알루로난 및/또는 하이알루론산.
따라서, 일례로 담체 배지는 물, 염류, 수성 덱스트로오스, 락토오스, 완충된 용액, 하이알루로난 및 글리세롤, 완충 생리식염수(PBS), 링거 용액, 로케 용액, 행크스 용액, 최소 필수 배지, 최소 필수 배지 알파(알파 MEM), 또는 DMEM으로부터 선택되는 수성 배지를 포함한다. 일례로, 담체 배지는 알파 MEM를 포함한다. 또 다른 예로, 담체 배지는 DMEM을 포함한다. 또 다른 예로, 담체 배지는 HAMS 12를 포함한다.
담체 배지는 추가적으로 프로프리즈® 또는 크리오스토® 계의 적절한 제제와 같은 동결보존제를 포함할 수 있다. 다른 일례로, 담체 배지는 수성 용액으로서 프로프리즈® 및 크리오스토® 계의 적절한 제제와 같은 동결보존제를 포함할 수 있다. 본 예에서는 조성물이 물, 염류, 수성 덱스트로오스, 락토오스, 링거 용액, 완충된 용액, 하이알루로난 및 완충 생리식염수(PBS), 로케 용액, 행크스 용액, 알파 MEM; DMEM; 또는 HAMS F12와 같은 담체를 포함하지 않으며, 대신 프로프리즈® 또는 크리오스토® 계의 적절한 제제와 같은 동결보존제를 포함하면서 선택적으로 디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 트레할로오스, 수크로오스 및 기타 당 또는 디메틸아세트아미드와 같은 하나 이상의 동결보존제와 조합된다. 예로서, 담체 배지는 프로프리스® 또는 DMSO으로 이루어지거나 이를 포함할 수 있다.
담체 배지는 배양 배지로서 사용될 수 있으며, 유기염 및/또는 무기염, 탄수화물, 비타민, 아미노산 및/또는 세포가 분할하고 시험관내에서 정상적으로 기능하도록 허용하는 세포의 영양 요건을 충족시키는 기타 물질로 보충될 수 있다. 일 례로, 담체 배지는 혈청 및/또는 단백질 보충제를 포함한다. 따라서, 배양 배지는 BSA 또는 트랜스페린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 단백질로 보충될 수 있다. 이에 추가하거나 또는 이를 대신하여, 배양 배지는 혈청, 예를 들면 송아지 태아 혈청과 같은 성장인자를 함유하는, 태아 또는 신생아 혈액으로 보충될 수 있다. 이러한 배지의 제조 하이알루론산 및 사용하이알루론산은 당업자에게 잘 알려져 있다. 적절한 배지는 [Adams RLP. Cell culture for Biochemists. Elsevier/North-Holland Biomedical Press, Amsterdam, New York, Oxford. 1980, pp 84 - 97 및 pp 246 - 260.(ISBN 0-444-80199-5)] 및 [Dawson RMC, Elliott DC, Elliott WH and Jones KM, Data for Biochemical Research(3판), Clarendon Press, Oxford, 2002, pp 417 -448 (ISBN 0-19-855299-8)]에서 확인할 수 있으며, 상기 문헌의 전문은 본원에 포함된다.
일례로, 담체 배지는 동결보존 배지로서 작용한다. 냉동-해동 세포용 동결보존 배지는 (단독으로 또는 혈청 단백질 보충제를 포함한) 통상적으로 공지된 담체 및/또는 본원에 기술된 수성 배지를 포함하는 배양 배지의 사용을 포함한다. 또한, 담체 배지는 프로프리즈® 및 크리오스토® 와 같은 적절한 제제를 포함할 수 있다. 담체 배지로서 기능하기 위하여, 일반적으로, 냉동-해동 하이알루론산 도중에 형성되는 빙정에 의한 손상으로부터 새포막 및 기관을 보호하는, 화합물이 첨가된다.
따라서, 또 다른 일례로, 담체는 하나 이상의 동결보존제를 포함한다. 적절한 약품 또는 동결보존제는 디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 수크로오스 및 기타 당을 포함한다. 적절한 시약의 예는 [Brudder S, Jaiswal N, Hainsworth S, WO9739104], [Farrant. J. 1980, General observations on cell preservation, In: M.J. Ashwood-Smith 및 J. Farrant, Eds. Low Temperature Preservation in Medicine and Biology, Pitman Medical Limited, Kent, Englan.,p.1-18], [Frederick V, et al. Recovery, survival and functional evaluation by transplantation of frozen-thawed mouse germ cells, Human Reprod, 2004, 19: 948-53, Pegg DE, Principles of Cryopreservation, Methods Mol Biol, 2007; 368: 39 - 57]에서 찾을 수 있으며, 이들 문헌은 본원에 포함된다. 따라서, 또 다른 일례로, 담체 배지는 시약 또는 하나 이상의 디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 수크로오스 및 기타 당으로부터 선택되는 동결보존제를 추가로 포함한다. 또한, 동결보존제는 글리세롤, 트레할로오스 및/또는 수크로오스의 대체물로서 디메틸아세트아미드를 포함한다. 다른 일례로, 담체 배지는 통상적인 동결보존제를 포함하며, 선택적으로 성장인자 및/또는 분화 인자를 함께 포함한다. 적절한 담체 배지의 예는 WO9832333, WO9739104 또는 WO1997/039104에서 찾을 수 있다.
또 다른 일례로, 담체 배지는 프로프리즈® 및 크리오스토® 와 같은 적절한 제제를 추가로 포함할 수 있다. 비-동물 유래 성분을 함유하는 냉동 배지로서의 프로프리즈는 론자-바이오윗테이커(Lonza-BioWhittaker)에서 판매된다. 담체 배지는 본원에서 논의되었던 약품 또는 보호제, 특히 DMSO, 글리세롤, 수크로오스 및 기타 당으로 보충되며, 특히 DMSO로 추가적으로 보충될 수 있다. 특정 예로, 담체 배지는 프로프리즈® TM CDNAO 냉동 배지를 포함하며, 선택적으로 DMSO를 함께 포함한다. 다른 일례로, 담체 배지는 알파 MEM, 프로프리즈® TM CDNAO 냉동 배지 및 DMSO을 포함한다.
본 발명은 담체 배지가 다수의 요건들을 충족시키는 가능성을 고려하고 이를 포함한다. 따라서, 담체 배지는 배양 배지 및 동결보존 배지 모두로서 기능할 수 있다. 마찬가지로, 담체 배지는 동결보호 배지 및 약리학적으로 허용가능한 담체 모두로서 기능할 수 있다.
담체 배지는 디메틸설폭사이드(DMSO) 및/또는 글리세롤을 포함할 수 있다. 일례로, 담체 배지는 디메틸설폭사이드(DMSO)를 포함한다. 또 다른 일례로, 조성물은 1-20% DMSO을 포함한다. 또 다른 일례로, 조성물은 1-15% DMSO, 5-15% DMSO, 1-10% DMSO, 5% DMSO, 7.5% DMSO, 10% DMSO, 15% DMSO 또는 20% DMSO을 포함한다. 특정 예로, DMSO은 고순도 급의 DMSO이다.
DMSO와의 장기적으로 접촉됨으로써 일부 세포가 악영향을 받을 수 있다. 4℃에서 DMSO를 세포 현탁액에 첨가하고, 해동 후 즉시 DMSO를 제거함으로써, 이러한 악영향은 감소되거나 소멸될 수 있다. 또한, 저농도의 DMSO가 사용될 수 있다.
또한 다른 방안으로서, 담체 배지는 DMSO 대신에 글리세롤을 포함할 수 있다. 따라서, 다른 일례로, 담체 배지는 글리세롤을 포함할 수 있다. 일례로, 글리세롤은 1-30%, 1-20%, 5-20%, 1-15%, 5-15%, 1-10% 또는 5-10%의 농도로 존재한다.
일례로, 배지는 DMEM, HETA-전분 및/또는 인간 혈청 성분 및/또는 기타 벌킹제와 함께 DMSO 또는 글리세롤을 함유한다.
일례로, 담체 배지는 주사용으로 적합하며, 세포의 기능에 영향을 주지 않는다. 일례로, 배지는 혈청을 함유한다. 다른 일례로, 배지는 무-혈청 배지이다.
일례로, 담체 배지는 혈청, 예로써 인간 혈청 성분을 함유한다. 예로, 담체 배지는 우태아혈청(FBS)을 추가로 포함한다. 일례로, 조성물은 1-50%의 FBS을 포함한다. 다른 일례로, 조성물은 1-20% FBS, 1-10% FBS, 5% FBS, 7.5% FBS, 10% FBS, 15% FBS 또는 20% FBS를 포함한다. 또한, 적절한 혈청으로는 동일한 가능 농도로 BSA, 트랜스페린 및/또는 난황 단백질을 포함한다.
주-혈청 동결보존 배지의 예로는, 링거 용액, 완충 생리식염수(PBS), 로케 용액, 행크스 용액, 알파 MEM, DMEM 또는 HAMS F12와 같은 수용액과 디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 트레할로오스, 수크로오스 및 기타 당과 같은 동결보존제 또는 디메틸아세트아미드 및 FBS 등의 혈청을 함께 담체 배지를 들 수 있다.
따라서, 주-혈청 동결보존 배지의 예는 DMEM 또는 알파 MEM, DMSO 및 혈청(예를 들어, 우태아 혈청을 이용함)을 포함하는 담체 배지일 수 있다.
담체 배지는 또한, 혈청 및/또는 단백질을 포함하지 않을 수 있으며, 화학적으로 특정 배지일 수 있다. 무-혈청 배지의 예로는, 넉아웃TM 세럼 리플레이스먼트(KnockOutTM Serum Replacement),넉아웃TMD-MEM, 스템프로®(StemPro)-34 SFM을 들 수 있다.
무-혈청 배지의 예로는, 링거 용액, 완충 생리식염수(PBS), 로케 용액, 행크스 용액, 알파 MEM, DMEM 또는 HAMS F12와 같은 수용액과 디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 트레할로오스, 수크로오스 및 기타 당과 같은 동결보존제 또는 디메틸아세트아미드 및 프로프리즈® 또는 크리오스토® 등의 적절한 제제와 같은 동결보존제 배지를 함께 포함하는 담체 배지를 들 수 있다.
따라서, 주-혈청 동결보존제 배지의 예로는, 알파 MEM, DMSO 및 프로프리즈® 또는 단순히 DMSO와 프로프리즈®를 포함하는 담체 배지를 들 수 있다.
일례로, 담체 배지는 프로프리즈®를 포함한다. 프로프리즈®는 무-혈청 냉동 배지이며, 무-혈청 배지 내에서 증식된 동결보존 세포용으로 특별히 제조된다. 이러한 무-단백질, 비-동물 성분 배지는 천연 동물 단백질을 포함하지 않으며, 냉동 보관으로부터 회복된 후, 높은 세포 생존을 유지한다. 다른 일례로, 담체 배지는 프로프리즈® 및 DMSO를 포함하며, 선택적으로 7.5 또는 15%의 DMSO를 포함한다. 또한, 담체 배지는 크리오스토® 를 포함할 수 있다.
일례로, 배지는 완충액을 함유한다. 완충액은 DMEM, 인산염 완충액 또는 CMF-PBS를 포함한다. 본 발명에는 통상적으로 사용되는 생리 완충액이 포함된다. 완충액의 예로는, 문헌 [Lelong IH and Rebel G. pH drift of "Phhysiological buffers" and culture media used for cell incubation during in vitro studies. J Pharmacol Toxicol Methods. 1998; 39: 203-210; John A Bontempo. Development of Biopharmaceutical Parenteral Dosage Forms. in Drugs and the Pharmaceutical Sciences.Marcel Dekker Inc, NY (ISBN: 0-8247-9981-X): pp 91-108]에서 찾을 수 있으며, 이들 문헌의 내용은 본원에 포함된다.
배지는 덱스트란, 트레할로오스, 수크로오스 또는 디메틸아세트아미드(DMA) 등의 사카라이드를 추가로 포함한다.
일례로, 조성물은 전구세포, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 및 하기를 포함하는 담체 배지를 포함한다:
-물, 염류, 수성 덱스트로오스, 락토오스, 링거 용액, 완충된 용액, 하이알루로난, 글리세롤, 완충 생리식염수(PBS), 로케 용액, 행크스 용액, 알파 MEM, DMEM 또는 HAMS F12로부터 선택되는 수성 배지
-프로프리즈® 또는 크리오스토® 등의 동결보존 배지
-디메틸설폭사이드(DMSO) 및/또는 글리세롤로부터 선택되는 동결보존제.
일례로, 동결보존 배지는 프로프리즈® 이다.
일례로, 수성 배지는 MEM 또는 DMEM이다.
일례로, 동결보존제는 DMSO이다.
일례로, 수성 배지는 1-99%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 약 90%으로 존재한다.
일례로, 동결보존 배지는 1-99%, 약 10%, 약 20%, 약 30%, 약 40%, 약 50%, 약 60%, 약 70%, 약 80% 또는 약 90%으로 존재한다.
일례로, 동결보존제는 1-50%, 1-30%, 1-15%, 1-10%, 1-7.5%, 2.5%, 5%, 7.5%, 10%, 12.5%, 15%, 17.5% 또는 20%의 양으로 존재한다.
다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편와 함께, 약 5 ml의 프로프리즈® CDNAO 냉동 배지, 7.5% DMSO 및 50% 알파 MEM 내에서 동결보존된 전구세포를 제공한다. 동결보존 시의 세포 농도는, 5 ml의 냉동 배지 내 90x106 세포/크리오백(cryobags) 내지 180x106세포/크리오백일 수 있다.
또 다른 일례로, 담체 배지는 지지 매트릭스(support matrix)를 포함한다. 그 외에도 지지 매트릭스는 바이오매트릭스 또는 바이오지지체로 불릴 수 있다.
다른 일례로, 본 발명은 전구세포의 동결보존을 향상시키는 방법으로서, 전구세포를 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편에 노출시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 일례로, 본 발명은 전구세포의 동결보존을 향상시키기 위한, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편의 용도를 제공한다. 다른 일례로, 본 발명은 전구세포의 생존을 향상시키기는 방법으로서, 전구세포를 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편에 노출시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
다른 일례로, 본 발명은 전구세포의 생존을 향상시키기 위한, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편의 용도를 제공한다.
다른 일례로, 본 발명은 동결보존제로서 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 용도를 제공한다.
다른 일례로, 본 발명은 전구세포의 동결보존을 향상시키기 위하여 본원에 정의된 조성물의 용도를 제공한다. 다른 일례로, 본 발명은 전구세포의 생존을 향상시키는 방법으로서, 본원에 정의된 조성물을 극저온 냉동시키고 연속하여 조성물을 해동하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
따라서, 극저온 배지에 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 첨가하는 것은 전구세포에 악영향을 미치지 않으며, 그의 생존에 유해한 영향을 끼치지 않는다는 것이 처음으로 밝혀졌다. 실제로, 극저온 배지에 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 첨가하는 것은 전구세포의 생존을 향상시킨다.
더욱이, 전구세포에 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 첨가하는 것은 전구세포 자체의 생존을 유지하거나 향상시킨다. 따라서, 다른 일례로, 전구세포 생존을 유지하거나 향상시키는 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 용도를 제공한다. 다른 일례로, 전구세포의 생존을 유지하거나 유지하는 방법으로, 전구세포와 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편은 전구세포의 증식을 조절할 수 있다.
따라서, 일례로, 본 발명은 전구세포의 증식을 조절하는 방법으로서, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편을 전구세포에 노출시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
또 다른 일례로, 본 발명은 전구세포의 증식을 조절하기 위한, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편의 용도를 제공한다.
다른 일례로, 본 발명은 증식을 증가시키기 위하여, 본원에 정의된 조성물의 용도를 제공한다. 따라서, 다른 일례로, 본 발명은 전구세포의 증식을 조절하는 방법으로서, 본원에 정의된 조성물을 사용하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다. 다른 일례로, 본 발명은 전구세포의 증식을 조절하기 위하여 본원에 정의된 조성물의 용도를 제공한다.
일례로, 증식을 증가하거나 상향 조절된다.
따라서, 전구세포와 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 사용으로 전구세포의 증식을 향상될 수 있다는 것이 처음으로 밝혀졌다. 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 농도 의존적 방식으로 전구세포의 증식을 자극한다. 따라서, 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 세포를 증식시킬 필요가 있는 경우에 적용된다. 예를 들면, 전구세포의 시험관내 증식은 바이오-엔지니어링 분야에 적용되는 콜로니 확장에 유용하다. 예를 들면, 바이오지지체는 전구세포 콜로니를 포함할 수 있으며, 37℃에서 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 함유하는 배양 배지에 의하여 살포될 수 있다. 이는 증식을 증진시켜, 추가적으로 생착되게 하고, 지지체를 충진시키므로 더 많은 기능성 대체 조직을 제공한다. 또 다른 일례로, 성형된(튜브형 또는 반구형) 바이오지지체는 자가 또는 동종 전구세포에 의해 파종되거나 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 함유하는 배지에 생착되어 궁극적으로 상기 연골이 손상된 수여자 내, 이식용 기도 또는 관절 표면을 생성한다. 이러한 용도에 관한 추가적인 자료는 [Chen FH and Tuan RS. Mesenchymal cells in rhematic diseases. Arthritis research and Therapy. 2008; 10: 223-239]에서 확인할 수 있다.
생체내에서, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 증식 자극은 큰 결함(예: 관절 연골)이나 살아 있는 내인성 거주 세포(예: 추간판의 센터)의 노출된 구획에 생착되는데 유리하므로, 결합의 재생 및 복원에 소요되는 시간을 감소시킨다. 전구세포는 항염증 사이토카인이 풍부한 공급원이며 면역억제 인자(참조 예: Aggarwal S and Pittenger A, Human progenitor cells modulate allogeneic immune cell response, Blood. 2005; 105: 1815-1822, Tyndale A, et al. Immunomodulatory properties of progenitor cells: a review based on an interdisciplinary meeting held at the Kennedy Institute of Rheumatology Division, London, UK, 31 October 2005. Arthritis Res Ther. 2007; 9: 301-15; Jorgensen C, et al. Multipotent mesenchymal stromal cells in articular disease. Best Practice and Research Clinical Rheumatology. 2008; 22: 269 284)이므로, 염증 또는 주사 후의 항원 반응 부위에서의 전구세포의 증식은 원치 않는 세포 과정을 억제하는 잠재력을 증가시킨다. 또한, 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 전구세포의 분화를 조절할 수 있다. 분화는 상향 조절되거나 하향 조절될 수 있다.
일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편을 전구세포에 노출시킴으로써 전구세포의 분화를 조절하는 방법을 제공한다.
다른 일례로, 전구세포의 분화를 조절하기 위한 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편의 용도를 제공한다.
본 발명은 전구세포의 분화를 조절한다. 본 발명의 세포는 연골 세포, 골아 세포 및 지방 세포 계통으로 분화할 수 있으며, 일례로, 골, 연골, 지방, 근육, 건 및 간질(stroma)을 포함하는 상이한 계열의 세포 타입으로 분화할 수 있다.
특히, 본 발명의 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편은 연골 세포로의 분화를 조절할 수 있다. 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편은 골아 세포로의 분화를 조절할 수 있다. 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편은 지방 세포로의 분화를 조절할 수 있다. 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편은 섬유 연골 세포로의 분화를 조절할 수 있다. 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편은 건 세포(tenocytes)로의 분화를 조절할 수 있다. 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편은 심근 세포(cardiocyte)로의 분화를 조절할 수 있다.
특히, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편은 연골 생성을 유도하고 조절한다.
다른 일례로, 본 발명은, 전구세포 내에서 연골 세포의 형질 분화 및 생존을 유지하는 연골 생성을 조절한다. 따라서, 일 면에 있어서, 본 발명은 연골 세포 또는 섬유 연골 세포의 형성에 관련한다.
다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 분화를 상향 조절한다. 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 분화를 하향 조절한다.
일례로, 본원 발명은 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 전구세포에 적용하는 단계를 포함하며, 전구세포 내에서 연골 생성을 조절하는 방법을 제공한다.
다른 일례로, 전구세포 내에서 연골 생성을 조절하는 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 용도를 제공한다.
다른 일례로, 본원 발명은 전구세포 내에서 골 형성을 하향 조절하는 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 용도를 제공한다.
다른 일례로, 본원 발명은 전구세포에 의한 골 형성을 억제하는, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 용도를 제공한다. 상기 방법 또는 용도는 예를 들면, 근육(심장), 간질, 보조 결합 조직 등, 정상적인 기능을 위하여 움직임 및 유연성이 필요한 연조직 부위와 같이, 골 생성이 수여자에게 유해하거나 또는 골이 신경 섬유/뿌리 또는 혈관을 침범하거나 포착하여, 파라테시스(parathesis), 마비, 허혈, 비가역적 조직 손상의 가능성에 이르게 할 수 있는 부위에 적용될 수 있다.
다른 일례로, 연골 생성하여 세포를 치료하는 방법으로서, 세포가 분화하도록 자극하는 조건 및 시간 동안에, 전구세포를 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편의 유효량에 접촉시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
전구세포
용어 "전구세포"는 임의의 다능성 줄기세포(mutipotent cell)를 의미한다. 따라서, 상기 용어 전구세포는 성체 및 태아 줄기 세포를 포함한다.
일례로, 전구세포는 간엽(mesenchymal) 전구세포이다.
다른 일례로, 전구세포는 내인성(endogenous) 또는 외인성(exogenous) 태아 또는 성체 간엽 또는 간엽 전구세포이다. 다른 일례로, 전구세포는 다능성 간질세포이다. 다른 일례로, 세포는 미분화된 성체 간엽세포이다.
다른 일례로, 전구세포는 연골 전구세포(chondroprogenitor cell)이다.
일례로, 전구세포는 골수로부터 유래된다. 또한, 전구세포는 연골, 활막 조직(synovial tissue), 근육, 지방 조직, 피부, 탯줄, 치수 또는 기타 이용가능한 근원으로부터 유래된다.
일례로, 전구세포는 외인성 인자에 의한 분화가 억제된 결합 조직 세포와 같은 체세포이다.
다른 일례로, 전구세포는 Stro-1bri, 또는 동종의 Stro-1bri세포 또는 Stro-1bri자손세포가 풍부한 세포군이다.
폴리설페이트화 폴리사카라이드
폴리설페이트화 폴리사카라이드 패밀리는 천연적으로 생성되거나, 하나 이상의 설페이트 에스테르 그룹이 공유 결합된(예: 헤파린 및 펜토산 폴리설페이트) 2 이상의 당 고리 또는 탄수화물 구조를 함유하는, 반-합성/합성 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 단편이다.
일례로서, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 단편은 천연 생성 고분자량 헤파린, 저분자량 헤파린, 헤파란 설페이트, 펜토산 폴리설페이트, 콘드로이틴 폴리설페이트, 키토산 폴리설페이트, 덜마탄 폴리설페이트, 설로덱사이드, 덱스트란 폴리설페이트, 폴리설페이트화 인슐린, 설페이트화 락토비온산 아미드, 설페이트화 비스-알돈산 아미드, 수크로오스 옥타설페이트, 푸코이단-1, 푸코이단-2, 설페이트화 베타-사이클로덱스트린, 설페이트화 감마-사이클로덱스트린 및 설페이트화 소 화합물(예: 이노시톨 헥사설페이트)로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 펜토산 폴리설페이트 콘드로이틴 폴리설페이트, 키토산 폴리설페이트, 덱스트란 폴리설페이트 및 헤파린(고분자량 및 소분자량)을 포함한다.
또 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 펜토산 폴리설페이트, 덱스트란 폴리설페이트 및 헤파린이다.
또 다른 일례로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 펜토산 폴리설페이트, 펜토산 폴리설페이트의 나트륨염(NaPPS), 펜토산 폴리설페이트의 마그네슘염(MgPPS) 및/또는 펜토산 폴리설페이트의 칼슘염(CaPPS)이다.
하나의 특정 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 펜토산 폴리설페이트(PPS) 또는 그의 나트륨염이다. 펜토산 폴리설페이트는 전구세포의 생존을 향상시키고, 전구세포의 동결보존을 증대시키고, 전구세포의 증식 및/또는 전구세포의 분화를 조절한다. 펜토산 폴리설페이트는 분화를 상향 조절하며, 특히 연골 생성을 유도한다.
또 다른 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 덱스트란 폴리설페이트이다. 덱스트란 폴리설페이트는 분화를 하향 조절하거나 억제하고, 특히 연골 생성을 하향 조절하거나 억제한다.
용도
본 발명의 전구세포는 연골 세포, 섬유 연골 세포, 골아 세포 및 지방 세포와 같은 다수의 세포 유형으로 분화할 수 있다.
전구세포는 연골 세포 또는 섬유 연골 세포로 분화할 수 있기 때문에, 전구세포들은 세포외 기질 생성에 유용하다. 세포외 기질은 치료가 필요한 개체 내의 결합 조직 결함 부위에 이식되기 적합하다.
본 발명은 연골 손상, 복구 또는 기질 신생을 유도하며, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 및 그의 생물학적 활성 분자 단편을 전구세포와 함께 투여함으로써 이화 작용을 감소시키는데 사용될 수 있다.
다른 일 례로, 본 발명의 조성물은 면역억제제, 항이화제(anticatabolic) 또는 항염증제로서 사용될 수도 있다. 예로서, 본 발명의 조성물은 류마티스 치료에 사용될 수 있다.
본원에서 논의된 방법은 생체내 또는 시험관내에서 사용될 수 있다. 생체내에서, 삽입된 전구세포는, 특히 원위치(in-situ)에서 연골을 재건할 수 있다. 또한, 관절 내의 거주 전구세포가 자극되어, 원위치에서 연골을 재건하여 효과적으로 지시된 치료가 가능하도록 할 수 있다.
시험관내에서, 본 발명은 생체기질 내의 연골을 생성하고, 환자에게 이식될 수 있도록 한다. 이러한 방법이 유용하게 적용될 수 있는, 부상당했거나 수술 교정을 요하는 유전적 기형에 의한 연골/섬유 연골 조직 또는 기타 조직의 대체하기 위하여 본 발명은 관절 면을 부분적으로 또는 전적으로 대체하는 연골을 생성하는데 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 현재 이용가능한 의학 또는 수술 치료가 유효하지 않은 환자에게 적용될 수도 있다. 예를 들면, 외상(trauma)에 의하여 유발된 급성 장애를 앓는 다수의 운동 선수 또는 개인은 증후를 보이는 연골/섬유 연골 결함을 가질 수 있다. 본 발명은 결합 조직을 대체하기 위한 새로운 연골이 자라도록 자극하는데 사용될 수 있다. 이러한 방법은 생체내에서, 관절 내의 전구세포가 제자리에서 성장하도록 자극함으로써 또는 결함 위치에 잘 맞으며, 후에 결함 부위에 삽입될 수 있도록 성형된 적합한 바이오지지체를 통한 시험관내에서, 또는 생체내 및 시험관내의 모든 방법에 의하여 실행될 수 있다. 또한, 결함 조직을 대체하기 위하여 새로운 연골 생성을 자극하고, 골증식체의 증식을 방지하고, 이러한 장애 증상들의 원인이 되는 염증을 감소시키는데 사용될 수 있는 본 발명은, 말초 관절염 및 척추 관절염과 같은 반성 관절 퇴행을 앓는 노인 환자에게 적용될 수 있다.
일례로, 본 발명은 동결보존제 및 분화를 조절하는 시약 모두로서 작용할 수 있는 동정 화합물을 가진다. 다른 일례로, 본 발명은 동결보존제 및 증식을 조절하는 시약 모두로서 작용할 수 있는 확인된 화합물을 가진다. 다른 일례로, 본 발명은 증식 및 분화를 조절할 수 있는 확인된 화합물을 가진다. 다른 일례로, 본 발명은 동결보존제, 증식을 조절할 수 있는 시약 및 분화를 조절할 수 있는 시약으로서 작용할 수 있는 확인된 화합물을 가진다. 이러한 다용도 화합물은 전구세포와 관련하여 본 출원 전에 발견되지 않았다.
본 발명은, 독립적으로 또는 서로 조합된 전구세포의 동결보존을 향상시키고, 그들의 세포 증식을 조절하고, 그의 분화를 조절할 수 있는 확인된 패밀리 분자 또는 그들의 생물학적 활성 단편을 가지므로, 전구세포와 함께 치료에 사용될 수 있다.
특히, 본 발명은 전구세포가 연골 세포/섬유아세포로 분화되어 연골 또는 섬유 연골을 형성하도록 한다. 따라서, 전구세포 및 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 용도는 퇴행성 질환을 치료하고, 연골/섬유 연골 결함을 치료하고 또는 퇴행성 질환 및 연골 결함의 진행을 예방하거나 최소화하기 위하여 사용될 수 있다.
본 발명은 새로운 확인된 조성물을 가진다. 상기 조성물은 치료학적 용도를 가지며 생체내 또는 시험관내에서 유익하게 사용될 수 있다. 일례로, 본 방법은 생체내에서 수행된다. 또한, 본 방법은 시험관내에서 수행된다.
따라서, 본 발명의 일례로, 의약으로서 사용되는 본원에 기술된 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일례로, 예를 들면 류마티스 관절염(RA), 골관절염(OA), 및 추간판 퇴행(DD), 퇴행성 질환 등의 골근격계의 질환과 같이, 연골의 파손 또는 감소에 의해 발병하는 질환을 치료하기 위한 용도로서 본원에 기술된 조성물 및 연골의 재생, 복구 또는 기질 재생의 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 일례로, 골 형성에 의한 전구세포의 분화가 바람직하지 않은 질환을 치료하는 용도로서 본원에 조성된 조성물을 제공한다. 예를 들면, 골 형성은, 추간판 내 주사(intra-discal injection)와 같이 연조직 재생에 있어서 대게 바람직하지 않다. 디스크로부터 척추관으로 또는 인접 기관(예: 식도)으로의 세포가 누출되면 치명적일 수 있다. 이러한 예로서 척추 융합(신생 골)을 증진시키기 위해 디스크 공간 내에 BMP-2를 배치하는 경우를 들 수 있다. 디스크 공간 옆의 이소성 골 형성으로 인하여 기도 및 신경이 압착되므로, 재조합 골 형성 단백질을 사용하면 생명에 위협적인 합병증이 초래된다.
본 발명의 다른 일례로, 지방 조직의 파손 또는 감소에 의해 발병하는 질환을 치료하는 용도로서 본원에 기재된 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일례로, 예를 들면, 류마티스 관절염(RA), 골관절염(OA), 및 추간판 퇴행(DD), 퇴행성 질환 등의 골근격계의 질환과 같이, 연골의 파손 또는 감소에 의해 발병하는 질환을 치료하기 위한 의약의 제조하기 위하여 본원에 정의된 조성물과 연골의 재생, 복구 또는 기질 재생의 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 일례로, 예를 들면 류마티스 관절염(RA), 골관절염(OA), 및 추간판 퇴행(DD), 퇴행성 질환 등의 골근격계의 질환과 같이, 연골의 파손 또는 감소에 의해 발병하는 질환을 치료하고, 완화시키고, 감소시키고 또는 예방하는 방법, 및 연골의 재생, 복구 또는 기질 재생의 방법으로서, 본원에 정의된 조성물을 치료학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
이러한 적용의 예로는, 본원 발명의 조성물을 연골 또는 디스크 손상이 있는 개인의 관절이나, 또는 신체적으로 접근하기가 어려운 기타 부위에 투여하여, 조직 및 세포를 융합시키기는 것을 허용함으로 특이적 생물학적 효과를 발휘한다. 임상적으로 진단된 질환(예: OA 또는 관련 장애)을 가지는 것은 아니지만, 운동 또는 일-관련 활동으로 인하여 관절 조직에 외상성 부상이 지속되는 개인을 치료하는 데 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 방법 및 용도는 연골 또는 반월판 절제/제거가 필요한 개흉술이나 슬관절 수술 후, 예방법으로서 제공될 수도 있다. 이러한 수술 후의 환자들은 일반적으로 의학적 치료를 요하는, OA 증후를 나타내는 것으로 잘 알려져 있다. 염증을 증진시키는 항원 생성의 감소 때문에, 연골 퇴화를 감소시킴으로써 증상을 호전시키기는 어렵다.
따라서, 환자에게 주입되어 전구세포의 분화 및/또는 세포 증식을 조절하는, 본원에서 논의된 본 발명의 조성물은, 연골의 파손 또는 감소에 의하여 발병되는 질환을 치료하고, 완화시키고, 감소시키고 또는 예방하는데 사용될 수 있다. 특이성 질환으로는 예를 들면, 류마티스 관절염(RA), 골관절염(OA), 및 추간판 퇴행(DD), 퇴행성 질환 등의 골근격계의 질환 및 연골의 재생, 복구 또는 기질의 재생 유도 방법을 포함한다.
일례로, 본 조성물은 정맥 투여된다. 다른 일례로, 본 조성물은 전신 투여된다. 또 다른 일례로, 본 조성물은 관절 내 투여된다. 다른 일례로, 본 조성물은 디스크 내 투여된다. 다른 일례로, 본 조성물은 전신 투여된다.
일례로는 전구세포와 함께 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 환자의 관절 내로 주입하는 방법이 있다. 상기 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 전구세포의 분화 및/또는 증식을 조절하는 것을 돕는다.
폴리설페이트화 폴리사카라이드는 또한 분화된 세포 내에서 히알루로란 또는 하이알루론산(HA)의 생생을 야기하고, 상향 조절하고, 자극한다는 것이 추가적으로 밝혀졌다. 하이알루론산(HA)은 동물 또는 세포, 즉, 생체내 동물 또는 시험관내 세포에서 생성될 수 있다.
이러한 예기치 않은 발견은, 본원 발명의 조성물이 정상적인 마모 및 소모, 퇴행성 질환 또는 기타 급성 외상에 의한 관절 내 HA, 특히 활액의 손실을 대체하는데 사용될 수 있음을 의미한다. 활액이 퇴화할수록, 관절을 보호하고 윤활제 구실 기능이 감소한다. 이는 관절을 더욱 퇴화시키고, 더 심한 손상을 야기하는 자가항원의 생성을 자극한다. 과거, 이러한 문제를 극복하거나 적어도 완화시키기 위한 하나의 방법은 활액을 대체하는 것이었다.
그러나, 본 발명은 활액 자체를 대체할 필요 없이, 하이알루로난 도는 하이알루론산(HA)의 생성을 자극하는 수단을 제공한다. 본 발명의 조성물은, 간엽 세포(예: 연골세포 또는 섬유아세포)로 분화되어 HA의 생성을 증가시키는, 전구세포와 접촉될 수 있다. HA는 제자리(in-situ)에서 형성되고, 활액 내의 HA의 손실을 대체하여, 퇴행성 질환 또는 조직의 퇴화에 의하여 야기되는 손상을 치료하고, 감소시키고 또는 적어도 완화시키는데 사용될 수 있다.
따라서, 다른 일례로 본 발명은 본원에 정의된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 히랄루로난(HA)의 생성을 야기하고, 상향 조절하고 또는 자극하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일례로, 조성물, 방법 및 용도는 관절염 또는 기타 퇴행성 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 그러나 다른 일례로, 본 발명은 관절염 또는 기타 퇴행성 질환을 치료하기 위한 방법을 배제한다. 특히, 일 면으로, 본 발명은 관절염 또는 기타 퇴행성 질환을 치료하기 위하여, 전구세포와 혼합된 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편의 용도를 포함한다.
따라서, 본 발명의 일례로, 류마티스 관절염(RA), 골관절염(OA), 및 추간판 퇴행(DD) 등의 골근격계의 질환, 퇴행성 질환, 윤활 관절의 골관절염, 안과학으로부터 고통받는 환자들을 치료하는 방법, 수술 후 복부 흡착 예방, 피부 치료 및 세포외 기질 기능의 재생 및 복구, 연골 재생, 복구 또는 기질 재생의 유도하기 위한 방법으로서, 전구세포의 분화 및/또는 증식을 조절하기 위하여 본원에 정의된 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
환자 또는 개체는 사람 또는 동물 환자일 수 있다. 일례로, 환자는 인간, 말, 개, 고양이, 양, 소 또는 영장류를 포함하는 포유류이다. 일례로, 환자는 인간이다. 환자는 퇴행성 질환 및/또는 연골 결함을 앓을 수 있다. 환자는 운동 선수이거나 또는 관절의 손상을 야기하는 외상을 입었을 수 있다.
본 발명은 폴리설페이트화 폴리사카라이드 및 전구세포를 포함하는 치료 방법을 포함한다. 본 발명은, 또한 의약으로서 사용되기 위한 폴리설페이트화 폴리사카라이드 및 전구세포, 본원에 논의된 치료용 의약의 제조에 있어서 폴리설페이트화 폴리사카라이드 및 전구세포의 용도, 및 폴리설페이트화 폴리사카라이드 및 전구세포를 함유하는 조성물 및 제제를 포함한다.
병용 요법
본 발명은, 분화 및 세포 증식 또한 조절하고, 특히, 연골 생성 및 세포 증식을 조절할 수 있는 폴리펩티드 또는 그의 생물학정 활성 단편을 최초로 발견하였다. 상기 폴리펩티드는 알파 IX 콜라겐의 비-콜라겐성 NC-4 도메인이거나 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편(이하 NC4)이다. 용어 "생물학적 활성 단편"은 용어 "생물학적 활성 분자 단편"과 동의어이다.
놀랍게도, 본 발명은 두 개의 서로 다른 패밀리가 독립적으로 연골 생성 및 세포 증식을 조절하는 효과를 가질 수 있는 반면, 함께 결합된 경우에는 상승적으로 각각의 효과가 증대될 뿐 아리라 작용의 특이성도 훨씬 향상된다는 것을 발견하였다.
연골 생성을 조절함으로써 특히, 연골 및 추간판의 재건하고, 관절의 퇴해을방지하고, 무혈관성 결합 조직의 재생을 향상시키는 것이 가능하므로, 이러한 예치치 못했던 발견들은 폴리설페이트화 폴리사카라이드가 NC4와 함께 다수의 새로운 곳에 적용될 가능성을 열었다. 본 발명 이전에는 폴리설페이트화 폴리사카라이드 및 NC4가 연골 생성 및 세포 증식을 조절할 수 있다는 것이 공지되지 않았으며, 상기 조합이 상승적 효과를 가진다는 것도 명확히 알려지지 않았다.
따라서, 다른 일례로, 본 발명은 전구세포와 함께 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편 및 NC4 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편을 포함하는 조성물을 제공한다
다른 일례로, 본 조성물은 담체 배지, 배양 배지, 동결보존 배지 및/또는 약리학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다.
따라서, 다른 일례로, 본 발명은 전구세포, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편 및 NC4 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편과 함께 담체 배지를 포함하는 조성물을 제공한다.
담체 배지는 배양 배지, 동결보존 배지 또는 약리학적으로 허용가능한 담체일 수 있다.
전구세포 및 폴리설페이트화 폴리사카라이드에 관한 본 발명의 조성물에 대한 임의적인 참고 또한, 전구세포, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 및 NC4를 함유하는 조성물, 농도, 세포 수 및/또는 선택적 추가 성분의 유형 및 함량에 관한 것이다.
따라서, 본 발명의 다른 일례로, 연골 생성 및/또는 세포 증식을 조절하는 방법으로서, 전구세포, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편 및 NC4 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편을 포함하는 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
따라서, 다른 일례로, 본 발명은 전구세포의 증식을 조절하는 방법으로서, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편 및 NC4 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편을, 전구세포에 노출시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명의 다른 일례로, 본 발명은 전구세포의 분화를 조절하는 방법으로서, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편 및 NC4 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편을, 전구세포에 노출시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
일례로, NC4의 생물학적 활성 분자 단편은 서열 번호:1과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 갖는다.
다른 일례로, NC4의 생물학적 활성 분자 단편은 서열 번호:2과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 갖는다.
다른 일례로, NC4의 생물학적 활성 분자 단편은, 서열 번호:2, 서열 번호: 3, 서열 번호: 4, 서열 번호: 5, 서열 번호: 6, 서열 번호: 7, 서열 번호: 8, 서열 번호: 9, 서열 번호: 10, 서열 번호: 11, 서열 번호: 12, 서열 번호: 13, 서열 번호: 14, 서열 번호: 15, 서열 번호: 16, 서열 번호: 17, 서열 번호: 18, 서열 번호: 19, 서열 번호: 20, 서열 번호: 21, 서열 번호: 22, 서열 번호: 23 또는 서열 번호: 24과 적어도 65%의 아미노산 동일성을 갖는다.
다른 일례로, NC4의 생물학적 활성 분자 단편은 상기 나열된 단편에 대하여 적어도 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 100%의 아미노산 동정을 가진다.
병용 요법의 일부로 본 발명의 조성물을 투여하거나 사용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 본 발명의 폴리사카라이드(들)는 하나 이상의 다른 화합물과 조합되어 사용될 수 있다. 이러한 화합물들은 구조 개질용 골관절염 약물(SMOADs)일 수 있다.
본 발명은, 본원에 논의된 질환의 치료에 사용되는 병용 요법까지 확장될 수 있다. 특히, 일례로, 본 발명은, 여러가지 퇴행성 조건의 치료에서 사용되는 추가제와 조합되는 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 용도로 확장된다. 이러한 시약들은 동시에 또는 다른 시간에 투여될 수 있다. 따라서 병용 요법은 동시에 또는 다른 시간대에 투여되는 단일 제제 형태 또는 다중 제제로서, 동시에 투여되는 활성 시약을, 포함할 수 있다. 동일하게, 병용 요법은 다른 시간대에 상이한 제제로 투여되는 활성제를 포함할 수 있다. 본 제제는 연속해서 투여될 수 있으며, 시간, 일 및 월 등의 시간 간격을 두고 투여될 수 있다.
본 발명은, 하나 이상의 성장 인자와 조합된, 본원에서 논의된 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 용도로 확장된다. 본 발명은 하나 이상의 성장 인자와 조합된, 본원에서 논의된 방법, 용도, 제제 및/또는 조성물을 추가로 포함한다. 가능한 성장 인자로 인슐린계 성장인자, 인슐린, 섬유아세포 유사 성장 인자; BMP-TGF-베타 수퍼 패밀리(예: BMP-2, BMP-7, BMP-8, TGF 베타) 및 섬유아세포 성장인자 패밀리, IGF, FGF, EGF, PDGF 및 VEGF를 포함한다.
도 1. 정상 인간 MSC 냉동/해동 생존에 미치는 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 효과
MSC을 37℃ 수조에서 급속히 해동시키고, HHF(송아지 태아 혈청 5%(v/v) 를 함유한 HBSS)로 2회 세척하였다. 그 후, 세포를 8,000 cells/cm2로 다중 T-75 플라스크에 파종하였다. 세포가 70-80%로 융합되고, 트립신화할 때까지, 세포를 성장시키고, 프로프리즈®/7.5 % DMSO의 세포 농도가 50x106/ml가 되도록 동결보존하였으며, 제시된 농도 내에서 PPS로 보충하였다. 액체 질소 보관으로부터 앰플을 추출하고, 급속히 해동하고, 부드럽게 혼합한 뒤, 0, 30, 60, 90 및 120 분에 각각 10ul 샘플을 취하였다. 각 세포 샘플에, 290ul의 티롭신 블루를 첨가하고, 세포 세수/생존 테스트를 실시하였다. PPS는 세포 생존에 악영향을 미치지 않았다.
도 2. 냉동-해동 사이클을 적용한 뒤, 7.5% DMSO 및 다양한 농도의 펜토산 폴리설페이트(PPS)를 함유하는 극저온의 배지에 부유된, 서로 다른 상이한 수의 뮤린 ATDC5 전구세포의 생존력을 보여주는 막대 그래프.
세포 생존력은 미토콘드리아 디하이드로제나아제 MTT 분석법을 이용하여 측정하였다.
도 3. 도 1에서 설명한 바와 같이 액체 질소 내에서 동결보존 및 급속 해동한 후, 전구세포 생존력에 미치는, 서로 상이한 농도의 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 효과.
세포 생존은 미토콘드리아 디하이드로제나아제 MTT 실험을 이용하여 측정하였다. 제시된 데이타= 평균±SD.
* =대조군 수치에 대한 p < 0.05.
도 4. 인간 전구세포 증식에 미치는 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 효과.
제 1 인간 전구세포를, PPS로 보충된 성장 배지 내의 24 웰 플레이트에서 상기 제시된 농도로 배양하였다. 다양한 시간 간격(1, 3, 6일)을 두고, 성장 배지를 제거하고, 37℃/5% CO2에서 2시간 동안 테트라졸리움염 WST-1을 함유하는 무-페놀레드 배지로 대체하였다. 450nm의 파장에서 ELISA 플레이트 리더기를 이용하여 탐지할 수 있는, 포르마잔 염료(formazan dye)를 생성하기 위해, WST-1는 생존 새포 내에서 미토콘드리아 탈수소효소에 의하여 절단된다. 각각의 시점에 대한 450nm에서의 흡광도를 PPS의 모든 농도에 대해 나타내었다. 증식에서, 통계학적으로 유의한 증가는 6일째 1 ㎕/ml를 초과하는 PPS 농도에서 관측되었다(* p <0.01, ANOVA).
도 5. 미세배양 4일 후,3H-티미딘을 매크로분자 DNA에 결합시켜 측정한, 인간 전구세포에 의한 DNA 합성에 대하여 미치는 펜토산 폴리설페이트(PPS) 농도 의존적 효과 막대 그래프.
* = p < 0.05; ** = 대조군 수치에 대한 p < 0.005
도 6. 아폽토시스 시약(apoptotic agents)으로 처리된 인간 전구세포에 미치는 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 효과.
인간 전구세포를 제시된 농도로 PPS로 보충된 무-혈청 배지 내에 심었다. 30ng/ml IL-4 및 30,000U/ml IFN-감마를 함께 첨가함으로써, 전구세포의 아폽토시스가 야기되었다. 배양 5일 후, 트립신화(trypsinisation)에 의하여 세포를 수확하고, 아넥신 V 염색으로 생존을 평가하였다. 과량의 1㎍/ml PPS 농도에서, 전구세포를 배양한 경우, IFN-감마/IL-4-유도 아폽토시스(아넥신 V 양성 세포)가 2배 감소됨을 관측하였다.
도 7. 인간 전구세포 분화에 미치는 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 효과: 무기화(mineralization) 실험.
제 1 인간 전구세포를 비-골유도 성장 배지(배지 대조) 또는 PPS가 존재하는 골유도 조건(10% FCS로 보충된 알파 MEM, 100 마이크로M L-아스코베이트-2-포스페이트, 덱사메타손 10-7 M 및 3 mM 무기 인산염) 내의 96 웰 플레이트에서 제시된 농도로 배양하였다. 28 일째 날, 크레졸프탈레인 콤플렉손(Cresolphthalein Complexone) 방법을 이용하여 웰 당 칼슘이 용해된 산의 농도를 측정하였다. (A) 형광 DNA 염색(Hoeshst 33258)을 사용하여 웰 당 DNA 총량을 평가한 뒤, DNA/웰 microg 당 칼슘이 용해된 산의 농도를 측정하였다. 1㎍/ml 및 100㎍/ml의 PPS 농도가 사용되었을 때, 무기화된 매트릭스 형성에 있어서 통계학적으로 유의한 감소가 관측되었다(* p <0.01, ANOVA). (B) x20으로 확대한 무기화된 배양의 위상 대조 현미경 사진.
도 8. 인간 전구세포 분화에 미치는 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 영향: 지방 세포의 형성.
제 1 전구세포를 비-지방 성장 배지(배지 대조) 또는 PPS 존재 하는 지방 조건(0.5 mM, 메틸이소부틸메틸산틴, 0.5 μM 하이드로코르티손 및 60 μM 인도메타신) 하의 96 웰 플레이트 내에서 제시된 농도로 배양하였다. 28 일째날, 친유성 염료 오일 레드 O(Oil Red O)를 사용하여 지질 함유 지방세포를 측정하였다. 웰 당 DNA의 총량을 측량한 뒤, 형광 DNA 염색(Hoeshst 33258)을 이용하여 DNA/웰의 총량을 평가한 뒤, DNA/웰 ㎍ 당 용해된 지질의 상대적 양을 측정하였다. (A) 1㎍/ml 과량의 PPS의 농도에서, 지방 세포 수의 통계학적으로 유의한 증가가 관측되었다(* p <0.01, ANOVA). (A) x20으로 확대된, 오일 레드 O가 표지된 지방세포의 위상 대조 현미경 사진.
도 9. 단층 배양으로 성장시킨 경우, 뮤린 전구세포(C3H10T1/2)의 프로테오글리칸(PG) 생합성 및 DNA 함량에 미치는 나트륨 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 농도 의존적 효과. 제시된 데이타는 평균 ± SD를 나타냄.
도 10. 3H-티미딘을 매크로분자 DNA에 결합시켜 측정한, 2일 동안 단층 배양으로 성장시킨 뮤린 전구세포(C3H10T1/2 세포)에 의한 DNA 합성에 미치는 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 농도 의존적 효과의 막대 그래프.
도 11. 인간 전구세포의 단층 배양 2일 후, 방사성 라벨된 설페이트를 PG의 설페이트화 글리코사민글리칸(35S-GAG)에 결합시켜 측정한, 프로테오글리칸(PG)의 생합성에 미치는 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 농도 의존적 효과의 막대 그래프. 이 데이타는 DNA 함량에 대하여 표준화시킨 분당 붕괴도(DPM)로서 35S-GAG 방사능으로 표현된다. * = p < 0.05; ** = p < 0.005; ***= p < 0.0005.
도 12. 뮤린 전구세포(ADTC-5)의 펠렛 배양 6일째, 방사성 표지된 설페이트를 PG의 설페이트화 글리코사미노글리칸(35S-GAG)에 결합시켜 측정한, 프로테오글리칸(PGs)의 생합성에 대한 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 농도 의존적 효과 막대 그래프. * = 대조군에 대한 p < 0.05
도 13. 유지 배지(MM) 내의 다양한 PPS의 농도에서 배양된 6일째 펠렛 배양내 ATDC5 세포에 의한 II형 콜라겐 및 Sox-9의 유전자 발현
도 14. 뮤린 전구세포(ADTC-5)의 6일째 펠렛 배양 내에서, 방사성 표지된 설페이트를 PG의 설페이트화 글리코사미노글리칸(35S-GAG)에 결합시켜 측정한, 프로테오글리칸(PGs)의 생합성에 미치는 헤파린의 농도 의존적 효과 막대 그래프. 헤파린은 상기 세포주 내 1.25 - 20 ㎍/mL 농도 범위에 대해 연골형성 효과를 보이지 않는다.
도 15. 뮤린 전구세포(C3H10T1-2)의 7일째 펠렛 배양 내에, 방사성 표지된 설페이트를 PG의 설페이트화 글리코사미노글리칸(35S-GAG)에 결합시켜 측정한, 프로테오글리칸(PGs)의 생합성에 대한 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 농도 의존적 효과 막대 그래프.
도 16. 6일 및 9일 동안, 미세배양 내의 뮤린 전구세포(C3H10T1-2)에 의한 프로테오글리칸 생합성에 미치는 PPS의 농도 의존적 효과를 보여주는 막대 그래프. PPS는 배지(햄의 F12+10%FCS)에 포함되어 있으며, 48시간마다 교체되었다. 배양 종료 24시간 전에 35S-SO4을 첨가하였다. 합성은 DNA 함량에 대해 표준화시켰다. 대조군에 대한 * P < 0.05, **P < 0.005, ***P < 0.0005.
도 17. 5일 동안, 미세배양 내의 인간 전구세포에 의한 프로테오글리칸 합성에 미치는 PPS의 농도 의존적 효과를 보여주는 막대 그래프. 데이타는 35S-GAG 방사능으로 나타내었으며, 대조군의 백분율을 100%로 잡았다. 대조군에 대한 * P < 0.05.
도 18. B에 도시된 면역염색된 미세배양을 스캐닝 및 디지털 분석 측정한, 10일 동안, 미세배양 내의 인간 전구세포에 의한 II형 콜라겐의 생성에 미치는 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 농도 의존적 자극의 보여주는 막대 그래프. (상세한 내용은 본문 참조)
도 19. 5일 동안, 미세배양 내의 인간 전구세포에 의한 프로테오글리칸의 생합성에 미치는 (A) 하이알루론산(SupartzTM) 및 (B) 덱스트란 폴리설페이트의 농도 의존적 효과를 보여주는 막대 그래프. 데이타는 35S-GAG 방사능으로 나타내었으며, 대조군의 백분율을 100% 또는 DPM/㎍ DNA로 잡았다. 대조군에 대한 * P < 0.05.
도 20. 제시된 농도에서, PPS 및/또는 하이알루론산(SupartzTM)으로 보충된 제 1 인간 전구세포 성장 배지를 배양한 결과를 보여준다. 다양한 시간 간격(3일 및 5일)으로, 성장 배지를 제거하고, 2시간 동안 37℃/5% CO2에서 테트라졸리움염 WST-1를 함유하는 무-페놀 레드 배지로 대체하였다. 각 시점에 있어서 PPS 및 HA의 모든 농도에 대한 450nm에서의 흡수량을 나타내었다. 본 실험은 HA 및 PPS가 전구세포의 증식을 자극하는데 상승적 효과를 가지지 않음을 나타낸다.
도 21. 뮤린 ATDC5 전구세포로 3일 배양 후, 방사성 표지된 설페이트를 PG의 설페이트화 글리코사미노글리칸(35S-GAG)에 결합시켜 측정한, 인슐린(10 μg/mL)의 부재(유지 배지, MM) 및 존재(분화 배지, DM) 하에서, 프로테오글리칸(PG)의 생합성에 미치는 K. 락티스에 의하여 발현되는 rhNC4(배치 PBA-1202P)의 농도 의존적 효과의 막대 그래프. 데이타는 rhNC4을 함유하지 않은 대조군 배양에 대한 % 변화율로 나타내었다. P < 0.05는 대조군 배양에 비하여 통계학적으로 유의함을 의미한다.
도 22. 인슐린(10 μg/mL)의 부재(유지 배지, MM) 및 존재(분화 배지, DM) 하에서, ATDC5 세포의 펠렛 배양 내의 프로테오글리칸(PG)의 생합성에 미치는 K. 락티스에 의하여 발현되는 rhNC4(배치 PBA-1202P)의 농도 의존적 효과 막대 그래프. 데이타는 대조군을 100%로 잡은 경우에 대한 % 변화율로 나타내었다.
도 23. 뮤린 ATDC5 전구세포로 1일 배양 후, 방사성 표지된 3H-티미딘의 결합에 의하여 측정한, 인슐린(10 μg/mL)의 부재(유지 배지, MM) 및 존재(분화 배지, DM) 하에서, 매크로분자 DNA의 생합성에 미치는 K. 락티스에 의하여 발현되는 rhNC4(배치 PBA-1202P) 및 펜토산 폴리설페이트(PPS)(2 μg/mL)의 농도 의존적 효과 막대 그래프. 데이타는 rhNC4을 함유하지 않은 대조군 배양에 대한 % 변화율로 나타내었다. P < 0.05는 대조군 배양에 비하여 통계학적으로 유의하다.
도 24. 뮤린 ATDC5 전구세포의 단층 배양에 의한 35S-PG의 생합성에 미치는 rhNC4(배치 PBA-1202P) 및 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 조합의 농도 의존적 효과 막대 그래프. 데이타는 대조군(유지 배지, MM)을 100%로 잡은 경우에 대한 % 변화율로 나타내었다.
도 25. 단층 배양 내의, rhNC4(배치 PBA-1202P) 및 PPS의 존재 및 부재 하에서 2일 동안 배양된, 뮤린 ATDC5 전구세포에 의해 발현되는 골 마커 Runx2, MGP, HAS3, CD44 및 하우스키핑 유전자 NADPH의 유전자 발현에 대한 RT-PCR 검출
도 26. 단층 배양 내에서 2일 동안 rhNC4(배치 PBA-1202P) 및 PPS의 존재 및 부재 하에서 배양된 뮤린 ATDC5 전구세포에 의하여 발현되는 Runx2 및 전달 단백질, Smad 2 및 Smad 4 및 하우스키핑 유전자 NADPH의 유전자 발현의 RT-PCR 검출
도 27. 3H-글루코사민을 HA에 결합시켜 측정한, 전구세포에 의한 하이알루로난(HA)의 생합성에 미치는 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 효과를 보여주는 크로마토그래피 용출 프로파일. 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 다양한 농도 하에서 9일 동안 미세배양된 인간 전구세포 배지의 슈퍼덱스-S200 크로마토그래피 프로파일이 패널 A 내지 D에 도시되었다. 히알라제 분해 전, 방사성 프로파일은, 세포에 의해 3H-글루코사민이 HA 및 PG 모두에 결합되었지만, 분해 후에는 오직 3H-PG만이 컬럼의 공극 용적(void volume)에 남아 있음을 보여준다. 공극 용적 구획 내 분해되기 전 및 분해된 샘플의 프로파일 면적의 % 변화율은 특정 PPS 농도에 의해 배지로 방출된 3H-HA 량을 나타낸다.
도 28. 뮤린 ATDC5 전구세포로 3일간 배양한 뒤, 3H-티미딘을 매크로분자 DNA에 결합시켜 측정한, 인슐린(10 μg/mL)의 부재 및 존재 하에서 DNA 합성에 미치는, K. 락티스 효모 세포에 의하여 발현되는 rhNC4(배치 PBA-1202P)의 농도 의존적 효과의 막대 그래프. 데이타는 rhNC4을 함유하지 않은 대조군 배양에 대한 % 변화율로 나타내었다. P < 0.01은 대조군 배양에 비하여 통계학적으로 유의하다.
도 29. 뮤린 ATDC5 전구세포 수로 3일간 배양한 뒤에, 인슐린(10 μg/mL)의 부재 및 존재 하에서, DNA 합성에 미치는 K. 락티스 효모 세포에 의하여 발현되는 rhNC4(배치 PBA-1202P)의 농도 의존적 효과의 막대 그래프. 데이타는 rhNC4을 함유하지 않은 대조군 배양에 대한 % 변화율로 나타내었다. P < 0.01은 대조군 배양에 비하여 통계학적으로 유의하다.
도 30. 13일 동안 대조군에 대한 rhNC4(배치 PBA-1200P)(5 ㎍/ml) 또는 인슐린(10㎍/ml)에 의해 유도되는 ATDC5 세포 성장의 동역학 막대 그래프. 0일 째(시작)에 웰 당 20,000개의 세포를 파종하고, 매 48시간 마다 배지를 변경하였다. 인슐린 처리된 배양액은 6일째 합류(confluent) 상태에 이르렀고, PBA-1200P는 9일 째 이르렀다. 대조군 배양액 또한 9일째 합류에 이르렀지만, 인슐린 또는 PBA-1200P을 함유하는 배양액은 복제를 멈추었다.
도 31. 뮤린 ATDC5 전구세포로 3일간 배양한 후, 방사성 표지된 설페이트를 PG의 설페이트화 글리코사미노글리칸(35S-GAG)에 결합시켜 측정한, 인슐린(10 μg/mL)의 부재(유지 배지, MM) 또는 존재(분화 배지, DM) 하에서, 프로테오글리칸(PG)의 생합성에 미치는 K. 락티스에 의해 발현되는 rhNC4(배치 PBA-1202P)의 농도 의존적 효과 막대 그래프. 데이타는 rhNC4를 함유하지 않은 대조군 배양액에 대한 상대적 변화%로 표시된다. P < 0.05는 대조군 배양에 비하여 통계학적으로 유의하다. 도 31은 인슐린의 존재 및 부재 하에서, rhNC4는 전구세포 ATDC5 세포에 의한 PC 합성을 자극하지만, 인슐린이 부재한 경우에는 더 높은 농도에서 효과적임을 나타낸다.
도 32. 뮤린 ATDC5 전구세포로 3일간 배양한 후, 방사성 표지된 설페이트를 PG의 설페이트화 글리코사미노글리칸(35S-GAG)에 결합시켜 측정한, 인슐린(10 μg/mL)의 부재 또는 존재 하에서, 프로테오글리칸(PG)의 생합성에 미치는 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 농도 의존적 효과 막대 그래프. 데이타는 PPS를 함유하지 않은 대조군 배양액에 대한 분당 수셈(CPM) 및 분 당 붕괴(DPM)로서 35S-GAG 방사능을 나타내었다. P < 0.05는 대조군 배양에 비하여 통계학적으로 유의하다. 도 32는 PPS 존재 하에서, 뮤린 ATDC5 전구세포에 의한 PG 합성의 농도 의존적 자극임을 보여준다.
도 33. 뮤린 ATDC5 전구세포로 1일간 배양한 후, 방사성 표지된 글루코사민을 PG의 글리코사미노글리칸(35H-GAG)에 결합시켜 측정한, 인슐린(10 μg/mL)의 부재(유지 배지, MM) 또는 존재(분화 배지, DM) 하에서, 프로테오글리칸(PG)의 생합성에 미치는, K.락티스에 의해 발현되는 rhNC4(배치 PBA-1202P) 및 나트륨 펜토산 폴리설페이트(PPS)(2 μg/mL)의 농도 의존적 효과 막대 그래프. 데이타는 rhNC4을 함유하지 않은 대조군 배양에 대한 % 변화율로 나타내었다. P < 0.05는 대조군 배양에 비하여 통계학적으로 유의하다.
도 34. 뮤린 ATDC5 전구세포로 3일간 배양한 후, 3H-티미딘을 매크로분자 DNA에 결합시켜 측정한, DNA 합성(세포 복제)에 미치는 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 농도 의존적 효과 막대 그래프. 데이타는 PPS를 함유하지 않는 대조군 배양액에 대한 % 변화율로 나타내었다.
도 35. 서열 번호:1 -신호 펩티드가 제외된, 총-길이 인간 NC4의 아미노 염기 서열
도 36. 서열 번호:2-K, 락티스로부터의 발현 동안 획득된 결절 hNC4의 아미노 염기 서열
도 37. 소, 인간, 뒤 및 영계 NC4의 염기서열의 염기서열 조성물
본 명세서 및 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 본문에서 명백하게 언급하지 않는 한 복수도 포함한다. 예를 들어, "폴리펩티드"는 그의 혼합물과 같은 복수의 폴리펩티드를 포함한다.
본원에서 사용된 용어 "~로부터 유래된"은 특정 근원으로부터 얻어지는 완전체(integer)를 의미하지만, 그 근원으로부터 반드시 직접적으로 얻어질 필요는 없다.
"조성물"은 활성제 및 다른 화합물 또는 조성물, 보조제와 같은 불활성(예: 검출가능한 시약 또는 표지) 또는 활성제의 조합을 의미하는 것으로 이해된다.
본문에서 별도로 요하거나, 반대로 특별히 언급하지 않는 한, 단수형의 물질, 단계 또는 요소로서 본원에 인용된 본 발명의 물질, 단계 또는 요소는 인용된 물질, 단계 또는 요소의 단수형 및 복수형 형태 모두를 명백히 포함한다.
본원에 기술된 본 발명의 일례는 필요한 경우 변경을 가하여 본원에 기술된 본 발명의 임의의 다른 예에 적용된다.
본문에서 요구되지 한, 명세서의 용어 "포함하다" 또는 이의 변형인 "포함한다" 또는 "포함하는"은 전술된 단계, 요소, 물질, 또는 단계, 요소 또는 물질의 그룹을 포함하지만, 기타 임의의 단계, 요소, 물질, 또는 요소 또는 물질의 그룹을 제외하는 것으로 해석된다.
당업자는 본원에 특별히 기술된 것 이외에도 변형 및 개조될 수 있는 것으로 이해한다. 본 발명은 모든 상기 변형 및 개조를 모두 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명은 모든 단계, 특징, 조성물 및 본원에서 인용되거나 언급된 화합물을 독립적으로 또는 집단적으로 포함하며, 모든 및 임의의 조합 또는 상기 단계 또는 특징을 2 개 이상 포함한다.
본 발명은 본원에 기술된 특정 예로 제한되지 않는다. 본원에 기술된 바와 같이, 기능적으로 균등한 생성물, 조성물 및 방법은 본 발명의 범위 내인 것이 명백하다.
본 발명은 언급하지 않는 한, 분자 생물학, 미생물학, 바이러스학, 재조합 DNA 기술, 용액 내에서의 펩티드 합성, 고상의 펩티드 합성, 및 면역학 등의 통상의 기술을 이용하여 과도한 실험 없이 수행될 수 있다. 이러한 공정의 예로는 하기 문헌에 기술되어 있으며, 이는 본원에 포함된다.
1. Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, Second Edition (1989), whole of Vols I, II, and III;
2. DNA Cloning: A Practical Approach, Vols. I and II (D. N. Glover, ed., 1985), IRL Press, Oxford, whole of text;
3. Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (M. J. Gait, ed., 1984) IRL Press, Oxford, whole of text, and particularly the papers therein by Gait, pp 1-22; Atkinson et al., pp35-81; Sproat et al., pp 83-115; and Wu et al., pp 135-151;
4. Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds., 1985) IRL Press, Oxford, whole of text;
5. Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984);
6. Wiinsch, E., ed. (1974) Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metoden der Organischen Chemie (Miiler, E., ed.), vol. 15, 4th edn., Parts 1 and 2, 30 Thieme, Stuttgart.
7. Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)
전구세포
본 발명은 전구세포에 관한 것이다. 광범위한 예로, 용어 전구세포는 모든 다능성 세포를 포함하는 것으로 이해된다. 따라서, 용어 전구세포는 성체 및 태아 줄기세포를 포함한다.
전구세포는 간엽 전구세포일 수 있다.
전구세포는 내인성 또는 외인성 태아 또는 성체 간엽 또는 간엽 전구세포일 수 있다. 전구세포는 다능성 간질 세포일 수 있다. 전구세포는 성체의 미분화된 간엽세포일 수 있다.
전구세포는 연골 전구세포 일 수 있다.
전구세포는 골수로부터 유래될 수 있다. 또한, 전구세포는 연골, 활막 조직, 근육, 지방 조빅, 피부, 탯줄, 치수 또는 기타 이용가능한 근원으로부터 유래될 수 있다.
전구세포는 외인성 인자에 의하여 분화가 억제된 결합 조식 세포와 같은 체세포일 수 있다.
다른 일례로, 전구세포는 Stro-1bri, 또는 동종의 Stro-1bri세포 또는 Stro-1bri자손세포가 풍부한 세포군이다.
전구세포의 하나의 타입은 간엽 전구세포(MCP)이다. 근본적으로 골수로부터 유래하며, 정상 조직의 전환, 손상 또는 노화에 의해 손실된 국부 세포를 대체하고 재생시키는 기능을 수행하는 것으로 간주되는, MPC 및 MCP계 세포는 다수의 성체 조직에 존재하는 것으로 확인되었으며, 이로부터 분리될 수 있다. 이러한 조직으로는 지방 세포, 골막, 윤활막, 활액(SF), 근육, 진피, 유치, 혈관주위세포(pericyte), 해면골(trabecular bone), 슬개하 지방대(infrapatellar fat pad) 및 관절 연골이 있다.
MCP는 형질 마커 및 다능성 분화 기능적 성질의 조합을 포함하는, 시험관내에서의 특징적 무리로 정의된다.
플라스틱 접착은 가장 일반적으로 사용되고, 간엽 세포용의 단순한 분리 과정으로 사용되지만, MPC 수득량 및 균질성을 높이기 위하여, 여러가지 양성 및 음성 표면 마커(예를 들면, Stro-1, CD146/흑색종 접착 분자, CD271/저 친화도 신경 성장 인자 및 상-특이적 태아 항원-4(stage-specific embryonic antigen-4))도 사용되었다. 또한, 표면 마커, 예를 들면 CD140b(혈소판 유도 성장인자 수용체-D), CD340(HER-2/erbB2), 및 CD349(frizzled-9)의 추가적인 패널은 CD217와 함께 MPC의 농화를 위하여 사용될 수 있다.
추가적인 전구세포는 세포주 C3H10T1/2 및 ATDC5 또는 M111 전구세포와 같은 쥐과의 전구세포를 포함한다. C3H10T1/2는 섬유아세포계 형질을 가지는 암컷 C3H/He 뮤린 계열의 골수로부터 유래되는 전구 줄기세포 주이다. ATDC5 세포는 상피계 형질을 가지는 연골 전구세포주로부터 유래되는 뮤린 배아이다.
C3H10T1/2 세포주는 1973년에 14 내지 17일 생의 C3H 뮤린 배아로부터 확립되었다. 이들 세포는 세포 배양에 있어서 섬유아세포 형질을 나타내며, 기능적으로 간엽 줄기 세포와 유사하다. 5-아자사이티딘을 가진 C3H10T1/2 세포 내에서의 메틸화의 저해는 근육, 지방, 골 또는 연골 세포의 안정적인 형질 및 생화학적 특징을 유도하였다. 이는 메틸화의 저해에 의한 내인성 유전자의 활성에 의하여 상기 형질 변화가 유도되는 것임을 시사한다. 또한, 형질 전환성장인자 타입-베타 수퍼패밀리의 멤버인 골 형질 단백질 4(BMP4)는, 지방 세포를 분화 프로토콜로 처리한 경우, 지방 세포 형질의 세포로 발전하는 지방전구세포로의 C3H10T1/2 세포의 수임(commitment)을 유도할 수 있다(Tang Qi-Qun, Otto TC, Lane MD. Commitment of C3H10T1/2 pluripotent stem cells to the adipocyte lineage. Pro Natl Acad Sci USA, 2004; 101: 9607 -9611). ATDC5 세포주를 먼저 AT805 기형암종(teratocarcinoma)의 분화 배양으로부터 분리하였다. ATDC5 는 성장기에 섬유아세포 형질을 발현시켰다. ATDC5 세포주에 대한 추가적인 정보는 [Atsumi T, Miwa Y, Kimata K, Ikawa Y. A chondrogenic cell line derived from a differentiating culture of AT805 teratocarcinoma cells. Cell Differ Dev. 1990; 30: 109-16]에서 확인할 수 있다.
전구세포는 Stro-1bri가 풍부한 세포군일 수 있다. 전구세포는 동종의 Stro-1bri 세포 또는 Stro-1bri의 자손세포일 수 있다.
Stro-1bri 세포는 골수, 혈액, 치수세포, 지방 조식, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장, 간, 심장, 신장, 모낭, 소장, 폐, 림프절, 흉선, 골, 인대, 건, 골격근, 진피 및 골막에서 발견되는 세포이며, 전형적으로 중배엽 및/또는 내배엽 및/또는 외배엽과 같은 생식계로 분화할 수 있다. 따라서, Stro-1bri 세포는 지방의, 골의, 연골의, 탄성, 근육 및 섬유 결합 조직에 제한되지 않지만 이를 포함하는 다수의 세포 타입으로 분화될 수 있다. 특이적 계열-수임 트 및 세포가 돌입하는 분화 경로는, 기계적 영향 및/또는 성장 인자, 사이토카인과 같은 내인성 생체 활성 인자 및/또는 숙주 조직에 의해 확립된 국부 미소 서식 환경 조건에 의한 다양한 영향에 의존한다. 따라서, Stro-1bri 세포는 시간에 따라 비가역적으로 분화하여 형질 세포를 생성하는 줄기 세포 또는 전구세포(precursor cell)인, 딸 세포로 분할되는, 비-조혈 전구세포일 수 있다.
또 다른 일례로, Stro-1bri 세포는 개체, 예를 들면, 치료받는 개체 또는 관련 개체 또는 비관련 개체(동일한 종이거나 다른 종)로부터 얻은 샘플로부터 농화된다. 본원에서 용어 '농화된', '농화' 또는 이의 변형은 치료받지 않는 군과 비교하였을 때, 하나의 특정 세포 타입의 일부 또는 다수의 특정 세포 타입의 일부가 증가된 세포군을 기술하기 위하여 사용된다.
다른 일례로, 본원에서 사용되는 세포는 TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ 또는 이들의 임의 조합으로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 또는 집단적으로 선택되는 하나 이상의 마커를 발현한다.
"독립적으로"은 본 발명이 인용된 마커 또는 마커 군을 별개로 포함하고 있음을 의미하지만, 개별 마커 또는 마커 군은 별도로 기재하지 않을 수 있으며, 본원의 특허청구범위는 상기 마커 도는 마커 군을 각각 별개로 또한 분리하여 정의할 수 있다.
"집단적으로"은 본원 발명이인용된 마커 또는 펩티드 군의 조합 또는 다수를 포함하지만, 상기 마커 또는 펩티드 군의 조합 또는 수는 본원에 구체적으로 기재하지 않을 수 있으며, 본원의 특허청구범위는 상기 조합 또는 하부 조합을 마커 또는 마커 군의 다른 조합으로부터 분리하여 별개로 정의할 수 있다.
일례로, Stro-1bri세포는 추가적으로 하나 이상의 TNAP+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+ 및/또는 CD146+이다.
주어진 마커에 대하여 "양성"이라 불리는 세포는, 세포 표면에 존재하는 마커의 정도에 대하여 낮은(lo 또는 dim) 또는 높은(bright, bri) 레벨의 마커를 발현하며, 상기 용어는 형광 강도 또는 세포 분류 과정에서 사용되는 기타 마커에 관한 것이다. lo(희미한 또는 둔탁한) 및 bri의 구분은 분류된 특성 세포군 상에서 사용되는 마커의 맥락에서 이해된다. 주어진 마커에 대하여 "음성"이라 불리는 세포는 반드시 상기 세포에서 완전히 부재한 것은 아니다. 본 용어는 마커가 상기 세포에 비하여 상대적으로 매우 낮은 레벨로 발현되었음을 의미하여, 검출가능하도록 표지시 매우 낮은 신호를 발생하거나, 백그라운드 레벨에 대해 검출불가능함을 의미한다.
본원에 있어서, 용어 "밝은"은 검출가능하게 표지되었을 때, 세포 표면 상에서 상대적으로 높은 신호를 발생하는 마커를 말한다. 이론에 제한되지는 않으면서, "밝은" 세포는 샘플 내의 다른 세포보다 타겟 마커 단백질(예를 들면, STRO-1에 의하여 인식되는 항원)을 더 발현하는 것으로 제안된다. 예를 들면, FITC-콘쥬게이트된 STRO-1 항체로 표지되었을 때, 형광 활성 세포 분류(FACS) 분석에 의하여 측정된 STRO-1bri 세포는, 밝지 않은 세포(STRO-1dull / dim)보다 큰 형광 신호를 발생한다. 일례로, "밝은" 세포는 시작 샘플에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵세포를 약 0.1% 이상 포함한다. 다른 예로, "밝은" 세포는 시작 샘플에 함유된 가장 밝게 표지된 골수 단핵세포를 약 0.1% 이상, 약 0.5% 이상, 역 1% 이상, 약 1.5% 이상, 약 2% 이상으로 포함한다. 다른 일례로, STRO-1bright 세포는 "백그라운드", 즉, STRO-1-인 세포에 비하여, STRO-1 표면 발현이 2 log 배 높다. 비교하면, STRO-1dim 및/또는 STRO-1intermediate 세포는 STRO-1 표면 발현이 2 log 배보다 적으며, 전형적으로 "백그라운드"보다 적거나 1 log 이다.
본원에 사용되는 용어 "TNAP"는 이소형 조직 비-특이적 알칼리성 포스파타제를 포함하는 것으로 해석된다. 예를 들면, 상기 용어는 간 이소형(LAP), 골 이소형(BAP) 및 신장 이소형(KAP)를 포함한다. 다른 예로, TNAP는 BAP이다. 또 다른 예로, 본원에 사용되는 TNAP는 부다페스트 조약 하에서 2005년 12월 19일에 기탁 번호 PTA-7282로 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주(hybridoma cell line)에 의하여 생성된 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자를 의미한다.
또한, 다른 예로, Stro-1bri 세포는 집락 CFU-F를 생성할 수 있다.
일례로, 다능성 세포의 상당 부분은 2개 이상의 다른 생식 계열로 분화할 수 있다. 다능성 세포가 수임할 수 있는 계열의 비제한적인 예로는 골 전구세포; 담관 상피 세포 및 간세포에 대해 다능성체 간 전구세포; 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 및 성상교 세포(astrocyte)로 진행하는 신경 교세포(glial cell) 전구세포를 생성하는 신경 제한 세포(neural restricted cells); 뉴런을 생성하는 신경 전구세포; 심근 및 심근세포의 전구세포, 글루코스-반응성 인슐린을 분비하는 췌장 베타 세포주를 포함한다. 다른 계열으로는 상아모세포(odontoblasts), 상아질-생성 세포 및 연골 세포, 및 하기의 전구세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 망막색소상피세포(retinal pigment epithelial cells), 섬유아세포, 각질형성세포(keratinocytes)와 같은 피부 세포, 수지상 세포(dendritic cells), 모낭 세포, 신장관 상피세포(renal duct epithelial cells), 평활근 및 골결근, 고환 전구세포, 혈관 내피세포, 건, 인대, 연골, 지방세포, 섬유아세포, 골수 간질, 심장근, 평활근, 골격근, 혈관주위세포, 혈관 세포, 내피 세포, 신경 교세포, 뉴런 세포, 성상교세포(astrocyte) 및 희소돌기아교세포.
다른 일례로, Stro-1bri 세포는 배양 후, 조혈세포를 생성할 수 있다.
일례로, 세포를 치료받는 개체로부터 취하여, 시험관내에서 표준 기술을 사용하여 배양하고, 자가 또는 동종 조성물로서, 개체에 투여하기 위해 확장된 세포를 얻는데 사용된다. 또 다른 일례로, 하나 이상의 확립된 인간 세포주의 세포가 사용된다. 본 발명의 또 다른 유용한 예로, 비-인간 동물 세포(또는 환자가 인간이 아니면, 다른 종으로부터 얻어진 세포)가 사용된다.
본 발명은 전구세포가 포함된 시험관내 배양액에서 생성된 Stro-1bri 세포 및/또는 그의 자손 세포(후자는 또한 확장된 세포로도 불린다)로부터 유래되거나 얻어진, 상층액 또는 가용성 인자의 용도를 포함한다. 본 발명의 확장된 세포는 배양 조건(배양 배지 내의 자극인자 타입 및/또는 수), 세대 수 등에 의하여 다양한 형질을 가진다. 일례로, 자손 세포는 모군으로부터 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9 또는 약 10 세대 후에 얻어진다. 그러나, 자손 세포는 모군으로부터 임의의 세대 수 후에 얻을 수 있다.
자손세포는 적절한 배지 내에서 배양됨으로써 얻어질 수 있다. 용어 "배지"는 세포 주위 환경의 성분을 포함하여, 세포 배양액을 의미하는 것으로 사용된다. 배지는 고체, 액체, 기체 또는 상들 및 물질의 혼합물일 수 있다. 배지는 액체 성장 배지뿐 아니라 세포 성장을 유지하지 않는 액체 배지를 포함한다. 배지는 또한 아가, 아가로스, 겔라틴 및 콜라겐 매트릭스와 같은 겔라틴성 배지를 포함한다. 기체 배지의 예로는, 페트리 디쉬 또는 다른 고체 또는 반고체 지지체 상에서 성장하는 세포가 노출되는, 기체 상일 수 있다. 또한, 용어 "배지"는, 세포와 접촉되지는 않더라도 세포 배양액 내에서 사용되는 것으로 의도된 물질을 말한다. 즉, 박테리아 배양용으로 제조된 영향이 풍부한 액체도 배지이다. 물 또는 기타 액체와 혼합되었을 때, 세포 배양액으로 적합한 분발 혼합은 "분말 배지"로 칭한다.
일례로, 본 발명의 방법에 유용한 자손 세포는, STRO-3 항체가 표지된 자석 비드를 이용하여 골수세포로부터 TNAP+ STRO-1+ 다능성 세포를 분리함으로써 얻어지며, 그 후 분리된 세포들을 확장 배양한다(참조: 적절한 배양 조건의 예, Gronthos et al . Blood 85: 929-940, 1995)
일례로, 상기 확장된 세포(자손)(선택적으로 적어도 5세대 이후)는 TNAP-, CC9+, HLA class I+, HLA class II-, CD14-, CD19-, CD3-, CD11a-c-, CD31-, CD86-, CD34-및/또는 CD80-일 수 있다. 그러나, 본원에서 기술한 것과 다른 배양 조건 하에서, 다른 마커의 발현은 다양할 수 있다. 또한, 상기 형질의 세포들은 확장된 세포군 내에서 우세할 수 있지만, 세포의 적은 부분이 이러한 형질을 가지지 않는 것을 의미하는 것은 아니다(예를 들면, 확장된 세포의 적은 부분이 CC9- 일 수 있다). 일례로, 확장된 세포는 다른 세포 타입으로 분화하는 능력을 여전히 가진다.
일례로, 상층액 또는 가용성 인자 또는 세포 자체를 획득하기 위하여 사용되는 확장된 세포군은, 세포의 25% 이상, 또 다른 예로는, 50% 이상이 CC9+인 세포를 포함한다.
또 다른 일례로, 상층액 또는 가용성 인자 또는 세포 자체를 획득하기 위하여 사용되는 확장된 세포군은, 세포의 40% 이상, 또 다른 예로는, 45% 이상이 STRO-1+인 세포를 포함한다.
또 다른 일례로, 확장된 세포는, LFA-3, THY-1, VCAM-1, ICAM-1, PECAM-1, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD90, CD29, CD18, CD61, 인테그린 베타 6-19, 트롬보모듈린, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, Leptin-R (STRO-2 = Leptin-R), RANKL, STRO-1bright 및 CD146 또는 이러한 마커들의 임의의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 집단적으로 또는 개별적으로 발현할 수 있다.
일례로, STRO-1bri 세포로부터 유래되는 자손 세포는 마커 Stro-1dim에 대하여 양성이다. 이러한 세포는 조직 특이성 수임 세포(TSCCs)라 불리며 STRO-1bri 세포보다 더 분화되되므로, 감응 인자에 대하여 덜 반응한다. TSCCs가 수임하는 계열의 비한적인 예로는, 담관 상피 세포 및 간세포에 대해 다능성체 간 전구세포; 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 및 성상교 세포(astrocyte)로 진행하는 신경 교세포(glial cell) 전구세포를 생성하는 신경 제한 세포(neural restricted cells); 뉴런으로 진행되는 신경 전구세포; 심근 및 심근세포의 전구세포, 글루코스-반응성 인슐린을 분비하는 췌장 베타 세포주를 포함한다. 다른 수임 전구세포로는 연골 세포, 골아세포, 상아모세포(odontoblasts), 상아질-생성 세포 및 연골 세포, 및 하기의 전구세포를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다: 망막색소상피세포(retinal pigment epithelial cells), 섬유아세포, 각질형성세포(keratinocytes)와 같은 피부 세포, 수지상 세포(dendritic cells), 모낭 세포, 신장관 상피세포(renal duct epithelial cells), 평활근 및 골결근, 고환 전구세포, 혈관 내피세포, 건, 인대, 연골, 지방세포, 섬유아세포, 골수 간질, 파골세포(osteoclast) 및 조혈-보조 간질(haemopoietic-supportive stroma), 심장근, 평활근, 골격근, 혈관주위세포, 혈관 세포, 내피 세포, 신경 교세포, 뉴런 세포, 성상교세포(astrocyte) 및 희소돌기아교세포. 전구세포는 특히, 지방 세포, 소공(areolar), 골성(osseous), 연골, 탄성 및 섬유 결합조직과 같은 결합 조직에 이를 수 있는 것들을 포함한다.
또 다른 일례로, 자손 세포는 WO 2006/032092에서 정의되고 및/또는 기술된 다능성 확장된 STRO-1+ 다능성 세포 자손(MEMPs)이다. 자손 세포가 유래될 수 있는 STRO-1+ 다능성 세포가 농화된 군의 제조방법은, WO 01/04268 및 WO 2004/085630에 기술되어 있다. 시험관내 STRO-1+ 다능성 세포는 완전 순수한 제제로 거의 존재하지 않으며, 일반적으로 조직 특이적 수임 세포(TSCCs)인 다른 세포들과 함께 존재한다. WO 01/04268는 상기 세포를 골수세포로부터 약 0.1% 내지 90%의 순도로 수확하는 것에 대해 언급한다. 자손 세포가 유래되는 전구세포를 포함하는 군은 조직 근원으로부터 직접적으로 수확되거나, 또한 생체 외(ex vivo)에서 이미 확장된 군일 수도 있다.
예를 들면, 자손은 수확되고, 확장되지 않은, 실질적으로 정제된 STRO-1+ 다능성 세포군으로부터 얻어질 수 있으며, 상기 다능성 세포가 존재하는 군의 총 세포의 약 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 95% 이상을 포함한다. 예를 들면, TNAP, STRO-1bright, 3G5+, VCAM-1, THY-1, CD146 및 STRO-2로 이루어진 군으로부터 개별적으로 또는 집단적으로 선택되는 하나 이상의 마커에 대하여 양성체 세포를 선택함으로써, 이러한 레벨이 달성된다.
MEMPS는 마커 STRO-1bri에 대하여 양성이며 마커 알칼라인 포스파타제(ALP)에 대하여 음성이라는 점에서, 새로 수확된 Stro-1bri 세포와는 구별된다. 반대로, 새로 분리된 Stro-1bri 세포는 STRO-1bri 및 ALP에 대하여 모두 양성이다. 본 발명의 다른 일례로, 투여되는 세포의 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95% 이상이 STRO-1bri 및 ALP-의 형질을 가진다. 또 다른 일례로, MEMPS는 하나 이상의 마커 Ki67, CD44 및/또는 CD49c/CD29, VLA-3, α3β1에 대하여 양성이다. 또 다른 일례로, MEMP는 TERT 활성을 가지지 않으며 또는 마커 CD18에 대하여 음성이다.
Stro-1bri 세포 시작 군은 골수, 치수 세포, 지방 조직 및 피부를 포함하는 하나 이상의 조직 타입으로부터 유래되거나 또는 더욱 광범위하게 지방 조직, 치아, 치수, 피부, 간 신장, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 소장, 폐, 비장, 림프절, 흉선, 췌장, 골, 인대, 골수, 건 및 골격근으로부터 유래될 수 있다.
본 발명을 실행하는데 있어서, 임의의 주어진 세포 표면 마커를 가지는 세포를 분리하는 것은 여러가지 상이한 방법에 의하여 달성될 수 있으나, 특정 방법들은 특정 마커에 결합제(예: 항체 또는 그의 항원 결합 단편)를 결합시켜, 높은 레벨의 결합 또는 낮은 레벨의 결합 또는 비결합의 결합을 보이는 세포들을 분리하는 방법에 의한다. 가장 편리한 결합제는, 항체 또는 항체-주 분자(antibody-based molecular)이며, 단일클론 항체 시약의 특이성 때문에, 바람직하게는 단일 클론 항체이거나 또는 단일 클론 항체를 주로 한다. 항체는 모든 단계에서 사용될 수 있으나, 다른 시약도 사용될 수 있으므로, 이러한 마커에 대한 리간드는 마커를 가지고 있거나 가지지 않은 세포를 농화시키는데 사용된다.
미정제(crude) 분리를 위하여 항체 또는 리간드는 고체 지지체에 부착될 수 있다. 바람직하게, 분리 기술은 수집되는 구획의 생존 지속력을 최대화한다. 상대적으로 미정제 분리하기 위하여 서로 다른 효과를 가지는 다양한 기술이 이용된다. 사용되는 특정 기술은 분리 효율, 관련 세포 독성, 수행의 용이함 및 속도, 및 정교한 장비 및/또는 기술적 노련미의 필요에 의존한다. 분리 과정은 항체-코팅된 자기 비드를 이용하는 자기 분리(magnetic separation), 친화성 크로마토그래피 및 고체 매트릭스에 부착된 항체를 가지는 "패닝(panning)"을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 정교한 분리를 제공하는 기술로는 FACS이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. FACS의 수행 방법은 당업자에게 자명하다.
본원에 기술된 마커의 각각에 대한 항체(예: STRO-1에 대한 단일클론항체 는 R&D 시스템, USA에서 시판된다)는 시판되며, ATCC 또는 기타 기탁 기관으로부터 얻을 수 있으며 및/또는 주지 기술을 이용하여 생성할 수 있다.
예를 들며, Stro-1bri 세포 분리 방법은 예를 들면, STRO-1의 높은 레벨의 발현을 인지하는 자기 활성 세포 분리(MACS)를 이용하여, 고체 상을 분리하는 제 1 단계를 포함한다. 뒤따르는 제 2 분리 단계는 바람직하게 높은 레벨의 전구세포 발현을 유도한다. 이러한 제2 분리 단계를 2개 이상의 마커 사용을 포함한다.
Stro-1bri 세포를 얻는 방법으로는 공지된 기술을 이용하여 제 1 농화 단계 전에 세포의 원료를 수확하는 단계를 포함한다. 따라서, 조직은 수술로 제거된다. 그 후, 원료 조직을 포함하는 세포는 소위, 단일 세포 현탁액으로 분리된다. 이러한 분리는 물리적 및 또는 효소 처리에 의하여 달성된다.
일단 적절한 Stro-1bri 세포군이 획득되면, MEMP을 얻기 위한 임의의 절적한 수단에 의하여 배양되거나 확장된다.
일례로, 세포는 치료받는 개체로부터 취해져 표준 기술을 이용하여 시험관내 배양되고, 자가 또는 동종 조성물로서, 개체에 투여하기 위해 상층액 또는 가용성 인자 또는 확장된 세포를 얻는데 사용된다. 다른 일례로, 상층액 및 가용 인자를 획득하기 위하여, 하나 이상의 확립된 인간 세포주의 세포가 사용된다. 본 발명의 또 다른 유용한 예로, 상층액 및 가용 인자를 획득하기 위하여, 하비-인간 동물 세포(또는 환자가 인간이 아니면, 다른 종으로부터 얻어진 세포)가 사용된다.
본 발명은 비-인간 영장류 세포, 유제동물, 개과, 고양이과, 토끼목, 설치류, 조류 및 어류 세포에 제한되지 않지만 이를 포함하는 임의의 비-인간 동물 종의 세포를 사용하여 수행될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 영장류 세포는 침팬지, 개코원숭이(baboon), 사이노몰거스(Cynomolgus) 원숭이, 원숭이 및 기타 신세계 또는 구세계 원숭이의 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용될 수 있는 유제 동물 세포는 소, 돼지, 양, 염소, 말, 퍼팔로 및 들소를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용될 수 있는 설치류 세포는 생쥐, 쥐, 기니아피그, 햄스터 및 게르빌루스쥐(gerbil) 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서 사용될 수 있는 토끼목의 예로는, 집토끼, 산토끼(jack rabbits), 산토끼(hares), 솜꼬리토끼(cottontails), 눈신멧토끼(snowshoe rabbits) 및 새앙토끼(pikass)가 포함된다. 닭(Gallus gallus)은 본 발명에서 사용될 수 있는 조류의 한 예이다.
본 발명의 방법에서 유용한 세포는 상층액 또는 가용성 인자의 사용 전 또는 획득 전에 보관될 수 있다. 진핵 세포의 보관 및 보존하는 방법 및 프로토콜은 공지되었다(cf., for example, Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.).
유전적으로 개질된 세포
일례로, 세포 및/또는 그의 자손 세포는 예를 들면, 관심 단백질, 예를 들면, 치료 및/또는 예방 효과를 제공하는 단백질(예: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 트립시노겐, 키모트립시노겐, 엘라스타아제, 카르복시펩티다아제, 췌장 리파아제 또는 아밀라아제 또는 향상된 혈관신생을 유도하거나 이와 관련 있는 폴리펩티드 또는 췌장 세포 또는 혈관 세포로의 세포 분화와 관련 있는 폴리펩티드)을 발현하고 및/또는 분비하도록 유전적으로 개질된다.
세포를 유전적으로 개질하는 방법은 당업자에게 자명하다. 예를 들면, 세포 내에서 발현되는 핵산은 세포 내에서 발현을 유도하기 위하여 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 예를 들면, 핵산은 개체의 다양한 세포 내에서 작동 가능하게 프로모터, 예를 들면, 바이러스 프로모터(예: CMV 프로모터(예: CMV-IE프로모터) 또는 SV-40프로모터에 연결된다. 추가적으로 적절한 프로모터는 공지되어 있으며 필요에 따라 변경하여 본 발명의 예로 적용될 수 있다.
일례로, 핵산은 발현 구조체(expression construct)의 형태로서 제공된다. 본원에 있어서, 용어 "발현 구조체"는 세포 내에서 작동가능하게 연결된 핵산(예: 표지 유전자 및/또는 대비선별가능한 표지 유전자)상에서의 발현을 부여하는 능력을 가지는 핵산을 말한다. 본 발명의 맥락에 있어서, 발현 구조체는 플라스미드, 박테리오파지, 파지미드(phagemid), 코스미드(cosmid), 바이러스 서브-게놈(virus sub-genomic) 또는 게놈 단편 또는 발현가능한 형태로 이종 DNA를 유지하고 및/또는 복제할 수 있는 다른 핵산이거나 이를 포함하는 것으로 이해된다.
본 발명을 실행하기 위한 적절한 발현 구조체의 건축 방법은 당업자에게 자명하고, 예로서, Ausubel et al (In: Current Protocols in Molecular Biology. Wiley Interscience, ISBN 047 150338, 1987) 또는 Sambrook et al (In: Molecular Cloning: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York, 제3판, 2001)에 기술되어 있다. 예를 들면, 발현 구조체 각각의 성분은 적절한 주형 핵산으로부터 예를 들면, PCR을 이용하여 증폭되고, 그 후, 예를 들면 플라스미드 또는 파지미드와 같은 적절한 발현 구조체로 복제된다.
상기 발현 구조체에 적합한 벡터는 당업계에 공지되었으며 및/또는 본원에 기술되어 있다. 예를 들면, 본 발명의 방법에 적합한 포유류 세포 내의 발현 벡터는 예를 들면, 인비트로겐(Invitrogen) 사에서 공급하는 pcDNA 벡터 스위트의 벡터, pCI 벡터 스위트의 벡터(프로메가), pCMV 벡터 스위트의 벡터(클론테크), pM 벡터(클론테크), pSI 벡터(프로메가), VP 16 벡터(클론테크) 또는 pcDNA 벡터 스위트의 벡터(인비트로겐)이다.
당업자는 추가적인 벡터 및 그러한 벡터의 공급처, 예를 들면, 인비트로겐 코퍼레이션, 클론테크 또는 프로메가를 숙지하고 있다.
발현을 위하여 분리된 핵산 분자 또는 이를 포함하는 유전자 구조체를 세포 내에 도입하는 방법은 당업자에게 알려져 있다. 주어진 유기체에 사용되는 상기 기술은 공지된 성공적인 기술에 의한다. 재조합 DNA를 세포에 도입하는 수단은, 미량 주사(microinjection), DEAE-덱스트란에 매개되는 형질전환(transfection), 리포펙타민(Gibco, MD, USA) 및/또는 셀펙틴(Gibco, MD, USA)을 이용하는 것과 같이 리포솜에 의하여 매개되는 형질전환, PEG-매개 DNA 업테이크, 전자 천공법(electroporation) 및 특히 DNA- 코팅된 텅스텐 또는 금 입자(Agracetus Inc., WI, USA)를 사용하는 미소입자 충격을 포함한다.
또한, 본 발명의 발현 구조체는 바이러스 벡터이다. 바이러스 벡터는 당업계에 공지되어 있으며 시판되고 있다. 핵산 운반 및 핵산의 숙주 세포 게놈으로의 통합을 위한 통상적인 바이러스계 시스템은, 예를 들면 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 아데노 관련 바이러스 벡터를 포함한다. 또한, 아데노 바이러스 벡터는 에피솜이 잔존하는 핵산을 숙주세포에 주입하는데 유용하다. 바이러스 벡터는 타겟 세포 및 조직 내에 유전자를 도입하는 효과적이며 다용도적인 방법이다. 또한, 다수의 상이한 세포 타입 및 타겟 조직에서 높은 전달 효율(transduction efficiencies)이 관측되었다.
예를 들면, 레트로바이러스 벡터는 일반적으로 최대 6-10 kb의 외래 염기서열의 패키징 성능을 가진 시스-작용 장 말단반복(LTRs)을 포함한다. 최소 시스-작용 LTRs은 벡터를 복제하고 패키징하기 충분하며, 장기간 발현을 제공하기 위하여 발현 구조체를 타켓 세포로 삽입하는데 사용된다. 널리 사용되는 레트로바이러스 벡터는 쥐백혈병 바이러스(MuLV), 긴팔원숭이 백혈병 바이러스(GaLV), 유인원 면역결핍 바이러스(SrV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 및 이들의 조합게 기초한 것을 포함한다(참조 예: Buchscher et al ., J Virol . 56:2731-2739 (1992); Johann et al, J. Virol . 65:1635-1640 (1992); Sommerfelt et al , Virol . 76:58-59 (1990); Wilson et al , J. Virol . 63:274-2318 (1989); Miller et al ., J. Virol. 65:2220-2224 (1991); PCT/US94/05700; Miller and Rosman BioTechniques 7:980-990, 1989; Miller, A. D. Human Gene Therapy 7:5-14, 1990; Scarpa et al Virology 75:849-852, 1991; Burns et al . Proc . Natl . Acad . Sci USA 90:8033-8037, 1993).
다양한 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터 시스템 또한 핵산 운반을 위하여 개발되었다. AAV 벡터는 공지된 기술에 의하여 용이하게 설계될 수 있다(참조 예: 미국 특허 번호 5,173,414 및 5,139,941; 국제 공개 번호 WO 92/01070 및 WO 93/03769; Lebkowski et al . Molec . Cell . Biol . 5:3988-3996, 1988; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press);Carter Current Opinion in Biotechnology 5:533-539, 1992; Muzyczka. Current Topics in Microbiol , and Immunol . 158:97-129, 1992; Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801, 1994; Shelling and Smith Gene Therapy 7:165-169, 1994; and Zhou et al . J Exp . Med . 179:1867-1875, 1994.)
본 발명의 발현 구조체를 운반하기 위해 유용한 추가적인 바이러스 벡터로는 예를 들면, 우두 바이러스 및 조류 바이러스 및 알파바이러스 또는 콘쥬게이트 바이러스 벡터와 같은 수두계 바이러스로부터 유래되는 것들을 포함한다(예: Fisher-Hoch et al ., Proc . Natl Acad . Sci . USA 56:317-321, 1989에 기재됨).
또 다른 일례로, 전구세포는 Stro-3bri 또는 동종의 Stro-3bri 세포 또는 Stro-3bri 자손 세포 용으로 농화된 세포군이다.
폴리설페이트화 폴리사카라이드( Polysulfated polysaccharide )
본 발명은 또한 폴리설페이트화 폴리사카라이드 화합물의 용도에 관한 것이다. 폴리설페이트화 폴리사카라이드는, 헤파린 및 펜토산 폴리설페이트에서 예시된 바와 같이, 하나 이상의 설페이트 에스테르기가 공유 결합되어 있는, 탄수화물 또는 2개 이상의 당 환을 포함하는, 천연 또는 반합성/합성 폴리설페이트화 폴리사카라이드, 또는 이들의 생물학적 활성 단편일 수 있다.
본 발명의 범위에 포함되는 폴리설페이트화 폴리사카라이드로는, 천연 폴리머량 헤파린, 저분자량 헤파린, 헤파란 설페이트, 펜토산 폴리설페이트, 콘드로이틴 폴리설페이트, 키토산 폴리설페이트, 덜마탄 폴리설페이트 설로덱시드, 덱스트란 폴리설페이트, 폴리설페이트화 이눌린, 설페이트화 락토비온산 아미드, 설페이트화 비스-알돈산 아미드, 슈크로스 옥타설페이트, 푸코이단-1, 푸코이단-2, 설페이트화 베타-사이클로덱스트린, 설페이트화 감마-사이클로덱스트린 및 이노시톨 헥사설페이트를 포함하나 이에 제한되지 않는 설페이트화 소화합물을 예로 들 수 있다.
폴리설페이트화 폴리사카라이드의 특정 예로는 펜토산 폴리설페이트, 칼슘 펜토산 폴리설페이트, 마그네슘 펜토산 폴리설페이트, 나트륨 펜토산 폴리설페이트, 폴리설페이트화 콘드로이틴 및 덱스트란 폴리설페이트를 들 수 있다.
본 발명에 적절한 다당류의 추가적인 예로는, 폴리설페이트화 폴리사카라이드, 폴리설페이트화 덱스트란, 폴리설페이트화 사이클로덱스트란, 폴리설페이트화 콘드로이틴, 및 펜토산 폴리설페이트, 예컨대, 칼슘 또는 나트륨염과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속염, 구리 및 아연과 같은 전이 금속, 및 플라티늄과 같은 귀금속을 포함한다. 직쇄 또는 분지쇄일 수 있는, 동질 다당류 또는 이질 다당류의 폴리설페이트화 폴리사카라이드 유도체를 추가로 예로 들 수 있다. 당은 펜토스 또는 헥소스, 예컨대, 갈락토스, 만노스, 글루코스, 라노스, 프럭토스, 소르보스, 자일로스, D-아라비노스, 리보스, L-아라비노스, 글루쿠론산 및 이들의 유도체로부터 유래할 수 있으나, 이에 제한하는 것은 아니다.
본 발명은 또한 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 생물학적 활성 분자 단편 또는 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 유사체 또는 유도체를 포함한다.
폴리설페이트화 폴리사카라이드의 하나는 펜토산 폴리설페이트(PPS)이다. PPS의 기본 구조는 펜토스, 즉, 통계적으로 10번째 단위마다 글루쿠론산기를 포함하는 (1→4) 연결된 베타-D-자일로피라노스 단위으로 구성되어 있다.
Figure pct00001
비치우드(beechwood) 헤미셀룰로스 (Fagus silvatica)로부터 분리된 펜토산 폴리설페이트 (PPS)의 구조식은 하기에 나타낸다. 이 구조식은, 펜토산 폴리설페이트의 직쇄 자일란 (펜토산) 모핵이, 10번째 자일로스 (펜토스) 환마다 2번 위치에 연결된, 4-O-메틸-글루쿠로네이트 측쇄를 평균적으로 하나 포함하고 있음을 보여준다.
PPS (CaPPS 또는 MgPPS)의 칼슘 및 마그네슘 유도체는 R = SO3-Ca+ 1/2 또는 Mg+1/2인 경우이다. 나트륨 유도체는 R =SO3-Na인 경우이다.
Figure pct00002

칼슘 또는 나트륨 염으로서 펜토산 폴리설페이트는 평균 분자량이 약 5700 달톤이고, 황 함량이 약 16%이다. 이 화합물은 1960년대 초반 이래로 합성 헤파리노이드 및 항혈전제로서 공지되어 있다.
특정 복합 이온이 알칼리 금속, 예컨대, Na+, 및 K+, 알칼리 토금속, 예컨대,Ca2 +, Zn2 +, Mg2 +, Ba2 +뿐만 아니라, Ag+, Au+, Pb2 +, Cu2 +, Au2 +, Pd2 +, Pd4 +, Pt4 +, Pt2+, 전이 금속 이온 및 4급 암모늄 화합물 복합체로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 후자의 화합물로는, 피리디늄 클로라이드, 테트라알킬 암모늄 클로라이드, 콜린 클로라이드, 세틸피리디늄 클로라이드, N-세틸-N,N,N-트리알킬암모늄 클로라이드 또는 이들의 유도체를 예로 들 수 있다. 일 특정 구현예에서, 칼슘 복합체가 사용된다.
폴리설페이트 다당류-금속 복합체의 제조 방법이 미국 특허 제5,668,116호에 상세히 기술되어 있으며, 이 문헌은 원용에 의해 그 전문이 본 명세서에 포함된다.
폴리설페이트 다당류 및 PPS에 관한 추가적인 정보는 WO02/41901에서 확인할 수 있으며, 이 문헌은 원용에 의해 그 전문이 본 명세서에 포함된다. 원용에 의해 그 전문이 본 명세서에 포함되는 문헌 [Semin Arthritis Rheum. 1999 Feb;28(4):211-67 Ghosh - The pathobiology of osteoarthritis and the rationale for the use of pentosan polysulfate for its treatment]에서 또한 추가 정보를 확인할 수 있다.
일 구현예에서, 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 펜토산 폴리설페이트 나트륨이다. 그 예로는, 황산, 더욱 구체적으로는 펜토산 폴리설페이트 나트륨으로 에스테르화된 다당류인, Bene Pharmachem사(독일) 제품인 SP54를 들 수 있다. 펜토산 폴리설페이트 나트륨의 반합성 제제는 정해진 분자량 범위로 (4000 내지 6000 달톤) 일정하고 재생산적인 제조가 가능하다.
추가적인 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 폴리설페이트화 콘드로이틴이다. 대부분이 폴리설페이트화 콘드로이틴으로 이루어진, 알테파론(Arteparon) RTM(상표: Luitpold-Werk)을 예로 들 수 있다. 이것은 항관절염제로 사용되어 왔다. 더욱 특이적으로 이것은, 대부분 (약 93%)의 이당류 반복 단위가 갈락토스아민에 글리코시드 결합된(glycosidically linked) 헥슈론산(hexuronic acid)인, 이질성 반합성 글루코사미노글리칸 폴리설페이트이다. 알테파론의 이당류 반복 단위의 약 4개의 자유 히드록실기가 설페이트기로 에스테르화되어, 황 농도가 약 13.0중량%가 된다. 상업적 제제는 분자량이 약 10,000 달톤이다.
폴리설페이트 다당류-금속 복합체의 제제는 미국 특허 제5,668,116호에 상세히 기재되어 있으며, 이 문헌은 원용에 의해 그 전문에 본 명세서에 포함된다.
폴리설페이트 다당류 및 PPS에 관한 추가 정보는 WO02/41901에서 확인 가능하며, 이 문헌은 원용에 의해 그 전문에 본 명세서에 포함된다. 원용에 의해 그 전문이 본 명세서에 포함되는 문헌 [Semin Arthritis Rheum. 1999 Feb;28(4):211-67 Ghosh - The pathobiology of osteoarthritis and the rationale for the use of pentosan polysulfate for its treatment)]에서 또한 추가 정보를 확인할 수 있다.
특히 적절한 담체 조성물 및 제형과 함께, 제조, 분리 및 정제 방법이 본 출원에 포함된다.
또한 문헌 [Ghosh P, Edelman J, March L and Smith M. Effects of pentosan polysulfate in osteoarthritis of the knee: A randomised, double blind, placebo-controlled pilot study. Current Therapeutic Research, 2005, 66: 552 571]에서 추가 정보를 확인할 수 있으며, 이 문헌은 근육내 주입에 의해 투여된 PPS를 이용한 OA 임상 시험에 관한 정보도 제공한다. PPS, 및 투여량 요법 및 투여 방법을 포함하여 시험에서 사용되는 방법은 원용에 의해 본 출원에 포함된다.
알파 IX 콜라겐의 비콜라겐성 NC4 도메인
추가 구현예에 따르면, 선택된 폴리펩티드는 알파 IX 콜라겐의 비콜라겐성 NC4 도메인 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편이다. 적절한 NC4 도메인 폴리펩티드에 관한 특이적 정보는 국제 특허 출원 PCT/AU2004/000788에서 확인할 수 있으며, 이 문헌은 원용에 의해 그 전문이 본 명세서에 포함된다.
특히, PCT/AU2004/000788은 폴리펩티드를 발현 및 정제하는 방법과 함께, 본 발명에 사용될 수 있는 다수의 폴리펩티드 및 그들의 서열을 개시하고 있다. 따라서 PCT/AU2004/000788은, 특히 본 명세서에 포함되는, 적절한 NC4 도메인 폴리펩티드의 예와 그들의 제조 방법을 포함한다. 특히, 도 1-7에 기재된 서열과 함께, 제7면 제24행 내지 제8면 제6행에 기재된 아미노산 서열이 본 출원에 포함된다. 또한 제9면 제10행 내지 제10면 제36행에 제시된 폴리펩티드의 회수 방법이 특히 본 출원에 포함된다. 제18면의 상세한 설명에 기재된 분리 및 회수 단계 및 제20-24면에 기재된 폴리펩티드와 함께, 제15면의 상세한 설명에 기재된 자가용해 기술이 본 발명에 포함된다. 마지막으로 도 7의 아미노산 부분 서열이 본 출원에 포함된다.
전술한 바와 같이, NC4 도메인은 PCT/AU2004/000788에서 논의되고 있다. 이것은 유전자 서열로부터 예측되고 대장균에서의 발현에 의해 얻어지는, 완전한 아미노산 서열을 포함한다 (도 1 참조).
그러나 K. 락티스(lactis)를 이용한 발현에 의해 제조되는 단백질 생성물은 글리코실화된, 전장 인간 NC4 및 절단형(truncated form) (MW = 24kDa)으로 구성되며, 이것은 하기 표 A에 포함되어 있고, 그 제제 및 ID가 방법 부분에 기재되어 있다. 대장균 및 K. 락티스 발현 단백질은 동물 모델 및 시험관내 분석에서 평가되고, 각각 코드 AWR-01 및 PBA-1200P로 확인될 수 있다. 이 실험에 사용되는 전구 세포는 방법 부분에서 언급한 바와 같이, 상업적으로 입수가능한 마우스 ATDC5였다. 사용된 분화 세포는 인간 관절 연결 유래의 연골세포, 정상 양 및 돼지 연골 및 연골세포, 및 전 관절 교체 수술을 실시한 OA 환자의 윤활 조직으로부터 유래된 윤활 섬유아세포를 포함한다.
특히, 하기 서열이 본 발명에 사용되는 폴리펩티드를 정의한다.
표 A - N 또는 O 글리코실화되지 않은 , 관심 있는 아미노산 서열
서열 번호: 1
1) hNC4 : ( 신호펩티드 없는 전장 인간 NC4 )
10 20 30 40 50 60
AVKRRPRFPV NSNSNGGNEL CPKIRIGQDD LPGFDLISQF QVDKAASRRA IQRVVGSATL
70 80 90 100 110 120
QVAYKLGNNV DFRIPTRNLY PSGLPEEYSF LTTFRMTGST LKKNWNIWQI QDSSGKEQVG
130 140 150 160 170 180
IKINGQTQSV VFSYKGLDGS LQTAAFSNLS SLFDSQWHKI MIGVERSSAT LFVDCNRIES
190 200 210 220 230 240
LPIKPRGPID IDGFAVLGKL ADNPQVSVPF ELQWMLIHCD PLRPRRETCH ELPARITPSQ
TTDER
서열 번호: 2
2) 프롤린 엔도펩티다아제의 추정 작용에 의해, K. 락티스 ( 락티스 ) 배양물로부터 발현 중에 얻어진 절단형( truncated ) hNC4 ( 잔기 6-224):
10 20 30 40 50 60
RFPVNSNSNG GNELCPKIRI GQDDLPGFDL ISQFQVDKAA SRRAIQRVVG SATLQVAYKL
70 80 90 100 110 120
GNNVDFRIPT RNLYPSGLPE EYSFLTTFRM TGSTLKKNWN IWQIQDSSGK EQVGIKINGQ
130 140 150 160 170 180
TQSVVFSYKG LDGSLQTAAF SNLSSLFDSQ WHKIMIGVER SSATLFVDCN RIESLPIKPR
190 200 210
GPIDIDGFAV LGKLADNPQV SVPFELQWML IHCDPLRP
3) 특허 출원 PCT / AU2004 /000788에서 기재되고, 프로테오믹승 의해 확인된, 밑줄친 볼드체로 표시된 서열들
1 Met Lys Thr Cys Trp Lys Ile Pro Val Phe Phe Phe Val Cys Ser 16 Phe Leu Glu Pro Trp Ala Ser Ala 23 Ala Val Lys Arg Arg Pro Arg 31 Phe Pro Val Asn Ser Asn Ser Asn Gly Gly Asn Glu Leu Cys Pro 46 Lys Ile Arg Ile Gly Gln Asp Asp Leu Pro Gly Phe Asp Leu Ile 61 Ser Gln Phe Gln Val Asp Lys Ala Ala Ser Arg Arg Ala Ile Gln 76 Arg Val Val Gly Ser Ala Thr Leu Gln Val Ala Tyr Lys Leu Gly 91 Asn Asn Val Asp Phe Arg Ile Pro Thr Arg Asn Leu Tyr Pro Ser 106 Gly Leu Pro Glu Glu Tyr Ser Phe Leu Thr Thr Phe Arg Met Thr 121 Gly Ser Thr Leu Lys Lys Asn Trp Asn Ile Trp Gln Ile Gln Asp 136 Ser Ser Gly Lys Glu Gln Val Gly Ile Lys Ile Asn Gly Gln Thr 151 Gln Ser Val Val Phe Ser Tyr Lys Gly Leu Asp Gly Ser Leu Gln 166 Thr Ala Ala Phe Ser Asn Leu Ser Ser Leu Phe Asp Ser Gln Trp 181 His Lys Ile Met Ile Gly Val Glu Arg Ser Ser Ala Thr Leu Phe 196 Val Asp Cys Asn Arg Ile Glu Ser Leu Pro Ile Lys Pro Arg Gly 211 Pro Ile Asp Ile Asp Gly Phe Ala Val Leu Gly Lys Leu Ala Asp 226 Asn Pro Gln Val Ser Val Pro Phe Glu Leu Gln Trp Met Leu Ile 241 His Cys Asp Pro Leu Arg Pro Arg Arg Glu Thr Cys His Glu Leu 256 Pro Ala Arg Ile Thr Pro Ser Gln Thr Thr Asp Glu Arg 268
소, 인간, 쥐 및 병아리 NC4 서열 간의 서열 조성이 도 37에 제공된다. 보존 서열은 다음과 같다:
서열 번호: 3 - K/QSVS/V/A/EFSYKG
서열 번호: 4 - KI/LMIG/SVER/TS/T
서열 번호: 5 - KLGNNVDFRI
서열 번호: 6 - R/KI/VES/TLP/NIKPR/KG
서열 번호: 7 - KH/N/YWS/N/TIWQIQDS/AGK/R
서열 번호: 8 - K/QSVS/VFSYKG
서열 번호: 9 - KIMIGVERTS
서열 번호: 10 - RIESLPIKPRG
서열 번호: 11 - KH/NWS/NIWQIQDSGK
서열 번호: 12 - RIGQDDLPGFDLISQFQI/VDKA
서열 번호: 13 - RH/NLYPN/SGLPEEYSFLTTFR
서열 번호: 14 - FSNLP/SSLFDSQWHKI
서열 번호: 15 - RSSATLFVDCNRI
서열 번호: 16- KSVSFSYKG
서열 번호:17 - KIMIGVERS
서열 번호: 18 - KLGNNVDFRI
서열 번호: 19 - RIESLPIKPRG
서열 번호: 20 - KHWSIWQIQDSSGK
서열 번호: 21 - RIGQDDLPGFDLISQFQIDKA
서열 번호: 22 - RHLYPNGLPEEYSFLTTFRM
서열 번호: 23 - FSNKOSKFDSQWHKI
서열 번호: 24 - RSSATLFVDCNRI
동결보존( cryoprotectorant )
전구 세포를 동결보존하기 위한 다양한 기술이 당업자에게 공지되어 있다. 보존 방법의 일예는 다음과 같다:
시험:
냉동에 앞서, 최상의 건강 및 양호한 회복력을 보장하기 위해서는, 세포를 활발한 성장 상태로 유지시켜야 한다. 바람직하게는, 전날 배양 배지를 교환해야 한다. 역상현미경을 이용하여, 배지의 일반적인 상태를 신속히 점검한다. 미생물 오염의 징후를 관찰한다. 또한 육안으로 배지를 관찰하여, 배지-대기 경계면에서 부유하여, 현미경을 통해 보이지 않는 작은 진균 집락을 관찰하는 것이 중요하다. 냉동 1주일 전에 배지를 무항균 상태로 유지하여, 임의의 잠재된(숨겨진) 배지 오염물이 드러나도록 하는 것이 가장 이상적이다.
세포 채취 및 냉동:
채취 중에 손상된 세포는 냉동 및 해동 과정 중에 발생하는 추가적인 손상에 대해 생존하기 매우 어려우므로, 채취 동안에는 세포를 조심해서 다룬다. 근 합류(near confluent) T-75 플라스크 (세포 형태 및 합류 정도에 의존함)로부터 1.5x107의 세포를 얻을 때까지 세포를 채취할 수 있다. 이는 세포가 적어도 몇몇 바이알에서 2x106 세포/vial 농도로 되기에 충분하다.
1. 멸균 피펫을 이용하여, 기존의 배지를 제거하고 폐기한다.
2. T-75 플라스크에 대해, 5mL의 칼슘 및 마그네슘이 없는 인산 완충 식염수 (CMF-PBS)로 세포 단층을 씻어내어, 모든 소태아 혈청을 제거한다.
3. (CMF-PBS 중) 트립신 용액 4 내지 5mL를 플라스크에 가하고, 세포들이 적어도 1분간 배양되도록 한다 (효소 4 용액의 예비 가열은 노출 기간을 단축시킬 것이다). 약 3mL의 트립신 용액을 제거하고 세포들이 흩어져서(round up) 느슨해지도록 한다.
4. 역위상차현미경 상에서 수초마다 효소 처리의 진행 과정을 점검한다. 일단 모든 세포들이 흩어지면, 플라스크를 조심스럽게 두드려 플라스틱 표면으로부터 세포들을 떼어낸다. 그 후 세포 부유액에 성장 배지 5mL를 가하고, 동일한 피펫을 이용하여 배양기의 저부로부터 잔존하는 세포들을 격렬하게 씻어낸다.
5. 15mL 원심관에 부유된 세포를 수집하고, 얼음 위에 둔다. 계수를 위해 샘플을 취한 후, 5분간 100xg로 회전시켜 세포 펠렛을 얻는다. 세포가 회전하는 동안, (트리판 블루 용액으로) 생존 세포수를 세고, 세포/mL 수 및 총 세포수를 계산한다.
6. 원심분리된 세포로부터 상청액을 제거하고, 10% DMSO (DMSO는 최종 농도가 5 내지 15%일 때 가장 빈번히 사용되어 최종 세포 농도가 1 내지 2x106 세포/mL가 되도록 함)를 함유하는 충분한 동결방지 배지에 세포 펠렛을 재부유시킨다.
7. 적절한 수의 냉동 바이알에 세포주 및 날자를 기입한다. 그 후 각 바이알에 DMSO 함유 세포 부유액 1.5 내지 1.8mL를 가한다.
8. 바이알을 밤새 속도 제어 냉동기에 둔다. 24시간 후, 지속 저장을 위해 세포를 액체 질소 냉동기에 옮겨야 한다.
9. 세포 저장소 기록에 세포에 관한 적절한 정보를 기록한다. 다음의 모든 정보를 포함하여, 배양 저장 조건을 충분히 상세히 기록한다: 배양 동질성(identity), 계대수(passage) 또는 배가 수준(population doubling level), 냉동 일자, 냉동 배지 및 사용 방법, 바이알당 세포수, 최초 냉동된 바이알의 총수 및 잔류 바이알 수, 그것들의 위치, 예상 생존력 및 수행된 모든 품질 대조 시험의 결과 (멸균, 미코플라스마, 종, 핵형 등). 추가 배양 정보, 특히 기원, 내력, 성장파라미터, 특이적 특성 및 적용 역시 도움이 되므로, 가능한 기록에 포함시켜야 한다.
세포 해동 및 회수(Recovery):
1. 적절한 안전 장치를 이용하여, 저장 위치로부터 바이알을 제거하고, 올바른 배양물인지 확인하기 위하여, 라벨 및 저장 기록 모두를 주의 깊게 점검한다. 용기를 따뜻한 물에 두고, 완전히 해동될 때까지 완만하게 교반한다. 급속 해동은 (37℃에서 60 내지 90초) 대부분의 세포 배양물에 최상의 회복력을 제공하고; 재수화 중에 세포 내에 해로운 얼음 결정이 생성되는 것을 완화 또는 방지한다.
2. 일부 동결 방지제는 장기간 노출 시 세포에 손상을 입힐 수 있으므로, 가능한 한 신속하고 완만하게 동결 방지제를 제거한다. 동결 방지제 및 세포의 특성 모두를 고려하여 몇몇 방법이 사용된다:
a) 6 내지 8 시간의 해동 중에 배지를 교환하면서, 동결 방지제가 제거되는 경우에는, 대부분의 세포가 정상적으로 회수된다. 앰플 또는 바이알의 내용물을, 15 내지 20mL의 배지를 포함하는 T-75 플라스크 또는 다른 적절한 용기에 옮기고, 정상적으로 배양한다. 대부분의 세포가 부착되는 대로 가능한 한 빨리(통상 3-4 시간), 희석된 동결 방지제를 포함하는 기존 배지를 제거하고 신선한 배지로 교환해준다.
b) 동결 방지제에 민감한 세포의 경우, 기존 배지의 제거는 완만한 원심분리에 의해 손쉽게 수행된다. 바이알 또는 앰플의 내용물을, 신선한 배지 10mL를 함유하는 15mL 원심분리관에 옮기고, 5분간 100xg에서 회전시킨다. 동결 방지제를 함유하는 상청액을 버리고, 신선한 배지에 세포 펠렛을 재부유시킨다. 그 후 적절한 배양 용기에 세포 부유물을 옮기고 정상적으로 배양한다.
지지 매트릭스
생물학 및 물질 과학의 최근 진보는, 새로운 연골 복구 기술의 선두에 서는 조직 공학을 발전시켰다. 자가 세포, 특히 고안된 지지체(scaffold), 생물 반응기(bioreactor), 기계적 자극 및 성장 인자는 연골 조직 재생성에 대한 유망한 방안을 제공한다.
바이오지지체( Bioscaffold ) 모방 세포 외 매트릭스
최근의 조직-공학 전략은, 합성 (예컨대, 폴리글리콜산) 및 천연-유래 (예컨대, 콜라겐) 물질 모두로부터 유래되어, 세포-지지체(cell-scaffold) 구조를 형성하는 지지체를 제공한다. 상용되는 조직 지지체 제품으로는, 소장 점막하 (레스토어(Restore)TM, 돼지 SIS, DePuy Orthopaedics), (커프패치(CuffPatch)TM, 돼지 SIS, Organogenesis), (SIS; Cook Biotech, Inc.), 재형성(reformulated) 콜라겐 지지체 (3D 콜라겐 성분, BD Biosciences), 무세포 인간 진피 콜라겐 매트릭스 (그래프트재킷(Graftjacket)®, Wright Medical Technologies), 소태아 진피 (티슈멘드(TissueMend)®, Stryker), 및 합성 폴리머 지지체, 주로 폴리에스테르 (예컨대, PGA, PCL, 및 PLA)를 포함한다.
최근의 조직 공학 지지체로는, 콜라겐 지지체, 연골세포 시드(seeded) 지지체, 인공 연골세포 시드 II형 콜라겐-GAG 지지체 [Vickers et al, Tissue Eng. 2006 May; 12(5): 1345-55] 및 폴리에틸렌 옥사이드 (PEO) 및 키토산을 포함하는 복합 지지체 [Kuo YC etal; J. Biomed Mater Res A. 2008 Nov 3]를 포함한다. Nettles DL et al., [Tissue Eng part A 2008 July; 14(7): 1133-40]에 기재된 것의 대체 형태로는, 연골 매트릭스 복구에 적용되는, 주입가능하고 교차 결합 가능한 엘라스틴 유사 폴리펩티드 (ELP) 겔이 있다.
매트릭스 물질은 생체적합성, 생분해성, 기계적 특성, 미용적인 외관 및 계면 특성을 고려하여 선택한다. 조성물에 대한 잠재 매트릭스는, 생분해성이고 화학적으로 수식된, 칼슘 설페이트, 트리칼슘 포스페이트, 하이드록시아파타이트, 폴리락트산 및 폴리안하이드라이드일 수 있다. 다른 잠재 물질은, 골 또는 진피 콜라겐과 같이, 생분해성이고 화학적으로 잘 수식된 물질일 수 있다. 또한 매트릭스는 순수 단백질 또는 세포 외 매트릭스 성분을 포함한다. 다른 잠재 매트릭스로는, 하이드록시아파타이트 소결체(sintered), 생체유리(bioglass), 알루미네이트 또는 다른 세라믹과 같이, 비생분해성으로 화학적으로 수식된 것들이 있다. 매트릭스는 폴리락트산 및 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐 및 트리칼슘 포스페이트와 같이, 전술된 임의의 물질의 조합을 포함할 수 있다. 생체세라믹(biceramic)은 칼슘-알루미네이트-포스페이트에서와 같은 조성, 및 공극 크기, 입자 크기, 입자 모양 및 생분해성을 변화시키는 공정에 따라, 달라질 수 있다.
일 구현예로서, 지지체는 합성 물질로부터 유래된다. 다른 구현예에서 지지체는 천연 유래 물질로부터 유래된다. 대안적으로, 지지체는 합성 및 천연 유래 물질의 조합이다.
실시예에 기재된 바와 같이, 일 구현예로서 지지 매트릭스는 콜라겐 스폰지이다. 임의로 NC4 폴리펩티드와 조합하여, 펜토산 폴리설페이트, 세포를 포함하는 본 발명의 조성물은 스폰지에 이식 또는 주입(infuse, perfuse)될 수 있다. 스폰지는 이식에 취약할 수 있으므로, 스폰지는 임의로 흡수성 케이지에 삽입된다.
조성물
모든 경우에서, 본 명세서에서 언급된 조성물 및 제형은 본 발명의 다당류 및/또는 폴리펩티드에 적합하다. 특히, 조성물 및 제형은 폴리설페이트화 폴리사카라이드, 일례로 펜토산 폴리설페이트, 칼슘 펜토산 폴리설페이트, 마그네슘 펜토산 폴리설페이트 및/또는 나트륨 펜토산 폴리설페이트화 단독에 적합하다. 조성물 및 제형은 또한 본 명세서에서 언급된 화합물의 조합, 예컨대, 다당류 및/또는 폴리펩티드의 조합, 특히 NC4 도메인 폴리펩티드 및 펜토산 폴리설페이트 및 그의 염의 조합에 적합하다.
본 발명에 따르면, 본 명세서에서 언급된 다당류 및/또는 폴리펩티드, 특히 펜토산 폴리설페이트, 칼슘 펜토산 폴리설페이트 및/또는 나트륨 펜토산 폴리설페이트 또는 단편 또는 절단형과 같은, NC4 도메인과 임의로 조합된 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 포함하는 조성물은, 인간 또는 동물에서 인간 및 수의학 약물로 사용되기 적합하며, 일반적으로는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 치료용으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 약제학 분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985)에 개시되어 있다. 약제학적 담체, 부형제 또는 희석제는 원하는 투여 경로 및 표준 약제학적 관례의 측면에서 선택될 수 있다. 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서, 또는 담체, 부형제 또는 희석제 이외에 추가로 임의의 적절한 결합제, 활택제, 현탁제(리포좀), 코팅제 또는 용해제를 포함할 수 있다.
상이한 송달 시스템에 따라 조성물/제형의 필요요건이 다를 수 있는 것으로 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, NC4 도메인을 포함하는 다당류 및/또는 단백질은 식염수에 용해시킬 수 있다. 대안적으로 이들 화합물은, 사용 전에 혼합되는 액체-분말의 2 부분으로 제공되는 용액 형태로 만들 수 있다.
이식가능한 (피하) 서방성 캡슐은 임플라논(Implanon)™ 또는 데포-프로베라(Depo-Provera)™ 주사와 같이, 피임용으로 종종 사용되며, 본 발명의 조성물의 투여에 유용할 수 있다.
다른 예로 본 발명의 조성물은, 원하는 위치로 지속 주입에 의해 조성물을 투여하는 이식 미니 펌프를 이용하여, 송달되도록 제형화될 수 있다.
다른 예로서 본 발명의 조성물은 비경구적으로 예를 들어, 정맥내, 피하, 근육내, 관절내, 디스크내(intra-discally) 또는 진피내로, 주입되거나, 다르게는 이식될 수 있다. 추가 예로 제형은 피하, 진피내 또는 관절내로 투여된다.
피하 및 진피내 제형은 또한 하나 이상의 추가 물질, 예컨대, 연조직 충진제, 리도카인 (국소 마취제), 매트릭스 금속단백분해효소 저해제, 항산화제 및 항염증제 (코르티코스테로이드)를 포함할 수 있다.
약물의 진피내 송달을 위한 다양한 제형은, 하나 이상의 다음 성분을 포함할 수 있다: 알부민, 완충액, 완충 식염수, 완충 염 용액, 및 마취제 (바람직하게는 국소 마취제).
본 발명은 전술한 질환의 치료를 위한 병용 요법에까지 확장된다. 특히 일례로, 본 발명은 다양한 퇴행성 증상의 치료에 사용되는 폴리설페이트화 폴리사카라이드 및 폴리펩티드의 용도에까지 확장된다. 이들 제제들은 동시에 또는 시간 차를 두고 투여될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서 병용 요법은, 단일 제형으로 활성 물질을 동시에 투여하거나, 다제형으로 동시에 또는 시간 차를 두고 활성 물질을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 동일하게 병용 요법은 다른 제형으로 시간 차를 두고 활성 물질을 투여하는 것을 포함할 수 있다. 제형은 순차적으로 투여되거나, 시간, 일, 주 및 달을 포함하는 시간에 걸쳐 별개로 투여될 수 있다.
예를 들어, 진피내, 피하 또는 근육내로, 동물에 주입하기에 적절한 제형의 예는 다음을 포함한다:
1) 멸균수에 용해된, 전구 세포와 함께, 폴리설페이트화 폴리사카라이드, 예를 들어, 펜토산 폴리설페이트, 칼슘 펜토산 폴리설페이트 및/또는 나트륨 펜토산 폴리설페이트
2) 0.9% 멸균 식염수 (150mM NaCl); +/- 인간 알부민 (0.01%-0.5%); +/- 국소 마취제; 예컨대, 부피바카인 하이드로클로라이드 (1.25-5 mg/ml); +/- 주석산 아드레날린 (0.0045-0.0091 mg/ml); +/- 리도카인 (0.5-2%); +/- 에피네프린 (1:100,000-1:200,000)에 용해된, 전구 세포와 함께, 폴리설페이트화 폴리사카라이드, 예를 들어, 펜토산 폴리설페이트, 칼슘 펜토산 폴리설페이트 및/또는 나트륨 펜토산 폴리설페이트
3) 인산염 완충 식염수; +/- 인간 알부민 (0.01-0.5%); +/- 국소 마취제; 137mM NaCl; 2.7mM KCl; 10mM 인산염 완충액; 150mM NaCl; 150mM NaH2PO4/Na2HPO4에 용해된, 전구 세포와 함께, 폴리설페이트화 폴리사카라이드, 예를 들어, 펜토산 폴리설페이트, 칼슘 펜토산 폴리설페이트 및/또는 나트륨 펜토산 폴리설페이트
4) 인산염-구연산염 완충액 (50mM) +/- 과붕산 나트륨 (0.03%); +/- 인간 알부민 (0.01-0.5%); +/- 국소 마취제에 용해된, 전구 세포와 함께, 폴리설페이트화 폴리사카라이드, 예를 들어, 펜토산 폴리설페이트, 칼슘 펜토산 폴리설페이트 및/또는 나트륨 펜토산 폴리설페이트
5) 카르복시메틸셀룰로스 (2.7%) 및 만니톨 함유 멸균수에 용해된, 전구 세포와 함께, 폴리설페이트화 폴리사카라이드, 예를 들어, 펜토산 폴리설페이트, 칼슘 펜토산 폴리설페이트 및/또는 나트륨 펜토산 폴리설페이트
6) 생체적합성 폴리알킬아미드 수화겔 (예컨대, 바이오-알카미드(Bio-Alcamid)®, Polymekon S.r.l.사 제품 (Milan, Italy)에 혼입된, 전구 세포와 함께, 폴리설페이트화 폴리사카라이드, 예를 들어, 펜토산 폴리설페이트, 칼슘 펜토산 폴리설페이트 및/또는 나트륨 펜토산 폴리설페이트
7) 하이란(hylan) B 겔 (예컨대, 하일라폼(Hylaform)® 플러스)에 혼입된, 전구 세포와 함께, 폴리설페이트화 폴리사카라이드, 예를 들어, 펜토산 폴리설페이트, 칼슘 펜토산 폴리설페이트 및/또는 나트륨 펜토산 폴리설페이트
8) 안정한 히알루론산 겔 (예컨대, 레스틸란(Restylane)®)에 혼입된, 전구 세포와 함께, 폴리설페이트화 폴리사카라이드, 예를 들어, 펜토산 폴리설페이트, 칼슘 펜토산 폴리설페이트 및/또는 나트륨 펜토산 폴리설페이트
9) 폴리-L-락트산 용액 (예컨대, 스컬프트라(Sculptra)®)에 혼입된, 전구 세포와 함께, 폴리설페이트화 폴리사카라이드, 예를 들어, 펜토산 폴리설페이트, 칼슘 펜토산 폴리설페이트 및/또는 나트륨 펜토산 폴리설페이트
10) NaCl 118.1 mM; KCl 3.4 mM; CaCl2 2.5 mM; MgSO4 0.8 mM; KH2PO4 1.2 m; NaHCO3 25.0 mM; 글루코스 11.1 mM를 포함하는 크랩스 링거액(Krebs-Ringer's solution)에 용해되어 혼입된, 전구 세포와 함께, 폴리설페이트화 폴리사카라이드, 예를 들어, 펜토산 폴리설페이트, 칼슘 펜토산 폴리설페이트 및/또는 나트륨 펜토산 폴리설페이트
본 발명의 제형은 또한 하나 이상의 다음 물질을 포함한다:
스테로이드성 항염증제 (코르티코스테로이드), 칼시뉴린 저해제 (예컨대, 피메크롤리무스(pimecrolimus), 타크롤리무스), 포스포디에스테라제 저해제, 항히스타민제, 항미생물제, 항생제, 항균제, 세라마이드, 성장 인자 (예컨대, 형질전환 성장 인자 β1-3, 혈소판 유도 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 인슐린 유사 성장 인자 I & II, 표피 성장 인자, 각질세포 성장 인자, 신경 성장 인자), 분열촉진제, 매트릭스 금속단백분해효소 저해제 (예컨대, TIMP's, 바티마스텟(Batimastat), 마리마스텟(Marimastat), 및 마틸스타틴(matlystatin) B), 단백분해효소 저해제, ECM 단백질, 트레티노인 (비타민 A), 항산화제 (비타민 E 및 C), 식물 사이키닌 (키네라제), 구리-펩티드 복합체, 및 다양한 식물, 동물 및 광물성 추출물 (즉, 콜타르(coal tar) 추출물).
본 발명의 특정 제형은 스테로이드성 항염증제와의 조합을 포함한다. 다른 조성물은 칼시뉴린 저해제를 포함한다. 또 다른 조성물은 항히스타민제를 포함한다. 다른 조성물은 항균제를 포함한다. 또 다른 조성물은 성장 인자를 포함한다. 또 다른 조성물은 단백분해효소 저해제를 포함한다.
투여용 조성물의 제조
리포좀
리포좀 내 단백질의 캡슐화는 예를 들어, 미국 특허 5,662,931; 5,853,755; 4,485,054; 5,780,054; 5,653,974; 6,019,999; 6,027,726; 5,739,273; 5,264,221; 5,413,804; 5,374,715에 상세히 기술되어 있다.
폴리머
본 발명의 다당류 및/또는 폴리펩티드는 제형 방출을 위해, 생분해성 합성 폴리머 (또는 유도체) 내에 캡슐화될 수 있다. 이들 폴리머 (및 유도체)는, 예를 들어, 다음 성분을 포함한다: 폴리(에스테르); 그 예로 폴리(e-카프로락톤) PCL, 폴리(글리콜산) PGA, 폴리(L-락트산) PLA, 폴리(에틸렌 글리콜) PEG, 폴리(에틸렌 옥사이드) PEO가 있다. 폴리(에스테르) 유도체는 폴리(에스테르) 코폴리머, 폴리(오르토 에스테르)를 포함한다. 폴리(에스테르) 코폴리머; 그 예로 폴리(락트산-co-글리콜산) PLGA, 폴리(D-락트산) PDLA, 폴리(L-락트산) PLLA, PLA-PEG, 디블록 PLA/PEG, 트리블록 PLA/PEG/PLA가 있다. 폴리(오르토 에스테르); 그 예로 3,9-디에틸리덴-2,4,8,10-테트라옥사스피로[5.5]운데칸(DETOSU)-기초 폴리(오르토에스테르)가 있다. 폴리(무수물); 그 예로 세박산(sebacic acid) (SA), p-(카르복시페녹시)프로판 (CPP), p-(카르복시페녹시)헥산 (CPH), SA/CPP 코폴리머, 폴리(지방산 다이머-세박산), 폴리(무수물-이미드), 폴리(무수물-에스테르)가 있다. 폴리아미드; 그 예로 폴리(아미노산), 폴리(글루탐산), 폴리(아스파르트산), 폴리(락트산-코-라이신)PLAL, 폴리[N-(3-하이드록시프로필)-L-글루타민], 폴리(이미노카보네이트), 타이로신-유래 폴리(카보네이트)가 있다. 인-함유 폴리머; 그 예로 폴리(포스파젠), 폴리(디클로로포스파젠), 폴리(오르가노포스파젠), 폴리[비스(카르복실레이토페녹시)-포스파젠], 폴리(포스포에스테르), 폴리(우레탄), 하이알루로난 담체가 있다.
결합(Coupling)
폴리펩티드(s) 및/또는 다당류(s)는 투여를 위해 콜라겐 매트릭스에 결합될 수 있다. 콜라겐 매트릭스는 일정 유효 농도로 결합된 약물을 방출할 수 있다. 따라서 콜라겐 및 다른 ECM 단백질 매트릭스는, 생체내(in vivo)로 예를 들어, 필요에 따라 조직 또는 공간에, 폴리펩티드(s) 및/또는 다당류(s)를 투여하는데, 효과적으로 사용될 수 있다. 일례로 교차결합된 콜라겐 매트릭스가 피하 투여된다.
일반
일반적으로, 본 발명은 전술된 조성물의 치료적 유효량 및/또는 예방적 유효량에 관한 것이고/것이거나 그러한 유효량을 사용한다.
용어 "치료적 유효량"은 필요한 시간 동안 원하는 효과를 발휘하는데 유효한 투여량을 의미한다.
용어 "예방적 유효량"은 필요한 시간 동안 원하는 예방적 결과, 예컨대 세포 아폽토시스 또는 조직 손상을 예방 또는 저해하는 결과를 달성하는데 유효한 투여량을 의미한다.
폴리펩티드
본 명세서에서 "폴리펩티드"는 단일 폴리펩티드, 폴리펩티드의 혼합물 및 폴리펩티드의 생물학적 활성 단편을 포함한다.
용어 "실질적으로 정제된 폴리펩티드"는, 천연 상태와 관계된, 지질, 핵산, 다른 폴리펩티드 및 다른 오염 물질로부터 적어도 부분적으로 분리된 폴리펩티드를 의미한다. 일례로 실질적으로 정제된 폴리펩티드는 적어도 60%가 천연 상태와 관계된 다른 성분이 존재하지 않는다. 추가 예로 실질적으로 정제된 폴리펩티드는 적어도 75%가 천연 상태와 관계된 다른 물질이 존재하지 않는다. 추가 예로서, 실질적으로 정제된 폴리펩티드는 적어도 90%가 천연 상태와 관계된 다른 물질이 존재하지 않는다. 또한, 용어 "폴리펩티드"는 용어 "단백질"과 상호 호환적으로 사용된다.
폴리펩티드의 % 동일성(identity)는 갭 형성 페널티(gap creation penalty)=5, 및 갭 확대 페널티(gap extension penalty)=0.3로 설정한, GAP (Needleman and Wunsch, 1970) 분석 (GCG 프로그램)에 의해 정량된다. 다르게 언급되지 않는 한, 질의 서열(query 서열)은 적어도 15개의 아미노산 길이이고, GAP 분석은 적어도 15개의 아미노산 영역에 걸쳐 2개의 서열과 정렬을 이룬다. 질의 서열은 적어도 50개의 아미노산 길이이고, GAP 분석은 적어도 50개의 아미노산 영역에 걸쳐 2개의 서열과 정렬을 이룬다. 질의 서열은 적어도 100개의 아미노산 길이이고, GAP 분석은 적어도 100개의 아미노산 영역에 걸쳐 2개의 서열과 정렬을 이룬다.
정의된 폴리펩티드/효소에 관하여, 상기 제공된 수치보다 큰 % 동일성 수치(identity figure)도 본 실시예에 포함되는 것으로 이해된다. 따라서 적용 시 최소 % 동일성 수치의 측면에서, 폴리펩티드는 관련된 지명 서열과 적어도 60%, 65%, 70%, 75%, 76%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 또는 99.9% 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "생물학적 활성 단편"은 항관절염 또는 항염증 활성(어느 쪽이든 관련된 활성)을 보유하는, 정의된 폴리펩티드의 일부를 의미한다. 상기 생물학적 활성 단편은, 전장 단백질의 연속적인 결실 및 생성된 단편의 활성 시험을 통해, 용이하게 결정될 수 있다.
본 명세서에 정의된 폴리펩티드/효소의 아미노산 서열 돌연변이/변이는, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산에 적절한 뉴클레오티드 변이를 도입하거나, 원하는 폴리펩티드의 시험관내 합성에 의해, 제조될 수 있다. 그러한 돌연변이는 예를 들어, 아미노산 서열 내 잔기의 결실, 삽입 또는 치환을 포함한다. 최종 단백질 생성물이 원하는 특성을 가지는 한, 결실, 삽입 및 치환을 조합하여, 최종 구조체를 제조할 수 있다.
아미노산 서열 돌연변이를 고안함에 있어, 돌연변이 부위의 위치 및 돌연변이 특성은 변형될 특성에 따라 달라질 수 있다. 돌연변이 부위는, 예컨대, (1) 보존적 아미노산으로 치환한 후, 그 결과에 따라 보다 활발하게 선별하거나, (2) 표적 잔기를 결실하거나, 또는 (3) 지정된 위치에 근접한 다른 잔기를 삽입함으로써, 개별적으로 또는 연속적으로 변형될 수 있다.
통상 약 1 내지 30 잔기, 약 1 내지 10 잔기 및 일반적으로 약 1 내지 5의 인접 잔기 범위로, 아미노산 서열의 결실이 이루어진다.
치환 돌연변이는 그 위치에 삽입된 상이한 잔기 및 제거된 폴리펩티드 분자가 적어도 하나의 아미노산 잔기를 가진다. 치환적 돌연변이에서 가장 흥미로운 부위는 활성 또는 결합 부위로서 확인된 부위를 포함한다. 관심 있는 다른 부위로는, 다양한 균주 또는 종으로부터 얻어진 특정 잔기가 동일한 부위가 있다. 이들 위치는 생물학적 활성에 중요할 수 있다. 이들 부위, 특히 동일하게 보전된 적어도 3개의 부위의 서열 내에 포함되는 부위는, 상대적으로 보존적인 방식으로 치환될 수 있다. 그러한 보존적 치환은 표 1에 나타낸다.
또한 원하는 경우, 비천연 아미노산 또는 화학 아미노산 유사체가 치환 또는 추가에 의해 본 발명의 폴리펩티드에 도입될 수 있다. 그러한 아미노산은, 일반적인 아미노산의 D-이성체, 2,4-디아미노부티르산, D-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, 2-아미노부티르산, 6-아미노 헥사노산, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르루신, 노르발린, 하이드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테인산(cysteic acid), t-부틸글라이신, t-부틸알라닌, 페닐글라이신, 사이클로헥실알라닌, D-알라닌, 플루오로-아미노산, 고안된 아미노산, 예컨대, D-메틸 아미노산, C-메틸 아미노산, N-메틸 아미노산, 및 통상의 아미노산 유사체를 포함하나, 이에 제한하지 않는다.
치환의 예
원 잔기 치환의 예
Ala (A) val; leu; ile; gly
Arg (R) lys
Asn (N) gln; his
Asp (D) glu
Cys (C) ser
Gln (Q) asn; his
Glu (E) asp
Gly (G) pro, ala
His (H) asn; gln
Ile (I) leu; val; ala
Leu (L) ile; val; met; ala; phe
Lys (K) arg
Met (M) leu; phe
Phe (F) leu; val; ala
Pro (P) gly
Ser (S) thr
Thr (T) ser
Trp (W) tyr
Tyr (Y) trp; phe
Val (V) ile; leu; met; phe, ala
또한, 예컨대, 비오티닐화, 벤질화, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 아미드화, 공지된 보호/차단 기에 의한 유도체화, 단백분해성 절단, 항체 분자 또는 다른 세포 리간드로의 결합 등에 의해, 합성 중 또는 합성 후에 별도로 변형된 본 발명의 폴리펩티드도 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 변형은 본 발명의 폴리펩티드의 안정성 및/또는 생물학적 활성을 증가시키는 역할을 할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드는 천연 단백질의 생산 및 회수, 재조합 단백질의 생산 및 회수 및 단백질의 화학적 합성을 포함하는, 다양한 방법으로 생산될 수 있다. 일례로 본 발명의 분리된 폴리펩티드는, 폴리펩티드 제조에 효율적인 조건 하에서 폴리펩티드를 발현하고 폴리펩티드를 회수할 수 있는 세포를 배양함으로써, 생산된다. 일 배양 세포는 본 발명의 재조합 세포이다. 효율적인 배양 조건은, 단백질 생산이 가능하도록 하는, 효율적인 배지, 생물 반응기, 온도, pH 및 산소 조건을 포함하나, 이에 제한하지 않는다. 효율적인 배지란, 세포가 본 발명의 폴리펩티드를 제조하도록 배양되는 임의의 배지를 의미한다. 그러한 배지는 일반적으로 동화할 수 있는 탄소, 질소 및 인산 원(source), 및 적절한 염, 무기질, 금속 및 비타민과 같은 다른 영양소를 가지는 수성 배지를 포함한다. 본 발명의 세포는 일반적인 발효 생물반응기, 교반 플라스크, 시험관, 미량역가판(microtiter dish), 및 페트리 플레이트에서 배양할 수 있다. 배양은 재조합 세포에 적절한 온도, pH 및 산소 농도에서 수행될 수 있다. 이러한 배양 조건은 당업자의 통상의 지식 범위에 내이다.
유전자 치료법
본 발명에 따라, 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드가 종종 "유전자 치료법"으로 언급되는 치료 요법에서 상기 폴리펩티드의 발현에 의해, 사용될 수 있다. 따라서 예를 들어, 환자 유래의 세포는 DNA 또는 RNA와 같은 폴리뉴클레오티드로 생체외 폴리펩티드를 코딩하도록 조작될 수 있다. 그 후 조작된 세포는 환자가 폴리펩티드로 치료되도록 제공될 수 있다. 조작된 세포는 이때 폴리펩티드로 치료될 환자에게 제공될 수 있다. 이러한 구체예에서, 세포는 예를 들어 본 발명의 방법으로 상기 세포를 형질전환시키는데 유용한 폴리펩티드를 코딩하는 레트로바이러스 플라즈미드를 사용하여 생체외(ex vivo)에서 조작될 수 있다. 상기와 같은 방법은 당해 분야에서 공지되어 있고, 본 발명에서 이러한 용도는 본원에 개시 내용으로부터 명백할 것이다.
또한, 세포는 당해 분야에서 공지된 방법에 의하여 생체내 폴리펩티드를 발현시키도록 생체내에서 조작될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에서 유용한 폴리뉴클레오티드는 복제 결함 레트로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터 또는 다른 벡터 (예를 들어, 폭스바이러스 벡터)에서 발현되도록 조작될 수 있다. 발현 구조체는 이때 분리될 수 있다. 패키지된 세포는 본 발명의 방법에 유용한 폴리펩티드를 코딩하는 RNA를 함유하는 플라즈미드 벡터로 형질유도되어, 패키지된 세포가 관심 유전자를 함유하는 감염성 바이러스 입자를 생산하게 된다. 이러한 생산 세포는 생체내에서 조작된 세포 및 생체내 폴리펩티드 발현을 시키기 위하여 환자에게 투여될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 투여하는 방법은 본 발명의 개시 내용으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
본원의 상기에서 언급된 레트로바이러스 플라즈미드 벡터로부터 수득된 레트로바이러스는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 로오스(Rous) 사르코마 바이러스, 하르베이(Harvey) 사르코마 바이러스, 아비안(Avian) 백혈증 바이러스, 기본(Gibbon) 에이프(Ape) 백혈병 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 아데노바이러스, 골수증식 사르코마 바이러스 및 포유류 종양 바이러스를 포함하나, 이에 제한하는 것은 아니다. 일 구체예에서, 레트로바이러스 플라즈미드 벡터는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래한다.
그러한 벡터로는, 폴리펩티드를 발현하는 하나 이상의 프로모터를 포함할 것이다. 사용될 수 있는 적절한 프로모터로는, 레트로바이러스 LTR; SV40 프로모터; 및 인간 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터를 포함하나, 이에 제한하지 않는다. 히스톤, RNA 폴리머라제 III, 및 β-액틴 프로모터를 포함하지만, 이에 제한하지 않는 진핵 세포 프로모터와 같은, 세포 프로모터가 또한 사용될 수 있다. 추가적으로 사용될 수 있는 바이러스 프로모터는, 아데노바이러스 프로모터, 티미딘 키나제 (TK) 프로모터, 및 B19 파르보바이러스 프로모터를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 적절한 프로모터를 선택하는 것은 본 발명의 개시 내용으로부터 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 방법에 유용한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은, 적절한 프로모터의 조절 하에 놓일 것이다. 사용될 수 있는 적절한 프로모터는, 아데노바이러스 프로모터, 예컨대, 아데노바이러스 주된 후반부(major late) 프로모터; 또는 이질적 프로모터, 예컨대, 거대세포바이러스 (CMV) 프로모터; 호흡기 세포융합 바이러스 (RSV) 프로모터; 유도형 프로모터, 예컨대, MMT 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터; 열 쇼크 프로모터; 알부민 프로모터; ApoAI 프로모터; 인간 글로빈 프로모터; 바이러스 티미딘 키나제 프로모터, 예컨대, 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제 프로모터; 레트로바이러스 LTRs (전술된 변이 레트로바이러스 LTRs를 포함); β-액틴 프로모터; 및 인간 성장 호르몬 프로모터를 포함하나, 이에 제한하지 않는다. 프로모터는 또한 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 조절하는 천연 프로모터일 수 있다.
레트로바이러스 플라즈미드 벡터는 패키지된 세포주를 형질유도하여 생산(producer) 세포주를 형성하는데 이용된다. 형질전환될 수 있는 패키지된 세포는, 문헌 [Miller(1990) Human Gene Therapy, 1:5-14]에 기재된, DAN 세포주, PE501, PA317, Y-2, Y-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, YCRE, YCRIP, GP+E-86, GP+envAm12를 포함하나, 이에 제한하지 않는다.
벡터는 당해 분야에 공지된 임의의 수단을 통하여 패키지된 세포로 형질유도될 수 있다. 그러한 수단으로는, 전기천공, 리포좀의 이용, 및 CaPO4 침전을 포함하나, 이에 제한하지 않는다. 대안적으로 레트로바이러스 플라즈미드 벡터는 리포좀에 캡슐화되거나 지질에 결합된 후, 숙주에 투여될 수 있다.
생산 세포주는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는, 감염성 레트로바이러스 벡터 입자를 생성할 수 있다. 상기 레트로바이러스 벡터 입자는 시험관내 또는 생체내에서 진행 세포를 형질유도하는데 이용될 수 있다. 형질유도된 진핵 세포는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 발현할 수 있다. 형질유도될 수 있는 진핵 세포는 간엽(mesenchemymal) 세포, 연골세포, 배아 줄기 세포, 배아 칼시노마(carcinoma) 세포, 및 조혈 줄기 세포, 간세포, 섬유아세포, 근육모세포, 각질세포, 내피 세포, 및 기관지 상피 세포를 포함하나, 이에 제한하지 않는다.
본 발명에 따른 유전자 치료법은, 환자에서 유전자 치료 폴리뉴클레오티드의 일과성 (일시적) 존재 또는 환자에게로 폴리뉴클레오티드의 영구 도입을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른, 전술한 물질의 직접 투여와 같은 유전자 치료법은, 단독으로 또는 다른 치료법과 결합하여 사용될 수 있다.
약제학적 조성물의 제조 및 투여
임의로 폴리펩티드와 함께 투여되는 다당류의 함량은 개인의 질병 상태, 연령, 성 및 체중에 따라 달라질 수 있다. 투여량 요법은 최적의 치료 반응을 제공하도록 조정될 수 있다. 예를 들어, 단독 볼루스(bolus)가 투여되거나, 시간에 따라 몇 회 분리된 용량이 투여되거나, 치료 상태의 위급성에 의해 용량을 비율적으로 감소 또는 증가하여 투여될 수 있다. 투약 편리성 및 용량 균일성을 위해, 용량 단위 형태의 비경구 조성물을 제형화하는 것이 바람직할 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "용량 단위 형태(Dosage unit form)"는 치료 개체의 일정한 투여에 적합하도록, 물리적으로 분리된 단위를 의미하며; 각 단위는, 필요한 약제학적 담체와 연관되어 원하는 치료 효과를 얻도록 계산된, 활성 화합물의 정해진 양을 포함한다.
임의로 폴리펩티드와 함께 다당류는 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물 형태로 투여될 수 있는 것으로 이해될 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체" 또는 "부형제"는 생리학적으로 호환가능한, 임의의 모든 용매, 분산 배지, 코팅제, 항균 및 항진균제, 등장액 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 일 구현예로서 담체는 비경구 투여에 적합하다. 대안적으로 담체는 정맥내, 복강내, 근육내, 설하 또는 경구 투여에 적절할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 상기 약제학적 활성 물질을 대해 사용되는 배지 및 물질은 당해 분야에 공지되어 있다. 임의의 일반 배지 또는 물질이 활성 물질과 비호환성인 경우를 제외하고는, 본 발명의 약제학적 조성물에서 이러한 사용이 고려된다. 또한 추가 활성 화합물이 또한 조성물에 포함될 수 있다.
치료 조성물은 통상 제조 및 저장 조건에서 멸균되고 안정하여야 한다. 상기 조성물은 용액, 마이크로유제, 리포좀, 또는 다른 원하는 구조로 제형화될 수 있다. 담체는 예를 들어, 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적절한 혼합물을 포함하는, 용매 또는 분산 배지일 수 있다. 예를 들어, 레시틴과 같은 코팅제를 사용하고, 분산 시 요구되는 입자 크기를 유지하고, 계면활성제를 사용함으로써, 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 많은 경우에, 조성물에 등장액, 예를 들어, 당, 폴리알콜, 예컨대 만니톨, 소르비톨 또는 나트륨 클로라이드를 포함하는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 조성물에 포함시켜, 주입 가능한 조성물의 흡수를 연장할 수 있다. 또한 다당류 및/또는 폴리펩티드는 예를 들어, 조성물 내에 서방성 폴리머를 포함하는, 시간 방출 제어 제형으로 투여될 수 있다. 활성 화합물은, 화합물이 신속히 방출되는 것을 방지할 수 있는 담체와 함께, 예컨대 이식 및 마이크로캡슐화 송달 시스템을 포함하는, 제어 방출 제형으로 제조될 수 있다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 폴리락트산 및 폴리락트, 폴리글리콜 코폴리머 (PLG)와 같은, 생분해성, 생체적합성 폴리머가 사용될 수 있다. 상기 제형을 제조하기 위한 다수의 방법이 특허되거나 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있다.
예를 들어, 골, 연골, 근육, 신경, 상피 및/또는 다른 연결 조직의 표면 성장을 제공하는, 적절한 매트릭스와 조합하여, 임의로 폴리펩티드와 함께 다당류가 투여될 수 있다. 매트릭스는 전형적인 매트릭스 생체 적합 물질(biomaterial) 형태일 수 있다. 매트릭스는 세포, 상청액 또는 용해 인자에 서방성을 부여할 수 있다.
매트릭스 물질은 생체적합성, 생분해성, 기계적 특성, 미용적인 외관 및 계면 특성을 고려하여 선택한다. 조성물에 대한 잠재 매트릭스는, 생분해성이고 화학적으로 수식된, 칼슘 설페이트, 트리칼슘 포스페이트, 하이드록시아파타이트, 폴리락트산 및 폴리안하이드라이드일 수 있다. 다른 잠재 물질은, 골 또는 진피 콜라겐과 같이, 생분해성이고 화학적으로 잘 수식된 물질일 수 있다. 또한 매트릭스는 순수 단백질 또는 세포 외 매트릭스 성분을 포함한다. 다른 잠재 매트릭스로는, 하이드록시아파타이트 소결체(sintered), 생체유리(bioglass), 알루미네이트 또는 다른 세라믹과 같이, 비생분해성으로 화학적으로 수식된 것들이 있다. 매트릭스는 폴리락트산 및 하이드록시아파타이트 또는 콜라겐 및 트리칼슘 포스페이트와 같이, 전술된 임의의 물질의 조합을 포함할 수 있다. 생체세라믹(bi℃eramic)은 칼슘-알루미네이트-포스페이트에서와 같은 조성, 및 공극 크기, 입자 크기, 입자 모양 및 생분해성을 변화시키는 공정에 따라, 달라질 수 있다.
본 발명의 조성물은 하나 이상의 다당류 및/또는 폴리펩티드로부터 제조될 수 있다. 추가 다당류 및/또는 폴리펩티드 단편 또는 펩티드는 본 명세서를 기초로 통상의 실험에 의해 동정할 수 있다. 자극 활성을 가진 펩티드 단편의 동정 방법은 예를 들어, US 5,399,342에 개시되어 있다.
약제학적 조성물은, 인간 또는 동물에서 인간 및 수의학 약물로 사용되며, 일반적으로는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 희석제, 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 치료용으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 약제학 분야에서 공지되어 있으며, 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985)에 개시되어 있다. 약제학적 담체, 부형제 또는 희석제는 원하는 투여 경로 및 표준 약제학적 관례의 측면에서 선택될 수 있다. 약제학적 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제로서, 또는 담체, 부형제 또는 희석제 이외에 추가로 임의의 적절한 결합제, 활택제, 현탁제, 코팅제 또는 용해제를 포함할 수 있다.
상이한 송달 시스템에 따라 조성물/제형의 필요요건이 다를 수 있는 것으로 당해 분야에 공지되어 있다.
본 발명에 따르면 비침습적 제형이 또한 포함된다. 예를 들어, 전구 세포가 비경구, 예컨대 관절내로 투여될 것 같으면, 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 흡입, 경구 또는 경비를 통하여, 좌제 또는 질좌제(pessary)의 형태로, 국소적으로는, 로션제, 용액제, 크림제, 연고제 또는 살포제의 형태나, 피부 패치를 이용하여, 경구적으로는, 전분 또는 락토스와 같은 부형제 함유 정제의 형태나, 단독 또는 부형제와 혼합하여 캡슐제, 츄어블정 또는 오뷸(ovule)의 형태, 또는 향미제 또는 색소를 포함하는 엘릭실제, 용액제, 시럽제 또는 현탁제의 형태로, 투여될 수 있다.
볼점막 또는 설하 투여의 경우, 조성물은 예를 들어, 통상적인 방식으로 제형화될 수 있는 정제 또는 로젠지(lozenge)의 형태로 투여될 수 있다.
경구 제형은 상기 일반적으로 사용되는 부형제들, 예를 들어, 약제학적 수준의 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 사카린 나트륨, 셀루로스, 마그네슘 카르보네이트 등을 포함한다. 이들 조성물은 용액제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 서방성 제형 또는 분말제의 형태를 취하며, 활성 성분 10% 내지 95%, 특히 25% 내지 70%를 포함한다. 환자에 경구 투여되는 캡슐제, 정제 및 환제는 예를 들어, 유드라짓(Eudragit) "S", 유드라짓 "L", 셀룰로스 아세테이트, 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트 또는 하이드록시프로필메틸 셀룰로스를 포함하는 장용성 코팅제로서 제공될 수 있다.
경비 제형 및 랄트리틱(larthrytic) 콜라겐 II형 및 랄트리틱 콜라겐 타입 IX의 투여가 예를 들어, 문헌 [Lu et al (1999) Different therapeutic and bystander effects by intranasal administration of homologous type II and type IX collagens on the collagen-induced arthritis and pristane-induced arthritis in rats, Clinical Immunology Vol 90 pp 119-127 (1999)]에 기재되어 있다.
다른 예로, 본 발명의 약제학적 조성물은 예를 들어, 흡입 또는 섭취 용액용 경비 스프레이 또는 에어로졸과 같은, 미니 펌프 또는 점막 경로를 이용하여 송달되도록 제형화될 수 있다.
약물이 위장관 점막을 통하여 점막적으로 송달되는 경우, 위장관을 통하여 일시적으로 잔류할 수 있어야 하는데, 예를 들어, 단백질 분해에 견디고, 적절한 항산화와 pH를 가지고, 담즙의 정화 작용에 저항해야 한다.
일례로 본 발명의 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 비침습적인 경로로 투여된다. 추가 예로 비침습적 경로는 경구 투여, 경비 투여 또는 흡입을 포함한다.
다른 예로 본 발명의 조성물은 비경구적으로, 예를 들어, 정맥내, 근육내 또는 피하내로 주입될 수 있다.
비경구 투여를 위해, 조성물은 다른 성분들, 예를 들어, 용액을 혈액과 등장성으로 만드는, 충분한 염 또는 단당류를 포함할 수 있는, 멸균 수용액의 형태로 사용되는 것이 가장 바람직하다. 또한 제제는 리포좀 내에 캡슐화 또는 유화될 수 있다.
제형화 후, 면역 보호성 조성물은 멸균 용기에 담겨진 후, 밀봉하고 저온, 예를 들어, 4℃에서 보관되거나, 또는 동결건조될 수 있다. 동결건조는 안정한 형태로 장기간 저장이 가능하도록 한다.
본 발명의 일구체예로서, 전구 세포, 특히 연골 전구 세포(chondroprogenitor), 더욱 특히 Stro-1bri 세포 및/또는 그의 자손 세포가 조성물의 형태로 투여된다. 일례로 상기 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 포함한다.
용어 "담체" 및 "부형제"는 활성 화합물의 저장, 투여 및/또는 생물학적 활성을 돕는, 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 물질을 의미한다 (예컨대, Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Ed., Mac Publishing Company (1980) 참조). 담체는 또한 활성 화합물의 바람직하지 못한 부작용을 감소시킬 수 있다. 적절한 담체는 예를 들어, 안정한, 예컨대, 담체 내 다른 성분들과 반응하지 않는다. 일구체예로서 담체는 치료에 이용되는 용량 및 농도에서는 수용자에 국소적 또는 전신적인 유의한 부작용을 나타내지 않는다.
본 발명에 적절한 담체는 통상적으로 사용되고 액체 담체, 특히 (등장성) 용액에서 바람직한, 예컨대, 물, 식염수, 수성 덱스트로스, 락토스, 링거액, 완충 용액, 하이알루로난 및 글리콜을 포함한다. 적절한 약제학적 담체 및 부형제는 전분, 셀룰로스, 글루코스, 락토스, 슈크로스, 젤라틴, 말트, 쌀, 곡분, 석회분말, 실리카겔, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 나트륨 클로라이드, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등을 포함한다.
다른 구체예에서 담체는 예컨대, 세포가 성장 또는 부유하는, 배지 조성물이다. 추가 구체예에서, 상기 배지 조성물은 투여되는 개체에서 어떠한 부작용도 유발하지 않는다.
바람직한 담체 및 부형제는 세포의 생존력에 부정적인 영향을 미치지 않는다.
일례로, 담체 또는 부형제는 세포 및/또는 용해성 인자를 적절한 pH로 유지시켜 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 완충 활성을 제공하며, 예컨대, 담체 또는 부형제는 인산염 완충 식염수 (PBS)이다. PBS는 세포 및 인자들과 최소한으로 상호 작용하고, 세포 및 인자들이 급속히 방출되도록 하기 때문에, 바람직한 담체 또는 부형제에 해당하며, 이 경우, 본 발명의 조성물은 예컨대 주입에 의해, 혈류 또는 조직 내 또는 조직을 둘러싸거나 조직에 인접한 부위에 직접 적용되는 액상제로서, 제조될 수 있다.
전구 세포, 특히 연골 전구 세포(chondroprogenitor), 더욱 특히 Stro-1bri 세포 및/또는 그의 자손 세포는, 수용자에 해롭지 않은 물질로 분해되는 수용자 적합성 지지체 내에 포함 또는 혼입될 수 있다. 이들 지지체는 수용 개체에 이식되는 세포를 지지 및 보호한다. 천연 및/또는 합성 생분해성 지지체를 상기 지지체의 예로 들 수 있다.
본 발명의 실시에 다양한 상이한 지지체가 성공적으로 사용될 수 있다. 지지체는 생물학적 분해성 지지체를 포함하나, 이에 제한하지 않는다. 천연 생분해성 지지체는 콜라겐, 피브로넥틴 및 라미닌 지지체를 포함한다. 세포 이식 지지체용의 적절한 합성 물질은 광범위한 세포 성장 및 세포 기능을 지지할 수 있어야 한다. 상기 지지체는 또한 재흡수가 가능할 수 있다. 적절한 지지체는 예컨대, 문헌 [Vacanti, et al . J. Ped . Surg . 23:3-9 1988; Cima, et al . Biotechnol . Bioeng. 38:145 1991; Vacanti, et al . Plast . Reconstr . Surg . 88:753-9 1991]에 개시된 것과 같은 폴리글리콜산 지지체; 또는 폴리안하이드라이드, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 합성 폴리머를 포함한다.
다른 구체예에서 세포는 겔 지지체(예컨대, Upjohn Company사 겔폼(Gelfoam))로 투여될 수 있다.
본 발명에 유용한 세포 조성물은 단독 또는 다른 세포와 혼합하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물과 결합하여 투여될 수 있는 세포로는, 다른 다잠재성(multipotent) 또는 다능성(pluripotent) 세포 또는 줄기 세포, 또는 골수 세포를 포함하나, 이에 제한하지 않는다. 다른 형태의 세포가 투여 직전에 본 발명의 조성물과 혼합되거나, 투여 이전 단계에서 함께 배양될 수 있다.
일 구체예에서, 조성물은 세포를 유효량 또는 치료적 또는 예방적 유효량으로 포함한다. 예를 들어, 조성물은 약 1x105 Stro-1bri 세포/kg 내지 약 1x107 Stro-1bri 세포/kg 또는 약 1x106 Stro-1bri 세포/kg 내지 약 5x106 Stro-1bri 세포/kg를 포함한다. 정확한 세포 투여량은 환자의 연령, 체중 및 성, 및 췌장 이상의 정도 및 중증도를 포함하는, 다양한 인자에 의존적이다. 전구 세포 및 연골 전구 세포 그 자체에 동일한 값이 적용될 수 있다.
일부 구체예에서, 개체의 순환으로 세포를 방출시키지 않으나, 세포로부터 분비된 인자들은 개체 순환으로 유입되도록 하는 챔버 내에, 세포를 포함시킨다. 이 경우, 세포가 개체의 순환으로 인자들을 분비하도록 함으로써, 가용성 인자들이 개체에 투여될 수 있다. 그러한 챔버도 동일하게 개체의 부위에 주입, 예컨대 이식한 기관 내 또는 부근에 주입하여, 가용성 인자의 국소 농도를 증가시킬 수 있다.
본 발명의 일부 구체예로서, 세포 조성물을 이용한 치료의 개시 이전에 환자의 면역을 억제시키는 것은 필요하지도 않을뿐더러 바람직하지 않을 수 있다. 따라서 어떤 경우에는 동종이형(allogeneic), 또는 심지어는 이종발생성(xenogeneic), Stro-1bri 세포 또는 그의 자손을 이용한 이식이 용인될 수 있다.
그러나 다른 예로, 세포 치료를 개시하기 이전에 환자의 면역을 약리학적으로 억제하는 것은 바람직하거나 적절할 수 있다. 이것은 전신 또는 국소 면역억제제를 이용하거나, 캡슐화 장치에 세포를 송달시킴으로써, 수행될 수 있다. 세포 및 치료 인자에 요구되는 산소 및 영양소를 투과시키는 캡슐에, 세포를 캡슐화시킬 수 있으며, 이때 세포는 체액성 면역 인자 및 면역 세포에는 비투과성이다. 캡슐화제(encapsulant)는 저알레르기성일 수 있고, 표적 조직에 쉽고 안정되게 위치되며, 이식된 구조에 추가적인 보호를 제공한다. 이식 세포에 대한 면역 반응을 감소 또는 제거하기 위한 상기 및 다른 수단들이 당해 분야에 공지되어 있다. 대안적으로, 세포는 유전자적으로 변이되어, 면역원성을 감소시킬 수 있다.
치료 용도 및 방법
본 발명의 방법, 조성물, 및 용도는 류마티스 관절염 (RA), 골관절염 (OA) 및 추간원판 탈출증 (DD)과 같은, 근골격계 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 그들은 또한 연골 재생 및 복구와 관련되어 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 방법, 조성물, 및 용도는 또한 연골형성(chondrogenesis) 및 세포 증식을 조절하고, 하이알루로난 (HA)을 생성, 상향 조절 또는 자극하는데 유용하다. 이러한 용도는, 류마티스 관절염 (RA), 골관절염 (OA), 및 추간원판 탈출증 (DD)을 포함하는 근골격계 질환의 치료; 또는 HA의 생성 증가가 유익한 상태들, 예를 들어, 윤활 관절의 골관절염의 치료, 안과 치료, 수술 후 복부 부착의 방지, 피부 치료 및 복구, 및 세포 외 매트릭스 기능의 복원; 또는 연골 복구, 복원 또는 매트릭스 신생의 유도에 이용될 수 있다.
또한 본 발명의 용도는, 그러한 치료를 필요로 하는 개체에서 결함이 있는 연결 조직에 이식하기에 적절한 세포 외 매트릭스의 제조를 포함한다.
따라서 본 발명의 방법은, 환자, 일부 예에서, 인간 환자에서 전술된 다수의 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 상기 방법은 또한 이러한 질환의 개시를 방지 또는 최소화하기 위해 예방적 차원에서 사용될 수 있다.
본 발명의 범위는 류마티스 관절염 (RA), 골관절염 (OA) 및 추간원판 탈출증 (DD)과 같은 근골격계 질환의 치료 및/또는 예방에 사용될 수 있는, 본 명세서에 기재된 조성물로 확장된다. 이들 조성물은 또한 연골 재생 및 복구, 또는 HA의 생성 증가가 유익한 상태들, 예를 들어, 윤활 관절의 골관절염의 치료, 안과 치료, 수술 후 복부 부착의 방지, 피부 치료 및 복구, 및 세포 외 매트릭스 기능의 복원; 또는 연골 복구, 복원 또는 매트릭스 신생의 유도와 관련하여 유용하게 사용할 수 있다.
상기 조성물은, 또한 그러한 치료를 필요로 하는 개체에서 결함이 있는 연결 조직에 이식하기에 적절한 세포 외 매트릭스의 제조, 및 연골형성 및 세포 증식의 조절 및/또는 하이알루로난 (HA)의 생성, 상향 조절 또는 자극에, 이용될 수 있다.
본 발명의 범위는 또한 류마티스 관절염 (RA), 골관절염 (OA) 및 추간원판 탈출증 (DD)과 같은 근골격계 질환의 치료 및/또는 예방용 의약의 제조에서의 본 명세서에 기재된 조성물의 용도로 확장된다. 상기 용도는 또한 연골 재생 및 복구, 또는 HA의 생성 증가가 유익한 상태들, 예를 들어, 윤활 관절의 골관절염의 치료, 안과 치료, 수술 후 복부 부착의 방지, 피부 치료 및 복구, 및 세포 외 매트릭스 기능의 복원; 또는 연골 복구, 복원 또는 매트릭스 신생의 유도로 확장된다.
또한 본 명세서에서 언급된 조성물의 용도는, 그러한 치료를 필요로 하는 개체에서 결함이 있는 연결 조직에 이식하기에 적절한 세포 외 매트릭스의 제조, 및 연골형성 및 세포 증식의 조절, 및/또는 하이알루로난 (HA)의 생성, 상향 조절 또는 자극을 위한 의약의 제조로 확장된다.
본 발명은 본 발명의 조성물이 투여되어, 전구 세포를 환자에게 이식시켜서, 결과적으로 HA 생성이 증가되도록 유도시키고/증가시키거나 연골발생 표현형으로 형질전환시킨다.
상기의 적용 예로서, 연골 또는 디스크 병변이 있는 개체의 관절에, 또는 접근이 쉽지 않은 부위에 전신적으로, 본 발명의 조성물을 주사함으로써, 제제가 조직 및 세포에 주입되도록 하여, 특유의 생물학적 효과를 나타내도록 할 수 있다. 본 출원은, 임상적으로 정의된 질병(때로는, OA 또는 관련 질환)은 앓고 있지 않지만, 스포츠나 근로 관련 활동을 통해 관절 조직에 외상이 지속되고 있는 개체를 치료하는 것을 포함할 수 있다.
OA 또는 관련 질환을 앓고 있는 노년층 개체에서, 관절내 HA 치료 (점성 보충(viscosupplementation)) 대신에, 이러한 형태의 치료가 이용될 수 있다.
또한 본 발명은, 연골 또는 반월(meniscal) 절제/변연절제술(debridement)이 필요한 경우, 관절경 또는 개방 수술 후에 예방적 방법으로 사용될 수 있다. 수술 후의 환자는 시간의 경과에 따라, 통상 의학적 치료가 필요한 증상적인 OA를 나타내도록 진행된다는 것이 잘 규명되어 있다. 연골 퇴행을 감소시키면, 염증을 촉진하는 연골 유래 자가 항원의 생성이 감소되기 때문에, 증상이 개선되는 것으로 생각된다.
활성을 나타내는 본 발명의 조성물은 동물 모델에서 안정성 및 효능에 관한 추가 시험을 실시한 후, 원하는 경우에는 인간에서 임상 시험을 수행한다. 당연하게도 수의학적 적용을 위해서는, 인간에서의 임상 시험은 필요하지 않다. 동물 또는 인간에서 안정하고 유용한 조성물은 적절한 개체에 투여되어, 전술한 질병을 치료 또는 보호할 수 있다. "치료 및 보호"는 전술한 질병의 개시 및 출현을 방지하기 위한 예방적 및 치료적 수단 모두를 포함한다.
본 명세서에서 치료 방법은, 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물을 투여하지 않은 것에 비하여, 개체에서 나타나는, 증상을 방어 또는 저해하고, 증상의 출현을 지연하며, 증상의 심각한 발전을 감소하고/감소하거나 다수의 다양한 증상을 감소시키는 것을 의미한다. 따라서 이러한 기재를 통하여, 본 발명에 따른 치료에 의해, 근골격 퇴행성 질환의 일 증상을 임상적 또는 통계적으로 유의하게 경감시키는 것이 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 이해될 것이다.
하기 예는 본 발명의 일 측면을 추가로 기술한 것이다. 그러나 이러한 실시예들은 본 발명의 암시 또는 개시 내용을 어떠한 형태로든 제한하지 않는다.
결과 및 토론
본 발명에 따르면, 광범위한 농도로 냉동 배지(예컨대, 프로프리즈®)에 폴리설페이트화 폴리사카라이드 및 많고 적은 수의 전구 세포를 포함하는 7.5% DMSO를 첨가한 후, 액체 질소 증기상에서 냉동시키고 주변 온도 또는 37℃에서 해동시키는 경우, 생육성에 어떠한 유해한 효과도 나타내지 않았다. 이 결과는 도 1-3에 나타낸다. 이 실험에서 실제로 향상된 생존력을 보였으며, 특히 도 3 및 도 4에서, 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 함유하지 않는 동결유지 배지에서 동결된 전구 세포에 비하여, 향상된 전구 세포 생존력을 보였다.
도 6은, 아폽토시스의 매개체로 알려진 IL-4 및 IFN-감마로 세포를 배양한 경우, 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 농도가 1 μg/mL 이상이면, 인간 전구 세포에서의 아폽토시스가 약 50% 감소된다는 것을 분명히 보여준다.
또한 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 농도 의존적으로 전구 세포 증식을 자극하는 것으로 나타났다. WST-1 미토콘드리아 탈수소효소 절단 분석법으로 측정한, 세포 분열에 대한 현저한 자극이, 도 4에서 나타났으며, 3H-티미딘을 DNA에 결합시킨 경우에, 도 5에서는, 뮤린 전구 세포주에서(도 10)뿐만 아니라, 인간 전구 세포의 단층 및 미세 배양(micromass culture)에서 1-5 μg/mL의 범위로 세포 분열에 대한 현저한 자극이 나타났다.
골생성 배지에서 배양 시, 골모세포로의 전구 세포 분화를 촉진하는, BMP-TGF-베타 슈퍼 패밀리 (예컨대, BMP-2, BMP-7, BMP-8) 및 섬유아세포 성장 인자 패밀리의 몇몇 일원과는 대조적으로, 폴리설페이트화 폴리사카라이드가 세포 표현형으로의 전구 세포 분화를 억제한다는 것을 최초로 밝혀내었다. 이것은 도 7에서 확인할 수 있는데, 골생성에 관한 전구 세포의 하향 조절을 보여준다.
한편 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 존재 하에 지방성(adipogenic) 배지에서 배양된 전구 세포는 지방세포로 분화된 것으로 나타났다. 따라서 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 지방세포로의 전구 세포 분화의 조절자로서 작용한다. 이것은 도 8에서 확인할 수 있다.
정상적인 비선택적 배양 조건 하에서, 프로테오글리칸 및 II형 콜라겐 합성의 증가로부터 입증되듯이, 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 전구 세포와 함께 배양하는 것은 연골형성 과정에서 분화에 예외 없이 유익하였다. 프로테오글리칸 및 II형 콜라겐은 연골세포의 생합성 산물로 인식되며, 유리질 연골의 표현형 마커로서 사용된다. 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 연골형성 촉진 효과는, 뮤린 MSC 세포주 C3H10T1/2를 대상으로 한 도 9와, 인간 전구 세포의 단층 배양 결과인 도 11에 나타내었다.
상기 결과는 추가적으로, 뮤린 ATDC5 세포주를 이용한 펠렛 배양 시, 2 μg/mL 농도에서, 프로테오글리칸 (PG) 합성이 (폴리설페이트화 폴리사카라이드가 없는) 대조군 배양물에 비해, 25% 증가된 것으로 관찰된 도 12에 의해 뒷받침되었다.
추가적인 증거로는, 펠렛 배양 6일 후, 세포 유전자 발현 시험에 의해, 폴리설페이트화 폴리사카라이드가 연골 발생 및 연골 형성을 촉진하였고, 이때 폴리설페이트화 폴리사카라이드에 의해 II형 콜라겐 발현이 농도 의존적으로 상향 조절되었다. 이 결과는 도 13에서 확인할 수 있다.
흥미롭게도 천연 생성 폴리설페이트화 폴리사카라이드인 헤파린은 펠렛 배양 시 시험된 모든 농도에서 프로테오글리칸 합성을 유의성 있게 자극하지 못하였다. 이 결과는 도 14에서 확인할 수 있다. 헤파린은 2.5 μg/mL 농도에서 활성을 거의 나타내지 않으나, 고농도에서는 저해 활성을 나타낼 수도 있다.
뮤린 MSC 주 C3H10T1/2를 이용하여 7일간 펠렛 배양한 경우, 10 μg/mL에서 폴리설페이트화 폴리사카라이드가 프로테오글리칸 합성을 대조군보다 80% 이상 증가시키는 것으로 입증되었다. 이는 도 15에서 확인할 수 있다. 이러한 결과는, 도 16에 나타난, 뮤린 MSC 주 C3H10T1/2을 이용하여 6일간 미세배양한 경우에 얻어지는 결과와 일치하였다. 전구 세포를 배양하는 이러한 방법은 원래 Denker et al (Andrew E. Denker AE, Haas AR, Nicoll SB, Tuan RS. Chondrogenic differentiation of murine C3H10T1/2 multipotential progenitor cells: I. Stimulation by bone morphogenetic protein-2 in high-density μMass cultures. Differentiation (1999) 64:67-76 1999)에 기재되어 있다.
또한 도 16에 나타난 바와 같이, 미세배양 9일 후, 1 μg/mL의 폴리설페이트화 폴리사카라이드에서 100% 자극이 얻어졌다. 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 존재 하에 배양하는 경우, 인간 전구 세포는 미세배양에서 연골세포로 분화되었다. 그러나 도 17에 나타난 바와 같이, 배양 5일째, 2.5 μg/mL의 폴리설페이트화 폴리사카라이드에서 PG 합성의 최대 자극은 30%로 얻어졌다. Denker et al (Andrew E. Denker AE, Haas AR, Nicoll SB, Tuan RS. Chondrogenic differentiation of murine C3H10T1/2 multipotential progenitor cells: I. Stimulation by bone morphogenetic protein-2 in high-density μMass cultures. Differentiation (1999) 64:67-76 1999)]에 기재된, 면역 염색 기술을 이용한 상기 미세배양에서, PG와 함께 II형 콜라겐의 공동 생산이 확인되었다.
도 18로부터 명백한 바와 같이, 10일간 1-10 μg/mL 농도 범위의 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 존재 하에 유지시킨, 인간 전구 세포의 미세배양은, 강력한 II형 콜라겐 염색을 제공하였고, 폴리설페이트화 폴리사카라이드가 5 μg/mL일 때 최대 수준을 달성하였다.
도 19A로부터 알 수 있듯이, 인간 전구 세포 및 하이알루로난 (HA)을 이용하여 수행된 유사한 미세배양 시, PG로의 35SO4 혼입 수준이 낮은 것으로 관찰되었다. 그러나 초음극으로 하전된 덱스트란 설페이트(DS)는, 1-20 μg/mL의 농도 범위에서 PG 합성을 저해하였다 (도 19B). DS는 폴리설페이트화 폴리사카라이드와 유사한 분자량 및 전하 밀도를 가지므로 전구 세포에 대해 유사한 활성을 나타낼 것으로 기대되기 때문에, 이러한 결과는 놀랄만한 것이었다. 효율적인 수용체 결합 및 단백질 상호작용에 중요한, 분자의 입체형태(conformation) 및 다른 인자들이 중요한 역할을 했을 것으로 예상된다.
하이알루로난은 삼차원 배양(alginate bead culture)에서 전구 세포에 대해 연결형성 효과를 나타내는 것으로 보고되고 있다 (Kavalkovich KW, Boynton RE, Murphy JM, Barry F. Chondrogenic differentiation of human progenitor cells within an alginate layer culture system. in vitro cells. Dev. Bioil - Animal. 38:457-466, 2002). 도 20에서, WST-1 분석법을 이용한, 인간 전구 세포 증식에서, 펜토산 폴리설페이트 단독 및 하이알루로난(Supartz™)과의 조합으로 인한 효과가 3일째 및 5일째 배양에서 나타났다. 본 실험 결과, HA 단독으로는 전구 세포 증식에 대해 유의한 자극 효과를 나타내지 않는 것으로 확인되었으며, 폴리설페이트화 폴리사카라이드와의 조합에 의한 상승 효과도 없음이 증명되었다. 따라서 폴리설페이트화 폴리사카라이드가 HA보다 우수한 연골형성제인 것으로 볼 수 있다. 추가로 NC4와는 대조적으로, HA는 폴리설페이트화 폴리사카라이드와 상승적으로 결합하지 않는다.
IX형 콜라겐의 알파-1 체인의 비콜라겐성 도메인의 재조합 인간 제제인 rhNC4는, 전구 세포에 의한 PG 생성 및 연골형성을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 도 21로부터 확인되는 바와 같이, ATDC5 세포에 인슐린이 부재하거나(유지 배지) 존재하는(분화 배지) 모든 경우에, PG 합성이 농도 의존적으로 자극되는 것으로 관찰되었으며, 최대 효과는 1 μg/mL일 때 나타났다. ATDC5 세포의 펠렛 배양에서 rhNC4의 자극 효과가 입증되었으나, 유지 배지에서 최적 효과는 농도가 0.5 μg/mL일 때 나타났다.
도 23 및 24에서 확인되듯이, 단백질이 폴리설페이트화 폴리사카라이드와 함께 배양된 경우에, 뮤린 ADTC5 세포에 대한 rhNC4의 연골형성 및 분열촉진 효과가 향상된 것으로 관찰되었다. HA 및 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 조합과는 상이하게, rhNC4 및 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 조합은, rhNC4 농도 1μg/mL 및 폴리설페이트화 폴리사카라이드 농도 2 μg/mL에서, 분화 배양 배지 내 3H-DNA 합성을 450%까지 상승적으로 자극하였다 (도 23). PG 합성의 측면에서, 5μg의 폴리설페이트화 폴리사카라이드와 1-5μg/mL rhNC4의 조합이, 가장 효과적인 조합으로 보였다(도 24).
도 21, 33 및 23은, 성장 인자 (이 경우는 인슐린) 함유 전구 세포 (ATDC5)에 대한 분화 매질 (DM), 및 성장 인자를 함유하지 않는 유지 배지 (MM) 모두를 사용한 실험 결과를 보여준다. 도 21은 NC4 단독 사용의 경우인 반면, 도 33 및 23은 폴리펩티드 및 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 조합의 효과를 나타낸 것이다. 본 발명의 화합물은 성장 인자가 부재하는 경우에는 연골형성을 촉진하지만, 동시에 성장 인자가 존재하는 경우에는 연골형성률에 긍정적인 영향을 가지는 것으로 확인되었다. 따라서 본 발명의 화합물은 다른 성장 인자 없이도 사용될 수 있지만, 동시에 다른 성장 인자와 함께 사용되어 연골형성을 더욱 촉진할 수 있다.
rhNC4 및 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 존재 하에 배양된 ATDC5 세포에 의한, Runx 2 유전자의 발현 연구에서, 농도가 증가함에 따라 골 마커의 점진적인 하향 조절이 관찰되었다 (도 25 및 26). 이와는 대조적으로 이들 화합물에 의해, HA 합성 유전자 중 하나 (HAS3) 및 HA 수용체 (CD44) 모두가 상향 조절되었다 (도 25 및 26). PG 합성을 자극하는 것으로 나타난 농도에서, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 단독 및 폴리설페이트화 폴리사카라이드 + rhNC4에 의해, Smad 2 및 Smad 4의 상향 조절이 발견되었다는 점이 특히 흥미롭다. Smad 4는, 전구 세포들이 BMP에 의해 활성화되는 경우, 전구 세포 내 II형 콜라겐 프로모터의 전사 활성(transactivation)에 대한 주요 세포내 단백질로 보고되고 있다 (Hatakeyama Y et al. Smad signaling in progenitor and chondroprogenitor cells. J Bone Joint Surg AM. 85A Suppl 3, 13-8, 2003, Chen D, Zhao M, Munday GR, Bone morphogenetic proteins. Growth Factors, 22: 233 - 41, 2004). 따라서 전구 세포에 대한 폴리설페이트화 폴리사카라이드 및 NC4의 연골형성/증식성 효과는 BMP 활성을 통해 매개될 수 있으며, 이들 두 화합물이 단독 또는 조합하여 존재하는 경우에 활성 수준이 상승하는 것이 가능하나, 이러한 논리에 제한되는 것은 아니다.
실험방법 및 프로토콜
비신코닌산 ( Bicinchoninic Acid : BCA ) 검출법을 사용한 시료의 단백질 양 결정법
모든 시료의 단백질량을 BCA 검출법 (Smith PK, Krohn RI, Hermanson GT, Mallia AK, Gartner FH, Provenzano MD, Fujimoto EK, Goeke NM, Olson BJ and Klenk DC. Anal. Biochem. 150, 76-85, 1985)을 사용하여 결정하였다. 냉동 건조된 단백질 시료를 직접 H2O에 용해시켜서 2.0 mg/ml 용액을 제공하였다. 각 시료의 20㎕을 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 검출하기 이전에, 시약 1의 50 부(0.4% NaOH; 1.7% Na2CO3; 0.95% NaHCO3; 1.0% 비신코닌산; 0.16% Na2-타트레이트)를 시약 2와(4% CuSO4.5H2O)와 혼합하였다. 이러한 실험 시약의 200㎕를 시료 용액에 첨가하였다. 60분 동안 37℃에서 배양한 후에 A562 흡광도에서 써머맥스 마이크로플레이트 계측기를 사용하여 측정하였다. 우 혈청 알부민 (BSA) 또는 고도로 정체된 젤라틴 (Gibco)을 0-10 ㎍/well을 사용하여 표준 곡선을 그렸다. 시료의 단백질양을 이러한 표준 곡선으로부터 결정하였다.
SDS - PAGE 전기영동에 의한 단백질의 분석
사용된 방법은 램리에 의해서 기술된 방법에 기초한다(Laemmli UK. Clevage of structural protein during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature. 1970; 227:680-685). 요약하면 시료를 2 x 시료 로딩 완충액 (0.07 M TrisHCl, 1.5% SDS, 20% 글리세롤, 0.2M DTT 및 0.1% BPB)을 사용하여 1:1로 혼합하여 4.0-20 mg/ml의 최종 농도가 되도록 하였다. 혼합물을 5분동안 수조에서 끓였다. 20㎕의 용액을 8-16 % 프리-캐스트 트리-글리신 젤(Norvex)의 웰에 로딩시켰다. 시블루(SeeBlue) 사전 염색한 저 분자량 범위의 단백질 마커(Norvex)를 젤의 왼쪽 편 상의 웰에 로딩하고 전기영동을 125 V에서 2시간 동안 수행하였다. 젤을 쿠모시 블루(Coomassie blue) R250 용액 (40% 에탄올, 10% 아세트산 및 0.2% 쿠마시 R250)으로 30분 동안 염색하고, 10% 에탄올 및 7.5% 아세트산을 함유하는 용액에서 16시간 탈염색시켰다. 상기 젤을 바이로-래드 젤에어(Bio-Rad Gelair) 건조기에서 건조시켰다.
DMMB 염색을 이용한 황산화 글리코스아미노글리칸 (S- GAG ) 검출법
시료상에서 황산화 글리코스아미노글리칸 (S-GAG) 농도를 파른달 등(Farndale RW, Buttle DJ, Barrett AJ. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethyl methylene blue. Biochem. et. Biophys. Acta. 1986; 883:173-177)에 의해 기술된 것을 수정한 비색형 염색 결합 검출법으로 결정하였다.
이 검출법은 시료에서 또는 표준 용액에서 복합체가 1,9-디메틸메틸렌 블루 (DMMB)의 혼합물 및 황산화-GAG 사이에 형성된 경우, 최대 690 nm 내지 535 nm의 흡광도에서 이형 이동에 기초한다. 염색 용액은 16 mg의 1,9-디메틸메틸렌 블루를 5 ml 에탄올에 첨가하고 2 g의 나트륨 포르메이트에 2 ml의 포름산을 첨가하여 pH 3.5에서 총 부피 1리터가 되도록 하여 제조하였다. 콘드로이틴-6-설페이트 (CS-C) 표준용액 (0-15 및 0-40 ㎍/ml: 50 ㎕) 또는 시료 (50㎕)를 미세 플레이트에 이동시켰다. 염색용액(200 ㎕)을 침전물이 스탠딩 상에서 형성될 것이기 때문에, 즉시 각 웰에 첨가하고 흡광도를 540 nm에서 측정하였다. 표준 곡선을 공지된 CS-C 농도의 시료 흡광도 및 플레이트 리더 소프트웨어를 이용하여 그렸다. 공지되지 않은 시료에서 공지된 시료에서의 S-GAG에서의 S-GAG의 농도를 고려하여, CS-C 표준을 기준으로 곡선을 그렸다.
하이알루로난 ( Hyaluronan : HA ) ELISA
96웰 역가용 미세 플레이트(Maxisorp® Nunc)를 코팅 완충액에 용해시킨 탯줄 HA(Sigma Chemical Co) (100 ㎕/well)을 사용하여 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 코팅되지 않은 영역을 60분 동안 25℃에서 포스페이트 완충 염수 (PBS)에 녹인 1% (w/v) BSA을 150 ㎕/well로 사용하여 블록킹시켰다. PBS-Tween으로 세척한 후에, 검출할 시료 100 ㎕ 기준 경합체 (HA Healon® 범위 19.53-10,000 ng/ml)을 바이오틴이 컨쥬게이션된-HA-결합 단백질 (1:200)과 함께 첨가하였다. 60분 동안 25℃에서 배양한 후에, 플레이트를 세척하고 그 다음에 페록시다아제-마우스 단일클론 항- 바이오틴(Invitrogen) (100 ㎕/well; 1:4,000)을 첨가하였으며, 이 혼합물을 60분 동안 25℃에서 배양하였다. 이 플레이트를 다시 세척한 후에 페록시다아제 기질(Invitrogen) (100 ㎕/well)을 첨가하고 10-20분 동안 37℃에서 배양하여 발색되도록 하였다. 이 반응을 50 ㎕의 4 M H2SO4를 첨가하여 중지시켰다. 492/690 nm에서 흡광도를 티터르테크 멀티스캔 M340 멀티플레이트 리더(Titertek Multiskan M340 multiplate reader)로 측정하였다.
반-정량 분석 RT - PCR mRNA
총 RNA를 오럼 토털 RNA 미니 키트 (Bio-Rad, USA)용 제조자의 설명서에 따라 전구 세포로부터 분리하였다. 이 RNA를 RevertAidTM H Minus First Stand cDNA 합성 키트 (Fermentas, USA)를 사용하여 역전사시켰다. 표 2 및 3은 PCR에 대한 프라이머 서열 및 조건을 보여준다. PCR 생산물을 아가로스 젤로 이동시키고 이티움 브로마이드 염색에 의하여 시각화시키고, 사이언 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 밀도를 통합하였으며, 하우스-키핑 유전자(the house-keeping gene)인 글리세르알데히드즈-3-포스페이트 디하이드로게나아제(GAPDH)로 표준화시켜서 mRNA 수준을 반-정량분석 비교를 하였다(L.Marchuk, P.Sciore, C.Reno, C.B.Frank, D.A.Hart. Postmortem stability of total RNA isolated from rabbit ligament, tendon and cartilage, Biochim Biophys Acta. 1379 (1998) 171-177. R.Boykiw, P.Sciore, C.Reno, L.Marchuk, C.B.Frank, D.A.Hart. Altered levels of extracellular metrix molecule mRNA in healing rabbit ligaments, metrix Biol. 17 (1998) 371-378.)
뮤린 역전사 PCR을 위한 프라이머
유전자 (뮤린) 프라이머 서열 Tm 사이클 제품 크기 프로토콜
GADPH F: 5'AC CAT GGA GAA GGC CGG GG 3'
R: 5'AC GGA CAC ATT GGG GGT AT 3' 		55 28 418 RT130308
SOX-9 F: 5'TG AAG GGC TAC GAC TGG AC 3'
R: 5'AG GAG GAA TGT GGG GAG TC 3' 		58 28 406 RT040308
아그리캔(Aggrecan) F: 5'GG AGG TGG TAC TGC TGG TG 3'
R: 5'CT CAC TCC AGG GAA CTC GT 3' 		55 28 448 RT130308
II형 콜라겐 F: 5'GT CAA GGG AGA TCG TGG TG 3'
R: 5'GT CGT GCT GTC TCA AGG TA 3' 		58 28 598 RT040308
ALPH F: 5'CC CTC TCC AAG ACA TAT A 3'
R: 5'CA TGA TCA CGT CGA TAT CC 3' 		55 28 372 RT130308
반정량적 RT-PCR에 사용되는 프라이머
유전자 (인간) 아닐링 온도 (℃) 제품 크기
(염기쌍)		 서열 (5' 내지 3')
아그리캔 65 110 순방향: ACTTCCGCTGGTCAGATGGA
역방향: TCTCGTGCCAGATCATCACC
콜라겐 II 65 106 순방향: CAACACTGCCAACGTCCAGAT
역방향: CTGCTTCGTCCAGATAGGCAAT
SOX9 68 101 순방향: ACACACAGCTCACTCGACCTTG
역방향: GGAATTCTGGTTGGTCCTCTCTT
hsp 70 60 590 순방향: TTTGACAACAGGCTGGTGAACC
역방향: GTGAAGGATCTGCGTCTGCTTGG　
HAS1

 65 348 순방향: CGGCCTGTTCCCCTTCTTCGTG
역방향: TCGTGTGCTACGCTGCGGACCA
HAS2 51 358 순방향: CACAGCTGCTTATATTGTTG
역방향: AGTGGCTGATTTGTCTCTGC
HAS3 55 317 순방향: CAGCCTCCTCCAGCAGTTCC
역방향: TAACCGTGGCAATGAGGAAG
HYAL1 51 208 순방향:　AGCTGGGAAAATACAAGAACC
역방향:　TGAGCTGGATGGAGAAACTGG
HYAL2 55 448 순방향:　GAGTTCGCAGCACAGCAGTTC
역방향:　CACCCCAGAGGATGACACCAG
HYAL3 65 500 순방향:　CCGCCTCCAGTGCCCTCTTCC
역방향:　AGCCCAGCCCCAGTAACAGTG
MMP-1 68 84 순방향: CTGTTCAGGGACAGAATGTGCT
역방향: TCGATATGCTTCACAGTTCTAGGG
MMP-2 56 ~100 순방향: TCAAGTTCCCCGGCGAT
역방향: TGTTCAGGTATTGCACTGCCA
MMP-3 65 138 순방향: TTTTGGCCATCTCTTCCTTCA
역방향: TGTGGATGCCTCTTGGGTATC
MMP-9 56 ~100 순방향: TGAGAACCAATCTCACCGACAG
역방향: TGCCACCCGAGTGTAACCAT
MMP-13 65 96 순방향: TCCTCTTCTTGAGCTGGACTCATT
역방향: CGCTCTGCAAACTGGAGGTC
인간-
iNOS		 60 340 순방향: CAGTACGTTTGGCAATGGAGACTGC
역방향: GGTCACATTGGAGGTGTAGAGCTTG　
5-인테그린 55 324 순방향: CATTTCCGAGTCTGGGCCAA
역방향: TGGAGGCTTGAGCTGAGCTT
1-인테그린 55 452 순방향: TGTTCAGTGCAGAGCCTTCA
역방향: CTTCATACTTCGGATTGACC
피브로넥틴
외부 도메인 A		 56 143 순방향: CAT TCA CTG ATG TGG ATG TC
역방향: CAG TGT CTT CTT CAC CAT CA
피브로넥틴
외부 도메인 B		 56 129 순방향: CCG CCA TTA ATG AGA GTG AT
역방향: AGT TAG TTG CGG CAG GAG AAG
총-피브로넥틴
 60 184 순방향: GAT AAA TCA ACA GTG GGA GC
역방향: CCC AGA TCA TGG AGT CTT TA
CD44 56 602 순방향: GATCCACCCCAATTCCATCTGTGC
역방향: AACCGCGAGAATCAAAGCCAAGGCC
ADAMTS1
 60.4 ~100 순방향: GAACAGGTGCAAGCTCATCTG
역방향: TCTACAACCTTGGGCTGCAAA
ADAMTS4
 56 ~100 순방향: CAAGGTCCCATGTGCAACGT
역방향: CATATGCCACCACCAGTGTCT
ADAMTS5
 60.4 ~100 순방향: TGTCCTGCCAGCGGATGT
역방향:　ACGGAATTACTGTACGGCCTACA
GAPDH 53 370 순방향: TGGTATCGTGGAAGGACTCAT
역방향:　GTGGGTGTCGCTGTTGAAGTC
Dowex MAC3 양이온 교환 수지를 이용한 펩타칸 ( Peptacan ) 단백질/폴리펩티드의 분리
Dowex MAC3 수지 (100 g) (Sigma Chemical Co)는 4% HCl를 이용하여 24시간에 걸쳐 수소형(hydrogen form)으로 재생시켰다. 소결 유리 필터에 의해, 수지를 완전히 세척(3 X 2L H2O)한 후, 0.1M 칼슘 아세테이트로 평형화시켜, pH 4.5로 조정하였다. 펩타칸 (10g)을 5mg/ml 농도, pH 4.5에서, 0.1M 칼슘 아세테이트 중에 용해시킨 다음, 수지와 혼합하고, 1hr 동안 온화하게 교반하였다. 수지로부터 여과에 의해 비결합 S-GAG 및 단백질을 포함하는 용액을 분리해내고, Farndale 분석법으로 S-GAG가 검출되지 않을 때까지, 수지를 완충용액(loading buffer) (10 x 수지 부피)으로 세척하였다. 상기 수지는 Milli-Q 물로 수회 추가 세척한 후, 0.2M Na2HPO4로 평황화시켰다. 수지에 결합된 단백질은, NaOH를 이용하여 pH 10.5로 조정된 0.2M Na2HPO4 용액에 의해, 방출되었다. 이 수지를 다시 소결 유리 부후너 깔때기(Buchner funnel)를 통항 여과에 의해 분리시키고, 여액을 수집하고 1KDa TFF 막 (Millipore Australia Pty Ltd, Sydney, Australia)을 이용하여 투석여과한(diafiltrate) 다음, 동결 건조하였다.
세틸피리디늄 클로라이드 ( CPC ) 침전법을 이용한 펩타칸 단백질/폴리펩티드의 분리
세틸 피리디늄 클로라이드 (CPC)는, 펩타칸의 설페이트화 글리코사미노글리칸 (S-GAG) 성분상에 존재하는 음으로 하전된 설페이트기와 양으로 하전된 피리디늄 이온 사이에 강력한 수불용성 복합체를 형성하는, 수용성 계면활성제이다.
이 수불용성 CPC-S-GAG 복합체는 생물학적 조직 또는 체액의 추출물로부터 S-GAG를 분리하고 정제할 목적으로 지난 40년에 걸쳐 많은 연구자들에 의해 널리 사용되어 왔다. 그러나 본 발명자들은, 복합체의 침전 및 제거 후에, 여과액 중에 펩타칸 단백질이 잔류하기 때문에, 펩타칸 내에 존재하는 단백질/폴리펩티드를 분리하는데에도 이러한 원칙이 사용될 수 있을 것으로 추론하였다. CPC-S-GAG 침전 단계에 이용되는 공정은, Oegema 및 Thompson (Oegema TR and Thompson RC. Characterisation of a hyaluronic acid-dermatan sulfate proteoglycan complex from dediffertiated human chondrocyte cultures. J Biol Chem. 256:1015-1022; 1981)에 개시된 방법을 기초로 하였으나, GAG-CPC 복합체를 해리하기 위해 2M 염화칼슘을 사용하고, 물 부피 4 X의 에탄올로, 수용액으로부터 S-GAG을 참전시키는 것으로 변형하였다. CPC-S-GAG 복합체를 제거한 후, 펩타칸 단백질/폴리펩티드 함유 수용액을, 1000Da 차단 한외여과 막(cut-off ultrafiltration membrane) (YC10) 또는 유사한 MW 차단의, 연속식 흐름방식 한위여과(tangental flow ultrafiltration) (TFF) 카트리지(Millipore Australia Pty Ltd, Sydney, Australia)를 이용하여, 광범위하게 투석여과하였다. 그러나, 단백질의 참전을 피하기 위해, 투석여과의 최종 단계에서, 투석분리(dialysing) 용액을 0.001 M 아세트산으로 교체하였다. 투석여과된 용액을 동결건조시켜, 백색 분말로서 단백질/폴리펩티드를 제공하였다.
박테리아 시스템을 이용한 rhNC4 의 제조
23 신호 펩티드가 결여된, 인간 콜라겐 IX의 NC4의 유전자를, 전술된 방법(Pihlajama T, et al. Characterization of Recombinant Amino-terminal NC4 Domain of Human Collagen IX: Interaction with glycosaminoglycans and cartilage oligomeric matrix protein. J. Biol. Chem. 2004; 279: 24265-24273)을 기초로, GST 융합 태그에 대한 서열과 플레임에 맞게(in-frame) pGAT-2 박테리아 발현 벡터 상에 구축하였다. 재조합 인간 NC4 (rhNC4) 구조체를 대장균(Escherichia coli) BL21 (DE3) 세포주 내로 전이시켰다. 100 μ/ml 암피실린이 보충된 원하는 최종 부피의 LB 매질에, 세포주(1:100)를 접종시켜, 융합 단백질을 교반 플라스크에서 발현시켰다. 세포는 600 nm에서의 흡광도가 0.6에 이를 때까지, 37℃에서 성장시켰다. 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노사이드 (IPTG)의 추가로 발현을 유도하여, 최종 농도가 0.5 mM가 되도록 하였다. 4-6 시간 또는 16 시간 동안 37℃에서 배양을 지속하였다. 원심분리 후, 세포 펠렛을 3회 1xPBS로 세척하고 균질화(homogenisation) 완충액 [0.3 M NaCl, 0.2% IGEPAL CA-630 (Sigma, Sydney, Australia), 0.05 M 인산염 나트륨 완충액 (pH 7), 0.25 mg/ml 라이소자임]으로 재부유시킨 후, 냉동 보관하고, 초음파로 얼음 상에 균질화하였다. 40분간 4℃에서 17,000g으로 원심분리하여, 불용성 물질을 제거하였다. 융합 단백질은 암모늄 설페이트를 가하여, 30% 포화시켜, 상청액으로부터 침전시켰다. 침전물은 30분간 4℃에서 23,000g로 원심분리하여 수집하고, 1x PBS (1% IGEPAL-CA 630 함유)에 용해시켰다. 용액을 30분간 4℃에서 23,000g로 원심분리하여 청정화하고, 4℃에서 250ml/분 유속으로 글루타치온-세파로스 4 FF (Amersham Biosciences, Sydney, Australia) 컬럼에 적용하였다. 내독소를 제거하기 위하여, 1x PBS (0.1% 트리톤 X-114 함유) 50 컬럼부피 (CV)를 적용하여 비결합 물질을 제거하고, 1x PBS (멸균)의 20 CV로 세척하였다 (Reichelt P, Schwarz C and Donzeau M. Single step protocol to purify 재조합 proteins with low endotoxin contents. Protein Expression and Purification 46: 483-488, 2006). 인자 Xa 절단 완충액 (멸균) 10 CV로 평형화한 후, 실온에서 인자 Xa 단백분해효소 (Amersham Biosciences 또는 Promega)로 밤새 소화시켜, 융합 GST로부터 재조합 NC4 (rNC4)를 절단하였다. 벤즈아미딘 세파로스 4 FF 결합 완충액 (50 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, pH 7.4)의 용출액을 이용하여, rhNC4 용액을 글루타치온-세파로스 컬럼을 통하여 이동시키고, 벤즈아미딘 세파로스 4 FF 컬럼 (Amersham Biosciences)을 이용하여 추가 정제시켰다. 용출되서 나온(flow-through) rhNC4는 농축시키고, 5K 컷오프(cut-off) 농축기(Agilent Technologies)에서 dH2O로 세척하여 탈염하였다. 슈퍼덱스(Superdex) S-200 컬럼을 이용하여, 크기 배제 크로마토그래피로 최종 정제를 수행하였다. 생성물의 크기 및 순도는 SDS-PAGE 분석 및 웨스턴 블랏팅에 의해 정량되었다. 정제된 rhNC4의 농도는 브래드포드(Bradford) (Sigma, Sydney, Australia) 또는 BCA 단백질 분석법에 의해 측정되었다.
효모 K. 락티스에서 인간 NC4 의 발현
(i) 콜라겐 α1( IX ) NC4 도메인 유전자의 분리
23 신호 펩티드가 결여된, 인간 콜라겐 IX의 NC4의 유전자(GenBank accession number NM_001851)는, 관절 연골 유래의 인간 연골세포로부터 추출한 RNA를 이용한 역전사 PCR로, 수득하였다. 인간 연골세포를 10% FCS가 보충된 알파-MEM 매질에 접종하였다. 세포가 융합되면(confluent), 트립신 처리하고 원심분리하여 세포 펠렛으로 수집하였다. RNeasy® Mini Kit (QiaGen Pty Ltd, Melbourne, Australia)로 세포 펠렛으로부터 전체 RNA를 추출하였다. 제조자의 지시에 따라 플라티늄 택(Platinum Taq)을 이용한 SuperScript™ One-Step RT-PCR로(Invitrogen, Melbourne, Australia) 역전사 PCR를 수행하였다. 상류 및 하류 프라이머는 각각 KL-NC451 및 KL-NC431였다 (표 4). 30분간 55 ℃에서 1 사이클로 cDNA 합성을 수행한 후, 2분간 94 ℃에서 전 변성(pre-denaturation)한 후, PCR 증폭을 40 사이클 수행하였다 (변성: 94℃에서 30초간; 아닐링: 55℃에서 30초간; 확장: 72℃에서 1분간). RT-PCR 생성물은 0.8% 아가로스겔로 분리하고, SNAP™ 겔 정제(Invitrogen, Melbourne, Australia)로 정제시켰다.
( ii ) 효모에서 콜라겐 α1( IX ) NC4 도메인을 발현하는 벡터의 구축
K. 락티스 발현 시스템(New England Biolab, USA)을 적용하여, 효모인 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis)에서, 인간 α1(IX) 콜라겐 (hNC4)의 NC4 도메인의 발현을 위한 DNA 구조체를 생성하였다. 1 그룹의 올리고뉴클레오티드 프라이머 (표 4)를, 23-아미노산 신호 펩티드가 결여된 전장 hNC4 (NCBI accession number NP_001842)의 아미노산 24-268번 단편을 증폭시키도록 고안하였다.
pKLAC1-NC4 발현 벡터 구축에 사용되는 프라이머
명칭 프라이머
KL-NC451 5'-ACTCTCGAGAAAAGAGCTGTCAAGCGTCGC-3'
KL-NC431 5'-GTCAGATCTTTATCTCTCGTCGGTGGTCTG-3'
KL-NC454 5'-ACTCTCGAGAAAAGAGCTGTTAAGCGTAGACCAAGATTCC-3'
KL-NC433 5'-GTCAGATCTTCATTATCTCTCGTCGGTAGTCTGGCTTGGAGTAAT
TCTGGCTGGCAGCTCATGGCAAGTTTCTCTCCTAGGTCTCAGTGG-3'
KL-NC438 5'-CTGAGATCTACCAGGTGGACCTCTTCCATCGGTAGTTTGAC-3'
GAT2-GST53 5'-CTGAGATCTGGTGCTGGTGCTATGACTAAGTTACCTATACTAGGTTATTGG-3'
GAT2-GST33 5'-ACTGTCGACTTAGTCATTAATGATCAGATTTTGGAGGATGATCTCCACC-3'
5'-프라이머 KL-NC451는 조작된 Xho I 절단 부위를 포함하였고, 3'-프라이머 KL-NC431은 조작된 Bgl II 절단 부위를 포함하였다. 이 2가지 프라이머를 이용하여, 신호 펩티드가 결여된 hNC4 단편을 역전사 PCR로 증폭시켰다.
5'-프라이머 KL-NC454 및 3'-프라이머 KL-NC433은 각각 조작된 Xho I 및 Bgl II 절단 부위를 포함하였다. 프라이머 KL-NC451 및 프라이머 KL-NC431과는 상반되게, KL-NC454 및 KL-NC433은, 효모 K. 락티스에 따른 hNC4 유전자를 바람직한 코돈으로 변화시키지만, hNC4 단백질 서열은 변화하지 않도록 보존하는, 다수의 유전자 돌연변이를 제공하였다.
hNC4의 PCR 생성물은 제한 효소로 소화시키고, 다양한 클로닝 부위 Xho I 및 Bgl II에서 pKLAC1 발현 벡터에 결찰하였다 (도 1). 양성 삽입된 재조합체의 서열을 분석하여, NC4 유전자 삽입이 올바른지 확인하였다. 올바른 재조합체는 제한 효소 Sac II로 소화시키고, 수용성 있는(competent) K. 락티스 GG799 세포로 형질전환시켰다. 질소원으로 5mM 아세트아미드를 포함하는 효모 탄소 염기 (YCB) 매질을 선택적인 매질로 사용하였다.
표적 NC4 유전자 및 amdS 유전자 (pKLAC1에 존재하는 amdS 유전자)를 가지는, 상기 재조합체의 Sac II 단편을 효모 염색체 DNA에 삽입된 경우에만, 그 세포가 이러한 선별된 YCB 매질에서 생존할 수 있다.
효모 K. 락티스에서 발현되는 일부 돌연변이를 가지고 있는, 박테리아 벡터 pGAT-2로부터 글루타치온-S-전이효소 (GST) 유전자를 얻기 위하여, 5'-프라이머 GAT2-GST53 및 3'-프라이머 GAT2-GST33을 고안하였다. 3'-말단에 3개의 STOP 번역 코돈을 가지는 상기 GST 유전자는, 벡터 pKLAC1 다중 클로닝 부위 Bgl II 및 Sal I에서 구축되어, pKLAC1-GST을 형성하였다.
Glu267를 Gly로 전환하는 돌연변이를 가지는 재조합 hNC4를 얻기 위하여, 5'-프라이머 KL-NC454 및 3'-프라이머 KL-NC438을 고안하였다. 이 돌연변이는 hNC4의 C-말단에서 트롬빈 절단 부위를 제공하였다. 재조합 hNC4를 클로닝 부위 Xho I 및 Bgl II에서 벡터 pKLAC1-GST에 결찰시켜, N-말단 GST 융합 단백질을 얻었다. DNA 서열을 확인한 후, NC4-GST 융합 단백질 유전자와 함께 재조합체를 Sac II로 소화시키고, 효모 K. 락티스 GG799 세포의 염색체 DNA에 삽입한 다음, YCB 선택적 매질로, 통합 NC4 및 amdS 유전자를 가지고 있는 생존 콜로니를 스크리닝하였다.
( iii ) 효모 K. 락티스 GG799 세포에서 콜라겐 α1( IX ) NC4 도메인의 발현
삽입되어 발현될 수 있는 hNC4를 함유하는 각 콜로니에서, 이쑤시게 또는 피펫 말단으로 긁어내어, 약 2 mm2 영역으로부터, 세포를 수확(harvest)하고, 멸균 배양관 내 2 ml의 YPGal 매질 (10 g 효모 추출물, 20 g Bacto™ 펩톤, 2% 갈락토스) 중에 재부유시켰다. 배양물은 최소 2일의 성장 기간 동안 30℃에서 교반(~250 r.p.m.)하면서 배양하였다. NC4의 최대 분비를 달성하기 위한 최적의 성장 시간을 결정하기 위해, 배양 상청액에 대한 분석을 매일 수행하였다. 30℃에서 밤새 성장시킨 개시 배양물로, 단백질 정제를 위한 더 많은 배양물(예컨대, ≥1 L)을 1:100의 비율로 접종하였다. 시료 (각 배양물의 1 ml)를 1분간 10,000g으로 원심분리하여, 세포를 펠렛화시켰다. 배양 상청액을 신선한 마이크로원심분리관에 옮기고, 얼음상에 보관하였다. 30 ㎕의 비농축 배양 상청액을 SDS-PAGE (NuPAGE 4-12% Tris-Bis Gel, MES 완충액, Invitrogen)에 적용하고, 쿠마시 염색(Coomassie stain) (Colloidal Blue Stain Kit, Invitrogen) 및/또는 웨스턴 블랏팅을 실시하였다.
( iv ) 효모 K. 락티스 GG799 로부터 발현된 rhNC4 단백질의 부분 정제
단백질 정제에 사용될, > 1L 부피의 30일째 배양액을 Celite-512로 여과하여, 세포 및 조직파편(debris)을 제거하였다. 청정한 수성 여액을 투석 여과하고, 컷오프 접선 유동 여과 (Tangential Flow Filtration; TFF) 막 (Millipore Ltd, Sydney, Australia)에 적용하여, 농축하였다. 50 mM 인산염 나트륨 완충액 (pH7.4) 2X5 부피를 투석여과한 후, 배지 용액을 1-2L로 농축시키고, 밤새 4℃에서 저장하거나, 즉시 (NH4)2SO4 참전을 실시하였다. 고체 (NH4)2SO4를 배지 용액에 가하여, 80%로 포화시켰다(0℃). 4℃에서 30분간 14,000로 원심분리하여, 침전물을 수집하고, 50 mM 인산염 나트륨 완충액 (pH7.4)에 용해시켰다. Bradford 또는 BCA (Sigma, Sydney, Australia) 분석법을 이용하여, 정제된 hNC4의 단백질 농도를 정량하였다. 대장균(E. coli)으로부터 제조된 rhNC4에 대해 수행된, 본 명세서에 기재된 방법과 동일한 방법으로, 상기 물질의 추가 정제를 수행하였다.
다양한 농도의 펜토산 폴리설페이트 ( PPS ) 존재 하에서 전구 세포의 동결보존
세포를 수확하고, 5.0 내지 20.0 x 106 세포/ml 농도로 차가운 무혈청 배지에서 재부유시켰다. 동량의 냉장 프로프리즈®-CDM 완전 매질을 0, 10, 20, 50 및 100 μg/mL의 PPS 함유 냉장 세포 부유액에 가하였다. 생성된 최종 DMSO 농도는 7.5%이고, PPS 농도는 0, 5, 10, 25 및 50 μg/mL이며, 최종 세포 농도는 약 2.5 내지 10 x 106 세포/ml였다. 세포 혼합물을 동결보존 앰플(Nunc, Intermed, Denmark)에 분취하여 담고, C156 냉동 용기 (Thermo Scientific, Melbourne, 21 Australia)에서 -1℃/분으로 조절된 냉동 속도 및 -80℃로 동결보존하였다. 그 후 앰플을 액체 질소 하에 저장하였다 (-196℃).
동결보존된 시료의 해동
동결보존된 세포는 37℃ 수조에서 1분간 신속히 해동하고, 10mL 폴리프로필렌 튜브에 옮겼다. 일정하게 혼합하면서 적절한 배지 약 3mL를 상기 세포에 점적 첨가하고, 최종 부피가 10mL가 되도록 하였다. 세포를 4℃에서 5분간 400 x g로 원심분리하여 펠렛화하고, 상청액을 흡인하였다. 잔류 DMSO를 확실히 제거하기 위해, 세포를 매질 중에 세척시키고, 전술한 바와 같이 원심분리하였다. 세포를 최종 부피 10mL로 재부유시키고, 5% CO2 존재하에 37℃, 습식배양기에 접종하기 전에, 75cm2 플라스크에 접종하였다.
다양한 펜토산 폴리설페이트 ( PPS )의 존재 하에서 동결보존 후 세포의 계수
PPS 함유 동결보존 바이알로부터 전구 세포를 해동시킨 후에 얻어진, 단일 세포 부유액의 분취물을 인산염 완충 식염수 (PBS) 내 동량의 0.4% (w/v) 트립판 블루에 희석시켰다. 세포수는 혈구계수기(haemocytometer) (Neubauer Improved, Assistant, Germany) 및 광현미경(Olympus CKX41, Japan)으로 측정하였다.
이 실험의 결과는 도 1에 나타낸다. 일반적으로 PPS의 첨가는 전구 세포의 동결보존에 부작용을 나타내지 않았다.
30분인 경우를 제외하고는, 모든 시점에서 50 μg/ml PPS을 사용함으로써 전구 세포의 생존력이 향상되었다. 25 μg/ml PPS를 사용 시, 30분인 경우를 제외하고 모든 시점에서 생존력을 향상시키거나, 전구 세포의 생존력에 부정적인 영향을 미치지 않았다. 10 μg/ml PPS의 사용은 시점 0에서, 그 다음으로는 60 및 90분에서, 유용한 효과를 나타내었다. 5 μg/ml PPS를 사용하는 경우는, 60분에서 생존력에 유리한 효과를 나타내었다.
종합하면, 일반적으로 PPS의 추가는 부작용을 나타내지 않으면서, 전구 세포의 동결보존력을 향상시킬 수 있다. 수치에 있어서의 미차는 세포 계수 방법으로 인한 것일 수 있다. 전구 세포는 응집하는 경향이 있어서 오차가 발생할 수 있으며, 이는 응집이 일반적인 5 μg PPS이 명백히 낮은 값을 나타낸 이유가 될 수 있다.
MTT 실험을 이용한, 동결보존 및 해동 후의 전구 세포의 생존력에 대한 펜토산 폴리설페이트 ( PPS )의 농도 결정적 효과
RIKEN 세포 은행(Tsukuba, Japan)으로부터 입수한 뮤린 전구 세포 (세포주 C3H10T1/2 또는 ATDC5) 또는 인간 면역선택적 Stro-1+ 전구 세포(Mesoblast Ltd, Melbourne, Australia)를 DMEM + 10% FBS을 함유하는 2mL 스크류 캡(screw-capped) 원심분리관에, 다양한 세포 밀도로 1.68x105 - 1.0x106 세포 범위에 걸쳐 접종하였다. 분리관에서, DMEM + 20% FBS 및 15% DMSO에 용해된 PPS를 필요량의 2배로 함유하는 원액(stock solution)을 제조하였다. 이 원액을 세포 배양액에 가하여, PPS의 최종 농도가 원액 농도의 50%, FBS 농도의 10%, 및 DMSO 농도의 7.7%가 되도록 하였다. 여러 회에 걸친 독립적인 실험에서, 최종 용액 내 PPS의 최종 농도는 0.0 - 100μg/ml 범위였다 (더욱 상세한 것은 도면 참조). 사용된 PPS는 전농도에서 3회 시험하였다. PPS 함유 동결보존 용액 및 세포를 5분간 부드럽게 혼합하고, 액체 질소에서 보관하였다. 3일 후, 액체 질소로부터 튜브를 제거하고, 37℃ 수조에서 해동시킨 후, 실온에 약 15분간 두었다. 세포를 5분간 200g으로 원심분리하고 상청액을 버렸다. 세포를 페놀 레드 없이 DMEM 900ul로 세척한 후, 5분간 200g로 원심분리 하였다. 세포를 DMEM 내 1mg/ml MTT 용액 500ul 중에 재부유시키고, 3시간동안 37℃에서 배양한 후, 5분간 6000g로 원심분리 하였다. DMSO 300ul를 각 튜브에 가하여, 염료 결정을 용해시켰다. 각 튜브로부터 90ulx3씩 96웰 플레이트에 옮기고, 540nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 2는 냉동-해동 사이클을 적용한 뒤, 7.5% DMSO 및 다양한 농도의 펜토산 폴리설페이트(PPS)를 함유하는 극저온의 배지에 부유된, 서로 상이한 수의 뮤린 ATDC5 전구세포의 생존력을 보여주는 막대 그래프를 나타낸 것이다. 세포 생존력은 MTT 실험을 이용하여 측정하였다.
도 2는 모든 농도 범위에서 PPS의 존재에 의해, 전구 세포의 생존력이 향상되었음을 보여준다. 100㎕/ml의 PPS에서, 세포수가 0.25 밀리온, 0.5 밀리온 및 1.0 밀리온 세포일 때, 생존력이 향상되었다. 250㎕/ml PPS의 경우도 동일하였다. 500㎕/ml PPS에서, 세포수가 0.25 밀리온 및 0.5 밀리온 세포인 경우, 생존력의 향상을 보였다. 1 밀리온 세포에 대해서는, 500㎕/ml 농도의 PPS가 생존력을 향상시키지 않은 것으로 보이나, 생존력에 해롭지는 않았다.
이들 데이터로부터, 적절한 동결보존 매질에서 냉동-해동 사이클을 적용한, 25-50mg PPS와 조합한 100 밀리온 용량의 연골전구 세포가, 그러한 치료를 필요로 하는 환자에서 허용가능한 수준으로 세포의 생존력을 유지시킬 수 있다는 점을 추정할 수 있다.
도 3은 MTT 실험을 이용하여 측정한, -180℃에서의 동결보존 및 해동 후, 인간 전구 세포 생존력에 미치는, 서로 상이한 농도의 나트륨 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 효과를 나타낸 것이다. 제시된 데이타= 평균±SD. * =대조군 수치에 대한 p < 0.05.
168,000개의 세포를 동결보존하는 경우, PPS의 존재가, 특히 1 및 2.5 ㎕/ml 농도에서 세포의 생존력을 향상시켰다. 350,000개 세포에 관한 실험에서, 일반적으로 PPS의 존재가 전구 세포의 생존력에 부정적인 영향을 미치지 않는 것으로 볼 수 있다. 일부 경우에, 세포의 생존력은 해동 이후에 향상되었다.
이들 데이터로부터, 적절한 동결보존 매질에서 냉동-해동 사이클을 적용한, 30mg PPS와 조합한 100 밀리온 용량의 인간 전구 세포가, 그러한 치료를 필요로 하는 환자에서 허용가능한 수준으로 세포의 생존력을 유지시킬 수 있다는 점을 추정할 수 있다.
유세포 측정기( Flow cytometry )로 측정된, IL -4 IFN -감마의 조합을 첨가함에 따른, 인간 전구 세포 아폽토시스에 미치는 펜토산 폴리설페이트 ( PPS )의 효과.
인간 전구 세포를 0, 1, 2, 5 및 10 μg/mL 농도의 PPS로 보충한 무혈청 배지에 위치시켰다. 30ng/ml IL-4 30,000U/ml IFN 감마의 조합을 첨가함에 따라, 전구 세포 아폽토시스가 유도되었다. 5일간 배양한 후, 트립신화(트립신isation)에 의해 세포를 수확하고, 전술한 아넥신(Annexin) V 염색으로 생존력을 측정하였다 (Kortesidis A, A Zannettino, S Isenmann, S Shi, T Lapidot and S Gronthos. (2005). Stromal-derived factor-1 promotes the growth, survival, and development of human bone marrow stromal stem cells. Blood 105:3793-3801).
이 실험의 결과는 도 6에 나타낸다. PPS의 전 농도에서 세포 아폽토시스가 감소되었고, 특히 10 ㎕/ml일 때 최상의 결과가 나타났음을 알 수 있다. 상기 결과는, 동결보존 매질에 PPS를 첨가함으로써, 해동 시 아폽토시스가 감소됨을 시사한다.
상기 실험은 50,000 전구 세포/웰을 포함하는 96웰 플레이트에서 수행되었다. 스트레스 단백질의 일련의 과정의 아폽토시스 및 활성화는 세포 동결-해동의 공지된 과정이고, 이러한 과정을 유의성있게 감소시키는 PPS의 능력은, 의약 공정 기반의 대부분의 세포에서 요구되는, 동결보존 및 해동 이후의 세포 이용에 유익할 것임이 분명하다고 생각되나, 이러한 논리에 제한되는 것은 아니다.
단층 배양으로 성장시킨 전구 세포에 의한, 프로테오글리칸 ( 35 S- GAG 로 측정)의 합성에 미치는 나트륨 펜토산 폴리설페이트 ( PPS ) 단독 또는 rhNC4 와의 조합의 효과
RIKEN 세포 은행(Tsukuba, Japan)으로부터 입수한 뮤린 전구 세포 (세포주 C3H10T1/2 또는 ATDC5) 또는 인간 면역선택적 Stro-1+ 전구 세포(Mesoblast Ltd, Melbourne, Australia)를 10% FBS (Sigma)가 보충된 1:1 고 글루코스 DMEM/햄의 F-12 매질 (Invitrogen) 함유 50 mL 플라스틱 배양 플라스크에 접종하고, 37℃, 5% CO2에서 배양하였다. 합류(confluence)에 도달한 후, 트립신화에 의해 전구 세포가 유리되면, 원심분리에 의해 수확하였다. 웰당 3x104 세포 또는 2x105 세포의 밀도로, 세포를 96-웰 또는 24-웰 플레이트에 접종하였다. 37℃에서 48시간 5% CO2 하에서 인큐베이션시킨 후, 합류(confluent) 단층을 정상적으로 구축하였다. 그 후 상기 매질을, rhNC4 및 5μCi/ml의 35S-H2SO4 (PerkinElmer, USA)의 존재하 및 부재하에서 서로 상이한 농도의 PPS를 포함하는 한정(defined) 매질로 변화시켰다. 48시간 인큐베이션 후, 통상 실험이 종결되는데, 이때 후술한 바와 같이 프로테오글리칸 생합성은 35SO4를 글리코사미노글리칸 (35S-GAGs)에 결합시켜 측정함으로써, 결정되었다.
(A) 96-웰 플레이트: 파파인을 이용하여 배양액을 단백질분해 소화시켜, 글리코사미노글리칸을 유리시켰다. 사용된 파파인 원액은 파파인 소화 완충액(0.1M NaAc, 5mM EDTA, pH6.0) 내에 파파인(Sigma) 2.5mg/ml, 시스테인-HCl(Sigma) 7.9mg/ml을 포함하였다. 파파인 원액 50㎕를 각 웰에 가하였다. 플라스틱 시트을 이용하여 플레이트를 밀봉하고, 2시간 동안 65℃에서 배양하였다. 종결시킨 경우, 훽스트(Hoechst) 33258 염료를 사용한 DNA 형광 분석(fluorometric assay) 및 Kim et al (Kim YJ, Sah RLY, Doong J-YH, Grodzinsky AJ, Fluorometric assay of DNA in cartilage explants using Hoechst 3358. Anal Chem. 1988; 174: 168-176)에 기재된 방법에 이용하기 위해, 웰당 50㎕의 소화 용액 분취물을 수집하였다.
잔류 용액(200ul) 내 35SO4-GAG를 세틸 피리디늄 클로라이드 (CPC) (Sigma)로 침전시켰다. 간략히 말하면, 5% CPC 20㎕를 각 웰에 가한 후, 1mg/ml 콘드로이틴 설페이트 A (CSA, Sigma) 10㎕를 공침전제로 가하였다. 세포 하베스터(harvester) (Skatron 7021)를 이용하여 진공 여과로 35S-GAG-CPC 복합체를 수집하였다. 그 후, 필터를 대기 건조시키고, 디스크로 펀칭되어 섬광 바이알(scintillation vial)에 첨가되었다. 3ml 섬광액을 가하고, 회전시킨(vortexing) 후, 시료 내의 35S-GAG-CPC 복합체의 방사능을 섬광 계수(PerkinElmer, USA)로 측정하고, DPM/시료 단위로 기록하였다. 그 후 데이터를 DNA에 대해 표준화하고, 35-S-GAGs/μg DNA로 표시하였다.
(B) 24-웰 플레이트: 한정(defined) 배지에서 48시간 배양 후, (용해성 35S-표지 프로테오글리칸 함유하는) 웰당 배지를 세포로부터 분리하고, 2.0ml 마이크로관(microfuge tube)으로 옮겼다. 웰에 잔류하는 단층 세포를 트립신화로 떼어낸 후, 5분간 350g으로 원심분리하여 (매트릭스 프로테오글리칸 함유하는) 상청액으로부터 분리해 냈다. 상기 상청액을 수집하고, 매질과 혼합하였다. 200㎕의 매질 및 상청액 혼합물을 96-웰 플레이트에 옮기고, 파파인 소화를 통해 글리코사미노글리칸을 유리시켰다. 파파인 소화 후, 35S-GAG을 침전시키기 위해 5% CPC 20㎕를 각 웰에 가하여, 담체로서 1mg/ml CSA 10㎕를 가하였다. 35S-GAG-CPC 복합체를 섬유 필터로 수집하고, 전술한 액체 섬광 분석기를 이용하여 35S-GAG의 방사능을 측정하였다. RNA 시약으로 세포를 추출하고, 유전자 발현 및/또는 DNA 함량을 결정하는데 사용된 분취물(aliquot)을 형광 분석으로 측정하고, 그 결과를 35-S-GAGs/μg DNA로 나타내었다.
도 4는 인간 전구세포 증식에 미치는 펜토산 폴리설페이트의 효과를 보여준다.
제 1 인간 전구세포를, PPS로 보충된 성장 배지 내의 24 웰 플레이트에서 상기 제시된 농도로 배양하였다. 다양한 시간 간격(1, 3, 6일)을 두고, 성장 배지를 제거하고, 37℃/5% CO2에서 2시간 동안 테트라졸리움염 WST-1을 함유하는 무-페놀레드 배지로 대체하였다. 450nm의 파장에서 ELISA 플레이트 리더기를 이용하여 탐지할 수 있는, 포르마잔 염료(formazan dye)를 생성하기 위해, WST-1는 생존 새포 내에서 미토콘드리아 탈수소효소에 의하여 절단된다. 각각의 시점에 대한 450nm에서의 흡광도를 PPS의 모든 농도에 대해 나타내었다. 증식에서, 통계학적으로 유의한 증가는 6일째 1 ㎕/ml를 초과하는 PPS 농도에서 관측되었다(* p <0.01, ANOVA). 도 4는 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 함유하지 않는 동결유지 배지에서 동결된 전구 세포에 비해, 전구 세포 생존력이 향상되었음을 보여준다.
도 9는 단층 배양으로 성장시킨 경우, 뮤린 전구세포(C3H10T1/2)의 프로테오글리칸(PG) 생합성 및 DNA 함량에 미치는 나트륨 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 농도 의존적 효과를 보여준다. 제시된 데이터는 평균 ± SD이다.
상기 결과는 모든 농도의 PPS에서 프로테오글리칸의 생합성이 증가하였음을 보여준다. 이는 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 이용하면 모든 농도 범위에서 분화, 특히 연골형성이 유도될 수 있음을 나타낸다. 5-10㎕/ml일 때 최적의 결과가 도출되었으며, PG 합성은 10㎕/ml일 때 최적이었고, DNA 함량은 5㎕/ml 및 10㎕/ml일 때 최적이었다.
도 10은 3H-티미딘을 매크로분자 DNA에 결합시켜 측정한, 2일 동안 단층 배양으로 성장시킨 뮤린 전구세포(C3H10T1/2 세포)에 의한 DNA 합성에 미치는 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 농도 의존적 효과의 막대 그래프를 나타낸 것이다.
도 11은 인간 전구세포의 단층 배양 2일 후, 방사성 라벨된 설페이트를 PG의 설페이트화 글리코사민글리칸(35S-GAG)에 결합시켜 측정한, 프로테오글리칸(PG)의 생합성에 미치는 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 농도 의존적 효과의 막대 그래프를 나타낸다. 이 데이타는 DNA 함량에 대하여 표준화시킨 분당 붕괴도(DPM)로서 35S-GAG 방사능으로 표현된다. * = p < 0.05; ** = p < 0.005; ***= p < 0.0005.
도 21는 뮤린 ATDC5 전구세포로 3일 배양 후, 방사성 라벨된 설페이트를 PG의 설페이트화 글리코사미노글리칸(35S-GAG)에 결합시켜 측정한, 인슐린(10 μg/mL)의 부재(유지 배지, MM) 및 존재(분화 배지, DM) 하에서, 프로테오글리칸(PG)의 생합성에 미치는 K. 락티스에 의하여 발현되는 rhNC4(배치 PBA-1202P)의 농도 의존적 효과의 막대 그래프를 나타낸 것이다. 데이타는 rhNC4을 함유하지 않은 대조군 배양에 대한 % 변화율로 나타내었다. P < 0.05는 대조군 배양에 비하여 통계학적으로 유의함을 의미한다.
도 24는 PPS 및 NC4의 조합에 따른 결과를 나타낸 것이다. PPS의 효과가 농도 의존적으로 증가하였음을 보여준다. 또한 NC4의 농도가 증가할수록 이러한 효과가 향상되는 것을 확인할 수 있다.
NC4 0.5㎕/ml 및 PPS 5㎕의 조합에 의해, 프로테오글리칸 합성이 통계적으로 유의하게 증가하는 것으로 나타났다. 또한 NC4 1㎕/ml와 PPS 2㎕/ml 및 5㎕/ml의 조합이 프로테오글리칸 합성을 통계적으로 유의하게 증가시킨 것으로 나타났다. 또한 NC4 2㎕/ml를 PPS 1㎕/ml, 2㎕/ml 또는 5㎕/ml와 조합하거나, NC4 5㎕/ml를 PPS 1㎕/ml, 2㎕/ml 또는 5㎕/ml와 조합한 모든 경우에, 프로테오글리칸 합성이 통계적으로 유의하게 증가한 것으로 나타났다.
NC4 5㎕/ml 또는 PPS 5㎕/ml를 사용하면 최적의 결과가 도출되었으며, NC4 5㎕/ml 및 PPS 5㎕/ml를 조합하는 경우 가장 최적의 효과를 보였다.
펠렛 배양으로 성장시킨 전구 세포에 의한 프로테오글리칸 ( 35 S- GAGs 로 측정)의 생합성에 미치는, 나트륨 펜토산 폴리설페이트 ( PPS ) 단독 또는 rhNC4 과의 조합의 효과
RIKEN 세포 은행(Tsukuba, Japan)으로부터 입수한 뮤린 전구 세포 (세포주 C3H10T1/2 또는 ATDC5) 또는 인간 면역선택적 Stro-1+ 전구 세포(Mesoblast Ltd, Melbourne, Australia)를 2mL 스크류 캡(screw-capped) 멸균 원심분리관에 접종하고, 10% FBS를 함유하는 DMEM-고 글루코스 매질로, 최종 부피가 1 ml가 되도록 하였다. 그 후, 스윙 아웃(swing-out) 로터에서, 실온에서 10분간 500g으로 전구 세포를 원심분리 하였다. 스크류 캡을 느슨하고 하고, 분리관을 5% CO2/95% 습윤공기 분위기하, 37℃에서, 인큐베이터에 두었다. 통상 24시간 이내에 펠렛이 형성되었다. 처음 2일간은 매일, 그 이후로는 2-3일마다 한번씩 매질을 교체하였다. 5일째 매질을 제거하고, 10% FBS, 5.0 μCi/ml 35S-H2SO4 및 다양한 농도의 PPS (0, 0.1, 0.5, 1.0,2.5, 5.0, 10.0, 20.0, ㎕/ml) (도 12-15) 또는 rhNC4 (0, 0.1, 0.5, 1.0, 2,0 ㎕/ml) (도 22)를 함유하는 DMEM-고 글루코스 매질 1 ml를 각 분리관에 첨가하였다. 모든 농도의 약물에 대해 3개의 배양물을 사용하였다. 스크류 캡을 느슨하게 하고, 관을 3일간, 5% CO2/95% 습윤공기 분위기하, 37℃에서, 인큐베이터에 두었다. 6일째 파파인 원액[파파인 완충액 (0.1 M NaAC, 5mM EDTA, pH6.0) 내 파파인 2.5 mg/ml, L-시스테인 7.9 mg/ml] 200 ㎕를 각 관에 첨가하였다. 관은 단단히 마개를 씌우고, 2시간 동안 65℃에서 인큐베이션 하였다. 파파인 소화 후, 파파인 소화 용액 200㎕ 중 4개의 복재물(replicate)을 개별적으로 96-웰 미세 플레이트(micro-titre 플레이트) (200 ㎕/웰)에 옮겼다. 잔류 용액은, 전술한 바와 같이 3회(in triplicate) 수행된 DNA 형광 분석에 사용하였다. 35S-GAGs의 생합성은, 단층 배양에 대해 기술한 바와 같이 측정되었고, 그 결과는 35-S-GAGs/μg DNA로 표기되었다.
도 22는 인슐린(10 μg/mL)의 부재(유지 배지, MM) 및 존재(분화 배지, DM) 하에서, ATDC5 세포의 펠렛 배양 내의 프로테오글리칸(PG)의 생합성에 미치는 K. 락티스에 의하여 발현되는 rhNC4(배치 PBA-1202P)의 농도 의존적 효과 막대 그래프를 나타낸 것이다. 이 데이타는 대조군을 100%로 잡은 경우에 대한 % 변화율로 나타내었다.
PPS 대신에 헤파린 (Sigma, Sydney, Australia)을 사용하여 유사한 실험이 행해졌다. 이 결과는 도 14에 나타내었다. 헤파린은 전구 세포의 연골형성을 억제하형, 분화를 조절한다.
6일간 펠렛 배양으로 성장시킨 전구 세포에 의한, DNA ( 3 H- 티미딘 결합) 생합성에 미치는, 나트륨 펜토산 폴리설페이트 ( PPS ) 단독 또는 rhNC4 과의 조합의 효과
RIKEN 세포 은행(Tsukuba, Japan)으로부터 입수한 뮤린 전구 세포 (세포주 C3H10T1/2 또는 ATDC5) 또는 인간 면역선택적 Stro-1+ 전구 세포(Mesoblast Ltd, Melbourne, Australia)를 3x105 세포 밀도로 2mL 스크류 캡(screw-capped) 원심분리관에 접종하고, DMEM-고 (+10% FBS)로 최종 부피가 1 ml가 되도록 하였다. 세포를, 스윙 아웃 원심분리기에서, 실온에서 10분간 500g으로 원심분리한 후, 5% CO2/95% 습윤공기 분위기하, 37℃에서, 24시간 동안 인큐베이션 하였다. 시간이 지남에 따라 펠렛이 형성되었는지 관찰하였다. 처음 2일간은 매일, 그 이후로는 2-3일마다 한번씩 매질을 교체하였다. 3일째 매질을 제거하고, DMEM 640 ㎕ (+10% FBS) 중 50mCi/ml 3H-티미딘 80 ㎕ 및 rhNC4 80 ㎕ (0, 1, 2.5, 5, 10, 25 μg g/ml)을 각 관에 첨가하였다 (도 23).
모든 분석은 3회 실시하였다. 3일(66 hrs) 후, HA ELISA를 위해 남겨둔 것을 제외하고, 상기 상청액 매질을 제거하였다. 100 ㎕ of 1mg/ml 콜라게나제 (DMEM 매질 중에 용해) 100 ㎕를 각 펠렛 관에 가하였다. 관을 3.5시간 동안 180-200 rpm 진탕기에서 37℃로 인큐베이션 하였다. 콜라게나제 소화물을 96-웰 플레이트로 옮겨, 각 관의 내용물이 4개의 웰로 나누어지도록 하였다. 각 웰에 200 ㎕의 dH2O를 가하고, 플레이트는 이후의 분석을 위해 -20℃에서 보관하였다. 콜라게나제 소화물을 해동하고, 세포 하베스터로 DNA를 수집하고, 필터 디스크는 섬광 튜브에 두었다. 섬광 칵테일 액체(3 mL)를 가하고 약 1분간 회전시켰다. 섬광 계수기를 이용하여 이들 시료에서 3H-DNA의 방사능을 측정하였다.
미세배양으로 성장시킨 전구 세포에 의한, 프로테오글리칸 ( 35 S- GAG 으로 측정)의 생합성에 미치는, 나트륨 펜토산 폴리설페이트 ( PPS ) 단독 또는 rhNC4 과의 조합의 효과
본 실험에서 사용된 기술은 문헌 (Denker AE, Haas AR, Nicoll SB and Tuan RS. Chondrogenic differentiation of murine C3H10T1/2 multipotential progenitor cells:I. Stimulation by bone morphogenetic protein-2 in high density microMass cultures. Differentiation (1999); 64: 67-76)에 기재된 것을 기초로 하였다. 간략히 말하면, 전구 세포 부유액 (햄의 F12 매질 내 1x107 cells/ml +10% FBS)의 인간 면역선택적 Stro-1+ 전구 세포(Mesoblast Ltd, Melbourne, Australia) 10 ㎕ 또는 RIKEN 세포 은행(Tsukuba, Japan)으로부터 입수한 뮤린 전구 세포 (세포주 C3H10T1/2 또는 ATDC5)를 24-웰 플레이트의 각 웰에 적용하였다. 2-3시간 동안 5% CO2/95% 습윤공기 분위기하, 37℃에서 인큐베이션한 후, 900 ㎕의 Ham F12 매질 (10% FBS) 및 동일 매질 내의 100 ㎕의 PPS 용액을 웰에 천천히 가하여, PPS의 최종 농도가 각각 단독으로 0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 20.0 ㎕/ml 또는 rhNC4과 조합하여 0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 25.0 ㎕/ml가 되도록 하였다. 각 약물 농도는 3회 반복 측정하였다. 세포는 10일까지 배양 상태로 유지하였다. 약물 존재/부재의 매질을 3일마다 교체하되, 실험이 종결되기 24시간 전에 50 μCi/ml35S-H2SO4 80 ㎕를 가하여, 최종 35SO4 농도가 5 μCi/ml이 되도록 하였다. 다음날, 하나의 플레이트 내의 세포를 2.5% 트립신 150 ㎕/웰로 트립신화하고, 10분간 800g로 원심분리하여 매질로부터 분리시키고, 500 ㎕의 1xPBS로 세척하고, RNA 및/또는 DNA 추출 및 분석을 위해 액체 질소에 저장하였다. 사용된 PPS의 각 농도에 대하여, 하나의 관에 배지 및 상청액을 합쳤다. 200 ㎕의 5x 파파인 용액 [파파인 완충액 (0.1 M NaAC, 5mM EDTA, pH6.0) 중 2.5 mg/ml 파파인, 7.9 mg/ml L-시스테인] 및 상기 용액을 2시간 동안 65℃에서 인큐베이션 하였다. 파파인 소화 후, 소화된 용액 200㎕를 4등분한 것을 96-웰 플레이트 (200 ㎕/웰)에 옮겼다. 20-30분간 300rpm RT에서 온화하게 교반하면서, 20㎕ 5% CPC 20㎕ 및 1mg/ml CSA 10㎕를 가하여, 소화 단계에서 유리된 35S-GAG를 프리 35SO4로부터 분리해내어, 35S-GAG-CPC 복합체를 침전시켰다. 침전물은 세포 하베스터를 이용하여 유리섬유 필터로 여과하여 수집하였다. 그 후 상기 필터를 대기 건조시키고, 디스크로 펀칭되어 섬광 바이알(scintillation vial)에 첨가되었다. 섬광 칵테일 액체를 가하고, 30-45초간 회전시켰다. 섬광 계수기를 이용하여 이들 시료에서 35S-SO4 결합된 35S-GAG-CPC 복합체의 방사능을 측정하였다.
II 형 콜라겐에 대한 전구 세포 미세배양의 면역화학적 염색
상기 기재된 바와 같이 다양한 농도의 펜토산 폴리설페이트의 존재/부재 하에 DMEM (+10%FBS) 1ml 내 최초 밀도 8x104 세포/μMass로, 24-웰 배양 플레이트에, 전구 세포의 미세배양물을 형성시켰다. 5일 및 10일째 배양물에, 배지를 제거하고, RT에서 20-30분간 히스토초이스(Histochoice) MB (Amresco, Solon, OH, USA)로 고정시켰다. 고정된 배양물을 PBS (매회 5분)에서 2회 세척하고, 20분간 RT에 둔 후, 5분간 PBS에서 세척하였다. 그리고 나서 플레이트를 인큐베이션하였다. 우선 온화한 PBS 스트림으로 세정고, PBS로 3회 (매회 5분) 세척한 다음, 웰을 P5 미닛(minute)으로 블록킹하였다. 온화한 PBS 스트림으로 세정하고, PBS로 3회 (매회 5분) 세척한 다음, 각 미세 배양물에 200㎕의 1x (BCIP/완충액 + NBT)을 가하고, 플레이트를 인큐베이션하되, 이때 흐르는 물로 세척함으로써 해당 구역에 보라색이 최초로 형성된 시점에 반응을 정지시켰다. 그 후 플레이트 및 웰은 디지털 카메라로 촬영하고, 퍼스털 컴퓨터에서 이미지 J® 소프트웨어(http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 사용하여 이미지를 분석하였다.
도 16은 6일 및 9일 동안, 미세배양 내의 뮤린 전구세포(C3H10T1-2)에 의한 프로테오글리칸 생합성에 미치는 PPS의 농도 의존적 효과를 보여주는 막대 그래프를 나타낸 것이다. PPS는 배지(햄의 F12+10%FCS)에 포함되어 있으며, 48시간마다 교체되었다. 배양 종료 24시간 전에 35S-SO4을 첨가하였다. 합성은 DNA 함량에 대해 표준화시켰다. (* P < 0.05, **P < 0.005, ***P < 0.0005).
이 세포주에서 1-20 μg/mL 농도 범위에 걸쳐, 새롭게 합성된 PG로의 35S의 섭취(uptake)가 유의성 있게 자극되는 것으로 관찰되었다 (도 16). 또한 미세배양에서 9일 후, PPS 농도가 1 μg/mL일 때 100% 자극이 얻어졌다 (도 16).
도 17은 5일 동안, 미세배양 내의 인간 전구세포에 의한 프로테오글리칸 합성에 미치는 PPS의 농도 의존적 효과를 보여주는 막대 그래프를 나타낸 것이다. 데이타는 35S-GAG 방사능으로 나타내었으며, 대조군의 백분율을 100%로 잡았다. 대조군에 대한 * P < 0.05. 0.5-10㎕/ml의 농도 범위에서 프로테오글리칸 합성이 증가된 것으로 나타났다.
PPS의 존재하에 인큐베이션하는 경우, 인간 전구 세포는 미세배양에서 연골세포로 분화되었다. 그러나 5일간 배양에서, PPS 농도가 2.5 μg/mL일 때 PG 합성의 최대 자극률은 30%인 것으로 나타났다 (도 17).
도 18은 B에 도시된 면역염색된 미세배양을 스캐닝 및 분석 측정한, 10일 동안, 미세배양 내의 인간 전구세포에 의한 II형 콜라겐의 생성에 미치는 펜토산 폴리설페이트(PPS)의 농도 의존적 자극의 보여주는 막대 그래프를 나타낸 것이다. 0.5-10㎕/ml의 농도 범위에서 II형 콜라겐 생성이 증가하였고, 5㎕/ml일 때 최상의 결과가 도출되었다.
프로테오글리칸 및 II형 콜라겐 모두의 합성이 증가되는 것에 의해 입증되는 바와 같이, 상기 실험 결과는 PPS가 전구 세포를 유도하여 연골세포로 분화시킨다는 점을 시사한다.
PPS 대신에, 히알루론산 (SuperArtz (SKK, Tokyo, Japan)) 및 덱스트란 폴리설페이트 (MW = 5000) (Sigma, Sydney, Australia)을 사용하여 유사한 실험을 행하였다. 그 결과는 5일 동안, 미세배양 내의 인간 전구세포에 의한 프로테오글리칸의 생합성에 미치는 (A) 히알루론산(HA)(SupartzTM) 및 (B) 덱스트란 폴리설페이트의 농도 의존적 효과를 보여주는 막대 그래프로서, 도 19에 나타내었다. 이 데이타는 35S-GAG 방사능으로 나타내었으며, 대조군의 백분율을 100% 또는 DPM/㎍ DNA로 잡았다. (대조군에 대한 * P < 0.05) HA는 프로테오글리칸의 합성을 증가시키나, 강하게 증가시키지는 않는 것으로 볼 수 있다. 이와는 대조적으로, 덱스트란 설페이트는, 프로테오글리칸 생성을 농도 의존적으로 감소시키는 것에 의해 입증되듯이, 전구 세포의 분화를 하향 조절하였다.
8일간 미세배양으로 성장시킨 전구 세포에 의한, DNA 생합성( 3 H- 티미딘 결합으로 측정)에 미치는, 나트륨 펜토산 폴리설페이트 ( PPS )의 농도 효과
전구 세포 (7x106세포/ml) 10 ㎕를 24-웰 배양 플레이트의 각 웰에 접종하였다. 5% CO2/95% 습윤 공기하 37℃에서 2-3 시간 배양 후, DMEM-고 매질 중에 용해된, 지시된 농도의 PPS 및 900 ㎕의 DMEM-고 매질 (+10% FBS)를 천천히 웰에 가하였다. 최종 PPS 농도는 각각 0, 0.1, 0.5, 1.0,2.5, 5.0, 10.0, 20.0 ㎕/ml였다. 모든 PPS 농도는 3회 측정된 것이다. 3일간 배양이 진행되도록 하였다. 4일째 24-웰 플레이트의 각 웰에 640 ㎕의 DMEM-고 (+10% FBS), 80 ㎕의 10xPPS 용액 및 80 ㎕의 10 μCi/ml 3H-티미딘 용액을 가하여, 최종 3H-티미딘 농도가 1 μCi/ml, 최종 PPS 농도가 지시된 대로 되도록 하였다. 그 후 배양물을 추가 22시간 동안 37℃, 5% CO2에서 인큐베이션 하고, 매질을 제거한 후, 1mg/ml 콜라게나제 용액 [콜라게나제 완충액: 66.7mM NaCl, 6.7mM KCl, 4.8mM CaCl2ㆍH2O, 10mM HEPES (pH7.4)] 200 ㎕를 각 웰에 가하였다. 플레이트는 2.5 시간 동안 37℃에서 인큐베이션하여, 세포를 유리시켰다. 30분마다 플레이트를 손으로 부드럽게 흔들어 주었다. 콜라게나제 소화 후, 세포 및 소화 용액을 5분간 500g로 원심분리 하였다. 상청액을 제거하였다. 세포를 200㎕의 TE 완충액으로 온화하게 혼합하고, 2회 동결-해동에 의해 용해시켰다. 용해 후, 혼합하면서 세포에 TE 완충액 200㎕를 더 가하였다. 세포 용해질(lysate)의 분취물을 4개의 반복단위(repeat)로(각 웰당 100㎕씩) 96-웰 플레이트에 가하였다. 세포 용해질 내 3H-DNA를 유리 섬유 필터 및 세포 하베스터를 이용하여 수집하였다. 그 후 필터를 공기 건조시키고, 펀칭되어 섬광 바이알(scintillation vial)에 첨가되었다. 섬광 칵테일 액체 3ml/vial를 가하고, 30-40초간 회전시켰다. 증식 세포의 DNA에 결합된 3H의 방사능을 섬광 계수기로 측정하였다.
그 결과는 도 5에서 확인할 수 있듯이, PPS와 조합한 전구 세포의 증식이 증가한 것으로 나타났다. 모든 농도의 PPS가 증식을 증가시켰으며, 농도가 1 및 2.5㎕/ml일 때 최상의 결과를 보였다.
3 H-글루코사민을 HA 에 결합시켜 측정한, 전구 세포에 의한 하이알루로난 (HA)의 생합성에 미치는, 나트륨 펜토산 폴리설페이트 ( PPS )의 농도 효과
전구 세포를 7x105 세포/웰의 밀도로 접종하는 것을 제외하고는, 전술한 방법과 동일한 방법으로, 24웰 플레이트에 인간 면역선택적 Stro-1+ 전구 세포 (Mesoblast Ltd, Melbourne, Australia)의 미세배양물을 형성시켰다. 24시간 후 배지를 바꾸고, 0.22 μm 필터로 멸균한, 0.0, 0.5, 1.0, 2.5 μg/mL 농도의 PPS (Bene-Arzneimittel, Munich, Germany)를 포함하는, 10% FCS 및 25 ㎕/ml 겐타마이신 함유 DMEM 배양 배지로 교체하였다. 배양물은 8일간 5% CO2/95% 습윤공기하 37℃에서 인큐베이션 시키고, 3일마다 지시된 농도의 PPS를 함유하는 배지로 교체하였다. 8일째 3H-글루코사민을, 각 웰당 1.0 μCi/ml 농도로 함유하는 용액이 되도록, 상기 지시된 농도의 PPS 함유 배지에 첨가하였다. 플레이트를 추가 24시간동안 인큐베이션 시켰다. 배양 종결일인 9일째에, 배지를 캡핑된 5 ml 관에 수집하고, 후술한 바와 같이 크기 배제 크로마토그래피를 실시하기 이전에 4℃에서 저장하였다.
겔 여과 크로마토그래피를 이용한, 배양 배지에서 3 H- 하이알루로난 ( 3 H- HA )의 분리 및 정량
각 배지 시료로부터의 0.5ml 분취물 2개를 A 및 B로 라벨링하였다. 1 M 아세트산 (pH 6.0) 20 ㎕을 모든 분취물(aliquot)에 가하였다. 반응 완충액 (20 mM Na- 아세테이트 및 0.15 M NaCl, pH 6.0) 50 ㎕를 분취물 A에 첨가하고, 반응 완충액 내 5 TRU 스트렙토마이세스 히알루로니다제(HYALASE) 50 ㎕를 분취물 B에 첨가하였다. 모든 시료를 3시간 동안 60℃에서 인큐베이션 시킨 후, 5분간 가열하여, 첨가된 히알루로니다제를 불활성화시켰다. 겔 여과에 앞서 시료를 -20 ℃에서 저장하였다.
Superdex-S200로 가포장된 겔 여과 컬럼을 사용하여, 배양 배지 중의 3H-HA 및 3H-PGs을 분리 및 동정하였다. 배지 시료는, 컬럼에 로딩하기 직전에, 10분간 벤치 원심분리기(bench Microfuge)에서 고속으로 일정하게 원심분리하였다. 시료(각 200 ㎕)를 시료 루프를 통해 컬럼에 주입하고, 컬럼은 0.2 ml/1 min의 유속에서 PBS 완충액 (0.15 M NaCl, 0.05 M Na2PO4, pH 7.2)으로 용출하였다. 컬럼 용출액은 총 186 분획에 대해 1.0 ml/fraction로 수집하고, 섬광 계수기를 사용하여 방사능을 측정하였다.
그 결과는 도 27에 나타낸다. PPS를 함유하지 않는 대조군 배양물에 대해, 스트렙토마이세스 히알루로니다제 (HYALASE)로 소화시키기 전과 후의 크로마토그래피 프로파일 하 면적을 분석하였더니, 14.3%의 3H-글루코사민이 HA에 결합하고, 85.7%가 PG 서브유닛에 결합한 것으로 나타났다. 도 27A의 프로파일로부터 명백한 바와 같이, HA가 소화되면서 자유롭게 된 PG 모노머보다 PG-HA 아그리캔 복합체의 분자 크기가 컸다. 시험된 PPS 농도가 0.1 μg/mL 및 1.0 μg/mL인 경우에만, 배양 배지에서 새롭게 합성된 3H-HA의 수준이 실질적으로 증가하였다. 소화 후, PG 모노머의 공극 용적(void volume) 분획에 존재하는 방사능 비율이 50.4%였는데, 이는 1 μg/mL의 PPS에 대해 49.6%가 HA에 결합하였고(도 27 C), 0.1 μg/mL의 PPS에 대해 35.5%가 HA에 결합하였음(프로파일 미도시)을 시사한다. PPS가 저농도인 경우 (도 27B), HA 분획에서 15.1%의 방사능이 확인된 반면, 2.5 μg/mL의 고농도인 경우, 단지 약 11%의 3H-글루코사민이 HA에 결합되었다. 이들 데이타는 PPS 농도가 1.0 μg/mL일 때, 미세배양에서 전구세포에 의한 HA의 최대 합성이 이루어진다는 것을 보여주지만, 미세 세포 외 매트릭스에 잔류하는 3H-HA 수준은 측정되지 않았다. 본 명세서에 기재된 병렬 연구는, PPS가 전구 세포의 연골형성 분화 및 연골 프로테오글리칸의 형성을 자극한다는 점을 보여주므로, 세포를 둘러싼 세포 외 매트릭스는 PG 아그리캔 복합체 성분의 형태로 새롭게 합성된 HA의 더욱 풍부한 공급원에 해당할 것이다. 그럼에도 불구하고 본 발명을 통하여, PPS가 배양된 전구 세포에 의한 HA의 생합성을 자극한다는 점이 최초로 입증되었다.
3 H-글루코사민을 HA 에 결합시켜 측정한, 전구 세포에 의한 하이알루로난 (HA)의 생합성에 미치는, rhNC4 (배치 PBA -1202p) 단독 또는 나트륨 펜토산 폴리설페이트 ( PPS )와의 조합에 따른 농도 효과
RIKEN 세포 은행(Tsukuba, Japan)으로부터 입수한 뮤린 전구 세포 (세포주 C3H10T1/2 또는 ATDC5) 또는 인간 면역선택적 Stro-1+ 전구 세포(Mesoblast Ltd, Melbourne, Australia)를 전술한 바와 같이 미세배양물로 형성하거나, 6-웰 배양 플레이트에 1.5 x 105 세포/웰의 농도로 접종하고, 화합물을 첨가하기 전에 24시간 동안 부착시킨다. 배양에 요구되는 농도의 2배로 10% FCS 및 50 ㎕/ml의 겐타마이신을 함유하는 DMEM 배지에서, 다양한 농도의 rhNC4 단독 및 PPS (Bene-Arzneimittel, Munich, Germany)와의 조합 제제를 제조하고, 0.22 μm 필터로 멸균한 후, 연속적으로 희석하여 각 실험에 필요한 최종 농도를 갖는 약물을 제조한다. 각 시험 용액의 분취물을 24-웰 배양 플레이트의 각 웰에 가한다. 3H-글루코사민 원액을 배지에서 희석시켜 1.0 μCi/ml 용액을 제조하고, 즉시 각 웰에 첨가한다. 플레이트를 추가 24 h 동안 인큐베이션시킨다. 배양 종결 시, 배지를 캡핑된 5 ml 관에 수집하고, 3H-HA 분석을 위해 -20℃에서 저장한다. 세포는 트립신화를 통해 유리시키고, 세척과 함께 원심분리한다. 배지에 대해, 트립신 이동성(mobilized) 방사성 표지된-HA 및 세척을 분석하고, 세포는, 후술한 바와 같이 유전자 발현 평가 및 RNA 추출을 위해 사용된다.
겔 여과 크로마토그래피를 이용한, 배양 배지에서 3 H- 하이알루로난 ( 3 H- HA )의 분리 및 정량
각 배지 시료로부터의 0.5ml 분취물 2개를 각각 A 및 B로 라벨링한다. 1 M 아세트산 (pH 6.0) 20 ㎕을 모든 분취물(aliquot)에 가한다. 반응 완충액 (20 mM Na- 아세테이트 및 0.15 M NaCl, pH 6.0) 50 ㎕를 분취물 A에 첨가하고, 반응 완충액 내 5 TRU 스트렙토마이세스 히알루로니다제 50 ㎕를 분취물 B에 첨가한다. 모든 시료를 3시간 동안 60℃에서 인큐베이션시킨 후, 5분간 가열하여, 첨가된 히알루로니다제를 불활성화시킨다. 겔 여과에 앞서 시료를 -20 ℃에서 저장한다.
Superose 6 또는 Superdex-S200로 가포장된 겔 여과 컬럼을 사용하여, 배양 배지 중의 3H-HA를 분리 및 동정한다. 배지 시료는, 컬럼에 로딩하기 직전에, 10분간 벤치 원심분리기(bench Microfuge)에서 고속으로 일정하게 원심분리한다. 시료(각 200 ㎕)를 시료 루프를 통해 컬럼에 주입하고, 컬럼은 0.2 ml/1 min의 유속에서 PBS 완충액 (0.15 M NaCl, 0.05 M Na2PO4, pH 7.2)으로 용출한다. 컬럼 용출액은 총 46 분획에 대해 0.5 ml/fraction로 수집하고, 섬광 계수기를 사용하여 방사능을 측정한다.
이 실험은, HA 합성의 농도 의존적인 자극이, PPS 단독으로 1-5 μg/mL 및 rhNC4 5-25 μg/mL의 농도 범위에서 최적의 효과를 나타낸다는 것을 보여줄 것이다. 2 μg/mL의 PPS를 5-25 μg/mL의 rhNC4와 조합하면 상승 효과를 나타낼 것이다.
ELISA 를 이용한, 전구 세포에 의한 하이알루로난 ( HA )의 합성에 미치는, rhNC4 (배치 PBA -1202p) 단독 및 나트륨 펜토산 폴리설페이트 ( PPS )와의 조합의 농도 효과
RIKEN 세포 은행(Tsukuba, Japan)으로부터 입수한 뮤린 전구 세포 (세포주 C3H10T1/2 또는 ATDC5) 또는 인간 면역선택적 Stro-1+ 전구 세포(Mesoblast Ltd, Melbourne, Australia)를 24 웰 배양 플레이트에 2 x 105 세포/웰 농돌 접종하고, 10% FBS (Sigma)가 보충된 DMEM/햄의 F-12 매질 (Invitrogen)에 유지시키고, 세포가 80% 합류(confluence)에 도달할 때까지 5% CO2/95% 습윤공기 분위기하, 37℃에서 인큐베이션시킨다. 그 후, 다양한 농도의 rhNC4 단독 및 펜토산 폴리설페이트와의 조합 제제 (Bene-Arzneimittel, Munich, Germany)를 함유하는 DMEM/Ham의 F-12로 배지를 교체하고, 배양물은 추가 24시간 동안 5% CO2, 37℃에서 유지한다. 각 웰의 배지는 세포로부터 분리해내고, 2.0ml 마이크로관으로 옮긴다. 웰에 잔류하는 단층 세포를 트립신화에 의해 떼어낸 후, 5분간 350g으로 원심분리하여 상청액으로부터 분리해낸다. 상청액을 수집하고, 매질과 조합한다. 전술한 바와 같이 HA-ELISA를 이용하여, 조합된 매질 및 상청액 혼합물(200㎕)에서 하이알루로난 농도를 분석한다. 세포 트립신화로부터 얻은 상청액을 끓여, 효소를 변성 및 불활성화시키고, ELISA를 이용하여 HA 농도를 분석한다. 이들 분획의 HA는, 세포 외 매트릭스 (ECM)의 HA 농도를 대표하는 것으로 간주된다.
이 실험의 결과는 도 27에서 확인할 수 있다. ELISA에 의해, (1-5 μg/ml을 포함하는) 저농도의 폴리설페이트화 폴리사카라이드 존재 하에, 전구 세포에 의한 HA 생성률이 입증될 것이다.
시험관내 무기질화 분석을 이용한, 골형성 배지에서 인간 전구 세포의 분화에 미치는 나트륨 펜토산 폴리설페이트 ( PPS )의 효과
인간 전구 세포를 유도하여, 시험관내 무기질화 골 매트릭스를 발달시키는데 필요한 조건은 이미 공지되어 있다 (Gronthos S, AC Zannettino, SJ Hay, S Shi, SE Graves, A Kortesidis and PJ Simmons. (2003). Molecular and cellular characterisation of highly purified stromal stem cells derived from human bone marrow. J Cell Sci 116:1827-1835). 골유도(osteoinductive) 배지는 2% (v/v) FCS, 1.8mM KH2PO4, 10-7 덱사메타손 인산염 나트륨, 50IU/ml 페니실린, 50μg/mL 스트렙토마이신, 1mM 나트륨 피루베이트, 100㎕ L-아스코르브산 2-포스페이트, 2mM L-글루타민 및 10mM HEPES 완충액이 보충된 알파-MEM 배지로 구성된다.
인간 전구 세포를 웰당 8 x 103 세포 비율로 96-웰 플레이트에 접종하고, 지정된 농도의 PPS (0.0, 1.0, 5.0,10 μg/mL) 함유 골유도 배지를 첨가하기 전에, ≥ 90% 합류에 도달하도록 하였다. 지정된 시간 동안 5% CO2의 존재하에 37℃에서 세포를 배양하였다. 4주 기간 동안 매주 2회, 신선한 화합물을 함유하는 골유도 배양 배지로 교체하였다.
이 실험의 결과는 도 7A에서 확인할 수 있다. 특히 1 및 10 μg PPS/mL 농도에서, PPS의 존재가 골세포로의 분화를 억제하였다.
시험관내 무기질화 분석을 이용한, 골형성 배지에서 인간 전구 세포의 분화에 미치는 나트륨 펜토산 폴리설페이트 ( PPS )의 효과 - 시험관내 무기질 농도의 분석
각 웰에서 총 DNA당 칼슘 수준을 측정함으로써, 상기 배양물에서 웰당 무기질의 총농도를 평가하였다. 세포 배양물은 Ca+ 및 Mg+이 없는 PBS로 3회 세척하고, 0.6M 염산 (웰당 100㎕) 중에 가용화 되도록 밤새 두었다. 산-가용화 무기질 23을 새로운 96-웰 플레이트에 옮기고, o-크레졸-프탈레인-컴플렉손(complexone) (Thermal Electron Corporation, USA)과 반응시켜, EL 808 울트라 마이크로플레이트 리더로 570nm에서 측정되는, 보라색 염료를 형성하였다. 보라색 염료의 강도는 각 웰의 칼슘 농도에 직접 비례한다. 제조자의 권고에 따라, 칼슘 표준 곡선으로부터 절대 칼슘 농도를 외삽법에 의해 추정하였다. 이후, 산-가용화 배양물을 Ca+ 및 Mg+이 없는 PBS로 3회 세척하고, 2시간 동안 37℃에서 100μg/mL 단백분해효소 K의 용액 100㎕에서 인큐베이션시켰다. 소화된 시료는 격렬하게 피펫으로 재고, 각 웰에서 50㎕씩을, DNA 분석 완충액 (2M NaCl 및 50mM 인산염 나트륨) 중의 희석된 훽스트(Hoechst) 33258 (2μg/mL) 150㎕를 함유하는, 비형광성 분석 플레이트의 웰에 이동시켰다. LS55 형광분광광도계 (Perkin Elmer)를 사용하여 350nm에서 일련의 표준 DNA에 대해 절대 흡광도를 측정하였다.
이 실험 결과는 도 7B에 나타내었다. PPS 배양물 모두가 배지와 동일한 것으로 보인다는 것은, 석회화 퇴적물(calcified deposite)이 존재하지 않음을 의미한다. 정상적인 광물질화 퇴적물은 알라자린 레드(Alizarin Red) 시약에 양성 염색되며, 4주 이내에 골 유도 상태에서 전구 세포의 배양물을 형성한다.
시험관내 지방성 분석을 이용하여, 지방성 배지에서 인간 전구 세포의 분화에 미치는 나트륨 펜토산 폴리설페이트 ( PPS )의 효과
시험관내에서 인간 골수 간질 세포로부터 지질을 생성하는데 필요한 조건은 공지되어 있다 (Gimble J. Marrow stromal adip℃ytes. In: Marrow stromal cell culture. JN Beresford, Owen, M.E., ed. Cambridge University Press, Cambridge, pp 67-87 (1998)). 간략히 말하면, 인간 전구 세포를, 완전한 알파-MEM 성장 배지 내 웰당 8 x 103 세포의 밀도로, 96-웰 플레이트에 접종하고, 유도 배지를 첨가하기 전에, ≥ 90% 합류에 도달하도록 하였다. 세포를 적정 PPS (0.0, 1.0, 5.0,10 μg/mL)의 존재 하에, 0.5mM 3-이소부틸-1-메틸-크산틴(IBMX), 60μM 인도메타신 및 0.5μM 하이드로코르티손이 보충된 완전한 알파-MEM을 포함하는, 지방성 유도 배지에서 배양하였다. 유도 배지는 4주의 기간 동안 매주 2회 교체하였다. 오일 레드 'O'를 사용하여, 지질이 존재할 경우, 세포가 염색되었다.
지질의 오일 레드 'O' 염색
상기 기재된 바와 같이 세포를 배양하고, 1 X PBS (pH7.4)에 부드럽게 세정하여 세포 단층의 붕괴를 회피하였다. 세포는 15분간 RT에서 인산 완충 포르말린에 고정시켰다. 그 후에 고정액을 제거하고, RT에서 2시간 동안 새롭게 여과된 오일 레드 O (3mg/mL; MP Biomedicals, Australia) 100㎕를 가하여, 지질을 염색시켰다. 세포는 RO 물로 3회 세정하고, 메이어의 헤마톡실린(Lillie의 변형)으로 대조 염색하였다. 헤마토실린 염색을 흡인하고, 물로 교체한 후, 오일 레드 O 양성 지방세포를 광현미경 하에서 시험하고, DP20-56 올림푸스 카메라 (Olympus, Japan)로 촬영하였다.
이 결과는 도 8A 및 B에 나타낸다. PPS는 전구 세포의 지방세포로의 분화를 모든 농도에서 상향 조절하는 것으로 나타났다.
콜라겐 스폰지에서 성장시킨 전구 세포에 의한, 프로테오글리칸 ( 35 S- GAG 로 측정)의 생합성에 미치는 나트륨 펜토산 폴리설페이트 ( PPS )의 효과
10% FBS (Sigma)가 보충된 1:1 고 글루코스 DMEM/Ham의 F-12 매질 (Invitrogen) 100 ㎕ 중 평균 100,000개의 세포를 포함하는 부유액으로서 제조된, 인간 면역선택적 Stro-1+ 전구 세포 (Mesoblast Ltd, Melbourne, Australia)를, 마이크로피펫을 사용하여, 24 웰 배양 플레이트의 웰에 위치한, 제조 콜라겐 스폰지 블록의 중심 부분에 주입한다. 콜라겐 스폰지는, 0.5 cm3 큐브로 미리 잘라낸, 멸균 젤폼(Gelfoam) (Pharmacia & Upjohn Co., Kalamazoo, MI)이다. 각 웰에 2 mL의 배지 + FBS를 가하고, 플레이트를 48시간 동안 37℃, 5% CO2/95% 공기에서 인큐베이션시켰다. 그 후 추가 48시간 동안 배지를, 다양한 농도의 PPS (0, 0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0, 25.0 ㎕/ml) 함유 10% FBS (Sigma)로 보충된, 1:1 고 글루코스 DMEM/Ham의 F-12 매질 (Invitrogen)로 교체한다. 모든 농도의 PPS는 3회 배양된다. 그 후, 매질은, 지정된 농도의 PPS 및 5μCi/ml의 35S-H2SO4 (Perkin Elmer, USA)를 포함하는, 정의된 매질로 교체한다. 48시간 인큐베이션 후 실험을 종결하며, 이때 전술한 바와 같이 스폰지의 콜라게나제 소화 후, (35S-GAGs)가 배지로 유리되기 때문에, PG 생합성은 35SO4를 PG에 결합시켜 측정함으로써, 결정된다.
이 실험은, 전술한 시험관내 실험에서와 유사한 농도에서, 스폰지 내 연골 형성이 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 존재로 향상되었음을 증명해줄 것이다. 이 실험은, 전구 세포의 0.5-1.0 밀리온 함량은 적절한 세포수이며, 폴리설페이트화 폴리사카라이드 농도가 1-10 μg/ml일 때 유리한 효과를 제공한다는 사실을 확인시켜줄 것이다.
전구 세포 및 펜토산 폴리설페이트 ( PPS )의 제형을 사용한, 디스크 재생 및 연골 복구의 동물 모델에서의 신생( de novo ) 연골 형성에 대한 평가
동물 프로토콜
무작위적으로 6마리씩 2군으로 분류될, 12마리의 메리노/레스터종 성숙 암양의 경부 C3/4 및 C4/5 척수 수준에서, 2 단계의 척수 수술을 행한다. 이 과정에서, 추간반은 상기 척수 수준으로부터 외과적으로 제거될 필요가 있고, 전구 세포 함유 콜라겐 스폰지 지지체에 의해 채워진 생분해성 임플란트는, 디스크에 의해 점유된 척추체(vertebral body) 사이로 이식될 필요가 있다. 스폰지에 주입된 상이한 세포는 제쳐 두고라도, 본 시험의 고안에서 유일하게 다른 변수는, 임플란트의 삽입 이전에 연골 및 플레이트 (CEP)에 기계적으로 구멍이 생기는지 여부이다. 시험기간은, 임플란트 시점에서부터 희생시킬 때까지 12주간이다.
A군 (N = 6)
멸균 겔폼 젤라틴 스폰지 (Pharmacia & Upjohn Co., Kalamazoo , MI, USA)를 기성 템플릿을 이용하여 크기에 맞추어 절단한 후, 마이크로피펫으로 100 ㎕의 프로프리즈® 용액을 주입한다. 그리고 나서, 정해진 수준에서 외과적으로 적출된 경부 디스크 공간 내에 고정될, 특이적으로 수식된 생분해성 케이지에 로딩된 스폰지가 삽입된다. 상기 케이지는 상업적 척추판(vertebral plate)에 의해, 그 자리에서 얻어질 것이다.
B군 (N = 6)
멸균 겔폼 젤라틴 콜라겐 스폰지를 기성 템플릿을 이용하여 크기에 맞추어 절단하고, 전구 세포 (1 밀리온 양 전구 세포) + 10 μg의 PPS 함유 프로프리즈® 용액 100 ㎕를 로딩한다. 그 후, 정해진 수준에서 외과적으로 적출된 경부 디스크 공간 내에 고정될, 생분해성 케이지에 상기 로딩된 스폰지가 삽입된다. 상기 케이지는 상업적 척추판(vertebral plate)에 의해, 그 자리에서 얻어질 것이다.
실험 결과의 평가
기준선, 수술, 시험체의 이식 후 1, 2 및 3개월의 시점에서, 유도 마취하 모든 경추에 대한 측면 방사선 사진(Lateral radiograph)을 촬영하고, 표 5에 나타난 바와 같은 점수 시스템을 이용하여 골형성에 대한 점수를 매긴다.
점수 설명
0 골성 융합(bony fusion)이 없음
1 두개-미측 방향(cranio-caudal direction)으로 최대 추간 간격이 5 mm를 초과함
2 두개-미측 방향(cranio-caudal direction)으로 최대 추간 간격이 5 mm 미만임
3 완전한 골성 융합. 두개-미측 방향으로 최대 추간 간격은 룰러를 사용하여, 측면 방사선 사진에서 직접 측정될 것임
하기 표 6에 나타난 계획표를 이용하여, 만성적으로 준비된 양을 케어하기 위한 동물 윤리 지침에 따라, 본 실험 내내 동물을 모니터한다.
수술 후 동물의 관찰
관찰 빈도/일 기간
체중 x1 시험 시작
행동, 자세 및 활동 x1 시험 기간
통증 및 불안 x1 시험 기간
국소 자극/감염에 대한 실험 영역의 관찰 x1 수술 후 최소 3일
활동 감소/운동 무능력 x1 시험 기간
음식/물의 1일 소비의 평가 x1 시험 기간
조직학적 분석
동물을 희생시킨 후, 기계톱을 이용하여 온전한 경추를 동물로부터 절개하고, 잔여 척추로부터 C3/4 및 C4/5 운동 분절을 절단해낸다. 이후, 상기 2개의 분절을 종단면에서 2개 절편으로 절단하고, 10% 노말 버퍼 포르말린에 저장한다. 상기 절편은 한면에 3 mm의 상 및 하 척추체(superior and inferior vertebral bodies)를 가지는 케이지를 포함한다. 그 후, 절편은 포름산을 사용하여 석회질을 제거하고, 교반하에 에탄올 농도를 상승시키면서 탈수시킨다. 크실렌으로 크리어링 후, 조직을 파라핀에 포매하고, 절단 및 H&E, 알시안 블루(Alcian Blue), 톨루딘 블루(Toludine Blue), 마손 트리크롬(Massons Trichrome)으로 염색한다. 톨루딘 블루로 염색된 절편은, 퍼스털 컴퓨터에서 이미지 J® 소프트웨어(http://rsb.info.nih.gov/ij/)를 사용하여 매트릭스 크기(dimension) 및 프로테오글리칸 분포의 광학 밀도를 결정하는, 정량적 이미지 분석을 이용하여 조직형태계측학적 분석(histomorphometric analysis)용으로 사용된다.
비염색 파라핀 절편은, 매트릭스 성분의 면역조직화학적 분석을 목적으로 사용된다. 이들 절편들은, 37℃에서 1시간 동안 20 mM 트리스-아세테이트 완충액 (pH 8.0) 내 콘드로이티나제 ABC (0.25 U/ml) 및 37℃에서 1시간 동안 포스페이트 완충액 (pH 5.0) 내 소 고환 히알루로니다제 (1000 U/ml)의 조합으로, 전소화시킨(pre-digested) 후, 6분간 실온에서 20 mM Tris-HCl pH 7.2 0.5M NaCl (TBS) 또는 단백분해효소-K (DAKO S3020)로 3회 세척하여, 항원성 에피토프를 노출시킨다. 그 후, 조직을 20% 정상 돼지 혈청으로 1시간 동안 블록킹하고, 다수의 일차 항체로 크고 작은 프로테오글리칸 및 콜라겐을 탐색한다 (표 7). 음성 대조군 절편은, 일차 항체를 결실시키거나, 아이소타입이 일치하는(isotype matched) 관련 없는 일차 항체를 관심 있는 진정한 일차 항체로 치환하여, 가공될 것이다. 이 단계에서 상용제품인(DAKO) 아이소타입이 일치하는 마우스 IgG (DAKO Code X931) 또는 IgM (DAKO Code X942) (적절한) 대조군 항체가 사용될 것이다. DAKO 제품 X931 및 X942는, 포유동물 조직에 유도성이 아니고 존재하지도 않는 효소인, 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger ) 글루코스 옥시다아제에 대한, 마우스 단일클론 IgG1 (클론 DAK-GO1) 및 단일클론 IgM (클론 DAK-GO8) 항체일 수 있다. TBS 내의 0.05% 3, 3'-디아미노벤지덴 디하이드로클로라이드 및 0.03% H2O2, 노바 레드(Nova RED), 니트로블루 테트라졸리움/5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트/아이오도니트로테트라졸리움 바이올렛 (NBT/BCIP/INT) 또는 뉴 푹신(New Fuchsin)을 기재로 사용하여 검출하는데, 이차 항체에 결합된, 허스래디시(Horseradish) 퍼옥시다아제 또는 알칼린 포스페이타아제가 사용될 것이다. 염색된 슬라이드는 명시야 현미경(bright field microscopy)으로 관찰하고, 레이카 MPS 60 광학현미경 디지털 카메라 시스템으로 촬영할 것이다.
프로테오글리칸 및 콜라겐 코어 단백질 에피토프에 대한 일차 항체
일차 항체 에피토프 클론 (아이소타입) 참조 문헌
대형 프로테오글리칸
아그리캔 AD 11-2A9 (IgG) a
베르시칸(Versican) 12C5 (IgG) b
콜라겐
I형 I8H5 ( IgG 1 ) b,c
II 형 II -4 CII ( IgG 1 ) b,c
IV 형 CIV -22 ( IgG 1 ) b,c
VI 형 토끼 다클론 항체 b,c
IX 형 마우스 단클론 항체 D1 -9 ( IgG 1 ), B3-1 ( IgG 2b ) d
(a) Melrose, J., Little, C.B. & Ghosh, P. Detection of aggregaable proteoglycan populations by affinity blotting using biotinylated hyaluronan. Anal Bi ℃ hem 256, 149-157 (1998). Melrose, J., Smith, S. & Ghosh, P. Differential expression of proteoglycan epitopes by ovine intervertebral disc cells. J Anat 197 ( Pt 2), 189-198 (2000).
(b) Melrose, J., Smith, S., Ghosh, P. & Taylor, T.K. Differential expression of proteoglycan epitopes and growth characteristics of intervertebral disc cells grown in alginate bead culture. Cells Tissues Organs 168, 137-146 (2001).
(c). Shen, B., Melrose, J., Ghosh, P. & Taylor, F. Induction of matrix metalloproteinase-2 and -3 activity in ovine nucleus pulposus cells grown in three-dimensional agarose gel culture by interleukin-1beta: a potential pathway of disc degeneration. Eur Spine J 12, 66-75 (2003).
(d) Ye, X.J., Terato, K., Nakatani, H., Cremer, M.A. & Yoo, T.J. Monoclonal antibodies against bovine type IX collage (LMW fragment): production, characterization, and use for immunohist℃hemical l℃alization studies. J Histochem Cytochem 39, 265-271 (1991).
통계
지시된 바와 같이, 서열쌍 비교(pair wise comparison)를 위해 스튜던트 t검정을 이용할 것이다. P가 .05 미만인 경우 통계적인 유의성을 부여한다. 다중 비교를 위해 일원 분산 분석(One-way analysis of variance: ANOVA)이 사용될 것이다. P가 .05 미만인 경우 피셔가 고안한 LSD(least significance difference) 시험을 이용하여 그룹 간의 통계적인 유의성을 결정할 것이다.
이 실험은 폴리설페이트화 폴리사카라이드 및 전구 세포의 사용이, 디스크 공간에서 대조군에 비하여, 연골을 더욱 많이 (더욱 풍부하게) 생성할 것이라는 점을 입증해줄 것이다.
또한, 전구 세포 및 PPS 함유 콜라겐 스폰지와 접촉하는, 연골판 천공(punctured cartilaginous end plate)이 있는 절개된 디스크 공간에서, 기계적으로 생성된 연골의 결점을 완전히 보완함에 따라, 내인성 혈액 기원(endogenous blood bourne) 전구 세포의 침투가 개선된 것으로 관찰되었다.
본 명세서에 광범위하게 기재되어 있는, 본 발명의 정신 또는 범위를 벗어나지 않는 특정 구현예로 나타난 바와 같이, 본 발명이 다양하게 변형 및/또는 수식될 수 있는 것으로 당업자에 의해 이해될 것이다. 그러나 본 발명의 구현예는 모든 점에서 예시적으로 기재된 것일 뿐, 제한적인 것으로 이해되지는 않는다.

Claims (22)

  1. 폴리설페이트화 폴리사카라이드(polysulfated polysaccharide) 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편과 함께, 전구 세포를 포함하는 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    담체 매질을 추가로 포함하는 조성물.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 담체 매질이 배양 배지, 동결보존 매질 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체인 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전구 세포가 연골전구 세포(chondroprogenitor cell)인 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 전구 세포가 스트로(Stro)-1bri 세포, 및/또는 스트로-1bri 자손 세포인 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 펜토산 폴리설페이트 콘드로이틴 폴리설페이트, 키토산 폴리설페이트, 덱스트란 폴리설페이트 및 헤파린 (고 및 저분자량), 및 그들의 약제학적으로 허용되는 염으로부터 선택되는, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리설페이트화 폴리사카라이드는 펜토산 폴리설페이트, 펜토산 폴리설페이트의 나트륨 염(NaPPS), 펜토산 폴리설페이트의 마그네슘 염(MgPPS), 및/또는 펜토산 폴리설페이트의 칼슘 염(CaPPS)으로부터 선택되는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 약 1000 내지 약 1x1010 세포; 약 1x105 내지 약 1x109 세포; 약 100,000 내지 약 5x108 세포; 약 500,000 내지 약 2x108 세포, 약 1x106 내지 약 2x108 세포; 약 1x106 내지 약 1x108 세포; 약 1x106, 2x106, 3x106, 4x106, 5x106, 6x106, 7x106, 8x106, 9x106, 1x107, 2x107, 3x107, 4x107, 5x107, 6x107, 7x107, 8x107, 9x107, 1x108, 2x108, 3x108, 4x108, 5x108, 6x108, 7x108, 8x108, 또는 약 9x108 세포를 포함하는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 약 500ng/ml/밀리온 세포 - 10mg/ml/밀리온 세포, 500ng/ml/밀리온 세포 - 2000μg/ml/밀리온 세포, 1μg/ml/밀리온 세포 - 1000μg/ml/밀리온 세포, 또는 1μg/ml/밀리온 세포 - 500μg/ml/밀리온 세포, 500ng - 10μg/ml/밀리온 세포, 1μg - 10μg/ml/밀리온 세포, 1μg - 8μg/ml/밀리온 세포, 1μg - 6μg/ml/밀리온 세포, 1μg - 5μg/ml/밀리온 세포, 1μg - 3μg/ml/밀리온 세포, 2μg - 6μg/ml/밀리온 세포, 2.5μg - 5μg/ml/밀리온 세포, 또는 3μg - 5μg/ml/밀리온 세포, 1μg - 100μg/ml/밀리온 세포, 1μg - 50μg/ml/밀리온 세포, 1μg - 20μg/ml/밀리온 세포, 1μg - 15μg/ml/밀리온 세포, 10μg - 100μg/ml/밀리온 세포, 20μg - 100μg/ml/밀리온 세포, 또는 50μg - 100μg/ml/밀리온 세포, 1μg - 1000μg/ml/밀리온 세포, 100μg - 800μg/ml/밀리온 세포, 100μg - 600μg/ml/밀리온 세포, 100μg - 500μg/ml/밀리온 세포, 200μg - 500μg/ml/밀리온 세포, 500ng, 1μg, 2μg, 2.5μg, 5μg, 10μg, 15μg, 20μg, 30μg, 40μg, 50μg, 60μg, 70μg, 80μg, 90μg, 100μg, 150μg, 200μg, 250μg, 300μg, 350μg, 400μg, 450μg, 500μg, 550μg, 600μg, 650μg, 700μg, 750μg, 800μg, 850μg, 900μg, 950μg, 1000μg, 1050μg, 1100μg, 1150μg, 1200μg, 1250μg, 1300μg, 1350μg, 1400μg, 1450μg, 1500μg, 1550μg, 1600μg, 1650μg, 1700μg, 1750μg, 1800μg, 1850μg, 1900μg, 1950μg, 또는 2000μg/ml/밀리온 세포의 농도로 포함하는, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    약 1x106 내지 약 1x108의 전구 세포 및 25 내지 50mg의 폴리설페이트화 폴리사카라이드; 1x108의 전구 세포 및 25 내지 50 mg/ml의 폴리설페이트화 폴리사카라이드를 포함하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 하기 성분들을 추가로 포함하는 조성물:
    - 유기 및/또는 무기염;
    - 완충액;
    - BSA 또는 트랜스페린(transferin)과 같은 단백질;
    - 인슐린 유사 성장 인자, 인슐린, 섬유아세포 유사 성장 인자를 포함하는 성장 인자 및 사이토카인; BMP-TGF-베타 슈퍼 패밀리 (예컨대, BMP-2, BMP-7, BMP-8, TGF 베타) 및 섬유아세포 성장 인자 패밀리, IGF, FGF, EGF, PDGF, VEGF;
    - FBS, 신생 송아지, 기타 모든 포유류종을 포함하는 동물 혈청;
    - 프로프리즈(Profreeze)® 및 크리오스토(CryoStor)®와 같은 동결보존제;
    - 디메틸 설폭사이드(DMSO), 글리세롤, 트레할로오스, 수크로오스 및 기타 당 또는 디메틸아세트아미드와 같은 동결보존제;
    - 탄수화물;
    - 비타민/보조 인자;
    - 호르몬;
    - 항생제;
    - 접착 인자;
    - 아미노산;
    - 덱스트란과 같은 혈장 확장제;
    - 인간 및 기타 포유류 모두의 혈장;
    - 혈장 대체제;
    - 천연 또는 가교된 하이알루로난 및/또는 하이알루론산.
  12. 제11항에 있어서,
    DMSO가 1-20%, 1-15%, 5-15%, 1-10%, 5%, 7.5%, 10%, 15% 또는 20%의 범위로 존재하고/존재하거나 FBS가 1-50%, 1-20%, 1-10%, 5%, 7.5%, 10%, 15% 또는 20%의 범위로 존재하는, 조성물.
  13. 제2항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 담체 매질은 프로프리즈(Profreeze)®를 포함하는, 조성물.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물이 NC4 또는 그의 생물학적으로 활성인 단편을 추가로 포함하는, 조성물.
  15. 전구 세포를 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편에 노출시키는 것을 포함하는, 전구세포의 동결보존을 향상시키는 방법.
  16. 동결보존제로서 폴리설페이트화 폴리사카라이드의 용도.
  17. 전구세포의 동결보존을 향상시키기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  18. 전구 세포에 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편을 노출시키는 것을 포함하는, 전구 세포의 증식을 조절하는 방법.
  19. 전구 세포의 증식을 조절하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  20. 전구 세포의 분화를 조절하는 방법으로서,
    전구 세포에 폴리설페이트화 폴리사카라이드 또는 그의 생물학적 활성 분자 단편을 노출시키는 것을 포함하고,
    상기 분화는 연골세포(chondrocyte)로의 분화, 골아세포(osteoblast)로의 분화 또는 지방세포(adipocyte)로의 분화를 포함하는, 방법.
  21. 연골세포(chondrocyte)로의 분화, 골아세포(osteoblast)로의 분화 또는 지방세포(adipocyte)로의 분화를 포함하는, 전구 세포의 분화를 조절하기 위한, 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항의 조성물의 용도.
  22. 후술하는 도면과 관련하여, 상기에서 실질적으로 정의된 조성물, 방법 또는 용도.
KR1020107014920A 2007-12-04 2008-12-04 전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절 KR20100097726A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
AU2007906607 2007-12-04
AU2007906607A AU2007906607A0 (en) 2007-12-04 Compounds that regulate chondrogenesis and enhance the production of hyaluronan (HA)

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167008165A Division KR101718375B1 (ko) 2007-12-04 2008-12-04 전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20100097726A true KR20100097726A (ko) 2010-09-03

Family

ID=40717200

Family Applications (5)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187003527A KR101923152B1 (ko) 2007-12-04 2008-12-04 전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절
KR1020187033879A KR101995016B1 (ko) 2007-12-04 2008-12-04 전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절
KR1020107014920A KR20100097726A (ko) 2007-12-04 2008-12-04 전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절
KR1020167008165A KR101718375B1 (ko) 2007-12-04 2008-12-04 전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절
KR1020177006972A KR101828421B1 (ko) 2007-12-04 2008-12-04 전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187003527A KR101923152B1 (ko) 2007-12-04 2008-12-04 전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절
KR1020187033879A KR101995016B1 (ko) 2007-12-04 2008-12-04 전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167008165A KR101718375B1 (ko) 2007-12-04 2008-12-04 전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절
KR1020177006972A KR101828421B1 (ko) 2007-12-04 2008-12-04 전구 세포의 보호 및 그의 분화 조절

Country Status (8)

Country Link
US (3) US20110014701A1 (ko)
EP (1) EP2229436B1 (ko)
JP (1) JP5542686B2 (ko)
KR (5) KR101923152B1 (ko)
CN (2) CN103725646B (ko)
AU (1) AU2008331434B2 (ko)
ES (1) ES2647944T3 (ko)
WO (1) WO2009070842A1 (ko)

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ES2692879T3 (es) * 2008-06-25 2018-12-05 Mesoblast, Inc. Reparación y/o reconstitución de discos invertebrales
MX2011012183A (es) * 2009-05-20 2012-03-06 Cardio3 Biosciences Sa Composicion farmaceutica para el tratamiento de enfermedades cardiacas.
JP2011041472A (ja) * 2009-08-19 2011-03-03 Tokai Univ 細胞混合物からなる細胞移植治療用スフェロイド及びその作製方法
US9597379B1 (en) 2010-02-09 2017-03-21 David Gordon Bermudes Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies
US8771669B1 (en) 2010-02-09 2014-07-08 David Gordon Bermudes Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria
US8524220B1 (en) 2010-02-09 2013-09-03 David Gordon Bermudes Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria
WO2011098367A2 (en) * 2010-02-12 2011-08-18 Universität Zürich Method for in-vitro production of tissue engineered auto- and allografts suitable for guarded cryopreservation
US10130736B1 (en) 2010-05-14 2018-11-20 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US9352003B1 (en) 2010-05-14 2016-05-31 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
US8883210B1 (en) 2010-05-14 2014-11-11 Musculoskeletal Transplant Foundation Tissue-derived tissuegenic implants, and methods of fabricating and using same
JP6026717B2 (ja) * 2010-08-02 2016-11-16 クラシエホームプロダクツ株式会社 ヒアルロン酸産生促進剤
WO2012051505A1 (en) * 2010-10-14 2012-04-19 Fibrocell Science, Inc. Treatment of vocal cords with autologous dermal fibroblast formulation
JP5937612B2 (ja) * 2010-12-02 2016-06-22 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニーＢｅｃｔｏｎ， Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 血液安定剤を含む採血用デバイス
US10426983B2 (en) * 2010-12-23 2019-10-01 Michael L. Hennegan Fire sprinkler system having combined detection and distribution piping
TWI520740B (zh) * 2011-02-02 2016-02-11 模範健康科技私人企業有限公司 利用多硫酸化多醣之骨髓水腫（水腫）的治療
EP2686435B1 (en) * 2011-03-18 2016-06-15 INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) Chondrogenic differentiation media and methods for inducing chondrogenic differentiation of cells
US9382510B2 (en) * 2011-08-25 2016-07-05 Jian Chen Methods and devices for electroporation
ES2623166T3 (es) * 2012-01-17 2017-07-10 Inserm - Institut National De La Santé Et De La Recherche Médicale Crioconservación de células, tejidos y órganos
US9861663B2 (en) * 2012-02-23 2018-01-09 Technion Research & Development Foundation Ltd. Ex-vivo vascularized implant composition comprising poly-l-lactic acid, polylactic-co-glycolic-acid and olfactory bulb cells
SG11201406115VA (en) 2012-03-30 2014-11-27 Ajinomoto Kk Culture medium for proliferating stem cell, which contains sulfated compound
WO2013184978A2 (en) * 2012-06-07 2013-12-12 David Moscatello Compositions and methods for collecting, washing, cryopreserving, recovering and return of lipoaspirates to physician for autologous adipose transfer procedures
US10030465B2 (en) * 2012-11-15 2018-07-24 Kureha Corporation Solidification- and extrusion-molded article of polyglycolic acid and method for manufacturing same
WO2014089623A1 (en) * 2012-12-12 2014-06-19 Mesoblast, Inc. Treatment of diseases of endothelial dysfunction and inflammation
EP2952579B1 (en) * 2013-01-31 2021-09-01 Ajinomoto Co., Inc. Culture method for stable undifferentiated proliferation of pluripotent stem cells
BR112015030374A2 (pt) * 2013-06-28 2017-07-25 Otsuka Pharma Factory Inc solução contendo trealose e dextrana para transplante de células mamíferas
EP3027235A1 (en) 2013-07-30 2016-06-08 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
US9737592B1 (en) 2014-02-14 2017-08-22 David Gordon Bermudes Topical and orally administered protease inhibitors and bacterial vectors for the treatment of disorders and methods of treatment
JP2017512757A (ja) * 2014-02-24 2017-05-25 ウリゲン ファーマシューティカルズ、インコーポレイテッド 経口投与するためのペントサンポリ硫酸塩の組成物および使用の方法
KR101767195B1 (ko) * 2014-04-18 2017-08-24 한양대학교 산학협력단 세포 동결보존용 조성물 및 이를 이용한 세포 동결보존 방법
SG11201700726UA (en) * 2014-07-30 2017-02-27 Hitachi Chemical Co Ltd Method for capturing rare cells in blood
US20170269086A1 (en) * 2014-07-30 2017-09-21 Hitachi Chemical Company, Ltd. Method for capturing rare cells in blood
PT3189135T (pt) * 2014-09-05 2021-08-19 Astellas Inst For Regenerative Medicine Células ganclionares retinianas e seus progenitores
WO2016164857A1 (en) * 2015-04-10 2016-10-13 President And Fellows Of Harvard College Methods and devices for live cell imaging analysis
US10531957B2 (en) 2015-05-21 2020-01-14 Musculoskeletal Transplant Foundation Modified demineralized cortical bone fibers
CN104914057B (zh) * 2015-05-25 2018-06-19 上海中医药大学附属曙光医院 简易快速检测糖胺多糖的试剂盒及其检测方法
CN104938479B (zh) * 2015-05-29 2018-02-09 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 组合物及其用途、脐带保存制剂及其制备方法
US10912864B2 (en) 2015-07-24 2021-02-09 Musculoskeletal Transplant Foundation Acellular soft tissue-derived matrices and methods for preparing same
US11052175B2 (en) 2015-08-19 2021-07-06 Musculoskeletal Transplant Foundation Cartilage-derived implants and methods of making and using same
JP7058603B2 (ja) * 2016-01-13 2022-04-22 ベーリンガー インゲルハイム アニマル ヘルス ユーエスエイ インコーポレイテッド 哺乳動物の変形性関節症及び関連する関節症状の治療に有用なｈａｓ２及びルブリシンを含む骨保護遺伝子を発現する組換えａａｖベクター
CA3010792A1 (en) * 2016-01-14 2017-07-20 DePuy Synthes Products, Inc. Composition and methods for cryopreservation of hutc
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
US20180333358A1 (en) * 2017-05-18 2018-11-22 Adamis Pharmaceuticals Corporation Drug compositions
EP3852525B1 (en) 2018-09-20 2023-05-10 Citospin, S.L. Method for obtaining an enriched population of functional mesenchymal stem cells, cells obtained thereof and compositions comprising the same
FR3088541B1 (fr) * 2018-11-15 2021-11-05 Lab Francais Du Fractionnement Procede de conservation de cellules a visee therapeutique
WO2020243248A1 (en) * 2019-05-28 2020-12-03 Phosphorex, Inc. Microparticles and nanoparticles having sulfate groups on the surface
US20220380731A1 (en) * 2019-11-08 2022-12-01 Kansas State University Research Foundation Isolation, preservation, and expansion of canine umbilical cord mesenchymal stromal cells
CN111979172A (zh) * 2020-08-31 2020-11-24 安徽惠恩生物科技股份有限公司 一种让细胞保持较长时间活性的输注液及其制备方法
CN112155008A (zh) * 2020-09-30 2021-01-01 北京银丰鼎诚生物工程技术有限公司 脂肪组织的冻存与复苏方法及脂肪组织冻存复苏试剂盒
KR20230174376A (ko) 2022-06-21 2023-12-28 계명대학교 산학협력단 소태아 혈청(fbs) 대체 조성물

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE129254T1 (de) * 1987-03-19 1995-11-15 Arthropharm Pty Ltd Antientzündungsmittel und zusammensetzungen.
CN1177905A (zh) * 1995-03-08 1998-04-01 切洛克斯实验室股份有限公司 冷冻保存溶液
AU722569B2 (en) * 1995-12-29 2000-08-03 Alg Company Expansion of bone marrow stromal cells
AU2730497A (en) * 1996-04-17 1997-11-07 Case Western Reserve University Cryopreservation and extensive subculturing of human mesenchymal stem cells
CN1158894A (zh) * 1996-09-17 1997-09-10 中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所 体外细胞低温保存的保护剂
JP3938973B2 (ja) * 1997-05-19 2007-06-27 旭化成メディカル株式会社 細胞分離方法
CN1347983A (zh) * 2000-10-11 2002-05-08 四川省脐血干细胞中心有限公司 用于保存脐带血造血干细胞的低温保存剂
US20030069639A1 (en) * 2001-04-14 2003-04-10 Tom Sander Methods and compositions for repair or replacement of joints and soft tissues
AU2003903037A0 (en) * 2003-06-17 2003-07-03 Institute Of Nutraceutical Research Connective tissue derived polypeptides
WO2005107772A1 (en) * 2004-05-07 2005-11-17 The University Of Queensland Composition for stimulating bone growth and differentiation and method for isolating same
JP2006055106A (ja) * 2004-08-23 2006-03-02 National Institute Of Advanced Industrial & Technology ヒト血清培地を用いるヒト骨髄由来間葉系幹細胞培養法
US20080260694A1 (en) * 2004-09-24 2008-10-23 Angioblast Systems, Inc. Multipotential Expanded Mesenchymal Precursor Cell Progeny (Memp) and Uses Thereof
WO2006076627A2 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Massachusetts Institute Of Technology Methods and compositions related to modulating the extracellular stem cell environment
SG148171A1 (en) 2005-02-11 2008-12-31 Agency Science Tech & Res Methods of proliferating stem cells
US8753391B2 (en) * 2007-02-12 2014-06-17 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Fully synthetic implantable multi-phased scaffold
BR112012028927B1 (pt) * 2010-06-29 2020-11-10 Pirelli Tyre S.P.A. processo para produzir pneus, instalação para produzir pneus, e, pneu verde para rodas de veículo
WO2012101544A1 (en) 2011-01-29 2012-08-02 Alembic Pharmaceuticals Limited An improved process for the preparation of pentosan polysulfate or salts thereof
WO2014089623A1 (en) 2012-12-12 2014-06-19 Mesoblast, Inc. Treatment of diseases of endothelial dysfunction and inflammation

Also Published As

Publication number Publication date
EP2229436A1 (en) 2010-09-22
US9888679B2 (en) 2018-02-13
US20110014701A1 (en) 2011-01-20
KR101995016B1 (ko) 2019-06-28
KR101923152B1 (ko) 2018-11-28
CN101939417A (zh) 2011-01-05
EP2229436B1 (en) 2017-08-30
ES2647944T3 (es) 2017-12-27
JP2011505152A (ja) 2011-02-24
KR101828421B1 (ko) 2018-02-12
KR20160038084A (ko) 2016-04-06
KR101718375B1 (ko) 2017-03-22
CN101939417B (zh) 2014-02-05
JP5542686B2 (ja) 2014-07-09
US20170042140A1 (en) 2017-02-16
US10609922B2 (en) 2020-04-07
KR20170031805A (ko) 2017-03-21
US20180206480A1 (en) 2018-07-26
KR20180127555A (ko) 2018-11-28
KR20180015769A (ko) 2018-02-13
AU2008331434A1 (en) 2009-06-11
EP2229436A4 (en) 2012-12-12
CN103725646A (zh) 2014-04-16
CN103725646B (zh) 2016-09-07
AU2008331434B2 (en) 2013-06-27
WO2009070842A1 (en) 2009-06-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10609922B2 (en) Protection of progenitor cells and regulation of their differentiation
US20210355447A1 (en) Multipotential Expanded Mesenchymal Precursor Cell Progeny (MEMP) and Uses Thereof
JP2022167950A (ja) 椎間板の修復および／または再構成
JP6745713B2 (ja) 椎間板の修復および／または再構成
Sheth et al. Transplantation of human bone marrow–derived stromal cells into the contused spinal cord of nude rats
AU2013234396B2 (en) Protection of progenitor cells and regulation of their differentiation
AU2017200689B2 (en) Repair and/or reconstitution of invertebral discs

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
AMND Amendment
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
J201 Request for trial against refusal decision
AMND Amendment
E801 Decision on dismissal of amendment
J121 Written withdrawal of request for trial
WITB Written withdrawal of application