DE102018218739B3

DE102018218739B3 - Blutentnahmeröhre und Verfahren zur Präparation

Info

Publication number: DE102018218739B3
Application number: DE102018218739.8A
Authority: DE
Inventors: Tim Kinitz
Original assignee: Walter Sarstedt Geraete und Verbrauchsmaterial fuer Medizin und Wissenschaft
Current assignee: Walter Sarstedt Geraete und Verbrauchsmaterial fuer Medizin und Wissenschaft
Priority date: 2018-11-01
Filing date: 2018-11-01
Publication date: 2020-03-19
Anticipated expiration: 2038-11-02
Also published as: WO2020089461A1

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung einer flüssigen biologischen Probe mit dem Schritt des Einziehens der Probe in ein erstes Ende einer Röhre, die ein voreingestelltes Vakuum aufweist und/oder an deren gegenüberliegendem zweiten Ende ein Kolben verschieblich an einer Kolbenstange geführt ist, und die Röhre als Füllung zumindest eine Stabilisierungszusammensetzung, die in Wasser und/oder in Blutserum löslich ist und eine wässrige Stabilisierungslösung bildet, und ein Gel enthält, optional zusätzlich eine schwere wässrige Komponente, mit dem Schritt des anschließenden Zentrifugierens.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Röhre, die zur Stabilisierung einer flüssigen biologischen Probe, z.B. einer Vollblutprobe, und zur Präparation von Zellen, insbesondere kernhaltigen Zellen, und/oder von zellfreien Nukleinsäuren eingerichtet ist.
Weiter betrifft die Erfindung die Verwendung der Röhre als Stabilisierungsvorrichtung für eine flüssige biologische Probe und ein Verfahren zur Stabilisierung und Präparation von kernhaltigen Zellen und/oder von zellfreien Nukleinsäuren aus der Probe.
Die Röhre ermöglicht ein Verfahren, bei dem die Probe, die bevorzugt Vollblut ist, nach dem Einziehen in die Röhre mit nur einem Zentrifugationsschritt in eine vom restlichen Volumen abgetrennte Fraktion, die einen Großteil der oder alle kernlosen Zellen enthält, und eine Fraktion, die im Wesentlichen zellfreie Flüssigkeit mit darin enthaltenen zellfreien Nukleinsäuren und eine in dieser Fraktion enthaltene Schicht kernhaltiger Zellen aufgetrennt wird. Die Stabilisierung und insbesondere die Präparation von kernhaltigen Zellen und/oder von zellfreien Nukleinsäuren umfasst die Erzeugung einer Fraktion, die kernhaltige Zellen und/oder zellfreie Nukleinsäuren aufweist oder daraus besteht, z.B. in Plasma bei Vollblut als Probe, und die bevorzugt frei von kernlosen Zellen ist. Die Schicht der kernhaltigen Zellen kann z.B. bei Vollblut als Probe mononukleäre Blutzellen und freie Tumorzellen enthalten.
Das Verfahren und die Verwendung der Röhre umfassen im Anschluß an die Stabilisierung die Analyse der Mischung aus der Probe und der Stabilisierungslösung, bevorzugt mit der Lagerung der Röhre mit der darin eingezogenen Probe im Anschluß an das Einziehen der Probe in die Röhre und/oder vor der Entnahme der Mischung der Probe mit der Stabilisierungslösung aus der Röhre.
Die Vorrichtung ist daher zur Verwendung in einem Verfahren geeignet, bei dem mit genau einem Zentrifugationsschritt und in der einen Röhre, d.h. ohne Entnehmen eines Teils der Probe aus der Röhre, die Fraktion bereitgestellt wird, die stabilisierte kernhaltige Zellen und/oder zellfreie Nukleinsäuren enthält oder, z.B. in Plasma, daraus besteht, wobei die Fraktion von kernlosen Zellen, insbesondere von Erythrozyten bei Vollblut als Probe, durch eine stabile Barriere abgetrennt ist. Die Röhre ist geeignet, dass sie im Verfahren nach dem Einfüllen der Probe vor und/oder nach dem einzigen Zentrifugationsschritt gelagert wird und dabei die Fraktion stabilisierter kernhaltiger Zellen und/oder stabilisierter zellfreier Nukleinsäuren stabil erhält, z.B. für zumindest 12h, bevorzugt zumindest 24h oder zumindest 36h, z.B. für bis zu 7d oder bis zu 5d.
Stand der Technik
Es ist bekannt, zur Präparation einer Fraktion kernhaltiger Zellen und von zellfreiem Plasma eine Probe aus Vollblut vorsichtig auf eine wässrige Zusammensetzung aus Ficoll (verzweigtes, hochmolekulares, hydrophiles Polysaccharid) und Diatrizoat (erhältlich unter der Bezeichnung Hypaque) zu schichten, die in einem Zentrifugenbecher vorgelegt ist, wobei die Zentrifugation zur Separation der kernlosen Erythrozyten in der unteren Phase mit Ficoll führt und sich darüber eine Schicht kernhaltiger Zellen, insbesondere mononukleärer Blutzellen, und sich als oberste Phase im wesentlichen zellfreies Plasma bildet.
Die WO 2013/123030 A2 beschreibt zur Stabilisierung von Vollblut für die spätere Analyse zellfreier DNA das Einmischen einer Formaldehyd freisetzenden Verbindung, insbesondere von Diazolidinyl-Harnstoff oder Imidazolidinyl-Harnstoff, in Kombination mit einem Fänger zur Entfernung freien Formaldehyds, z.B. von Aminosäuren, insbesondere Glycin, Alkylaminen, Polyaminen, jeweils in Verbindung mit EDTA als Antikoagulans. Die WO 2013/045458 beschreibt zur Stabilisierung von Vollblut eine Mischung aus Dihydroxyaceton als hypertonischen Zusatz, N,N-Dimethylformamid, N,N-Diethylformamid, N,N-Dimethylacetamid oder N,N-Diethylacetatmid als Stabilisierungsmittel für extrazelluläre Nukleinsäuren, bevorzugt mit einem Chelatbildner als Antikoagulans und einem Inhibitor der Apoptose, der insbesondere ein Caspase-Inhibitor ist.
Die Patentanmeldung WO 2019/025387 A1 , die nach §3 II PatG nur in Bezug auf die Neuheit relevant ist, beschreibt als Stabilisierungsmittel für die in einer biologischen Probe enthaltenen zellfreien Nukleinsäuren eine Zusammensetzung, die zumindest eine Puffersubstanz, die auf einen pH-Wert von 7 oder darunter puffert, zumindest einen Gerinnungshemmer, der bevorzugt ein Chelatbildner ist, und Urotropin, optional PEG, in wässriger Lösung aufweist oder daraus besteht.
Aufgabe der Erfindung
Der Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, eine alternative Vorrichtung und ein damit durchführbares Verfahren bereitzustellen, die zur Stabilisierung kernhaltiger Zellen und/oder von zellfreien Nukleinsäuren und zur einfachen Abtrennung kernloser Zellen, insbesondere aus Vollblut als Probe geeignet sind.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung löst die Aufgabe mit den Merkmalen der Ansprüche, insbesondere mit einem Verfahren zur Stabilisierung einer flüssigen biologischen Probe mit dem Schritt des Einziehens der Probe in ein erstes Ende einer Röhre, die ein voreingestelltes Vakuum aufweist und/oder an deren gegenüberliegendem zweiten Ende ein Kolben verschieblich an einer Kolbenstange geführt ist, und die Röhre als Füllung zumindest eine Stabilisierungszusammensetzung, die in Wasser und/oder in Blutserum löslich ist und eine wässrige Stabilisierungslösung bildet, und ein Gel enthält, optional zusätzlich eine schwere wässrige Komponente, oder die Füllung vor dem Einziehen der flüssigen Probe daraus besteht, bevorzugt ist die Probe eine Vollblutprobe. Weiter betrifft die Erfindung die Röhre, die diese Füllung aufweist, insbesondere zur Verwendung in dem Verfahren. Die Stabilisierungszusammensetzung kann als trockene Zusammensetzung in der Röhre enthalten sein, z.B. lose oder auf einem inerten Träger anhaftend. Eine an einem inerten Träger anhaftende Stabilisierungszusammensetzung kann als wässrige Lösung auf den Träger aufgesprüht und darauf aufgetrocknet sein. Ein inerter Träger kann von der Innenwand der Röhre und/oder von in der Röhre angeordneten Partikeln, z.B. Kunststoffkugeln, gebildet sein. Optional ist die Stabilisierungszusammensetzung als wässrige Stabilisierungslösung in der Röhre angeordnet. Vor dem Einziehen der Blutprobe, z.B. im Auslieferungszustand der Röhre, können die Stabilisierungslösung und das Gel teilweise oder vollständig in Mischung in der Röhre vorliegen. Vor Einziehen der Blutprobe bildet alternativ die Stabilisierungslösung einen ersten Abschnitt und das Gel bildet einen angrenzenden, vom ersten Abschnitt getrennten zweiten Abschnitt, wobei bevorzugt der erste Abschnitt am ersten Ende der Röhre angeordnet ist und der zweite Abschnitt am zweiten Ende der Röhre. Die optionale zusätzliche schwere wässrige Komponente kann vor Einziehen der Blutprobe mit der Stabilisierungszusammensetzung, trocken oder in Form der Stabilisierungslösung, und/oder dem Gel teilweise oder vollständig in Mischung vorliegen, alternativ kann die optionale zusätzliche schwere wässrige Komponente einen an den ersten Abschnitt der Stabilisierungslösung und/oder einen an den zweiten Abschnitt des Gels angrenzenden getrennten dritten Abschnitt bilden. In einer Ausführungsform weist die Füllung der Röhre vor dem Einfüllen der Probe eine Anordnung auf, die von ihrem ersten Ende zum zweiten Ende einen ersten Abschnitt, der eine Stabilisierungslösung aufweist, einen zweiten Abschnitt, der das Gel aufweist, und einen optionalen dritten Abschnitt, der eine schwere wässrige Komponente, die z.B. eine Zusammensetzung mit Ficoll ist, aufweist, wobei die Abschnitte aneinander angrenzen und getrennt sind. Die Anordnung bzw. die Füllung kann aus diesen geschichteten Abschnitten bestehen. Dabei sind aneinander angrenzende Abschnitte voneinander getrennt, dass sie separate Phasen bilden, die z.B. in ihrer Dichte, optischen Dichte und Zusammensetzung unterschiedlich sind.
Das Verfahren umfasst den anschließenden Schritt des Zentrifugierens der Röhre. Generell ist das Verfahren ein in vitro Verfahren. Das Einziehen der Probe in die Röhre durch deren erstes Ende erfolgt ex vivo. Dabei wird die Stabilisierungszusammensetzung, die z.B. den ersten Abschnitt bildet oder in Mischung mit dem Gel und der optionalen schweren wässrigen Komponente vorliegt, beim Einziehen der Probe mit dieser gemischt. Bei einer Stabilisierungszusammensetzung, die in trockener Form in der Röhre angeordnet ist, löst sich die Stabilisierungszusammensetzung beim Mischen in der Probe. Im Anschluß an das Einziehen der Probe wird die Röhre zentrifugiert, wobei bevorzugt das zweite Ende einer größeren Zentrifugalgeschwindigkeit ausgesetzt wird, als das erste Ende der Röhre. Optional erfolgt das Zentrifugieren nach einer Lagerung der Röhre von 1h bis 10d, bei einer Temperatur im Bereich von 5 bis 25 °C, nach Einziehen der Probe. Optional wird die Röhre unmittelbar nach dem Einziehen der Probe bewegt, z.B. einmaliges bis dreimaliges Invertieren, z.B. um die Querachse, um die Stabilisierungszusammensetzung, die in wässriger Lösung den ersten Abschnitt bilden kann, mit der eingezogenen Probe zu durchmischen, in Ausführungsformen, in denen das Gel und die optionale schwere wässrige Komponente getrennte Abschnitte bilden, bevorzugt mit Beibehalten der Schichtung des zweiten und dritten Abschnitts, bzw. ohne den zweiten Abschnitt und/oder den zweiten und den dritten Abschnitt vollständig aufzulösen bzw. ohne diese mit der gelösten Stabilisierungszusammensetzung zu mischen.
Das Zentrifugieren kann z.B. durch Zentrifugieren in einem Schwenkbecherrotor oder einem starren Rotor erfolgen, in dem die Röhre z.B. geneigt gehalten wird. So kann beim Schritt des Zentrifugierens das zweite Ende der Röhre einer größeren Zentrifugalkraft ausgesetzt werden, als deren erstes Ende. Die Dichteunterschied zwischen der mit der Stabilisierungszusammensetzung gemischten Probe, dem Gel und der optionalen schweren wässrigen Komponente führt zur schichtweisen Anordnung dieser, so dass bevorzugt die schichtweise Anordnung der Abschnitte beim Zentrifugieren erhalten bleibt bzw. erzeugt wird, und diese schichtweise Anordnung bevorzugt auch bei einer anschließenden Lagerung erhalten bleibt. Dabei sind nach dem Zentrifugieren in der Stabilisierungslösung freie Nukleinsäuren und in der Stabilisierungslösung z.B. dicht oberhalb des Gels und/oder in dem Abschnitt des Gels mononukleäre Zellen angeordnet und unterhalb des Gels und ggf. in dem Abschnitt der schweren wässrigen Komponente oder darunter sind Erythrozyten angeordnet.
Generell ist das Verfahren ein in vitro Verfahren und erfolgt z.B. ausschließlich außerhalb eines menschlichen oder tierischen Körpers. Die Probe kann optional unmittelbar aus einem menschlichen oder tierischen Körper entnommen sein und in die Röhre eingezogen werden.
Durch das Einziehen der Probe in die Röhre wird die Probe mit der Stabilisierungszusammensetzung bzw. dem ersten Abschnitt in Kontakt gebracht und damit gemischt. Das Einziehen der Probe erfolgt durch Ziehen des Kolbens an der Kolbenstange in Richtung auf das zweite Ende der Röhre und/oder durch die Wirkung eines Vakuums, das in der Röhre voreingestellt wurde, durch Öffnen der Röhre an ihrem ersten Ende.
Bevorzugt grenzen der erste Abschnitt, der zweite Abschnitt und der dritte Abschnitt unmittelbar aneinander an. Dabei sind die Abschnitte im Wesentlichen nicht miteinander gemischt, so dass z.B. der zweite Abschnitt eine Barriere zwischen dem dritten Abschnitt und dem ersten Abschnitt bildet. Bevorzugt ist das Gel nicht mit dem ersten Abschnitt und/oder nicht mit dem zweiten Abschnitt mischbar.
Optional können die in Wasser oder Probe gelöste Stabilisierungszusammensetzung, das Gel und optional die schwere wässrige Komponente nicht stabil homogen miteinander mischbar sein. Bevorzugt ist das Gel nicht stabil homogen mit der Stabilisierungslösung oder der schweren wässrigen Komponente mischbar, bzw. die gelöste Stabilisierungszusammensetzung ist nicht im Gel löslich und die schwere wässrige Komponente ist nicht im Gel löslich, optional können die gelöste Stabilisierungszusammensetzung und die schwere wässrige Komponente mischbar sein. Entsprechend ist generell bevorzugt, dass das Gel nicht wasserlöslich ist, oder dass das Gel mit Wasser oder mit der Probe keine homogene stabile Mischung bildet.
Generell wird die in Wasser oder in wässriger Probe gelöste Stabilisierungszusammensetzung auch als Stabilisierungslösung bezeichnet. Generell ist die Stabilisierungszusammensetzung eine für Konzentration und Unversehrtheit der in der Probe enthaltene freie Nukleinsäuren und Zellen, insbesondere stabilisiert die Stabilisierungszusammensetzung die Konzentration und Unversehrtheit freier Nukleinsäuren und verhindert eine Lyse von Zellen. Bevorzugt enthält die Stabilisierungszusammensetzung als Stabilisierungsmittel eine Verbindung, die in Lösung Formaldehyd freisetzt und die daher als Vorläuferverbindung für Formaldehyd oder als Formaldehyd freisetzende Verbindung bezeichnet werden kann.
Weiter optional kann die Stabilisierungslösung eine geringere Dichte als das Gel aufweisen und das Gel kann eine geringere Dichte als die schwere wässrige Komponente aufweisen. Auf diese Weise können die Stabilisierungslösung, das Gel und die schwere wässrige Komponente durch Zentrifugation in die schichtweise Anordnung gebracht werden, insbesondere nach Einziehen der Probe bzw. nach Mischen der Probe mit der Stabilisierungslösung.
Das Gel bildet mit Wasser und bevorzugt mit der Stabilisierungslösung keine stabile homogene Mischung. Entsprechend bilden das Gel und die Stabilisierungslösung, mit oder ohne Probe, separate Phasen. Auch die optionale schwere wässrige Komponente bildet eine vom Gel separate Phase.
Das Gel weist bevorzugt eine Dichte von 1,03 bis 1,09 und/oder eine Viskosität von 130 bis 320 Pas, bevorzugt 130 oder 140 Pas bis 220 Pas, z.B. von 150 bis 220 Pas oder 130 bis 170 Pas, die bevorzugt bei 25 ± 1 °C bei 0,5 Upm an einem Rotationsviskosimeter gemessen wird, oder 140-320 PaS, die z.B. mit einem Kegel-Platte-Viskosimeter (z.B. Viskosimeter vom EHD-Typ) bei variablen Scherraten, z.B. 0,5 Upm, bei 20 bis 25 °C gemessen wird, auf. Das Gel kann ein Polyestergel sein, z.B. Polyacrylatgel, polymerisiertes Silikonöl oder eine Mischung von zumindest zweien dieser.
Die schwere wässrige Komponente ist z.B. eine wässrige Zusammensetzung mit einem Saccharose-Epichlorhydrin-Copolymer, erhältlich als Ficoll oder Histopaque, Kieselgel, z.B. erhältlich als Percoll oder Sepracell, quervernetztem Dextran, z.B. erhältlich als Macrodex, oder Gelatine, auch als Plasmagel bezeichnet, oder einer Mischung aus zumindest zweien dieser. Die schwere wässrige Komponente kann generell einen Gehalt an Diatrizoat aufweisen, so dass ihre Dichte erhöht ist.
Da das Gel nicht mit der Stabilisierungslösung mischbar ist, bzw. das Gel keine stabile homogene Mischung mit der Stabilisierungslösung und der optionalen schweren wässrigen Komponente bildet, können diese im Auslieferungszustand in der Röhre ungeordnet, z.B. nicht in Schichten, enthalten sein und sich bereichsweise durchdringen. Denn der Schritt des Zentrifugierens der Röhre nach Einziehen der Probe führt zu einer Trennung der separaten Phasen, die das Gel einerseits und andererseits die Stabilisierungszusammensetzung in Mischung mit der Probe bilden, bzw. die einerseits das Gel und andererseits die optionale schwere wässrige Komponente, ggf. mit kernlosen Zellen versetzt, bilden.
Unmittelbar nach dem Einziehen der Blutprobe in die Röhre oder nach einer Lagerzeit im Anschluß an das Einziehen der Blutprobe in die Röhre folgt der Schritt des Zentrifugierens der Röhre. Nach dem Schritt des Zentrifugierens kann zumindest ein Anteil der leichten Fraktion und/oder optional ein Anteil einer in der leichten Fraktion ausgebildeten Zellschicht entnommen werden, z.B. unmittelbar nach dem Schritt des Zentrifugierens oder nachdem die Röhre im Anschluß an das Zentrifugieren gelagert wurde. Dabei kann die Röhre nach dem Einziehen der Blutprobe, vor oder nach dem Zentrifugieren, bevorzugt vertikal mit ihrem ersten Ende oberhalb des zweiten Endes, z.B. bei 0 bis 30 °C für 1h bis 14d stabil gelagert werden. Denn es hat sich gezeigt, dass die Stabilisierungszusammensetzung, die auch als wässrige Stabilisierungslösung vorgelegen haben kann, in Mischung mit der Probe, insbesondere Vollblut, zellfreie Nukleinsäuren und Zellen für diese Zeit stabil erhalten kann.
Das Entnehmen eines Anteils der leichten Fraktion und/oder einer darin ausgebildeten Zellschicht kann durch Einstechen einer Hohlnadel durch die Wand der Röhre oder durch einen Deckel, der das erste Ende der Röhre verschließt, erfolgen, oder nach Entfernen eines Deckels, der das erste Ende der Röhre verschließt.
Generell bevorzugt weist die Röhre am ersten Ende einen aufgeschraubten Deckel auf, der ein Ansatzstück für eine Hohlnadel aufweist, z.B. mit einem Bajonettanschluß. Das Ansatzstück ist bevorzugt mittels eines durchstechbaren Diaphragmas überdeckt, das durch eine Hohlnadel, die an dem Ansatzstück angeschlossen werden kann, durchstochen wird und sich nach Entfernung der Hohlnadel vom Ansatzstück selbsttätig verschließt.
Generell bevorzugt ist die Probe Vollblut, das z.B. unmittelbar nach der Entnahme aus einem menschlichen oder tierischen Körper in die Röhre eingezogen wird.
Die Stabilisierungszusammensetzung, bzw. die wässrige Stabilisierungslösung, enthält bevorzugt eine Vorläuferverbindung für Formaldehyd und kann insbesondere z.B.

a) Mercaptoethanol, Dithiotreitol (DTT), optional zusätzlich Glycin, ein Alkylamin und/oder Polyamin als Fänger für freies Formaldehyd, oder
b) Urotropin und zumindest eine Puffersubstanz, die auf eine pH-Wert von 7 oder darunter puffert, bevorzugt Urotropin und als Puffersubstanz Citrat,

Die Stabilisierungszusammensetzung für die in der biologischen Probe enthaltenen zellfreien Nukleinsäuren und/oder für die kernhaltigen Zellen kann eine Zusammensetzung sein, die zumindest eine Puffersubstanz, die auf einen pH-Wert von 7 oder darunter puffert, zumindest einen Gerinnungshemmer, der bevorzugt ein Chelatbildner ist, und Urotropin, optional PEG, z.B. in trockener Mischung oder in wässriger Lösung bzw. in Probe gelöst, aufweist oder daraus besteht. Die Stabilisierungszusammensetzung kann aus der zumindest einen Puffersubstanz, dem zumindest einen Gerinnungshemmer, der ein Chelatbildner ist, und Urotropin, optional PEG, in wässriger Lösung bestehen. Bevorzugt enthält diese Stabilisierungszusammensetzung keine Fängerverbindung für freies oder gelöstes Formaldehyd. Die Puffersubstanz kann die wässrige Lösung auf einen pH-Wert im Bereich von 3,5 bis 7 puffern und eine Pufferkapazität aufweisen, die einer Konzentration von 10 bis 100 mM Citrat entspricht, wobei in der Lösung 1 bis 30 Gew./Vol.-% Urotropin gelöst ist. Die zumindest eine Puffersubstanz und der zumindest eine Gerinnungshemmer, der ein Chelatbildner ist, können durch Citratpuffer gebildet sein. Die zumindest eine Puffersubstanz kann z.B. unter Citratpuffer, Acetatpuffer, MES (2-N-Morpholinoethanolsulfonsäure), PIPES (Piperazin-N,N'-bis-2-ethanosulfonsäure), MOPS (3-N-Morpholinopropansulfonsäure), Phosphatpuffer und Mischungen von zumindest zweien dieser ausgewählt sein und der zumindest eine Gerinnungshemmer, der ein Chelatbildner ist, kann unter Citrat und/oder EDTA und Mischungen dieser ausgewählt sein.
Die Stabilisierungslösung kann in der Röhre in einem volumetrischen Anteil von bis zu 20% an dem maximal einzuziehenden Probenvolumen, für die eine Röhre eingerichtet ist, in der Röhre enthalten sein.
Die schichtweise Anordnung des ersten, zweiten und dritten Abschnitts in der Röhre kann durch Einfüllen der schweren wässrigen Komponente angrenzend an den Kolben, anschließendes Einfüllen des Gels und anschließendes Einfüllen der Stabilisierungslösung hergestellt werden, wobei optional nach dem Einfüllen des Gels und vor dem Einfüllen der Stabilisierungslösung die Röhre zentrifugiert wird, um die Schichtung des dritten und zweiten Abschnitts zu erzeugen.
Alternativ oder zusätzlich kann die schichtweise Anordnung durch aufeinander folgendes oder gleichzeitiges Einfüllen der schweren wässrigen Komponente, des Gels und der Stabilisierungslösung in die Röhre und anschließendes Zentrifugieren der Röhre erzeugt werden. Dabei ist bevorzugt, dass die schwere wässrige Komponente, das Gel und die Stabilisierungslösung nicht miteinander mischbar sind.
Optional kann die schwere wässrige Komponente und/oder das Gel beim Einfüllen in die Röhre z.B. auf eine Temperatur von maximal 40 bis maximal 1°C oberhalb ihrer jeweiligen Erstarrungstemperatur temperiert sein.
Optional kann eine schichtweise Anordnung der schweren wässrigen Komponente, des Gels und der Stabilisierungslösung in der Röhre dadurch erzeugt werden, dass diese Zusammensetzung, das Gel und die Stabilisierungslösung nacheinander in die Röhre dosiert werden und nach dem Einfüllen von jeweils einer dieser Zusammensetzungen die Röhre auf eine Temperatur gekühlt wird, die bei oder unterhalb der Erstarrungstemperatur der jeweils eingefüllten Zusammensetzung liegt.
Generell ist bevorzugt, dass beim Einfüllen das zweite Ende der Röhre von dem Kolben in einer Stellung überdeckt ist, in der der Kolben in der Röhre in einem Abstand vom ersten Ende angeordnet ist, in dem der erste, zweite und dritte Abschnitt ohne das Probenvolumen die Röhre über diesen Abstand vollständig ausfüllen.
In dem Verfahren wird nach dem Schritt des Zentrifugierens zumindest ein Anteil der leichten Phase aus der Röhre entnommen wird und daraus kernhaltige Zellen und/oder zellfreie Nukleinsäuren werden analysiert.
Die Röhre ist zur Verwendung als Stabilisierungsvorrichtung in dem Verfahren geeignet und weist ein erstes Ende mit einer Einfüllöffnung und einen am gegenüberliegendem zweiten Ende verschieblich an einer Kolbenstange geführten Kolben auf, wobei die Röhre von ihrem ersten Ende zum zweiten Ende eine Anordnung mit einem ersten Abschnitt, der eine Stabilisierungslösung aufweist, einem zweiten Abschnitt, der ein Gel aufweist, und optional einen dritten Abschnitt, der eine schwere wässrige Komponente aufweist, enthält, wobei die Abschnitte aneinander angrenzen und voneinander getrennt sind. Dabei können in der Röhre der zweite Abschnitt und der dritte Abschnitt unmittelbar aneinander angrenzen. Gegenüber dem dritten Abschnitt kann der erste Abschnitt unmittelbar an den zweiten Abschnitt angrenzen.
Die Röhre ist eine Blutentnahmeröhre und kann optional in ihrem Innenvolumen ein voreingestelltes Vakuum aufweisen.
Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen mit Bezug auf die Figuren näher beschrieben, die schematisch in

- 1 eine Röhre zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren in einem Auslieferungszustand,
- 2 eine Röhre unmittelbar nach Einziehen einer Vollblutprobe und
- 3 eine Röhre nach dem Zentrifugieren

Die Figuren zeigen schematisch eine Röhre 1, die an ihrem ersten Ende 2 offen ist und ein Gewinde 3 für einen Deckel 4 aufweist. Ein Kolben 5 ist an einer Kolbenstange 6 längs der Röhre 1 verschieblich am zweiten Ende 7 der Röhre 1 geführt. Wie hier gezeigt ist, ist der Kolben 5 bevorzugt ein Hohlkolben, alternativ kann der Kolben ein Flachkolben sein oder eine in das Innenvolumen ragende Oberfläche aufweisen. Der Deckel 4 hat ein Ansatzstück 8 für eine Hohlnadel und ist von einem durchstechbaren Diaphragma 9 verschlossen.
Ein Auslieferungszustand ist der Röhre 1 ist in 1 gezeigt. Dabei ist die Stabilisierungslösung 10 angrenzend an das Gel 11 in der Röhre 1 enthalten, wobei die Stabilisierungslösung 10 angrenzend an das erste Ende 2 der Röhre 1 angeordnet ist, so dass eine am ersten Ende 2 durch das Ansatzstück 8 eingezogene Blutprobe unmittelbar mit der Stabilisierungslösung 10 vermischt werden kann. Da das Gel 11 generell keine stabile homogene Mischung mit Wasser oder der Stabilisierungslösung bildet, bilden die Stabilisierungslösung 10 und das Gel 11 getrennte Abschnitte. Bevorzugt ist das Innenvolumen der Röhre im Auslieferungszustand nicht vollständig von der Stabilisierungslösung 10 und dem Gel 11, optional der schweren wässrigen Komponente 12 ausgefüllt, bevorzugt ist ein Anteil des Innenvolumens von Gas gefüllt, das Luft oder Inertgas sein kann, optional bei einem Druck unter Umgebungsdruck, z.B. bei einem Druck von 325 bis 780 hPa, z.B. bei einem Umgebungsdruck von 976 hPa.
In den Figuren ist die Ausführungsform mit der optionalen schweren wässrigen Komponente 12 gezeigt, die generell bevorzugt mit dem Gel 11 keine stabile homogene Mischung bildet. Im Auslieferungszustand der Röhre 1 können die Stabilisierungslösung 10 und das Gel 11, sowie die optionale schwere wässrige Komponente 12 getrennte Abschnitte bilden, die sich jeweils als eine Schicht über den Querschnitt der Röhre 1 erstrecken. Dabei kann das Gel 11 und/oder die schwere wässrige Komponente 12 in der Ausnehmung des Kolbens 5 angeordnet sein, wenn dieser wie hier gezeigt als Hohlkolben ausgebildet ist.
In einer Ausführungsform können die Stabilisierungslösung 10 und das Gel 11, optional zusätzlich die schwere wässrige Komponente 12, nicht in schichtweiser Anordnung sondern ungeordnet in der Röhre enthalten sein.
Die 2 zeigt, dass im Verfahren eine flüssige biologische Probe, insbesondere Vollblut, in die erfindungsgemäße Röhre 1 eingezogen ist und sich sofort mit der Stabilisierungslösung 10 zur Mischung 13 vermischt. Alternativ kann die Stabilisierungszusammensetzung in trockener Form in der Röhre 1 angeordnet sein und sich in der Probe lösen, um die Mischung 13 zu bilden. Die Mischung 13 aus der Probe mit der Stabilisierungszusammensetzung bzw. der Stabilisierungslösung 10 bildet eine vom Gel 11 getrennte Phase, da das Gel 11 keine stabile homogene Mischung mit Wasser bzw. der Stabilisierungslösung 10 bildet. Das Gel 11 kann zumindest teilweise am Kolben 5 angeordnet bleiben, ebenso optional eine schwere wässrige Komponente 12. Generell bevorzugt weist das Gel 11 eine Viskosität im Bereich 140-320 PaS, gemessen mit einem Rotationsviskosimeter bei 0,5 Upm, 25 °C auf, oder mit einem (Typ EHD) Kegel-Platte-Viskosimeter gemessen. Dabei bildet das Gel 11 bevorzugt eine Schicht, die den Querschnitt der Röhre 1 auch während der Bewegung des Kolbens 5 in Richtung auf ihr zweites Ende 7 überdeckt und weiter bevorzugt eine optionale schwere wässrige Komponente 12 von der Mischung 13 trennt.
Die 3 zeigt die Röhre 1 nach Einziehen einer flüssigen biologischen Probe und Zentrifugation. Durch die Zentrifugation werden kernlose Zellen aus der Mischung 13 getrennt, so dass ein Rest der Mischung 13', der im Wesentlichen keine kernlosen Zellen enthält, eine leichte Phase oberhalb des Gels 11 bildet. Die Stabilisierungslösung 10 bewirkt eine Stabilisierung der freien Nukleinsäuren und der Zellen der Probe und das Gel 11 hält kernhaltige Zellen in dem Rest der Mischung 13', die die Stabilisierungslösung 10 enthält, zurück, so dass eine Schicht kernhaltiger Zellen 14 in dem Rest der Mischung 13' angrenzend an das Gel 11 gebildet wird. Diese Schicht kernhaltiger Zellen 14 enthält im Wesentlichen keine kernlosen Zellen, z.B. keine Erythrozyten bei einer Vollblutprobe, da sich diese auf der Seite des zweiten Endes 7 des Gels 11, bzw. unterhalb des Gels 11 finden und eine Phase kernloser Zellen 15 bilden, die eine höhere Dichte als der Teil der Mischung 13' bzw. als das Gel 11 aufweist.
In den 2 und 3 ist die Kolbenstange 6 vom Kolben 5 entfernt worden, so dass das zweite Ende 7 der Röhre 1 außen einen für die Zentrifugation geeigneten Boden bildet. Die Schicht kernhaltiger Zellen 14 und der oberhalb liegende leichtere Rest der Mischung 13' können separat aus der Röhre 1 entnommen werden, um anschließend getrennt analysiert zu werden.
Beispiel: Stabilisierung einer Vollblutprobe
In eine Röhre 1, in der eine Anordnung aus einem ersten Abschnitt aus Stabilisierungslösung 10 am ersten Ende 2 der Röhre 1 angrenzend an deren Einlassöffnung, eine daran angrenzende Schicht aus einem zweiten Abschnitt aus Gel 11 und daran gegenüber dem ersten Abschnitt angrenzend eine schwere wässrige Komponente 12, enthalten war, wurde ca. 5 mL Vollblut in das erste Ende der Röhre eingezogen. Dabei bestand die Stabilisierungslösung aus 20 mM Citronensäure (Monohydrat) und 27 mM Trinatriumcitrat (Dihydrat) in Wasser und 15 Gew./Vol.-% Urotropin. Das Gel bestand aus 2 g Gel mit einer Dichte von 1,077 g/ml und einer Viskosität von 140-320 PaS (gemessen bei 25°C mit einem Rotationsviskosimeter bei 0,5 Upm, alternativ mit einem Typ-EHD Kegel-Platte-Viskosimeter). Die schwere wässrige Komponente 12 bestand aus 1 mL Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, #10771). Die Röhre hatte unter Berücksichtigung der Stabilisierungslösung 10, des Gels 11 und der schweren wässrigen Komponente 12 sowie eines freien Kopfvolumens noch ein mögliches freies Innenvolumen zum Einziehen eines Probenvolumens von maximal 5 mL.
Die Röhre wurde nach Einziehen des Vollbluts durch dreimaliges Invertieren über ihre Längsachse gedreht, um das Blut mit der Stabilisierungslösung zu mischen und dann wurde die Röhre zentrifugiert, z.B. bei 4000 x g für 15 min. Bei der Zentrifugation war das zweite Ende in einem größeren Radius angeordnet als das erste Ende der Röhre. Anschließend wurde die zentrifugierte Röhre bei 22,5 °C gelagert. Während der Lagerung für bis zu 14d wurden Aliquots aus der leichten Phase 13' entnommen und aufgearbeitet und daraus zellfreie DNA isoliert und analysiert.
Aus der so erzeugten leichten Phase 13', die zellfreies Plasma in Mischung mit der Stabilisierungslösung enthielt, wurde mit dem NucleoSnap DNA Plasma Kit (erhältlich von Macherey-Nagel) zellfreie DNA isoliert. Es zeigte sich, dass die zellfreie DNA in der Mischung aus Vollblut und der Stabilisierungslösung 10 über eine Lagerdauer von zumindest 14 d bei 22,5 °C für die anschließende Analyse stabilisiert wird.
Die Zellen, die in der leichten Phase 13' oberhalb des Gels 11 eine Schicht 14 bilden, können aus der Röhre entnommen werden, sind stabilisiert und enthalten im Wesentlichen keine kernlosen Zellen.
Bezugszeichenliste

1: Röhre
2: erstes Ende der Röhre
3: Gewinde
4: Deckel
5: Kolben
6: Kolbenstange
7: zweites Ende der Röhre
8: Ansatzstück
9: Diaphragma
10: Stabilisierungslösung
11: Gel
12: schwere wässrige Komponente
13: Mischung aus Stabilisierungslösung und eingezogener Probe
13': Rest der Mischung aus Stabilisierungslösung und eingezogener Probe nach Zentrifugation
14: kernhaltige Zellen
15: kernlose Zellen

Claims

Verfahren zur Stabilisierung einer flüssigen biologischen Probe mit den Schritten des Einziehens der Probe in ein erstes Ende (2) einer Röhre (1) mit einem gegenüberliegendem zweiten Ende (7) , dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre (1) eine Stabilisierungszusammensetzung und ein Gel (11) enthält, das keine stabile homogene Mischung mit der gelösten Stabilisierungszusammensetzung (10) bildet, und durch den Schritt des anschließenden Zentrifugierens.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre (1) zusätzlich eine schwere wässrige Komponente (12) enthält, die keine stabile homogene Mischung mit dem Gel (11) bildet.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stabilisierungszusammensetzung eine Vorläuferverbindung für Formaldehyd enthält und in trockener Form oder in wässriger Lösung in der Röhre angeordnet ist.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass durch den Schritt des Zentrifugierens eine leichte Phase erzeugt wird, die stabilisierte zellfreie Nukleinsäuren enthält und angrenzend an das Gel (11) eine Schicht kernhaltiger Zellen (14), die im Wesentlichen keine kernlosen Zellen (15) enthält.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe durch Ziehen des Kolbens (5) in Richtung auf das zweite Ende (7) oder durch ein in der Röhre (1) voreingestelltes Vakuum eingezogen wird.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Einziehen der Probe die Röhre (1) von ihrem ersten Ende zum zweiten Ende eine Anordnung mit einem ersten Abschnitt, der die Stabilisierungslösung (10) aufweist, einem zweiten Abschnitt, der das Gel (11) aufweist, und optional einem dritten Abschnitt, der die schwere wässrige Komponente (12) aufweist, enthält, wobei die sich die Abschnitte über den Querschnitt der Röhre (1) erstrecken.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Abschnitt, der zweite Abschnitt und der optionale dritte Abschnitt unmittelbar aneinander angrenzen.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung (13, 13') der Stabilisierungszusammensetzung mit der Probe einerseits und andererseits das Gel (11) separate Phasen bilden.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre nach dem Schritt des Zentrifugierens für zumindest 12h bei 5°C bis 25°C gelagert wird.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre nach dem Schritt des Zentrifugierens für bis zu 5d bei 5°C bis 25°C gelagert wird.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Schritt des Zentrifugierens zumindest ein Anteil der leichten Phase aus der Röhre entnommen wird und daraus kernhaltige Zellen und/oder zellfreie Nukleinsäuren analysiert werden.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Vollblutprobe ist.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stabilisierungszusammensetzung a) Mercaptoethanol, Dithiotreitol (DTT), optional zusätzlich Glycin, ein Alkylamin und/oder Polyamin als Fänger für freies Formaldehyd oder b) Urotropin und zumindest eine Puffersubstanz, die auf eine pH-Wert von 7 oder darunter puffert, bevorzugt Urotropin und als Puffersubstanz Citrat, jeweils optional zusätzlich eine Puffersubstanz und/oder einen Gerinnungshemmer und/oder PEG, aufweist oder daraus besteht.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel (11) eine Viskosität von 150-320 Pas, bei 0,5 Upm an einem Rotationsviskosimeter bei 25±1 °C gemessen, oder 140-320 Pas, mit einem Kegel-Platte-Viskosimeter bei variablen Scherraten gemessen, aufweist.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel (11) ein Polyestergel, Polyacrylatgel, polymerisiertes Silikonöl oder eine Mischung von zumindest zweien dieser ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die schwere wässrige Komponente (12) eine wässrige Mischung mit Ficoll, Kieselgel, quervernetztem Dextran, Gelatine oder eine Mischung aus zumindest zweien dieser, optional jeweils zusätzlich Diatrizoat, aufweist oder daraus besteht.
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Ende der Röhre (1) durch den in der Röhre (1) angeordneten Kolben (5) gebildet wird und der Kolben (5) ein Hohlkolben ist.
Röhre zur Verwendung als Stabilisierungsvorrichtung, insbesondere in einem Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, die ein erstes Ende (2) mit einer Einfüllöffnung und einem gegenüberliegendem zweiten Ende (7) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre (1) eine Stabilisierungszusammensetzung und ein Gel (11) enthält, das keine stabile homogene Mischung mit der gelösten Stabilisierungszusammensetzung (10) bildet.
Röhre nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre (1) von ihrem ersten Ende (2) zum zweiten Ende (7) eine Anordnung mit einem ersten Abschnitt, der die Stabilisierungszusammensetzung aufweist, und einem zweiten Abschnitt enthält, der das Gel (11) aufweist.
Röhre nach einem der Ansprüche 18 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre (1) einem dritten Abschnitt, der eine schwere wässrige Komponente (12) aufweist, enthält, die keine stabile homogene Mischung mit dem Gel (11) bildet.
Röhre nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Stabilisierungszusammensetzung einerseits und andererseits das Gel (11) separate Phasen bilden.
Röhre nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die in Wasser oder Probe gelöste Stabilisierungszusammensetzung (10) eine geringere Dichte als das Gel (11) aufweist.
Röhre nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel (11) eine geringere Dichte als die schwere wässrige Komponente (12) aufweist.
Röhre nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel (11) ein Polyestergel, z.B. Polyacrylatgel, polymerisiertes Silikonöl oder eine Mischung von zumindest zweien dieser ist.
Röhre nach einem der Ansprüche 18 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Stabilisierungszusammensetzung eine Vorläuferverbindung für Formaldehyd enthält und in trockener Form oder in wässriger Lösung in der Röhre angeordnet ist, insbesondere a) Mercaptoethanol, Dithiotreitol (DTT), optional zusätzlich Glycin, ein Alkylamin und/oder Polyamin als Fänger für freies Formaldehyd oder b) Urotropin und zumindest eine Puffersubstanz, die auf eine pH-Wert von 7 oder darunter puffert, bevorzugt Urotropin und als Puffersubstanz Citrat, jeweils optional zusätzlich eine Puffersubstanz und/oder einen Gerinnungshemmer und/oder PEG, aufweist oder daraus besteht.
Röhre nach einem der Ansprüche 18 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen am zweiten Ende (7) verschieblich geführten Kolben (5) oder ein voreingestelltes Vakuum aufweist.