CN103725646B - 祖细胞的保护和它们的分化的调节 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及祖细胞的保护和它们的分化的调节。本发明提供多硫酸化多糖与祖细胞相结合以改进这些祖细胞的活力，包括改进这些祖细胞的深冷保存的用途，并且提供新颖的组合物、方法和用途。本发明还提供用多硫酸化多糖调节祖细胞的增殖和分化的用途。

Description

祖细胞的保护和它们的分化的调节
本申请是申请日为2008年12月4日的题为“祖细胞的保护和它们的分化的调节”的中国专利申请No.200880126107.3的分案申请。
技术领域
本发明涉及使用多硫酸化多糖与祖细胞相组合以改进祖细胞的活力（包括改进祖细胞的深冷保存），并且提供新颖的组合物、方法和使用。本发明还涉及用多硫酸化多糖调节祖细胞的增殖和分化的用途。
背景技术
人类祖细胞是未成熟的细胞，它们产生了所有不同类型的成熟细胞，这些成熟细胞组成了成体的器官和组织。从祖细胞转变至成熟的、专一性的成体细胞经过了一个被称为分化的过程。
体内的祖细胞采用不同的分化途径来对来自其环境的不同刺激物进行应答。类似地，在实验室中祖细胞可以通过将它们暴露于不同的生化试剂组合而受到刺激从而沿着不同的途径分化。在适当的刺激下，除其他组织之外，祖细胞可以分化成血细胞、骨骼、软骨、脂肪、血管或心肌。由于这个原因，对祖细胞作为治疗的基础用于修复和再生一定范围的组织和器官的用途产生了极大的兴趣。
祖细胞存在于胚胎中，并且也存在于成体组织中例如骨髓、脂肪、皮肤和牙髓中，尽管与在胚胎中相比数量少很多。这两种类型的成体祖细胞是造血性的（它们生成新的骨髓和血细胞）、以及非造血性的（它们生成实体器官和组织，例如骨，心脏和软骨）。造血型成体祖细胞可以从骨髓容易地获得并且已经用于临床。然而，与非造血型成体细胞相关的技术开发得相当少，这是由于难以获得足够数目的这些细胞并且难以使这些细胞在实验室中生长。
为了在治疗中使用祖细胞，必需的是能够将祖细胞在使用它们之前成功地储藏。祖细胞必须以一种方式储藏，这样使得它们被有效保藏并且它们的活力得以维持。大体上，这些祖细胞被深冷保存用于存储并且使用前解冻。
细胞培养物的深冷保存（低于-100℃储藏）被广泛用于保持细胞的备份或储备，而无需与喂养和照顾它们相关联的努力和开支。冷冻过程的成功取决于4个关键的方面：培养物的适当处理、受控的冷冻、适当的储存以及一种适当的深冷防护剂。最后这一点是特别地重要，并且一种适当的试剂可以有助于保持细胞的活力。
在临床情况下，特别地重要的是在深冷保存之后，细胞仍然有活力并且细胞活力的任何增加将提高治疗的效果。
此外，对于祖细胞而言为了治疗有效，它们有必要分化成所要求的细胞类型。因此，对于开发祖细胞分化的有效调节剂以确保这些祖细胞分化成所要求的细胞类型也存在着一种需要。
而且，对于开发祖细胞增殖的有效调节剂也存在着一种需要。通常令人希望的是祖细胞在体外和体内都增殖。
所以，在深冷保存期间对于一种或多种可以保护祖细胞、增强它们的活力、调节它们的分化和/或调节它们的增殖的试剂仍存在着一种需要。
发明内容
发明概述
诸位本发明人目前已经发现，多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以改进祖细胞的活力。特别地，诸位本发明人已经发现多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以增强祖细胞的深冷保存。
诸位本发明人也已经发现多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节祖细胞的增殖。
本发明人也已经发现多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节祖细胞的分化。调节可以是向上调节或向下调节。已经发现多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节分化成软骨细胞、成骨细胞、以及脂肪细胞。特别地，已经发现多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以诱导软骨形成。
这些发现表明多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以与祖细胞进行组合使用以便在深冷保存之后改进或增强祖细胞的活力，并且可以按照体外和体内的方法和用途与祖细胞进行组合使用。
所以，这些出乎意料的发现开启了在许多新应用中使用多硫酸化多糖或它们的一种生物学活性分子片段的可能性。例如，通过调节分化，特别是软骨形成，除其他事物之外还有可能重建软骨和椎间盘，防止关节退化并且增强无血管结缔组织的修复。本发明之前，并不知道多硫酸化多糖可以调节祖细胞的分化，特别是软骨形成。而且，通过调节增殖，有可能在体外和体内都控制祖细胞的生产。当与骨关节炎（OA）治疗本身相关的多硫酸化多糖的使用公开时，以前并不知道多硫酸化多糖具有与祖细胞相关的有利的深冷保存特性、或者并不知道它们可以调节所述细胞的分化和/或细胞增殖。所以，这开启了以前没有考虑到的新的治疗途径。
如在此所使用的，一种“生物学活性分子片段”是本发明的一种分子的一部分，它保持全长分子的定义的活性，即在一个实施方案中能够增强活力、调节细胞分化和/或调节细胞增殖。
相应地，在第一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括一种祖细胞以及一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括多个祖细胞、以及一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段、以及一种载体介质。
该载体介质可以是一种培养基、生物支架、深冷保存介质、生理介质、和/或一种药学上可接受的载体。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括多个祖细胞以及一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段，以及一种深冷保存介质。
该组合物在体外和体内都可以使用。
该组合物可以包含任何数量的祖细胞。在另一个实施方案中，本发明包含约1000至约1x1010个祖细胞。在另一个实施方案中，本发明包含约1x105至1x109个细胞。在另一个实施方案中，本发明包含约100,000至约5x108个祖细胞。在另一个实施方案中，本发明包含约500,000至约2x108个祖细胞、约1x106至约2x108个祖细胞、或约1x106至约1x108个祖细胞。在又另一个实施方案中，该组合物包含约1x106、2x106、3x106、4x106、5x106、6x106、7x106、8x106、9x106、1x107、2x107、3x107、4x107、5x107、6x107、7x107、8x107、9x107、1x108、2x108、3x108、4x108、5x108、6x108、7x108、8x108、或9x108个祖细胞。在又另一个实施方案中，该组合物包含约1x108个祖细胞。
在一个实施方案中，在该组合物中该多硫酸化多糖的浓度将取决于该组合物中的细胞的数量。因此，在一个实施方案中，在该组合物中该多硫酸化多糖的浓度是从500ng/ml/百万个细胞至10mg/ml/百万个细胞、或500ng/ml/百万个细胞至2000μg/ml/百万个细胞、1μg/ml/百万个细胞至1000μg/ml/百万个细胞、或1μg/ml/百万个细胞至500μg/ml/百万个细胞。
在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在以下范围内：500ng至10μg/ml/百万个细胞；1μg至10μg/ml/百万个细胞；1μg至8μg/ml/百万个细胞；1μg至6μg/ml/百万个细胞；1μg至5μg/ml/百万个细胞；1μg至3μg/ml/百万个细胞；2μg至6μg/ml/百万个细胞；2.5μg至5μg/ml/百万个细胞；或3μg至5μg/ml/百万个细胞。在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在以下范围内：1μg至100μg/ml/百万个细胞；1μg至50μg/ml/百万个细胞；1μg至20μg/ml/百万个细胞；1μg至15μg/ml/百万个细胞；10μg至100μg/ml/百万个细胞；20μg至100μg/ml/百万个细胞；或50μg至100μg/ml/百万个细胞。在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在以下范围内：1μg至1,000μg/ml/百万个细胞；100μg至800μg/ml/百万个细胞；100μg至600μg/ml/百万个细胞；100μg至500μg/ml/百万个细胞；200μg至500μg/ml/百万个细胞。在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在250μg至500μg/ml/百万个细胞的范围内。
在一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度包括500ng、1μg、2μg、2.5μg、5μg、10μg、15μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、950μg、1000μg、1050μg、1100μg、1150μg、1200μg、1250μg、1300μg、1350μg、1400μg、1450μg、1500μg、1550μg、1600μg、1650μg、1700μg、1750μg、1800μg、1850μg、1900μg、1950μg、或2000μg/ml/百万个细胞。在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度包括多硫酸化多糖的浓度包括200μg/ml/百万个细胞、250μg/ml/百万个细胞、300μg/ml/百万个细胞、400μg/ml/百万个细胞、或500μg/ml/百万个细胞。在又另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度包括250μg/ml/百万个细胞或500μg/ml/百万个细胞。
可替代地，该多硫酸化多糖的浓度独立于该组合物中细胞的数量。因此，在本发明的另一个实施方案中，在该组合物中该多硫酸化多糖的浓度是：从500ng/ml至10mg/ml；500ng/ml至2000μg/ml；1μg/ml至1000μg/ml；或1μg/ml至500μg/ml。
在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在以下范围内：500ng至10μg/ml；1μg至10μg/ml；1μg至8μg/ml；1μg至6μg/ml；1μg至5μg/ml；1μg至3μg/ml；2μg至6μg/ml；2.5μg至5μg/ml；或3μg至5μg/ml。在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在以下范围内：1μg至100μg/ml；1μg至50μg/ml；1μg至20μg/ml；1μg至15μg/ml；10μg至100μg/ml；20μg至100μg/ml；或50μg至100μg/ml。在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在以下范围内：1μg至1000μg/ml；100μg至800μg/ml；100μg至600μg/ml；100μg至500μg/ml；200μg至500μg/ml。在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在以下范围内：1mg至1,000μg/ml；100μg至800μg/ml；100μg至600μg/ml；100μg至500μg/ml；200μg至500μg/ml。在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖的浓度在250μg至500μg/ml的范围内。
进一步，多硫酸化多糖的浓度包括500ng、1μg、2μg、2.5μg、5μg、10μg、15μg、20μg、30μg、40μg、50μg、60μg、70μg、80μg、90μg、100μg、150μg、200μg、250μg、300μg、350μg、400μg、450μg、500μg、550μg、600μg、650μg、700μg、750μg、800μg、850μg、900μg、950μg、1000μg、1050μg、1100μg、1150μg、1200μg、1250μg、1300μg、1350μg、1400μg、1450μg、1500μg、1550μg、1600μg、1650μg、1700μg、1750μg、1800μg、1850μg、1900μg、1950μg、或2000μg/ml。进一步，多硫酸化多糖的浓度包括200μg/ml、250μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、或500μg/ml。进一步，多硫酸化多糖的浓度包括250μg/ml和500μg/ml。
进一步，组合物包含的总多硫酸化多糖含量为：1mg、2mg、3mg、4mg、5mg、6mg、7mg、8mg、9mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、70mg、80mg、90mg、或100mg。进一步，组合物包含的总多硫酸化多糖含量为：15至70mg、20至60mg、或25至50mg。
另一个实施方案包括约1x106至1x108个祖细胞以及25至50mg多硫酸化多糖。另一个实施方案包含1x108个祖细胞以及25至50mg/ml多硫酸化多糖。
在另一个实施方案中，该硫酸化多糖可以按照一个量值进行施用，从而在该生物学区室中产生0.01至100微克/ml生物介质浓度的多硫酸化多糖，例如0.1至50微克/ml生物学介质、0.1至50微克/ml生物学介质、0.1至10微克/ml生物学介质、1至10微克/ml生物学介质、2至8微克/ml生物学介质、4至6微克/ml生物学介质、或4、5、或6微克/ml生物学介质。
提及生物学区室，它是指身体的一个区域，例如椎间盘、肌肉、滑膜关节、内滑膜组织（半月板、滑膜）、外滑膜组织（关节囊（capsule））、内腱、外腱、贲门、心包、心肌、和/或内脂肪组织、内韧带、外韧带、内真皮、皮下、腹膜内、静脉内、动脉内。该生物学介质将取决于这种生物区室。生物学介质包括血液、血清、血浆、滑液、腹膜液、浆液、或脂肪组织。因此，例如在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖可以按照一个量值进行施用，从而在滑膜关节中产生1至10微克/ml滑液浓度的多硫酸化多糖。
载体介质
该组合物可以包含一种载体介质。在一个实施方案中，该载体介质是一种水性溶液。该介质可以可任选地含有其他组分，这些组分保持了这些细胞的正常生理结构和功能，特别地与维持它们的环境渗透压、pH、它的质膜和胞内细胞器的完整性和流动性相关。
适合于本发明的载体包括常规单独地以及组合使用的那些，例如水、盐水、含水葡萄糖（aqueous dextrose）、乳糖、格林氏溶液、哺乳动物克-林二氏溶液、厄尔氏溶液（Earles’s solution）、盖氏溶液（Gey’s solution）、西蒙氏溶液（Simm’s solution）、台罗德溶液（Tyrode solution）、透明质酸物（hyaluronan）、生理缓冲盐水（PBS）、洛克氏溶液（Locke’s solution）、汉克斯氏溶液（Hank’s solution）、克-路二氏缓冲剂、缓冲剂；由以下构成的缓冲剂：MES-NaOH、HEPES-NaOH、TRICINE-NaOH、EPPS-NaOH、BICINE-NaOH、Tris(羟甲基)氨基甲烷-HCl、甘氨酸-NaOH、碳酸氢钠-CO2、碳酸钠-碳酸氢钠、二甲基胂酸钠、马来酸氢钠-NaOH；培养基例如伊格尔培养基（Eagle’s medium）、杜伯科氏培养基或缓冲剂（Dulbecco’smedium or buffer）、麦科伊氏培养基（McCoy’s medium）、克里克氏培养基（Click’s medium）、埃姆斯氏培养基（Ames’medium）、αMEM、DMEM、Ham’s F12、Ham’s F10、RPMI-1640CMRL1066和1415NCTC135；商购的专门的细胞系培养基例如Stemline和Megacell或商购的深冷保存试剂例如Profreeze和CryoStor
因此，在一个实施方案中，该载体介质是一种水性介质，它可以任选地进一步包括以下组分中的一种或多种：
-有机盐和/或无机盐；
-缓冲剂类
-蛋白类，如BSA或转铁蛋白（transferin）；
-生长因子类和细胞因子类，包括胰岛素样生长因子、胰岛素、成纤维细胞样生长因子、BMP-TGF-β超级家族（例如，BMP-2、BMP-7、BMP-8、TGFβ）以及成纤维细胞生长因子家族、IGF、FGF、EGF、PDGF、VEGF；
-动物血清，包括FBS、新生胎牛/小牛、所有其他哺乳动物物种；
-深冷保存剂类，如Profreeze和CryoStor
-深冷保护剂类，包括二甲亚砜（DMSO）、甘油、海藻糖、蔗糖和其他糖类、或二甲基乙酰胺；
-碳水化合物类；
-维生素类/辅因子类；
-激素类
-抗生素类
-附着因子类；
-氨基酸类；
-血浆增容剂，如葡聚糖；
-人类和其他哺乳动物物种的血浆；
-血浆代用品；
-透明质酸物（hyaluronan）和/或透明质酸，包括自然的或交联的两者。
因此，在一个实施方案中，该载体介质包括一种水性介质，该介质：水、盐水、含水葡萄糖、乳糖、一种缓冲溶液、透明质酸物和乙二醇类、生理缓冲盐水（PBS）、格林氏溶液、洛克氏溶液、汉克斯氏溶液、最低基础培养基，最低基础培养基α（αMEM），或DMEM。在一个实施方案中，该载体介质包括αMEM。在一个可替代的实施方案中，该载体介质包括DMEM。在一个可替代的实施方案中，该载体介质包括HAMS12。
该载体介质可以额外地包括深冷保存剂类，例如专有制备品，像Profreeze或CryoStor
在一个可替代的实施方案中，该载体介质可以包括深冷保存剂类，例如像Profreeze或CryoStor这样的专有制备品作为水性溶液。在该实施方案中，该组合物不包含以下载体：如，水、盐水、含水葡萄糖、乳糖、格林氏溶液、一种缓冲溶液、透明质酸物、生理缓冲盐水（PBS）、洛克氏溶液、汉克斯氏溶液、αMEM；DMEM；或HAMS F12，并且相反，包括一种深冷保存剂，例如像Profreeze或CryoStor这样的专有制备品，可任选地与一种或多种以下的深冷保护剂相组合：例如二甲亚砜（DMSO）、甘油、海藻糖、蔗糖和其他糖类、或二甲基乙酰胺。作为一个例子，该载体介质可以包括Profreeze和DMSO或由其组成。
该载体介质可以作为一种培养基，并且可以添加有机盐和/或无机盐、碳水化合物类、维生素类、氨基酸类和/或其他实体，它们满足了细胞的营养要求，允许它们在体外正常地分裂并且发挥作用。在一个实施方案中，该载体介质进一步包括血清和/或蛋白添加物。因此，该培养基可以添加蛋白，包括但不限于BSA或转铁蛋白。除此之外，或作为替代，该培养基可以添加血清，例如胎儿或新生儿血清，它们含有生长因子，例如胎牛血清。这种制备品的配方以及使用这些介质的方法对于本领域的普通技术人员而言是熟知的。适合的介质可见于Adams RLP.Cell culture for Biochemists.Elsevier/North-HollandBiomedical Press,Amsterdam,New York,Oxford.1980,pp84-97and pp246-260.(ISBN0-444-80199-5),和Dawson RMC,Elliott DC,Elliott WH and Jones KM,Data forBiochemical Research(Third Edition),Clarendon Press,Oxford,2002,pp417–448(ISBN0-19-855299-8)，其内容以其全文进行结合。
在一个实施方案中，该载体介质作为一种深冷保存介质。用于冻融细胞的的深冷保存介质包括使用通常已知的载体和/或培养基，包括在此说明的水性介质（单独使用或与血清蛋白添加物相组合）。可替代地，该载体介质可以包括或包含专有制备品，例如Profreeze和CryoStor为了作为一种载体介质发挥作用，通常加入了保护细胞膜和细胞器免于在冻融过程中形成由冰晶损伤的化合物。
因此，在另一个实施方案中，该载体介质进一步包括一种或多种深冷保护剂。适当的试剂或深冷保护剂包括二甲亚砜（DMSO）、甘油、蔗糖以及其他糖类。适当的试剂的例子可以见于Brudder S,Jaiswal N,Hainsworth S,WO9739104；Farrant,J.1980.Generalobservations on cell preservation.In:M.J.Ashwood-Smith and J.Farrant,Eds.LowTemperature Preservation in Medicine and Biology,Pitman Medical Limited,Kent,England,p.1-18；Frederick V,et al.Recovery,survival and functional evaluationby transplantation of frozen-thawed mouse germ cells.Human Reprod.2004,19:948–53,Pegg DE,Principles of Cryopreservation.Methods Mol Biol.2007;368:39-57，其内容通过引用结合在此。因此，在另一个实施方案中，该载体介质进一步包括一种试剂或深冷保护剂，它选自以下各项中的一种或多种：二甲亚砜（DMSO）、甘油、蔗糖和其他糖类。可替代的深冷保护剂包括二甲基乙酰胺（作为甘油的一种替代）、海藻糖和/或蔗糖。在另一个实施方案中，该载体介质包括常规的深冷保护剂，可任选地与生长因子类和/或分化因子类相组合。适合的载体介质的例子可见于WO9832333、WO9739104或WO1997/039104。
在又另一个实施方案中，该载体介质进一步包括一种专有配制品，例如Profreeze和CryoStorProfreeze由Lonza-BioWhittaker作为含有无动物来源组分的冷冻介质而出售。
该载体介质可以添加有在此中讨论的试剂或保护剂，特别是DMSO、甘油、蔗糖和其他糖类，并且进一步特别是DMSO。在一个具体实施方案中，该载体介质包括Profreeze TMCDNAO冷冻介质，可任选地与DMSO相组合。在另一个实施方案中，该载体介质包括αMEM、Profreeze TMCDNAO冷冻介质和DMSO。
本发明考虑并包括了该载体介质实现多种要求的可能性。因此，该载体介质既可以作为一种培养基也可以作为一种深冷保存介质发挥作用。同样地，该载体介质既可以作为一种深冷保存介质也可以作为一种药学上可接受的载体发挥作用。
该载体介质可以包括二甲亚砜（DMSO）和/或甘油。在一个实施方案中，该载体介质包括二甲亚砜（DMSO）。在另一个实施方案中，该组合物包括1%至20%DMSO。在又另一个实施方案中，该组合物包括1%-15%DMSO、5%-15%DMSO、1%-10%DMSO、5%DMSO、7.5%DMSO、10%DMSO、15%DMSO或20%DMSO。在一个具体实施方案中，该DMSO是高纯度等级的DMSO。
一些细胞可能会通过延长与DMSO的接触而受到不利影响。这可以通过在4℃下向该细胞悬液加入DMSO并且在刚刚融化时将它除去而被降低少或消除。可替代地，可以使用更低浓度的DMSO。
作为一种另外的可能性，该载体介质可以包括甘油而不是DMSO。因此，在一个可替代的实施方案中，该载体介质可以包括甘油。在一个实施方案中，甘油按照以下浓度存在：1%-30%、1%-20%、5%-20%、1%-15%、5%-15%、1%-10%或5%-10%。
在一个实施方案中，该介质包含DMSO或甘油与DMEM、HETA-淀粉和/或人血清组分和/或其他增量剂相组合。
在一个实施方案中，该载体介质对于注射液是可接受的，并且不影响这些细胞的功能性。在一个实施方案中，该载体包含血清。在另一个实施方案中，该载体是一种无血清的载体。
在一个实施方案中，该载体介质包含血清，在一个实施方案中是人血清组分。在一个实施方案中，该载体介质进一步包括胎牛血清（FBS）。在一个实施方案中，该组合物包括1%-50%FBS。在另一个实施方案中，该组合物包括1%-20%FBS、1%-10%FBS、5%FBS、7.5%FBS、10%FBS、15%FBS或20%FBS。可替代地，适合的血清包括在同样可能的浓度下的BSA、转铁蛋白和/或卵黄蛋白。
一种基于血清的深冷保存介质的例子可以是一种载体介质，该载体介质包括一种水性溶液（例如，格林氏溶液、生理缓冲盐水（PBS）、洛克氏溶液、汉克斯氏溶液、αMEM、DMEM或HAMSF12）以及一种深冷保护剂（例如，二甲亚砜（DMSO）、甘油、海藻糖、蔗糖和其他糖类、或二甲基乙酰胺）以及血清（例如，FBS）。
因此，一个示例性的基于血清的深冷保存介质可以是一种载体介质，它包括DMEM或αMEM、DMSO以及血清（例如，使用胎牛血清）。
该载体介质也可以是无血清的和/或无蛋白的，并且可以是一种化学确定成分的介质。无血清介质的例子包括KnockOutTM Serum Replacement、KnockOutTM D-MEM、StemPro-34SFM。
一种无血清介质的例子可以是一种载体介质，它包括一种水性溶液（例如，格林氏溶液、生理缓冲盐水（PBS）、洛克氏溶液、汉克斯氏溶液、αMEM、DMEM或HAMS F12）以及一种深冷保护剂（例如，二甲亚砜（DMSO）、甘油、海藻糖、蔗糖和其他糖类、或二甲基乙酰胺）以及一种深冷保护介质（例如，像Profreeze或CryoStor这样的专有制备品）。
因此，一种示例性的基于血清的深冷保存介质可以是一种载体介质，该载体介质包括αMEM、DMSO以及Profreeze或仅仅是DMSO和Profreeze
在一个实施方案中，该载体介质包括ProfreezeProfreeze是一种无血清的冷冻介质，并且专门被配制为用于深冷保存已经在无血清的介质中繁殖的细胞。这种无蛋白、无动物组分的介质是不含自然的动物蛋白的，并且当从冷冻存储复苏时保持着高细胞活力。在另一个实施方案中，该载体介质包括Profreeze以及DMSO，其中该DMSO可任选地是7.5%或15%。可替代地，该载体介质可以包括CryoStor
在一个实施方案中，该介质可以包括缓冲剂类。缓冲剂类包括DMEM、磷酸盐缓冲液、或CMF-PBS。本发明涵盖了通常使用的生理缓冲剂类。示例性的缓冲剂可见于文献中，例如Lelong IH and Rebel G.pH drift of“physiological buffers”and culture mediaused for cell incubation during in vitro studies.J Pharmacol ToxicolMethods.1998;39:203–210；John A Bontempo.Development of BiopharmaceuticalParenteral Dosage Forms.in Drugs and the Pharmaceutical Sciences.MarcelDekker Inc,NY(ISBN:0-8247-9981-X):pp91–108，其内容通过引用结合在此。
该介质可以任选地进一步包括糖类（包括：葡聚糖、海藻糖、蔗糖）或二甲基乙酰胺（DMA）。
在一个实施方案中，该组合物包括多个祖细胞；多硫酸化多糖以及一种载体介质，该载体介质包括：
-一种水性介质，选自：水、盐水、含水葡萄糖、乳糖、格林氏溶液、一种缓冲溶液、透明质酸物、乙二醇类、生理缓冲盐水（PBS）、洛克氏溶液、汉克斯氏溶液、αMEM、DMEM、或HAMSF12；
-一种深冷保存介质，包括Profreeze或CryoStor；以及
-一种深冷保护剂，选自：二甲亚砜（DMSO）和/或甘油。
-在一个实施方案中，该深冷保存介质是Profreeze
在一个实施方案中，该水性介质是αMEM或DMEM。
在一个实施方案中，该深冷保护剂是DMSO。
在一个实施方案中，该水性介质以1%-99%、约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、或约90%存在。
在一个实施方案中，该深冷保存介质以1%-99%,约10%、约20%、约30%、约40%、约50%、约60%、约70%、约80%、或约90%存在。
在一个实施方案中，该深冷保护剂以1%-50%、1%-30%、1%-15%、1%-10%、1%-7.5%、2.5%、5%、7.5%、10%、12.5%、15%、17.5%或20%的量存在。
在另一个实施方案中，提供了多个祖细胞与一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段，深冷保存于约5mL的Profreeze TMCDNAO冷冻介质、7.5%DMSO、和50%αMEM中。在深冷保存的那个时间细胞浓度可以是在5mL冷冻介质中90x106个细胞/深冷袋至180x106个细胞/深冷袋。
在又另一个实施方案中，该载体介质包括一种支持基质。该支持基质另外可以指生物基质或生物支架。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种增强祖细胞的深冷保存的方法，包括将这些祖细胞暴露于一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段用于增强祖细胞的深冷保存的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种改进祖细胞的活力的方法，包括将这些祖细胞暴露于一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段用于改进祖细胞的活力的用途。
在另一实施方案中，本发明提供了一种多硫酸化多糖作为一种深冷保存剂的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种如在此所定义的组合物用于增强祖细胞的深冷保存的用途。在另一实施方案中，本发明提供了一种改进祖细胞活力的方法，包括深冷冻存如在此所定义的一种组合物并且随后融化该组合物。
因此，将多硫酸化多糖加入到深冷介质中对祖细胞没有不良作用、并且对它们的活力没有有害的作用已经第一次得到证明。事实上，将多硫酸化多糖加入到深冷介质中已经显示出增强了祖细胞的活力。
此外，已经显示出将多硫酸化多糖加入到祖细胞中保持或改进了祖细胞本身的活力。因此，在另一个实施方案中，提供了多硫酸化多糖用于保持或改进祖细胞的活力的用途。在另一个实施方案中，提供了一种保持或改进祖细胞活力的方法，该方法包含将一种多硫酸化多糖与该祖细胞进行接触。
还已经发现多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节祖细胞的增殖。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种调节祖细胞增殖的方法，该方法包括将一种祖细胞暴露于一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段用于调节祖细胞的增殖的用途。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种如在此定义的组合物用于增加增殖的用途。因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种调节祖细胞增殖的方法，该方法包括使用一种如在此定义的组合物。在另一个实施方案中，本发明提供了一种如在此定义的组合物用于调节祖细胞的增殖的用途。
在一个实施方案中，增殖是增加的或向上调节的。
因此，将多硫酸化多糖与祖细胞一起使用可以改进这些祖细胞的增殖已经第一次得到证明。这些多硫酸化多糖以一种浓度依赖的方式刺激祖细胞增殖。所以，多硫酸化多糖可以用于其中增殖这些细胞是令人希望的应用中。例如，祖细胞的体外增殖将用于集落的扩展用于生物工程领域内的应用。作为一个例子，一种生物支架可以用祖细胞的集落浸渍，并且在37℃下由含有一种或多种多硫酸化多糖的培养基灌注。这将促进增殖从而进一步移入并填充该支架，从而提供一种更加功能化的替代组织。作为另一个例子，一种预先成型的（管状或半球形）生物支架可以与自体的或异体的祖细胞一起种下，并且用含有一种或多种多硫酸化多糖的介质灌注，从而最终生成一种在宿主中（其中这些软骨是缺损的）用于移植的气管或关节表面。关于这些用途的进一步信息可见于在Chen FH and TuanRS.Mesenchymal cells in rhematic diseases.Arthritis research andTherapy.2008;10:223-239。
体内多硫酸化多糖刺激增殖将利于促进移植物进入到大的缺陷处（例如，在关节软骨中）或剥夺了活性的内源驻留细胞的隔区中（例如，椎间盘的中心），由此减少了修复和重建这种缺损所要求的时间。因为祖细胞也是抗炎细胞因子和免疫抑制因子的一种丰富的来源（参见，例如Aggarwal S and Pittenger A,Human progenitor cells modulateallogeneic immune cell responses.Blood.2005;105:1815–1822、Tyndale A,etal.Immunomodulatory properties of progenitor cells:a review based on aninterdisciplinary meeting held at the Kennedy Institute of RheumatologyDivision,London,UK,31 October2005.Arthritis Res Ther.2007;9:301–15；JorgensenC,et al.Multipotent mesenchymal stromal cells in articular disease.BestPractice and Research Clinical Rheumatology.2008;22:269284），它们在炎症部位的增殖或注射之后的抗原应答将增加对抑制这些不想要的细胞加工的潜力。
还已经发现多硫酸化多糖可以调节祖细胞的分化。该分化可以是向上调节或向下调节。
在另一个实施方案中，提供了一种调节祖细胞的分化的方法，这是通过将一种祖细胞暴露于一种多硫酸化多糖或它的一种生物学活性分子片段来进行的。
在另一个实施方案中，提供了一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段用于调节祖细胞的分化的用途。
本发明调节了祖细胞的分化。本发明的细胞可以分化成软骨细胞、成骨细胞、以及脂肪细胞谱系，并且在一个实施方案中可以分化成不同谱系的细胞类型，包括骨骼、软骨、脂肪、肌肉、腱、以及间质（stroma）。
具体地，在本发明的一个实施方案中，这些多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调控分化成软骨细胞。在另一个实施方案中，这些多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节分化为成骨细胞。在又另一个实施方案中，这些多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节分化成脂肪细胞。在另一个实施方案中，这些多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节分化成纤维软骨细胞。在另一个实施方案中，这些多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节分化成腱细胞（tenocyte）。在另一个实施方案中，这些多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节分化成心脏细胞（cardiocyte）。
特别地，已经发现多硫酸化多糖或它们的生物学活性分子片段可以调节并诱导软骨形成。
在另一个实施方案中，本发明调节了祖细胞中软骨形成，这些祖细胞支持软骨细胞表现型的分化和存活率。因此，一方面，本发明涉及软骨细胞或纤维软骨细胞的形成。
在另一个实施方案中，该多硫酸化多糖向上调节了分化。在一个可替代的实施方案中，该多硫酸化多糖向下调节了分化。
在本发明的一个实施方案中，提供了一种在祖细胞中调节软骨形成的方法，该方法包括将一种多硫酸化多糖施用一种祖细胞。
在另一个实施方案中，提供了一种多硫酸化多糖用于调节祖细胞中软骨形成的用途。
在另一个实施方案中，提供了一种多硫酸化多糖用于向下调节祖细胞中成骨作用的用途。
在另一个实施方案中，提供了一种多硫酸化多糖用于阻止祖细胞中成骨作用的用途。本方法或用途可以用于其中骨骼的生成对于宿主将是有害的应用中，例如在软组织部位，这些部位要求灵活性以及活动用于正常的功能，例如肌肉（心脏）、间质、支持性结缔组织、等等，或在以下部位，其中骨骼可能碰撞或缠绕神经纤维/神经根或血管，导致感觉异常、麻痹、局部缺血以及潜在的不可逆的组织损伤。
在另一个实施方案中，提供了一种处理细胞来经历软骨形成的方法，该方法包括将一种祖细胞与有效量的一种多硫酸化多糖或它的一种生物学活性分子片段进行接触，持续一段时间，并且在刺激该细胞分化的条件下。
祖细胞
术语“祖细胞”是指包括任何多能（multipotent）细胞。因此，术语祖细胞涵盖了成体细胞和胚胎干细胞。
在一个实施方案中，该祖细胞是一种间充质祖细胞。
在另一个实施方案中，该祖细胞是一种内源性或外源性的胚胎的、或成体间充质的、或间充质的祖细胞。在另一个实施方案中，祖细胞是一种多能的间质细胞。在另一个实施方案中，该细胞是一种成体未分化的间充质细胞。
在另一个实施方案中，祖细胞是一种软骨祖细胞。
在一个实施方案中，这些祖细胞是从骨髓衍生的。可替代地，这些祖细胞从软骨、滑膜组织、肌肉、脂肪组织、皮肤、脐带、牙髓、或其他可获得的来源衍生的。
在一个实施方案中，该祖细胞是一种体细胞，例如被内源性因子抑制分化的结缔组织细胞。
在另一个实施方案中，这些祖细胞是富集Stro-1bri的细胞、或同质的Stro-1bri细胞、或Stro-1bri子代细胞的群体。
多硫酸化多糖
该多硫酸化多糖家族可以被认为是任何天然发生的或半合成/合成的多硫酸化多糖或它的一种生物学活性片段，它包含两个或多个糖环或碳水化合物结构，其中一个或多个硫酸酯基团共价连接到该环或该结构上，正如通过肝素和多硫酸戊聚糖例证。
根据一个实施方案，该多硫酸多糖或它的生物学活性片段可以是选自（但不限于）：自然发生的高分子量肝素、低分子量肝素、硫酸乙酰肝素、多硫酸戊聚糖、多硫酸软骨素、多硫酸壳聚糖、多硫酸皮肤素舒洛地昔、多硫酸葡聚糖、多硫酸化胰岛素、硫酸化乳糖酸酰胺、硫酸化双醛糖酸酰胺、八硫酸蔗糖、墨角藻聚糖-1、墨角藻聚糖-2、硫酸化β-环糊精、硫酸化γ-环糊精以及小的硫酸化的化合物，包括但不限于肌醇六硫酸酯。
在另一个实施方案中，这些多硫酸化多糖包括：多硫酸戊聚糖、多硫酸软骨素、多硫酸壳聚糖、多硫酸葡聚糖以及肝素（高和低分子量）。
在又另一个实施方案中，这些多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖、多硫酸葡聚糖以及肝素。
在又另一个实施方案中，这些多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖的钠盐（NaPPS）、戊聚糖多硫酸酯的镁盐（MgPPS）、和/或戊聚糖多硫酸酯的钙盐（CaPPS）。
一种具体的多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖（PPS）或它的钠盐。多硫酸戊聚糖已经显示出改进祖细胞的活力、增强祖细胞的深冷保持、调节祖细胞的增殖和/或调节祖细胞的分化。多硫酸戊聚糖已经显示出向上调节分化，并且特别是诱导软骨形成。
一种可替代的多硫酸化多糖是多硫酸葡聚糖。多硫酸葡聚糖已经显示出向下调节或抑制分化，并且特别是向下调节或抑制软骨形成。
用途
本发明的祖细胞可以分化成许多细胞类型，包括：软骨细胞、纤维软骨细胞、成骨细胞以及脂肪细胞。
因为祖细胞可以分化成软骨细胞或纤维软骨细胞，这些细胞在生成细胞外基质中是有用的。细胞外基质可以适用于移入到需要这种治疗的患者体内的结缔组织缺损中。
本发明可用于诱导软骨修复、再生或基质新生并且减缓其分解代谢，这是通过将一种多硫酸化多糖或它的一种生物学活性分子片段与多个祖细胞相组合来进行的。
在另一个实施方案中，本发明的组合物也可以用作一种免疫抑制剂、抗代谢分解或抗炎剂。作为一个实例，本发明的组合物可以用于治疗类风湿性关节炎。
在此所讨论的方法可以在体内或体外使用。在体内，除了其他事项之外，所插入的祖细胞还可以在原位重建软骨。此外，也可以刺激在关节中驻留的祖细胞来原位重建软骨，由此形成一种有效的指向性的治疗。
在体外，本发明允许在一种生物基质中生成软骨，它可以随后被移植到患者体内。这可以用来生成软骨以便部分地或全部替换活动关节的表面，用于替换软骨的/纤维软骨的组织或可以从该过程受益的任何其他组织，它们已经受到损伤或由遗传异常产生，这些异常需要外科矫治。
本发明还发现用于可能未从目前可获得的内科或外科治疗受益的患者。例如，已经遭受由外伤引起的急性损伤痛苦的许多运动员或个体可能具有软骨/纤维软骨缺损，这些缺损是具有症状的。本发明提供了一种可以用于刺激新软骨生长来替换该缺损组织的方法。这可以在体内通过刺激祖细胞在关节原位生长或在体外通过一种适当的生物支架来完成，该生物支架是成型的从而适合放入该缺损中并且随后插入该缺损中；或者通过体内和体外两种方法来完成。可替代地，它可以用于具有确定的关节退化的老年患者，例如在外周关节和脊柱的骨性关节炎中，其中本发明可以用于刺激新软骨的生长从而替换该缺损组织并阻止骨赘的进展并且降低炎症，这种炎症通常是这些障碍的症状的原因。
在一个实施方案中，本发明已经鉴定了一种或多种化合物，这种或这些化合物可以充当一种深冷保存剂以及可以调节分化的试剂。在一个实施方案中，本发明已经鉴定了一种或多种化合物，这种或这些化合物可以充当一种深冷保存剂以及可以调节增殖的试剂。在另一个实施方案中，本发明已经鉴定了一种或多种化合物，这种或这些化合物可以调节增殖并调节分化。在另一个实施方案中，本发明已经鉴定了一种或多种化合物，这种或这些化合物可以充当一种深冷保存剂、充当一种调节增殖的试剂、并充当一种可以调节增殖的试剂。此类多用途的化合物以前没有发现与祖细胞相关。
本发明已经鉴别出多个分子家族或它们的生物学活性片段，它们可以独立地或彼此相组合增强祖细胞的深冷保存、调节它们的细胞增殖和/或调节它们的分化；由此，这些分子在治疗处理时可以与祖细胞进行组合使用。
具体地，本发明允许祖细胞分化成软骨细胞/成纤维细胞，由此允许形成软骨或纤维软骨。所以，使用祖细胞和多硫酸化多糖可以用于治疗退行性疾病、治疗软骨/纤维软骨缺损、和/或阻止退行性疾病和软骨缺损的进展或将其最小化。
本发明已经鉴别出一种新颖的组合物。这种组合物具有治疗用途，并且可以有利地在体内或体外使用。在一个实施方案中，该方法是在体内进行的。可替代地，该方法是在体外进行的。
所以，在本发明的一个实施方案中，提供了一种如在此所说明的用作药物的组合物。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种如在此所说明的组合物，用于治疗由软骨断裂或减小所影响的任何疾病，包括肌肉骨骼系统疾病，包括类风湿性关节炎（RA）、骨性关节炎（OA）、以及椎间盘退行性变（DD）、退行性疾病；以及诱导软骨修复、再生或基质新生的方法。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种如在此所说明的组合物，用于治疗由软骨断裂或减小所影响的任何疾病，包括肌肉骨骼系统疾病，包括类风湿性关节炎（RA）、骨性关节炎（OA）、以及椎间盘退行性变（DD）、退行性疾病；以及诱导软骨修复、再生或基质新生的方法。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种如在此所说明的组合物，用于治疗以下任何疾病，其中经由成骨作用的祖细胞分化是不想要的。例如，骨形成通常对于软组织修复（例如，盘内注射）是不想要的。细胞从椎间盘进入到脊椎管中或到邻近器官上（例如，食管）的渗漏可能是灾难性的。这样的一个例子可以在将BMP-2置于椎间盘隔间中来促进脊柱融合（新骨）时看到。已经发现使用重组骨形成蛋白导致了威胁生命的并发症，因为邻近该椎盘隔间形成的异位性骨，它造成气道和神经压迫。
在本发明的另一个实施方案中，提供了一种如在此所说明的组合物，用于治疗被脂肪组织的断裂或减少所影响的疾病。
在本发明的另一个实施方案中，在此提供了：一种如在此所说明的组合物用于制造对由软骨断裂或减小所影响的任何疾病进行治疗的药物的用途，这些疾病包括肌肉骨骼系统疾病，包括类风湿性关节炎（RA）、骨性关节炎（OA）、以及椎间盘退行性变（DD）、退行性疾病；以及诱导软骨修复、再生或基质新生的方法。
所以，根据本发明的一个实施方案，在此提供了：一种治疗、减轻、减少或预防由软骨断裂或减少所影响的任何疾病的方法，这些疾病例如肌肉骨骼系统疾病，包括类风湿性关节炎（RA）、骨性关节炎（OA）、以及椎间盘退行性变（DD）、退行性疾病；以及诱导软骨修复、再生或基质新生的多种方法，包括给予治疗有效量的如在此定义的一种组合物。
这种应用的例子可以是将本发明的组合物注入具有软骨或椎间盘损伤的个体的关节中、或全身地用于其他较难达到的位点，允许该制备品灌注该组织和细胞从而发挥其独特的生物效应。施用可以包括治疗以下个体，这些个体可能不具有临床定义的疾病（通常是OA或相关障碍）、但已经持续一种由（例如）运动或工作有关的活动所造成的对关节组织的外伤损害。
本发明的方法和用途还可以充当关节镜或开放手术后的一种预防方法，其中软骨或半月板切除/清创是必需的。已经完全确定的是随着时间推移此类术后患者将普遍地发展到表现出要求内科治疗的症状的OA。通过减少软骨退化使得多种症状得以改进也不是不可能，这是由于促进炎症的抗原产生减少的缘故。
由此，使用在此讨论的本发明的组合物来调节引入到患者体内的祖细胞的分化和/或细胞增殖，能够用于治疗、减轻、减少或防止由软骨断裂或减少所影响的任何疾病。特定的疾病包括肌肉骨骼系统疾病，包括类风湿性关节炎（RA）、骨性关节炎（OA）、以及椎间盘退行性变（DD）、退行性疾病；以及诱导软骨修复、再生或基质新生的方法。
在一个实施方案中，该组合物是通过静脉内进行给药的。根据又另一个实施方案，该组合物是全身给药的。根据又另一个实施方案，该组合物是通过关节内进行给药的。根据又另一个实施方案，该组合物是通过椎间盘内进行给药的。根据又另一个实施方案，该组合物是全身给药的。
在一个实施方案中的是将一种多硫酸化多糖与多个祖细胞相组合注射到该患者的一个关节或多个关节中的方法。该多硫酸化多糖帮助调节这些祖细胞的分化和/或增殖。
额外地，已经发现本发明的多硫酸化多糖还能够在分化的细胞中生成、向下调节透明质酸物或透明质酸（HA）、或刺激透明质酸物或透明质酸（HA）的产生。这种透明质酸（HA）可以在一种动物或细胞中（即一种动物体内或在一种体外的细胞中）产生。
这个出乎意料的发现意味着本发明的组合物可用于替换关节中（特别是滑液中）由于正常磨损和撕裂、退行性疾病或其他急性外伤的HA损失。因为滑液退化，它保护并润滑关节的能力被降低。这使关节进一步退化，并且还可以刺激产生又造成进一步损伤的自身抗原在过去，克服或至少减轻这个问题的一种方法是替换该滑液。
然而，本发明提供了一种刺激生成透明质酸物或透明质酸（HA）、而不需要替换该滑液其自身的手段。本发明的组合物可以与祖细胞进行接触，然后这些祖细胞分化成间充质细胞（例如，软骨细胞或成纤维细胞）来增加HA的生成。这种HA是原位形成的，并且可以用于替换滑液中损失的HA，它治疗、减少或至少减轻由这些退行性疾病或组织退化所引起的损伤。
因此，根据另一个实施方案，本发明涉及一种产生、向上调节透明质酸物（HA）或刺激透明质酸物（HA）产生的方法，包括给予一种如在此定义的组合物。
在本发明的一个实施方案中，这些组合物、方法和用途可以用于治疗关节炎或其他退行性疾病。然而，在一个可替代的实施方案中，本发明排除了治疗关节炎或其他退行性疾病的方法。确切地，一方面，本发明包括将一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段与多个祖细胞进行组合给予来对治疗关节炎或其他退行性疾病进行治疗的用途。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供了一种治疗患者的方法，该患者患有肌肉骨骼系统疾病，包括类风湿性关节炎（RA）、骨性关节炎（OA）、以及椎间盘退行性变（DD）；退行性疾病、滑膜关节的骨性关节炎、眼科学、术后腹部粘连的防止、皮肤治疗和修复以及细胞外基质的功能的恢复；或用于诱导软骨修复、恢复或基质新生，包括给予一种如在此定义的组合物，从而调节这些祖细胞的分化和/或增殖。
该患者或受试者可以是人或动物患者。在一个实施方案中，该患者是一种哺乳动物，包括人、马、犬、猫、绵羊、奶牛或灵长类动物。在一个实施方案中，该患者是人。该患者可能患有一种退行性疾病和/或软骨缺损。该患者可能是一位运动员或可能已经遭受一种造成关节损伤的外伤。
本发明涵盖了涉及到多硫酸化多糖和祖细胞的治疗方法。本发明还涵盖了这些多硫酸化多糖和祖细胞用作药物；这些多硫酸化多糖以及祖细胞在制造用于如在此所说明的治疗的药物中的用途；并且还涵盖了包含这些多硫酸化多糖和祖细胞的组合物和配制品。
联合治疗
本发明第一次鉴定了还可以调节分化和细胞增殖（特别是调节软骨形成和细胞增殖）的多肽或它们的一种生物学活性片段。该多肽是αIX胶原的一种非胶原NC4结构域或它的一种生物学活性分子片段（以下称NC4）。术语“一种生物学活性片段”与术语“一种生物学活性分子片段”是同义的。
出人意料的是，本发明已经发现尽管两个独立的家族可以独立地进行它们对软骨形成和细胞增殖的调节，当组合在一起时它们能够协同地发挥作用，不仅增加它们各自的效应而且提供了更大的作用特异性。
这些未曾预料的发现开启了在许多新的应用中将一种多硫酸化多糖与NC4进行组合使用的可能性，因为通过调节软骨形成，除了其他事项之外还有可能重建软骨和椎间盘、防止关节的退化并且增强无血管结缔组织的修复。在本发明之前，并不知道一种多硫酸化多糖和NC4的组合可以调节软骨形成和细胞增殖，并且显然不知道该组合会具有一种协同效应。
相应地，在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括多个祖细胞以及一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段、以及NC4或它的一种生物学活性分子片段。
在另一个实施方案中，该组合物进一步包括一种载体介质、培养基、深冷保存介质和/或药学上可接受的载体。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，该组合物包括多个祖细胞、一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段、以及NC或它的一种生物学活性分子片段、连同一种载体介质。
该载体介质可以是一种培养基、深冷保存介质或药学上可接受的载体。
对本发明的组合物（这些组合物涉及祖细胞和多硫酸化多糖）的任何提及也涉及包含多个祖细胞、多硫酸化多糖和NC4的组合物，包括浓度、细胞数和/或类型以及任选的其他成分的量。此外，如在此定义的这些组合物的方法和用途也涉及包括一种多硫酸化多糖和NC4这两者的组合物。
因此，根据本发明的另一个实施方案，提供了一种调节软骨形成和/或细胞增殖的方法，该方法包括给予一种组合物，该组合物包括多个祖细胞、一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段、以及NC4或它的一种生物学活性分子片段。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种调节祖细胞增殖的方法，该方法包括将一种祖细胞暴露于一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段、以及NC4或它的一种生物学活性分子片段。
因此，在另一个实施方案中，本发明提供了一种调节祖细胞分化的方法，这是通过将这些祖细胞暴露于一种多硫酸化多糖或它的生物学活性分子片段、以及NC4或它的一种生物学活性分子片段来进行的。
在一个实施方案中，NC4的生物学活性分子片段具有与SEQ ID NO:1的片段至少65%的氨基酸一致性。
在另一个实施方案中，NC4的生物学活性分子片段具有与SEQ ID NO:2的片段至少65%的氨基酸一致性。
在又另一个实施方案中，NC4的生物学活性分子片段具有与以下序列的片段至少65%的氨基酸一致性，这些序列是：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、或SEQ ID NO:24。
在另一个实施方案中，NC4的生物学活性分子片段具有与以上列出的片段至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、100%的氨基酸一致性。
还有可能的是将本发明的组合物作为联合治疗的一部分来进行给药或使用。例如，本发明的这种或这些多糖可以与一种或多种其他化合物进行联合给药。这些化合物可以是一种结构修饰的骨性关节炎药物（SMOAD）。
本发明延伸到联合治疗用于治疗在此所讨论的疾病。具体地，在一个实例中，本发明延伸到使用一种多硫酸化多糖与另外一种试剂相组合用于治疗不同的退行性病症。应当理解，这些试剂可以在相同的时间或不同的时间上进行给药。因此，该联合治疗可以包括将这些活性剂一起进行给予，这些活性剂处于单一的配制品中或处于多个配制品中（在相同的或不同的时间给药）。同样地，该联合治疗可以包括以不同的配制品在不同时间点所给予的活性试剂。这些配制品可以进行依次给药，并且可以被一段时间（包括数小时、数天、数周和数月）分开。
本发明也延伸到如在此讨论的多硫酸化多糖与一种或多种生长因子相组合的用途。本发明进一步延伸到如在此所披露的方法、用途、配制品和/或组合物，它们与一种或多种生长因子相组合。可能的生长因子包括胰岛素样生长因子、胰岛素、成纤维细胞样生长因子、BMP-TGF-β超家族（例如，BMP-2,BMP-7,BMP-8,TGFβ）以及成纤维细胞生长因子家族、IGF、FGF、EGF、PDGF和VEGF。
附图说明
图1.多硫酸戊聚糖（PPS）对正常的人类MSC冻/融活力的作用。在37℃水浴中将人类MSC快速融化，并且用HHF（HBSS，含有5%(体积/体积）胎牛血清）洗涤2次。随后，将这些细胞以8,000个细胞/cm2种于多个T-75烧瓶中。这些细胞一直生长直到70%至80%的会合，用胰蛋白酶进行消化，并且以50x106/ml的细胞浓度在添加指定浓度的PPS的Profreeze/7.5%DMSO中将这些细胞深冷保存。将安瓿从液氮库中取回，并且快速融化、轻轻混合，并且在时间=0、30、60、90和120分钟时去除10ul样品。向每一个细胞样品中加入290ul台盼蓝，并且进行细胞计数/活力测试。PPS并未对细胞活力产生不利的影响。
图2.柱状图显示在经受冻融循环之后悬浮在含有7.5%DMSO和不同浓度的多硫酸戊聚糖（PPS）的深冷介质中不同数量的鼠ATDC5祖细胞的活力。细胞活力是使用线粒体脱氢酶MTT测定来确定的。
图3.不同浓度的多硫酸戊聚糖（PPS）对祖细胞在液氮中深冷保存并且快速融化之后（如图1中所说明）的活力的作用。细胞活力是使用线粒体脱氢酶MTT测定来确定的。显示的数据=平均值±SD
*=p<0.05相对于对照值
图4.多硫酸戊聚糖（PPS）对人类祖细胞增殖的作用。原代人类祖细胞在24孔板中在添加指定浓度的PPS的生长培养基中进行培养。在不同的时间间隔（第1、3、6天），将生长培养基去除并且用含有四唑鎓盐WST-1的无酚红的培养基替换，在37℃下/5%CO2下持续2小时。在有活力的细胞中WST-1被线粒体脱氢酶剪切从而产生一种甲臜（formazan）染料，该染料可以使用ELISA酶标仪在波长450nm处检测到。显示了所有浓度的PPS对于每个时间点在450nm处的吸光度。在第6天在超过1μg/ml的PPS浓度下观察到统计学上显著的增殖增加（*p<0.01,ANOVA）。
图5.多硫酸戊聚糖（PPS）对在微团培养（micromass culture）4天之后人类祖细胞DNA合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如通过将3H-胸腺嘧啶核苷掺入到大分子DNA中所确定。*=p<0.05；**=p<0.005相对于对照物。
图6.多硫酸戊聚糖（PPS）对用凋亡试剂处理的人类祖细胞的作用。将人类祖细胞铺板于添加指定浓度的PPS的无血清培养基中。祖细胞的凋亡是通过加入30ng/ml IL-4加上30,000U/ml IFN-γ的组合来诱导的。5天培养后，通过胰蛋白酶消化收获细胞，并且通过钙磷脂结合蛋白Ⅴ（Annexin V）染色来评估活力。当祖细胞以超过1ug/ml的PPS浓度培养时，观察到了IFN-γ/IL-4-诱导的凋亡（钙磷脂结合蛋白Ⅴ阳性细胞）2倍的减少。
图7.多硫酸戊聚糖（PPS）对人类祖细胞分化的作用：矿化测定。将原代人类祖细胞在96孔板中在无骨诱导性生长培养基（培养基对照）中或在骨诱导性条件下（αMEM，添加10%FCS、100μML-抗坏血酸-2-磷酸酯、地塞米松10-7M和3mM无机磷酸盐）在指定浓度的PPS的存在下进行培养。第28天，使用甲酚酞络合酮法（Cresolphthalein Complexone method）来确定每个孔的酸可溶的钙的浓度。(A)每μg DNA/孔的酸可溶的钙的浓度是在使用荧光性DNA染色（Hoeshst33258）来评估每个孔中DNA总量之后所测定的。当使用1ug/ml和100ug/ml的PPS的浓度时，观察到矿化基质形成方面的统计学上显著的降低（*p<0.01,ANOVA）。(B)在x20放大倍率下矿化培养物的相差显微照片。
图8.多硫酸戊聚糖（PPS）对人类祖细胞分化的作用：脂肪细胞的形成。将原代祖细胞在96孔板中在无脂肪形成性生长培养基中（培养剂对照）或在脂肪形成性条件下（0.5mM甲基异丁甲基黄嘌呤、0.5μM氢化可的松、以及60μM吲哚美辛）在指定浓度的PPS的存在下进行培养。第28天，充满脂质的脂肪细胞的存在是使用亲脂性染料油红O来确定的。每μg DNA/孔的可溶脂的相对量是在使用荧光性DNA染色（Hoeshst33258）来评估每孔的DNA总量之后来测定的。(A)在超过1ug/ml的PPS浓度下观察到脂肪细胞数量的统计学上显著的增加(*p<0.01,ANOVA)。(A)油红O标记的脂肪细胞在x20放大倍率下的相差显微照片。
图9.多硫酸戊聚糖（PPS）对鼠祖细胞（祖细胞C3H10T1/2）在单层培养生长时蛋白聚糖（PG）的生物合成以及DNA含量的浓度依赖性作用。显示的数据=平均值±SD。
图10.多硫酸戊聚糖（PPS）对以单层培养生长2天的鼠祖细胞（C3H10T1/2细胞）的DNA合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如通过将3H-胸腺嘧啶核苷掺入到大分子DNA中所确定。
图11.多硫酸戊聚糖（PPS）对人类祖细胞在单层培养2天后进行的蛋白聚糖（PG）生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如通过将放射性标记的硫酸根（sulfate）掺入到PG的硫酸化葡糖胺多糖（35S-GAG）所确定。这些数据被表示为35S-GAG放射活性，作为每分钟衰变数（DPM）、归一化为DNA含量。*=p<0.05；**=p<0.005；***=p<0.0005。
图12.多硫酸戊聚糖（PPS）对蛋白聚糖（PG）生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在6天成团培养的鼠祖细胞细胞（ADTC-5）中通过将放射性标记的硫酸根掺入到PG的硫酸化葡糖胺多糖（35S-GAG）中所确定。*=p<0.05相对于对照物。
图13.在6天成团培养（pellet culture）中用不同浓度的PPS在维持培养基（MM）中孵育的、由ATDC5细胞进行的胶原II型和Sox-9的基因表达。
图14.肝素对蛋白聚糖（PG）生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在6天成团培养的鼠祖细胞（ADTC-5）中通过将放射性标记的硫酸根掺入到PG的硫酸化葡糖胺多糖（35S-GAG）中所确定。在这个细胞系中肝素在1.25至20ug/mL的浓度范围中并未展示出一种软骨形成效应。
图15.显示多硫酸戊聚糖（PPS）对蛋白聚糖（PG）生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在7天成团培养的鼠祖细胞（C3H10T1-2）中通过将放射性标记的硫酸根掺入到PG的硫酸化葡糖胺多糖（35S-GAG）中所确定。
图16.显示PPS对由微团培养6天和9天的鼠祖细胞（C3H10T1-2）进行的蛋白聚糖合成的浓度依赖性作用的柱状图。向该培养基（Ham’s F12+10%FCS）中加入PPS并且每48小时更换。在培养终止前24小时加入35S-SO4。将合成归一化为DNA含量。*P<0.05，**P<0.005，***P<0.0005相对于对照物。
图17.显示PPS对由微团培养5天的人类祖细胞进行的蛋白聚糖合成的浓度依赖性作用的柱状图。数据表示为35S-GAG放射活性，并且作为对照物的百分比（对照物取为100%）。*P<0.05相对于对照物。
图18.A：显示由微团培养10天的人类祖细胞所进行的多硫酸戊聚糖（PPS）浓度依赖性刺激的胶原II型生成的柱状图，正如通过B中所示的扫描和数字分析免疫染色的微团培养物所确定。（详见正文）.
图19.显示(A)透明质酸物（SupartzTM）和(B)多硫酸葡聚糖对由微团培养5天的人类祖细胞进行的蛋白聚糖合成的浓度依赖性作用的柱状图。数据表示为35S-GAG放射活性，并且作为对照物的百分比（对照物取为100%）或为DPM/ug DNA。*P<0.05相对于对照物。
图20.显示了添加指定浓度的PPS和/或透明质酸（SupartzTM）的生长培养基来培养原代人类祖细胞的结果。在不同的时间间隔（第3天和第5天），除去生长培养基并且用含有四唑鎓盐WST-1的无酚红的培养基替换，在37℃下/5%CO2下持续2小时。显示了所有浓度的PPS和HA对于每个时间点在450nm处的吸光度。这个实验显示HA和PPS没有协同地作用来刺激祖细胞增殖。
图21.由乳酸克鲁维斯酵母（K.lactis）表达的rhNC4（批号PBA-1202P）在缺少（维持培养基，MM）和存在胰岛素（10微克/mL）（分化培养基，DM）时对蛋白聚糖（PG）生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在用鼠ATDC5祖细胞培养3天之后通过将放射性标记的硫酸根掺入到的PG的硫酸化葡糖胺多糖（35S-GAG）所确定。这些数据被表达为相对于不含有rhNC4的对照培养物的%变化。P<0.05相对于对照培养物是统计学上显著的。
图22.由乳酸克鲁维斯酵母表达的rhNC4（批号PBA-1202P）在缺少（维持培养基，MM）和存在胰岛素（10微克/mL）（分化培养基，DM）下对成团培养的ATDC5细胞进行的蛋白聚糖（PG）生物合成的浓度依赖性作用的柱状图。数据显示为相对于对照物的%变化，该对照物取为100%。
图23.由乳酸克鲁维斯酵母所表达的rhNC4（批号PBA-1202P）加上多硫酸戊聚糖（PPS）（2微克/mL）在缺少（维持培养基，MM）和存在胰岛素（10μg/mL）（分化培养基，DM）时对大分子DNA生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在用鼠ATDC5祖细胞培养1天之后通过将放射性标记的3H-胸腺嘧啶核苷掺入所确定。这些数据被表达为相对于不含有rhNC4的对照培养物的%变化。P<0.05相对于对照培养物是统计学上显著的。
图24.rhNC4（批号PBA-1202P）与多硫酸戊聚糖（PPS）的结合对由鼠ATDC5祖细胞的单层培养物进行的35S-PG生物合成的浓度依赖性作用的柱状图。数据相对于对照物（维持培养基，MM）表示，该对照物取为100%。
图25.由鼠ATDC5祖细胞在存在和缺少rhNC4（批号PBA-1209P）以及PPS时以单层培养方式培养2天所表达的骨标志物Runx2、MGP、HAS3、CD44以及管家基因NADPH的基因表达的RT-PCR检测。
图26.由鼠ATDC5祖细胞在存在和缺少rhNC4（批号PBA-1209P）以及PPS时以单层培养方式培养2天所表达的Runx2和这些转导蛋白（Smad2和Smad4）以及管家基因NADPH基因表达的RT-PCR检测。
图27.色谱洗脱曲图，显示了多硫酸化多糖对由祖细胞进行的透明质酸物（HA）生物合成的作用，这是通过测量3H-葡糖胺掺入HA中来进行的。在存在不同浓度的多硫酸戊聚糖（PPS）持续9天时来自微团培养的人类祖细胞的培养基的Superdex-S200色谱图展示于在组图A至D中。在玻璃酸酶酶解之前，放射活性曲图显示出由这些细胞将3H-葡糖胺掺入到HA和PG中、但是在酶解后仅3H-PG保留在该柱的空隙体积中。在这些酶解和酶解前样品的曲线中在空隙体积部分上面积上的%差异代表了由PPS浓度所限定的释放到培养基中的3H-HA的量。
图28.由乳酸克鲁维斯酵母细胞所表达的rhNC4（批号PBA-1202P）在缺少和存在胰岛素（10微克/mL）下对DNA合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在用鼠ATDC5祖细胞培养3天之后通过将3H-胸腺嘧啶核苷掺入到大分子DNA中所确定。这些数据被表达为相对于不含有rhNC4的对照培养物的%变化。P<0.01相对于对照培养物是统计学上显著的。
图29.由乳酸克鲁维酵母细胞所表达的rhNC4（批号PBA-1202P）对鼠ATDC5祖细胞数目的浓度依赖性作用的柱状图，这是在缺少和存在胰岛素（10微克/mL）下培养3天之后使用血细胞计数器来确定的。这些数据被表达为相对于不含有rhNC4的对照培养物的%变化。P<0.01相对于对照培养物是统计学上显著的。
图30.相对于对照物由rhNC4（批号PBA-1200P）（5ug/ml）或胰岛素（10ug/ml）所诱导的ATDC5细胞在13天内生长的动力学柱状图。将20,000个细胞/孔在第0天（开始）种下，其中每48小时更换培养基。在第6天，胰岛素处理的培养物达到会合，并且在第9天PBA-1200P达到会合。在第9天，对照培养物也达到会合，但是与含有胰岛素或PBA-1200P的培养物相反，它停止进行复制。
图31.由乳酸克鲁维斯酵母所表达的rhNC4（批号PBA-1202P）在缺少（维持培养基，MM）和存在胰岛素（10微克/mL）（分化培养基，DM）对蛋白聚糖（PG）生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在用鼠ATDC5祖细胞培养3天之后通过将放射性标记的硫酸根掺入到的PG的硫酸化葡糖胺多糖（35S-GAG）所确定。这些数据被表达为相对于不含有rhNC4的对照培养物的%变化。P<0.05相对于对照培养物是统计学上显著的。图31.显示由这些祖细胞ATDC5细胞在存在和缺少胰岛素时进行的rhNC4刺激的PG合成，但是在缺少胰岛素时在更高的浓度下更有效。
图32.多硫酸戊聚糖（PPS）在存在胰岛素（10微克/mL）时对蛋白聚糖（PG）的生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在用鼠ATDC5祖细胞培养3天之后通过将放射性标记的硫酸根掺入到PG的硫酸化葡糖胺多糖（35S-GAG）中所确定。这些数据被表达为35S-GAG放射活性，作为相对于不含有PPS的对照培养物每分钟计数（CPM）以及每分钟衰变数（DPM）。P<0.05是相对于对照培养物统计学上显著的。图32.显示了在PPS存在下由鼠ATDC5祖细胞进行的PG合成的浓度依赖性刺激。
图33.由乳酸克鲁维斯酵母所表达的rhNC4（批号PBA-1202P）加上多硫酸戊聚糖（PPS）（2微克/mL）在缺少（维持培养基，MM）和存在胰岛素（10微克/mL）（分化培养基，DM）时对蛋白聚糖（PG）的生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在用鼠ATDC5祖细胞培养1天之后通过将放射性标记的葡糖胺掺入到PG的葡糖胺多糖（3H-GAG）中所确定。这些数据被表达为相对于不含有rhNC4的对照培养物的%变化。P<0.05相对于对照培养物是统计学上显著的。
图34.多硫酸戊聚糖（PPS）在缺少和存在胰岛素（10微克/mL）时对DNA合成（细胞复制）的浓度依赖性作用的柱状图，正如在用鼠ATDC5祖细胞培养3天之后通过将3H-胸腺嘧啶核苷掺入到大分子DNA中所确定。这些数据被表达为相对于不含有PPS的对照培养物的%变化。
图35.SEQ ID NO:1-无信号肽的全长人类NC4的氨基酸序列。
具体实施方式
如在本说明书和权利要求中所使用，单数形式“一种/个”（″a″,″an″）和“该”包括复数的引用，除非在上下文中的其他地方清楚地指出。例如，术语“一种多肽”包括多个多肽，包括它们的混合物。
如在此所使用的，术语“衍生自”应当被认为是指一个指明的整体（integer）是从一个特定的来源获得的，尽管不需要直接地从该来源获得。
一种“组合物”旨在是指活性试剂与另一种惰性的（例如，一种可检出的试剂或标记）或活性的（例如，一种佐剂）化合物或组合物的组合。
除非上下文在其他地方或明确地进行相反地说明，在此所叙述的本发明的整数、步骤、或元素作为单数的整数、步骤或元素清楚地涵盖了单数和复数这两种形式的所叙述的整数、步骤或元素。
相对于任何单一的实施方案，在此说明的本发明的实施方案应当为认为参照在此说明的本发明的任何其他实施方案进行施用。
贯穿本说明书，除非上下文另外需要，词语“包括”、或变体例如“包括了”或“包括着”应当理解为意指包括一个所述的步骤或元素或整数、或多个步骤或元素或整数的组，但不排除任何其他一个步骤或元素或整数、或多个元素或整数的组。
本领域的普通技术人员应当理解在此说明的本发明是容易进行改变和变更的，除外确切地说明的那些。应当理解，本发明包括所此类的改变和变更。本发明还包括在本说明书中逐个地或共同地提及或指出的所有这些步骤、特征、组合物和化合物，以及所述步骤或特征的任何和所有的组合或其中的任何两种或多种。
本发明并非局限于在此说明的特定实例的范围内。功能上等效的产物、组合物和方法清楚地在本发明的范围内，如在此所说明。
无需过多的实验过程即可进行本发明，本发明使用了（除非另外指出）分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、溶液中肽合成、固相肽合成、以及免疫学的常规技术。例如，此类操作说明于以下文件中，它们通过引用结合在此。
1.Sambrook,Fritsch&Maniatis,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratories,New York,Second Edition (1989),whole of VolsI,II,and III；
2.DNA Cloning:A Practical Approach,Vols.I and II(D.N.Glover,ed.,1985),IRL Press,Oxford,whole of text；
3.Oligonucleotide Synthesis:A Practical Approach(M.J.Gait,ed.,1984)IRL Press,Oxford,whole of text,and particularly the papers therein by Gait,pp1-22;Atkinson et al.,pp35-81;Sproat et al.,pp 83-115;and Wu et al.,pp135151；
4.Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach(B.D.Hames &S.J.Higgins,eds.,1985)IRL Press,Oxford,whole of text；
5.Perbal,B.,A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；
6.Wiinsch,E.,ed.(1974)Synthese von Peptiden in Houben-Weyls Metodender Organischen Chemie(Miiler,E.,ed.),vol.15,4th edn.,Parts1and2,30Thieme,Stuttgart。
7.Handbook of Experimental Immunology,Vols.I-IV(D.M.Weir andC.C.Blackwell,eds.,1986,Blackwell Scientific Publications)。
祖细胞
本发明涉及了祖细胞。在它的最广泛的实施方案中，术语祖细胞旨在涵盖包括任何多能细胞。因此，术语祖细胞涵盖了成体细胞和胚胎干细胞。
这种祖细胞可以是一种间充质的祖细胞。
该祖细胞可以是一个内源性或外源性的胚胎的、或成体间充质的、或间充质的祖细胞。该祖细胞可以是一种多能间质细胞。该祖细胞可以是一种成体未分化的间充质祖细胞。
该祖细胞可以是一种软骨祖细胞。
这些祖细胞可以衍生自骨髓。可替代地，这些祖细胞可以衍生自软骨、滑膜组织、肌肉、脂肪组织、皮肤、脐带、牙髓、或其他可获得的来源。
这些祖细胞可以是一种体细胞，例如被内源性因子抑制分化的结缔组织细胞。
在另一个实施方案中，这些祖细胞是富集Stro-1bri的细胞、或同质的Stro-1bri细胞、或Stro-1bri子代细胞的群体。
一种类型的祖细胞是一种间充质的祖细胞（MPC）。最初地衍生自骨髓，MPC和MPC样细胞已经被鉴定出存在于大量的成体组织中并且可以从其中分离出，其中它们被假定执行了替换和再生局部细胞的功能，这些局部细胞由于正常的组织更新、损伤、或老化而损失。这些组织包括脂肪、骨膜、滑膜、滑液（SF）、肌肉、真皮、乳牙、周皮细胞、骨小梁、髌下脂肪体以及关节软骨。
MPC可以反过来由一系列体外特征进行定义，这些特征包括表型标志物和多潜能的分化功能特性的组合。
尽管塑料附着对于间充质细胞而言是最常使用的并且是简单的分离操作，不同的阳性和阴性表面标志物（例如Stro-1、CD146/黑色素瘤细胞粘附分子、CD271/低亲和力神经生长因子、以及阶段特异性胚胎抗原-4）也已经被用于富集MPC产量和同质性。此外，另一组表面标志物，包括CD140b（血小板衍生的生长因子受体-D）、CD340（HER-2/erbB2）、以及CD349（卷曲蛋白-9（frizzled-9)）与CD217相结合也可以用于MPC富集。
其他的祖细胞包括鼠祖细胞，包括细胞系C3H10T1/2和ATDC5或M111祖细胞。C3H10T1/2是由具有成纤维细胞样形态学的雌性C3H/He小鼠品系所衍生的骨髓祖干细胞系。ATDC5细胞是具有上皮细胞样形态学的小鼠胚胎衍生的软骨祖细胞系。
C3H10T1/2细胞系是在1973年从14至17天大的C3H小鼠胚胎建立的。这些细胞在细胞培养中展示了成纤维细胞的形态学，并且功能类似于间充质的干细胞。用5-氮杂胞苷抑制C3H10T1/2细胞中的甲基化产生了肌肉、脂肪、骨骼、或软骨细胞的稳定的形态学和生物化学特征。提示了这种表型的变更是由响应于阻断甲基化的内源基因的激活引起的。此外，已经显示骨形态发生蛋白4（BMP4），转化生长因子型β超级家族的一个成员，可以诱导将C3H10T1/2细胞定型为前脂肪细胞，当经历一个脂肪分化的科学试验计划时，发展成该脂肪细胞表型的细胞（Tang Qi-Qun,Otto TC,Lane MD.Commitment of C3H10T1/2pluripotentstem cells to the adipocyte lineage.Pro Natl Acad Sci USA,2004;101:9607–9611）。
这种ATDC5细胞系最初是从AT805畸胎癌的一种分化的培养株中分离的。ATDC5细胞在生长期表达一种成纤维细胞表型。有关这种ATDC5细胞系的其他信息可见于Atsumi T,Miwa Y,Kimata K,Ikawa Y.A chondrogenic cell line derived from adifferentiating culture of AT805 teratocarcinoma cells.Cell Differ Dev.1990;30:109-16。
这些祖细胞可以是富集Stro-1bri的细胞群。这些祖细胞可以是同质的Stro-1bri细胞，或Stro-1bri子代细胞。
Stro-1bri细胞是在骨髓、血液、牙髓细胞、脂肪组织、皮肤、脾脏、胰、脑、肾、肝、心、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、淋巴结、胸腺、骨骼、韧带、腱、骨骼肌、真皮、以及骨膜中发现的细胞；并且是能够典型地分化成多个种系，例如中胚层和/或内胚层和/或外胚层。因此，Stro-1bri细胞能够分化成大量的细胞类型，包括但不限于：脂肪的、骨的、软骨的、弹性的、肌肉的、以及纤维的结缔组织。这些细胞进入的特异性谱系定型和分化途径取决于不同的影响，这些影响来自于机械影响和/或内源性生物学活性因子，例如生长因子、细胞因子、和/或由宿主组织建立的局部微环境条件。因此，Stro-1bri细胞可以是非造血祖细胞，这些祖细胞分裂生成子细胞，这些子细胞是干细胞或前体细胞，它们将及时地不可逆地分化生成一种表型细胞。
在另一个实施方案中，这些Stro-1bri细胞是从一种样品富集的，该样品从一位受试者获得，例如有待治疗的受试者或相关的受试者或不相关的受试者（无论是相同的物种还是不同的物种）。术语“富集的”、“富集”或它们的变体在此用于说明一群细胞，当与未处理的群体相比时其中的一种特定细胞类型的比例或多种特定细胞类型的比例是增加的。
在另一个实施方案中，在本发明中使用的细胞逐个地或共同地表达了一种或多种标志物，这种或这些标志物选自下组，其组成为：TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+、CD45+、CD146+、3G5+或它们的任何组合。
“逐个地”一词是指本发明分开地涵盖了所述的标志物或多个标志物的组，并且是指尽管单独的标志物或多个标志物的组可能并未在此分开列出，所附的权利要求可以分开地定义此类标志物或多个标志物的组并且可以彼此分开。
“共同地”一词是指本发明涵盖了任何数目或组合的所述的标志物或多个肽的组，并且是指尽管此类数目的或组合的标志物或多个标志物的组未能在此确切地列出，所附的权利要求可以分开地定义此类组合或亚组合，并且可以与标志物或标志物的组的任何其他组合分开。
在一个实施方案中，这些Stro-1bri细胞额外地是TNAP+、VCAM-1+、THY-1+、STRO-2+和/或CD146+中的一种或多种。
对于一种给定的标志物被称为是“阳性”的细胞，它可以表达低水平（lo或暗）或高水平（亮，bri）的这种标志物，这取决于该标志物在细胞表面上存在的程度，其中这些术语涉及在细胞分选过程中所使用的荧光强度或其他标志物。Lo（或暗或弱）与bri的区别应当在有待分选的一种特定的细胞群上所使用的标志物的背景下进行理解。对于给定的标志物称为“阴性”的一种细胞并不是该细胞完全不存在的。这些术语是指该标志物以一个相对非常低的水平由该细胞表达，并且它在可检测地标记时产生一个非常低的信号或是可检测高于背景水平。
术语“亮”当在此使用时是指在细胞表面上的一种标志物，它在可检测地标记时产生了一个相对高的信号。尽管不希望被理论束缚，提出“亮”的细胞与该样本中其他细胞相比表达更多的靶标志物蛋白（例如，被STRO-1识别的抗原）。例如，STRO-1bri细胞当用一种FITC-偶联的STRO-1抗体进行标记时与不亮的细胞（STRO-1弱/暗）相比产生了一种更大的荧光信号，正如通过荧光激活的细胞分选（FACS）分析所确定。在一个实施方案中，“亮”的细胞构成了至少约0.1%的最多亮标记的、包含在起始样品中的骨髓单核细胞。在另一个实施方案中，“亮”的细胞构成了至少约0.1%至少约0.5%、至少约1%至少约1.5%、或至少约2%的最亮标记的包含在起始样品中的骨髓单核细胞。在另一个实施方案中，STRO-1亮细胞相对于“背景”（即STRO-1-细胞）具有2个对数量级的更高表达的STRO-1表面表达。通过比较，STRO-1暗和/或STRO-1中间体细胞所具有的与2个对数量级更高表达的STRO-1表面表达更低，典型地是约1个对数或低于“背景”。
如在此所使用的，术语“TNAP”旨在涵盖组织非特异性碱性磷酸酶的所有同种型。例如，该术语涵盖了肝同种型（LAP）、骨同种型（BAP）和肾同种型（KAP）。在另一个实施方案中，该TNAP是BAP。在另一个实施方案中，如在此所使用的，TNAP是指一种可以与由以下杂交瘤细胞系产生的STRO-3抗体相结合的分子，该杂交瘤细胞系在布达佩斯条约的规定下于2005年12月19日保藏于ATCC，保藏登录号为PTA-7282。
此外，在另一个实施方案中，这些Stro-1bri细胞能够产生克隆性CFU-F。
在一个实施方案中，显著比例的多潜能细胞能够分化成至少2种不同的种系。这些多潜能细胞可以定型的谱系的非限制性例子包括骨前体细胞；肝祖细胞，它们对于胆管上皮细胞和肝细胞是多能的；神经限制的细胞，它们能够生成神经胶质细胞前体，该细胞前体发展成少突胶质细胞和星形胶质细胞；神经元前体，它们发展成神经元；心肌和心肌细胞的前体，葡萄糖应答胰岛素分泌型胰腺β-细胞系。其他谱系包括但不限于：成齿质细胞、生成牙本质的细胞以及软骨细胞、以下以下各项的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞（例如，角质化细胞）、树突细胞、发囊细胞、输尿管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌的细胞、睾丸祖细胞、血管上皮细胞、腱细胞、韧带细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓间质细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、周皮细胞、血管细胞、上皮细胞、神经胶质细胞、神经元细胞、星形胶质细胞以及少突胶质细胞。
在另一个实施方案中，这些Stro-1bri细胞当培养时不能产生造血细胞。
在一个实施方案中，这些细胞是从有待治疗的患者处获得的，使用标准技术进行体外培养，并且用于获得扩展出的细胞用于作为一种自体的或异体的组合物给予该受试者。在一个可替代的实施方案中，使用了这些已建立的人类细胞系中一种或多种的细胞。在本发明的另一个有用的实施方案中，使用了一种非人类动物的细胞（或若该患者不是人类，则来自另一个物种）。
本发明也考虑使用获自或衍生自Stro-1bri细胞和/或它们的子代细胞（后者也称为扩展出的细胞）的上清液或可溶的因子，它们是由与这些祖细胞相组合进行体外培养而产成的。本发明的扩展出的细胞可以具有多种多样的表型，这取决于培养条件（包括在培养基中的数目和/或刺激因子的类型）、传代次数、以及类似因素。在某些实施方案中，这些子代细胞是在约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9、或约10次传代后从亲本群体获得的。然而，这些子代细胞可以在任何次数的传代之后从亲本群体获得的。
这些子代细胞可以通过在任何适当的介质中培养来获得。如在提及一种细胞培养物时所使用的，术语“介质”包括在这些细胞周围的环境的组分。介质可以是固体、液体、气体或多种相和物质的混合物。介质包括液体生长培养基连同不能维持细胞生长的液体培养基。介质也包括凝胶状的介质，例如琼脂、琼脂糖、明胶以及胶原基质。示例性的气体介质包括将在培养皿上或其他固体或半固体支持物上生长的细胞暴露至的气相。术语“介质”也指以下材料，该材料旨在用于一种细胞培养中，即使它还没有与细胞进行接触。换言之，一种准备用于细菌培养的营养丰富的液体是一种介质。当与水或其他液体混合时变成适于细胞培养的一种粉末混合物可以称为“粉末介质”。
在一个实施方案中，对于本发明的方法有用的子代细胞是使用标记了STRO-3抗体的磁珠、通过将TNAP+STRO-1+多潜能细胞从骨髓分离、并接着培养扩展这些分离的细胞而获得的（参见Gronthos et al.Blood85:929-940,1995用作适当培养条件的一个例子）。
在一个实施方案中，此类扩展出的细胞（子代）（可任选的是至少5代之后）可以是TNAP-、CC9+、HLA类I+、HLA类II-、CD14-、CD19-、CD3-、CD11a-c-、CD31-、CD86-、CD34-和/或CD80-。然而，有可能的情况是在不同的培养条件下对于在此说明的那些细胞不同的标志物的表达可以发生变化。而且，尽管这些表型的细胞在扩展出的细胞群中可以占绝大多数，它并不意味着存在着较少比例的不具有这种或这些表型的细胞（例如，小百分比的扩展出的细胞可以是CC9-）。在一个实施方案中，扩展出的细胞仍然具有分化成不同细胞类型的能力。
在一个实施方案中，用于获得上清液或可溶性因子或细胞本身的扩展的细胞群所包括的细胞至少25%是CC9+，在另一个实施方案中至少50%CC9+。
在另一个实施方案中，用于获得上清液或可溶性因子、或细胞本身的扩展出的细胞群所包括的细胞至少40%是STRO-1+，在另一个实施方案中至少45%是STRO-1+。
在另一个实施方案中，这些扩展出的细胞可以表达一种或多种标志物，这种或这些标记物共同地或逐个地选自下组，其组成为：LFA-3、THY-1、VCAM-1、ICAM-1、PECAM-1、P-选择素、L-选择素、3G5、CD49a/CD49b/CD29、CD49c/CD29、CD49d/CD29、CD90、CD29、CD18、CD61、整联蛋白β6-19、血栓调节蛋白、CD10、CD13、SCF、PDGF-R、EGF-R、IGF1-R、NGF-R、FGF-R、瘦蛋白-R（STRO-2=瘦蛋白-R）、RANKL、STRO-1亮和CD146或这些标志物的任何组合。
在一个实施方案中，衍生自STRO-1bri细胞的子代细胞对于标志物Stro-1暗是阳性的。这些细胞被称为组织特异性定型细胞（TSCC），并且与STRO-1bri相比细胞更致力于分化，因此不太能应答诱导因子。TSCC可能被定型的谱系的非限制性例子可以包括肝祖细胞，它们对于胆管上皮细胞和肝细胞是多能性的；神经限制的细胞，它们能够生成神经胶质细胞前体，该细胞前体发展成少突胶质细胞和星形胶质细胞；以及神经元前体，它们发展成神经元；心肌和心肌细胞的前体，葡萄糖应答胰岛素分泌型胰腺β-细胞系。其他定型的前体细胞包括但不限于：软骨细胞，成骨细胞，成牙本质细胞，生成牙本质的细胞以及软骨细胞，以及以下各项的前体细胞：视网膜色素上皮细胞、成纤维细胞、皮肤细胞（例如，角质化细胞）、树状突细胞、毛囊细胞、输尿管上皮细胞、平滑肌和骨骼肌的细胞、睾丸祖细胞、血管内皮细胞、肌腱细胞、韧带细胞、软骨细胞、脂肪细胞、成纤维细胞、骨髓间质细胞、破骨细胞和造血-支持间质细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、骨骼肌细胞、周皮细胞、血管细胞、上皮细胞、神经胶质细胞、神经元细胞、星形胶质细胞以及少突胶质细胞。前体包括可以特异性地导向结缔组织的那些前体，特别是包括脂肪组织、蜂窝组织、骨组织、软骨组织、弹性组织以及纤维结缔组织。
在另一个实施方案中，这些子代细胞是如WO2006/032092中所定义和/或说明的多潜能扩展出的STRO-1+多潜能细胞子代（MEMP）。用于制备衍生出子代的、STRO-1+多潜能细胞的富集群的方法可以在WO01/04268和WO2004/085630中说明。在一种体外的背景中，STRO-1+多潜能细胞将很少作为一种绝对纯的制备物出现，并且将通常与其他细胞一起出现，这些其他细胞是组织特异性定型细胞（TSCC）。WO01/04268涉及从骨髓以约0.1%至90%的纯度水平收获此类细胞。衍生出子代的、包括祖细胞的群体可以直接从组织来源获得，或可替代地，它可以是一个已经在体外扩展出的群体。
例如，这种子代是可以从一种收获的、未扩展的、基本上纯的STRO-1+多潜能细胞群获得的，包括它们所在群体的总细胞的至少约0.1%、1%、5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或95%。这个水平可以通过以下方式达到，例如，通过选择对至少一种标志物呈阳性的细胞，该标记物逐个地或共同地选自下组，其组成为：TNAP、STRO-1亮、3G5+、VCAM-1、THY-1、CD146和STRO-2。
MEMPS可以与新收获的Stro-1bri细胞进行区别，因为它们对于标志物STRO-1bri是阳性的并且对于标志物碱性磷酸酶（ALP）是阴性的。相比之下，新分离的Stro-1bri细胞对STRO-1bri和ALP这两者都是阳性的。在本发明的另一个实施方案中，至少5%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%的所给予的细胞具有表型STRO-1bri、ALP-。在另一个实施方案中，这些MEMPS对于以下标志物中的一种或多种是阳性的，这些标志物是：Ki67、CD44和/或CD49c/CD29、VLA-3、α3β1。在又另一个实施方案中，这些MEMPs未展示出TERT活性和/或对于标志物CD18是阴性的。
这种Stro-1bri细胞起始群可以衍生自任何一种或多种组织类型，包括骨髓、牙髓细胞、脂肪组织和皮肤、或可能更广泛地来自脂肪组织、牙齿、牙髓、皮肤、肝、肾、心脏、视网膜、脑、毛囊、肠、肺、脾脏、淋巴结、胸腺、胰、骨骼、韧带、骨髓、腱以及骨骼肌。
应当理解，在进行本发明中，分离带有任何给定细胞表面标志物的细胞可以受到许多不同的方法的影响，然而某些方法依赖于将一种结合剂（例如，一种抗体或它的抗原结合片段）结合到所关心的标志物上、之后跟随展示出结合的那些物质的分离，该结合是高水平的结合、或是低水平的结合或者不结合。最便捷的结合剂是抗体或基于抗原的分子，优选地是单克隆抗体或基于单克隆的抗体，这是由于后面这些试剂的特异性的缘故。抗体可以用于两个步骤，然而其他试剂也是可以使用的，因此也可以采用这些标志物的配体从而富集带有它们、或缺乏它们的细胞。
可以将这些抗体或配体连接到一种固体支持物上，从而允许一种粗分离。这些分离技术优选地将有待收集的馏分的活力的保留最大化。可以采用不同效率的不同技术来获得相对粗的分离。所采用的具体的技术将取决于分离的效率、相关联的细胞毒性、实行的容易程度和速度、以及对复杂设备和/或技术技能的需要。用于分离的操作可以包括但不限于：磁性分离（使用抗体涂覆的磁珠）、亲和层析以及用连接到固体基质上的抗体进行“淘选”。提供精确分离的技术包括但不限于FACS。用于进行FACS的方法对于本领域的普通技术人员是清楚的。
对抗在此说明的标志物中每一种的抗体是可商购的（例如，对抗STRO-1的单克隆抗体是可以从R&D Systems,USA商购）、从ATCC或其他保藏机构获得和/或可以使用本领域公认的技术进行生产的。
优选的是用于分离Stro-1bri细胞的方法，例如包括第一步是使用例如磁性激活细胞分选（MACS）、识别高水平表达的STRO-1的一个固相分选步骤。然后，可以进行第二个分选步骤，该步骤应该是令人希望的，从而造成更高水平的前体细胞表达。这种第二个分选步骤可能涉及使用两种或多种标志物。
获得Stro-1bri细胞的方法还可以包括在第一个富集步骤之前使用已知的技术来收获该细胞的来源。因此，该组织将通过手术除去。然后，将包含该来源组织的细胞分成一种所谓的单细胞悬浮液。这种分离是可以通过物理和/或酶促的方法来实现的。
一旦已经获得一种适当的Stro-1bri细胞群，可以通过任何适当的手段进行培养或扩展来获得MEMP。
在一个实施方案中，这些细胞是从有待治疗的受试者获得的，使用标准技术进行体外培养并且用于获得上清液或可溶性因子或扩展出的细胞，用于作为一种自体的或异体的组合物给予该受试者。在一个可替代的实施方案中，使用这些已建立的人类细胞系中一种或多种细胞系的细胞来获得这些上清液或可溶的因子。在本发明的另一个有用的实施方案中，使用一种非人类动物的细胞（或若该患者不是人类，则来自其他物种）来获得上清液或可溶的因子。
本发明可以使用来自任何非人类的动物物种的细胞来进行，这些非人类的动物物种的细胞包括但不限于：非人类的灵长类动物细胞、有蹄动物、犬科动物、猫科动物、兔形目动物、啮齿动物、禽类和鱼类的细胞。本发明可以使用来进行的灵长类动物细胞包括但不限于：黑猩猩、狒狒、食蟹猴、以及任何其他新或旧大陆猴（New or Old World monkey）的细胞。本发明可以使用来进行的有蹄动物细胞包括但不限于：牛、猪、绵羊、山羊、马、水牛和野牛的细胞。本发明可以使用来进行的啮齿动物细胞包括但不限于：小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠和沙土鼠的细胞。本发明可以使用来进行的兔形目动物的例子包括家兔、长腿野兔、野兔、白尾野兔、雪鞋兔和鼠兔。鸡（Gallus gallus）是禽类的一个例子，可以使用它来进行本发明。
对于本发明的方法有用的细胞可以在使用之前、或在获得该上清液或可溶的因子之前进行储存。用于保存和储存真核细胞、并且特别是哺乳动物细胞的方法和科学试验计划在本领域内是已知的（参见，例如Pollard,J.W.and Walker,J.M.(1997)Basic CellCulture Protocols,Second Edition,Humana Press,Totowa,N.J.;Freshney,R.I.(2000)Culture of Animal Cells,Fourth Edition,Wiley-Liss,Hoboken,N.J.）。
遗传修饰的细胞
在一个实施方案中，这些Stro-1bri细胞和/或它们的子代细胞是被遗传修饰的，从而例如表达和/或分泌一种感兴趣的蛋白，例如一种提供治疗益处和/或预防性益处的蛋白，例如，胰岛素、高血糖素、生长抑素、胰蛋白酶原、糜蛋白酶原、弹性蛋白酶、羧肽酶、胰脂肪酶或淀粉酶、或与增强的血管新生相关联或其成因的一种多肽、或与一种细胞分化成胰细胞或血管细胞相关联的一种多肽。
用于遗传修饰细胞的方法对于普通技术人员而言将是清楚的。例如，将有待在细胞中表达的一种核酸可操作地连接到一种启动子上用于在该细胞中诱导表达。例如，将该核酸连接到一种启动子上，该启动子在受试者的不同细胞中是可操作的，例如病毒启动子，例如CMV启动子（例如，CMV-IE启动子）或SV-40启动子。额外的适当的启动子在本领域内是已知的，并且应当被认为参照本发明的现有实施方案进行施用。
在一个实施方案中，该核酸以一种表达构建体的形式提供。如在此所使用的，术语“表达构建体”是指一种核酸，该核酸在细胞中具有在与其可操作地连接的核酸上赋予表达的能力（例如，报告基因和/或可以反选择的报告基因）。在本发明的上下文中，应当理解，一种表达构建体可以包括或者是一种质粒、噬菌体、噬菌粒、黏粒、病毒亚基因组的或基因组的片段，或能够以一种可表达的形式保持和/或复制异源DNA的其他核酸。
用于构建一种适当的表达构建体来进行本发明的的方法对于普通技术人员而言应该是清楚的，并且说明于例如Ausubel等人的文件中（在：Current Protocols inMolecular Biology.Wiley Interscience,ISBN 047 150338,1987），或Sambrook等人的文件（在:Molecular Cloning:Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratories,New York,Third Edition2001）。例如，该表达构建体的元件中每一种元件是使用例如PCR从一种适当的模板核酸扩增的，并且随后被克隆到一种适当的表达构建体中，例如像，一种质粒或噬菌粒。
适用于这种表达构建体的载体在本领域内是已知的和/或在此进行了说明。例如，在哺乳动物细胞中一个适用于本发明的方法的表达载体是例如pcDNA载体套件的载体（由Invitrogen提供）、pCI载体套件的载体（Promega）、pCMV载体套件的载体（Clontech）、pM载体（Clontech）、pSI载体（Promega）、VP16载体（Clontech）或pcDNA载体套件的载体（Invitrogen）。
专业的行家应该知道额外的载体以及此类载体的来源，例如InvitrogenCorporation、Clontech或Promega。
用于将这种分离的核酸分子或包括以上物质的一种基因构建体引入到细胞中用于表达的手段对于本领域的普通技术人员而言是已知的。用于一种给定的生物体的技术取决于已知的成功的技术。用于将重组DNA引入到细胞中的手段除了其他之外还包括微注射、由DEAE-葡聚糖介导的转染、由脂质体介导的转染（例如通过使用Lipofectamine（Gibco,MD,USA）和/或Cellfectin（Gibco,MD,USA)）、PEG-介导的DNA摄取、电穿孔和微粒轰击（例如通过使用DNA-涂覆的钨或金颗粒（Agracetus Inc.,WI,USA)）。
可替代地，本发明的一种表达构建体是一种病毒载体。适当的病毒载体在本领域内是已知的并且是可商购的。用于递送一种核酸并且将该核酸整合到宿主细胞基因组中的常规的基于病毒的系统包括例如一种逆转录病毒载体、慢病毒载体或腺相关病毒载体。可替代地，一种腺病毒载体对于引入一种核酸是有用的，该核酸仍然是附加型地进入宿主细胞中。病毒载体是在靶细胞和组织中一种有效的和多用途的基因转移方法。额外地，已经在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到高转导效率。
例如，一种逆转录病毒载体大体上包括顺式作用长末端重复（LTR），其中包装能力达到6kb至10kb的外来序列。最小的顺式作用LTR对于载体的复制和包装是足够的，然后用它将该表达构建体整合到该靶细胞中从而提供长时程表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒（MuLV）、长臂猿白血病病毒（GaLV）、猴免疫缺陷病毒（SrV）、人免疫缺陷病毒（HIV）、以及它们的组合的那些载体（参见，例如Buchscher et al.,J Virol.56:2731-2739(1992)；Johann et al,J.Virol.65:1635-1640(1992);Sommerfelt et al,Virol.76:58-59(1990)；Wilson et al,J.Virol.63:274-2318(1989);Miller et al.,J.Virol.65:2220-2224(1991)；PCT/US94/05700;Miller and Rosman BioTechniques7:980-990,1989;Miller,A.D.Human Gene Therapy7:5-14,1990；Scarpa et alVirology75:849-852,1991;Burns et al.Proc.Natl.Acad.Sci USA90:8033-8037,1993）。.
也已经开发了不同的腺病毒相关联的病毒（AAV）载体系统用于核酸递送。使用本领域中已知的技术可以容易地构建AAV载体。参见例如美国专利No.5,173,414和No.5,139,941；国际公开号WO92/01070和WO93/03769；Lebkowski et al.Molec.Cell.Biol.5:3988-3996,1988；Vincent et al.(1990)Vaccines90(Cold Spring Harbor LaboratoryPress)；Carter Current Opinion in Biotechnology 5:533-539,1992；Muzyczka.Current Topics in Microbiol,and Immunol.158:97-129,1992；Kotin,HumanGene Therapy5:793-801,1994；Shelling and Smith Gene Therapy7:165-169,1994；以及Zhou et al.J Exp.Med.179:1867-1875,1994。
对于递送本发明的一种表达构建体有用的额外的病毒载体包括例如衍生自病毒的pox家族的那些，例如牛痘病毒和禽痘病毒、或一种甲病毒属病毒、或一种偶联的病毒载体（例如，在Fisher-Hoch et al.,Proc.Natl Acad.Sci.USA 56:317-321,1989中所说明的）。
在另一个实施方案中，这些祖细胞是富集Stro-3bri的细胞、或同质的Stro-3bri细胞、或Stro-3bri子代细胞的群体。
多硫酸化多糖
本发明也涉及多硫酸化多糖化合物的用途。
该多硫酸化多糖家族可以被认为是任何天然发生的或半合成的/合成的多硫酸化多糖、或它的一种生物学活性片段，它含有两个或多个糖环或碳水化合物结构，其中一个或多个硫酸酯基团与它共价连接，正如通过肝素和多硫酸戊聚糖所例证。
落在本发明范围内的硫酸化多糖的例子是天然发生的高分子量肝素、低分子量肝素、硫酸乙酰肝素、多硫酸戊聚糖、多硫酸软骨素、多硫酸壳聚糖、多硫酸皮肤素舒洛地昔、多硫酸葡聚糖、多硫酸化胰岛素（polysulfated inulin）、硫酸化乳糖酸酰胺、硫酸化双糖醛酸酰胺、八硫酸蔗糖、墨角藻聚糖-1、墨角藻聚糖-2、硫酸化的β-环糊精、硫酸化的γ-环糊精以及小的硫酸化的化合物，包括但不限于肌醇六硫酸酯。
多硫酸化多肽的一个特别的列表是：多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖钙、多硫酸戊聚糖镁、多硫酸戊聚糖钠、多硫酸化软骨素以及多硫酸葡聚糖。
适合于本发明的多糖的其他例子包括多硫酸化多糖、多硫酸化葡聚糖、多硫酸化环葡聚糖、多硫酸化软骨素、以及多硫酸戊聚糖（作为它的碱金属或碱土金属盐，例如它的钙或钠盐，过渡金属例如铜和锌、以及贵金属例如铂）。其他例子是均多糖或杂多糖的多硫酸化多糖衍生物，它们可以是线性的或分支的。这些糖可以来自但不限于：戊糖类或己糖类，例如半乳糖、甘露糖、葡萄糖、鼠李糖、果糖、山梨糖、木糖、D-阿拉伯糖、核糖、L-阿拉伯糖、葡糖醛酸以及它们的衍生物。
本发明还涵盖了多硫酸化多糖、或多硫酸化多糖的类似物或衍生物的生物学活性分子片段。
一种多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖（PPS）。PPS的基本结构是由多个戊糖形成的，即在统计学上每第10个单元上包含葡糖醛酸基团的（1→4）连接的β-D-吡喃木糖单元。
以下显示的是从山毛榉材半纤维素（欧洲水青冈木）分离的多硫酸戊聚糖（PPS）的结构式。该化学式显示多硫酸戊聚糖的线性木聚糖（戊聚糖）主链含有平均一个4-O-甲基-葡糖醛酸酯侧链，该侧链连接到每第10个木糖（戊糖）环上的2-位置上。
PPS的钙和镁衍生物（CaPPS或MgPPS）是当R=SO3-Ca+1/2或Mg+1/2时。该钠衍生物是当R=SO3-Na时。
多硫酸戊聚糖（作为它的钙盐或钠盐）具有的平均分子量为约5700道尔顿，并且硫含量为约16%。自从二十世纪六十年代早期，该化合物已知是一种合成的肝素样物质以及抗血栓形成剂。
这些具体的络合离子可以选自下组，其组成为：碱金属（例如Na+，和K+）、碱土金属（例如，Ca2+、Zn2+、Mg2+、Ba2+）、连同Ag+、Au+、Pb2+、Cu2+、Au2+、Pd2+、Pd4+、Pt4+、Pt2+、三价金属离子、以及季铵化合物络合物。后者化合物的例子是氯化吡啶鎓（pyridinium chloride）、四烷基氯化铵、氯化胆碱、西吡氯铵、N-十六烷基-N,N,N-三烷基氯化铵或它们的衍生物。在一个具体的实施方案中，使用了这种钙络合物。
这些多硫酸化多糖-金属络合物的制备详细地说明于美国专利5,668,116中，其全部披露通过引用结合在此。
涉及多硫酸化多糖和PPS的其他信息可见于WO02/41901，其全部披露通过引用结合在此。其他信息还可见于Semin Arthritis Rheum.1999Feb;28(4):211-67 Ghosh-Thepathobiology of osteoarthritis and the rationale for the use of pentosanpolysulfate for its treatment，其全部披露通过引用结合在此。
在一个实施方案中，该多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖钠。这种情况的一个例子是SP54，由德国的Bene Pharmachem制造，它是一种多糖，用硫酸酯化，更确切地说多硫酸戊聚糖钠。多硫酸戊聚糖钠的半合成制备确信是以一个确定范围的分子量（4000至6000道尔顿）进行连贯且可重现地制造的。
另一种多硫酸化多糖是多硫酸化软骨素。这种情况的一个例子是Arteparon RTM（Luitpold-Werk的商标），它主要由多硫酸化软骨素组成。它已经用作一种抗关节炎药物。更确切地，它是一种异质的半合成多硫酸葡糖胺多糖，其中这种主导的（约93%）二糖重复单元是与半乳糖胺进行糖苷键连接的己糖醛酸。Arteparon的二糖重复单元的游离羟基基团中有大约4个被硫酸根基团酯化从而给出按重量计约13.0%的硫含量。该商业制剂具有的分子量为约10,000道尔顿。.
这些多硫酸化多糖-金属络合物的制备详细地说明于美国专利5,668,116，其全部披露通过引用结合在此。
涉及多硫酸化多糖和PPS的其他信息可见于WO02/41901，其全部披露通过引用结合在此。其他信息可见于Semin Arthritis Rheum.1999Feb;28(4):211-67 Ghosh-Thepathobiology of osteoarthritis and the rationale for the use of pentosanpolysulfate for its treatment，其全部披露通过引用结合在此。.
具体而言，制造、分离和纯化的方法与适当的载体组合物和配制品一起结合到本应用中。
其他信息还可见于Ghosh P,Edelman J,March L and Smith M.Effects ofpentosan polysulfate in osteoarthritis of the knee:A randomised,double blind,placebo-controlled pilot study.Current Therapeutic Research,2005,66:552–571，并且它提供了有关OA临床研究、通过肌内注射使用所给定的PPS的信息。有关PPS的信息、以及在该试验中所使用的方法（包括剂量方案和给药方法）由此通过引用结合于本申请中。
αIX胶原的非胶原NC4结构域
根据另一个实施方案，所选择的多肽是αIX胶原的一种非胶原的NC4结构域或它的一种生物学活性分子片段。有关适当的NC4结构域多肽的具体信息可见于国际申请PCT/AU2004/000788，其内容以其全文进行结合。
具体而言，PCT/AU2004/000788披露了多种多肽和它们的序列，它们可以在本发明中以表达和纯化这些多肽的多种方法进行使用。因此，PCT/AU2004/000788包括适当的NC4结构域多肽的例子以及制备它们的方式，它们确切地结合到本申请中。具体而言，如第7页第24行至第8页第6行给出的氨基酸序列与如图1至7中给出的序列一起明确地结合到本申请中。而且，如第9页第10行至第10页第36行给出的回收多肽的方法明确地结合到本申请中。在第15页的具体说明中给出的自溶技术连同在第18页的具体说明中给出的分离和回收步骤、以及在第20至24页中明确地给出的多肽结合到本发明中。最后，图7的部分氨基酸序列结合到本申请中。
如上所说明，该NC4结构域在PCT/AU2004/000788中进行讨论。它包括从该基因序列预测的、以及通过在大肠杆菌中进行表达所获得的完整的氨基酸序列（参见表1）。
然而，应当注意到通过使用乳酸克鲁维斯酵母进行表达所获得的这些蛋白产物是由全长人类NC4加上一种截短形式（MW=24kDa）组成的，其中这两种形式均被糖基化，这些也包括在表1中并且这些制剂和ID在方法部分中进行了说明。大肠杆菌和乳酸克鲁维斯酵母这两者表达的蛋白在动物模型中并且在体外测定中进行评估，并且可以对应地由编码AWR-01和PBA-1200P进行鉴定。在这些实验中使用的祖细胞是小鼠ATDC5，该细胞如在方法部分中所讨论的是可商购的。所使用的分化的细胞包括：来自人类关节软骨的软骨细胞，正常的绵羊和猪的软骨、以及软骨细胞和滑膜成纤维细胞（衍生自经历全关节置换手术的OA患者的滑液组织）。具体而言，以下序列也定义了在本申请中使用的多肽。
表1-感兴趣的氨基酸序列但不显示N或O糖基化作用SEQUENCE ID No:1
1)hNC4:（全长人类NC4，无信号肽）
SEQUENCE ID No:2
2)通过假定的脯氨酸肽链内切酶的作用在表达期间从乳酸克鲁维斯酵母培养物获得的截短的hNC4（残基7至224）：
3)粗体加下划线的序列，它们通过蛋白组学进行鉴定并且说明于专利申请PCT/AU2004/000788中
SEQUENCE ID No:94
1Met Lys Thr Cys Trp Lys Ile Pro Val Phe Phe Phe Val Cys Ser16 PheLeu Glu Pro Trp Ala Ser Ala23Ala Val Lys Arg Arg Gly Ile Val Ala Thr Ile Pro Thr Arg Asn Leu Tyr Pro Ser 106 Gly Leu Lys AsnAsn 151Gln Val Ser Arg Gly211ProIle Asp Ile Asp Gly Phe Ala Val Leu Gly Lys Leu Ala Asp 226 Asn Pro Gln ValSer Val Pro Phe Glu Leu Gln Trp Met Leu Ile 241 His Cys Asp Pro Leu Arg ProArg Arg Glu Thr Cys His Glu Leu 256 Pro Ala Arg Ile Thr Pro Ser Gln Thr ThrAsp Glu Arg 268
粗体加下划线的来自SEQ ID No:94的序列，这些序列通过蛋白质组学得到鉴定并且说明于专利申请PCT/AU2004/000788中
起始位置-
29-Pro Arg Phe Pro Val Asn Ser Asn Ser Asn Gly[SEQ ID No:95]
41-Asn Glu Leu Cys Pro Lys[SEQUENCE ID No:96]
48-Arg Ile Gly Gln Asp Asp Leu Pro Gly Phe Asp Leu Ile Ser Gln PheGln[SEQUENCE ID No:97]
66-Asp Lys Ala Ala Ser Arg Arg Ala Ile Gln Arg Val Val Gly Ser[SEQUENCE ID No:98]
83-Leu Gln Val Ala Tyr Lys Leu Gly Asn Asn Val Asp Phe Arg [SEQUENCEID No:99]
108-Pro Glu Glu Tyr Ser Phe Leu Thr Thr Phe Arg Met Thr Gly Ser ThrLeu[SEQUENCE ID No:100]
126-Lys
128-Trp
130-Ile Trp Gln Ile Gln Asp Ser Ser Gly Lys Glu Gln Val Gly Ile LysIle Asn Gly Gln Thr[SEQUENCE ID No:101]
152-Ser Val
155-Phe Ser Tyr Lys Gly Leu Asp Gly Ser Leu Gln Thr Ala Ala Phe SerAsn Leu[SEQUENCE ID No:102]
174-Ser Leu Phe Asp Ser Gln Trp His Lys Ile Met Ile Gly Val Glu ArgSer Ser Ala Thr Leu Phe Val Asp Cys Asn Arg Ile Glu Ser Leu Pro Ile Lys Pro[SEQUENCE ID No:103]
牛、人、鼠和鸡NC4序列之间的保守序列如下：
SEQ ID NO:3-K/QSVS/V/A/EFSYKG
SEQ ID NO:4-KI/LMIG/SVER/TS/T
SEQ ID NO:5-KLGNNVDFRI
SEQ ID NO:6-R/KI/VES/TLP/NIKPR/KG
SEQ ID NO:7-KH/N/YWS/N/TIWQIQDS/AGK/R
SEQ ID NO:8-K/QSVS/VFSYKG
SEQ ID NO:9-KIMIGVERTS
SEQ ID NO:10-RIESLPIKPRG
SEQ ID NO:11-KH/NWS/NIWQIQDSGK
SEQ ID NO:12-RIGQDDLPGFDLISQFQI/VDKA
SEQ ID NO:13-RH/NLYPN/SGLPEEYSFLTTFR
SEQ ID NO:14-FSNLP/SSLFDSQWHKI
SEQ ID NO:15-RSSATLFVDCNRI
SEQ ID NO:16-KSVSFSYKG
SEQ ID NO:17-KIMIGVERS
SEQ ID NO:18-KLGNNVDFRI
SEQ ID NO:19-RIESLPIKPRG
SEQ ID NO:20-KHWSIWQIQDSSGK
SEQ ID NO:21-RIGQDDLPGFDLISQFQIDKA
SEQ ID NO:22-RHLYPNGLPEEYSFLTTFRM
SEQ ID NO:23-FSNLPSLFDSQWHKI
SEQ ID NO:24-RSSATLFVDCNRI
深冷保存
存在着用于深冷保存祖细胞的不同的技术，这些技术对于本领域的普通技术人员而言是已知的。一个示例性操作如下：
检验：
冷冻前，应该将这些细胞维持在一种活跃的生长状态以确保最高的健康状态以及良好的复苏。理想地，该培养基应当在前一天更换。使用倒置显微镜，快速检查培养物的全貌。寻找微生物污染的迹象。用肉眼寻找小的真菌集落来检验该培养物也是重要的，这些真菌集落可以在介质-空气界面浮动并且因此通过该显微镜不能看到。在冷冻前若将该培养物无抗生素维持至少1周是最好的，从而帮助发现任何隐含的（隐藏的）培养物污染物。
细胞收集和冷冻：
在收集期间轻柔地处理这些细胞，因为在收集期间受损的细胞难以在冷冻和融化过程期间所发生的额外的损伤下存活。你应该能够从一个接近会合的T-75烧瓶中获得高达1.5x107个细胞（取决于细胞类型和会合的程度）。这应该是足以建立2x106细胞/小瓶的至少几个小瓶的细胞。
1.使用一个无菌移液管，去除并且弃去旧培养基。
2.对于T-75烧瓶，用5mL的无钙和无镁的磷酸缓冲盐溶液（CMF-PBS）漂洗该细胞单层以去除所有痕量的胎牛血清。
.3.将4至5mL的胰蛋白酶溶液（在CMF-PBS中）加到该烧瓶中并且允许细胞孵育至少1分钟。（预加温该酶4溶液将减少暴露期）。取出约3mL的胰蛋白酶溶液，并且允许这些细胞变圆并且松开。
4.在倒置相差显微镜上每几分钟检查该酶处理的进展。一旦所有这些细胞已经变圆，轻轻敲打该烧瓶以使它们与塑料表面分开。然后，将5mL的生长培养基加到该细胞悬液中，并且使用同一个移液管剧烈地洗涤来自该培养瓶底部的任何残留的细胞。
5.将悬浮的细胞收集到一个15mL离心管中并且置于冰上。取一个样品计数，并接着以100xg旋转5分钟以获得细胞团（cell pellet）。在这些细胞旋转的同时，进行活细胞计数（使用台盼蓝溶液），并且计算细胞数/mL和总细胞数。
6.将上清液从这些离心的细胞去除，并且将该细胞团块在足够的含有10%DMSO（DMSO最常以5%至15%的终浓度进行使用以给出1至2x106个细胞/mL的终细胞浓度）的深冷保存介质中再次悬浮。
7.用该细胞系、以及日期来标记适当数量的深冷小瓶。然后，将1.5至1.8mL的含有细胞悬液的DMSO加到这些小瓶中的每一个中并且密封。
8.将这些小瓶放入可控速率的冷冻器中过夜。24小时后，这些细胞应当被转移到液氮冷冻器用于永久保存。
9.在你的细胞库记录中记录这些细胞的适当信息。在这些信息中全面详细记录了该培养物的存储条件，这些细节包括以下所有信息：培养物身份、传代或群体翻倍的水平、冷冻日期、所使用的冷冻介质和方法、每个小瓶的细胞数、开始冷冻的小管的总数以及剩余的数目、它们的位置、它们预期的活力以及所进行的全部质量控制实验的结果（无菌度、支原体属、物种、核型、等）。额外的培养物信息，尤其是它的起源、历史、生长参数、特性和应用也是有用的，并且应当在可能时包括在内。
细胞融化和复苏：
1.使用适当的安全设备将该小瓶从它的储存位置移出，并且仔细地检查标签和储存记录以确保它是正确的培养物。将该容器放在温水中轻轻搅拌直到完全融化。快速融化（在37℃下60至90秒）为大多数细胞培养物提供了最好的复苏；它减少或防止在再水化过程中在细胞内形成损伤性的冰晶。
2.因为一些深冷防护剂在延长暴露时可以损伤细胞，尽快地并且尽可能轻柔地去除这些试剂。使用了几种方法，这取决于这些深冷防护剂和细胞的特性。
a)大多数细胞若在6至8小时的融化过程中通过更换介质将该深冷防护剂去除，则正常地复苏。将该安瓿或小管的内含物转移到含有15至20mL培养基的T-75烧瓶、或其他适当的容器中，并且正常地孵育。一旦这些细胞中有大多数已经贴壁（通常3至4小时），去除含有当前稀释的深冷防护剂的培养基并且用新鲜的培养基替换。
b)对于对深冷防护剂敏感的细胞，通过温和离心很容易地完成旧培养基的去除。将该小瓶或安瓿的内含物转移到含有10mL新鲜培养基的15mL离心管中，并且在100xg下旋转5分钟。弃去含有该深冷防护剂的上清液，并且在新鲜的培养基中将该细胞团块再次悬浮。然后，将该细胞悬浮液转移到一个适当的培养容器中并且正常地孵育。
支持基质
在生物学和材料科学中最新的进展已经将组织工程学带到新型软骨修复技术的前沿。自体细胞、专门设计的支架、生物反应器、机械刺激以及生长因子的结合为软骨组织再生提供了有希望的途径。
生物支架模拟的细胞外基质
当前的组织工程学策略提供了衍生自合成的（例如，聚乙醇酸）以及自然衍生的（例如，胶原）物质的支架来形成这种细胞支架构建体。当前，可获得的组织支架产品包括小肠粘膜下层（RestoreTM、猪SIS、DePuy Orthopaedics）、（CuffPatchTM,猪SIS、Organogenesis）、（SIS；Cook Biotech，Inc.）、重新配制的胶原支架（3D CollagenComposite、BD Biosciences）、无细胞的人表皮胶原基质（GraftjacketWrightMedical Technologies）、胎牛真皮（TissueMendStryker）、以及合成的聚合物支架，主要地是聚酯类（例如PGA、PCL、以及PLA）。
近来已经说明的组织工程化的支架包括胶原支架、接种软骨细胞的支架、接种关节软骨细胞的胶原II型-GAG支架[Vickers et al,Tissue Eng.2006May;12(5):1345-55]以及包括聚氧化乙烯（PEO）和壳聚糖的复合支架[Kuo YC etal;J.Biomed Mater ResA.2008 Nov 3]。Nettles DL等人描述的一种可替代的形式[Tissue Eng part A 2008July;14(7):1133-40]是用于软骨基质修复的一种可注射的可交联的弹性蛋白样多肽（ELP）凝胶。.
基质材料的选择取决于生物相容性、可生物降解性、机械特性、外表显现以及界面特性。这些组合物潜在的基质可以是可生物降解的并且化学定义的硫酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、聚乳酸以及聚酐。其他潜在的材料是可生物降解的并且生物学明确定义的，例如骨骼，或真皮胶原。其他基质包括纯蛋白或细胞外基质组分。其他潜在的基质是非生物降解的并且化学定义的，例如烧结的羟基磷灰石、生物玻璃、铝酸盐、或其他陶瓷。基质可以包括以上提及的材料类型中任何的组合，例如聚乳酸与羟基磷灰石、或胶原与磷酸三钙。这些生物陶瓷可以在组合物中得到改变（例如，在钙-铝酸盐-磷酸盐中）并且进行加工以改变孔径、粒径、颗粒形状、以及生物降解能力。
在一个实施方案中，该支架是由一种合成的材料衍生的。在另一个实施方案中，该支架是由自然衍生的材料所衍生的。可替代地，该支架是合成的材料与自然衍生的材料的组合。
在一个实施方案中，并且如在这些例子中所说明，该支持基质是一种胶原海绵。可以将包括这些细胞、多硫酸戊聚糖、可任选地与一种NC4多肽相结合的本发明的组合物植入或输注或灌注入该海绵中。因为海绵可以进行精巧地植入，该海绵被可任选地插入到一种可再吸收的笼子中。
组合物
在所有的例子中，如在此所讨论的组合物和配制品适合于本发明的多糖和/或多肽。具体地，这些组合物和配制品适合于多硫酸化多糖，在一个实施方案中是单独的多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖钙、多硫酸戊聚糖镁和/或多硫酸戊聚糖钠。这些组合物和配制品也适合于在此讨论的这些化合物的组合，例如多糖和/或多肽的组合，以及特别地NC4结构域多肽以及多硫酸戊聚糖以及它的盐类的组合。
根据本发明，包括如在此披露的一种多糖和/或多肽的组合物，特别是多硫酸化多糖可任选地连同NC4结构域，在一个实施方案中，多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖钙和/或多硫酸戊聚糖钠或一种片段或截短的形式是适合于在人类医学和兽医中用于人类或动物，并且将典型地包括一种药学可接受的稀释剂、载体或赋形剂中的任何一种或多种。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域内是熟知的，并且说明于例如Remington′sPharmaceutical Sciences Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)。药用载体赋形剂或稀释剂的选择可以考虑预期的给药途径和标准的药学实践来进行选择。这些药物组合物可以包括作为（或除此之外还包括）该载体、赋形剂或稀释剂、任何适当的粘合剂、滑润剂、悬浮剂（脂质体）、涂层剂、或增溶剂。.
在本领域内熟知的是存在着不同的组合物/配制品的要求，这取决于不同的递药系统。例如，包括一种NC4结构域的多糖和/或蛋白可以溶于盐水中。可替代地，这些化合物可以在一种溶液中制成，该溶液是用一种两份式液体-粉末（使用前混合）提供的。
可植入的（皮下）缓慢释放的胶囊通常用于避孕药，例如ImplanonTM或Depo-ProveraTM注射剂，并且对于给予本发明的一种组合物将是有用的。
在另一个例子中，本发明的组合物可以被配制为适应一台植入的小泵进行递送，其中该组合物典型地是通过连续输注到所希望的位置来进行给药的。
在一个可替代的实施方案中，本发明的组合物可以被注射或通过其他方式胃肠外（例如静脉内、皮下、肌内、关节内、椎间盘内或真皮内）进行植入。在另一个实施方案中，该配制品是通过皮下、真皮内或关节内进行给药的。
皮下和真皮内的配制品还可能含有一种或多种额外的试剂，例如软组织填充剂物质、利多卡因（局部麻醉剂）、基质金属蛋白酶抑制剂、抗氧化剂以及抗炎剂（皮质类固醇类）。
用于真皮内递送药物的不同配制品可以包括以下组分中的一种或多种：白蛋白、缓冲剂、缓冲盐水、缓冲盐溶液、以及麻醉剂（优选局部的）。
本发明延伸到用于治疗在此讨论的疾病的联合治疗。特别地，在一个例子中，本发明延伸到使用一种多硫酸化多糖以及一种多肽用于治疗不同的退行性病症。应当理解，这些试剂可以同时或在不同的时间进行给药。因此，该联合治疗可以包括将这些活性剂一起进行给予，这些活性剂处于单一的配制品中或处于多个配制品中（在相同的或不同的时间给药）。同样地，该联合治疗可以包括在不同的时间以不同的配制品进行给药的活性剂。这些配制品可以进行依次给药，并且可以分开一段时间，包括数小时、数天、数周和数月。
适合注射到动物（例如，真皮内、皮下或肌内）中的示例性配制品包括：
1)一种多硫酸化多糖，在一个实施方案中，多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖钙、和/或多硫酸戊聚糖钠连同多个祖细胞溶解于无菌水中。
2)一种多硫酸化多糖，在一个实施方案中，多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖钙和/或多硫酸戊聚糖钠连同多个祖细胞溶解于0.9%无菌盐水（150mM NaCl）；+/-人白蛋白（0.01%-0.5%）；+/-局部麻醉剂；例子例如盐酸布比卡因（1.25-5mg/ml）；+/-重酒石酸肾上腺素（0.0045-0.0091mg/ml）；+/-利多卡因（0.5-2%）；+/-肾上腺素（1:100,000-1:200,000）。
3)一种多硫酸化多糖，在一个实施方案中，多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖钙和/或多硫酸戊聚糖钠连同多个祖细胞溶解于磷酸缓冲盐溶液；+/-人白蛋白（0.01-0.5%）；+/-局部麻醉剂；137mMNaCl；2.7mM KCl；10mM磷酸盐缓冲液；150mM NaCl；150mM NaH2PO4/Na2HPO4。
4)一种多硫酸化多糖，在一个实施方案中，多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖钙和/或多硫酸戊聚糖钠连同多个祖细胞溶解于磷酸盐-柠檬酸盐缓冲剂（50mM）+/-过硼酸钠（0.03%）；+/-人白蛋白（0.01-0.5%）；+/-局麻药。
5)一种多硫酸化多糖，在一个实施方案中，多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖钙和/或多硫酸戊聚糖钠连同多个祖细胞溶解于一种含有羧甲基纤维素（2.7%）和甘露醇的无菌水的溶液中。
6)一种多硫酸化多糖，在一个实施方案中，多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖钙和/或多硫酸戊聚糖钠连同多个祖细胞，结合到生物相容的聚烷基酰胺水凝胶上（例如Bio-Alcamid由Polymekon S.r.l.制造（米兰,意大利）)。
7)一种多硫酸化多糖，在一个实施方案中，多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖钙和/或多硫酸戊聚糖钠连同多个祖细胞，结合到hylan B凝胶上（例如HylaformPlus）。
8)一种多硫酸化多糖，在一个实施方案中，多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖钙和/或多硫酸戊聚糖钠连同多个祖细胞，结合到稳定的透明质酸凝胶（例如Restylane）中。
9)一种多硫酸化多糖，在一个实施方案中，多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖钙和/或多硫酸戊聚糖钠连同多个祖细胞，结合到聚-L-乳酸溶液（例如Sculptra）中。
10)一种多硫酸化多糖，在一个实施方案中，多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖钙和/或多硫酸戊聚糖钠连同多个祖细胞，结合地溶解于克-林二氏溶液中，该溶液含有NaCl118.1mM；KCl 3.4mM；CaCl22.5mM；MgSO40.8mM；KH2PO41.2m；NaHCO325.0mM；葡萄糖11.1mM。
本发明的配制品还可以进一步包括以下各项中的一种或多种：
一种类固醇抗炎药（皮质类固醇）、钙调神经磷酸酶抑制剂（例如，吡美莫司、他克莫司）、磷酸二酯酶抑制剂、抗组织胺剂、抗微生物剂、抗生素、抗细菌剂、神经酰胺（ceremide）、生长因子（例如，转化生长因子β1-3、血小板衍生的生长因子、成纤维细胞生长因子、胰岛素样生长因子I和II、表皮生长因子、角质形成细胞生长因子、神经生长因子）、有丝分裂剂、基质金属蛋白酶抑制剂（例如，TIMP、巴马司他、马立马司他、以及matlystatinB）、蛋白酶抑制剂、ECM蛋白、维甲酸（维生素A）、抗氧化剂（维生素E和C）、植物细胞分裂素（分裂酶（kinerase））、铜-肽络合物连同多种植物、动物和矿物质提取物（例如，煤焦油提取物）。
本发明的专门的配制品包括与一种类固醇抗炎药的组合。另一种组合物包括一种钙调神经磷酸酶抑制剂。另一种组合物包括一种抗组织胺剂。另一种组合物包括一种抗微生物剂。另一种组合物包括一种生长因子。另一种组合物包括一种蛋白酶抑制剂。
制备用于给药的组合物
脂质体类
将蛋白封装在脂质体中在例如美国专利5,662,931；5,853,755；4,485,054；5,780,054；5,653,974；6,019,999；6,027,726；5,739,273；5,264,221；5,413,804；5,374,715中进行详细说明。
聚合物类
本发明的多糖和/或多肽可以被封装在可生物降解的合成的聚合物（或衍生物）中用于控制释放。这些聚合物（以及衍生物）包括例如：聚(酯)类；例子是聚(ε-己内酯)PCL、聚(乙醇酸)PGA、聚(L-乳酸)PLA、聚(乙二醇)PEG、聚(氧化乙烯)PEO。聚(酯)衍生物类包括聚(酯)共聚物、聚(正酯)。聚(酯)共聚物；例子是聚(乳酸-共-乙醇酸)PLGA、聚(D-乳酸)PDLA、聚(L-乳酸)PLLA、PLA-PEG、二嵌段PLA/PEG、三嵌段PLA/PEG/PLA。聚(正酯)类；例子是基于3,9-二亚乙基-2,4,8,10-四氧杂螺[5.5]十一烷(DETOSU)的聚(原酸酯)类。聚(酸酐)类；例子是癸二酸（SA）、对-(羧基苯氧基)丙烷（CPP）、对-(羧基苯氧基)己烷（CPH）、SA/CPP共聚物、聚(脂肪酸二聚体-癸二酸)、聚(酸酐-酰亚胺类)、聚(酸酐-酯类)。聚(酰胺)类；例子是聚(氨基酸类)、聚(谷氨酸)、聚(天冬氨酸)、聚(乳酸-共-赖氨酸)PLAL、聚[N-(3-羟丙基)-L-谷氨酰胺]、聚(亚氨基碳酸酯类)、酪氨酸衍生的聚(碳酸盐类)。含磷的聚合物；例如聚(磷腈)、聚(二氯磷腈)、聚(有机磷腈)、聚[双(偶氮羧基苯氧基)-磷腈]、聚(磷酸酯类)、聚(乌拉坦类)、一种透明质酸物载体。
偶联
可以将一种或多种多肽和/或多糖与一种胶原基质进行偶联用于给药。胶原基质可以按照一种恒定有效的浓度释放一种偶联的药物。相应地，胶原和其他ECM蛋白基质可以有效地用于在体内（例如，在一种组织或需要它的间隔中）基于一种或多种多肽和/或多糖。在一个实施方案中，这种交联的胶原基质是通过皮下进行给予的。
概述
大体上，本发明涉及和/或使用了治疗有效量和/或预防有效量的在此讨论的组合物。
一种“治疗有效量”指一个量值，该量值以对于达到令人希望的效果所必需的剂量和时间是有效的。
一种“预防有效量”指一个量值，该量值以多个剂量并且在必要的时间内对于达到令人希望的预防结果（例如，防止或抑制细胞凋亡或组织损伤）是有效的。
多肽类
在此提到的“多肽”包括多种单一的多肽、多种多肽的混合物以及多种多肽的生物学活性片段。
用“基本上纯的多肽”一词我们是指一种多肽，该多肽已经至少部分地与这些脂类、核酸、其他多肽、以及其他污染的分子（它们与处于其天然状态的这种多肽相关联）相分离。在一个实施方案中，这种基本上纯的多肽是至少60%减免了与该多肽自然地相关联的其他组分。在另一个实施方案中，这种基本上纯的多肽是至少75%减免了与该多肽自然地相关联的其他组分。在另一个实施方案中，这种基本上纯的多肽是至少90%减免了与该多肽自然地相关联的其他组分。而且，术语“多肽”在此可以与术语“蛋白”互换地使用。
多肽的%一致性是通过GAP（Needleman and Wunsch,1970）分析（GCG程序）、使用空隙建立罚分=5，以及空隙延伸罚分=0.3来确定的。除非另外说明，该查询序列的长度为至少15个氨基酸，并且这种GAP分析在至少15个氨基酸的区域内比对了这两个序列。该查询序列的长度可以是至少50个氨基酸，并且该GAP分析在至少50个氨基酸的区域内比对了这两个序列。该查询序列的长度可以是至少100个氨基酸，并且该GAP分析在至少100个氨基酸的区域内比对了这两个序列。
对于这些已定义的多肽/酶，应当理解，高于以上所提供的那些的%一致性的数值将包括在实施方案中。因此，在适合时，鉴于最小的%一致性的数值，该多肽可以包括一种氨基酸序列，该氨基酸序列是与相关命名的EQ ID NO至少60%、65%、70%、75%、76%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、或99.9%一致的。
如在此所使用的，术语“生物学活性片段”是指仍然保持着抗关节炎或抗炎性活性的已定义的多肽的一部分（无论哪一个是相关的）。此类生物活性片段可以通过系列删除这种全长蛋白、并且测试得到的片段的活性来容易地确定。
在此定义的这些多肽/酶的氨基酸序列突变体/变体可以通过将适当的核苷酸变化引入到一种编码该多肽的核酸中、或通过体外合成所希望的多肽来进行制备。此类突变体包括例如该氨基酸序列中的残基的缺失、插入或置换。可以进行缺失、插入和置换的组合来达到最终的构建体，条件是这种最终的蛋白产物具有令人希望的特性。
在设计氨基酸序列突变体中，该突变位点的定位以及该突变的本性将取决于有待修饰的一种或多种特征。可以逐个地或系列地修饰用来突变的位点，例如通过（1）首先用保守的氨基酸选择进行置换，并接着用更多基团的选择进行置换，这取决于所达到的结果，（2）删除该目标残基，或（3）邻近该定位的位点将其他残基插入。
氨基酸序列缺失总体上是在约1至30个残基、约1至10个残基、并且典型地约1至5个连续的残基的范围内。
取代突变体在该多肽分子中将至少一个氨基酸去除，并且在其位置上插入一种不同的残基。用于取代性诱变的最感兴趣的位点包括被鉴定为这种或这些活性位点或结合位点的位点。感兴趣的其他位点是以下位点，其中从不同菌株或物种获得的具体的残基是一致的。这些位置对于生物学活性可能是重要的。这些位点，特别是落在至少3个其他相同的保守位点的序列中的那些位点，可以按照一种相对保守的方式被取代。此类保守性取代在表A中显示。
而且，若希望，非天然氨基酸或化学氨基酸类似物可以作为一种取代或加入而引入到本发明的多肽中。此类氨基酸包括但不限于：常见的氨基酸的D-同分异构体、2,4-二氨基丁酸、D-氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸、3-氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基丙胺酸、叔-丁基甘氨酸、叔-丁基丙氨酸、苯基甘氨酸、环己基丙氨酸、D-丙胺酸、氟-氨基酸类、设计的氨基酸类例如D-甲基氨基酸类、C-甲基氨基酸类、N-甲基氨基酸类、以及泛指的氨基酸类似物。
表A.示例性的取代
初始残基 示例性的取代
Ala(A) val;leu;ile;gly
Arg(R) lys
Asn(N) gln;his
Asp(D) glu
Cys(C) ser
Gln(Q) asn;his
Glu(E) asp
Gly(G) pro，ala
His(H) asn;gln
Ile(I) leu；val;ala
Leu(L) ile;val；met；ala；phe
Lys(K) arg
Met(M) leu；phe
Phe(F) leu；val;ala
Pro(P) gly
Ser(S) thr
Thr(T) ser
Trp(W) tyr
Tyr(Y) trp；phe
Val(V) ile;leu；met；phe；ala
还包括在本发明范围内的是本发明的多肽，这些多肽在合成过程中或之后被差异性地修饰，例如通过生物素化作用，苄基化作用，糖基化作用，乙酰化作用，磷酸化作用，酰胺化作用，通过已知的保护/阻断基团，蛋白酶剪切、连接到一种抗体分子或其他细胞配体上等等的衍生作用。这些修饰可以用于增加本发明的多肽的稳定性和/或生物活性。
本发明的多肽可以按照不同的方式进行制备，包括制备和回收天然蛋白、制备和回收重组蛋白、以及化学合成这些蛋白。在一个实施方案中，本发明的一种分离的多肽是通过对一种细胞进行培养而产生的，该细胞能够在对于生成该多肽而言有效的条件下表达该多肽、并且回收该多肽。所培养的一种细胞是本发明的一种重组细胞。有效的培养条件包括但不限于允许蛋白生成的有效的介质、生物反应器、温度、pH和氧条件。一种有效的介质指其中对一种细胞进行培养以产生本发明的一种多肽的任何介质。此类介质典型地包括一种水性介质，该介质含有可同化的碳源、氮源和磷源，以及适当的盐类，矿物质，金属和其他营养物，例如维生素类。本发明的细胞可以在常规的发酵生物反应器、摇瓶、试管、微孔板、以及培养皿中进行培养。培养可以在适合于一种重组细胞的温度、pH和氧含量下进行。此类培养条件在本领域的普通技术人员的专业技能范围之内。
基因治疗
这些聚核苷酸和多肽可以根据本发明进行使用，这是通过在通常被称作“基因治疗”的治疗模式中表达此类多肽来进行的。因此，例如可以用一种多核苷酸（例如，DNA或RNA）将患者的细胞进行工程化处理，从而对一种多肽进行离体编码。然后，可以将这些工程化处理的细胞提供给有待用该多肽进行治疗的患者。在这个实施方案中，可以对细胞进行离体工程化处理，例如通过使用一种逆转录病毒的质粒载体来转化所述细胞，该载体含有编码一种多肽的RNA，该多肽对于本发明的方法是有用的。此类方法在本领域内是熟知的，并且它们在本发明中的用途从此处的传授内容将是清楚的。
此外，可以对细胞进行体内工程化处于，用于通过本领域内已知的操作在体内表达多肽。例如，可以工程化处于对于本发明的一种方法有用的多核苷酸，用于在复制缺陷型逆转录病毒载体或腺病毒载体或其他载体（例如，痘病毒载体）进行表达。然后，可以将这种表达构建体分离。将一种包装细胞用一种质粒载体进行转导，该载体含有有编码了对于本发明的一种方法有用的多肽的RNA，这样使得现在该包装细胞生产了含有感兴趣的基因的感染性病毒颗粒。可以将这些生产者细胞施给予患者，用于对细胞进行体内工程化处理并且在体内表达该多肽。用于给予本发明的一种多肽的这些和其他的方法对于本领域的普通技术人员而言从本发明的传授内容中应该是清楚的。
从其中可以衍生出以上提及的逆转录病毒质粒载体的逆转录病毒包括但不限于：莫洛尼氏鼠白血病病毒、脾坏死病毒、劳斯氏肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病病毒、人免疫缺陷病毒、腺病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒、以及乳腺肿瘤病毒。在一个实施方案中，该逆转录病毒质粒载体衍生自莫洛尼氏鼠白血病病毒。
此类载体将包括用于表达该多肽的一种或多种启动子。可以使用的适合的启动子包括但不限于：逆转录病毒LTR；SV40启动子；以及人类巨细胞病毒（CMV）启动子。还可以使用细胞的启动子，例如真核细胞启动子，包括但不限于：组蛋白、RNA聚合物III、以及β-肌动蛋白启动子。可以使用的额外的病毒启动子包括但不限于：腺病毒启动子、胸腺嘧啶核苷激酶（TK）启动子，以及B19细小病毒启动子。选择一种适合的启动子对于本领域的普通技术人员从在此包含的传授内容中将是清楚的。
编码对于本发明的一种方法有用的多肽的核酸序列将被置于一种适合的启动子的控制之下。可以使用的适合的启动子包括但不限于：腺病毒启动子，例如腺病毒主要晚期启动子；或异源性启动子，例如巨细胞病毒（CMV）启动子；呼吸道合胞病毒（RSV）启动子；诱导型启动子，例如MMT启动子、金属硫蛋白启动子；热休克启动子；白蛋白启动子；ApoAI启动子；人类珠蛋白启动子；病毒胸腺嘧啶核苷激酶启动子，例如单纯疱疹-胸腺激酶启动子；逆转录病毒LTR（包括在此以上说明的经修饰的逆转录病毒LTR）；β-肌动蛋白启动子；以及人类生长激素启动子。该启动子还可以是控制对该多肽进行编码的基因的天然启动子。
使用该逆转录病毒质粒载体来转导包装细胞系以形成生产者细胞系。可以被转染的包装细胞的例子包括但不限于：PE501、PA317、Y-2、Y-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、YCRE、YCRIP、GP+E-86、GP+envAm12、以及DAN细胞系，如在Miller(1990)Human GeneTherapy、1:5-14中所说明。
该载体可以通过本领域内的任何已知的手段而被转导至这些包装细胞中。此类手段包括但不限于：电穿孔、使用脂质体、以及CaPO4沉淀。在一个替代方案中，可以将该逆转录病毒质粒载体封装到一个脂质体中、或与一种脂类相连接，并接着给予一个宿主。
这种生产者细胞系将产生传染性的逆转录病毒载体颗粒，这些颗粒包括对这些多肽进行编码的一种或多种核酸序列。然后，可以使用此类逆转录病毒载体颗粒，从而在体外或者内转导真核细胞。这些转导的真核细胞将表达对该多肽进行编码的一种或多种核酸序列。可以进行转导的真核细胞包括但不限于：间充质细胞、软骨细胞、胚胎干细胞、胚胎癌细胞、连同造血干细胞、肝细胞、成纤维细胞、肌细胞、角质化细胞、内皮细胞、以及支气管上皮细胞。
根据本发明的基因治疗可以涉及该基因治疗多核苷酸在患者体内的瞬时（暂时）存在，或将一种多核苷酸永久地引入到该患者体内。
根据本发明的基因治疗，像直接给予以上所讨论的试剂，可以单独使用或与其他治疗模式进行联合。
药物组合物的制备和给予
有待给予的多糖与可任选的一种多肽的量可以根据以下因素发生变化，例如个体的疾病状态、年龄、性别和体重。可以对给药方案进行调节以提供最适宜的治疗响应。例如，可以给予快速灌注剂，随着时间可以给予几次分开的剂量，或该剂量可以根据治疗情况的紧急程度所指示按比例地减少或增加可能有利的是为了给药容易以及剂量的一致性，以剂量单位形式来配置肠胃外的组合物。如在此所使用的，“剂量单位形式”是指物理地分散的、适合作为单一的剂量用于有待治疗的患者的单元；每一个单元含有一个预先确定的量的活性化合物，该量值被计算为产生与所要求的药物载体相关联的令人希望的疗效。
应当理解，该多糖可任选地与一种多肽可以以一种组合物的形式进行给药，该组合物包括一种药学上可接受的载体或赋形剂。
如在此所使用的，“药学上可接受的载体”或“赋形剂”包括任何以及所有的生理学相容的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、以及类似物。在一个实施方案中，该载体适合于肠胃外给药。可替代地，该载体可以适合于静脉内、腹膜内、肌肉内、舌下或口服给药。药学上可接受的载体包括无菌的水性溶液或分散液、以及用于临时制备无菌可注射的溶液或分散液的无菌粉末。此类介质和试剂用于药学活性物质的用途在本领域内是熟知的。除了任何常规的介质或试剂是与该活性化合物不相容的之外，还考虑了它在本发明的药学组合物中的使用。还可以将补充的活性化合物结合至这些组合物中。
治疗组合物典型地应该是无菌的，并且在制造和储存的条件下是稳定的。该组合物可以被配制为一种溶液、微乳剂、脂质体或其他有序结构。该载体可以是一种溶剂或分散介质，它包含例如：水、乙醇、多元醇（例如，甘油、丙二醇、以及液体聚乙二醇、以及类似物），以及它们的适合的混合物。适当的流动性可以通过以下方式来维持，例如通过使用一种涂层（例如，卵磷脂）、通过在分散液的情况下维持所要求的粒径、并且通过使用表面活性剂。在许多例子中，优选的是在该组合物中包括等渗剂，例如糖类、多元醇（例如，甘露醇、山梨糖醇、或氯化钠）。这种可注射的组合物的延长吸收可以通过在该组合物中包括一种延迟吸收的试剂（例如，单硬脂酸盐类和明胶）来实现。而且，该多糖和/或多肽可以按照一种计时释放的配制品进行给药，例如在包含一种缓慢释放的聚合物的组合物中。这些活性化合物可以用将保护该混合物免于快速释放的载体进行制备，例如，一种受控释放的配制品，包括植入物和微囊化的递药系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐类、聚乙醇酸、胶原、聚原酯类、聚乳酸以及聚乳酸、聚乙醇酸的共聚物（PLG）。用于制备此类配制品的许多方法已申请专利或对于本领域的普通技术人员而言大体上是已知的。
该多糖可任选地与一种多肽可以与一种适当的基质相组合进行给予，例如为了向骨骼、软骨、肌肉、神经、表皮和/或其他结缔组织的生长提供一个表面。该基质可以是处于传统的基质生物材料的形式。该基质可以提供这些细胞、表面活性剂或可溶的因子的缓慢释放。
基质材料的选择取决于生物相容性、生物可降解性、机械特性、外表显现和界面性质。对于这些组合物潜在的基质可以是可生物降解的并且化学定义的硫酸钙、磷酸三钙、羟基磷灰石、聚乳酸和聚酐类。其他潜在的材料是可生物降解的并且生物学明确定义的，例如骨骼，或真皮胶原。其他基质包括纯蛋白或细胞外基质组分。其他潜在的基质是非生物降解的并且化学定义的，例如烧结的羟基磷灰石、生物玻璃、铝酸盐、或其他陶瓷。基质可以包括以上提及的材料类型中的任何的组合，例如聚乳酸与羟基磷灰石、或胶原与磷酸三钙。这些生物陶瓷可以在组合物中得到改变（例如，在钙-铝酸盐-磷酸盐中）并且进行加工以改变孔径、粒径、颗粒形状、以及生物降解能力。
本发明的组合物是可以从一种或多种多糖和/或多糖制备的。额外的多糖和/或多肽片段或肽可以按照本说明书、权利要求、以及附图通过例行试验进行鉴别。用于鉴别具有刺激活性的肽片段的方法例如在US5,399,342中进行了说明。
这些药物组合物可以在人类医学和兽医中用于人类或动物，并且将典型地包括一种药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂中的任何一种或多种。用于治疗用途的可接受的载体或稀释剂在制药领域中是熟知的，并且说明于例如Remington′s PharmaceuticalSciences Mack Publishing Co.(A.R.Gennaro edit.1985)。药用载体赋形剂或稀释剂的选择可以考虑预期的给药途径和标准的药学实践来进行选择。这些药物组合物可以包括作为、或除此之外还包括，该载体、赋形剂或稀释剂、任何适当的粘合剂、滑润剂、悬浮剂、涂层剂、或增溶剂。
在本领域内熟知的是存在着不同的组合物/配制品的要求，这取决于不同的递药系统。
根据本发明，还涵盖了非侵入性的配制品。例如，当这些祖细胞很可能通过肠胃外（例如，关节内）进行给药时，这种多硫酸化多糖能够通过以下方式进行给药：通过吸入、口服或鼻内，以栓剂或阴道环的形式，局部地以一种洗液、溶液、乳剂、软膏或扑粉（dustingpowder）的形式，通过使用皮肤贴剂，以片剂的形式口服（这些片剂含有赋形剂，例如淀粉或乳糖），或以胶囊的形式，可咀嚼的或胚珠，单独存在或与赋形剂的混合物，或者以含有调味剂或着色剂的酏剂、溶液、糖浆或悬浮液的形式
对于口腔或舌下给药，这些组合为可以例如以按照常规方式进行配制的片剂或锭剂的形式进行给药。
口服配制品包括在正常情况下使用的赋形剂，例如像药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁、以及类似物。这些组合物采用了溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊、持续释放的配制品或粉末的形式，并且含有10%至95%、特别是25%至70%的活性成分。
用于口服给予患者的胶囊、片剂和丸剂可以配备有一种肠溶包衣，该肠溶包衣包括例如Eudragit″S″、Eudragit″L″、醋酸纤维素、邻苯二甲酸醋酸纤维素或羟基丙基甲基纤维素。
已经说明了鼻内配制品，并且关节炎（larthrytic）胶原II型和关节炎胶原IX型的给药说明于例如Lu et al(1999)Different therapeutic and bystander effects byintranasal administration of homologous type II and type IX collagens on thecollagen-induced arthritis and pristane-induced arthritis in rats,ClinicalImmunology Vol 90pp 119-127(1999)。
在另一个例子中，本发明的药物组合物可以被配制为使用一种微型泵或通过粘膜途径（例如像，一种鼻喷雾或气溶胶）进行递送，用于吸入或可吸收的溶液。
当该试剂将通过胃肠粘膜粘膜进行递送时，在通过该胃肠道在运输过程中它应当能够保持稳定；例如它应该能够耐受蛋白质分解的降解、稳定的制酸剂、pH并且耐受胆汁的洗涤剂效应。
在一个实施方案中，本发明的多硫酸化多糖是通过一种非侵入性途径进行给药的。在另一个实施方案中，这种非侵入性途径包括口服给药、或肠内给药、鼻腔给药或通过吸入。
在一个可替代的实施方案中，本发明的组合物可以通过胃肠外（例如，通过静脉内、肌内或皮下）进行注射。
对于肠胃外给药，这些组合物可以最好以一种无菌水性溶液的形式进行使用，该水性溶液可以含有其他物质，例如足够的盐类或单糖类，从而使该溶液与血液等渗。该制剂也可以被乳化或包封到脂质体中。
在配制之后，可以将这种免疫保护的组合物加入到无菌容器中，然后将该容器密封并且在低温下（例如4℃）储存、或它可以被冷冻干燥。冷冻干燥允许以一种稳定的形式长期储存。
在本发明的一个实施方案中，祖细胞，特别是软骨祖细胞并且甚至更具体地是Stro-1bri细胞和/或它们的子代细胞是以一种组合物的形式进行给药的。在一个实施方案中，这种组合物包括一种药学上可接受的载体和/或赋形剂。
术语“载体”和“赋形剂”是指在本领域中常规使用的，用于促进活性化合物的储存、给药和/或生物活性的物质的组合物（参见例如Remington′s PharmaceuticalSciences,16th Ed.,Mac Publishing Company(1980)）。一种载体还可以降低该活性化合物的任何不希望的副作用。一种适当的载体是（例如）稳定的，例如，在该载体中不能与其他成分进行反应。在一个例子中，该载体在接受方中以用于治疗所采用的剂量和浓度下未产生显著的局部的或全身性的不良反应。
适合于本发明的载体包括常规使用的那些，例如水、盐水、含水葡萄糖、乳糖、格林氏溶液、一种缓冲溶液、透明质酸物和乙二醇类是优选的液体载体，特别地（当等渗时）是对于溶液。适当的药物载体和赋形剂包括淀粉、纤维素、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、稻、面粉、白垩（chalk）、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、甘油、丙二醇、水、乙醇、以及类似物。
在另一例子中，一种载体是一种介质组合物，例如其中生长或悬浮一种细胞。在另一个例子中，这种介质组合物在服用它的患者体内不诱导任何不良反应。
优选的载体和赋形剂并未不利地影响一种细胞的活力。
在一个例子中，该载体或赋形剂提供了一种缓冲活性以便在一个适当的pH下维持这些细胞和/或可溶的因子，从而发挥一种生物学活性，例如该载体或赋形剂是磷酸缓冲盐溶液（PBS）。PBS代表一种具有吸引力的载体或赋形剂，因为它与细胞和因子进行最低限度地相互作用并且允许这些细胞和因子的快速释放，在这种情况下，本发明的组合物可以被制成一种液体用于直接施用到血流、或组织、或组织的周围或邻近的区域，例如通过注射。
祖细胞，特别是软骨祖细胞并且甚至更具体地是Stro-1bri细胞和/或它们的子代细胞也可以被结合到或包埋入支架中，这些支架是接收方相容的并且它们降解成对该接收方无害的产物。这些支架为有待移植入该接收方受试者体内的细胞提供了支持和保护。天然的和/或合成的可生物降解的支架是此类支架的例子。
多种多样的支架可以在本发明的实践中进行成功地使用。支架包括但不限于生物性的、可降解的支架。天然的可生物降解的支架包括胶原、纤连蛋白、以及层粘连蛋白的支架。适合于一种细胞移植支架的合成材料应该能够支持广泛的细胞生长和细胞功能。此类支架也可以是可再吸收的。适当的支架包括聚乙醇酸支架，例如正如由Vacanti,etal.J.Ped.Surg.23:3-91988;Cima,et al.Biotechnol.Bioeng.38:145 1991;Vacanti,etal.Plast.Reconstr.Surg.88:753-9 1991所说明；或合成的聚合物，例如聚酐类、聚原酯类、以及聚乳酸。
在另一个例子中，这些细胞可以在一种凝胶支架（例如来自Upjohn Company的Gelfoam）进行给予。
对于本发明有用的细胞组合物可以单独给予或作为与其他细胞的混合物。可以与本发明的组合物一起给予的细胞包括但不限于其他多能的或多效能的细胞、或干细胞、或骨髓细胞。不同类型的细胞可以与本发明的一种组合物在给予之前立即或刚刚混合，或者它们在给予之前可以共培养一段时间。
在一个实施方案中，该组合物包括有效量的、或治疗或预防有效量的细胞。例如，该组合物包括约1x105个Stro1bri细胞/kg至约1x107个Stro-1bri细胞/kg、或约1x106Stro-1bri个细胞/kg至约5x106个Stro-1bri细胞/kg。有待给予的细胞的确切的量取决于不同的因素，包括该患者的年龄、体重、和性别，以及胰腺功能障碍的程度和严重性。相同的数值也可应用于这些祖细胞和软骨祖细胞本身。
在一些实施方案中，细胞是包含在一个室中，该室不允许这些细胞退出进入到受试者的循环中，然而却允许由这些细胞分泌的因子引入到该循环中。按照这种方式，可溶的因子是可以通过允许这些细胞将这些因子分泌到该受试者的循环中而给予受试者。同样，这种室可以植入到受试者体内的一个位置，从而增加这些可溶的因子的局部水平，例如植入或邻近一个移植的器官。
在本发明的一些实施方案中，也许不必要或不希望的是在用细胞组合物开始治疗之前对患者进行免疫抑制。相应地，用异种的（allogeneic）或甚至异源（xenogeneic）进行移植，Stro-1bri细胞或它们的子代细胞在一些例子中是可以忍受的。
然而，在其他例子中，也许令人希望或适当的是在开始细胞治疗之前对患者进行药理学免疫抑制。这可以通过使用全身的或局部的免疫抑制剂来实现，或它可以通过将这些细胞递送到一种封装的装置中来实现。这些细胞是可以封装到胶囊中的，该胶囊对于该细胞所要求的营养和氧气、以及治疗因子是可渗透的，该细胞对于免疫体液因子和细胞仍然是不可渗透的。该胶囊剂可以是低过敏原性的，是易于并且稳定地置于一个靶组织中，并且对所植入的结构提供了额外的保护。用于降低或消除针对这些移植细胞的免疫应答的这些和其他手段在本领域中是已知的。作为一个替代方案，可以对这些细胞进行遗传修饰以降低它们的免疫原性。
用途和治疗的方法
本发明的方法、组合物和用途对于治疗和/或预防肌肉骨骼系统疾病（例如，风湿性关节炎（RA）、骨关节炎（OA）以及椎间盘退行性变（DD））是有用的。它们还可以有效地用于相关的软骨再生和修复。
本发明的方法、组合物和用途也是有用的，因为它们能够调节软骨形成和细胞增殖，并且可以用于产生、向上调节透明质酸物（HA）或刺激透明质酸物（HA）的产生。这些用途可以用于治疗肌肉骨骼系统的疾病，包括风湿性关节炎（RA）、骨关节炎（OA）、以及椎间盘退行性变（DD）；或治疗从增加的HA的产生中受益的病症，例如滑膜关节的骨关节炎、眼科学、术后腹部粘连的防止、皮肤治疗和修复、以及细胞外基质的功能的恢复、或诱导软骨修复、恢复或基质新生。
本发明的其他用途包括产生一种细胞外基质，该基质适合于移植到需要这种治疗的受试者体内的一种结缔组织缺损中。
所以，本发明的方法可以用于治疗患者（在一些实施方案中是人类患者）免受以上所述的多种疾病。这些方法还能够以预防为基础用于防止这些疾病的发生或使其最小化。
本发明还延伸到如在此所讨论的组合物，用于治疗和/预防肌肉骨骼系统疾病，例如风湿性关节炎（RA)、骨关节炎（OA）以及椎间盘退行性变（DD）。它们还可以被有效地用于相关的软骨再生和修复、或治疗从增加的HA的产生受益的病症，例如像滑膜关节的骨关节炎、眼科学、术后腹部粘连的防止、皮肤治疗和修复、以及细胞外基质的功能的恢复、或诱导软骨修复、恢复或基质新生。
如在此所讨论的这些组合物也可以用于生产一种细胞外基质，该基质适合于移植到需要这种治疗的受试者体内的一种结缔组织缺损中，并且也适合调节软骨形成和细胞增殖和/或产生、向上调节透明质酸物（HA）或刺激透明质酸物（HA）的产生。
本发明还延伸到如在此所讨论的组合物用于制造对肌肉骨骼系统疾病进行治疗和/或预防的药物的用途，这些疾病例如风湿性关节炎（RA）、骨关节炎（OA）以及椎间盘退行性变（DD）。该用途还延伸到软骨再生和修复、或治疗从增加的HA的产生受益的病症，例如像滑膜关节的骨关节炎、眼科学、术后腹部粘连的防止、皮肤治疗和修复、以及细胞外基质的功能的恢复、或诱导软骨修复、恢复或基质新生。
如在此所讨论的组合物的用途还延伸到制造用于生产一种细胞外基质的药物，该基质适合移植到需要这种治疗的受试者体内的一种结缔组织缺损中，并且也适合调节软骨形成和细胞增殖和/或产生、向上调节透明质酸物（HA）或刺激透明质酸物（HA）的产生。
本发明允许给予本发明的组合物以便将祖细胞植植到患者体内，随后对这些细胞进行诱导以增加HA的产生和/或经历转化成为一种软骨形成性表型。
这种应用的例子可以是将本发明的组合物注射到具有软骨或椎间盘损伤的个体的关节中、或全身性地用于较难达到的位点，允许这种制备品灌注该组织和细胞从而发挥其独特的生物效应。施用可以包括治疗以下个体，这些个体可能不具有临床定义的疾病（通常是OA或相关障碍）、但已经持续一种由（例如）运动或工作有关的活动所造成的对关节组织的外伤损害。
在具有OA或相关疾病的老年患者中，可以使用这种形式的治疗而不是关节内HA治疗（粘度补充）。
它也可以充当关节镜或开放手术后的一种预防方法，其中软骨或半月板切除/清除是必需的。已经完全确定的是随着时间推移此类术后患者将普遍地发展到表现出要求内科治疗的症状的OA。不可能的是通过减少软骨退化症状也可以将其改进，这是由于软骨衍生的促进炎症的抗原的产生减少的缘故。
根据本发明的、已经显示具有活性的组合物可以在其他动物模型中进一步测试安全性和有效性，并接着在人体内进行临床试验，若希望的话。自然地，对于兽医应用，不要求在人体内进行临床试验。可以将在动物或人体内安全并且有效的那些组合物给予适当的受试者来治疗或可替代地保护免受在此讨论的疾病。“治疗和保护”包括防止如在此所讨论的疾病的发生和出现的预防性和治疗性措施。
在此的治疗方法是指，当与未给予一种含有本发明的多肽的药物组合物相比，抵抗或抑制一种症状、延迟症状的出现、减少症状发展的严重性、和/或减少个体患有的症状的数目或类型。相应地，贯穿本说明书，应当理解遵照根据本发明的治疗的一种肌骨胳退化病症的甚至一种症状的任何临床上或统计上显著的缓解是在本发明的范围内。
以下例子进一步说明了本发明的各个方面。然而，它们决不是如在此所给出的本发明的传授内容或披露的限制。
结果和讨论
本发明已经显示将以广泛浓度的多硫酸化多糖加入到含有高数量和低数量的祖细胞的深冷介质（例如Profreeze和7.5%DMSO）中、之后跟随在液氮气相中冷冻并且在环境温度下或37℃下融化对它们的活力没有有害的作用。这可以通过图1至3看到。实际上，从这些实验中看到了增强的活力，特别地在图3和图4中，该图显示相对于在不含有该多硫酸化多糖的深冷保存介质中冷冻的祖细胞，祖细胞的活力得到增强。
图6清楚地显示浓度超过1微克/mL的多硫酸化多糖将人类祖细胞中细胞凋亡降低了约50%，这是当这些细胞与IL-4和IFN-γ（它们是已知的凋亡介导物）孵育时进行的。
它还显示多硫酸化多糖以一种浓度依赖的方式刺激了祖细胞增殖。细胞分裂的显著刺激，正如用WST-1线粒体脱氢酶裂解测定所测量在图4中、以及从图5中的3H-胸腺嘧啶核苷掺入到DNA中（这在以1至5微克/mL的范围在单层和微团培养的人类祖细胞中得到证实）、连同在图10中的鼠祖细胞系中看到。
与BMP-TGF-β超家族的几个成员（例如BMP-2、BMP-7、BMP-8）以及成纤维细胞生长因子家族（当在成骨性介质中培养时它促进祖细胞分化为成骨细胞）相比，第一次发现这些多硫酸化多糖抑制祖细胞分化成这种细胞表型。这可以在图7中看到并且对于成骨作用显示该祖细胞的向下调节。
另一方面，在多硫酸化多糖的存在下在脂肪形成性介质中培养的祖细胞显示分化成脂肪细胞。因此，多硫酸化多糖充当祖细胞分化成脂肪细胞的一种调节剂。这可以在图8中看到。
在正常的非选择性培养条件下，将多硫酸化多糖与多个祖细胞进行孵育常常有利于沿着软骨形成途径进行分化，正如通过增加的蛋白聚糖和胶原II型合成所证明。蛋白聚糖和胶原II型被认为是软骨细胞的生物合成产物，并且用作透明软骨的表型标志物。多硫酸化多糖的软骨形成促进作用显示在图9中的鼠MSC细胞系C3H10T1/2中、以及图11中的人类祖细胞中（当单层培养时）。
使用这种成团培养的鼠ATDC5细胞系提供了另外的支持，其中相对于对照培养（无多硫酸化多糖）在图12中观察到在2微克/mL下蛋白聚糖（PG）合成的25%的增加。
多硫酸化多糖促进软骨形成和软骨形成的额外的证据是通过以成团培养6天后检测由这些细胞进行基因的表达来提供的，其中胶原II型的表达被多硫酸化多糖以一种浓度依赖的方式向上调节。这可以在图13中看到。
有趣的是，肝素，一种自然发生的多硫酸化多糖在成团培养中在所检查的全部浓度内没有显著地刺激蛋白聚糖的合成。这可以在图14中看到。肝素在浓度2.5ug/mL下显示少量活性，但在更高的浓度下可能引起抑制。
使用7天成团培养中的鼠MSC细胞系C3H10T1/2证实，10微克/mL的多硫酸化多糖将蛋白聚糖合成增加了超过对照值的80%。这可以在图15中看到。这项发现与使用鼠MSC细胞系C3H10T1/2在微团培养6天后获得的结果（这可以在图16中看到）一致。这种培养祖细胞的方法最初是由Denker等人说明的（Andrew E.Denker AE,Haas AR,Nicoll SB,TuanRS.Chondrogenic differentiation of murine C3H10T1/2 multipotential progenitorcells:I.Stimulation by bone morphogenetic protein-2 in high-density micromasscultures.Differentiation(1999)64:67–761999）。
而且，微团培养9天之后1微克/mL的多硫酸化多糖获得100%的刺激作用，也在图16所示。人类祖细胞当在多硫酸化多糖的存在下进行孵育时在微团培养中也分化成软骨细胞。然而，在5天培养物中，用2.5微克/mL浓度的多硫酸化多糖获得30%的PG合成的最大刺激作用，如在图17中所示。胶原II型和PG的共生产是在这些微团培养中证实的，使用了由Denker等人（Andrew E.Denker AE,Haas AR,Nicoll SB,Tuan RS.Chondrogenicdifferentiation of murine C3H10T1/2 multipotential progenitor cells:I.Stimulation by bone morphogenetic protein-2 in high-density micromasscultures.Differentiation(1999)64:67–761999）所说明的免疫染色技术。.
从图18明显地看到，人类祖细胞的微团培养物在多硫酸化多糖以1–10微克/mL的浓度范围存在下维持10天提供了强的胶原II型染色，多硫酸化多糖在5ug/mL时达到最大水平。
在采用人类祖细胞以及透明质酸物（HA)的类似微团培养中，在图19A中观察到低水平的35SO4掺入到PG中。然而，在1-20微克/mL的范围内带有高负电荷的葡聚糖硫酸酯（DS）抑制了PG合成（图19B）。这是一个出乎意料的结果，因为DS具有与多硫酸化多糖类似的分子量和电荷密度，并且因此预期证明对祖细胞的类似的活性。据信，分子构象和对于有效的受体结合和蛋白相互作用重要的其他因素可以发挥作用。
透明质酸物据报道在藻酸酯珠培养物上对祖细胞产生了软骨形成作用（Kavalkovich KW,Boynton RE,Murphy JM,Barry F.Chondrogenic differentiation ofhuman progenitor cells within an alginate layer culture system.In vitroCell.Dev.Biol-Animal.38:457–466,2002）。在图20中，使用WST-1测定所测得的单独使用多硫酸戊聚糖以及与透明质酸物（SupartzTM）相组合对人类祖细胞增殖的作用以第3天和第5天培养物显示。这个试验的结果证实单独的HA对祖细胞增殖缺乏任何显著的刺激作用，并且还证明与多硫酸化多糖相组合缺乏任何协同作用。因此，可以看出多硫酸化多糖与HA相比是更好的软骨形成剂。此外，与NC4相反，HA不与多硫酸化多糖进行协同地结合。
还发现胶原IX型的α-1链的非胶原结构域的重组人类制剂，rhNC4诱导由祖细胞进行的软骨形成和ＰG生成。从图21明显可知，在缺乏（维持培养基）和存在胰岛素（分化培养基）这两种情况下都在ATDC5细胞上观察到ＰG合成的浓度依赖性刺激，最大的作用发生在1微克/mL。rhNC4的这种刺激作用也在成团培养的ATDC5细胞中得到证明，但在维持培养基中在0.5微克/mL的浓度下产生最佳效果。
当该蛋白与多硫酸化多糖共同培养时，观察到rhNC4对鼠ADTC5细胞的软骨形成和促有丝分裂的作用得到增强，正如可以在图23和24中见到。相对于HA与多硫酸化多糖，rhNC4与多硫酸化多糖的结合是协同性的，正如在分化培养基中1微克/mL的rhNC4以及2微克/mL的多硫酸化多糖这些浓度下通过3H-DNA合成的450%刺激作用所显示（图23）。对于PG合成的刺激作用，1-5微克/mL的rhNC4和5微克的多硫酸化多糖显示为最有效的结合（图24）。
图21、33和23显示使用含有一种生长因子的（在这个例子中是胰岛素）、针对祖细胞（ATDC5）的分化培养基（DM）以及不含有生长因子的维持培养基（MM）这两者的实验的结果。图21显示单独使用NC4，而图33和23显示该多肽与该多硫酸化多糖的结合的作用。可以看到本发明的化合物在缺乏该生长因子时促进软骨形成，但在这些生长因子的存在下对软骨形成的速率具有阳性作用。所以，本发明的化合物可以不与其他生长因子一起使用，但也可以与其他生长因子一起使用以便进一步促进软骨形成。
由在rhNC4和多硫酸化多糖的存在下所培养的ATDC5细胞进行表达的Runx2基因的研究显示，随着浓度的增加这种骨标志物逐步地向下调节（图25和26）。相比之下，用于HA合成基因之一（HAS3）以及针对HA（CD44）的受体都被这些化合物向上调节（图25和26）。特别值得注意的是，发现由单独使用多硫酸化多糖以及多硫酸化多糖+rhNC4（以显示刺激PG合成的浓度）进行的Smad2和Smad4的向上调节。Smad4已经被报道为一种主要的细胞内蛋白，用于在祖细胞中反式激活胶原II型启动子，这是当这些细胞被BMP激活时进行的（HatakeyamaY et al.Smad signaling in progenitor and chondroprogenitor cells.J Bone JointSurg AM.85A Suppl 3,13-8,2003,Chen D,Zhao M,Munday GR,Bone morphogeneticproteins.Growth Factors,22:233-41,2004）。尽管不希望被理论束缚，所以有可能的是多硫酸化多糖和NC4对祖细胞的软骨形成/增殖作用可能通过BMP的作用进行介导，该水平在这两种化合物的存在下在单独使用或组合使用时得到提高。
实验方法和方案
用双金鸡宁酸（BCA）测定法来确定样品的蛋白含量
所有样品的蛋白含量是使用BCA测定法来确定的（Smith PK,Krohn RI,HermansonGT,Mallia AK,Gartner FH,Provenzano MD,Fujimoto EK,Goeke NM,Olson BJ and KlenkDC.Anal.Biochem.150,76–85,1985）。将冷冻干燥的蛋白样品直接溶于H2O中，从而提供2.0mg/ml的溶液。每种样品溶液20μl，加入到96孔板的一个孔中。在测定之前，刚刚将50份的试剂1（0.4%NaOH；1.7%Na2CO3；0.95%NaHCO3；1.0%双金鸡宁酸；0.16%Na2-酒石酸盐）与试剂2（4%CuSO4.5H2O）混合。将200ul的这种工作试剂加入到该样品溶液中。在37℃下在孵育60分钟之后，使用Thermomax酶标仪读取吸光度A562。以0–10μg/孔使用牛血清白蛋白（BSA）或高纯度的明胶（Gibco）来构建一条标准曲线。样品的蛋白含量是从这条标准曲线测定的。
通过SDS-PAGE电泳分析蛋白
所使用的方法是基于由Laemmli所说明的方法（Laemmli UK.Clevage ofstructural protein during the assembly of the head bacteriophageT4.Nature.1970;227:680-685）。简言之，将样品与2x加样缓冲液（0.07M TrisHCl、1.5%SDS、20%甘油、0.2M DTT和0.1%BPB）1:1混合以达成终浓度在4.0至20mg/ml之间。将该混合物在水浴中煮沸5分钟。将20μl溶液上样到8%至16%预制Tris-甘氨酸凝胶（Norvex）的孔中。将SeeBlue预染低分子量范围蛋白标志物（Norvex）上样到该凝胶的左手侧的孔中，并且在125V下进行电泳，持续2小时。该凝胶在考马斯蓝R250溶液（40%乙醇、10%乙酸和0.2%考马斯R250）中染色30分钟，并且在含有10%乙醇和7.5%乙酸的溶液中脱色16小时。将该凝胶在Bio-Rad Gelair干燥机中干燥。
使用DMMB染料来进行硫酸化葡糖胺多糖（S-GAG）测定样品中硫酸化葡糖胺多糖（S-GAG）浓度是使用一种比色染料结合测定来确定，该测定是由Farndale等人所说明的方法改进的（Farndale RW,Buttle DJ,Barrett AJ.Improved quantitation anddiscrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethyl methyleneblue.Biochem.et.Biophys.Acta.1986;883:173-177）。
该测定基于当在该样品中或标准溶液中在1,9-二甲基亚甲蓝（DMMB）与硫酸化的GAG之间的混合物中形成了一种络合物时最大吸收处从690nm到535nm的异染色质性转换（metachromatic shift）。该染料溶液是通过将16mg的1,9-二甲基亚甲蓝加入到5ml乙醇中制备的，从而在pH3.5下在1升的总体积中2g甲酸钠和2ml甲酸。将软骨素-6-硫酸酯（CS-C）标准物（0-15和0-40μg/ml:50μl）或样品（50μl）转移到一个微孔板中。将染料溶液（200μl）立即加入到每一个孔中，并且当在静置时形成沉淀时立即在540nm处测量吸光度。使用已知CS-C浓度的样品的吸光度以及该酶标仪软件绘制了标准曲线。在未知样品中S-GAG的浓度是从该CS-C标准曲线确定的。
透明质酸物（HA）ELISA
将96孔微孔板（MaxisorpNunc）在4℃下用溶解于包被缓冲剂的脐带HA（SigmaChemical Co）（100μl/孔）包被过夜。然后，将未包被的区域在25℃下、用处于磷酸盐缓冲液（PBS）中的150μl/孔的1%（重量/体积）BSA封闭60分钟。在用PBS-Tween洗涤之后，加入100μl的有待测定的样品或标准的竞争物（HA Healon范围是19.53-10,000ng/ml）连同生物素偶联的-HA-结合蛋白（1:200）。在25℃下孵育60分钟之后，洗涤孔板并接着加入一种过氧化物酶-小鼠单克隆抗生物素（Invitrogen）（100μl/孔；1:4,000），并且将该混合物在25℃下孵育60分钟。再次洗涤该孔板，并接着加入一种过氧化物酶底物（Invitrogen）（100μl/孔），并且在37℃下孵育10到20分钟，从而允许颜色显色。这种反应式通过加入50μl的4M H2SO4而停止的。使用Titertek MultiskanM340多孔板酶标仪测量了492/690nm处的吸光度比值。
半定量RT-PCR mRNA
根据制造商的Aurum total RNA迷你试剂盒（Bio-Rad,USA）的说明书，从祖细胞中分离出总RNA。该RNA是用RevertAidTM H Minus First Stand cDNA Synthesis Kit（Fermentas,USA）反转录的。表1和2示出了用于PCR的引物序列和条件。将PCR产物转移到琼脂糖凝胶上，并且通过溴化乙锭染色进行可视化，并且整合的密度是使用Scion图像分析软件计算的，将其对于管家基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）进行标准化从而允许在mRNA水平上进行半定量比较（L.Marchuk,P.Sciore,C.Reno,C.B.Frank,D.A.Hart.Postmortemstability of total RNA isolated from rabbit ligament,tendon and cartilage,Biochim Biophys Acta.1379(1998)171-177.R.Boykiw,P.Sciore,C.Reno,L.Marchuk,C.B.Frank,D.A.Hart.Altered levels of extracellular matrix molecule mRNA inhealing rabbit ligaments,Matrix Biol.17(1998)371-378.）。
表1
鼠反转录物PCR的引物
表2用于半定量RT-PCR的引物
使用Dowex MAC3阳离子交换树脂来分离Peptacan蛋白/多肽
使用4%HCl超过24小时将Dowex MAC3树脂（100克）（Sigma Chemical Co）再生为氢型。借助于烧结玻璃过滤器，将该树脂彻底洗涤（3X2L H2O），然后用0.1M醋酸钙平衡调节到pH4.5。在pH4.5下以5mg/ml的浓度将Peptacan（10克）溶解于0.1M醋酸钙中，然后与该树脂混合并且轻柔地搅动1小时。通过过滤将这种含有未结合的S-GAG以及蛋白的溶液从该树脂分离，并且用加样缓冲液（10x树脂体积）洗涤该树脂直到使用Farndale等人的测定法不能检测到S-GAG。用Milli-Q水进一步洗涤该树脂几次并接着用0.2M Na2HPO4平衡。结合到该树脂上的蛋白是通过用NaOH将0.2M的Na2HPO4溶液调节到pH10.5来释放的。通过过滤穿过烧结玻璃的布氏漏斗再次将该树脂分离，收集滤液并且使用1Kda的TFF膜（MilliporeAustralia Pty Ltd,Sydney,Australia）透析过滤、然后冷冻干燥。
使用氯化十六烷基吡啶（CPC）沉淀法来分离Peptacan蛋白/多肽
氯化十六烷基吡啶（CPC）是一种水溶性的表面活性剂，它在其带有正电荷的吡啶鎓离子以及存在于Peptacan的硫酸化葡糖胺多糖（S-GAG）组分上的带有负电荷的硫酸根基团之间形成了强的水不溶性络合物。
在过去的40年间，许多研究人员已经对这些水不溶性CPC-S-GAG络合物进行了广泛地使用，从而将S-GAG从生物组织或流体的提取物中分离和纯化。然而，我们推测这个原理也可以用于分离在Peptacan中存在的蛋白/多肽，因为在沉淀并且除去这些CPC-S-GAG络合物之后这些Peptacan蛋白可以留在过滤的液体中。用于CPC-S-GAG沉淀步骤的操作是基于由Oegema和Thompson说明的方法（Oegema TR and Thompson RC.Characterisation ofa hyaluronic acid-dermatan sulfate proteoglycan complex from dediffertiatedhuman chondrocyte cultures.J Biol Chem.256:1015-1022;1981)，但修改如下：使用2M氯化钙将这种GAG-CPC络合物解离，并且用4X水性体积的乙醇将这些S-GAG从水性溶液中沉淀。这种含有Peptacan蛋白/多肽的水溶液，在除去CPC-S-GAG络合物之后，使用1000Da的截留超滤膜（YC10）或相似MW截留切向流超滤（TFF）筒（Millipore Australia Pty Ltd,Sydney,Australia)进行广泛地透析过滤。然而，在透析过滤的最后阶段用0.001M的乙酸替换该透析溶液以避免这些蛋白的沉淀。将这些透析过滤的溶液冷冻干燥以提供作为白色粉末的蛋白/多肽。
使用细菌系统来制备rhNC4
没有23信号肽的人类胶原IX的NC4的基因是在pGAT-2细菌表达载体上构建的，框内含有针对GST融合标签的序列，这是基于一种之前所说明的方法来进行的（Pihlajama T,et al.Characterization of Recombinant Amino-terminal NC4 Domain of HumanCollagen IX:Interaction with glycosaminoglycans and cartilage oligomericmatrix protein.J.Biol.Chem.2004;279:24265-24273）。将该重组人类NC4（rhNC4）构建体转移到一种大肠杆菌BL21（DE3）细胞系中。通过将该细胞系接种（1:100）到所希望的最终体积的、添加100微克/ml氨比西林的LB培养基上而在摇瓶中表达该融合蛋白。这些细胞在37℃下进行培养，直到在600nm处的吸光度达到0.6这个值。这种表达是通过加入异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷（IPTG）来诱导的，从而提供0.5mM的最终浓度。在37℃下继续孵育4至6小时或16小时。在离心之后，用1xPBS洗涤细胞团块3次，并且用匀浆缓冲剂[0.3M NaCl、0.2%IGEPAL CA-630（Sigma,Sydney,Australia）、0.05M磷酸钠缓冲剂（pH7）、0.25mg/ml溶菌酶]进行再次悬浮，然后冷冻保存，并且稍后在冰上通过超声均匀化。通过在4℃以17,000g离心40分钟将不溶的物质除去。该融合蛋白是通过加入硫酸铵至30%饱和而从上清液中沉淀出的。通过在4℃下以23,000g离心30分钟收集该沉淀，并且将其溶解于1x PBS（具有1%IGEPAL-CA630）中。通过在4℃下以23,000g离心30分钟使该溶液澄清，并且在4℃下以250μl/min的流速施用到谷胱甘肽-琼脂糖凝胶4FF柱（Amersham Biosciences,Sydney,Australia）。为了除去内毒素，施用50个柱体积（CV）的1x PBS（含有0.1% Triton X-114）来除去未结合的物质，之后跟随用20CV的1x PBS（无菌）进行洗涤（Reichelt P,Schwarz Cand Donzeau M.Single step protocol to purify recombinant proteins with lowendotoxin contents.Protein Expression and Purification46:483–488,2006）。在用10CV的因子Xa裂解缓冲剂（无菌）平衡之后，通过用Factor Xa蛋白酶（AmershamBiosciences或Promega）在室温下进行过夜消化将这种重组NC4（rNC4）从所融合的GST中切除。该rhNC4溶液迁移穿过谷胱甘肽-琼脂糖凝胶柱，用苯甲脒琼脂糖凝胶4FF结合缓冲剂（50mM Tris-HCl,100mM NaCl,pH7.4）洗脱，并且使用苯甲脒琼脂糖凝胶4FF柱（AmershamBiosciences）经受进一步纯化。流过的rhNC4是通过用dH2O在5K截留洗涤浓缩器（AgilentTechnologies）中进行洗涤而浓缩并且脱盐的。最终的纯化是使用一根Superdex S-200柱子、通过分子排阻色谱法来实现的。产物的大小和纯度是通过SDS-PAGE分析和蛋白质印迹法来确定的。纯化的rhNC4的浓度是使用Bradford（Sigma,Sydney,Australia）或BCA蛋白测定法来确定的。
在乳酸克鲁维斯酵母中表达人类NC4
(i)分离胶原α1(IX)NC4结构域基因
无23信号肽的人类胶原IX（GenBank登录号NM_001851)的NC4的基因是通过反转录PCR、连同从来自关节软骨的人类软骨细胞中提取的RNA而获得的。将人类软骨细胞接种到添加10%FCS的α-MEM培养基上。当这些细胞汇合时，将它们进行胰蛋白酶消化并且通过离心收集为一个细胞团块。用RNeasy迷你试剂盒（QiaGen Pty Ltd,Melbourne,Australia)从该细胞团块中提取总RNA。按照制造商的说明书，用SuperScriptTMOne-Step RT-PCR和Platinum Taq（Invitrogen,Melbourne,Australia)进行反转录PCR。上游和下游的引物对应地是KL-NC451和KL-NC431（表1）。使用1个循环的55℃持续30分钟、之后跟随2分钟94℃预变性、以及40个循环的PCR扩增（变性:94℃，持续30秒；退火：55℃，持续30秒；延伸：72℃，持续1分钟）进行cDNA合成。这些RT-PCR产物是由0.8%琼脂糖凝胶进行分离的，并且用SNAPTMGel Purification（Invitrogen、Melbourne、Australia）进行纯化。
(ii)在酵母中构建表达该胶原α1(IX)NC4结构域的载体
将乳酸克鲁维斯酵母表达系统（New England Biolab,USA）用来生成一种DNA构建体，用于在酵母（产乳糖酶酵母）中表达人类α1(IX）胶原NC4结构域（hNC4）。对一组寡核苷酸引物（表1）进行设计以扩增全长hNC4（NCBI登录号NP_001842）的氨基酸24–268的片段，它省略了23个氨基酸的信号肽。
表1.用于构建pKLAC1-NC4表达载体的引物
该5’-引物KL-NC451包含一个工程化处理的Xho I切割位点，并且该3’-引物KL-NC431包含一个工程化处理的Bgl II切割位点。使用这两个引物，通过反转录PCR来扩增无信号肽的hNC4片段。
该5’-引物KL-NC454和该3’-引物KL-NC433对应地包含经工程化处理的Xho I和Bgl II切割位点。与引物KL-NC451和引物KL-NC431不同，KL-NC454和KL-NC433提供了许多基因突变，根据乳酸克鲁维斯酵母优选的密码子这些突变改变了hNC4基因、但保持该hNC4蛋白序列没有改变。
hNC4的PCR产物是通过限制性内切酶消化并且在多克隆位点Xho I和Bgl II处连接到pKLAC1表达载体上（图1）。对阳性插入的重组体进行测序以确定该NC4基因插入序列是正确的。通过限制性核酸内切酶Sac II将这些正确的重组体消化，并且将其转移感受态乳酸克鲁维斯酵母GG799细胞中。使用含有作为一种氮源的5mM乙酰胺的酵母碳基（YCB）培养基作为一种选择培养基。只有在具有NC4目标基因和amdS基因（amdS基因存在于pKLAC1中）的重组体的Sac II片段已经整合到酵母染色体DNA中之后，这些细胞才可以在这种选择性YCB培养基中存活。
对该5’-引物GAT2-GST53和该3’-引物GAT2-GST33进行设计，以便从具有一些突变的细菌载体pGAT-2中获得一种谷胱甘肽-S-转移酶（GST）基因用于在乳酸克鲁维斯酵母中进行表达。这种GST基因（它在3’端具有3个终止翻译的密码子）在载体pKLAC1多克隆位点Bgl II和Sal I中构建以形成pKLAC1-GST。
该5’-引物KL-NC454和该3’-引物KL-NC438被设计用于一种重组hNC4，该重组hNC4具有将Glu267转变成Gly的突变。这个突变在hNC4的C末端提供了一个凝血酶切割位点。将这种重组hNC4在克隆位点Xho I和Bgl II处连接到载体pKLAC1-GST上，这样就获得了一个N-末端GST融合蛋白。在DNA序列证实之后，这种具有NC4-GST融合蛋白基因的重组体用Sac II消化并且被插入乳酸克鲁维斯酵母GG799细胞的染色体DNA中，然后由YCB选择性培养基对具有整合的NC4和amdS基因的存活的克隆进行筛选。
(iii)在乳酸克鲁维斯酵母GG799细胞中表达胶原α1(IX)NC4结构域
来自每个含有整合表达的hNC4的集落的细胞是从约2mm2的区域中、通过用无菌牙签或枪头刮取收获的，并且在一个无菌培养试管中将它们再次悬浮在2ml的YPGal培养基（10g酵母提取物、20g BactoTM蛋白胨、2%半乳糖）中。将这些培养物在30℃下摇动（约250r.p.m.）孵育持续最少2天的生长。每天对培养上清液进行分析以确定达到NC4最大分泌的最适宜的生长时间。用于蛋白纯化的较大的培养物（例如，≥1L）与起始培养物以1:100接种，在30℃下生长过夜。样品（每个培养物1ml）以10,000g离心1分钟以使细胞成团。将培养物上清液转移到一个新的微量离心管并且在冰上保存。将30μl未浓缩的培养物上清施用于SDS-PAGE（NuPAGE 4-12% Tris-Bis Gel,MES缓冲剂，Invitrogen），之后跟随考马斯染色（Colloidal Blue Stain Kit,Invitrogen）和/或蛋白质印迹法。
(iv)部分纯化从乳酸克鲁维斯酵母GG799表达的rhNC4蛋白
将体积大于1L、用于蛋白纯化的3天的培养物用C盐-512（Celite-512）过滤以除去这些细胞和碎片。将澄清的水性滤液透析过滤，并且通过施用10KDa截留切向流动过滤（TFF）膜（Millipore Ltd,Sydney,Australia）进行浓缩。在2X5体积的50mM磷酸钠缓冲剂（pH7.4）透析过滤之后，该培养基溶液被浓缩到1至2L并且在4℃下保存过夜或立即进行(NH4)2SO4沉淀。将固体(NH4)2SO4加入到该培养基溶液中达到80%饱和（0℃）。该沉淀是在4℃下通过以14,000g离心30分钟来收集的，并且将其溶解于50mM磷酸钠盐缓冲液（pH7.4）中。纯化的rhNC4的蛋白浓度是使用Bradford或BCA（Sigma、Sydney、Australia）测定法确定的。使用与在此说明用于从大肠杆菌制备的rhNC4相同的方法进行这种物质的额外的纯化。
在不同浓度的多硫酸戊聚糖（PPS）的存在下对祖细胞的深冷保存
收集细胞并且以5.0至20.0x106个细胞/ml在冷的无血清的培养基中将这些细胞再次悬浮。将等体积的凉的完全Profreeze-CDM培养基加入到这种凉的细胞悬浮液（含有0、10、20、50和100微克/mL的PPS）中。得到的最终DMSO浓度是7.5%，PPS浓度是0、5、10、25和50微克/mL，并且最终的细胞浓度是约2.5至10x106个细胞/ml。将该细胞混合物等分到几个深冷保存安剖（Nunc,Intermed,Denmark）中，并且在C156冷冻容器（Thermo Scientific,Melbourne,21 Australia）中在-80℃以-1℃/分钟的受控冷却速度进行深冷保存。然后，将这些安瓿转移到液氮存储器（-196℃）中
深冷保存的样品的融化
将深冷保存的细胞在37℃水浴中快速融化1分钟，并且将其转移到一个10mL的聚丙烯试管中。将大约3mL适当的培养基逐滴加入到这些细胞中，不断搅拌，并且形成10mL的最终体积。通过以400xg、4℃离心5分钟将细胞成团，并且吸取上清液。为了确保将残留的DMSO去除，在培养基中洗涤细胞并且如以上所述进行离心。将细胞再次悬浮于10mL的最终体积中，并且在37℃下在5% CO2的存在下、在潮湿培养箱中孵育之前接种于一个75cm2烧瓶中。
在不同浓度的多硫酸戊聚糖（PPS）存在下对深冷保存之后的细胞进行计数
从含有PPS的深冷保存小管中融化祖细胞之后获得的等分部分的单细胞悬浮液以等体积的0.4%（重量/体积）台盼蓝稀释到磷酸盐缓冲盐水中（PBS）。使用血球计数器（Neubauer Improved,Assistant,Germany）和光学显微镜（Olympus CKX41,Japan）来确定细胞计数。
这项实验的结果在图1中示出。大体上，可以看到加入PPS对祖细胞的深冷保存没有不良作用。
除了30分钟以外，使用50μg/ml PPS在所有的时间点增强了祖细胞的活力。使用25μg/ml PPS在所有时间点（而不是30分钟）增强了活力或对这些祖细胞的活力没有不利影响。使用10μg/ml PPS在时间点0并接着在60和90分钟具有一种有益的作用。使用5μg/mlPPS在60分钟对活力一种具有有益的作用。
总体而言，大体上可以看到PPS的加入不具有负面作用并且可以增强祖细胞的深冷保存。在数值上的微小差别可能是由于对细胞进行计数所使用的方法的缘故。由于这些祖细胞倾向于成簇，这可能导致一些误差，这些误差将解释5微克PPS（其中成簇是常见的）的值为何明显较低。
使用MTT测定法来测定多硫酸戊聚糖（PPS）对祖细胞在深冷保存和融化之后的活力的浓度决定的作用
将购于RIKEN细胞库（Tsukuba,Japan)的鼠祖细胞（细胞系C3H10T1/2或ATDC5）或人类免疫选择的Stro-1+祖细胞（Mesoblast Ltd、Melbourne、Australia）以不同的细胞密度（在1.68x105-1.0x106个细胞的范围内）接种于含有DMEM+10%FBS的2ml带螺帽的离心管中。在分开的试管中制备含有2x所要求浓度的PPS的母液（溶解于DMEM+20%FBS和15%DMSO）。将这些母液加入细胞培养物中，这样使得PPS的最终浓度是该母液浓度的一半并且FBS是10%并且DMSO是7.7%。在几个独立的实验中，在最终的溶液中PPS的最终浓度在0.0–100ug/ml的范围内（详见附图）。将所用的PPS的所有浓度测验3次。将细胞和含有该PPS的深冷保存溶液轻柔地混合5分钟并且储存在液氮中。3天后，将这些试管从液氮中取出并且在37℃水浴中融化，并且允许在环境温度下静置约15分钟。将这些细胞以200g离心5分钟，并且弃去上清液。将这些细胞用900ul无酚红的DMEM进行洗涤，并接着以200g离心5分钟。将这些细胞在处于DMEM中的500ul、1mg/ml MTT溶液中再次悬浮，并且在37℃孵育3小时然后以6000g离心5分钟。向每个试管加入300ul的DMSO来溶解这些染料晶体。将来自每个试管的90ul x3转移到一个96孔板中，并且确定在540nm处的吸光度。
图2显示了一个柱状图，该柱状图显示在经受冻融循环之后悬浮于深冷介质（含有7.5%DMSO和不同浓度的多硫酸戊聚糖（PPS)）中的不同数量的鼠ATDC5祖细胞的活力。用MTT测定法确定细胞活力
图2显示这些祖细胞的活力被以所有浓度存在的PPS增强。在100μg/ml PPS，活力得到增强，细胞计数为0.25百万、0.5百万以及1.0百万个细胞。在250μg/ml PPS看到了同样的情况。对于500μg/ml PPS，对于0.25百万和0.5百万个细胞看到了增强作用。对于1百万个细胞，500μg/ml PPS的浓度没有显示增强活力但对活力没有有害的作用。
通过外推这些数据，可以推测100百万个软骨祖细胞连同25-50mg PPS的剂量当在一种适当的深冷防护介质中经受一次冻融循环时将保持这些细胞的活力，达到可接受的给予需要这种治疗的患者的一个水平。
图3显示在-180℃深冷保存并且融化之后不同浓度的多硫酸戊聚糖（PPS）钠对人类祖细胞活力的作用，正如使用MTT测定法所确定。显示的数据=平均值+SD*=p<0.05（相对于对照值）。当深冷保存168,000个细胞时，PPS的存在改进了这些细胞的活力，特别是在1和2.5μg/ml PPS。使用350,000个细胞，大体上可以看到这些祖细胞的活力没有由于存在PPS而受到不良影响。在一些情况中，这些细胞的活力在融化之后得到增强。
通过外推这些数据，可以推测100百万个人类祖细胞连同30mg PPS的剂量当在一种适当的深冷防护介质中经历一次冻融循环时将保持这些细胞的活力，达到可接受的给予需要这种治疗的患者的一个水平。
多硫酸戊聚糖（PPS）对通过加入IL-4IFN-γ的组合所诱导的人类祖细胞凋亡的作用，正如通过流式细胞仪所确定
将人类祖细胞铺在以0、1、2、5和10微克/mL浓度的PPS补充的无血清培养基中。通过加入30ng/ml IL-430,000U/ml IFNγ的组合来诱导祖细胞凋亡。5天培养之后，通过胰蛋白酶消化收集细胞，并且如之前所说明通过钙磷脂结合蛋白Ⅴ染色来评估活力(Kortesidis A,A Zannettino,S Isenmann,S Shi,T Lapidot and S Gronthos.(2005).Stromal-derived factor-1 promotes the growth,survival,and development ofhuman bone marrow stromal stem cells.Blood 105:3793-3801)。
这项实验的结果示于图6中。可以看到对于所有浓度的PPS而言细胞凋亡都被降低，其中10μg/ml可以看到最好的结果。这些结果表明当融化时将PPS加入到深冷保存介质中将降低凋亡。
这项实验是在含有50,000个祖细胞/孔的一个96孔板中进行的。不希望被理论束缚，据信凋亡和应激蛋白级联的激活是细胞冻融的一个公认的顺序，并且因此PPS显著地降低该过程的能力必须是对在深冷保存和融化之后使用这些细胞有益的，正如在基于医学操作的大多数细胞中所要求的。
单独使用多硫酸戊聚糖钠（PPS）或与rhNC4相结合对由单层培养生长的祖细胞进行的蛋白聚糖的生物合成（以35S-GAG测量）的作用
将购于RIKEN细胞库（Tsukuba,Japan）的鼠祖细胞（细胞系C3H10T1/2或ATDC5）或人类免疫选择的Stro-1+祖细胞（Mesoblast Ltd,Melbourne,Australia）接种于50mL塑料培养瓶中（含有1:1高糖DMEM/Ham’s F-12培养基（Invitrogen），补充10%FBS（Sigma)），并且在37℃下、在5%CO2中进行孵育。达到会合之后，通过胰蛋白酶消化释放祖细胞并且通过离心进行收集。将细胞以每孔3x104个细胞或2x105个细胞的密度接种到96孔或24孔板中。在37℃下、5%CO2孵育48小时之后，在正常情况下建立了会合的单层。然后，将该培养基更换为限定的培养基，该培养基含有不同浓度的PPS、具有和不具有rhNC4以及5μCi/ml的35S-H2SO4（PerkinElmer,USA）。孵育48小时之后当通过测量35SO4的掺入到葡糖胺多糖（35S-GAG）中来确定蛋白聚糖生物合成时这些实验大体上被终止，如以下所说明。
(A)96孔板用木瓜蛋白酶对培养物进行蛋白质分解消化以释放葡糖胺多糖。所使用的木瓜蛋白酶母液含有2.5mg/ml木瓜蛋白酶（Sigma）、7.9mg/ml半胱氨酸-HCl（Sigma），处于木瓜蛋白酶消化缓冲剂（0.1M NaAc，5mM EDTA，pH6.0）中。向每个孔中加入50μl的木瓜蛋白酶母液。用塑料薄膜密封该孔板，并且在65℃下孵育2小时。一旦终止，收集每孔等分部分的50μl消化的溶液用于使用Hoechst 33258染料进行的DNA荧光测定，并且该方法由Kim等人说明（Kim YJ,Sah RLY,Doong J-YH,Grodzinsky AJ,Fluorometric assay of DNA incartilage explants using Hoechst3358.Anal Chem.1988;174:168-176）。
用氯化十六烷基吡啶（CPC）（Sigma）将剩余溶液中（200ul）的35SO4-GAG沉淀。简言之，向每个孔加入20μl的5% CPC，之后跟随10μl的1mg/ml硫酸软骨素A（CSA,Sigma）作为一种共沉淀剂。使用细胞收集器（Skatron 7021）通过真空过滤收集这些35S-GAG-CPC络合物。然后，将这些过滤器进行空气干燥，并且转盘对闪烁瓶打孔。随后加入3ml闪烁液体并且漩涡震荡，样品中这些35S-GAG-CPC络合物的放射活性是通过闪烁计数器（PerkinElmer,USA）测量的并且记录为DPM/样品。然后，将数据对DNA归一化并且表达为35-S-GAGs/μg DNA。
(B)24孔板在这种限定的培养基中孵育48小时之后，将每孔的培养基（含有可溶的35S-标记的蛋白聚糖）与这些细胞分离并且将其转移到一个2.0ml的微量离心管中。将这些孔中剩余的单层细胞通过胰蛋白酶消化分离，并接着通过以350g离心5分钟与上清液（含有基质蛋白聚糖）分离。收集该上清液并且将其与该培养基组合。将200μl的培养基与上清液混合物转移到一个96孔板中，并且经受木瓜蛋白酶消化，从而释放葡糖胺多糖。木瓜蛋白酶消化之后，向每个孔加入20μl的5% CPC来沉淀35S-GAG，之后跟随10μl的1mg/ml CSA作为一种载体。通过该纤维过滤器收集这些35S-GAG-CPC络合物，并且使用如以上所说明的液体闪烁分析仪来测量35S-GAG的放射活性。用RNA试剂提取这些细胞，并且通过该荧光测定来测量用于确定基因表达和/或DNA含量的等分部分，并且将这些结果表示为35-S-GAGs/μgDNA。
图4显示了多硫酸戊聚糖对人类祖细胞增殖的作用。
原代人类祖细胞在24孔板中在添加指定浓度的PPS的生长培养基中进行培养。在不同的时间间隔（第1、3、6天），去除该生长培养基并且用不含酚红、含有四唑鎓盐WST-1的培养基替换，在37℃/5% CO2下持续2小时。在活细胞中WST-1被线粒体脱氢酶分裂，从而产生一种甲臜染料，该染料可以使用ELISA酶标仪在450nm的波长下进行检测。显示了所有浓度的PPS对于每个时间点在450nm处的吸光度。在第6天在超过1μg/ml的PPS浓度下观察到统计学上显著的增殖增加（*p<0.01,ANOVA）。图4显示相对于在不含有该多硫酸化多糖的深冷保存介质中冷冻的祖细胞，祖细胞的活力得到增强。
图9显示多硫酸戊聚糖钠（PPS）对鼠祖细胞（C3H10T1/2）在单层培养生长时生物合成蛋白聚糖（PG）和DNA含量的浓度依赖性作用。显示的数据是平均值±SD。
可以看到在所有浓度的PPS下蛋白聚糖的生物合成得到增加。这显示使用多硫酸化多糖可以诱导分化，特别是在所有浓度范围软骨形成。对于5–10μl/ml可以看到最好的结果，其中相对于PG合成10μl/ml是最好的，并且相对于DNA含量5μl/ml和10μl/ml是最好的。
图10显示多硫酸戊聚糖（PPS）对由单层培养生长2天的鼠祖细胞（C3H10T1/2细胞）进行的DNA合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如通过3H-胸腺嘧啶核苷掺入到大分子DNA中所确定。
图11显示多硫酸戊聚糖（PPS）对蛋白聚糖（PG）的生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在人类祖细胞的单层培养2天后通过将放射活性标记的硫酸根掺入到PG的硫酸化葡糖胺多糖（35S-GAG）所确定。这些数据被表示为35S-GAG放射活性，作为每分钟衰变数（DPM）、归一化为DNA含量。*=p<0.05；**=p<0.005；***=p<0.0005。
图21显示在缺少（维持培养基，MM）和存在胰岛素（10微克/mL）（分化培养基，DM)）下由乳酸克鲁维斯酵母表达的rhNC4（批号PBA-1202P）对蛋白聚糖（PG）的生物合成的浓度依赖性作用的柱状图，正如在鼠ATDC5祖细胞培养3天之后通过将放射活性标记的硫酸根掺入到硫酸化葡糖胺多糖（35S-GAG）中所确定。这些数据被表示为相对于不含有rhNC4的对照培养物的%变化。P<0.05是相对于对照培养物在统计学上显著的。
图24显示了PPS和NC4相组合的结果。可以看到PPS的作用随着浓度而增加。还可以看到在越来越高的浓度的NC4的存在下这种作用得以增强。
0.5μl/ml NC4和5μl PPS的组合显示了蛋白聚糖合成的统计学显著的增加。此外，1μl/mlNC4和2μl/ml以及5μl/ml PPS的组合显示了蛋白聚体合成的统计学显著的增加。而且，2μl/ml NC4连同1μl/ml、2μl/ml或5μl/ml PPS的组合，或5μl/ml NC4连同1μl/ml、2μl/ml或5μl/ml PPS的组合都显示蛋白聚糖合成的统计学显著的增加。
使用5μl/ml NC4或5μl/ml PPS显示出最好的结果，其中5μl/ml NC4和5μl/ml PPS的组合是最好的。
单独使用多硫酸戊聚糖（PPS）钠或与rhNC4相组合对由成团培养生长的祖细胞进行的蛋白聚糖的生物合成（以35S-GAG测量）的作用
将购于RIKEN细胞库（Tsukuba,Japan）的鼠祖细胞（细胞系C3H10T1/2或ATDC5）或人类免疫选择的Stro-1+祖细胞（Mesoblast Ltd,Melbourne,Australia）接种于2ml带螺帽的无菌离心管中，并且用含有10%FBS的DMEM高糖培养基使总体积达到1ml。然后，将祖细胞在甩平式转头中在室温下以500g离心10分钟。松开螺旋帽，并且将这些试管在37℃、在5%CO2/95%空气的潮湿气氛中置于一个培养箱中。大体上在24小时内形成这些团块。在开始2天内每天更换培养基，接着在这之后每2-3天更换一次。在第5天去除该培养基，并且向每个试管中加入1ml的DMEM-高糖培养基，该培养基含有10%FBS、5.0μCi/ml35S-H2SO4以及不同浓度的PPS（0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μg/ml）（图12-15）或rhNC4（0、0.1、0.5、1.0、20.0μg/ml）（图22）。对于所有浓度的药物使用3次进行培养。松开螺旋帽，并且将这些试管在37℃下、在5%CO2/95%潮湿空气的气氛中在一个培养箱中放置3天。第6天，向每个试管中加入200ul储备的木瓜蛋白酶溶液[2.5mg/ml木瓜蛋白酶，7.9mg/ml L-半胱氨酸，在木瓜蛋白酶缓冲剂（0.1M NaAC，5mM EDTA，pH6.0）中]。将这些试管紧密地盖上帽，并且在65℃下孵育2小时。在木瓜蛋白酶酶解后，将4个重复的200μl木瓜蛋白酶酶解的溶液分开转移到一个96孔微孔板中（200μl/孔）。剩余的溶液用于DNA荧光测定，该测定如以上所说明进行3次。如所说明对这些单层培养物确定35S-GAG的生物合成，并且将这些结果表示为35-S-GAGs/μgDNA。
图22显示了在缺少（维持培养基，MM）和存在胰岛素（10微克/mL）（分化培养基，DM）下由乳酸克鲁维斯酵母表达的rhNC4（批号PBA-1202P）对成团培养的ATDC5细胞的蛋白聚糖（PG）生物合成的浓度依赖性作用的柱状图。数据被显示为%对照值，对照值取为100%。
用肝素（Sigma,Sydney,Australia）替代PPS进行类似的实验。这些结果见于图14。肝素通过抑制这些祖细胞的软骨形成而调节分化。
单独使用多硫酸戊聚糖钠（PPS）或与rhNC4相组合对由6天成团培养生长的祖细胞进行的生物合成DNA（以3H-胸腺嘧啶核苷插入进行测量）的作用
将购于RIKEN细胞库（Tsukuba,Japan）的鼠祖细胞（细胞系C3H10T1/2或ATDC5）或人类免疫选择的Stro-1+祖细胞（Mesoblast Ltd、Melbourne、Australia）以3x105个细胞的密度接种于2ml带螺帽的离心管中，并且用DMEM-高（+10%FBS）注满到1ml。将细胞在一台甩平式离心机中在室温下以500g离心10分钟，然后在37℃下、在5%CO2/95%空气的潮湿气氛下孵育24小时。在这个时间内观察到团块建立起来。在开始2天内每天更换培养基，接着在此之后每2-3天更换一次。在第3天，去除该培养基，向每个试管加入640ul的DMEM（+10%FBS）、80ul的50mCi/ml3H-胸腺嘧啶核苷以及80ul的rhNC4（0、1、2.5、5、10、25微克/ml）。（图23）。
所有测试进行3次。3天（66小时）之后，将上清液培养基去除并且保留用于HAELISA。向每个团块试管加入100ul的1mg/ml胶原酶（溶解于DMEM培养基中）。将试管在37℃下在摇床中以180-200rpm孵育3.5小时。将胶原酶酶解物转移到一个96孔板中，这样使得每个试管的内含物分到4个孔中。向每个孔加入200ul dH2O，并且将该孔板保存在-20℃下用于稍后的分析。将这些该胶原酶酶解物融化，并且用细胞收集器和放在闪烁试管中的滤片收集DNA。加入闪烁混合物液体（3mL）并且漩涡震荡约1分钟。使用β-闪烁计数器来确定这些样品中3H-DNA的放射活性。
单独使用多硫酸戊聚糖钠（PPS）或与rhNC4相结合对由微团培养生长的祖细胞进行的蛋白聚糖生物合成（以35S-GAG测量）的作用
所使用的技术是基于以下所说明（Denker AE,Haas AR,Nicoll SB and TuanRS.Chondrogenic differentiation of murine C3H10T1/2 multipotential progenitorcells:I.Stimulation by bone morphogenetic protein-2 in high density micromasscultures.Differentiation(1999);64:67-76）。简言之，将购于RIKEN细胞库（Tsukuba,Japan）的鼠祖细胞（细胞系C3H10T1/2或ATDC5）或人类免疫选择的Stro-1+祖细胞（Mesoblast Ltd,Melbourne,Australia）。将10微升（10μl）的祖细胞悬浮液（1x107个细胞/ml，在Ham′s F12培养基+10%FBS中）施用于一个24孔板的单个孔中。在37℃下在5%CO2/95%空气的潮湿气氛下孵育2-3小时之后，向这些孔中缓慢加入900μl的Ham′s F12培养基（10%FBS）和100μl的PPS溶液（在同一培养基中），从而提供0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μg/ml中每种的PPS最终浓度，这种PBS是单独存在的或与rhNC4（0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0μg/ml）相结合。每个药物浓度重复3次。将这些细胞保持培养高达10天。每3天更换具有/没有药物的培养基，但在实验结束前24小时加入80μl的50μCi/ml35S-H2SO4以实现最终5μCi/ml的35SO4浓度。在接下来的一天，将这些孔板之一的细胞用150μl/孔的2.5%胰蛋白酶进行胰蛋白酶酶解，并且通过以800g离心10分钟与培养基分离，用500μl的1xPBS洗涤，并且保存在液氮中用于RNA和/或DNA的提取和分析。将培养基和上清液与对于所使用的每种浓度的PPS的一个试管中。向这些试管加入200μl的5x木瓜蛋白酶溶液[2.5mg/ml木瓜蛋白酶、7.9mg/ml L-半胱氨酸，在木瓜蛋白酶缓冲剂（0.1M NaAC、5mM EDTA、pH6.0）中]，并且将该溶液在65℃下孵育2小时。在木瓜蛋白酶酶解之后，将4个等分部分的200μl的酶解溶液转移到一个96孔板中（200μl/孔）。通过加入20μl 5% CPC和10μl 1mg/ml CSA、以300rpm在室温下温和地摇动20-30分钟，将由酶解步骤释放35S-GAG与游离的35SO4分开，从而将这些35S-GAG-CPC络合物沉淀。通过使用细胞收集器过滤通过玻璃纤维过滤器来收集这些沉淀。然后，将这些过滤器进行空气干燥，并且转盘对闪烁瓶打孔。加入3ml/瓶闪烁混合物液体并且漩涡震荡30-45秒。通过闪烁计数法测量掺入35S-GAG-CPC络合物的35S-SO4的放射活性。
针对II型胶原对微团培养的祖细胞的免疫化学染色
在24孔培养板中以8x104个细胞/微团培养的起始密度在1ml DMEM（+10%FBS）（具有/不具有不同浓度的如以上说明的多硫酸戊聚糖）中建立了微团培养的祖细胞。在培养的第5天和第10天，去除培养基并且用Histochoice MB（Amresco、Solon、OH、USA）在室温下将培养物固定20-30分钟。将所固定的培养物在PBS中洗涤2次（每次5分钟）；在PBS中p洗涤2次（每次5分钟）；在室温下blfor20分钟，然后在PBS中洗涤5分钟。然后孵育这些孔板。在漂洗（首先用柔和的PBS液流，之后跟随使用PBS洗涤3次（5分钟每次））之后，这些孔用P5封闭分钟。对于deIgG，用柔和的PBS液流漂洗、然后用PBS洗涤3次（每次5分钟），向每个微团培养物中加入200μl的1x（BCIP/缓冲液+NBT），并且当通过用自来水洗涤在该部分中首先确立起紫色时将在反应中所孵育的这些孔板终止反应。然后，用数字照相机对孔板和孔进行照相，并且通过在个人计算机上用软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/）来分析这些图像。
图16显示了一个柱状图，该图显示了PPS对由微团培养6天和9天的鼠祖细胞（C3H10T1-2）进行的蛋白聚糖合成的浓度依赖性作用。向该培养基（Ham’s F12+10%FCS）中加入PPS，并且每48小时进行更换。在培养终止前24小时加入35S-SO4。将合成归一化为DNA含量。*P<0.05、**P<0.005、***P<0.0005。
在该细胞系中观察到在1至20微克/mL的浓度范围内35S摄入到新合成的PG中的非常显著的刺激作用。（图16）。而且，在微团培养9天后在1微克/mL PPS下观察到100%刺激作用（图16）。
图17显示了柱状图，这些图显示了PPS对由微团培养5天的人类祖细胞进行的蛋白聚糖合成的浓度依赖性作用。数据呈现为35S-GAG放射活性，并且作为对照物的百分比，对照物取为100%。*P<0.05相对于对照物。在0.5至10μg/ml的浓度范围内可以看到增加的蛋白聚糖的合成。
当在PPS的存在下孵育时在微团培养中人类祖细胞也分化成软骨细胞。然而，在这些5天的培养物中，用2.5微克/mL的PPS浓度获得了30%的PG合成的最大刺激作用（图17）。
图18显示了一个柱状图，该柱状图显示了由微团培养10天的人类祖细胞所生产的II型胶原多硫酸戊聚糖（PPS）浓度依赖性刺激，正如通过筛选和分析B中所示的免疫染色的微团培养物所确定。在0.5至10μg/ml的浓度范围内看到增加的胶原II型的产生，其中对于5μg/ml看到最好的结果。
这些结果表明PPS诱导这些祖细胞分化成软骨细胞，正如通过蛋白聚糖和胶原II型这两者增加的合成所证明。
用用透明质酸（SuperArtz（SKK,Tokyo,Japan））和多硫酸葡聚糖（MW=5000）（Sigma,Sydney,Australia）替代PPS进行类似的实验。这些结果示于图19中，图19表示了柱状图，这些柱状图显示(A)透明质酸物（HA）（SupartzTM）和(B)多硫酸葡聚糖对微团培养5天的人类祖细胞进行的蛋白聚糖合成的浓度依赖性作用。数据呈现为35S-GAG放射活性，并且作为对照物的百分比（对照物取为100%）或作为DPM/ug DNA。*P<0.05相对于对照物。可以看到HA表现出增加蛋白聚糖的合成，但并不强烈。相比之下，葡聚糖硫酸酯向下调节了祖细胞的分化，正如通过蛋白聚糖产量的浓度依赖性减少所证实。
多硫酸戊聚糖钠（PPS）对由8天微团培养生长的祖细胞生物进行的生物合成DNA（以3H-胸腺嘧啶核苷掺入进行测量）的浓度作用。
向24孔培养板的每个孔中接种10μl祖细胞（7x106个细胞/ml）。在37℃下在潮湿的5%CO2/95%空气中孵育2至3小时之后，向这些孔中缓慢地加入900μl的DMEM-高培养基（+10%FBS）以及溶解于DMEM-高培养基中指定浓度的PPS。最终的PPS浓度对应地是0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0μg/ml。每个PPS浓度确定3次。这些培养可以进行3天。在第4天，向该24孔板的每个孔加入640μl的DMEM-高（+10%FBS）、80μl的10xPPS溶液以及80μl的10μCi/ml 3H-胸腺嘧啶核苷溶液，从而生成1μCi/ml的3H-胸苷终浓度、以及如所指定的PPS终浓度。然后，将这些培养物在37℃、5% CO2下进一步孵育22小时，去除该培养基并且向每个孔加入200μl的1mg/ml胶原酶溶液[胶原酶缓冲剂：66.7mM NaCl、6.7mM KCl、4.8mM CaCl2·2H2O、10mM HEPES(pH7.4)]。将这些孔板在37℃下孵育2.5小时以释放这些细胞。每半小时用手轻轻摇动该孔板。胶原酶消化之后，将这些细胞和消化溶液以500g离心5分钟。去除上清液。将这些细胞轻柔地与200μl的TE缓冲剂混合，并且通过冻融2次进行裂解。裂解之后，在搅拌下向这些细胞中加入超过200μl的TE缓冲剂。将几个等分部分的细胞裂解液施用到96孔板中作为4个重复（每孔100μl）。使用玻璃纤维过滤器和细胞收集器来收集细胞裂解液中的3H-DNA。然后，将这些过滤液空气干燥，并且对闪烁瓶打孔。加入3ml/瓶闪烁混合液体并且漩涡振荡30至40秒。通过闪烁计数器来测量结合到增殖细胞的DNA中3H的放射活性。
这些结果示于图5，它显示了与PPS相结合的祖细胞的增加的增殖。可以看到所有浓度的PPS增加了增殖，其中在1和2.5μg/ml的浓度下看到最好的结果。
通过测量3H-葡糖胺掺入到HA中多硫酸戊聚糖（PPS）钠对由祖细胞进行的透明质酸物的生物合成的浓度作用
使用以上的方法在24孔板中在微团培养物中建立人类免疫选择的Stro-1+祖细胞（Mesoblast Ltd、Melbourne、Australia），除了将这些祖细胞以7x105细胞/孔的密度接种。培养24小时后，更换该培养基并且更换为DMEM培养基，该培养基含有10% FCS和25μg/ml庆大霉素、含有多种浓度（0.0、0.5、1.0、2.5微克/mL）的PPS（Bene-Arzneimittel,Munich,Germany），该培养基已经通过0.22μm过滤器进行灭菌。这些培养物在5% CO2/95%潮湿空气下、在37℃下孵育将8天，其中每3天更换含有指定浓度的PPS的培养基。在第8天，向含有指定浓度的PPS的培养基中加入3H-葡糖胺，从而提供一种含有1.0μCi/ml的溶液，将它加入到每个孔中。将这些孔板再孵育24小时。在第9天结束培养，将培养基收集到5ml带盖的试管中，并且在分子排阻色谱分析之前在4℃下保存，如以下所说明。
使用凝胶过滤层析法在培养基中分离并定量3H-透明质酸物（3H-HA）
来自每个培养基样品的两个0.5ml的等分部分被标记为A和B。将20μl的1M乙酸（pH6.0）加入到所有等分部分中。将50μl反应缓冲剂（20mM乙酸钠和0.15M NaCl，pH6.0）加入到等分部分A中，并且将50μl的5TRU链霉菌玻璃酸酶（HYALASE）（在反应缓冲剂中）加入到等分部分B中。将所有样品在60℃下孵育3小时，之后跟随煮沸5分钟，从而使加入的玻璃酸酶失活。在凝胶过滤之前将这些样品保存在-20℃下。
使用预先包装Superdex-S200的凝胶过滤柱来分离并且鉴别培养基中的3H-HA和3H-PG。培养基样品在上样到该柱之前刚刚使用台式微量离心机在高速下常规地离心10分钟。将样品（每个200μl）通过加样环注射到该柱中，并且用PBS缓冲剂（0.15M NaCl、0.05MNa2PO4、pH7.2）以0.2ml/1分钟的流速洗脱该柱。以1.0ml/馏分（共186个馏分）收集柱子的洗脱液，并且使用β-闪烁计数器来确定放射活性。
这些结果显示在图27中。在用这种链霉菌玻璃酸酶（HYALASE）对不含PPS的对照培养物进行酶解之前或之后分析色谱图下的面积显示，14.3%的3H-葡糖胺掺入到HA中并且85.7%掺入到PG亚基中。从27A中所示的图中显然可知，PG-HA聚集蛋白聚糖络合物的分子量大于当HA酶解完成时所释放的PG单体。
在所测试的多种浓度的PPS中，仅0.1微克/mL和1.0微克/mL显示该培养基中新合成的3H-HA的水平大量地增加。放射活性比例示出了消化后的PG单体空隙体积部分是50.4%，这显示对于1微克/mL，49.6%已掺入到HA中（图27C）；并且对于0.1微克/mL是35.5%（没有显示图形）。对于更低浓度的PPS（图27B）在HA馏分中发现15.1%的放射活性，而更高浓度的2.5微克/mL仅约11%的H-葡糖胺掺入到HA中。尽管这些数据提示在微团培养物中由祖细胞进行的最大程度的HA合成发生在1.0微克/mL的PPS浓度，仍然需要确定在该小量细胞外基质中剩余的3H-HA水平。因为在此说明的平行研究已经表明PPS刺激祖细胞的软骨形成分化以及软骨蛋白聚糖的形成，这些细胞周围的细胞外基质也许代表了新合成的HA（以PG聚集蛋白聚糖络合物的一种组成的形式）的更富有的来源。尽管如此，这是证明PPS刺激由培养的祖细胞进行的生物合成HA的第一个报道。
rhNC4（批号PBA-1202p）单独地和与多硫酸戊聚糖钠（PPS）的组合对祖细胞透明质酸物（HA）的生物合成浓度影响（通过3H-葡糖胺结合到HA中测量）。
购于RIKEN细胞库（Tsukuba，Japan）的鼠祖细胞（细胞系C3H10T1/2或ATDC5）或人类免疫选择的Stro-1+祖细胞（Mesoblast Ltd,Melbourne,Australia）将如以上所述在微团培养物中确立、或以1.5x105个细胞/孔接种于6孔培养板中，并且在加入化合物之前允许贴壁24小时。不同浓度的rhNC4制剂（单独以及与PPS（Bene-Arzneimittel,Munich,Germany））相组合将在DMEM培养基中以这些培养物所要求的浓度的两倍进行制备，该培养基含有10%FCS和50μg/ml庆大霉素），通过0.22μm过滤器消毒，并接着连续稀释以给出每项实验所要求的药物的最终浓度。将这些测试溶液中每一种的等分部分加入到24孔培养板的每个孔中。将储备的3H-葡糖胺在培养基中进行稀释，从而给出1.0μCi/ml溶液，将它立即加入每个孔。将这些孔板再孵育24小时。在培养结束时，将培养基收集到一个5ml带帽的试管中并且在-20℃下保存用于3H-HA分析。通过胰蛋白酶消化来释放细胞并且离心并洗涤。胰蛋白酶使放射活性标记的HA流动，并且对于培养基分析洗涤物，并接着将这些细胞用于RNA的提取以及基因表达的评估，如以下所说明。
在培养物中使用凝胶过滤层析法分离并定量3H-透明质酸物（3H-HA）
来自每个培养基样品的两个0.5ml的等分部分被标记为A和B。将20μl的1M乙酸（pH6.0）加入到所有等分部分中。将50μl反应缓冲剂（20mM乙酸钠和0.15M NaCl，pH6.0）加入到等分部分A中，并且将50μl的5TRU链霉菌玻璃酸酶（HYALASE）（在反应缓冲剂中）加入到等分部分B中。将所有样品在60℃下孵育3小时，之后跟随煮沸5分钟，从而使加入的玻璃酸酶失活。在凝胶过滤之前将这些样品保存在-20℃下。
将使用Superose6或Superdex-S200预先包装的凝胶过滤柱用于分离和鉴别培养基中的3H-HA。培养基样品在上样到该柱之前刚刚使用台式微量离心机在高速下常规地离心10分钟。将样品（每个200μl）通过加样环注射到该柱中，并且用PBS缓冲剂（0.15M NaCl、0.05M Na2PO4、pH7.2）以0.2ml/1分钟的流速洗脱该柱。以1.0ml/馏分（共186个馏分）收集柱子的洗脱液，并且使用β-闪烁计数器来确定放射活性。
该实验将显示HA合成的浓度依赖性刺激作用，其中最佳的作用是1-5微克/mL范围内的PPS单独使用以及rhNC4 5-25微克/mL。2微克/mL与5至25微克/mL rhNC4的组合将显示出协同作用。
使用ELISA检测的单独使用rhNC4（批号PBA-1202p）以及与多硫酸戊聚糖钠（PPS）相组合对由祖细胞进行的生物合成透明质酸物（HA）的浓度效应
将购于RIKEN细胞库（Tsukuba，Japan）的鼠祖细胞（细胞系C3H10T1/2或ATDC5）或人类免疫选择的Stro-1+祖细胞（Mesoblast Ltd、Melbourne、Australia）以2x105个细胞/孔种于24孔培养板，并且保持在添加10% FBS（Sigma）的1ml DMEM/Ham’s F-12培养基中（Invitrogen），并且在37℃下在5% CO2/95%潮湿空气的气氛下进行孵育直到细胞达到80%会合。然后，用DMEM/Ham’s F-12（含有不同浓度的rhNC4制剂，这些制剂单独存在并且与多硫酸戊聚糖（Bene-Arzneimittel,Munich,Germany）相结合）替换该培养基，并且将这些培养物在37℃下、在5% CO2中再保持24小时。将每个孔中的培养基与细胞分离，并且将其转移到一个2.0ml微离心管中。在这些孔中剩余的单层细胞将通过胰蛋白酶消化进行分离，并接着通过以350g离心5分钟而与上清液分离。收集上清液，并且将其与培养基结合。使用HA-ELISA对结合的培养基和上清液混合物（200μl）测定透明质酸物含量，如以上所说明。将由细胞胰蛋白酶消化的上清液煮沸，以便使该酶变性和失活，并且也使用这种ELISA来测定HA含量。这些馏分的HA将被认为是代表细胞外基质（ECM）的HA含量。
该实验的结果将证实在图27中发现的结果。这种ELISA将证明在低剂量（包括1至5微克/ml）的多硫酸化多糖的存在下由祖细胞生成的HA。
使用体外矿化作用测定法所测定的在一种成骨性培养基中多硫酸戊聚糖钠（PPS）对人类祖细胞分化的作用
对于诱导人类祖细胞体外发育成矿化骨基质所必需的条件已经在之前进行了说明(Gronthos S,AC Zannettino,SJ Hay,S Shi,SE Graves,A Kortesidis and PJSimmons.(2003).Molecular and cellular characterisation of highly purifiedstromal stem cells derived from human bone marrow.J Cell Sci 116:1827-1835)。这种骨诱导性培养基是由以下各项组成的：α-MEM培养基，添加2%（体积/体积）FCS、1.8mMKH2PO4、10-7地塞米松磷酸钠、50IU/ml青霉素、50μg/mL链霉素、1mM丙酮酸钠、100μM L-抗坏血酸2-磷酸酯、2mM L-谷氨酰胺和10mM HEPES缓冲液。
将人类祖细胞以每孔8x103个细胞种于96孔板中，并且在加入含有指定浓度的PPS（0.0、1.0、5.0、10微克/mL）的骨诱导性培养基之前可以达到≥90%会合。将细胞在37℃下在5% CO2的存在下培养持续指定的时间。这种含有新鲜化合物的骨诱导性培养基每周更换2次，持续4周。
这个实验的结果可以在图7A中看到。它显示存在PPS抑制分化为成骨细胞，特别是在1和10微克PPS/mL下。
在成骨性培养基中多硫酸戊聚糖钠（PPS）对人类祖细胞的分化的作用-体外分析矿物质含量
通过测量每个孔中每总DNA钠的钙水平来评估以上培养物中每个孔的总矿物含量。用无Ca+和Mg+的PBS将细胞培养物洗涤3次，并且将其置于0.6M盐酸（100μL每个孔）中溶解过夜。将这种酸可溶的矿物质23转移到一个新的96孔板中，并且与邻-甲酚肽络合酮（Thermal Electron Corporation，USA）反应，从而形成一种紫色染料，该紫色染料用EL808Ultra酶标仪在570nm处测量。该紫色染料的强度直接正比于每个孔中钙的浓度。根据制造商的建议，从一条钙标准曲线外推出绝对的钙浓度。在这之后，将这些酸可溶的培养物用无Ca2+和Mg2+的PBS冲洗3次，并且在37℃下在100μL的100μg/mL蛋白酶K的溶液中孵育2小时。剧烈地吹打消化的样品，并且将每孔的50μL转移到非荧光检测板的一个孔中，该孔含有150μL在DNA测定缓冲液（2M NaCl和50mM磷酸钠）中稀释的Hoechst33258（2μg/mL）。通过在350nm由LS55发光光谱仪（Perkin Elmer）对一系列DNA标准品进行测量来确定绝对吸光度。
这个实验的结果可以在图7B中看到。PPS培养物都表现得与培养基一样这一事实表明没有钙化沉积出现。正常矿化的沉积物用茜素红试剂进行阳性染色，并且在骨诱导性条件下在4周内形成祖细胞的培养物。
多使用体外脂肪形成测定法测定的在一种脂肪形成性培养基中硫酸戊聚糖钠（PPS）对人类祖细胞分化的作用
对于从人类骨髓基质细胞体外发育的脂质所要求的条件已经在之前进行了说明（Gimble J.Marrow stromal adipocytes.In:Marrow stromal cell culture.JNBeresford,Owen,M.E.,ed.Cambridge University Press,Cambridge,pp67-87(1998)）。简言之，将人类祖细胞以8x103个细胞/孔的密度在完全α-MEM生长培养基中种于96孔板中，并且在加入诱导性培养基之前允许达到大于90%的会合。将细胞培养在诱导脂肪形成性培养基中，该培养基包括完全α-MEM，添加0.5mM 3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤（IBMX）、60μM吲哚美辛、以及0.5μM氢化可的松、在一组滴定的PPS（0.0、1.0、5.0、10微克/mL）的存在下。该诱导性培养基每周更换2次，持续4周。用油红O对细胞进行染色以检测脂质的存在。
脂类的油红O染色
如之前所说明培养细胞，并且用1X PBS（pH7.4）柔和地冲洗以避免细胞单层的破裂。在室温下将细胞在磷酸盐缓冲的福尔马林中固定15分钟。随后除去该固定剂，并且通过在室温下加入100μL新鲜滤过的油红O（3mg/mL；MP Biomedicals，Australia）持续≥2小时对脂质进行染色。用RO水将细胞冲洗3次并且用迈尔氏苏木精（Lillie进行了改进）进行复染。将苏木素染色剂吸出，并且用水替换，并且在光学显微镜下检验油红O阳性的脂肪细胞，并且DP20-56 Olympus照相机（Olympus，Japan）照相。
这些结果示于图8A和B中。可以看到PPS通过在所有浓度下看到的向上调节的方式调节祖细胞分化成脂肪细胞。
多硫酸戊聚糖钠（PPS）对由在胶原海绵中生长的祖细胞进行的蛋白聚糖的生物合成（以35S-GAG测量）的作用
将制备为一种悬浮液（在100μL的添加10% FBS(Sigma)的1:1高糖DMEM/Ham’s F-12培养基(Invitrogen)中含有平均100,000个细胞）的人类免疫选择的Stro-1+祖细胞（Mesoblast Ltd、Melbourne、Australia）用微量移液器注射到所制备的胶原海绵块的中心，将该胶原海绵块放在24孔培养板的孔中。这些胶原海绵将是之前预切成0.5cm3正方体的无菌Gelfoams（Pharmacia和Upjohn Co.、Kalamazoo、MI）。向每个孔加入2mL培养基+FBS，并且将这些平板在37℃下、在5%CO2下/95%空气下孵育48小时。然后，将这些培养基用添加10%FBS(Sigma)、含有不同浓度PPS（0、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0μg/ml）的1:1DMEM/Ham’s F-12培养基(Invitrogen)替换，持续另外48小时。所有的PPS浓度将培养三次。然后，将该培养基换成限定的培养基，该培养基含有指定浓度的PPS和5μCi/ml of35S-H2SO4（Perkin Elmer，USA）。48孵育小时后，当通过测量将35SO4掺入到PG成为释放到培养基中的（35S-GAGs）来确定PG生物合成时并且如以上所说明在胶原酶消化这些海绵之后可以终止该实验。
这个实验将证明在该海绵中软骨形成在多硫酸化多糖以类似于体外和在此说明所示的那些浓度存在下得到增强。该实验将证实0.5-1.0百万个祖细胞的剂量是适当的细胞数，并且1-10微克/ml多硫酸化多糖的浓度提供了有益的效果。
使用祖细胞和多硫酸戊聚糖（PPS）的配制品在椎间盘再生和软骨修复的动物模型中重新评估软骨形成
动物实验方案
在12只成年美利奴/来斯特母羊颈部C3/4和C4/5脊柱水平面上将进行两种水平的脊柱手术，这些母羊被随机分成2组每组6只。该操作将要求通过手术椎间盘从这些水平面上除去，并且由一种含有这些祖细胞的胶原海绵支架所填充的可生物降解的植入物被植入到之前被椎盘占据的椎体之间。除了将不同的细胞注射到这些海绵中之外，本研究的设计中唯一的另外的变化将是这些软骨终板（CEP）是否在插入该植入物之前被机械地穿孔。从植入时到处死时，本研究的持续时间将是12周。
组A（N=6）
使用一个预成型的模板将无菌Gelfoam明胶海绵（Pharmacia& Upjohn Co.,Kalamazoo,MI,USA）切成胶料，然后用微量移液器注射100ul的Profreeze溶液。然后，将负载的海绵插入到专门改进的可生物降解的笼子中，该笼子在标明的水平上被固定于外科切除的颈盘腔中。通过商品化的椎板将该笼子固定在合适的位置。
组B（N=6）
使用一个预成型的模板将无菌Gelfoam明胶胶原海绵切成胶料，并且载入100微升的含有祖细胞（1百万个绵羊祖细胞）+10微克PPS的Profreeze溶液。然后，将负载的海绵插入到一个可生物降解的笼子中，该笼子在标明的水平上被固定于外科切除的颈盘腔中。通过商品化的椎板将该笼子固定在合适的位置。
实验结果的评估
在吸气麻醉下，在以下时间点将取得的所有颈椎的侧位平片：基线、操作、植入测试物品后1、2和3个月，并且使用表3中所示的评分系统对骨形成评分。
表3
依照动物伦理指导方针，本研究也将从始至终监测动物，用表4中所示的时间表对长期制备的羊进行照顾。
表4：手术后观察动物
观察 频率/天 持续时间
体重 X1 研究入口
行为，体位和活力 X1 研究期间
疼痛和不适 X1 研究期间
观察操作区域的局部刺激/感染 X1 手术后最少3天
活力降低/不能移动 X1 研究期间
评估每天食物/水的消耗 X1 研究期间
组织学分析
处死后，用带锯将完整的颈椎从动物身上切下并且从脊骨的剩余部分切下C3/4的C4/5运动区段。然后，这两个区段在矢状面上被切成2个部分并且保存在10%标准缓冲的福尔马林中。这些部分将含有在任意一边上具有3mm的上锥体和下锥体的笼子。然后，用甲酸将它们脱钙，并接着在搅拌下在升高的乙醇浓度下进行脱水。在二甲苯清洁后，将组织埋入石蜡中，切片并用H&E、阿尔新蓝、甲苯胺蓝、马森三色（Massons Trichrome）进行染色。这些甲苯胺蓝染色的切片将被用于使用定量图像分析的组织形态学测定术的分析，从而在个人计算机上使用Image J软件（http://rsb.info.nih.gov/ij/）来确定蛋白聚糖分布的光密度和基质尺寸。
未染色的石蜡切片也将用于基质组分的免疫组织化学分析。通过软骨素酶ABC（0.25U/ml）在20mM Tris-乙酸缓冲液pH8.0中在37℃下1小时、牛睾丸透明质酸酶1000U/ml在37℃下在磷酸盐缓冲液pH5.0下1小时的组合将它们预消化，之后跟随在20mM Tris-HClpH7.2、0.5M NaCl(TBS)或蛋白酶K（DAKO S3020）中进行3次洗涤在室温下持续6分钟以暴露出抗原表位。然后，在20%正常的猪血清中将这些组织封闭1小时，并且用针对大和小蛋白聚糖和胶原的多种一抗进行探查（表5）。阴性对照切片也将被加工，或者省略一抗或者用感兴趣的真正的一抗替代一种无关的同型配对的一抗。在这个步骤将使用Commercial（DAKO）同型配对的小鼠IgG（DAKO Code X931）或IgM（DAKO Code X942）对照抗体（适当时）。DAKO的产品X931和X942将是直接对抗黑曲霉的葡萄糖氧化酶（在哺乳动物组织中既不存在也不能诱导的酶）的小鼠单克隆IgG1（克隆DAK-GO1）以及单克隆IgM（克隆DAK-GO8）抗体。辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的二抗将用于检测，这是使用0.05% 3,3′-二氨基苯亚基二氢氯和0.03%H2O2（在TBS,Nova RED中）、硝基蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸盐/碘硝基四唑紫（NBT/BCIP/INT）或新品红作为底物。通过亮视野显微镜检查染色的载玻片并且用LeicaMPS 60摄影显微镜数码摄影系统进行照相。
表5.针对蛋白聚糖和胶原核心蛋白表位的一抗
(a)Melrose,J.,Little,C.B.&Ghosh,P.Detection of aggregatableproteoglycan populations by affinity blotting using biotinylatedhyaluronan.Anal Biochem256,149-157(1998).Melrose,J.,Smith,S.& Ghosh,P.Differential expression of proteoglycan epitopes by ovine intervertebraldisc cells.J Anat197(Pt2),189-198(2000)。
(b)Melrose,J.,Smith,S.,Ghosh,P.& Taylor,T.K.Differential expressionof proteoglycan epitopes and growth characteristics of intervertebral disccells grown in alginate bead culture.Cells Tissues Organs 168,137-146(2001)。
(c)Shen,B.,Melrose,J.,Ghosh,P.&Taylor,F.Induction of matrixmetalloproteinase-2 and -3 activity in ovine nucleus pulposus cells grown inthree-dimensional agarose gel culture by interleukin-1beta:a potentialpathway of disc degeneration.Eur Spine J12,66-75(2003)。
(d)Ye,X.J.,Terato,K.,Nakatani,H.,Cremer,M.A.&Yoo,T.J.Monoclonalantibodies against bovine type IX collagen(LMW fragment):production,characterization,and use for immunohistochemical localization studies.JHistochem Cytochem39,265-271(1991)。
统计
如所示将用t检验（Student t test）进行成对比较。统计显著性将以P小于0.05来给出。如所示，单因素方差分析法（ANOVA）将用来做多重比较。使用Fisher设计的最小显著性差异测试来确定这些组之间的统计显著性为P小于0.05。
本实验将证明与对照物相比，使用多硫酸化多糖和多个祖细胞将导致在该盘腔中产生更多的（更大量的）软骨。
此外，在切开的盘腔中，该盘腔具有带刺的软骨端板，这些端板与含有祖细胞加上PPS的胶原海绵之间具有一个界面，将观察到内源性造血祖细胞的增强的渗入，伴有着更加完全地治愈机械地生成的软骨缺损。
本领域的普通技术人员应当理解，正如在特定的实施方案中所示可以对本发明进行许多改变和/或修饰，而不偏离如广泛说明的本发明的精神或范围。因此，这些实施方案将在所有的方面被认为是用作说明性的并且不是限制性的。

Claims (15)

1.一种组合物，包括软骨祖细胞、间充质祖细胞或来自骨髓的祖细胞以及一种多硫酸化多糖和透明质酸，其中所述多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖或它的药学上可接受的盐。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述透明质酸是自然的或交联的。
3.如权利要求1所述的组合物，进一步包括一种载体介质。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述载体介质是一种培养基和/或一种药学上可接受的载体和/或一种生物支架。
5.如权利要求1所述的组合物，其中所述祖细胞是一种Stro-1bri细胞，和/或一种Stro-1bri子代细胞。
6.如权利要求1所述的组合物，其中所述多硫酸化多糖是选自：多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖的钠盐(NaPPS)、多硫酸戊聚糖的镁盐(MgPPS)、和/或多硫酸戊聚糖的钙盐(CaPPS)。
7.如权利要求1所述的组合物，进一步包括深冷保存介质。
8.一种生物支架，包括软骨祖细胞、间充质祖细胞或来自骨髓的祖细胞以及一种多硫酸化多糖和透明质酸，其中所述多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖或它的药学上可接受的盐。
9.如权利要求8所述的生物支架，其中所述祖细胞是一种Stro-1bri细胞，和/或一种Stro-1bri子代细胞。
10.如权利要求8所述的生物支架，其中所述多硫酸化多糖是选自：多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖的钠盐(NaPPS)、多硫酸戊聚糖的镁盐(MgPPS)、和/或多硫酸戊聚糖的钙盐(CaPPS)。
11.一种组合物在制备用于治疗椎间盘退行性变、类风湿性关节炎或骨性关节炎或诱导椎间盘再生的药物中的应用，所述组合物包括软骨祖细胞、间充质祖细胞或来自骨髓的祖细胞以及一种多硫酸化多糖，其中所述多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖或它的药学上可接受的盐。
12.如权利要求11所述的应用，其中所述祖细胞是一种Stro-1bri细胞，和/或一种Stro-1bri子代细胞。
13.如权利要求11所述的应用，其中所述多硫酸化多糖是选自：多硫酸戊聚糖、多硫酸戊聚糖的钠盐(NaPPS)、多硫酸戊聚糖的镁盐(MgPPS)、和/或多硫酸戊聚糖的钙盐(CaPPS)。
14.如权利要求11所述的应用，进一步包括深冷保存介质。
15.如权利要求11所述的应用，其中所述组合物包括软骨祖细胞、间充质祖细胞或来自骨髓的祖细胞以及一种多硫酸化多糖和透明质酸，其中所述多硫酸化多糖是多硫酸戊聚糖或它的药学上可接受的盐。
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