WO2020089461A1 - Blutentnahmeröhre und verfahren zur präparation - Google Patents

Blutentnahmeröhre und verfahren zur präparation Download PDF

Info

Publication number
WO2020089461A1
WO2020089461A1 PCT/EP2019/079985 EP2019079985W WO2020089461A1 WO 2020089461 A1 WO2020089461 A1 WO 2020089461A1 EP 2019079985 W EP2019079985 W EP 2019079985W WO 2020089461 A1 WO2020089461 A1 WO 2020089461A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
tube
gel
sample
stabilizing
section
Prior art date
Application number
PCT/EP2019/079985
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tim Kinitz
Original Assignee
Sarstedt Ag & Co. Kg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sarstedt Ag & Co. Kg filed Critical Sarstedt Ag & Co. Kg
Publication of WO2020089461A1 publication Critical patent/WO2020089461A1/de

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/15—Devices for taking samples of blood
    • A61B5/150007—Details
    • A61B5/150015—Source of blood
    • A61B5/15003—Source of blood for venous or arterial blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/15—Devices for taking samples of blood
    • A61B5/150007—Details
    • A61B5/150206—Construction or design features not otherwise provided for; manufacturing or production; packages; sterilisation of piercing element, piercing device or sampling device
    • A61B5/150236—Pistons, i.e. cylindrical bodies that sit inside the syringe barrel, typically with an air tight seal, and slide in the barrel to create a vacuum or to expel blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/15—Devices for taking samples of blood
    • A61B5/150007—Details
    • A61B5/150206—Construction or design features not otherwise provided for; manufacturing or production; packages; sterilisation of piercing element, piercing device or sampling device
    • A61B5/150244—Rods for actuating or driving the piston, i.e. the cylindrical body that sits inside the syringe barrel, typically with an air tight seal, and slides in the barrel to create a vacuum or to expel blood
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/15—Devices for taking samples of blood
    • A61B5/150007—Details
    • A61B5/150755—Blood sample preparation for further analysis, e.g. by separating blood components or by mixing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/15—Devices for taking samples of blood
    • A61B5/153—Devices specially adapted for taking samples of venous or arterial blood, e.g. with syringes

Definitions

  • the present invention relates to a tube used to stabilize a liquid biological sample, e.g. a whole blood sample, and for the preparation of cells, in particular nucleated cells, and / or of cell-free nucleic acids.
  • a liquid biological sample e.g. a whole blood sample
  • cells in particular nucleated cells, and / or of cell-free nucleic acids.
  • the invention further relates to the use of the tube as a stabilization device for a liquid biological sample and a method for stabilizing and preparing nucleated cells and / or cell-free nucleic acids from the sample.
  • the tube enables a method in which the sample, which is preferably whole blood, is drawn into the tube with only one centrifuge step into a fraction separated from the remaining volume, which contains a large part or all of the seedless cells, and a fraction which is in the Essentially cell-free liquid with cell-free contained therein
  • Nucleic acids and a layer of nucleated cells contained in this fraction is separated.
  • the stabilization and in particular the preparation of nucleated cells and / or of cell-free nucleic acids comprises the generation of a fraction, the nucleated cells and / or has cell-free nucleic acids or consists thereof, for example in plasma with whole blood as a sample, and which is preferably free of seedless cells.
  • the layer of the nucleated cells can contain mononuclear blood cells and free tumor cells as a sample.
  • the method and use of the tube after stabilization comprise analysis of the mixture of the sample and the stabilizing solution, preferably with the storage of the tube with the sample drawn therein following the drawing of the sample into the tube and / or before Taking the mixture of the sample with the
  • the device is therefore suitable for use in a method in which exactly one centrifugation step and in one tube, i.e. without taking a portion of the sample from the tube, the fraction is provided which contains stabilized nucleated cells and / or cell-free nucleic acids or, e.g. in plasma, consists of this, the fraction of seedless cells, in particular of erythrocytes in whole blood as a sample, being separated by a stable barrier.
  • the tube is suitable for being stored in the process after the sample has been filled in before and / or after the single centrifugation step, and the fraction of stabilized nucleated cells and / or stabilized cell-free ones
  • WO 2013/123030 A2 describes the stabilization of whole blood for the later analysis of cell-free DNA by mixing in a formaldehyde-releasing compound, in particular diazolidinyl urea or imidazolidinyl urea, in combination with a scavenger for the removal of free formaldehyde, for example of amino acids, in particular glycine,
  • Alkylamines, polyamines, each in combination with EDTA as an anticoagulant are provided.
  • WO 2013/045458 describes a mixture of to stabilize whole blood
  • Dihydroxyacetone as a hypertonic additive, N, N-dimethylformamide, N, N-diethylformamide, N, N-dimethylacetamide or N, N-diethylacetamide as a stabilizing agent for extracellular nucleic acids, preferably with a chelating agent as an anticoagulant and an inhibitor of apoptosis, which in particular is a caspase Inhibitor is.
  • Stabilizing agent for the cell-free nucleic acids contained in a biological sample a composition which has at least one buffer substance that buffers to a pH of 7 or below, at least one anticoagulant, which is preferably a chelating agent, and urotropin, optionally PEG, in aqueous solution or consists of it.
  • the object of the invention is therefore to provide an alternative device and a method which can be carried out with it, which are suitable as a sample for stabilizing nucleated cells and / or cell-free nucleic acids and for simple separation of nucleated cells, in particular from whole blood.
  • the invention solves the problem with the features of the claims, in particular with a method for stabilizing a liquid biological sample with the step of
  • Stabilizing composition which is soluble in water and / or in blood serum and forms an aqueous stabilizing solution and contains a gel, optionally additionally a heavy aqueous component, or the filling consists of it before the liquid sample is drawn in, preferably the sample is a whole blood sample.
  • the invention further relates to the tube having this filling, in particular for use in the method.
  • Stabilizing composition can be contained in the tube as a dry composition, for example loosely or adhering to an inert carrier.
  • One on an inert carrier adhering stabilizing composition can be sprayed onto the carrier as an aqueous solution and dried thereon.
  • An inert carrier can be formed by the inner wall of the tube and / or by particles arranged in the tube, for example plastic balls.
  • the stabilizing composition is optionally arranged in the tube as an aqueous stabilizing solution. Before the blood sample is drawn in, for example in the delivery state of the tube, the stabilizing solution and the gel can be partially or completely mixed in the tube. Alternatively, before drawing in the blood sample, the
  • Stabilizing solution a first section and the gel forms an adjacent second section separate from the first section, wherein the first section is preferably arranged at the first end of the tube and the second section at the second end of the tube.
  • the optional additional heavy aqueous component may be partially or completely mixed before the blood sample with the stabilizing composition, dry or in the form of the stabilizing solution and / or the gel, or alternatively the optional additional heavy aqueous component may be attached to the first section of the stabilizing solution and / or form a separate third section adjacent to the second section of the gel.
  • the filling of the tube before the filling of the sample has an arrangement which, from its first end to the second end, has a first section which has a stabilizing solution, a second
  • Section comprising the gel and an optional third section containing a heavy aqueous component e.g. is a composition with Ficoll, the sections adjoining each other and being separated.
  • a heavy aqueous component e.g. is a composition with Ficoll
  • the arrangement or the filling can consist of these layered sections.
  • the method includes the subsequent step of centrifuging the tube.
  • the process is an in vitro process.
  • the sample is drawn into the tube through its first end ex vivo.
  • the stabilizing composition e.g. forms the first section or is in a mixture with the gel and the optional heavy aqueous component, mixed with this when the sample is drawn in.
  • Stabilizing composition which is arranged in dry form in the tube, the stabilizing composition dissolves when mixed in the sample.
  • the tube is centrifuged, the second end preferably being subjected to a higher centrifugal speed than the first end of the tube.
  • Optional centrifugation is carried out after storage of the tube from 1h to 10d, at a
  • the tube is moved immediately after the sample is drawn in, preferably before the centrifugation step, e.g. one to three times inverting, e.g. around the transverse axis, around the
  • Stabilizing composition which can form the first section in aqueous solution to mix with the drawn sample, in embodiments in which the gel and the optional heavy aqueous component form separate sections, preferably with or without maintaining the layering of the second and third sections to completely dissolve the second section and / or the second and third section or without mixing them with the dissolved stabilizing composition.
  • the method preferably has exactly one single centrifugation step.
  • Centrifugation can e.g. by centrifugation in a swivel cup rotor or a rigid rotor in which the tube e.g. is held inclined.
  • the second end of the tube can be subjected to a greater centrifugal force than its first end. The density difference between that with the
  • Stabilizing composition mixed sample, the gel and the optional heavy aqueous component leads to the layered arrangement of these, so that the layered arrangement of the sections is preferably retained or generated during centrifugation, and this layered arrangement is preferably also retained during subsequent storage. After centrifugation there are free ones in the stabilizing solution
  • Nucleic acids and in the stabilizing solution e.g. Mononuclear cells are arranged just above the gel and / or in the section of the gel and erythrocytes are arranged below the gel and possibly in the section of the heavy aqueous component or below.
  • the process is an in vitro process and takes place e.g. only outside of a human or animal body.
  • the sample can optionally be taken directly from a human or animal body and drawn into the tube.
  • Stabilizing composition or the first section brought into contact and mixed with it The sample is drawn in by pulling the piston on the piston rod towards the second end of the tube and / or by the action of a vacuum that has been preset in the tube, by opening the tube at its first end.
  • the first section, the second section and the third section preferably adjoin one another directly.
  • the sections are essentially not mixed with one another, so that, for example, the second section forms a barrier between the third section and the first section.
  • the gel is preferably not miscible with the first section and / or with the second section.
  • the stabilizing composition dissolved in water or sample, the gel and optionally the heavy aqueous component may not be homogeneously miscible with one another.
  • the gel is preferably not stable, homogeneously miscible with the stabilizing solution or the heavy aqueous component, or the dissolved one
  • Stabilizing composition is not soluble in the gel and the heavy aqueous
  • Component is not soluble in the gel, optionally the dissolved one
  • Stabilizing composition and the heavy aqueous component to be miscible Accordingly, it is generally preferred that the gel is not water-soluble or that the gel does not form a homogeneous stable mixture with water or with the sample.
  • the stabilizing composition dissolved in water or in an aqueous sample is also referred to as a stabilizing solution.
  • the stabilizing composition is for the concentration and integrity of the free nucleic acids and cells contained in the sample, in particular the stabilizing composition stabilizes the concentration and integrity of free nucleic acids and prevents cell lysis.
  • the stabilizing composition preferably contains, as a stabilizing agent, a compound which releases lormaldehyde in solution and which can therefore be referred to as a precursor compound for lormaldehyde or as a lormaldehyde-releasing compound.
  • the stabilizing solution can have a lower density than the gel and the gel can have a lower density than the heavy aqueous component.
  • the stabilizing solution, the gel and the heavy aqueous component can be brought into the layered arrangement by centrifugation, in particular after the sample has been drawn in or after the sample has been mixed with the stabilizing solution.
  • the gel does not form a stable homogeneous mixture with water and preferably with the stabilizing solution. Accordingly, the gel and the stabilizing solution form with or without sample, separate phases.
  • the optional heavy aqueous component also forms a phase separate from the gel.
  • the gel preferably has a density of 1.03 to 1.09 and / or a viscosity of 130 to 320 Pas, preferably 130 or 140 Pas to 220 Pas, e.g. from 150 to 220 Pas or 130 to 170 Pas, which is preferably measured at 25 ⁇ 1 ° C at 0.5 rpm on a rotary viscometer, or 140-320 PaS, which e.g. with a cone-plate viscometer (e.g. viscometer of the EHD type) at variable shear rates, e.g. 0.5 rpm, measured at 20 to 25 ° C.
  • the gel can be a polyester gel, e.g. Polyacrylate gel, polymerized silicone oil or a mixture of at least two of these.
  • the heavy aqueous component is e.g. an aqueous composition with a sucrose-epichlorohydrin copolymer, available as Ficoll or Histopaque, silica gel, e.g. available as Percoll or Sepracell, cross-linked dextran, e.g. available as Macrodex, or gelatin, also known as plasma gel, or a mixture of at least two of these.
  • the heavy aqueous component can generally contain diatrizoate, so that its density is increased.
  • the gel is not miscible with the stabilizing solution or the gel does not form a stable, homogeneous mixture with the stabilizing solution and the optional heavy aqueous component, these can be disordered in the tube when delivered, e.g. not be contained in layers and penetrate each other in certain areas. Because the step of centrifuging the tube after pulling in the sample leads to a separation of the separate phases, which on the one hand form the gel and on the other hand the stabilizing composition in a mixture with the sample, or on the one hand the gel and on the other hand the optional heavy aqueous component, possibly seeded with seedless cells.
  • the step of centrifuging the tube follows immediately after the blood sample is drawn into the tube or after a storage period following the drawing of the blood sample into the tube.
  • the centrifugation step at least a portion of the light fraction and / or optionally a portion of a cell layer formed in the light fraction can be removed, for example immediately after the centrifugation step or after the tube has been stored following centrifugation.
  • the tube can be drawn in after the blood sample is drawn in, before or after centrifuging, preferably vertically with it the first end above the second end, for example at 0 to 30 ° C for 1h to 14d stable. This is because it has been shown that the stabilizing composition, which may also have been present as an aqueous stabilizing solution, in a mixture with the sample, in particular whole blood, can stably maintain cell-free nucleic acids and cells for this time.
  • a portion of the light fraction and / or a cell layer formed therein can be removed by inserting a hollow needle through the wall of the tube or through a cover which closes the first end of the tube, or after removing a cover which the first end of the Tube closes.
  • the tube preferably has a screwed-on cover at the first end, which has an attachment piece for a hollow needle, e.g. with a bayonet connection.
  • the extension piece is preferably covered by a pierceable diaphragm which is covered by a
  • Hollow needle which can be connected to the attachment piece, is pierced and closes automatically after removal of the hollow needle from the attachment piece.
  • sample whole blood e.g. is drawn into the tube immediately after removal from a human or animal body.
  • the stabilizing composition or the aqueous stabilizing solution preferably contains a precursor compound for formaldehyde and can in particular e.g.
  • mercaptoethanol dithiotreitol (DTT)
  • DTT dithiotreitol
  • glycine an alkylamine and / or polyamine as scavenger for free formaldehyde
  • urotropin and at least one buffer substance that buffers to a pH of 7 or below, preferably urotropin and as Buffer substance citrate, each optionally additionally a buffer substance and / or an anticoagulant, which can be a chelating agent for divalent cations, in particular EDTA and / or citrate, optionally PEG,
  • the stabilizing composition for the cell-free nucleic acids contained in the biological sample and / or for the nucleated cells can be a composition which contains at least one buffer substance which buffers to a pH of 7 or below, at least one anticoagulant, which is preferably a chelating agent. and urotropin, optional PEG, For example, dissolved in a dry mixture or in aqueous solution or in a sample, or has or consists thereof.
  • the stabilizing composition can consist of at least one
  • Buffer substance the at least one anticoagulant, which is a chelating agent, and urotropin, optionally PEG, in aqueous solution.
  • This preferably contains
  • the buffer substance can buffer the aqueous solution to a pH in the range from 3.5 to 7 and have a buffer capacity which corresponds to a concentration of 10 to 100 mM citrate, 1 to 30 gcw./vol.-% in the solution. Urotropin is dissolved.
  • the at least one buffer substance and the at least one anticoagulant, which is a chelating agent can be formed by citrate buffers.
  • the at least one buffer substance can e.g. citrate buffer, acetate buffer, MES (2-N-morpholinoethanolsulfonic acid), PIPES (piperazine-N, N'-bis-2-ethanosulfonic acid), MOPS (3-N-morpholinopropanesulfonic acid), phosphate buffer and mixtures of at least two of these and the at least one anticoagulant that is a chelating agent can be selected from citrate and / or EDTA and mixtures thereof.
  • the stabilizing solution can be contained in the tube in a volumetric proportion of up to 20% of the maximum sample volume to be drawn in for which a tube is set up.
  • the layered arrangement of the first, second and third sections in the tube can be produced by filling the heavy aqueous component adjacent to the flask, then filling the gel and then filling the stabilizing solution, optionally after filling the gel and before filling the stabilizing solution the tube is centrifuged to create the stratification of the third and second sections.
  • the layered arrangement can be produced by successively or simultaneously pouring the heavy aqueous component, the gel and the stabilizing solution into the tube and then centrifuging the tube. It is preferred that the heavy aqueous component, the gel and the stabilizing solution are not miscible with one another.
  • the heavy aqueous component and / or the gel can be tempered when filling the tube, for example, to a temperature of a maximum of 40 to a maximum of 1 ° C. above its respective setting temperature.
  • a layered arrangement of the heavy aqueous component, the gel and the stabilizing solution in the tube can be created by this
  • compositions, the gel and the stabilizing solution are successively metered into the tube and after filling each of these compositions, the tube is cooled to a temperature which is at or below the solidification temperature of the respectively filled composition.
  • the method after the centrifugation step, at least a portion of the light phase is removed from the tube and nucleated cells and / or cell-free nucleic acids are analyzed therefrom.
  • the tube is suitable for use as a stabilization device in the method and has a first end with a filling opening and a piston which is displaceably guided on a piston rod at the opposite second end, the tube having an arrangement with a first section from its first end to the second end, the one
  • Stabilizing solution has, a second section, which has a gel, and optionally a third section, which has a heavy aqueous component, wherein the sections adjoin and are separated from each other.
  • the second section and the third section can directly adjoin each other in the tube.
  • the first section can directly adjoin the second section.
  • the tube is a blood collection tube and can optionally have a preset vacuum in its internal volume.
  • FIG. 1 shows a tube for use in the method according to the invention in a delivery state
  • Figure 2 shows a tube immediately after taking a whole blood sample
  • Figure 3 shows a tube after centrifugation
  • the figures schematically show a tube 1, which is open at its first end 2 and has a thread 3 for a cover 4.
  • a piston 5 is slidably guided on a piston rod 6 along the tube 1 at the second end 7 of the tube 1.
  • the piston 5 is preferably a hollow piston, alternatively the piston can be a flat piston or have a surface projecting into the internal volume.
  • the cover 4 has an extension 8 for a hollow needle and is closed by a pierceable diaphragm 9.
  • FIG. 1 A delivery state of the tube 1 is shown in FIG. 1. Here is the
  • Stabilizing solution 10 adjacent to the gel 11 contained in the tube 1, wherein the stabilizing solution 10 is arranged adjacent to the first end 2 of the tube 1, so that a blood sample drawn through the attachment 8 at the first end 2 can be mixed directly with the stabilizing solution 10 . Since the gel 11 generally does not form a stable homogeneous mixture with water or the stabilizing solution, the
  • Stabilizing solution 10 and the gel 11 separate sections. This is preferred
  • gas which can be air or inert gas, optionally at a pressure below ambient pressure, e.g. at a pressure of 325 to 780 hPa, e.g. at an ambient pressure of 976 hPa.
  • the embodiment with the optional heavy aqueous component 12 is shown, which generally preferably does not form a stable homogeneous mixture with the gel 11.
  • the stabilizing solution 10 and the gel 11, as well as the optional heavy aqueous component 12 can form separate sections, each of which extends as a layer over the cross section of the tube 1.
  • the gel 11 and / or the heavy aqueous component 12 can be arranged in the recess of the piston 5 if the latter is designed as a hollow piston as shown here.
  • the stabilizing solution 10 and the gel 11, optionally additionally the heavy aqueous component 12, can be contained in the tube not in a layered arrangement but in a disordered manner.
  • FIG. 2 shows that in the method a liquid biological sample, in particular whole blood, is drawn into the tube 1 according to the invention and mixes immediately with the stabilizing solution 10 to form a mixture 13.
  • the stabilizing composition can be placed in a dry form in the tube 1 and dissolve in the sample to form the mixture 13.
  • the mixture 13 from the sample with the stabilizing composition or the stabilizing solution 10 forms a phase separate from the gel 11, since the gel 11 does not form a stable homogeneous mixture with water or the stabilizing solution 10.
  • the gel 11 can remain at least partially arranged on the piston 5, likewise optionally a heavy aqueous component 12.
  • the gel 11 preferably has a viscosity in the range 140-320 PaS, measured with a rotary viscometer at 0.5 rpm, 25 ° C. or measured with a (type EHD) cone-plate viscometer.
  • the gel 11 preferably forms a layer which also covers the cross section of the tube 1 during the movement of the piston 5 towards its second end 7 and more preferably separates an optional heavy aqueous component 12 from the mixture 13.
  • FIG. 3 shows the tube 1 after drawing in a liquid biological sample
  • the centrifugation separates seedless cells from the mixture 13, so that a remainder of the mixture 13 ′, which essentially does not contain any seedless cells, forms a light phase above the gel 11.
  • the stabilizing solution 10 stabilizes the free nucleic acids and the cells of the sample and the gel 11 retains nucleated cells in the rest of the mixture 13 'containing the stabilizing solution 10, so that a layer of nucleated cells 14 in the rest of the mixture 13 'is formed adjacent to the gel 11.
  • This layer of nucleated cells 14 essentially contains no nucleated cells, for example no erythrocytes in a whole blood sample, since these are located on the side of the second end 7 of the gel 11 or below the gel 11 and form a phase of nucleated cells 15 which form a higher density than the part of the mixture 13 'or than the gel 11.
  • the piston rod 6 has been removed from the piston 5, so that the second end 7 of the tube 1 forms a base suitable for centrifugation on the outside.
  • the layer of nucleated cells 14 and the lighter remainder of the mixture 13 'lying above can be removed separately from the tube 1 in order to subsequently be analyzed separately.
  • Stabilizing solution of 20 mM citric acid (monohydrate) and 27 mM trisodium citrate (dihydrate) in water and 15 gcw./Vol.-% urotropin.
  • the gel consisted of 2 g of gel with a density of 1.077 g / ml and a viscosity of 140-320 PaS (measured at 25 ° C. with a rotary viscometer at 0.5 rpm, alternatively with a type EHD cone-plate viscometer) .
  • the heavy aqueous component 12 consisted of 1 mL Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich, # 10771). The tube had the stabilizing solution 10, the gel 11 and the heavy aqueous component 12 in mind, as well as a free one
  • Head volume still a possible free interior volume for pulling in a
  • the tube was rotated by inverting three times along its longitudinal axis to mix the blood with the stabilizing solution, and then the tube was centrifuged, e.g. at 4000 x g for 15 min. In the centrifugation, the second end was arranged in a larger radius than the first end of the tube. The centrifuged tube was then stored at 22.5 ° C. During storage for up to 14d, aliquots from the light phase 13 'were removed and processed and cell-free DNA was isolated and analyzed therefrom.
  • cell-free DNA was isolated using the NucleoSnap DNA Plasma Kit (available from Macherey-Nagel). It was shown that the cell-free DNA in the Mixture of whole blood and the stabilizing solution 10 is stabilized over a storage period of at least 14 d at 22.5 ° C. for the subsequent analysis.
  • the cells which form a layer 14 in the light phase 13 'above the gel 11 can be removed from the tube, are stabilized and contain essentially no seedless cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Surgery (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Manufacturing & Machinery (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Stabilisierung einer flüssigen biologischen Probe mit dem Schritt des Einziehens der Probe in ein erstes Ende einer Röhre, die ein voreingestelltes Vakuum aufweist und/oder an deren gegenüberliegendem zweiten Ende ein Kolben verschieblich an einer Kolbenstange geführt ist, und die Röhre als Füllung zumindest eine Stabilisierungszusammensetzung, die in Wasser und/oder in Blutserum löslich ist und eine wässrige Stabilisierungslösung bildet, und ein Gel enthält, optional zusätzlich eine schwere wässrige Komponente, mit dem Schritt des anschließenden Zentrifugierens.

Description

Blutentnahmeröhre und Verfahren zur Präparation
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Röhre, die zur Stabilisierung einer flüssigen biologischen Probe, z.B. einer Vollblutprobe, und zur Präparation von Zellen, insbesondere kernhaltigen Zellen, und/oder von zellfreien Nukleinsäuren eingerichtet ist.
Weiter betrifft die Erfindung die Verwendung der Röhre als Stabilisierungsvorrichtung für eine flüssige biologische Probe und ein Verfahren zur Stabilisierung und Präparation von kernhaltigen Zellen und/oder von zellfreien Nukleinsäuren aus der Probe.
Die Röhre ermöglicht ein Verfahren, bei dem die Probe, die bevorzugt Vollblut ist, nach dem Einziehen in die Röhre mit nur einem Zentrifügationsschritt in eine vom restlichen Volumen abgetrennte Fraktion, die einen Großteil der oder alle kernlosen Zellen enthält, und eine Fraktion, die im Wesentlichen zellfreie Flüssigkeit mit darin enthaltenen zellfreien
Nukleinsäuren und eine in dieser Fraktion enthaltene Schicht kernhaltiger Zellen aufgetrennt wird. Die Stabilisierung und insbesondere die Präparation von kernhaltigen Zellen und/oder von zellfreien Nukleinsäuren umfasst die Erzeugung einer Fraktion, die kernhaltige Zellen und/oder zellfreie Nukleinsäuren aufweist oder daraus besteht, z.B. in Plasma bei Vollblut als Probe, und die bevorzugt frei von kernlosen Zellen ist. Die Schicht der kernhaltigen Zellen kann z.B. bei Vollblut als Probe mononukleäre Blutzellen und freie Tumorzellen enthalten.
Das Verfahren und die Verwendung der Röhre umfassen im Anschluß an die Stabilisierung die Analyse der Mischung aus der Probe und der Stabilisierungslösung, bevorzugt mit der Fagerung der Röhre mit der darin eingezogenen Probe im Anschluß an das Einziehen der Probe in die Röhre und/oder vor der Entnahme der Mischung der Probe mit der
Stabilisierungslösung aus der Röhre.
Die Vorrichtung ist daher zur Verwendung in einem Verfahren geeignet, bei dem mit genau einem Zentrifugationsschritt und in der einen Röhre, d.h. ohne Entnehmen eines Teils der Probe aus der Röhre, die Fraktion bereitgestellt wird, die stabilisierte kernhaltige Zellen und/oder zellfreie Nukleinsäuren enthält oder, z.B. in Plasma, daraus besteht, wobei die Fraktion von kernlosen Zellen, insbesondere von Erythrozyten bei Vollblut als Probe, durch eine stabile Barriere abgetrennt ist. Die Röhre ist geeignet, dass sie im Verfahren nach dem Einfüllen der Probe vor und/oder nach dem einzigen Zentrifügationsschritt gelagert wird und dabei die Fraktion stabilisierter kernhaltiger Zellen und/oder stabilisierter zellfreier
Nukleinsäuren stabil erhält, z.B. für zumindest l2h, bevorzugt zumindest 24h oder zumindest 36h, z.B. für bis zu 7d oder bis zu 5d.
Stand der Technik
Es ist bekannt, zur Präparation einer Fraktion kernhaltiger Zellen und von zellfreiem Plasma eine Probe aus Vollblut vorsichtig auf eine wässrige Zusammensetzung aus Ficoll
(verzweigtes, hochmolekulares, hydrophiles Polysaccharid) und Diatrizoat (erhältlich unter der Bezeichnung Hypaque) zu schichten, die in einem Zentrifugenbecher vorgelegt ist, wobei die Zentrifugation zur Separation der kernlosen Erythrozyten in der unteren Phase mit Ficoll führt und sich darüber eine Schicht kernhaltiger Zellen, insbesondere mononukleärer Blutzellen, und sich als oberste Phase im wesentlichen zellfreies Plasma bildet.
Die WO 2013/123030 A2 beschreibt zur Stabilisierung von Vollblut für die spätere Analyse zellfreier DNA das Einmischen einer Formaldehyd ff eisetzenden Verbindung, insbesondere von Diazolidinyl-Hamstoff oder Imidazolidinyl-Hamstoff, in Kombination mit einem Fänger zur Entfernung freien Formaldehyds, z.B. von Aminosäuren, insbesondere Glycin,
Alkylaminen, Polyaminen, jeweils in Verbindung mit EDTA als Antikoagulans.
Die WO 2013/045458 beschreibt zur Stabilisierung von Vollblut eine Mischung aus
Dihydroxyaceton als hypertonischen Zusatz, N,N-Dimethylformamid, N,N-Diethylformamid, N,N-Dimethylacetamid oder N,N-Diethylacetatmid als Stabilisierungsmittel für extrazelluläre Nukleinsäuren, bevorzugt mit einem Chelatbildner als Antikoagulans und einem Inhibitor der Apoptose, der insbesondere ein Caspase-Inhibitor ist.
Die WO 2019/025387 Al, die erst nach dem Anmeldetag der prioritätsbegründenden
Anmeldung der vorliegenden Anmeldung veröffentlicht wurde, beschreibt als
Stabilisierungsmittel für die in einer biologischen Probe enthaltenen zellfreien Nukleinsäuren eine Zusammensetzung, die zumindest eine Puffersubstanz, die auf einen pH-Wert von 7 oder darunter puffert, zumindest einen Gerinnungshemmer, der bevorzugt ein Chelatbildner ist, und Urotropin, optional PEG, in wässriger Lösung aufweist oder daraus besteht.
Aufgabe der Erfindung
Der Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, eine alternative Vorrichtung und ein damit durchführbares Verfahren bereitzustellen, die zur Stabilisierung kernhaltiger Zellen und/oder von zellfreien Nukleinsäuren und zur einfachen Abtrennung kernloser Zellen, insbesondere aus Vollblut als Probe geeignet sind.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung löst die Aufgabe mit den Merkmalen der Ansprüche, insbesondere mit einem Verfahren zur Stabilisierung einer flüssigen biologischen Probe mit dem Schritt des
Einziehens der Probe in ein erstes Ende einer Röhre, die ein voreingestelltes Vakuum aufweist und/oder an deren gegenüberliegendem zweiten Ende ein Kolben verschieblich an einer Kolbenstange geführt ist, und die Röhre als Füllung zumindest eine
Stabilisierungszusammensetzung, die in Wasser und/oder in Blutserum löslich ist und eine wässrige Stabilisierungslösung bildet, und ein Gel enthält, optional zusätzlich eine schwere wässrige Komponente, oder die Füllung vor dem Einziehen der flüssigen Probe daraus besteht, bevorzugt ist die Probe eine Vollblutprobe. Weiter betrifft die Erfindung die Röhre, die diese Füllung aufweist, insbesondere zur Verwendung in dem Verfahren. Die
Stabilisierungszusammensetzung kann als trockene Zusammensetzung in der Röhre enthalten sein, z.B. lose oder auf einem inerten Träger anhaftend. Eine an einem inerten Träger anhaftende Stabilisierungszusammensetzung kann als wässrige Lösung auf den Träger aufgesprüht und darauf aufgetrocknet sein. Ein inerter Träger kann von der Innenwand der Röhre und/oder von in der Röhre angeordneten Partikeln, z.B. Kunststoffkugeln, gebildet sein. Optional ist die Stabilisierungszusammensetzung als wässrige Stabilisierungslösung in der Röhre angeordnet. Vor dem Einziehen der Blutprobe, z.B. im Auslieferungszustand der Röhre, können die Stabilisierungslösung und das Gel teilweise oder vollständig in Mischung in der Röhre vorliegen. Vor Einziehen der Blutprobe bildet alternativ die
Stabilisierungslösung einen ersten Abschnitt und das Gel bildet einen angrenzenden, vom ersten Abschnitt getrennten zweiten Abschnitt, wobei bevorzugt der erste Abschnitt am ersten Ende der Röhre angeordnet ist und der zweite Abschnitt am zweiten Ende der Röhre. Die optionale zusätzliche schwere wässrige Komponente kann vor Einziehen der Blutprobe mit der Stabilisierungszusammensetzung, trocken oder in Form der Stabilisierungslösung, und/oder dem Gel teilweise oder vollständig in Mischung vorliegen, alternativ kann die optionale zusätzliche schwere wässrige Komponente einen an den ersten Abschnitt der Stabilisierungslösung und/oder einen an den zweiten Abschnitt des Gels angrenzenden getrennten dritten Abschnitt bilden. In einer Ausführungsform weist die Füllung der Röhre vor dem Einfüllen der Probe eine Anordnung auf, die von ihrem ersten Ende zum zweiten Ende einen ersten Abschnitt, der eine Stabilisierungslösung aufweist, einen zweiten
Abschnitt, der das Gel aufweist, und einen optionalen dritten Abschnitt, der eine schwere wässrige Komponente, die z.B. eine Zusammensetzung mit Ficoll ist, aufweist, wobei die Abschnitte aneinander angrenzen und getrennt sind. Die Anordnung bzw. die Füllung kann aus diesen geschichteten Abschnitten bestehen. Dabei sind aneinander angrenzende
Abschnitte voneinander getrennt, dass sie separate Phasen bilden, die z.B. in ihrer Dichte, optischen Dichte und Zusammensetzung unterschiedlich sind.
Das Verfahren umfasst den anschließenden Schritt des Zentrifugierens der Röhre. Generell ist das Verfahren ein in vitro Verfahren. Das Einziehen der Probe in die Röhre durch deren erstes Ende erfolgt ex vivo. Dabei wird die Stabilisierungszusammensetzung, die z.B. den ersten Abschnitt bildet oder in Mischung mit dem Gel und der optionalen schweren wässrigen Komponente vorliegt, beim Einziehen der Probe mit dieser gemischt. Bei einer
Stabilisierungszusammensetzung, die in trockener Form in der Röhre angeordnet ist, löst sich die Stabilisierungszusammensetzung beim Mischen in der Probe. Im Anschluß an das Einziehen der Probe wird die Röhre zentrifugiert, wobei bevorzugt das zweite Ende einer größeren Zentrifugalgeschwindigkeit ausgesetzt wird, als das erste Ende der Röhre. Optional erfolgt das Zentrifugieren nach einer Lagerung der Röhre von lh bis lOd, bei einer
Temperatur im Bereich von 5 bis 25 °C, nach Einziehen der Probe. Optional wird die Röhre unmittelbar nach dem Einziehen der Probe, bevorzugt vor dem Schritt des Zentrifugierens, bewegt, z.B. einmaliges bis dreimaliges Invertieren, z.B. um die Querachse, um die
Stabilisierungszusammensetzung, die in wässriger Lösung den ersten Abschnitt bilden kann, mit der eingezogenen Probe zu durchmischen, in Ausführungsformen, in denen das Gel und die optionale schwere wässrige Komponente getrennte Abschnitte bilden, bevorzugt mit Beibehalten der Schichtung des zweiten und dritten Abschnitts, bzw. ohne den zweiten Abschnitt und/oder den zweiten und den dritten Abschnitt vollständig aufzulösen bzw. ohne diese mit der gelösten Stabilisierungszusammensetzung zu mischen. Bevorzugt weist das Verfahren genau einen einzigen Schritt des Zentrifugierens auf.
Das Zentrifugieren kann z.B. durch Zentrifugieren in einem Schwenkbecherrotor oder einem starren Rotor erfolgen, in dem die Röhre z.B. geneigt gehalten wird. So kann beim Schritt des Zentrifugierens das zweite Ende der Röhre einer größeren Zentrifugalkraft ausgesetzt werden, als deren erstes Ende. Die Dichteunterschied zwischen der mit der
Stabilisierungszusammensetzung gemischten Probe, dem Gel und der optionalen schweren wässrigen Komponente führt zur schichtweisen Anordnung dieser, so dass bevorzugt die schichtweise Anordnung der Abschnitte beim Zentrifugieren erhalten bleibt bzw. erzeugt wird, und diese schichtweise Anordnung bevorzugt auch bei einer anschließenden Lagerung erhalten bleibt. Dabei sind nach dem Zentrifugieren in der Stabilisierungslösung freie
Nukleinsäuren und in der Stabilisierungslösung z.B. dicht oberhalb des Gels und/oder in dem Abschnitt des Gels mononukleäre Zellen angeordnet und unterhalb des Gels und ggf. in dem Abschnitt der schweren wässrigen Komponente oder darunter sind Erythrozyten angeordnet.
Generell ist das Verfahren ein in vitro Verfahren und erfolgt z.B. ausschließlich außerhalb eines menschlichen oder tierischen Körpers. Die Probe kann optional unmittelbar aus einem menschlichen oder tierischen Körper entnommen sein und in die Röhre eingezogen werden.
Durch das Einziehen der Probe in die Röhre wird die Probe mit der
Stabilisierungszusammensetzung bzw. dem ersten Abschnitt in Kontakt gebracht und damit gemischt. Das Einziehen der Probe erfolgt durch Ziehen des Kolbens an der Kolbenstange in Richtung auf das zweite Ende der Röhre und/oder durch die Wirkung eines Vakuums, das in der Röhre voreingestellt wurde, durch Öffnen der Röhre an ihrem ersten Ende. Bevorzugt grenzen der erste Abschnitt, der zweite Abschnitt und der dritte Abschnitt unmittelbar aneinander an. Dabei sind die Abschnitte im Wesentlichen nicht miteinander gemischt, so dass z.B. der zweite Abschnitt eine Barriere zwischen dem dritten Abschnitt und dem ersten Abschnitt bildet. Bevorzugt ist das Gel nicht mit dem ersten Abschnitt und/oder nicht mit dem zweiten Abschnitt mischbar.
Optional können die in Wasser oder Probe gelöste Stabilisierungszusammensetzung, das Gel und optional die schwere wässrige Komponente nicht stabil homogen miteinander mischbar sein. Bevorzugt ist das Gel nicht stabil homogen mit der Stabilisierungslösung oder der schweren wässrigen Komponente mischbar, bzw. die gelöste
Stabilisierungszusammensetzung ist nicht im Gel löslich und die schwere wässrige
Komponente ist nicht im Gel löslich, optional können die gelöste
Stabilisierungszusammensetzung und die schwere wässrige Komponente mischbar sein. Entsprechend ist generell bevorzugt, dass das Gel nicht wasserlöslich ist, oder dass das Gel mit Wasser oder mit der Probe keine homogene stabile Mischung bildet.
Generell wird die in Wasser oder in wässriger Probe gelöste Stabilisierungszusammensetzung auch als Stabilisierungslösung bezeichnet. Generell ist die Stabilisierungszusammensetzung eine für Konzentration und Unversehrtheit der in der Probe enthaltene freie Nukleinsäuren und Zellen, insbesondere stabilisiert die Stabilisierungszusammensetzung die Konzentration und Unversehrtheit freier Nukleinsäuren und verhindert eine Lyse von Zellen. Bevorzugt enthält die Stabilisierungszusammensetzung als Stabilisierungsmittel eine Verbindung, die in Lösung Lormaldehyd freisetzt und die daher als Vorläuferverbindung für Lormaldehyd oder als Lormaldehyd freisetzende Verbindung bezeichnet werden kann.
Weiter optional kann die Stabilisierungslösung eine geringere Dichte als das Gel aufweisen und das Gel kann eine geringere Dichte als die schwere wässrige Komponente aufweisen. Auf diese Weise können die Stabilisierungslösung, das Gel und die schwere wässrige Komponente durch Zentrifugation in die schichtweise Anordnung gebracht werden, insbesondere nach Einziehen der Probe bzw. nach Mischen der Probe mit der Stabilisierungslösung.
Das Gel bildet mit Wasser und bevorzugt mit der Stabilisierungslösung keine stabile homogene Mischung. Entsprechend bilden das Gel und die Stabilisierungslösung, mit oder ohne Probe, separate Phasen. Auch die optionale schwere wässrige Komponente bildet eine vom Gel separate Phase.
Das Gel weist bevorzugt eine Dichte von 1,03 bis 1,09 und/oder eine Viskosität von 130 bis 320 Pas, bevorzugt 130 oder 140 Pas bis 220 Pas, z.B. von 150 bis 220 Pas oder 130 bis 170 Pas, die bevorzugt bei 25 ± 1 °C bei 0,5 Upm an einem Rotationsviskosimeter gemessen wird, oder 140-320 PaS, die z.B. mit einem Kegel-Platte-Viskosimeter (z.B. Viskosimeter vom EHD-Typ) bei variablen Scherraten, z.B. 0,5 Upm, bei 20 bis 25 °C gemessen wird, auf. Das Gel kann ein Polyestergel sein, z.B. Polyacrylatgel, polymerisiertes Silikonöl oder eine Mischung von zumindest zweien dieser.
Die schwere wässrige Komponente ist z.B. eine wässrige Zusammensetzung mit einem Saccharose-Epichlorhydrin-Copolymer, erhältlich als Ficoll oder Histopaque, Kieselgel, z.B. erhältlich als Percoll oder Sepracell, quervemetztem Dextran, z.B. erhältlich als Macrodex, oder Gelatine, auch als Plasmagel bezeichnet, oder einer Mischung aus zumindest zweien dieser. Die schwere wässrige Komponente kann generell einen Gehalt an Diatrizoat aufweisen, so dass ihre Dichte erhöht ist.
Da das Gel nicht mit der Stabilisierungslösung mischbar ist, bzw. das Gel keine stabile homogene Mischung mit der Stabilisierungslösung und der optionalen schweren wässrigen Komponente bildet, können diese im Auslieferungszustand in der Röhre ungeordnet, z.B. nicht in Schichten, enthalten sein und sich bereichsweise durchdringen. Denn der Schritt des Zentrifugierens der Röhre nach Einziehen der Probe fuhrt zu einer Trennung der separaten Phasen, die das Gel einerseits und andererseits die Stabilisierungszusammensetzung in Mischung mit der Probe bilden, bzw. die einerseits das Gel und andererseits die optionale schwere wässrige Komponente, ggf. mit kernlosen Zellen versetzt, bilden.
Unmittelbar nach dem Einziehen der Blutprobe in die Röhre oder nach einer Lagerzeit im Anschluß an das Einziehen der Blutprobe in die Röhre folgt der Schritt des Zentrifugierens der Röhre. Nach dem Schritt des Zentrifugierens kann zumindest ein Anteil der leichten Fraktion und/oder optional ein Anteil einer in der leichten Fraktion ausgebildeten Zellschicht entnommen werden, z.B. unmittelbar nach dem Schritt des Zentrifugierens oder nachdem die Röhre im Anschluß an das Zentrifugieren gelagert wurde. Dabei kann die Röhre nach dem Einziehen der Blutprobe, vor oder nach dem Zentrifugieren, bevorzugt vertikal mit ihrem ersten Ende oberhalb des zweiten Endes, z.B. bei 0 bis 30 °C für lh bis l4d stabil gelagert werden. Denn es hat sich gezeigt, dass die Stabilisierungszusammensetzung, die auch als wässrige Stabilisierungslösung Vorgelegen haben kann, in Mischung mit der Probe, insbesondere Vollblut, zellfreie Nukleinsäuren und Zellen für diese Zeit stabil erhalten kann.
Das Entnehmen eines Anteils der leichten Fraktion und/oder einer darin ausgebildeten Zellschicht kann durch Einstechen einer Hohlnadel durch die Wand der Röhre oder durch einen Deckel, der das erste Ende der Röhre verschließt, erfolgen, oder nach Entfernen eines Deckels, der das erste Ende der Röhre verschließt.
Generell bevorzugt weist die Röhre am ersten Ende einen aufgeschraubten Deckel auf, der ein Ansatzstück für eine Hohlnadel aufweist, z.B. mit einem Bajonettanschluß. Das Ansatzstück ist bevorzugt mittels eines durchstechbaren Diaphragmas überdeckt, das durch eine
Hohlnadel, die an dem Ansatzstück angeschlossen werden kann, durchstochen wird und sich nach Entfernung der Hohlnadel vom Ansatzstück selbsttätig verschließt.
Generell bevorzugt ist die Probe Vollblut, das z.B. unmittelbar nach der Entnahme aus einem menschlichen oder tierischen Körper in die Röhre eingezogen wird.
Die Stabilisierungszusammensetzung, bzw. die wässrige Stabilisierungslösung, enthält bevorzugt eine Vorläuferverbindung für Formaldehyd und kann insbesondere z.B.
a) Mercaptoethanol, Dithiotreitol (DTT), optional zusätzlich Glycin, ein Alkylamin und/oder Polyamin als Fänger für freies Formaldehyd, oder b) Urotropin und zumindest eine Puffersubstanz, die auf eine pH-Wert von 7 oder darunter puffert, bevorzugt Urotropin und als Puffersubstanz Citrat, jeweils optional zusätzlich eine Puffersubstanz und/oder einen Gerinnungshemmer, der ein Chelatbildner für zweiwertige Kationen sein kann, insbesondere EDTA und/oder Citrat, optional PEG,
aufweisen oder daraus bestehen.
Die Stabilisierungszusammensetzung für die in der biologischen Probe enthaltenen zellfreien Nukleinsäuren und/oder für die kernhaltigen Zellen kann eine Zusammensetzung sein, die zumindest eine Puffersubstanz, die auf einen pH-Wert von 7 oder darunter puffert, zumindest einen Gerinnungshemmer, der bevorzugt ein Chelatbildner ist, und Urotropin, optional PEG, z.B. in trockener Mischung oder in wässriger Lösung bzw. in Probe gelöst, aufweist oder daraus besteht. Die Stabilisierungszusammensetzung kann aus der zumindest einen
Puffersubstanz, dem zumindest einen Gerinnungshemmer, der ein Chelatbildner ist, und Urotropin, optional PEG, in wässriger Lösung bestehen. Bevorzugt enthält diese
Stabilisierungszusammensetzung keine Fängerverbindung für freies oder gelöstes
Formaldehyd. Die Puffersubstanz kann die wässrige Lösung auf einen pH-Wert im Bereich von 3,5 bis 7 puffern und eine Pufferkapazität aufweisen, die einer Konzentration von 10 bis 100 mM Citrat entspricht, wobei in der Lösung 1 bis 30 Gcw./Vol.-% Urotropin gelöst ist.
Die zumindest eine Puffersubstanz und der zumindest eine Gerinnungshemmer, der ein Chelatbildner ist, können durch Citratpuffer gebildet sein. Die zumindest eine Puffersubstanz kann z.B. unter Citratpuffer, Acetatpuffer, MES (2-N-Morpholinoethanolsulfonsäure), PIPES (Piperazin-N,N'-bis-2-ethanosulfonsäure), MOPS (3-N-Morpholinopropansulfonsäure), Phosphatpuffer und Mischungen von zumindest zweien dieser ausgewählt sein und der zumindest eine Gerinnungshemmer, der ein Chelatbildner ist, kann unter Citrat und/oder EDTA und Mischungen dieser ausgewählt sein.
Die Stabilisierungslösung kann in der Röhre in einem volumetrischen Anteil von bis zu 20% an dem maximal einzuziehenden Probenvolumen, für die eine Röhre eingerichtet ist, in der Röhre enthalten sein.
Die schichtweise Anordnung des ersten, zweiten und dritten Abschnitts in der Röhre kann durch Einfüllen der schweren wässrigen Komponente angrenzend an den Kolben, anschließendes Einfüllen des Gels und anschließendes Einfüllen der Stabilisierungslösung hergestellt werden, wobei optional nach dem Einfüllen des Gels und vor dem Einfüllen der Stabilisierungslösung die Röhre zentrifugiert wird, um die Schichtung des dritten und zweiten Abschnitts zu erzeugen.
Alternativ oder zusätzlich kann die schichtweise Anordnung durch aufeinander folgendes oder gleichzeitiges Einfüllen der schweren wässrigen Komponente, des Gels und der Stabilisierungslösung in die Röhre und anschließendes Zentrifugieren der Röhre erzeugt werden. Dabei ist bevorzugt, dass die schwere wässrige Komponente, das Gel und die Stabilisierungslösung nicht miteinander mischbar sind. Optional kann die schwere wässrige Komponente und/oder das Gel beim Einfüllen in die Röhre z.B. auf eine Temperatur von maximal 40 bis maximal l°C oberhalb ihrer jeweiligen Erstarrungstemperatur temperiert sein.
Optional kann eine schichtweise Anordnung der schweren wässrigen Komponente, des Gels und der Stabilisierungslösung in der Röhre dadurch erzeugt werden, dass diese
Zusammensetzung, das Gel und die Stabilisierungslösung nacheinander in die Röhre dosiert werden und nach dem Einfüllen von jeweils einer dieser Zusammensetzungen die Röhre auf eine Temperatur gekühlt wird, die bei oder unterhalb der Erstarrungstemperatur der jeweils eingefüllten Zusammensetzung liegt.
Generell ist bevorzugt, dass beim Einfüllen das zweite Ende der Röhre von dem Kolben in einer Stellung überdeckt ist, in der der Kolben in der Röhre in einem Abstand vom ersten Ende angeordnet ist, in dem der erste, zweite und dritte Abschnitt ohne das Probenvolumen die Röhre über diesen Abstand vollständig ausfüllen.
In dem Verfahren wird nach dem Schritt des Zentrifugierens zumindest ein Anteil der leichten Phase aus der Röhre entnommen wird und daraus kernhaltige Zellen und/oder zellfreie Nukleinsäuren werden analysiert.
Die Röhre ist zur Verwendung als Stabilisierungsvorrichtung in dem Verfahren geeignet und weist ein erstes Ende mit einer Einfüllöffnung und einen am gegenüberliegendem zweiten Ende verschieblich an einer Kolbenstange geführten Kolben auf, wobei die Röhre von ihrem ersten Ende zum zweiten Ende eine Anordnung mit einem ersten Abschnitt, der eine
Stabilisierungslösung aufweist, einem zweiten Abschnitt, der ein Gel aufweist, und optional einen dritten Abschnitt, der eine schwere wässrige Komponente aufweist, enthält, wobei die Abschnitte aneinander angrenzen und voneinander getrennt sind. Dabei können in der Röhre der zweite Abschnitt und der dritte Abschnitt unmittelbar aneinander angrenzen. Gegenüber dem dritten Abschnitt kann der erste Abschnitt unmittelbar an den zweiten Abschnitt angrenzen.
Die Röhre ist eine Blutentnahmeröhre und kann optional in ihrem Innenvolumen ein voreingestelltes Vakuum aufweisen. Die Erfindung wird nun anhand von Beispielen mit Bezug auf die Figuren näher beschrieben, die schematisch in
Figur 1 eine Röhre zur Verwendung in dem erfindungsgemäßen Verfahren in einem Auslieferungszustand,
Figur 2 eine Röhre unmittelbar nach Einziehen einer Vollblutprobe und
Figur 3 eine Röhre nach dem Zentrifugieren
zeigen.
Die Figuren zeigen schematisch eine Röhre 1 , die an ihrem ersten Ende 2 offen ist und ein Gewinde 3 für einen Deckel 4 aufweist. Ein Kolben 5 ist an einer Kolbenstange 6 längs der Röhre 1 verschieblich am zweiten Ende 7 der Röhre 1 geführt. Wie hier gezeigt ist, ist der Kolben 5 bevorzugt ein Hohlkolben, alternativ kann der Kolben ein Flachkolben sein oder eine in das Innenvolumen ragende Oberfläche aufweisen. Der Deckel 4 hat ein Ansatzstück 8 für eine Hohlnadel und ist von einem durchstechbaren Diaphragma 9 verschlossen.
Ein Auslieferungszustand ist der Röhre 1 ist in Figur 1 gezeigt. Dabei ist die
Stabilisierungslösung 10 angrenzend an das Gel 11 in der Röhre 1 enthalten, wobei die Stabilisierungslösung 10 angrenzend an das erste Ende 2 der Röhre 1 angeordnet ist, so dass eine am ersten Ende 2 durch das Ansatzstück 8 eingezogene Blutprobe unmittelbar mit der Stabilisierungslösung 10 vermischt werden kann. Da das Gel 11 generell keine stabile homogene Mischung mit Wasser oder der Stabilisierungslösung bildet, bilden die
Stabilisierungslösung 10 und das Gel 11 getrennte Abschnitte. Bevorzugt ist das
Innenvolumen der Röhre im Auslieferungszustand nicht vollständig von der
Stabilisierungslösung 10 und dem Gel 11, optional der schweren wässrigen Komponente 12 ausgefüllt, bevorzugt ist ein Anteil des Innenvolumens von Gas gefüllt, das Luft oder Inertgas sein kann, optional bei einem Druck unter Umgebungsdruck, z.B. bei einem Druck von 325 bis 780 hPa, z.B. bei einem Umgebungsdruck von 976 hPa.
In den Figuren ist die Ausführungsform mit der optionalen schweren wässrigen Komponente 12 gezeigt, die generell bevorzugt mit dem Gel 11 keine stabile homogene Mischung bildet. Im Auslieferungszustand der Röhre 1 können die Stabilisierungslösung 10 und das Gel 11, sowie die optionale schwere wässrige Komponente 12 getrennte Abschnitte bilden, die sich jeweils als eine Schicht über den Querschnitt der Röhre 1 erstrecken. Dabei kann das Gel 11 und/oder die schwere wässrige Komponente 12 in der Ausnehmung des Kolbens 5 angeordnet sein, wenn dieser wie hier gezeigt als Hohlkolben ausgebildet ist.
In einer Ausführungsform können die Stabilisierungslösung 10 und das Gel 11, optional zusätzlich die schwere wässrige Komponente 12, nicht in schichtweiser Anordnung sondern ungeordnet in der Röhre enthalten sein.
Die Figur 2 zeigt, dass im Verfahren eine flüssige biologische Probe, insbesondere Vollblut, in die erfindungsgemäße Röhre 1 eingezogen ist und sich sofort mit der Stabilisierungslösung 10 zur Mischung 13 vermischt. Alternativ kann die Stabilisierungszusammensetzung in trockener Form in der Röhre 1 angeordnet sein und sich in der Probe lösen, um die Mischung 13 zu bilden. Die Mischung 13 aus der Probe mit der Stabilisierungszusammensetzung bzw. der Stabilisierungslösung 10 bildet eine vom Gel 11 getrennte Phase, da das Gel 11 keine stabile homogene Mischung mit Wasser bzw. der Stabilisierungslösung 10 bildet. Das Gel 11 kann zumindest teilweise am Kolben 5 angeordnet bleiben, ebenso optional eine schwere wässrige Komponente 12. Generell bevorzugt weist das Gel 11 eine Viskosität im Bereich 140-320 PaS, gemessen mit einem Rotationsviskosimeter bei 0,5 Upm, 25 °C auf, oder mit einem (Typ EHD) Kegel-Platte-Viskosimeter gemessen. Dabei bildet das Gel 11 bevorzugt eine Schicht, die den Querschnitt der Röhre 1 auch während der Bewegung des Kolbens 5 in Richtung auf ihr zweites Ende 7 überdeckt und weiter bevorzugt eine optionale schwere wässrige Komponente 12 von der Mischung 13 trennt.
Die Figur 3 zeigt die Röhre 1 nach Einziehen einer flüssigen biologischen Probe und
Zentrifugation. Durch die Zentrifugation werden kernlose Zellen aus der Mischung 13 getrennt, so dass ein Rest der Mischung 13', der im Wesentlichen keine kernlosen Zellen enthält, eine leichte Phase oberhalb des Gels 11 bildet. Die Stabilisierungslösung 10 bewirkt eine Stabilisierung der freien Nukleinsäuren und der Zellen der Probe und das Gel 11 hält kernhaltige Zellen in dem Rest der Mischung 13', die die Stabilisierungslösung 10 enthält, zurück, so dass eine Schicht kernhaltiger Zellen 14 in dem Rest der Mischung 13' angrenzend an das Gel 11 gebildet wird. Diese Schicht kernhaltiger Zellen 14 enthält im Wesentlichen keine kernlosen Zellen, z.B. keine Erythrozyten bei einer Vollblutprobe, da sich diese auf der Seite des zweiten Endes 7 des Gels 11, bzw. unterhalb des Gels 11 finden und eine Phase kernloser Zellen 15 bilden, die eine höhere Dichte als der Teil der Mischung 13' bzw. als das Gel 11 aufweist. In den Figuren 2 und 3 ist die Kolbenstange 6 vom Kolben 5 entfernt worden, so dass das zweite Ende 7 der Röhre 1 außen einen für die Zentrifugation geeigneten Boden bildet.
Die Schicht kernhaltiger Zellen 14 und der oberhalb liegende leichtere Rest der Mischung 13' können separat aus der Röhre 1 entnommen werden, um anschließend getrennt analysiert zu werden.
Beispiel: Stabilisierung einer Vollblutprobe
In eine Röhre 1, in der eine Anordnung aus einem ersten Abschnitt aus Stabilisierungslösung 10 am ersten Ende 2 der Röhre 1 angrenzend an deren Einlassöffnung, eine daran
angrenzende Schicht aus einem zweiten Abschnitt aus Gel 11 und daran gegenüber dem ersten Abschnitt angrenzend eine schwere wässrige Komponente 12, enthalten war, wurde ca. 5 mL Vollblut in das erste Ende der Röhre eingezogen. Dabei bestand die
Stabilisierungslösung aus 20 mM Citronensäure (Monohydrat) und 27 mM Trinatriumcitrat (Dihydrat) in Wasser und 15 Gcw./Vol.-% Urotropin. Das Gel bestand aus 2 g Gel mit einer Dichte von 1,077 g/ml und einer Viskosität von 140-320 PaS (gemessen bei 25°C mit einem Rotationsviskosimeter bei 0,5 Upm, alternativ mit einem Typ-EHD Kegel-Platte- Viskosimeter). Die schwere wässrige Komponente 12 bestand aus 1 mL Histopaque-l077 (Sigma- Aldrich, #10771). Die Röhre hatte unter Berücksichtigung der Stabilisierungslösung 10, des Gels 11 und der schweren wässrigen Komponente 12 sowie eines freien
Kopfvolumens noch ein mögliches freies Innenvolumen zum Einziehen eines
Probenvolumens von maximal 5 mL.
Die Röhre wurde nach Einziehen des Vollbluts durch dreimaliges Invertieren über ihre Längsachse gedreht, um das Blut mit der Stabilisierungslösung zu mischen und dann wurde die Röhre zentrifugiert, z.B. bei 4000 x g für 15 min. Bei der Zentrifugation war das zweite Ende in einem größeren Radius angeordnet als das erste Ende der Röhre. Anschließend wurde die zentrifugierte Röhre bei 22,5 °C gelagert. Während der Lagerung für bis zu l4d wurden Aliquots aus der leichten Phase 13' entnommen und aufgearbeitet und daraus zellfreie DNA isoliert und analysiert.
Aus der so erzeugten leichten Phase 13', die zellfreies Plasma in Mischung mit der
Stabilisierungslösung enthielt, wurde mit dem NucleoSnap DNA Plasma Kit (erhältlich von Macherey-Nagel) zellfreie DNA isoliert. Es zeigte sich, dass die zellfreie DNA in der Mischung aus Vollblut und der Stabilisierungslösung 10 über eine Lagerdauer von zumindest 14 d bei 22,5 °C für die anschließende Analyse stabilisiert wird.
Die Zellen, die in der leichten Phase 13' oberhalb des Gels 11 eine Schicht 14 bilden, können aus der Röhre entnommen werden, sind stabilisiert und enthalten im Wesentlichen keine kernlosen Zellen.
Bezugszeichenliste :
1 Röhre
2 erstes Ende der Röhre
3 Gewinde
4 Deckel
5 Kolben
6 Kolbenstange
7 zweites Ende der Röhre
8 Ansatzstück
9 Diaphragma
10 Stabilisierungslösung
11 Gel
12 schwere wässrige Komponente
13 Mischung aus Stabilisierungslösung und eingezogener Probe
13' Rest der Mischung aus Stabilisierungslösung und eingezogener Probe nach Zentrifugation
14 kernhaltige Zellen
15 kernlose Zellen

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Stabilisierung einer flüssigen biologischen Probe mit den Schritten des Einziehens der Probe in ein erstes Ende (2) einer Röhre (1) mit einem
gegenüberliegendem zweiten Ende (7) , dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre (1) eine Stabilisierungszusammensetzung und ein Gel (11) enthält, das keine stabile homogene Mischung mit der gelösten Stabilisierungszusammensetzung (10) bildet, und den Schritt des anschließenden Zentrifugierens.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre (1) zusätzlich eine schwere wässrige Komponente (12) enthält, die keine stabile homogene
Mischung mit dem Gel (11) bildet.
3. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stabilisierungszusammensetzung eine Vorläuferverbindung für Formaldehyd enthält und in trockener Form oder in wässriger Lösung in der Röhre angeordnet ist.
4. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass durch den Schritt des Zentrifugierens eine leichte Phase erzeugt wird, die stabilisierte zellfreie Nukleinsäuren enthält und angrenzend an das Gel (11) eine Schicht kernhaltiger Zellen (14), die im Wesentlichen keine kernlosen Zellen (15) enthält.
5. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe durch Ziehen des Kolbens (5) in Richtung auf das zweite Ende (7) oder durch ein in der Röhre (1) voreingestelltes Vakuum eingezogen wird.
6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Einziehen der Probe die Röhre (1) von ihrem ersten Ende zum zweiten Ende eine Anordnung mit einem ersten Abschnitt, der die Stabilisierungslösung (10) aufweist, einem zweiten Abschnitt, der das Gel (11) aufweist, und optional einem dritten Abschnitt, der die schwere wässrige Komponente (12) aufweist, enthält, wobei die sich die Abschnitte über den Querschnitt der Röhre (1) erstrecken.
7. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Abschnitt, der zweite Abschnitt und der optionale dritte Abschnitt unmittelbar aneinander angrenzen.
8. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung (13, 13') der Stabilisierungszusammensetzung mit der Probe einerseits und andererseits das Gel (11) separate Phasen bilden.
9. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre nach dem Schritt des Zentrifugierens für zumindest l2h bei 5°C bis 25°C gelagert wird.
10. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre nach dem Schritt des Zentrifugierens für bis zu 5d bei 5°C bis 25°C gelagert wird.
11. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass nach dem Schritt des Zentrifugierens zumindest ein Anteil der leichten Phase aus der Röhre entnommen wird und daraus kernhaltige Zellen und/oder zellfreie
Nukleinsäuren analysiert werden.
12. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Vollblutprobe ist.
13. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Stabilisierungszusammensetzung
a) Mercaptoethanol, Dithiotreitol (DTT), optional zusätzlich Glycin, ein
Alkylamin und/oder Polyamin als Fänger für freies Formaldehyd oder b) Urotropin und zumindest eine Puffersubstanz, die auf eine pH-Wert von 7 oder darunter puffert, bevorzugt Urotropin und als Puffersubstanz Citrat, jeweils optional zusätzlich eine Puffersubstanz und/oder einen Gerinnungshemmer und/oder PEG, aufweist oder daraus besteht.
14. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel (11) eine Viskosität von 150-320 Pas, bei 0,5 Upm an einem Rotationsviskosimeter bei 25±l °C gemessen, oder 140-320 Pas, mit einem Kegel- Platte-Viskosimeter bei variablen Scherraten gemessen, aufweist.
15. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel (11) ein Polyestergel, Polyacrylatgel, polymerisiertes Silikonöl oder eine Mischung von zumindest zweien dieser ist.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die
schwere wässrige Komponente (12) eine wässrige Mischung mit Ficoll, Kieselgel, quervemetztem Dextran, Gelatine oder eine Mischung aus zumindest zweien dieser, optional jeweils zusätzlich Diatrizoat, aufweist oder daraus besteht.
17. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Ende der Röhre (1) durch den in der Röhre (1) angeordneten Kolben (5) gebildet wird und der Kolben (5) ein Hohlkolben ist.
18. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es nur einen einzigen Schritt des Zentrifugierens enthält.
19. Röhre zur Verwendung als Stabilisierungsvorrichtung, insbesondere in einem
Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, die ein erstes Ende (2) mit einer Einfüllöffnung und einem gegenüberliegendem zweiten Ende (7) aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre (1) eine Stabilisierungszusammensetzung und ein Gel (11) enthält, das keine stabile homogene Mischung mit der gelösten
Stabilisierungszusammensetzung (10) bildet.
20. Röhre nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre (1) von ihrem
ersten Ende (2) zum zweiten Ende (7) eine Anordnung mit einem ersten Abschnitt, der die Stabilisierungszusammensetzung aufweist, und einem zweiten Abschnitt enthält, der das Gel (11) aufweist.
21. Röhre nach einem der Ansprüche 19 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Röhre (1) einem dritten Abschnitt, der eine schwere wässrige Komponente (12) aufweist, enthält, die keine stabile homogene Mischung mit dem Gel (11) bildet.
22. Röhre nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass die Stabilisierungszusammensetzung einerseits und andererseits das Gel (11) separate Phasen bilden.
23. Röhre nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die in
Wasser oder Probe gelöste Stabilisierungszusammensetzung (10) eine geringere Dichte als das Gel (11) aufweist.
24. Röhre nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel (11) eine geringere Dichte als die schwere wässrige Komponente (12) aufweist.
25. Röhre nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Gel (11) ein Polyestergel, z.B. Polyacrylatgel, polymerisiertes Silikonöl oder eine Mischung von zumindest zweien dieser ist.
26. Röhre nach einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die
Stabilisierungszusammensetzung eine Vorläuferverbindung für Formaldehyd enthält und in trockener Form oder in wässriger Lösung in der Röhre angeordnet ist, insbesondere
a) Mercaptoethanol, Dithiotreitol (DTT), optional zusätzlich Glycin, ein
Alkylamin und/oder Polyamin als Fänger für freies Formaldehyd oder b) Urotropin und zumindest eine Puffersubstanz, die auf eine pH-Wert von 7 oder darunter puffert, bevorzugt Urotropin und als Puffersubstanz Citrat, jeweils optional zusätzlich eine Puffersubstanz und/oder einen Gerinnungshemmer und/oder PEG, aufweist oder daraus besteht.
27. Röhre nach einem der Ansprüche 19 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen am zweiten Ende (7) verschieblich geführten Kolben (5) oder ein voreingestelltes Vakuum aufweist.
28. Verwendung einer Röhre nach einem der Ansprüche 19 bis 27 als
Stabilisierungsvorrichtung in einem Verfahren zur Stabilisierung von Vollblut, das einen einzigen Schritt des Zentrifugierens enthält.
PCT/EP2019/079985 2018-11-01 2019-11-01 Blutentnahmeröhre und verfahren zur präparation WO2020089461A1 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102018218739.8 2018-11-01
DE102018218739.8A DE102018218739B3 (de) 2018-11-01 2018-11-01 Blutentnahmeröhre und Verfahren zur Präparation

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020089461A1 true WO2020089461A1 (de) 2020-05-07

Family

ID=68426510

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/EP2019/079985 WO2020089461A1 (de) 2018-11-01 2019-11-01 Blutentnahmeröhre und verfahren zur präparation

Country Status (2)

Country Link
DE (1) DE102018218739B3 (de)
WO (1) WO2020089461A1 (de)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111205971B (zh) * 2020-04-22 2020-07-31 博奥生物集团有限公司 采样管

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005014173A1 (en) * 2003-08-05 2005-02-17 Becton, Dickinson And Company Device and methods for collection of biological fluidsample and treatment of selected components
WO2012075407A2 (en) * 2010-12-02 2012-06-07 Becton, Dickinson And Company Blood collection devices containing blood stabilization agent
WO2012121998A1 (en) * 2011-03-04 2012-09-13 Becton, Dickinson And Company Blood collection device containing lysophospholipase inhibitor
WO2013045458A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Preanalytix Gmbh Stabilisation and isolation of extracellular nucleic acids
WO2013123030A2 (en) 2012-02-13 2013-08-22 Streck, Inc. Blood collection device for improved nucleic acid regulation
EP2848935A1 (de) * 2012-05-10 2015-03-18 Konica Minolta, Inc. Verfahren zur entfernung von roten blutkörperchen und zentrifugalröhrchen zur blutentnahme
WO2019025387A1 (de) 2017-08-02 2019-02-07 Sarstedt Ag & Co. Kg Verfahren und zusammensetzung zur stabilisierung zellfreier nukleinsäuren und zellen

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6913932B2 (en) * 2002-08-23 2005-07-05 Beckman Coulter, Inc. Formaldehyde-ammonium salt complexes for the stabilization of blood cells
WO2015013244A1 (en) * 2013-07-24 2015-01-29 Streck, Inc. Compositions and methods for stabilizing circulating tumor cells

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005014173A1 (en) * 2003-08-05 2005-02-17 Becton, Dickinson And Company Device and methods for collection of biological fluidsample and treatment of selected components
WO2012075407A2 (en) * 2010-12-02 2012-06-07 Becton, Dickinson And Company Blood collection devices containing blood stabilization agent
WO2012121998A1 (en) * 2011-03-04 2012-09-13 Becton, Dickinson And Company Blood collection device containing lysophospholipase inhibitor
WO2013045458A1 (en) 2011-09-26 2013-04-04 Preanalytix Gmbh Stabilisation and isolation of extracellular nucleic acids
WO2013123030A2 (en) 2012-02-13 2013-08-22 Streck, Inc. Blood collection device for improved nucleic acid regulation
EP2848935A1 (de) * 2012-05-10 2015-03-18 Konica Minolta, Inc. Verfahren zur entfernung von roten blutkörperchen und zentrifugalröhrchen zur blutentnahme
WO2019025387A1 (de) 2017-08-02 2019-02-07 Sarstedt Ag & Co. Kg Verfahren und zusammensetzung zur stabilisierung zellfreier nukleinsäuren und zellen

Also Published As

Publication number Publication date
DE102018218739B3 (de) 2020-03-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE3038196C2 (de) Faserförmiges Filtermaterial zur Abtrennung von Leukocyten aus einer Leukozyten enthaltenden Suspension
DE69020248T2 (de) Filtermaterial zum Abscheiden von Leukozyten und Verfahren zu seiner Herstellung.
DE69430990T2 (de) Zusammensetzung und methode zur anreicherung von weissen blutzellen aus menschlichem vollblut
DE102009040525B4 (de) Zentrifuge zum Trennen von Vollblut in Blutkomponenten, sowie fluidisch kommunizierende Behälter zum Einsetzen in die Zentrifuge, sowie Verfahren zur Gewinnung eines hochangereichten Thrombozytenkonzentrats aus Vollblut
DE2645553C2 (de) Medikamente enthaltendes Granulat von Serumalbumin
DE68902698T2 (de) Verfahren zur trennung von blut in blutkomponenten und einheit zur trennung von blutkomponenten.
DE69324754T2 (de) Filter und System zur Trennung der Leukozyten
DE3115608C2 (de) Vorrichtung für die Adsorption von Blutproteinen
DE69126643T2 (de) Methode und Vorrichtung zur Entfernung von Heparin
DE2908722A1 (de) Verfahren zum abtrennen von leukozyten aus einer leukozytenhaltigen loesung durch filtrierung und vorrichtung
DE69519649T2 (de) Verbesserte Zentrifuge und Phasentrennung
DE2800934A1 (de) Verfahren zur verbesserten trennung von zellschichten in zentrifugierten blutproben
DE102013010724A1 (de) Polymeres Vollbluthohlfasermembranfiltermedium und Verwendung davon zum Abtrennen von Blutplasma/-serum von Vollblut
DE1498577B2 (de) Vorrichtung zur Abtrennung flüssiger Bestandteile kleiner Blutproben
DE69530761T2 (de) Methode und poröser träger zur entfernung von verunreinigungen
DE102018126722A1 (de) Ölwannenbaugruppe
DE102018218739B3 (de) Blutentnahmeröhre und Verfahren zur Präparation
DE69824541T2 (de) Gerät zum Gewinnen von Blutbestandteilen und zugehöriges Verfahren
WO2011121019A2 (de) Verfahren zur herstellung eines drug-delivery-systems auf der basis von polyelektrolytkomplexen
DE69027686T2 (de) Trennung von verschiedenen zellen
Röhlich et al. Elektronenmikroskopische Untersuchungen am Organon vasculosum laminae terminalis der Ratte
DE69533053T2 (de) Gerät zur Inhibierung der Glykolyse in Blutproben
EP2389206B1 (de) Sorptionsmittel zum entfernen proteingebundener substanzen
EP0114281A2 (de) Vorrichtung zur Gewinnung von Zellmaterial aus Körperflüssigkeiten
DE60008894T2 (de) Verfahren zum einkapseln von aktiven materialien durch koazervierung von polymern in nichtchlorierten organischem lösungsmittel

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 19797719

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 19797719

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1