DE3326901C2

DE3326901C2 -

Info

Publication number: DE3326901C2
Application number: DE3326901A
Authority: DE
Inventors: Henry A. Philadelphia Pa. Us Sloviter
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1982-07-27
Filing date: 1983-07-26
Publication date: 1989-09-21
Also published as: SE455160B; GB2124104B; SE8304143D0; SE8304143L; JPS5946214A; GB8318539D0; GB2124104A; DE3326901A1; FR2530953B1; US4423077A; FR2530953A1; CA1216519A

Description

Es ist bekannt, Emulsionen von Perfluorverbindungen als künstliches Blut zu verwenden. Diese Emulsionen sind frei von infektiösen Mitteln und Antigenen. Die Blutgruppenbestimmung des Empfängers ist unnötig. Allerdings fehlen solchem künstlichem Blut Gerinnungsfaktoren, Blutplättchen, Immunglobuline und Antikörper.

So offenbart die DE-OS 21 44 094 ein Verfahren zur Herstellung einer Perfluorkohlenstoffemulsion in Lecithin mit 25- 30 (Gew./Vol.)% an Perfluorkohlenstoff und 3-5 (Gew./ Vol.)% an Lecithin. (Nachfolgend soll "(Gew./Vol.)%" die Materialmenge, gemessen in g, bedeuten, die in 100 ml Emulsion enthalten ist. Ferner soll "(Vol./Vol.)%" das Volumen eines in ml gemessenen Stoffes bedeuten, der in 100 ml Emulsion enthalten ist.)

Aus der US-PS 39 62 439 ist eine Emulsion zur Sauerstoffübertragung bekannt, die 10-40 (Gew./Vol.)% an Fluorkohlenstoff und 2-6 (Gew./Vol.)% Lecithin enthält.

Die US-PS 41 05 798 offenbart eine Emulsion, die 10-30 (Vol./Vol.)% per Fluorkohlenstoff und 1-5 (Vol./Vol.)% Lecithin enthält.

Die Wirksamkeit dieser bekannten Emulsionen als künstliches Blut wird durch die relativ kurze Retensionszeit der Emulsionsteilchen im Kreislauf begrenzt.

Aus der US-PS 42 52 827 ist eine Emulsion von zwei Perfluorkohlenstoffen mit insgesamt 10-50 (Gew./Vol.)% in einem hochmolekularen nicht-ionischen Tensid-Emulgator, der in einer Menge von 2,0-5,0 (Gew./Vol.)% vorhanden ist, einem Phospholipid-Emulgator-Hilfsmittel in einer Menge von 0,1-1,0 (Gew./Vol.)% und mit einem Anteil von 0,004-0,1 (Gew./Vol.)% an Fettsäure bekannt. Diese Emulsion ist stabiler als andere bekannte Emulsionen, jedoch gleichwohl von nur begrenzter Brauchbarkeit. Dies ist im wesentlichen darauf zurückzuführen, daß sie in drei separaten Bestandteilen hergestellt und gelagert wird, die bis unmittelbar vor dem Infusionszeitpunkt tiefgekühlt bleiben müssen. Die Infusion muß innerhalb von 24 Stunden nach dem Auftauen und Mischen durchgeführt werden. Das Auftauen bewirkt eine Verringerung der Stabilität der Emulsion. Am unangenehmsten ist jedoch, daß diese Emulsion nicht unter Anwendung herkömmlicher Techniken im Autoklaven behandelt werden kann. Die Sterilisation erfolgt vielmehr für die Dauer von 12 min bei 115°C in einem speziell ausgebildeten Rotationssterilisator. Die durch die US-PS 42 52 827 bekannten Emulsionen sind isotonisch, aber hyperionisch.

In der Veröffentlichung "Technical Information Ser. No. 1" vom 15. Mai 1975 der Firma Greencross Corporation, Seiten 38-39, wird eine als künstliches Blut verwendbare, unter Verwendung von Perfluorchemikalien hergestellte Emulsion beschrieben, die durch einstündiges Pasteurisieren bei 60°C an drei aufeinanderfolgenden Tagen stabilisiert werden muß, da die Wärmesterilisation bei 100°C die Emulsion zerstört. Es muß unter relativ milden Bedingungen - wiederholtes Erwärmen auf 60°C - sterilisiert werden. Innerhalb von 6 h nach der Infusion zerfällt die das Perfluorkohlenstoffteilchen umgebende Phospholipidschicht. Die nackten Perfluorteilchen verschwinden dann aus dem Kreislauf.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine insbesondere als künstliches Blut geeignete Emulsion verfügbar zu machen, die die Nachteile bekannter Emulsionen nicht oder nur in merklich geringerem Umfang aufweist. Insbesondere soll die Emulsion stabil, nicht-hämolytisch, unter Anwendung herkömmlicher Techniken autoklavbar und bei normalen Kühltemperaturen lagerbar sein. Insbesondere wird eine längere Retensionzeit der Emulsion im Kreislauf angestrebt, wobei die Emulsion die Aggregation der Blutplättchen oder die Gerinnungsfaktoren nicht nachteilig beeinflussen soll.

Zur Lösung dieser Aufgabe schlägt die Erfindung eine insbesondere als künstliches Blut geeignete Emulsion mit 30- 75 (Gew./Vol.)% an Perfluorverbindungsteilchen in einem physiologisch annehmbaren wäßrigen Medium mit einem Phospholipid- Emulgator vor, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie etwa 7-9 (Gew./Vol.)% des Phospholipid-Emulgators enthält.

Eine derartige Emulsion kann sogar bei Raumtemperaturen längere Zeit gelagert werden. Sie ist sowohl isotonisch als auch isoionisch gegenüber natürlichem Blutplasma. Die Emulsion ist merklich stabiler als bekannte Emulsionen.

Die Perfluorverbindung ist vorteilhaft aus der Gruppe Perfluordecalin, Perfluormethyldecalin, Perfluortripropylamin und Perfluortributylamin ausgewählt. Perfluordecalin hat sich hinsichtlich der Geschwindigkeit, mit welcher es aus Leber und Milz entfernt wird, als geeignetste Perfluorchemikalie erwiesen. Perfluortripropylamin ist leichter emulgierbar als Perfluordecalin, wird aber wesentlich langsamer aus Leber und Milz entfernt.

Der Phospholipid-Emulgator kann Lecithin sein, das beispielsweise in Form von Eidotter-Phospholipid vorliegt. Es kann aber auch aus Sojabohne-Phospholipid gewonnen werden.

Das physiologisch annehmbare Medium kann von einer Tyrode- Lösung (pH 7,4) gebildet werden. Die Tyrode-Lösung ist eine wäßrige Lösung mit folgenden Bestandteilen:

NaCl, KCl, CaCl₂, MeCl₂, NaH₂TO₄, NaHCO₃ und Glucose. Elektrolytkonzentrationen sollten so gewählt sein, daß die sich ergebende Emulsion sich isotonisch und isoionisch gegenüber Blutplasma verhält. Herkömmliche, als künstliches Blut geeignete Emulsionen sind hyperionisch und daher in Blutplasma weniger stabil.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung einer stabilen, insbesondere als künstliches Blut geeigneten Emulsion mit 30-75 (Gew./Vol.)% an Perfluorverbindungsteilchen in einem physiologisch annehmbaren wäßrigen Medium mit einem Phospholipid-Emulgator, wobei ein gereinigtes Phospholipid in einem physiologisch annehmbaren Medium unter Ultraschallbeaufschlagung dispergiert und nach Zugabe der Perfluorverbindung einer erneuten Ultraschallbeaufschlagung zur Bildung einer von mit Phospholipid überzogenen Perfluorverbindungsteilchen enthaltenden Emulsion unterworfen wird, wobei anschließend übergroße Teilchen von der gebildeten Emulsion abzentrifugiert werden. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß 7-9 (Gew./Vol.)% an Phospholipid- Emulgator eingesetzt werden. Das Phospholipid dient somit sowohl als Teilchenüberzug als auch als Emulgator, so daß die Notwendigkeit der Verwendung eines zusätzlichen Emulgators entfällt. Die gegenüber dem Stand der Technik erhöhte Lecithinkonzentration führt zu einem erheblich stabilieren, Lecithin-überzogenen Perfluorverbindungsteilchen, das bis zu vier Tagen im Kreislauf bleibt. Die Perfluorverbindungsteilchen sind dabei in einer Menge von etwa 50-70 µmol an Phospholipid-Emulgator pro ml Perfluorverbindungsteilchen überzogen. Herkömmliche Lecithin-überzogene Perfluorteilchen wie die jener Emulsion, die in "Technical Information Ser. No. 1" beschrieben ist, bleiben im Kreislauf nur etwa sechs Stunden stabil.

Der pH der anfallenden Emulsion wird auf einen Wert zwischen 7,2 und 7,6 eingestellt. Ein Emulsions-pH von 7,4, der dem von Blutplasma entspricht, ist optimal. Der osmotische Druck beträgt in idealer Weise 300 mOsm/l. Die Electrolyte und jeweilige Electrolytkonzentrationen einer bevorzugten Ausführungsform sind in Tabelle 1 aufgeführt:

Elektrolyte
Elektrolyt
Elektrolyt-Konzentration (Gew./Vol.)%
NaCl
0,75
KCl	0,015
CaCl₂	0,02
MgCl₂	0,007
NaH₂PO₄	0,004
NaHCO₃	0,07
Glucose	0,07

Bei der auf die vorbeschriebene Weise hergestellten Emulsion werden große Teilchen durch längere langsame Tieftemperaturzentrifugation entfernt. Da Perfluorchemikalien relativ dicht sind (spezifisches Gewicht 1,9-2,0) genügt ein Zentrifugieren mit geringer Geschwindigkeit. Zentrifugieren bei 0°C und 100 g wurde angewendet. Die Bodenfraktion der Emulsion, die Teilchen von ausreichender Größe, um toxisch zu sein, enthält, wird verworfen.

Nach 20wöchiger Lagerung bei 4°C wurden die Teilchen erneut durch Dunkelfeldmikroskopie untersucht. In der Teilchengröße wurde keine Veränderung beobachtet. Ferner wurde beim Zentrifugieren nach der Lagerung keine Änderung der Sedimentationsgeschwindigkeit beobachtet. Das Ausbleiben irgendeiner Änderung der Teilchengröße oder der Sedimentationsgeschwindigkeit zeigt die fortgesetzte Stabilität der Teilchen.

Die erfindungsgemäße Emulsion kann nach herkömmlichen Krankenhaus- Autoklavenarbeitsweisen bei Temperaturen über 120°C und einem Dampfdruck von 1,05 bar (15 lb/in²) ohne Phasentrennung oder Änderung der Teilchengröße sterilisiert werden. Ferner kann die erfindungsgemäße Emulsion vor ihrer Aufbewahrung autoklavenbehandelt und der Lagerung zur direkten Verwendung ohne weitere Autoklavenbehandlung entnommen werden. Dies ist ein bedeutender Vorteil gegenüber herkömmlichen Perfluorverbindungsemulsionen, die ein weiteres Mischen von Lösungen erfordern, bevor das Mittel nach der Lagerung verwendet werden kann.

Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden, nichtbegrenzenden Beispiele im einzelnen veranschaulicht:

Beispiel 1 Herstellung einer Perfluorverbindungsemulsion

Zu 7 ml kalter Tyrode-Lösung (pH 7,4) in einer Rosette-Zelle wurden 960 mg gereinigtes Lecithin (aus Eidotter) gegeben. Das Gemisch wurde mit 110 W 15 s ultraschallbehandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde nach einer Zeit von 1 min noch einmal wiederholt. Zu diesem dispergierten Lecithin in einer Rosette-Zelle bei 0°C wurden 4 ml Perfluorverbindung (Perfluortripropylamin oder Perfluordecalin) gegeben und das Gemisch wie zuvor für acht Zeiten von jeweils 15 s mit einem Intervall von 1 min nach jeder Ultraschallbehandlung ultrabeschallt. Die anfallende milchig-weiße Emulsion wurde 60 min bei 4°C und 100 g zentrifugiert, um irgendwelche große Teilchen zu sedimentieren. Die unteren 5% der Emulsion wurden verworfen. Die Emulsion enthielt 35-40 Vol./ Vol.% (67-76 Gew.-/Vol.-%) dispergierte Perfluorverbindung und ihr pH lag zwischen 7,35 und 7,40. Die emulgierten Perfluorteilchen hatten einen Durchmesser von etwa 0,1 µm und enthielten 50-70 µMol Lecithin pro ml Perfluorverbindung (etwa 7-9 Gew.-/Vol.-%) der Emulsion.

Der Lecithingehalt der Perfluorteilchen wurde durch zweimaliges Waschen der sedimentierten Teilchen aus einer Teilmenge der Emulsion mit Tyrode-Lösung, Extrahieren des Lecithins mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol und Bestimmen des Phosphorgehalts des Extrakts gemessen. Die Menge an vorhandenem Lecithin, gemessen in µMol, wird berechnet durch (1) Dividieren des Phosphorgehalts in µg durch die Zahl 31 (das Atomgewicht von Phosphor). Diese Berechnung liefert das Lecithin in µMol, da ein Molekül Lecithin ein Phosphoratom enthält.

Die in Beispiel 1 angegebene Herstellung, die mit Ultraschall emulgiert, unterscheidet sich deutlich von den herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Perfluorkohlenstoffemulsionen, die mechanische Homogenisatoren anwenden.

Die Perfluordecalin- und Perfluortripropylamin-Emulsionen, hergestellt nach Beispiel 1, wurden zwei separaten Gruppen von Laborratten verabreicht, wie in Beispiel 2 beschrieben.

Beispiel 2 Infusion von Perfluorverbindungsemulsion in Ratten

Männliche Sprague-Dawley-Ratten (200-250 g), anästhesiert mit Pentobarbital (30 mg/kg), erhielten 8-10 ml Emulsion pro Ratte über eine Pumpe in die Femoralvene zu 0,2 ml/min infundiert. Ein etwa gleiches Volumen Blut wurde während der Infusion abgenommen. Blutproben wurden in Abständen nach der Infusion zur Messung von Hämatokrit, der Konzentration an der Fluorverbindung und der Plättchenzahl genommen. Die Konzentration an Perfluorverbindung in Blut von Ratten bei Beendigung der Infusion lag im Bereich von 19-22 Vol./Vol.-%. Bei einer Gruppe von Ratten lagen diese Werte im Bereich von 24-28 Vol./Vol.-%.

Alle Ratten, die Emulsionen von Perfluordecalin (mehr als 100 Ratten) oder Emulsionen von Perfluortripropylamin (mehr als 100 Ratten) erhielten, blieben mehr als 1 Jahr bei guter Gesundheit. Die Plättchenzahl des Blutes dieser Ratten änderte sich nicht wesentlich nach der Infusion einer dieser Emulsionen; dies steht im Gegensatz zur Abnahme der Blutplättchen, die nach Infusion der meisten anderen Perfluorverbindungsemulsionen beobachtet wird.

Claims

1. Stabile, insbesondere als künstliches Blut geeignete Emulsion mit 30 bis 75 (Gew./Vol.)% an Perfluorverbindungsteilchen in einem physiologisch annehmbaren wäßrigen Medium mit einem Phospholipid-Emulgator, dadurch gekennzeichnet, daß es etwa 7 bis 9 (Gew./Vol.)% des Phospholipid-Emulgators enthält.

2. Emulsion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Perfluorverbindung aus der Gruppe Perfluordecalin, Perfluormethyldecalin, Perfluortripropylamin und Perfluortributylamin ausgewählt ist.

3. Emulsion nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Phospholipid-Emulgator Lecithin ist.

4. Emulsion nach einem der Ansprüche 1 bis 3, gekennzeichnet durch 67 bis 75 (Gew./Vol.)% von Perfluordecalin oder Perfluortributylamin und etwa 7 bis 9 (Gew./Vol.)% Lecithin.

5. Emulsion nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das physiologisch annehmbare Medium Tyrode-Lösung (pH 7,4) bildet.

6. Verfahren zur Herstellung einer stabilen, insbesondere als künstliches Blut geeigneten Emulsion mit 30 bis 75 (Gew./Vol.)% an Perfluorverbindungsteilchen in einem physiologisch annehmbaren wäßrigen Medium mit einem Phospholipid- Emulgator, wobei ein gereinigtes Phospholipid in einem physiologisch annehmbaren Medium unter Ultraschallbeaufschlagung dispergiert und nach Zugabe der Perfluorverbindung einer erneuten Ultraschallbeaufschlagung zur Bildung einer von mit Phospholipid überzogenen Perfluorverbindungsteilchen enthaltenden Emulsion unterworfen wird, wobei anschließend übergroße Teilchen von der gebildeten Emulsion abzentrifugiert werden, dadurch gekennzeichnet, daß 7 bis 9 (Gew./Vol.)% an Phospholipid-Emulgator eingesetzt werden.