JP5937612B2 - 血液安定剤を含む採血用デバイス - Google Patents

Description

関連出願への相互参照

本出願は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる２０１０年１２月２日出願の米国特許仮出願第６１／４１９，０６３号明細書の出願日の利益を主張する。

配列表
本出願は、ＥＦＳ−ウェブを通じてＡＳＣＩＩフォーマットで提出され、その全体が参照により本明細書に組み込まれる配列表を含む。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０１１年１１月３０日に作成され、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ ｆｏｒ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｄｅｖｉｃｅｓ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと名付けられ、そのサイズは６．１８キロバイトである。

ヒト血液は広範囲の診断目的のためにインビトロで評価される。血液は血液細胞および血漿からなっている。血液細胞の３つの主な種類のうち最も小さい血小板は赤血球の直径の約２０％に過ぎないが、血液中で最も数が多い細胞である。正常な血小板数は血液１μｌあたり１５０，０００〜３５０，０００個であるが、血小板は極めて小さいために血液体積の僅かな部分を占めるに過ぎない。血小板の主な機能は、血液の恒常性を維持し、出血を防ぐことである。したがって血小板機能は血液の恒常性の１つの指標である。

血液の恒常性は無傷で正常に機能する様式での血流の維持を意味する。これには血液の化学的特性の維持ならびに血液および脈管系の無傷性が含まれる。たとえば切傷、外傷、手術、または典型的には「出血」を起こす他の事象による脈管系の無傷性の障害の事象において、血液の損失を防止または最小化するという最終的な目的を有する、血液内の細胞性および生化学的プロセスのカスケードが開始される。この生物学的反応の目に見える終点は痂皮の生成である。分子および細胞レベルで、このプロセスには血液中を正常に循環しているタンパク質と血小板との相互作用が関係している。血液中の数種のタンパク質、および血小板それ自体が反応して、体中の他の多くの組織には存在するが、とりわけ正常な脈管系を構成する静脈および動脈の内部には存在しない「組織因子」と呼ばれるタンパク質に曝露される。直接的および間接的な化学的経路を通って、血小板は凝集、即ち不可逆的な（または「一度きりの」）プロセスによって組織因子の存在に応答し、それにより血小板は形状を大幅に変化させ、活発に相互結合する。このプロセスは血小板凝集として知られている。血液中の他の酵素も反応して血液中のタンパク質を変化させ始め、これが不溶性の線維性の塊を形成し始める。穴にペーストを詰めるのと同様に、タンパク質、血小板、および他の血液成分のこれらの不溶性混合物は、脈管壁の「穴」を閉塞し、簡単に言えば「出血を止める」。

より科学的には、損傷した血管に曝されると、血小板は露出した内皮下マトリックスに接着することになる。初期の接着に続いて、種々の因子（トロンビン、ＡＤＰ、増殖因子、およびコラーゲン等）が傷害の部位で放出または産生され、これらが血小板を活性化する。いったん血小板が活性化されれば、血小板の糖タンパク質ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターにおいてコンフォメーションの変化が起こり、そのため血小板がフィブリノーゲンおよび／またはフォンウィレブランド因子と結合できるようになる。隣り合う血小板上のＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａレセプターによる多価フィブリノーゲンおよび／またはフォンウィレブランド因子の分子のこの結合が傷害部位へのさらなる血小板の動員および止血性の塞栓または血栓を形成する血小板の凝集をもたらすと考えられる。血小板凝集は、血小板の相互の結合を記述するために用いられる用語である。血小板凝集は脱顆粒、即ち顆粒（タンパク質および小分子を含む「エンベロープ」）が周囲の血漿中に放出されるプロセスとも関連している。このプロセスは脱顆粒としても知られている。これらの顆粒内容物は止血の修復をさらに加速し、血管壁および任意の非血管組織上の細胞修復（治癒）プロセスを刺激するように作用する。

血小板の数が十分でない場合、または正常な血小板機能が低下しまたは存在すらしない場合でも、広範囲の出血という顕著な危険がある。重篤な傷害を受けた患者に、または広範囲の血液損失があった緊急手術の場合には、血小板輸液が投与される。

理解できることであるが、血小板が凝集し、それにより血液凝固を促進または加速する能力の測定は、いくつかの臨床的状況において重要なことがある。血栓症および急性冠動脈疾患の病因において血小板凝集が重要な役割を果たすことが知られている。種々の抗血小板剤に対する応答において、血小板機能の阻害には顕著な変化があることを示唆する証拠がある。抗凝集効果を得るための患者の治療にクロピドグレル（Ｐｌａｖｉｘ）等のＰ２Ｙ１２アンタゴニストを用いる場合には血小板凝集に個体間変化があることも示されてきた。たとえば、１つの研究の結果、薬剤を投与された患者の少なくとも１０％で予想された血小板凝集阻害が得られなかったことが示された（非特許文献１）。したがって、有害な心臓血管系事象の緊急性を考慮すると、理想的には患者を監視して代替治療を選択するように強制することなく、患者のために選択される最初の治療アプローチが直ちに恩恵をもたらすことを知るのは重要であろう。したがって、患者がそのような治療を受ける前に、患者から血液試料を吸引して血小板機能を試験することが多い。同様の試験は、手術／回復の間の有害な出血の影響の可能性を排除するための手術前スクリーニングに採用されることが多い。

米国特許第７，３０９，４６８号明細書 米国特許第５，８６０，９３７号明細書 米国特許第６，５１６，９５３号明細書 米国特許第６，４０６，６７１号明細書 米国特許第６，４０９，５２８号明細書 米国特許第６，４９７，３２５号明細書 米国特許第５，０５３，１３４号明細書 米国特許第５，０９６，６６９号明細書 米国特許第５，１１２，４５５号明細書 米国特許第５，８２１，３９９号明細書 米国特許第５，６２８，９６１号明細書 米国特許第７，４１９，８２１号明細書 米国特許第６，７５０，０５３号明細書 米国特許第Ｄ３３７，１６４号明細書 国際公開第２９０１７６９９号 国際公開第０３０９１２８４号 国際公開第２８１５５６５８号

Muller et al., Thromb Haemost. 89 (5): 783-7 (2003) Clinical Laboratory Standards Institute Guideline, "Platelet Function Testing by Aggregometry, H58-A (Vol. 28, No. 31 (2008)) Cho, et al., J. Biol. Chem. 282 (40): 29101-13 (2007) Wall, et al., Thromb. Res. 103: 325-35 (2001) Sarilla, et al., J. Biol. Chem. 285 (11): 8278-89 (2010) Nieman et al., J. Thrombosis Haemostasis 6: 837-845 (2008) Pintigny et al., Eur. J. Biochem. 207: 89-95 (1992) Lyon et al., Clin. Chem. 41: 1038-1041 (1995) Qiao et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 19: 462-468 (2009) Tamura et al., Circ. J. 73(3): 540-8 (2009) Kalb et al., Platelets 20(1): 7-11 (2009) Ohta et al., Thromb Haemost. 72 (6): 825-30 (1994) Jorgensen et al., Biochem. J. 231 (1): 59-63 (1985) Dennis et al., Nature 404 (6777): 465-70 (2000) Geiger et al.(2005) Clin. Chem. 51 (6): 957-965 Tentzeris et al., Thromb Haemost. 105 Suppl l: S60-6 (2011) Srinivasan et al., J. Biol. Chem. 284 (24): 16108-17 (2009) Bracey et al., Am. J. Cardiol. 98 (10A): 25N-32N (2006) Koh et al., J. Biol. Chem. 282 (40): 29101-13 (2007)

疾患のバイオマーカー試験のための試験目的で吸引された血液試料中の血小板を安定化させることも望ましい。血小板は診断上対象とするタンパク質および代謝産物を含んでいる。しかし、遊離して循環する形態のこれらのバイオマーカーの血漿中の濃度は疾患状態を診断する目的とより深く関係している。血小板の脱顆粒は、特に血小板の活性化または凝集の際に、これらのマーカーのレベルを人為的に高くすることがあり、制御されなければ分析前誤差を表わすと考えられる。血小板顆粒はまた、これらの循環バイオマーカーの分解を触媒し、それにより対象とするバイオマーカーのレベルを人為的に低くすることがある酵素をも含んでいる。

さらに、治療用途に用いられる安定な血小板を提供することが望ましい。自己血小板ゲル療法（いわゆる「多血小板血漿」の分離を含む）は、ある種の創傷および歯科インプラントの治癒から靭帯の損傷を修復するための注射までにわたる他の広範囲の病態を治療するために用いられる。血小板が凝集し、または時期尚早に活性化されると、血小板はその治療効果を失うことがある。したがって、これらのプロセスをさらに促進し得る安定化された血小板の提供へのニーズがある。

吸引された血液試料中で血小板が安定化されていないと、試験前に血小板を凝集させる（たとえば、試験すべき機能が「残っていない」）、または試験前に血小板がおそらく「死ぬ」、もしくは別の点で自然の機能を失わせることによって、インビトロの血小板機能の結果は不正確になることがあり得る。吸引された血液中では血小板は本質的に不安定である。それは、主としてその自然の役割が脈管系の破綻に応答して凝集することだからである。吸引された血液試料中では血小板凝集の化学的刺激が自然発生的に低レベルで起こることになる。採血後の時が経つにつれてこの自然発生的な刺激によって血小板が凝集し、それにより、血液試料を最終的に試験しようとする時には常に、まだ刺激され得る最初の状態における血小板の数は減少していく。臨床診療における現行の最高基準によれば、クエン酸塩で抗凝固処理した血液試料について採血後最長２から４時間以内に血小板機能試験を行なうべきことが要求されている（非特許文献２）。この時間の後には、試料はその当初の血小板機能の多くを失うことになり、臨床測定には使用できなくなる。この広く適用される操作基準により、血小板機能測定の広い市場有用性が制限される。現行の診療において、たとえば多くの血液試料が医院から地域の試験施設に送られ、採血後、数時間またはことによると数日間も試験されないことがある。

したがって、採取された血液試料等の組成物において血液および血小板等の血液成分を安定化させ、分析に先立つ採血後および保存もしくは移送中に機能をより良く保持することへのニーズが存在する。

本発明の１つの態様は、血液（たとえば全血試料）または血液の成分（たとえば白血球または血小板等の細胞成分）を含む組成物を採取し、安定化させるためのデバイスであって、第１の端部および第２の端部ならびに血液またはその成分を受容するための貯留槽部分を画定する少なくとも１つの内壁を有するデバイスを対象としている。貯留槽は、バリエジンもしくはその類似体、ポリ硫酸化二糖（八硫酸スクロース等）、またはそれらの組み合わせを、それぞれ血液を安定化させ、たとえば血小板の凝集能等の血小板機能を保持するために有効な量で含む血液安定剤を含んでいる。本発明の実施形態において血液の安定性の尺度として血小板機能を記述しているが、他の血液パラメーター（たとえば血漿または血清中の被分析物のレベル、細胞数、細胞の安定性、細胞の無傷性、溶血等）によって測定される血液試料の相対的安定性または不安定性に関する他の発現が存在することは、当業者には認識されるであろう。いくつかの実施形態において、デバイスには（たとえば貯留槽に血液を供給するため）針によって穿刺可能なクロージャーが取り付けられ、無菌で減圧されている。

本発明の別の態様は、血液またはその成分（たとえば白血球または血小板等の細胞成分）を含む組成物を採取し、安定化させるための方法であって、血液または組成物を、第１の端部および第２の端部ならびに血液または組成物を受容するための貯留槽部分を画定する少なくとも１つの内壁ならびに貯留槽の中に配置された血液安定剤を有するデバイスに導入するステップを含み、血液安定剤がバリエジンもしくはその類似体、ポリ硫酸化二糖（八硫酸スクロース等）、またはそれらの組み合わせを、それぞれ血液を安定化させ、たとえば血小板の凝集能等の血小板機能を保持するために有効な量で含む方法を対象としている。採取および保存に続いて、血液または組成物は、たとえば診断のための分析または治療目的のために用いられる。

本発明のさらなる態様は、インビトロにおいて血液機能（たとえば血小板機能）のパラメーターを測定するための方法であって、ａ）血液または血液の成分（たとえば血小板）を含む組成物を、血小板を採取し、安定化させるためのデバイスに導入するステップであり、デバイスが第１の端部および第２の端部ならびに血液または組成物を受容するための貯留槽部分を画定する少なくとも１つの内壁を有し、貯留槽が配列番号１として指定されるアミノ酸配列を有するバリエジンもしくはその類似体、ポリ硫酸化二糖、またはそれらの組み合わせを、それぞれ血液を安定化させ、たとえば血小板の凝集能等の血小板機能を保持するために有効な量で含む血液安定剤を含むステップと、ｂ）血液パラメーターを測定するステップとを含む方法を対象としている。血液パラメーターが血小板機能に関連するいくつかの実施形態において、方法はｃ）血小板の凝集を刺激する血小板アゴニストを組成物に添加するステップと、ｄ）血小板凝集の程度を測定するステップであって、アゴニストによって誘起される血小板凝集の程度が血小板機能の決定要因であるステップとをさらに伴う。

本発明のさらなる態様は、少なくとも１つのそのようなデバイス（および好ましくは複数のそのようなデバイス）を含むパッケージまたはキットを対象としている。

バリエジンおよび八硫酸スクロース等のポリ硫酸化二糖のインビボ（およびインビトロ）におけるトロンビン不活性化能に基づく治療への使用については報告があるが、本出願人らは（実施例に示すように）、トロンビン阻害活性は所与の薬剤が任意の延長された臨床的に意味のある時間にわたって、採取された血液試料中に含まれる血液またはその成分、特に血小板を安定化させる能力をそれ自体、単独で予測できるものではないことを発見した。特定の動作理論になんら縛られることを意図するものではないが、インビボにおける所与のトロンビン阻害剤の活性は、採取された血液試料または血小板等の血液成分を含む組成物（たとえば多血小板血漿（ＰＲＰ））等の非生理的環境においてそれがどのように機能するかを予測するものではないことを、特に血小板機能を保持し、それにより保存およびそれに続く分析の目的のために試料の無傷性を保持する能力の観点から、本出願人らは仮定している。

本発明における使用に適したデバイスの透視図である。 比較のための非発明実施形態に対する本発明の実施形態における血小板凝集をプロットした一連のグラフであり、ｙ軸に任意の無単位測定値であるインピーダンスを、ｘ軸の操作時間（血小板刺激剤導入後）６分の関数として測定した図である。 バリエジン（配列番号１）を含む本発明の実施形態において、血小板アンタゴニストであるアセチルサリチル酸（ＡＳＡ、またはアスピリン）の存在下または非存在下における血小板アゴニストであるコラーゲンを用いる分析と組み合わせた、採取した血液試料における時間の関数としての血小板凝集（曲線下面積（ＡＵＣ）として測定）を、ＡＳＡの存在下および非存在下のクエン酸塩、およびコラーゲンを含む非発明デバイスと比較して示すグラフである。 血小板アゴニストとして用いたコラーゲンと組み合わせた、バリエジン（配列番号１）を含む本発明の実施形態において採取した血液試料における時間の関数としての血小板凝集（初期値に対する百分率として測定）を、クエン酸塩およびコラーゲンを含む非発明デバイスと比較して示す棒グラフである。

概して、本発明の採取デバイスは、試験管および遠心管等のチューブ；採取バッグ等の閉鎖系血液採取デバイス；シリンジ、特にプレフィルドシリンジ；カテーテル；マイクロタイターおよび他のマルチウェルプレート；アレイ；チューブ類；フラスコ、スピナーフラスコ、ローラーボトル、バイアル等の実験用容器；顕微鏡スライド、顕微鏡スライドアセンブリー、カバースリップ、フィルムならびに多孔質基板およびアセンブリー；ピペットおよびピペットチップ；組織および他の生物学的試料の採取容器；および生物学的試料を保持するのに適した任意の他の容器、ならびに試料を移送するための容器および要素等の任意の採取デバイスを包含し得る。いくつかのそのようなデバイスの例および説明は、Ｓｔｅｖｅｎｓらに付与された共有の特許文献１に開示されている。デバイスは減圧されており、無菌であってよく、針によって穿刺可能なクロージャーを含み得る。あるいは、デバイスは血液を採取するための部分的減圧系または非減圧系であってよい。減圧系の好適な例は閉鎖チューブである。手動によるシリンジ吸引は部分的減圧系および非減圧系の両方の好適な例である。非減圧系には自動吸引システムも含まれる。

特許文献１にも示されている図１は本発明において有用な典型的な吸引デバイス１０を示し、これは内部チャンバーまたは貯留槽１４を画定する容器１２を含む。示された実施形態において、容器１２は側壁１６、閉じた底端１８および開いた上端２０を有する中空チューブである。任意選択で、分離部材１３が容器チャンバー１４の内部に取り付けられている。分離部材１３は血液試料の成分をたとえば遠心分離によって分離することを助けるために作用する。容器１２は適切な量の血液を採取するために寸法が決められている。無菌の製品が必要な場合には、開放端２０をカバーして容器１２を閉じるために閉鎖手段２２が必要である。いくつかの実施形態において、チューブはスクリューキャップのために構成されている。好ましくは、クロージャー２２は容器１２を効果的に閉じ、生物学的試料をチャンバー１４の中に保持することができるシールを形成する。クロージャー２２は、これだけに限らないが、ゴムクロージャー、ＨＥＭＯＧＵＡＲＤ（登録商標）クロージャー、金属シール、金属バンド付きゴムシールおよび種々のポリマーおよび設計によるシール等の種々の形態の１つであってよい。保護遮蔽材２４をクロージャー２２の上に被せてもよい。

容器１２は、たとえばプラスチック（たとえばポリオレフィン、ポリアミド、ポリエステル、シリコーン、ポリウレタン、エポキシ、アクリル樹脂、ポリアクリレート、ポリエステル、ポリスルホン、ポリメタクリレート、ＰＥＥＫ、ポリイミドおよびフルオロポリマー）およびシリカガラス等のガラス製品等の実験用容器に適した任意の材料から作ることができる。好ましくは、容器１２は透明である。容器１２に適した透明な熱可塑性材料の例としては、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプロピレンおよびポリエチレンテレフタレートが挙げられる。プラスチック材料は酸素不透過性材料であってよく、または酸素不透過もしくは半透過層を含んでよい。あるいは、容器１２は水および空気透過性のプラスチック材料から作ることができる。

チャンバー１４の内圧は所定の量の生物学的試料をチャンバー１４の中に吸引するために選択される。好ましくは、クロージャー２２は、大気圧と大気圧未満の圧力との間の内圧差を維持することができる弾力性のある材料から作られる。クロージャー２２は、当技術分野において知られているように、生物学的試料を容器１２の中に導入するために針２６または他のカニューラによって穿刺できるようなものである。好ましくは、クロージャー２２は再シールが可能である。クロージャー２２として好適な材料としては、たとえばシリコーンゴム、天然ゴム、スチレンブタジエンゴム、エチレンプロピレンコポリマーおよびポリクロロプレンが挙げられる。

容器１２の好適な例としては、単壁および多層チューブが挙げられる。好適な容器１２のより具体的な例は特許文献２に開示されている。

容器１２は、ゲル、機械的分離材または他の型の分離部材（たとえば濾紙その他）等の分離材１３を含んでもよい。分離材は典型的には血液血漿の調製、具体的にはヒトまたは動物の全血から血漿を分離するために有用である。いくつかの実施形態において、分離材は白血球と血小板の中間の密度を有し、全血試料の他の細胞要素からＰＲＰを単離するために有用と思われる。ゲルは望ましくはチクソトロピー性のあるポリマーゲル製剤である。ゲルはホモポリマーまたはコポリマーであってよく、たとえばポリシロキサン等のシリコーン系ゲル、またはたとえばポリアクリル樹脂、ポリエステル、ポリオレフィン、酸化シスポリブタジエン、ポリブテン、エポキシ化大豆油と塩素化炭化水素とのブレンド、ジ酸とプロパンジオールとのコポリマー、水素化シクロペンタジエンおよびα−オレフィンとジアルキルマレエートとのコポリマー等の有機炭化水素系ゲルが含まれ得る。本発明において有用と思われる機械的分離材の例は、特許文献３、特許文献４、特許文献５および特許文献６に記載されている。

容器１２は、全血試料の比重の重い相からリンパ球および単球を遠心分離するために適合させてもよい。そのような実施形態において、デバイスは液体密度勾配媒体および遠心分離に先立って液体密度勾配媒体と血液試料との混合を防止するための手段を含んでもよい。リンパ球／単球採取チューブの好適な例は特許文献７に開示されている。

図１に示した実施形態に加えて、本発明における使用に適した購入可能な他の採血チューブとしては、以下の、その全てがＢｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社（Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）から販売され、全ての登録および商標がＢｅｃｔｏｎ，Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ社に属する、ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）ヘマトロジーチューブ（たとえばカタログ番号３６７６５０−１、３６７６６１、６４０５、６３８５、６５６４、３６７６５３、３６７６６５、３６７６５８、３６７６６９、６４５０−８、６５３５−３７および３６７６６２）；ＶＡＣＵＴＡＩＮＥＲ（登録商標）Ｋ_２ＥＤＴＡチューブ（たとえばカタログ番号３６７８４１−２、３６７８５６および３６７８６１）；およびＢＤ Ｍｉｃｒｏｇａｒｄ（商標）クロージャーを有する非減圧ＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブ（たとえば３６５９８７、３６５９６５および３６５９７４）または従来のＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ（登録商標）チューブ（たとえば３６５９５６、３６５９５７、３６５９５８、３６５９５９、３６５９７１および３６５９７３）が挙げられる。市販の多くの採血チューブは典型的には２５０μｌから約１０．０ｍｌ、ある場合には１６ｍｌまでの標準容積を有している。典型的な容積としては、２５０、４００、および５００μｌ、ならびに２．０ｍｌ、３．５ｍｌ、４．０ｍｌ、５．０ｍｌ、８．０ｍｌ、８．５ｍｌ、および１０．０ｍｌが挙げられる。

他の実施形態において、デバイスには試験用カートリッジの内部に集約された貯留槽であって、全血を２から２００μｌ、より好ましくは５０〜１５０μｌの範囲の量で保持できる貯留槽が含まれ得る。そのようなカートリッジは、たとえばＡｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）からｉ−ＳＴＡＴ Ｐｏｉｎｔ ｏｆ Ｃａｒｅ Ｓｙｓｔｅｍという商標で販売されており、カートリッジとインターフェース可能な手持ちアナライザーとともに用いることができる。本発明において使用可能なそのようなカートリッジおよび手持ちアナライザーの例としては、それぞれｉ−ＳＴＡＴ ＣＨＥＭ８＋カートリッジおよびｉ−ＳＴＡＴ（登録商標）１手持ちアナライザーが挙げられる。そのようなデバイスは、たとえば特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、特許文献１３、および特許文献１４に教示されている。

いくつかの実施形態において、デバイスはシリンジである。シリンジアセンブリーには、開いた近位端、遠位端および血液を受容するための近位端と遠位端との間の無菌の中空チャンバーを有するバレル；開いた近位端に位置するプランジャー；バレルに固定された針；およびチャンバー内の血小板安定化剤が含まれ得る。

本発明のデバイスは、当技術分野で既知の材料、試薬およびプロセスに従って作製または組み立てることができる。たとえばそのような１つの方法には、血小板安定化少なくとも１つの血小板安定化剤（これは本明細書に記載したように乾燥または凍結乾燥状態であってよい）を、血小板を安定化させるために有効な量でデバイス中に加えること；および次いで任意選択により分離部材をデバイスに加えること、およびデバイスを減圧および／または滅菌することが含まれる。

代表的な凍結乾燥／減圧プロセスは、デバイスを温度約−４０℃、圧力約７６０ｍｍで約６から８時間凍結するステップ；圧力約０．０５ｍｍで約８から１０時間、温度を−４０℃から約２５℃まで上昇させながらデバイスを乾燥するステップ；次いで温度約２５℃、圧力約１２０ｍｍで約０．１時間、デバイスを減圧にするステップ、および次いでたとえばコバルト６０の照射でデバイスを滅菌するステップを伴い得る。添加物および抗凝固剤を液体状態でチューブに添加し、次いでこのようにして乾燥してもよい。

本明細書において、「血液」および「血液試料」という用語は、全血またはその成分（たとえば血液成分を含む別の体組織または流体等の組成物）、特にたとえば赤血球濃縮物、血小板濃縮物（たとえば多血小板血漿（ＰＲＰ））、白血球濃縮物等の細胞成分；または血漿および血清を意味する。したがって、他の実施形態において、試料は血液細胞または骨髄等の未成熟な血液細胞を含む体液または組織であり得る。

いくつかの実施形態において、血液安定化剤は吸血性節足動物の唾液腺から、好ましくはダニの唾液腺から、最も好ましくはアムブリオンマ バリエガツム（Ａｍｂｌｙｏｍｍａ ｖａｒｉｅｇａｔｕｍ）の唾液腺から抽出され、または誘導された天然または合成ペプチドである。そのようなペプチドは特許文献１５、特許文献１６、および特許文献１７に開示されている。そのようなペプチドは非特許文献３にも開示されている。バリエジンおよびその類似体は当技術分野において既知の「直接トロンビン阻害剤」であり、トロンビンの活性部位に結合して、それにより可溶性トロンビンおよびフィブリン結合性トロンビンの両方を不活性化することができる薬剤を意味する。

いくつかの実施形態において、血液安定化剤は配列番号１（本明細書においてバリエジンを意味する）と指定される３２アミノ酸の配列ＮＨ_２−ＳＤＱＧＤＶＡＥＰＫＭＨＫＴＡＰＰＦＤＦＥＡＩＰＥＥＹＬＤＤＥＳ−ＣＯＯＨを有する。本発明の目的のため、配列番号１の変異体、断片（およびその変異体）および誘導体を含むバリエジンの機能的同等物または類似体も、それらが必要な血小板安定活性を有している限り、本発明において有用であろう。バリエジンの断片は、バリエジンのタンパク質配列のＮ−末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸およびＣ−末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはさらにそれ以上のアミノ酸の喪失を除けば典型的には配列番号１と同一となる。

バリエジンの変異体は、典型的には配列番号１と同等の保存されたアミノ酸置換を含むことになる。そのような典型的な置換はＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間；ＳｅｒおよびＴｈｒの間；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの間；ＡｓｎおよびＧｌｎの間；塩基性残基ＬｙｓおよびＡｒｇの間；または芳香族残基Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＴｙｒの間に存在する。いくつかの実施形態において、アミノ酸置換は配列番号１の４、５、６、８、１０、１１、１２、１３、１４、１７、１８、２２、２５および３１位に存在する。したがって、いくつかの実施形態において、バリエジン変異体は以下の置換の１つまたは複数に関して配列番号１と異なり、４位のＧｌｙはＡｌａまたはＳｅｒで置き換えられ；５位のＡｓｐはＧｌｙで置き換えられ；６位のＶａｌはＡｒｇで置き換えられ；８位のＧｌｕはＧｌｎで置き換えられ；１０位のＬｙｓはＡｒｇで置き換えられ；１１位のＭｅｔはＬｅｕで置き換えられ；１２位のＨｉｓはＰｒｏで置き換えられ；１３位のＬｙｓはＡｒｇで置き換えられ；１４位のＴｈｒはＡｓｎで置き換えられ；１７位のＰｒｏはＧｌｎで置き換えられ；１８位のＰｈｅはＧｌｙで置き換えられ；２２位のＡｌａはＧｌｕで置き換えられ；２５位のＧｌｕはＡｓｐで置き換えられ；３１位のＧｌｕはＨｉｓで置き換えられる。

バリエジン断片の代表的な例を表１に示す。

本発明において有用と思われる別のバリエジン断片はＳＤＱＧＤＶＡＥＰＫＭＨＫＴＡＰＰＦＤＦＥＡＩＰＥＥＹＬ（配列番号５）である。

バリエジン断片は上述の１つまたは複数の部位にアミノ酸置換を含んでもよい。そのような断片の代表的な例としては、
ＳＤＱＧＤＶＡＥＰＡＭＨＫＴＡＰＰＦＤＦＥＡＩＰＥＥＹＬＤＤＥＳ（Ｋ１０Ａ）（配列番号６）、
ＳＤＱＡＤＲＡＱＰＫＬＨＲＮＡＰＱＧＤＦＥＡＩＰＤＥＹＬ（配列番号７）、
ＳＤＱＳＧＲＡＱＰＫＬＰＲＮＡＰＱＧＤＦＥＡＩＰＤＥＹＬ（配列番号８）、
ＳＤＱＧＤＶＡＥＰＫＭＨＫＴＡＰＰＧＤＦＥＡＩＰＥＥＹＬＤ（配列番号９）、
ＳＤＱＡＤＶＡＥＰＫＭＨＫＴＡＰＰＧＤＦＥＡＩＰＥＥＹＬＤ（配列番号１０）、
ＥＰＫＭＨＫＴＡＰＰＦＤＦＥＡＩＰＥＥＹＬＤＤＥＳ（ＥＰ２５）（配列番号１１）、
ＥＰＫＭＨＫＴＡＰＰＦＤＦＥＥＩＰＥＥＹＬＤＤＥＳ（ＥＰ２５Ａ２２Ｅ）（配列番号１２）、
ＥＰＫＭＨＫＴＡＰＰＦＤＦＥＡＩＰＥＥＹＬ（ＥＰ２１）（配列番号１３）、
ＭＨＫＴＡＰＰＦＤＦＥＡＩＰＥＥＹＬ（ＭＨ１ ８）（配列番号１４）、
ＤＶＡＥＰＫＭＨＫＴＡＰＰＦＤＦＥＡＩＰＥＥＹＬ（ＤＶ２４）（配列番号１５）
およびＤＶＡＥＰＲＭＨＫＴＡＰＰＦＤＦＥＡＩＰＥＥＹＬ（ＤＶ２４、Ｋ１０Ｒ）（配列番号１６）
を含むアミノ酸配列を有する断片が挙げられる。

したがって、変異体、断片および断片の変異体は、典型的には配列番号１に対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または約９７％の配列類似性を有する。

バリエジンの誘導体、ならびにその変異体および断片も、本発明の実施において有用であろう。そのような誘導体の代表的な例としては、バリエジン配列中のアミノ酸残基に糖基（たとえばグリコシル基）またはポリマー基（たとえばＰＥＧ）を付加させることによって修飾されたバリエジンならびにその変異体および断片の修飾形が挙げられる。いくつかの実施形態において、誘導体は配列番号１の１４位のＴｈｒがヘキソース基で修飾されたバリエジンのグリコシル化形である。他の実施形態としては、セリン、スレオニンまたはチロシン残基が関与することが多いホスホリル化、スモイル化、種々の脂肪酸の付加または脂質鎖等の当業者には公知の他の翻訳後修飾が挙げられ、これら全ては単独または組み合わせで含まれる。さらに、アルギニンの非荷電類似体としてのシトルリン、リジンの非荷電類似体としてのメチルリジン、プロリンの構造的類似体としてのヒドロキシプロリン等、当業者には公知の多くの代替物等、配列中の残基を置き換えることができる天然のまたは組み換えたアミノ酸の変種が存在する。

バリエジンおよびその類似体は、たとえば液相および固相化学手法を含むペプチド合成化学等の既知の手順によって合成することができる。たとえば、ペプチド合成は任意の固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法（たとえばＦｍｏｃまたはｔ−Ｂｏｃ化学アプローチ）によって実施することができ、その全ては当業者には公知である。典型的には、これらの合成は自動ペプチド合成装置によって実施される。他の実施形態において、ペプチドはバリエジンまたはその類似体をエンコードする核酸を用いて遺伝子操作（たとえば形質転換により）された微生物または他の非ヒト生命体中で産生することができる。

本発明において有用な他の血液安定剤としては、ポリ硫酸化二糖が挙げられる。二糖成分は典型的にはラクトース、トレハロース、スクロース、マルトース、またはセロビオースである。いくつかの実施形態において、二糖成分はスクロースまたはトレハロースである。二糖成分上の硫酸基の数は典型的には４から８の範囲である。したがって、実施形態には四硫酸化、五硫酸化、六硫酸化、七硫酸化、および八硫酸化されたラクトース、スクロース、マルトースおよびセロビオースが含まれる。たとえば非特許文献４、非特許文献５を参照されたい。例示的な実施形態において、ポリ硫酸化二糖は八硫酸スクロース（ＳＯＳ）または八硫酸トレハロースである。ポリ硫酸化二糖は間接トロンビン阻害剤であり、当技術分野で知られているように、アンチトロンビン複合体の一部として作用する薬剤であり、それ自体トロンビンの活性部位と直接に相互作用せず、したがって可溶性トロンビンを不活性化することができるのみで、フィブリンと結合したトロンビンとは反応できない。ＳＯＳはヘパリンコファクターＩＩを通して作用することが知られており、したがってＳＯＳ−ＨＣＩＩ複合体はトロンビンに結合してこれを阻害する。

血液安定剤には、少なくとも１つの他の直接トロンビン阻害剤および／または少なくとも１つの他の間接トロンビン阻害剤も含まれ得る。本発明において有用と思われる直接トロンビン阻害剤の代表的な例としては、アルガトロバン（（２Ｒ，４Ｒ）−１−［（２Ｓ）−５−（ジアミノメチリデンアミノ）−２−［［（３Ｒ）−３−メチル−１，２，３，４−テトラヒドロキノリン−８−イル］−スルホニルアミノ］ペンタノイル］−４−メチル−ピペリジン−２−カルボン酸）、ヒルジンおよびその類似体であるビバリルジン、Ｄ−異性体および／または異常アミノ酸を含むペンタペプチドＲＰＰＧＦの誘導体、たとえばｒＯｉｃＰａＦ（ｐ−Ｍｅ）−ＮＨ_２（当技術分野で「ＦＭ−１９」として既知）、ｒＯｉｃＰｓＦ（ｐ−Ｍｅ）、ｒＯｉｃＰａＦ（ｐ−Ｂｒ）、ｒＯｉｃＰａＦ（ｐ−Ｉ）、ｒＯｉｃＰａＦ（ｐ−ＮＯ_２）、Ｆ（ｐ−Ｍｅ）ＯｉｃｒＰａ、ａＰｒＯｉｃＦ（ｐ−Ｍｅ）、ＰａＦ（ｐ−Ｍｅ）ｒＯｉｃ、ＰＦ（ｐ−Ｍｅ）Ｏｉｃｒａ、およびＰｒａＦ（ｐ−Ｍｅ）Ｏｉｃ（ここでＤ−異性体は小文字で指定され、「Ｏｉｃ」は合成アミノ酸（２Ｓ，３ａＳ，７ａＳ）−オクタヒドロインドール−２−カルボン酸を表わす）（たとえば非特許文献６））、アプロチニン、既知のトロンビン阻害の可能性を有するペプチド（たとえば非特許文献７）、およびヘパリン代替物として知られるＤ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）（たとえば非特許文献８）が挙げられる。

本発明において有用と思われる間接トロンビン阻害剤の代表的な例としては、特定の製剤の分子量分布によって定義される種々の形態のヘパリン（たとえば未分別、低分子量（典型的には３〜７キロダルトンの画分）、超低分子量（典型的には２〜３キロダルトン）、および同様の寸法特異的サブ画分）が挙げられる。寸法または種々の化学的抽出プロセスのいずれかに基づく種々の分別法によって分離されたヘパリンの治療用サブ画分としては、ダルテパリン、エノキサパリン、アドレパリン、パルナパリン、レビパリン、チンザパリン、ビオパリン、ミニパリン、サンドパリン、セムロパリン、およびナドロパリンならびに他の同様の分子が挙げられる。

精製の様式は合成方法による。一般には、血液安定化剤の純度は用いる薬剤およびその源によって変動することになる。一般には、血小板安定化剤の純度は少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％もしくは９５％、またはそれより高い。

血液安定剤は血液およびその成分の実験的に試験し得る機能を保持するために有効な量で、採取デバイス中に存在する。たとえば、血小板の場合には、その量は、血小板の凝集能等の血小板機能を保持するため、および血小板が保持されず、それによりその自然の顆粒状態を失う場合に起こる血小板の脱顆粒を避け、または阻止するため、および／または血液もしくは血液試料または血液成分を含む組成物の血漿部分に存在する可能性のある１つまたは複数の内因性タンパク質を安定化させるために有効な量である。特定の血液安定剤の選択およびデバイス中に含ませる量または濃度は、試料の性質、各々の薬剤の能力およびその水への溶解性、血液安定化が望まれる時間、採血デバイスの容積、試料への薬剤の添加によって起こる溶血の程度、ならびに非特異的相互作用（たとえば血清アルブミン等の血液中の他のタンパク質の存在による）の性質および程度等のいくつかの要素による。したがって、本発明の目的のため、存在し得る血液安定剤（単数または複数）の量は、濃度範囲の観点でより便利に表現される（薬剤の実際の量はこれから容易に計算することができる）。

血小板に関しては、機能の保持は血小板が採取後、分析前に、それらが活性化または再活性化され、それにより血小板凝集（血小板機能の尺度として）がインビトロで測定できるような状態で維持されることを意味する。血小板に関して本明細書で用いる活性化または再活性化は、実験室におけるインビトロ分析のために血小板が血小板結合カスケードを開始して凝集する能力は保持されているが、インビトロの診断手順のための典型的な採血デバイスにおける採取、移送、および保存時の人為的な結果として血小板凝集が誘起されることは阻止されていることを意味する。

たとえば、いくつかの血液安定化剤は他のものよりも強力であり、したがってその有用性による試料ｍｌあたりの必要濃度が少ない。濃縮組成物（ＰＲＰ等）中に存在し得る血小板等の血液成分を安定化させるためには、同量の全血試料（たとえば単位体積あたり血小板等の成分の含有量が少ない）に比べて異なった量の血液安定化剤が必要になるであろう。

一般には、分析試験または治療用使用の時まで、採取、および保存および／または移送の経過にわたって、室温で少なくとも約５０％の凝集阻止活性、好ましくは少なくとも約６０％から約７５％の阻止活性、より好ましくは少なくとも約７５％の阻止活性を達成するために、少なくとも１つの血液安定化剤が選択され得る。必要性によるが、安定化は少なくとも１時間から約６、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間またはそれ以上にわたって達成され得る。

熟練した臨床医は、溶血した試料が血液試料の採取、移送、または保存の間のいずれかに血液細胞への損傷が起こったことの明白な目に見えるヒントであることを認識するであろう。溶血はいずれの臨床分析に対しても必ずしも有害をもたらすものではないが、それはいくつかの試験に対してはよく知られた妨害であり、したがって溶血の原因を避けることが好ましい。溶血は目に見える尺度（たとえば穏やかなまたは僅かなピンク色、中程度もしくは顕著な赤色、または強いもしくは暗い赤色）で測定することができる。溶血はヘモグロビン自体の赤色の分光学的測定によっても測定することができ、血清または血漿中に放出されたヘモグロビンの濃度によって報告することができる（たとえば放出されたヘモグロビン濃度が約２０ｍｇ／ｄＬ未満の場合またはヘモグロビン濃度が目視または分光法によって測定できない程度である場合は「僅かなまたは無視できる」溶血を表わし、約２０から約１００ｍｇ／ｄＬは「軽度の」溶血を表わし、約１００から約３００は「中程度の」溶血を表わし、または約３００ｍｇ／ｄＬを超える場合は「強い」溶血を表わす等）。

上記を考慮して、血液安定剤の濃度は一般に約１００ｎＭから約５０ｍＭ、いくつかの実施形態においては約１μＭから約１０ｍＭ、いくつかの実施形態においては約５μＭから約５ｍＭ、いくつかの実施形態においては約２０μＭから約３ｍＭ、いくつかの実施形態においては約５０μＭから約２ｍＭの範囲である。

たとえば、バリエジンまたはその類似体の濃度は一般に約１μＭから約１０ｍＭの範囲である。他の実施形態において、血液安定化剤の濃度は約１μＭから約１０ｍＭの範囲である。さらに他の実施形態において、バリエジンまたはその類似体の濃度は約１０μＭから約１ｍＭの範囲である。さらなる実施形態において、バリエジンまたはその類似体の濃度は約２５μＭから約５００μＭの範囲である。他の実施形態において、バリエジンまたはその類似体の濃度は約５０μＭから約３００μＭの範囲である。さらなる実施形態において、血液安定化剤の濃度は約１５０μＭ、他の実施形態においては約３００μＭである。

ポリ硫酸化二糖の濃度は一般に約５０μＭから約５０ｍＭの範囲である。他の実施形態において、ポリ硫酸化二糖の濃度は約２５０μＭから約２５ｍＭの範囲である。さらに他の実施形態において、ポリ硫酸化二糖の濃度は約１ｍＭから約５ｍＭの範囲であり、さらに他の実施形態において、約２ｍＭから約３ｍＭの範囲である。さらなる実施形態において、ポリ硫酸化二糖の濃度は約２ｍＭであり、他の実施形態においては約３ｍＭである。これらの範囲内の全ての部分的範囲も意図される。本明細書に開示した全ての濃度値に関連して用いる「約」という用語は、５０％の変動（プラス／マイナス値）を意味する。

血液安定化剤は溶液、懸濁液または他の液体、ペレット、錠剤、カプセル、噴霧乾燥された材料、フリーズドライされた材料、粉末、粒子、ゲル、結晶または凍結乾燥された材料等の任意の適切な形態であってよい。血液安定化剤は好ましくは薬剤の保存期間を最適化するような形態、即ち効率を低下させることになる血液安定化剤の劣化を防止するような形態で、容器中の貯留槽に導入される。薬剤を乾燥形態、たとえば凍結乾燥された形態で提供することは、良好な安定性を提供し、引き続く滅菌を可能にする上で有利であり、これらの両方は自動化および標準化の観点から重要である。貯留槽中に配置することに加え、血液安定化剤をデバイスの任意の表面の上に位置させてもよい。安定化剤は内壁の上、そのようなデバイスを閉鎖するための栓およびシールの上、または機構部もしくはそのようなデバイスの内部に置かれた他の挿入物の上に配置してもよい。

血液安定化剤に加えて、本発明のデバイスは抗凝固剤を含んでもよい。試料の凝固は血小板凝集の測定を必ずしも不利に妨害するものではないが、あまりに多くの不溶性物質が生成すると、結局は試験すべき液体試料に十分接近することが妨害される。完全に凝固した試料は血小板の研究には役に立たない。したがって、不溶性物質の生成を避けることは、血液機能試験を意図した血液試料の好ましい特性である。抗凝固剤はバリエジンおよび／またはポリ硫酸化二糖によってもたらされる抗凝固、血液安定化および／または抗溶血効果を増大させ得る。本発明において有用と思われる抗凝固剤の代表的な例としては、第Ｘａ凝固因子阻害剤、第ＶＩＩ因子阻害剤、第ＩＸ因子阻害剤、第ＸＩＩ因子阻害剤、および他のトロンビン（第ＩＩ因子）阻害剤が挙げられる。第Ｘａ因子阻害剤のいくつかの代表的な例は、非特許文献９に記載されており、その２つの構造は下記の通りである。

Ｉ＝６−（４−｛１−［（ジメチルアミノ）メチル］シクロプロピル｝フェニル）−１−（４−メトキシフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１，４，５，６−テトラヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オン、ＩＩ＝１−（４−メトキシフェニル）−６−［４−［１−（ピロリジン−１−イルメチル）シクロプロピル］フェニル］−３−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オン
これらの特定の抗凝固剤の量は、一般に１００μｇ／ｍｌから２５ｍｇ／ｍｌ、いくつかの実施形態においては約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌの範囲である。

いくつかの実施形態において、追加的な抗凝固剤はアルガトロバンおよびその誘導体である（たとえば非特許文献１０および非特許文献１１）。アルガトロバンの濃度は一般に約１μＭから約２ｍＭ、いくつかの実施形態においては約１０μＭから約１ｍＭ、さらに他の実施形態においては約２５μＭから約１００μＭの範囲である。

他の実施形態において、追加的な抗凝固剤はアンチスタシンまたはアンチスタシン関連ペプチド（アンチスタシンタンパク質から誘導されたペプチド断片）である（非特許文献１２参照）。アンチスタシンの濃度は一般に１００ｎＭから約２ｍＭ、いくつかの実施形態においては約１μＭから約１００μＭの範囲である。

本発明において有用と思われるさらに他の抗凝固剤の例としては、アンチトロンビンＩＩＩ（非特許文献１３）および組織因子ＶＩＩａコンプレックスに対するファージライブラリーセレクションから誘導されたペプチドであるＥ−７６である（非特許文献１４）。

本発明のデバイスは、キャリア媒体（たとえば水またはアルコール）、安定化媒体（ポリビニルピロリドン、トレハロース、マンニトール等）および／または血液もしくは血液試料を処理するための１つまたは複数の他の添加物を含んでもよい。適切な添加物としては、フェノール、フェノール／クロロホルム混合物、アルコール、アルデヒド、ケトン、有機酸、有機酸の塩、ハライドのアルカリ金属塩、有機キレート剤、蛍光染料、抗体、結合剤（キレート剤ではない）、緩衝剤、および分析のために生物学的試料を処理するために通常用いられる任意の他の薬剤または薬剤の組み合わせが挙げられる。

添加物および／または抗凝固剤は、それらの意図された効果を奏するために試料と接触する限り、貯留槽中および／またはデバイス中の他の場所に配置され得る。たとえば、これらの成分は内壁の上、そのようなデバイスを閉鎖するための栓およびシールの上、または機構部もしくはそのようなデバイスの内部に置かれた他の挿入物の上に配置してもよい。

本発明の方法には、血液または血液試料を、血液安定化剤を含むデバイスに導入するステップが含まれる。いくつかの実施形態において、血液試料は介在するプロセスステップなしに患者から容器に直接抜き取られる。他の実施形態において、採取された試料はさらに処理され、ＰＲＰ等の血液成分を含む濃縮組成物等の組成物が調製される。

試料は次に血液のパラメーターを測定するために、たとえば診断等の分析試験にかけられる。いくつかの実施形態において、測定されるパラメーターは刺激によって凝集する、試料中に含まれる血小板の能力によって試験され得る血小板機能である。試料（たとえばＰＲＰ）が治療用途を意図している場合であっても、そのような試験が実施され得る。

吸引された血液試料および血小板を含む組成物中の血小板機能を分析するために適用できるいくつかのインビトロ診断試験がある。光透過アグレゴメトリー（ＬＴＡ）は広く用いられている手法である。ＬＴＡは、多血小板血漿（ＰＲＰ）の製剤を通して透過できる光の量を測定することによっている。ＬＴＡにおいて、ＰＲＰ中の多数の血小板は光子を散乱するが、血小板アゴニストの添加によって刺激された凝集により、血小板は寄り集まって塊になり、結局は極めて大きくなって試験チャンバーの底に沈殿する。プロセスを通して光散乱は低減し、凝集は試料を通して透過できる光の量の増大として測定される。別の方法は、以下の実施例１に記載する全血インピーダンスアグレゴメトリー（ＷＢＩＡ）である。別の関連する手法はＡｃｃｕｍｅｔｉｃｓ社が販売しているＶｅｒｉｆｙＮｏｗ Ｓｙｓｔｅｍに具現化されている。これはフィブリノーゲンでコートされたラテックスビーズの表面上に血小板が凝集することによる凝集測定値の変動を用いており、凝集はシグナルにおける吸光度の変化によって監視される。Ｓｉｅｍｅｎｓ社によって市販されているＰＦＡ−１００と呼ばれる装置は、モデル系中の血栓形成に必要な時間を解析することによって血小板機能を測定する。ＰＦＡ−１００はそれを通して血液を吸引することができる小孔を有するカートリッジを用いており、血小板凝集が誘起されるとこの孔が閉塞し、この孔を通して血液を吸引するために必要な力が凝集の関数として増大する。ＰＦＡ−１００は「物理的」方法を代表しており、ここでは血小板機能の高分子的結果、この例ではデバイスの孔の閉塞が測定される。別の物理的方法はトロンボエラストグラフィーであり、ここでは血栓塊の不可欠の部分としての血小板の凝集を含む血栓形成が、試料中に浸漬された移動ピンに対する物理的抵抗の量によって測定され、血栓塊が増大すると抵抗が増大する。対照的に、フローサイトメトリー測定は、個別の血小板細胞に対して直接行なうことができ、細胞中の特定の分子的変化を測定することができる。フローサイトメトリーを用いて、細胞表面レセプタータンパク質等の表面タンパク質の形状および配向における変化、または血小板のイオン含量における変化（たとえば血小板の活性化に際して細胞内カルシウム濃度が変化することが知られている）等の、時には上記の測定における凝集のより物理的な特徴付けに対する前触れとしてさえも、血小板の活性化に際して起こる多くの特異的変化を測定することができる。さらに、血小板内のリン酸化タンパク質である血管拡張因子刺激リン酸化タンパク質（ＶＡＳＰ）は、血小板表面上のＰ２Ｙ１２レセプターの活性化に際してリン酸化度が低下し、したがってフローサイトメトリーによって監視可能なＶＡＳＰのリン酸化度の低下は血小板の活性化の指標となる（たとえば非特許文献１５参照）。フローサイトメトリーを用いてＶＡＳＰのリン酸化状態を血小板内部で測定することができるが、同じことをするためにより典型的な免疫化学法を用いる間接法も記述されてきた。

実施例で説明するように、血小板の凝集能およびその程度は、血液試料について「アグレゴメトリー」を実施することによって測定することもできる。アグレゴメトリーを実施するいくつかの方法の中で、アグレゴメトリーは「全血インピーダンスアグレゴメトリー」（ＷＢＩＡ）として測定することができる。ＷＢＩＡの利点は、ＬＴＡが試験試料としてＰＲＰの調製を必要とするのに対し、ＷＢＩＡは全血試料で実施でき、またＰＲＰでも実施できることである。ＷＢＩＡにおいて、特別の試料カップ中の２本のワイヤが、調製された血液試料中にワイヤ間の間隙を極めて小さくして浸漬され、ワイヤの間に小さな電流が流される（電流は小さな間隙中の血液を通して流される）。オペレーターによって導入された化学的刺激によって、血小板凝集が開始される。血小板が凝集するにつれてそれらはワイヤの表面に選択的に集積し、血小板の集積が増大することによって電流に対する絶縁が始まり、電気的インピーダンスの増大が引き起こされ、これが装置によって記録される。典型的な実験においては化学的刺激剤の導入後６分間の電流データが採取される。

これらの測定は血小板凝集（この場合には血小板機能をも意味する）の程度、またある程度には単に試料中の血小板数に感応するように意図されている。いくつかの実施形態において、採取後、特定の時間において血小板凝集を誘起することが有利であろう。したがって、凝集を誘起するために血小板アゴニストが試料に添加され得る。アゴニストは当業者には一般に既知であり、たとえばコラーゲン、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アラキドン酸（ＡＡ）、エピネフリン、トロンビンレセプターアクチベーターペプチド（ＴＲＡＰ）、コラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ）、リストセチン、トロンビン（およびトロンビン類似体）、トロンボキサンレセプターアゴニスト（たとえばＵ４６６１９）、カチオン性没食子酸プロピル、およびコンブルキシンが挙げられる。多くの場合には、最も興味深いアゴニストは血小板凝集の有害な集積を防止するために設計された薬剤であり、これらについては以下の実施例のいくつかにおいてより詳細に記述する。

いくつかのアンタゴニスト、または血小板の反応を阻害し得る化合物もあり、それらの効果も測定することができる。作用の様式によって、当業者には既知のこれらの化合物としては、シクロオキシゲナーゼ阻害剤（たとえばアセチルサリチル酸（ＡＳＡ、または「アスピリン」））、トロンボキサンレセプター阻害剤（たとえばテルトバン、スロトロバン、イフェトロバン）、トロンビンレセプターアンタゴニスト（ＰＡＲ−１、ボラパキサル、アトパキサル）、ＧｐＩＩｂＩＩＩａレセプター阻害剤（たとえばアブシキシマブ、チロフィバン、エプチフィバチド）、Ｐ２Ｙ１２レセプターアンタゴニスト（たとえばクロピドグレル（商品名Ｐｌａｖｉｘ）、［ジクロロ−［［［（２Ｒ，３Ｓ，４Ｒ，５Ｒ）−３，４−ジヒドロキシ−５−［６−（２−メチルスルファニルエチルアミノ）−２−（３，３，３−トリフルオロプロピルスルファニル）プリン−９−イル］オキソラン−２−イル］メトキシ−ヒドロキシホスホリル］オキシ−ヒドロキシホスホリル］メチル］ホスホン酸（Ｃａｎｇｒｅｌｏｒ）、または（１Ｓ，２Ｓ，３Ｒ，５Ｓ）−３−［７−［（１Ｒ，２Ｓ）−２−（３，４−ジフルオロフェニル）シクロプロピルアミノ］−５−（プロピルチオ）−３Ｈ−［１，２，３］トリアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン−３−イル］−５−（２−ヒドロキシエトキシ）シクロペンタン−１，２−ジオール（Ｔｉｃａｇｒｅｌｏｒ）、ならびに血小板の生化学的機能を妨害することができる他の化合物が挙げられる。

吸引した血液試料およびその成分を、多種の診断試験に用いるため、ならびに引き続く治療用の使用のために安定化させることは有利である。以下の開示により、これらの使用の代表的な例を、特に血小板機能の保持に関連して説明する。

有害な心臓血管系事象の緊急性に鑑み、理想的には患者を監視して代替治療を選択する必要なしに、患者のために選択される最初の治療アプローチが即時の効果を有することを知ることは重要である。したがって、患者がそのような治療を受ける前に、患者から血液試料が吸引され、血小板機能の試験が行なわれ得る。そのような試験は処方された抗血栓剤の効果の継続中のモニタリング、血小板機能の過阻害または低阻害の試験のためにも推奨される。同様の試験は、手術／回復の間に起こり得る有害な出血の影響を除外するための手術前スクリーニングにも採用されることが多い。重要なことに、吸引された血液試料中で血小板の機能が安定化されていないと、試験前に血小板を凝集させる（たとえば、試験すべき機能が「残っていない」）、または試験前に血小板がおそらく「死ぬ」、もしくは別の点で自然の機能を失わせることによって、試験は不正確になることがあり得る。

たとえば、抗血小板薬剤は米国および世界中で極めて多く用いられている。心臓の健康のために「ベビー」アスピリンを毎日服用することは普遍的習慣になっており、５千万人ものアメリカ人が毎日のアスピリン用量を摂っている。Ｐｌａｖｉｘ（または化学名クロピドグレル）は広く用いられる抗血小板療法であり、緊急の状況（たとえば介入的心臓処置の直後または心臓発作または卒中発作に関する緊急状況において）および心肺系または循環系の合併症を有していた患者の長期的看護のための両方において用いられている。Ｐｌａｖｉｘおよびアスピリンの作用機序は最終的には血小板凝集を阻害し、それによりたとえば心臓発作または卒中発作を誘発する可能性のある自然発生的に形成された血小板凝集物による動脈の閉塞の可能性を低減することが意図されている。Ｐｌａｖｉｘについては年間２９００万を超える処方箋が書かれている。これらの薬剤は血小板の凝集を誘起する化学的経路をブロックすることによって機能し、したがって血小板凝集物（血栓）が動脈または静脈の血流を機械的に閉塞することによって助長され得る危険な心臓血管系事象を軽減することの助けになる。おそらく５０％ものヒトがこれらの薬剤によく反応せず、現在の医学および科学文献において関心が高まっている課題である（非特許文献１６）。これらの薬剤に「抵抗性のある」患者はこの血小板阻害を受けず、したがって有害事象の危険性が極めて高い。これらの薬剤が意図されたように作用しなかったことの最初のまたは唯一の兆候は、処方箋が予防することを意図していた心臓発作または卒中発作を患者が実際に経験した時に起こり得る。

Ｐｌａｖｉｘおよびアスピリンと全く同様に、これらの効果を模倣する血小板阻害剤（アゴニスト）は、患者が（採血に先立って）薬剤を服用することを必ずしも必要とせずに、効率を試験するために吸引された血液試料に添加することができる。上述のように、脈管系の損傷の際に体内で誘起され得る種々の化学シグナルを模倣するアゴニストを添加することができ、アゴニストへの反応を弱める能力に関して血小板アンタゴニストの効果を試験することができる。

特に、アスピリンは血小板機能を直ちに阻害するので、血小板凝集を分析する前に血液試料に直接少量のアスピリンを単に添加することにより、アスピリンが有益か否かを決定することが可能になる。カングレロルおよびチカグレロル等のＰ２Ｙ１２阻害剤のいくつかは血小板に直接結合し、これを阻害することができる。したがって血小板阻害剤としてのそれらの効率を試験する前に血液試料に直接添加することができる。

一方、Ｐｌａｖｉｘはそれを摂取した後に代謝プロセスによって活性形に変換されなければならない「プロドラッグ」である。プロドラッグは肝臓中の酵素によって処理され、次いで血中を循環できる活性形をもたらすことが多い。したがって、摂取された（プロドラッグ）形態のＰｌａｖｉｘを吸引された血液試料に添加しても血小板凝集の阻害はもたらされない。しかし、それでもＰｌａｖｉｘの作用を模倣し、患者が最初に実際に薬剤を摂取する必要なしに試験することができる。Ｐｌａｖｉｘおよび他の同様の薬剤は、ＡＤＰが血小板を刺激、もしくはアゴナイズすることを可能にする経路を阻害するように作用する。化学物質である２−メチルチオアデノシン５’−一リン酸（２ＭｅＳＡＭＰ）は、Ｐｌａｖｉｘおよび他のＰ２Ｙ１２阻害剤がインビボで阻害するのと同じターゲットを阻害する（非特許文献１７）が、血小板に直接作用することができ、したがって試験の直前に血液試料に添加することができる。したがって、血小板凝集試験に先立って、吸引された血液試料に２ＭｅＳＡＭＰ等の血小板アンタゴニストを添加することにより、Ｐｌａｖｉｘが患者において治療上有用か否かを決定することが可能になる。アンタゴニスト２ＭｅＳＡＭＰは、薬剤ＣａｎｇｒｅｌｏｒおよびＴｉｃａｇｒｅｌｏｒの効果の適切な模倣物をも提供し得る。

したがって血小板機能試験は、たとえば薬剤療法を開始する前およびその後に血液を吸引して血小板機能を試験することにより、これらの薬剤が患者に対して所望の効果を有していたか否かを評価する直接的な方法を提供し得る。患者が薬剤に適正に反応していれば、測定された血小板機能は投与後には低下しているであろう。長期療法における継続的な患者のモニタリングは、血小板機能が心臓発作または卒中発作を防止することの助けとなるのに十分なレベルに阻害されていることを保証する一方、同時に血小板機能が過度に阻害されていないことを保証するためにも実施することができる。この後者の場合において、患者が止められない出血事象（たとえば薬剤誘起性血友病様状態）を経験する極めて高いリスクがあるかも知れない。

これらの試験の関連した用途は手術前スクリーニングに関係している。手術前の患者における固有の血小板機能の試験により、有害な出血事象の素地がある患者を特定することができ、それにより手術を延期し、または手術に先立って疾患を処置することができる（たとえば非特許文献１８参照）。たとえば、アグレゴメトリー試験によって判定される固有の血小板凝集能が異常に低い場合には、患者は「危険がある」と特定される。

血小板機能は、タンパク質または代謝物バイオマーカーの試験の目的でも保持され得る。血小板は診断上対象とするタンパク質および代謝産物を含んでいるが、分析値はこれらのバイオマーカーが遊離して血漿中を循環している形態の濃度を測定している可能性の方が高い。特に血小板の活性化または凝集の際の血小板の脱顆粒は、これらのマーカーのレベルを人為的に上昇させることに繋がる可能性があり、制御されなければ分析前誤差を表わすと考えられる。同様に、血小板顆粒は、これらの循環バイオマーカーに損傷を与え、したがって対象とするバイオマーカーのレベルを人為的に低下させる可能性がある酵素をも含んでいる。ある種の阻害剤を採血チューブに入れて、活性化された血小板から導出される任意の酵素を「妨害する」こともできるであろうが、これらの血漿由来のバイオマーカーの試験のために安定化された血小板を提供することによって最初から単純に血小板の活性化を防止することが望ましい。

本発明のさらに別の用途は、ある種の治療応用における使用のための安定化された血小板の使用に関連する。自己血小板ゲル療法は、ある種の創傷および歯科インプラントの治癒から靭帯の損傷を修復するために意図された注射までにわたる他の広範囲の病態を治療するためのプロセスである。その前提には、血漿試料を吸引するステップ、「多血小板血漿」を分離するステップおよび次いで治癒が望まれる部位において患者に製剤を再導入するステップが含まれる。１つの方法には、トロンビンまたは別の凝固剤を添加して血栓形成を誘起し、迅速に生成して治癒を改善すべき位置に適用することができる「糊」をもたらすステップが含まれる。サイトカインおよびある種の増殖因子を放出する血小板の脱顆粒が、この自己治療アプローチにおいて創傷治癒を刺激すると考えられる。血小板機能が失われ、その結果として血小板が時期尚早に活性化されると、血小板はその治療効果を失うことがある。したがって、本発明の血液安定剤の存在下に血小板を採取および／または保存することは、この観点からも有利である。

血小板機能の分析に加えて、他の臨床的に関連のある血液パラメーターを測定してもよい。代表的な血液パラメーターとしては、臨床化学、免疫化学、酵素学において一般的に試験されるもの等の血漿由来の被分析物の測定、および細胞の「外」の（血液の血漿部分における）分子の他の測定が挙げられる。他の血液パラメーターとしては、血液学、完全血液計数（ＣＢＣ）、血液細胞の血液フィルムおよび顕微鏡解析、血小板の顆粒／脱顆粒測定、ならびに細胞の生化学的および代謝的特徴付け（たとえばフローサイトメトリー、分子生物学、プロテオミクスによって測定されることが多い）等の細胞解析が挙げられる。これらの薬剤を含む、本発明の安定化された血液および血液試料は、抗凝固が血液試料の基本要求である任意の標準的な臨床分析に適合し、したがって有用である。たとえば、血液試料中の種々の細胞を区別して計数する完全血液計数（ＣＢＣ）等の標準的な臨床血液学試験は抗凝固された試料によっており、したがって全ての細胞は懸濁した／溶解した全血状態に留まっている。一般に、通常のＣＢＣの目的には、血液はＥＤＴＡを用いて安定化される。血漿について行なわれる試験はどれも明らかに抗凝固を必要とする（あるいは試料を凝固させ、次いで血清として定義する）。従来の臨床化学測定（当業者には公知の数十から数百の典型的な被分析物のメニュー）は、ヘパリンで抗凝固した血漿試料を用いて行なうことが多い。同様に、免疫化学、または検出機構として抗体結合を用いる被分析物の定量化も血漿試料によっている。しかし、ＥＤＴＡおよび典型的に用いられる濃度（たとえば１３Ｕ／ｍｌ）のヘパリンは、いずれも血小板機能試験を実施するための実際の能力を妨害する。したがって、プラットフォームを超えた試料の適用性に相互交換性がない。本発明は、血小板機能試験ならびにこれらの他の一般的な臨床血液学試験のための血液試料を安定化することにおいて、この制限を克服するものである。

本発明の使用を容易にするため、１つまたは複数のデバイスをキットの形態にパッケージしてもよい。いくつかの実施形態において、キットにはたとえば開いたラック中またはシールされたパッケージ中に配置された１つまたは複数のデバイスが含まれ得る。キットには血液を吸引および採取するために有用な１つまたは複数の要素、たとえば針、ターニケット、バンデージ、アルコールおよびワイプ、ならびにランセットが含まれてもよい。キットにはその中に既知の血液安定剤および／または抗凝固剤が配置されたチューブ等の他の種類の採血デバイスが含まれてもよく、その例としてはＥＤＴＡチューブ（たとえば日常の血液学計数のため）、ヘパリンチューブ（臨床化学のため）、クエン酸塩チューブ（凝固試験のため）、および他の特別チューブ（プロテオミクス、ゲノミクス等における使用のため）が挙げられる。本発明のキットには使用説明書が含まれてもよい。

他のいくつかの実施形態において、キットには一次採取デバイス、たとえばその中に分離要素を有する血漿分離チューブを有する血漿チューブ、および試験のための二次チューブ、たとえば採取した血漿を注ぎ、または分注するためのチューブが含まれてもよい。一次チューブ中の分離要素は、多血小板血漿を血液の他の細胞成分から分離することを可能にするために適切な密度を有するものであり得る。二次試験チューブは所望の試験に応じて一次チューブと同じまたは異なった寸法であってよい。両方のチューブにはその中に血小板安定化剤を配置してよい。キットには注ぎ入れまたは他の安全でない移送の実施の必要性を防止するため、チューブ間移送デバイスがさらに含まれてよく、その場合には二次チューブは血漿を吸引するために減圧されている。

本発明の別の態様において、一次採血チューブの中に血液安定剤とともに血小板アンタゴニストが含まれ得る。インビトロ診断分析の一部として適切なアゴニストを用いて刺激することによってそのような試料の血小板機能を試験することは、その患者の血液についてのアンタゴニスト／薬剤の効率を直接に反映するものであり得る。好ましい実施形態において、キットは少なくとも２つのチューブを含み、ここで１つのチューブは血液安定剤を含み、別のチューブは血液安定剤と血小板アンタゴニストとを含み、それによりオペレーターが凝集分析を実施する前に血液試料に他の操作を実施する必要なしに阻害状態および非阻害状態の両方で血小板を測定することが可能になる。

ここで本発明を以下の非限定的な実施例に関して説明する。

血小板凝集測定に反映される血小板機能試験のための全血試料の安定性の延長

血液試料：クエン酸ナトリウム（３．２％）または１５０μＭのバリエジン（配列番号１）のいずれかを含むチューブに、ヒト対象から静脈血を吸引した。表示した時間に試験を行なうまで、攪乱せずに分割して室温で放置した。時間とともに自然に沈降した血液細胞を再懸濁するため、試験の直前に試料を数回転倒させた。

測定：血小板機能（これはこの実験においては凝集活性である）の試験は、マルチプレート装置（Ｖｅｒｕｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｍｕｎｉｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて行なった。これは試料として全血を用い、血小板凝集の尺度としてインピーダンスの増加を用いるものである。装置はメーカーの指示に従って用いた。簡単に述べると、各々の反応キュベット中で３００μｌの等張食塩水を加温し、これに３００μｌの全血試料を加えた。インビトロでアスピリンまたは他の血小板アンタゴニスト（阻害剤）を加える反応において、２０μｌのアスピリンストック溶液を試料に加えた。凝集反応はメーカーの指示に従って血小板アゴニスト、この場合にはコラーゲンを濃度３．２μｇ／ｍｌ、２０μｌの量で添加することによって開始した。コラーゲンの添加によってインピーダンスの測定が自動的に開始され、６分間継続されて、図２に示すグラフのｘ軸に沿って全過程を表わした。グラフはｙ軸上の任意の無単位測定値としてのインピーダンスによって、ｘ軸上の操作時間６分にわたって報告される血小板凝集を示す。示された軌跡は装置から得られた生の血小板凝集データである。いくつかのグラフで明白な二重の軌跡は、データの統計的有意性を補助するために常に同時に行なった２つの二重測定チャネルを表わし、いくつかのグラフにおいては極めて接近して重なっているので、単独の軌跡のみであるかのように見える。代表的なデータは、最初の吸引から１時間、２４時間、４８時間、および７２時間後、室温に置いた血液について示している。データは血液それ自体、および試験の直前に血小板機能を阻害するためにアスピリンで前処理した血液について示している。

Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＣＬＳＩ）等の診断規制機関によれば、血小板機能試験における使用にはクエン酸塩加全血が臨床的標準と考えられている。したがって、われわれは本発明の実施形態をクエン酸塩と比較した。図２に示すように、クエン酸塩および本発明の試料は新しい場合、１時間において、全く同様に機能した。両方ともコラーゲンには強く反応し、アスピリンによって測定し得るアンタゴニズムを示した。しかし、本発明の実施形態のシグナルの強度は「新鮮な」試料においてさえもクエン酸塩対照試料よりも大きく、クエン酸塩加血液を採血後最大２〜４時間以内に試験することを推奨している現行の臨床ガイドラインの中においてさえも試験に対する本発明の利点を実証している。本発明の化学品に血液を直ちに曝すことには重要な利点がある。より長い時間では全て、クエン酸塩血液のシグナルは明白に失われ、シグナルは殆ど測定不能になり、したがってアスピリンアンタゴニズムによるさらなる減少のいかなる観察も実質的に不可能になることが明らかである。対照的に、２４時間および４８時間において、本発明の実施形態は実質的に血小板機能を１時間経過の試料において測定された機能のレベルに保持しており、アスピリンアンタゴニズムを測定する能力をも保持していた。７２時間において、シグナルは僅かに減少したが、アスピリンを添加した際のさらなる減少を観察できる程度にまだ十分に強かった。したがって、この実験の結果は本発明の有利な態様、即ち新鮮な試料についてのより強い血小板機能シグナル、ならびに吸引後数日間までの血小板機能の大きな保持の両方を実証し、かつ血液を単に室温で保存することをも可能にするものである。

血小板機能測定のための吸引された血液試料の可使時間の延長

図３に血小板機能測定法の限界、および試料吸引後の機能の喪失が有用な臨床診断データを生成する能力にどのように悪影響を及ぼすかを示す。実験は実施例１に記載したように実施した。この場合には、データは血液試料が体外に存在していた時間（ｘ軸）の関数として、血小板凝集シグナルの１つの表現としての曲線下面積（ＡＵＣ）として示される血小板機能をプロットしている。ＡＵＣは実施例１に示す生データ軌跡から集積されたシグナルであり、これも無単位の測定値として報告されている。装置の実効的なバックグラウンドレベルはグラフの下部にわたって点線として引いてある。このレベル以下のいずれのＡＵＣ凝集測定も極めて弱くて報告に値せず、実質的に「無」のデータレベルを表わしていると考えられた。

２４時間において、クエン酸塩加血液試料中の血小板は十分な機能を失って実効的な無レベルに極めて近くなり、アスピリンの存在下においては既にこの無レベルに到達していた。４８時間後までには、アスピリンの添加がない場合においてさえも、クエン酸塩加試料については意味のある凝集は検出されなかった。比較として、本発明の実施形態は血小板機能を安定化させ、採血の７２時間後においてさえも意味のある測定が可能であった。

データのさらに別の観点を図４に示す。ここでは各々の種類の試料について測定した血小板凝集を１時間の試料について測定した凝集に対する百分率として報告する。このグラフ中のデータは、３名のヒト対象の平均として、平均からの１標準偏差を表わす誤差バーとともに報告されている。この観点において、クエン酸塩を用いて採取および保存した血小板は２４時間以内にその機能の半分超を失い、４８時間までに機能の８０％超を失ったことがデータによって示されている。比較として、本発明の実施形態によって採取および保存した血小板については、４８時間においてシグナルの半分超が維持された。

血小板機能の保持および抗凝固に対する種々の濃度のバリエジンの影響

血小板の相対的安定性を、種々の濃度のバリエジン（配列番号１）に関して検討した。実験は上述のように実施し、アゴニストとしてコラーゲンまたはアデノシン二リン酸（ＡＤＰ）のいずれかを用い、全てメーカーが推奨するプロトコルによった。表２に安定性の定性的評価、即ち血液を最初に吸引してからどれだけ長く、血小板凝集が実効的な装置のベースラインの上で測定可能であったか、全血試料中で凝固した不溶性物質が最初に目視で観察された時間を記載し、またこの不溶性物質の存在の重大性または程度の評価も記録した。

この結果、バリエジン濃度の増大によって、測定可能な血小板凝集シグナルを有することと、全血試料中の不溶性物質の出現が遅くなることの両方に関して、全体としてより長い機能保持（安定化）効果がもたらされることが示される。

この結果はまた、本発明の使用は特定の用途の必要性に応じてカスタマイズおよび適合化させることができることを示している。たとえば、病院の救急部門におけるように、試料を迅速に採取し試験する必要がある状況において、比較的低濃度（たとえば２μＭ）のバリエジン等の血液安定剤を用いることによって、数時間の安定性を達成することが可能である。試験がことによると採取の数日後に行なわれる状況等におけるように、より長い安定時間が必要な場合には、比較的高濃度（たとえば１５０μＭ）のバリエジン等の血液安定剤を用いることが有利であることが、この結果から示される。クエン酸塩に対する本発明の利点と併せて、本発明は血液安定剤の適切な濃度を選択することによって、種々の時間枠にわたって血小板凝集シグナルがより強いという利点を提供し得る。

血小板機能の保持および試料品質の他の態様に対するバリエジンおよびバリエジンペプチドの他の変種の影響

実験はバリエジン（配列番号１）のいくつかの類似体を試験することで実施した。表３に、その全てが典型的な固相合成によって製造された、試験したペプチドを示す。

命名：略語Ｎｔはアミノ末端アミノ酸を表わし、番号はアミノ末端から数えた残基の数を表わす。Ｃｔは同様にアミノ末端から番号をつけた全てのカルボキシ末端アミノ酸を表わす。Ｋ１０Ａは標準のタンパク質配列命名に対する単一残基変異体である。

これらのペプチドを血液安定剤として用い、減圧にした空の採血チューブに採取した直後に血液に添加し、最終濃度１５０μＭとした。血液は全て実施例１に記載したように血小板凝集の可能性について分析するまで、全血状態で室温放置した。アゴニストとしてはメーカーの指示に従い、コラーゲンおよびＡＤＰを用いた。表４に安定性の定性的評価、即ち試料を最初に吸引してからどれだけ長く、血小板凝集が実効的な装置のベースラインの上で測定可能であったかを記載している。さらに、全血試料中で凝固した不溶性物質が最初に目視で観察された時間、およびこの不溶性物質の存在の重大性または程度の評価も記録した。いくつかの例において、血小板凝集測定を行なうことなしに、不溶性物質の量の目視による特徴付けのみを報告した。

データから示されるように、バリエジン配列を短くすると、特に目視で検出可能な量の不溶性物質が全血試料中で形成されるまで室温保存した時間によって判断される試料の安定性の期間が短くなった。それにも拘わらず、血小板試験が採血後比較的早く実施される病院内または救急部門の状況におけるように、全体の試料の安定性に対してより短い時間でも十分な状況において血小板機能の保持を達成するためには、短くされたバリエジン配列も使用できる。

バリエジンが最終的にトロンビンによって開裂した場合の製品の血小板機能の保持能を検討するため、これらのバリエジン類似体の２つ（配列番号６およびＮＯ：１６）を用いた。バリエジンはトロンビンの活性部位の結合について競合し、したがってそれ自体トロンビンによる開裂の対象となる（非特許文献１９）。また、開裂可能な残基である１０位のリジンのアラニンへの変異は配列番号６と指定されたペプチドを開裂させるトロンビンの能力をブロックし、その結果、試料は採血後４時間以内に固く凝固する。同様に、トロンビンがバリエジンを開裂させた後で生成するカルボキシ末端の２２残基のみを表わすＣｔ２２を添加すると、１時間以内に固く凝固した殆ど使用できない試料となった。これは本質的に瀉血後に何も血液に加えず、それ自体で凝固させた場合に起こり得ることである。

これらの結果は、従来の酵素学的実験によって測定してＣｔ２２が特に治療目的に効果的なトロンビン阻害剤であると報告したＫｏｈによる発見と一致しない。今回の結果をこの文脈で考慮すると、治療目的のためのトロンビン阻害の程度は、採取した血液試料中のような非生理学的条件下における血液および血小板等の血液成分を安定化させる目的でのトロンビン阻害を必ずしも予測するものではない（または必ずしもこれと相関するものではない）という意味で、当技術分野における予測不能性が強調される。

データからはまた、Ｃｔ２９と１．１７Ｕ／ｍｌのヘパリンとの組み合わせにより、試料の安定性の時間が延長されることが示される。

他の直接または間接トロンビン阻害剤によって提供される血小板機能の保持の検討

いくつかの直接または間接トロンビン阻害剤を、単独でまたは他の阻害剤と組み合わせて、血小板機能を保持することによって血液試料を安定化させる能力について評価した。血小板凝集の測定は、血小板アゴニストとしてコラーゲンおよび／またはＡＤＰを用い、メーカーが示唆するプロトコルに従って、上記の実施例に記載したように実施した。

バリエジンに加えて検討した直接トロンビン阻害剤はアルガトロバン、ＦＭ−１９、アプロチニン、およびＤ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニンクロロメチルケトン（ＰＰＡＣＫ）であった。

検討した間接トロンビン阻害剤はヘパリンおよび八硫酸スクロース（ＳＯＳ）であった。

全ての阻害剤は単独でまたはバリエジン（配列番号１）と組み合わせて、採取した血液試料中の血小板機能を保持する能力について試験した。

結果を表５に示す。この表には、新たに吸引した全血試料に単独でまたは組み合わせて添加した添加物を記載している。この表には３つの性能パラメーター、即ち１）採血後、アグレゴメーターのベースラインより上で信頼できる血小板凝集測定が可能であった最長時間；２）不溶性物質の目視検出が認められた最短時間（これには不溶性の程度の定性的な記述、即ち痕跡（注意深い目視観察が必要な低レベルの検出可能物質）または中程度（簡単な評価で容易に見られる）の量、次いで完全に凝固した試料（攪乱しない血清試料のように固化し、一般には決して血小板凝集測定には使用できない）のいずれかが含まれる）；および３）臨床実験室において普遍的で許容された業務である、目視で決定される溶血の定性的推定が報告されている。試験した条件のいくつかについては、これらの３つのパラメーターのうちのサブセットのみが記録されている。

表５に示すように、１５０μＭのバリエジンおよび２ｍＭのＳＯＳは、いずれも単独および組み合わせで、３つの性能マトリックスの全てに関して有効であることが証明された。本発明のこれらの実施形態は安定性に関して長い時間枠（即ち少なくとも７２時間）を達成し、望ましくない属性である不溶性物質の生成および溶血は概してなかった。

全く対照的に、直接トロンビン阻害剤のいくつかは、推奨された濃度でまたは治療に有用であると報告された濃度で単独使用すると、安定化のメリットが僅かであるか、なかった。特にＦＭ−１９、ＣＴＩおよびＰＰＡＣＫは、採血後２４時間以内に、完全に固体の凝固でなければ大量の不溶性物質を生じた。同様に、比較的高濃度のアルガトロバンを用いると、凝固の開始が早くなり、血小板凝集測定のための試料の安定性の時間が短くなり、また大量の溶血が生じた。ヘパリンも、典型的なヘパリン血漿試料中の用量の約１３分の１（１／１３）である１．１７Ｕ／ｍｌで単独使用すると、比較的劣る性能であった（データは示さない）。

これらの結果は、インビトロにおいて血液を安定化させる（たとえば血小板機能を保持する）ための既知のトロンビン阻害剤および抗凝固剤の使用に関する予測不能性をさらに強調するものであり、したがって、血液の安定化、特に血液の凝固が、少なくともインビトロの血液試料に関しては、他の血液成分が存在しない精製トロンビンの阻害の研究等のより単純な系に対するこれらの阻害剤の評価と比べて、異なった、またより複雑な生物学的／生化学的要求の組み合わせを有しているという、本出願人らの作業仮説と一致するものである。さらに、直接トロンビン阻害剤について研究されたことの多くは凝固異常の治療のための治療効果の可能性と関係があるが、重要なことには、そのような研究および究極的には有効な治療用量を作製することに関連する根底にある生化学的因子は、特に長い日時の間にわたって採取された血小板等の血液成分を安定化させる阻害剤の能力に関しては必ずしも関連があるとか予測できるというものではない。別の言い方をすれば、ある薬剤がトロンビン阻害剤として医学的に使用されることが知られているというだけの理由で、同一性および有効性のための適切な濃度の両方において、それがインビトロ試験の目的のための効果的な血液安定剤として機能するであろうということを必ずしも意味しない。

一方、これらの他の薬剤は単独で使用した場合にはあまり効果がないか、ほぼ無効であるにしても、本発明の実施形態−バリエジンおよびＳＯＳと組み合わせて用いた場合には付加的な血小板安定効果をもたらすことが結果から示される。たとえば、ヘパリンとバリエジンの場合に、われわれは凝集測定のための安定性の時間の延長および全血試料における不溶性物質の生成の低減または遅れを認めた。同様の観察が、バリエジンと組み合わせたＦＭ−１９で得られた。ＦＭ−１９およびＳＯＳについては、バリエジンとの組み合わせによっても、実験の全時間枠にわたって、測定された全体の血小板凝集シグナルが僅かに増加することが見られた。したがって、観察された結果は、これらの阻害剤（これらは多くの場合にはトロンビンの同じ領域に結合することによってその効果を発揮することが知られていた）によって提供される活性および究極的には追加的な利点は、吸引された血液試料を安定化させるためにインビトロで使用された場合には、治療目的のための実際の阻害可能性を評価するために設計されたモデルの酵素学的系における活性とは異なっていることを示している。

発明の実施形態とヒルジンとの比較

１５０μＭのバリエジン（配列番号１）＋１．１７ＵＳＰ／ｍｌの未分画ヘパリンを含む本発明の採血チューブと、比較としてＶｅｒｕｍ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社から購入可能なヒルジンを含む採血チューブ（カタログ＃ＭＰ０６００「ヒルジン真空採血チューブ」）とを用いて、５名の異なったヒト対象から採取した血液について、血小板の相対的安定性を検討した。実験は全血インピーダンスアグレゴメーターを用い、アゴニストとして低用量のＡＤＰ（最終濃度１．２５μＭ）を用いて、上記実施例１に記載したように実施した。

表６に示すように、直後および２４時間後の両方において、本発明の採取チューブにおける血小板機能測定の方が対照の非発明ヒルジン試料よりも強かった。

新鮮な血液を用いて吸引後１時間以内に試験すると、測定し得るＡＤＰ誘起血小板凝集は、本発明の採血チューブ中の血液の方がヒルジンを含むチューブ中に採取した血液よりも平均５６％高かった。これらの同じ試料は２４時間で同じ対照に対して平均３８％高い活性を示した。ヒルジン試料はまた、時間０において本発明の製剤よりも広い分布を示した。５個のヒルジン試料は６２＋／−３８の凝集を示し、約６１％（３８／６２＊１００）の標準誤差を表わした。対照的に、本発明のチューブ中の凝集は７７＋／−２８で、標準誤差はちょうど３６％であった。これらの結果は、本発明の採血デバイスの使用によって分析の再現性が改善され、ヒト試料の個体数にわたってより均一な応答が達成されたことを実証している。これらの利点により、血小板機能測定の臨床的有用性が改善される。たとえば、健常者母集団に対する「正常」の範囲をより狭くすることにより、疾患または抗血小板薬剤に対する低応答を反映する、凝集が範囲外である試料をより容易に検出できるであろう。

本発明の実施形態であるバリエジンは、ヒルジンと同様に、吸血性動物から得られるペプチドである。しかしここでも、そのような天然から誘導された直接トロンビン阻害剤は、１つの種類として、特に血小板機能分析のための血液添加物としては、同じまたはある場合にはほぼ同様の効率を有するのではないこと、およびこれに関するそれらの能力は予測できないことを、データは実証している。

表６にあるようなデータを利用するさらなる方法を考慮することも重要である。たとえば、少なくとも薬剤／アンタゴニストに適正に応答する患者の場合に、表６に報告したように、血小板アンタゴニストを導入することによって、アンタゴニスト未添加の場合のシグナルを大幅に低下させることが予想されよう。関連するアンタゴニストとしては、アスピリン、Ｐｌａｖｉｘおよび既に検討した他のもの等の抗血小板薬剤が挙げられる。以前の実験から、２ＭｅＳＡＭＰを添加すると５０％以上、たとえば６７％（約２／３）ものアゴニスト誘起血小板凝集がもたらされ、それによってシグナルが低くなり、凝集装置の検出下限より上で信頼性をもって測定することが難しいことがわかる。この操作下限付近またはそれ以下に入る２ＭｅＳＡＭＰ存在下のいかなる測定値も意味がないであろう。これらの実験で用いた装置に関しては、信頼できるシグナルの下限は８または９ＡＵＣの範囲にある。したがって、少なくともこの実験を実施するために用いる特定の装置の目的には、アンタゴニスト未添加のＡＤＰ誘起凝集測定値が少なくとも約２７ＡＵＣあることが、最低の信頼できるシグナルであると考えられる（２７ＡＵＣからの６７％の低下が９ＡＵＣとなり、これがこの特定の装置の検出限界である）。したがって、２７ＡＵＣの閾値が、表６のデータを判断するための基準である。

５個のヒルジン試料の１つにおいて、１時間の試料の曲線下面積は１８と測定され、この機能性閾値である２７未満になったので、２ＭｅＳＡＭＰの存在下では臨床的に重要でない測定値がもたらされるであろう。２４時間において、５個のヒルジン試料のうち３個が２７ＡＵＣ未満となり、４番目の試料はちょうど２７となった。

対照的に、本発明の採血チューブに採取した５個の試料全ては１時間で、また５個中４個は２４時間で、２７の閾値を優に上回る血小板凝集を維持していた。この結果は、本発明によって血小板が採取および引き続く保存の間に安定化され、それにより、特に低レベルの凝集を正確に測定することが重要な場合に、臨床的に関連のある血小板機能データを明確に決定することが可能になり、長時間にわたって有用なデータを測定することの可能性が（新鮮試料中と２４時間保存した試料との両方においてヒルジンと比較した場合等に）改善されることを実証している。

全ての特許文献および非特許文献は、本発明が関係する技術における当業者のレベルを示すものである。これら全ての文献は、各々の個別の文献が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書における発明を特定の実施形態と関連させて記述してきたが、これらの実施形態は本発明の原理および応用を説明するのみであることを理解されたい。したがって、説明用の実施形態には数多くの改変が可能であること、ならびに添付した特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、他の配置も考案され得ることを理解されたい。

Claims (15)

1. 血液またはその成分を採取し、安定化させるためのデバイスであって、
   前記デバイスは第１の端部、第２の端部、および血液を受容するための貯留槽部分を画定する少なくとも１つの内壁を有し、
   前記貯留槽は、
   ａ）配列番号１として指定されるアミノ酸配列を有するバリエジン、または配列番号２〜５から選択される番号１の断片である前記バリエジンの類似体、または配列番号６として指定される前記バリエジンの類似体からなる群から選択されるその類似体、
   ｂ）スクローステトラサルフェート、スクロースペンタサルフェート、スクロースヘキササルフェート、スクロースヘプタサルフェート、および、スクロースオクタサルフェート、からなる群から選択されるポリ硫酸化二糖、または、
   それら（ａ）および（ｂ）の組み合わせを含み、
   それぞれ血液またはその成分を安定化させるために有効な量で含む、
   血液安定剤を含み、
   配列番号１として指定される前記バリエジンまたはそれらの類似体は、前記デバイスの中に１μＭから１５０μＭの濃度で存在し、および、
   前記ポリ硫酸化二糖は前記デバイスの中に１ｍＭから５ｍＭの濃度で存在し、
   前記デバイスは、無菌で、および、少なくとも部分的に減圧されていて、さらに針によって穿刺可能なクロージャーを備える、
   ことを特徴とするデバイス。
2. 減圧されていることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
3. チューブであることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
4. 分離材をさらに備えることを特徴とする請求項３に記載のデバイス。
5. 前記血液安定剤は、アルガトロバン、ｒＯｉｃＰａＦ（ｐ−Ｍｅ）―ＮＨ₂、ヒルジン、ビバリルジン、アプロチニン、Ｄ−フェニルアラニル−Ｌ−プロリル−Ｌ−アルギニン（ＰＰＡＣＫ）、またはそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、直接トロンビン阻害剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
6. 前記血液安定剤は、ヘパリンおよび低分子量ヘパリンからなる群から選択される、間接トロンビン阻害剤をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
7. 前記血液安定剤は、乾燥形態であることを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
8. アンチスタシン、アルガトロバン、Ｅ−７６、アンチトロンビンＩＩＩ、ならびに、６−（４−｛１−［（ジメチルアミノ）メチル］シクロプロピル｝フェニル）−１−（４−メトキシフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１，４，５，６−テトラヒドロ−７Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オン；および１−（４−メトキシフェニル）−６−［４−（１−（ピロリジン−１−イルメチル）シクロプロピル］フェニル］−３−（トリフルオロメチル）−４，５−ジヒドロピラゾロ［３，４−ｃ］ピリジン−７−オン、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される第Ｘａ因子阻害剤、ならびに、第ＶＩＩ因子阻害剤、第ＩＸ因子阻害剤、第ＸＩＩ因子阻害剤および第ＩＩ因子阻害剤、ならびにそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される抗凝固剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のデバイス。
9. 前記血液安定剤は、シクロオキシゲナーゼ阻害剤、Ｐ２Ｙ１２阻害剤、抗血小板抗体、およびそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される血小板アンタゴニストをさらに含むことを特徴とする請求項１に記載のデバイス。
10. 血液または血液の組成物を安定化させるためのデバイスの使用であって、前記血液または前記組成物をデバイスに導入され、
    前記デバイスが、
    第１の端部、第２の端部、および前記血液または前記組成物を受容するための貯留槽部分を画定する少なくとも１つの内壁を有し、
    前記貯留槽は、
    ａ）配列番号１として指定されるアミノ酸配列を有するバリエジン、または配列番号２〜５から選択される番号１の断片である前記バリエジンの類似体、または配列番号６として指定される前記バリエジンの類似体からなる群から選択されるその類似体、
    ｂ）スクローステトラサルフェート、スクロースペンタサルフェート、スクロースヘキササルフェート、スクロースヘプタサルフェート、および、スクロースオクタサルフェート、からなる群から選択されるポリ硫酸化二糖、または、
    それら（ａ）および（ｂ）の組み合わせを含み、
    それぞれ血液またはその成分を安定化させるために有効な量で含む、
    血液安定剤を含み、
    配列番号１として指定される前記バリエジンまたはそれらの類似体は、前記デバイスの中に１μＭから１５０μＭの濃度で存在し、および、
    前記ポリ硫酸化二糖は前記デバイスの中に１ｍＭから５ｍＭの濃度で存在している、
    前記デバイスは、無菌で、および、少なくとも部分的に減圧されていて、さらに針によって穿刺可能なクロージャーを備える、
    ことを特徴とするデバイスの使用。
11. 前記組成物は、吸引された血液試料、または、
    前記組成物は、多血小板血漿（ＰＲＰ）または、
    前記組成物は、白血球であることを特徴とする請求項１０に記載の使用。
12. インビトロにおいてデバイスに導入された血液または血液組成物のパラメーターを測定するためのデバイスの使用であって、
    前記デバイスは、第１の端部、第２の端部および、血液または血液の成分を含む組成物を受容するための貯留槽部分を画定する少なくとも１つの内壁を有し
    前記貯留槽は、
    ａ）配列番号１として指定されるアミノ酸配列を有するバリエジン、または配列番号２〜５から選択される番号１の断片である前記バリエジンの類似体、または配列番号６として指定される前記バリエジンの類似体からなる群から選択されるその類似体、
    ｂ）スクローステトラサルフェート、スクロースペンタサルフェート、スクロースヘキササルフェート、スクロースヘプタサルフェート、および、スクロースオクタサルフェート、からなる群から選択されるポリ硫酸化二糖、または、
    それら（ａ）および（ｂ）の組み合わせを含み、
    それぞれ前記血液を安定化させるために有効な量で含む、
    血液安定剤を含み、
    配列番号１として指定される前記バリエジンまたはそれらの類似体は、前記デバイスの中に１μＭから１５０μＭの濃度で存在し、および、
    前記ポリ硫酸化二糖は前記デバイスの中に１ｍＭから５ｍＭの濃度で存在し、
    前記デバイスは、無菌で、および、少なくとも部分的に減圧されていて、さらに針によって穿刺可能なクロージャーを備える、
    ことを特徴とするデバイスの使用。
13. 前記パラメーターは血小板の凝集により測定される血小板機能であり、前記デバイスは、
    前記デバイスは、更に血小板の凝集を刺激する血小板アゴニストを含み、
    前記アゴニストは、コラーゲン、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、アラキドン酸（ＡＡ）、エピネフリン、トロンビンレセプターアクチベーターペプチド（ＴＲＡＰ）、コラーゲン関連ペプチド（ＣＲＰ）、リストセチン、トロンビン、トロンビン類似体、トロンボキサンレセプターアゴニスト、カチオン性没食子酸プロピル、コンブルキシン、およびそれらの２つ以上の組み合わせを含む、
    ことを特徴とする請求項１２に記載の使用。
14. 前記デバイスが、血小板の凝集を阻害する血小板アンタゴニストをさらに含み、
    前記血小板アンタゴニストは、アセチルサリチル酸、クロピドグレル、カングレロル、チカグレロル、および２−メチルチオアデノシン５’−一リン酸（２ＭｅＳＡＭＰ）、ならびにそれらの２つ以上の組み合わせからなる群から選択される、
    ことを特徴とする請求項１３に記載の使用。
15. 血液または血液成分を含む組成物を採取し、安定化させるための少なくとも１つのデバイスを含むキットであって、
    前記デバイスは、第１の端部、第２の端部、および前記血液または前記組成物を受容するための貯留槽部分を画定する少なくとも１つの内壁を有し、
    前記貯留槽は、
    ａ）配列番号１として指定されるアミノ酸配列を有するバリエジン、または配列番号２〜５から選択される番号１の断片である前記バリエジンの類似体、または配列番号６として指定される前記バリエジンの類似体からなる群から選択されるその類似体、
    ｂ）スクローステトラサルフェート、スクロースペンタサルフェート、スクロースヘキササルフェート、スクロースヘプタサルフェート、および、スクロースオクタサルフェート、からなる群から選択されるポリ硫酸化二糖、または、
    それら（ａ）および（ｂ）の組み合わせを含み、
    それぞれ前記血液または前記血液成分を安定化させるために有効な量で含む、
    血液安定剤を含み、
    配列番号１として指定される前記バリエジンまたはそれらの類似体は、前記デバイスの中に１μＭから１５０μＭの濃度で存在し、および、
    前記ポリ硫酸化二糖は前記デバイスの中に１ｍＭから５ｍＭ濃度で存在し、
    前記デバイスは、無菌で、および、少なくとも部分的に減圧されていて、さらに針によって穿刺可能なクロージャーを備え、
    前記キットは血小板アンタゴニストをさらに含む第２のデバイスをさらに含む、
    ことを特徴とするキット。

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