DE3927298C2

DE3927298C2 - Mehrfachemulsion und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE3927298C2
Application number: DE3927298A
Authority: DE
Inventors: Richard L Beissinger; Lakshman R Sehgal; Darsh T Wasan; Arthur L Rosen
Original assignee: ILLIONOIS INST OF TECHNOLOGY C; NORTHFIELD LAB; Northfield Laboratories Inc
Current assignee: ILLIONOIS INST OF TECHNOLOGY C; NORTHFIELD LAB; Northfield Laboratories Inc
Priority date: 1988-08-19
Filing date: 1989-08-18
Publication date: 2003-02-06
Anticipated expiration: 2009-08-19
Also published as: US5217648A; GB2221912B; NL194665C; GB2221912A; AU4008689A; JPH02160724A; FR2635458B1; DE3927298A1; SE8902773D0; GB8918880D0; AU614173B2; CA1330937C; ES2015777A6; SE8902773L; CH679206A5; FR2635458A1; US5061688A; NL8902100A; SE504671C2; US5438041A

Description

Feld der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion.

Eine Hämoglobin-Mehrfachemulsion ist aufgrund ihrer spezifischen Eigenschaften geeignet, als Blutersatz Sauerstoff zu transportieren oder andere Sauerstoffübertragungen vorzunehmen. Eine doppelte Emulsion von wäßrigem hohem Hämoglobin-Anteil in physiologisch kompatiblem Mineralöl oder Pflanzenöl in einer wäßrigen Außensalzlösung mit einer ausreichend kleinen Tröpfchengröße wird zum Sauerstofftransport durch Blutgefäße zu bestimmten Körpergeweben oder -organen verwendet. Ein Verfahren wird angegeben, mit dem Hämoglobin, ein zerbrechliches Material, mit hohem Anteil in einer Wasser-in-Öl-in-Wasser- Mehrfachemulsion enthalten sein kann, wobei die hohe Sauerstoffaustauschaktivität, die für derartige Anwendungsfälle nötig ist, beibehalten wird.

Beschreibung des Standes der Technik

Bei vielen physiologischen und industriellen Anwendungen ist es wichtig, daß man eine Sauerstoff tragende Chemikalie zur Verfügung hat, die Sauerstoff an eine sauerstoffarme Umgebung bringen kann. Einer der wichtigsten Aspekte ist das Vorsehen eines wirkungsvollen, Sauerstoff tragenden Blutersatzes. In Notsituationen, bei denen eine Versorgung mit genügend adäquatem Vollblut nicht gegeben ist, besteht zusätzlich der Vorteil in der Verwendung eines synthetischen Blutersatzes. So kann z. B. der Wirkungsgrad der Sauerstoffaufnahme bei einem mangelnden Blutstrom in einem Gewebe oder einem Organ, der aus einer Verengung einer Blutader resultiert, durch die Verwendung von Vollblut nicht behandelt werden, während Blutersatz mit niedriger Volumenviskosität Sauerstoff durch verengte Adern Liefern kann und dabei die durch die Einschnürung der Arterien verursachten Herzattacken und -schläge verhindert.

Die Verwendung von synthetischem Blutersatz eliminiert auch die Übertragung von blutbedingten Infektionskrankheiten, wie Hepatitis und erworbene Immunschwächesyndrome. Auch andere Schwierigkeiten der Blut-Unverträglichkeit oder Blut-Allergien können mit dem synthetischen Blutersatz gelöst werden.

Ein idealer synthetischer Blutersatz sollte eine hohe Sauerstoffaufnahmekapazität und eine geringe Sauerstoffaffinität haben, die ein Aufladen von Sauerstoff in der Lunge und ein Freigeben von Sauerstoff im Gewebe ermöglichen. Außerdem sollte der osmotische Kolloiddruck nahe des Druckes des Blutplasmas und die Viskosität gleich oder kleiner als die des Vollblutes sein. Ferner sollten gegeben sein: keine Giftigkeit für den menschlichen Körper, Histokompabilität, keine Antigen-Effekte, eine ausreichende Lebenszeit im Zirkulationssystem, um die für die Sauerstoffversorgung erwünschten Bedingungen zu erreichen, einen verhältnismäßig schnellen Stoffwechsel oder Ausscheidung der chemischen Mittel und eine ausreichende Speicherstabilität. Bis heute hat sich in den Vereinigten Staaten kein Blutersatz voll einsatzfähig erwiesen.

Bei einem Versuch zur Bereitstellung von Blutersatz wurden Mittel mit hoher passiver Sauerstofflöslichkeit, insbesondere Perfluorcarbon-Emulsionen verwendet. Es wurde gefunden, daß dieser Blutersatz unstabil ist, keine ausreichende Sauerstoffaufnahmekapazität hat und für den Menschen giftig ist. Schwierigkeiten mit vielen Perfluorcarbon-Emulsionen ergeben sich durch die hohe Sauerstoffkonzentration, die bei der Perfluorcarbon-Emulsion für den Sauerstofftransport durch passive Löslichkeit erforderlich ist, und durch die Notwendigkeit, die Emulsion zur Beibehaltung der Stabilität im gefrorenen Zustand zu halten.

Die z. Z. vielversprechenden Versuche beinhalten die Einbeziehung des chemischen Hämoglobins in verschiedenen Formen. Obwohl stromafreie Hämoglobin-Lösungen eine ausreichende Sauerstoffaufnahmekapazität haben, haben sie eine hohe Sauerstoffaffinität, einen hohen osmotischen Kolloiddruck, eine mögliche Giftigkeit und einen Spielraum für die Herzgefäßzirkulation, die zu schnell ist. Ein Problem mit stromafreien Hämoglobin-Lösungen war, daß ihre Sauerstoffaffinität viel höher war als die von normalem Hämoglobin in den roten Blutkörperchen und daher wurde Sauerstoff vorzugsweise aus dem Zellhämoglobin ausgeschieden. Sehgal, L. R., Gould, S. A., Rosen, A. L., Moss, G. S.: Appraisal of Red Cell Substitutes: Hemoglobin Solution and Perfluorochemical Emulsions, Laboratory Medicine, 14: 545, 1983; Gould, S. A., Rosen, A. L., Sehgal, L. R., Moss, G. S.: Red Cell Substitutes: Hemoglobin Solution or Fluorocarbon?, J. Trauma, 22: 736, 1982; Gould, S. A., Rosen, A. L., Sehgal, L. R., Moss, G. S.: Hemoglobin Solutions as Red Cell Substitutes; Trans. Am. Soc. Art. Int. Organs, 26: 350, 1980.

Die Pyridoxylation, gefolgt von einer Polymerisation der stromafreien Hämoglobin-Lösungen hat viele dieser Probleme reduziert, mit Ausnahme der hohen Sauerstoffaffinität und möglichen Giftigkeit. Das Verfahren erzeugt zudem etwas Methämoglobin, das eine Form von Hämoglobin ist, aber keinen Sauerstoff übertragen kann. Sehgal, L. R., Rosen, A. L., Gould, S. A., Moss, G. S.: Polymerized Pyridoxylated Hemoglobin: A Red Cell Substitute with Normal Oxygen Capacity, Surgery, 95: 433, 1984: Keipert, P. E., Chang, T. M. S.: Preparation and In-vitro Characteristics of Pyridoxylated Polyhemoglobin as Blood Substitutes, Appl. Biochem. Biotechnol. 10: 133, 1984.

Es wurde versucht, Hämoglobin-Lösungen in eine synthetische Zelle einzukapseln und zwar durch Einkapseln in Nylonmembranen, vernetzte Proteinmembranen, Polyhämoglobinmembranen und in Liposome, die Hämoglobin in Phospholipid-Bläschen einschließen. Miller, I., Synthetic Blood Substitutes: Where Are We and Where Do We Go From Here?, CRC, Crit. Rev. BioEng., 149-178, Dez. 1978. Hemoglobin solution droplet encapsulation in a polymerized hemoglobin encapsulating membrane using glutaraldehyde as a crosslinking agent is described in "Artificial Red Cells with Crosslinked Hemoglobin Membranes", Thomas A. Davis, William J. Asher and Herbert W. Wallace, Applied Biochemistry and Biotechnology, Vol. 10, pgs. 123-132 (1984).

Das in Liposome eingekapselte Hämoglobin wird, obwohl es viele der Probleme mit anderen Blutersatz-Produkten vermeidet, auch noch zu schnell aus dem Zirkulationssystem entfernt, hat eine begrenzte Sauerstoffaufnahmekapazität und niedrige Abkapselungswirkung in der Größenordnung von 10 bis 20 Prozent.

Ein Verfahren zur Herstellung von liposomgekapseltem Hämoglobin ist in der US-Patentanmeldung Serial No. 901 710, angemeldet am 29. August 1986, beschrieben. Dieses Verfahren beseitigt einige der vorstehend aufgeführten Probleme.

Die Herstellung von Mehrfachemulsionen von Wasser-in-Öl-in- Wasser, die nichtionische Emulgatoren, entionisiertes Wasser und flüssiges Paraffin verwenden und durch Mischen die Wasser-in-Öl-Emulsion und durch Homogenisierung der Öl-in-Wasser-Emulsion bilden, sind in dem Artikel: "An Attempt at Preparing Water-in-Oil-in-Water Multiple Phase Emul sions" von Sachio Matsumoto, Yashiko Kita und Daizo Yonezawa im Journal of Colloid and Interface Science, Band 57, No. 2, Seiten 353 bis 361 (1976) beschrieben. Wasser-in-Olivenöl-in-Wasser-Emulsionen wurden durch Verwen dung eines gemischten Sojabohnen-Lecithins und eines Span 80-Emulgators hergestellt, die miteinander reagieren und einen viskoelastischen Film an der Öl- Wasser-Grenzfläche und einen Sukrose-Fruchtsäureester in der äußeren Wasser phase bilden, wie in dem Artikel: "Preparation of Water-in-Olive Oil Multiple- Phase-Emulsions in an Eatable Form" von Sachio Matsumoto, Yoshiro Keda, Yoshiko Kito und Daizo Yonezawa in Agric. Biol. Chem. 42, No. 4, Seiten 739 bis 743 (1978) beschrieben wurde.

In der US 4,612,370 ist ein Sauerstofftransportsystem angegeben, das eine wässrige Hämoglobinlösung verwendet, die in einer komplexen Lipid- und koh lenhydrat-modifizierten Lipid-Phase eingekapselt ist. Die einkapselnde Lipid- Phase ist keine Flüssigphase, sondern vielmehr eine Feststoff-Membranphase. Eine flüssige Mehrfachemulsion wird in dieser Druckschrift nicht vorgeschlagen.

Eine in der US 4,612,370 gelehrte Ölphase besteht aus natürlichen Lipiden (Spalte 4, Zeilen 44 bis 45), die in die Membranphase eingelagert sind. Bei der Herstellung dieses Erzeugnisses wird das Lipid in einem organischen Lösungs mittel zum Bilden der Ölphase gelöst, die mit dem wässrigen Hämoglobin ge schüttelt wird, um angeblich eine Öl-Wasser-Öl-Emulsion zu bilden. Das orga nische Lösungsmittel wird dann durch Verdampfen mittels Vakuum oder Erstar ren und Vakuum entfernt. Während der Verdampfung des Lösungsmittels findet eine Umwandlung statt, und nach der vollständigen Verdampfung des organi schen Lösungsmittels ist das Erzeugnis eine Suspension von Liposomen, die eine Hämoglobinlösung in einer äußeren Hämoglobinlösungsphase einkapseln. Die Suspension wird zentrifugiert um die die Hämoglobinlösung einkapselnden Liposome von der äußeren Hämoglobinlösung zu trennen. Dann wird das lipo som-gekapselte Hämoglobin in einer wäßrigen Pufferlösung suspendiert um das endgültige Erzeugnis zu bilden. Bei dem Prozeß der Bildung des Erzeugnisses gemäß der Lehre dieser Druckschrift werden keine Emulgatoren verwendet. Da her versteht es sich, dass die Lipidphase des gemäß dieser Druckschrift ge bildeten Erzeugnisses keine Flüssigkeit ist, um eine Doppelemulsion zu er zeugen.

In der EP 0 038 173 A2 ist gelehrt, künstliche rote Zellen mit Mikrotröpfchen einer wässrigen, stromafreien Hämoglobinlösung zu erzeugen, die in Membranen polimerisierten Hämoglobins eingekapselt sind, welche durchlässig für Sauer stoff und undurchlässig für Hämoglobin sind. Die künstlichen roten Zellen werden mittels eines Prozesses gebildet, der die Erzeugung von Mikrotröpfchen einer Hämoglobinlösung in einer kontinuierlichen Ölphase umfasst, um eine Emulsion von Hämoglobin in Öl und suspendierenden Globuli der so gebildeten Emulsion in einer wässrigen Suspensionsphase zu erzeugen, die ein Hämoglobin verbindendes Mittel enthält, das zumindest bifunktional ist. Diese Druckschrift lehrt somit, Mikrotröpfchen einer wässrigen Hämoglobinlösung in Membranen polimerisierten Hämoglobins einzukapseln, die nicht flüssig sind.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, einen anderes Sauerstoff tragendes Material bereitzustellen und ein entsprechendes Verfahren anzugeben.

Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen der Ansprüche 1 bzw. 19 gelöst.

Zusammenfassung der Erfindung

Die Erfindung betrifft eine flüssige Doppel-Emulsion einer wässrigen Lösung eines Sauerstoff tragenden Materials, wie Hämoglobin, in Öl in einer wässrigen Außenphase. Die flüssige Doppel-Emulsion dieser Erfindung hat ein Primär-Emul gierungsmittel, das die Bildung und die Beibehaltung der Primär-Emulsion der wässrigen Hämoglobin-Lösung in Öl unterstützt. Ein Sekundär-Emulgator wird verwendet, um eine Sekundär-Emulsion der Primär-Emulsion in einer wässrigen Außenphase zu bilden und aufrecht zu erhalten. Daher wird die Primäremulsion aus Primäremulsionströpfchen aufgebaut, von denen jedes individuelle Tröpf chen oder eine Vielzahl von Tröpfchen einer wässrigen Hämoglobinlösung in der Ölphase enthält, während die Sekundäremulsion aus Sekundäremulsionströpf chen besteht, von denen jedes individuelle Tröpfchen oder eine Vielzahl von Tröpfchen der Primäremulsion in der wäßrigen Außenphase aufweist, wie in Fig. 1 schematisch dargestellt ist.

Die Ölphase kann mineralische oder pflanzliche Öle enthalten, die eine genügende Emulsionsstabilität aufweisen. Geeignete pflanzliche Öle können enthalten: Olivenöl, Safloröl, Sesamöl und Sojabohnenöl. Mineralische Öle werden bevorzugt, die umfassen Weißöl Nr. 40, Carnation-Leichtöl und Klearol-Leichtöl. Auch Mischungen dieser Öle können verwendet werden.

Um die Mehrfachemulsion nach dieser Erfindung herzustellen, ist es erforderlich, zuerst die Primäremulsion herzustellen und dann in einem getrennten Verfahren die Sekundäremulsion herzustellen. Es hat sich gezeigt, daß es bei der Herstellung der Primäremulsion erforderlich ist, zuerst die Komponenten mit einem Rührer, z. B. einem Magnetrührer, zu mischen, gefolgt von einem Mischvorgang mit hoher Zerkleinerung und Hohlraumbildung mit Hilfe eines Mikroverflüssigers. Die Sekundäremulsion wird getrennt davon durch Rühren hergestellt mit der gewünschten Auswahl kleiner Größe, die durch Filtration erreicht wird. Es hat sich nämlich gezeigt, daß die Mischung mit hoher Zerkleinerung für die Bildung der Sekundäremulsion nicht geeignet ist.

Die Mehrfachemulsion nach dieser Erfindung hat die folgenden Eigenschaften:

Die Größen der Primäremulsions- und Sekundäremulsionstropfen ist vorzugsweise so klein wie mit einer guten Stabilität vereinbar ist. Über 50 Prozent der frisch hergestellten Primäremulsion hat eine Tröpfchengröße kleiner als 0,5 Mikron und über 50 Prozent der frisch hergestellten Sekundäremulsion hat eine Tröpfchengröße kleiner als 4 Mikron. Die in dieser Erfindung verwendeten Emulsionen können Makro- oder Mikroemulsionen sein.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Der Zweck und die Vorteile dieser Erfindung werden anhand bevorzugter Ausführungsbeispiele der Erfindung anhand der Zeichnung besser verständlich. Es zeigen:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer flüssigen Doppel-Emulsion von wäßrigem Hämoglobin-in-Öl- in einer wäßrigen Außenphase,

Fig. 2 in vereinfachtem Diagramm die Schritte eines Verfahrens nach der Erfindung,

Fig. 3 eine Graphik der Sauerstoffzersetzung einer flüssigen Mehrfachemulsion (EM) von wäßrigem Hämoglobin-in-Öl-in einer wäßrigen Außenphase im Vergleich zu Vollblut und

Fig. 4 eine Graphik der Halbwertzeit einer flüssigen Doppel-Emulsion von Hämoglobin-in-Öl-in einer wäßrigen Außenphase dieser Erfindung.

Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen

Eine wäßrige Lösung eines beliebigen Sauerstoff tragenden Materials kann dem Primäremulsionsteil der Mehrfachemulsion dieser Erfindung verwendet werden. Sauerstoff aufweisende Materialien wie Hämoglobin, das aus dem menschlichen Blut oder von rindviehartigen Quellen gewonnen wird, ist ebenso geeignet wie modifiziertes Hämoglobin, z. B. pyridoxiertes Polyhämoglobin.

Das gesamte Verfahren wird vorzugsweise unter abgekühlten Bedingungen von etwa 4°C bis etwa 8°C durchgeführt, um die Bildung von sauerstoffinaktivem Methämoglobin zu reduzieren. Das Verfahren muß auch unter sterilen Bedingungen ausgeführt werden, wenn die Mehrfachemulsion als Blutersatz verwendet werden soll. Alle Lösungen, die zur Herstellung der Mehrfachemulsion verwendet werden, werden während der Herstellung der Mehrfachemulsion sowohl als Blutersatz als auch als Zusatz von Antibiotikas durch ein Sterilisationsfilter gefiltert. Das Hämoglobin kann durch beliebige bekannte Mittel aus roten Blutkörperchen isoliert und in einer verhältnismäßig stromafreien wäßrigen Hämoglobin-Lösung von etwa 1 Gewichtsprozent auf etwa 35 Gewichtsprozent, vorzugsweise von etwa 5 Gewichtsprozent auf etwa 35 Gewichtsprozent, konzentriert werden. Die wäßrige Hämoglobin-Lösung als Blutersatz kann mit Phosphat gepufferten Salzen dialysiert werden und es können Antibiotikas, Albumine, Glukose, Pyridoxol-5-Phosphat (Vitamin A) und Kohlenstoff-Anhydrase beigegeben werden.

Zur Bildung der Primäremulsion werden mineralische und pflanzliche Öle verwendet. Bevorzugte Mineralöle sind Weißöl Nr. 40 mit einer Viskosität von 4-5 cst bei 40°C, SG 0,804-0,820 bei 25°C; maximalem Fließpunkt von 2°C und minimalem Flammpunkt von 135°C, Carnation-Leichtöl mit einer Viskosität von 11-14 cst bei 40°C, SG 0,837-0,953 bei 25°C, maximalem Fließpunkt -7°C und minimalem Flammpunkt von 177°C, sowie Klearol-Leichtöl mit einer Viskosität von 7-10 cst bei 40°C, SG 0,811-0,833, Fließpunkt -7°C und minimalem Flammpunkt bei 138°C, die alle von der Fa. Witco Chemical Corp. zu beziehen sind. Bevorzugte Pflanzenöle sind Sesamöl, Olivenöl, Safloröl, die von der Firma Croda Inc., New York, N. Y., zu beziehen sind. Ein Primär-Emulgator aus Polyoxyäthylen-Alkohol, wie Brij 93, oder Sorbitanmonooleat, wie Span 80, (Handelsnamen der Fa. ICI America Inc.), werden mit einem Anteil von 2 bis 30 Volumenprozent, vorzugsweise 5 bis 15 Volumenprozent, bezogen auf die gesamte Primäremulsion, in der Ölphase aufgelöst.

Für eine Primäremulsion mit Mineralöl werden gemischt:
die wäßrige Hämoglobin-Lösung mit einem Anteil von etwa 40 bis etwa 90 Volumenprozent, vorzugsweise etwa 60 bis etwa 70 Volumenprozent; Mineralöl mit einem Anteil von etwa 8 bis etwa 58 Volumenprozent, vorzugsweise etwa 14 bis etwa 25 Volumenprozent und der Primär-Emulgator mit einem Anteil von etwa 2 bis etwa 30 Volumenprozent, vorzugsweise etwa 5 bis etwa 15 Volumenprozent.

Für eine Primäremulsion mit Pflanzenöl werden gemischt:
die wäßrige Hämoglobin-Lösung mit einem Anteil von etwa 40 bis etwa 90 Volumenprozent, vorzugsweise etwa 40 bis etwa 60 Volumenprozent; Pflanzenöl mit einem Anteil von etwa 5 bis etwa 30 Volumenprozent, vorzugsweise etwa 20 bis etwa 30 Volumenprozent, und der Primär-Emulgator mit einem Anteil von etwa 5 bis etwa 30 Volumenprozent, vorzugsweise etwa 20 bis etwa 30 Volumenprozent. Die wäßrige Hämoglobin-Lösung wird vorzugsweise langsam der schnell rührenden Ölphase beigegeben und gemischt. Der Rührvorgang kann mit einem Magnetrührer etwa 15 bis etwa 60 Minuten, vorzugsweise etwa 25 bis etwa 35 Minuten lang durchgeführt werden. Die gemischte Primäremulsion wird dann einer hohen Zerkleinerungs-Emulgierung unterworfen, die Scherraten von etwa 100.000 bis etwa 5.000.000, vorzugsweise etwa 500.000 bis etwa 1.000.000 s^-1 bringt und die mit einem Mikroverflüssiger bei einem Druckabfall von etwa 69 bis etwa 207, vorzugsweise etwa 124 bis etwa 138 bar durchgeführt wird. Vollständigere Information über einen Mikroverflüssiger ist der US-PS 4 533 254 zu entnehmen. Die Primäremulsion wird gefiltert, wobei ein 5 Mikron-Filter aus hydrophilem Polyvinylidendifluorid (Duropore der Fa. Millipore Inc.) verwendet wird.

Der Hämoglobin-Lösung kann vor der Emulgierung Albumin mit einem Anteil von etwa 1 bis etwa 5 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 2 bis etwa 3 Gewichtsprozent, zugegeben werden. Die Primäremulsion von wäßrigem Hämoglobin in Mineralöl oder Pflanzenöl, die für die Herstellung einer flüssigen Mehrfachemulsion nach der Erfindung geeignet ist sollte zu einem Tröpfchendurchmesser in der Primäremulsion führen, der in einem Bereich kleiner als 5, vorzugsweise kleiner als 3 Mikron, liegt. Die wäßrige Außenphase der Mehrfachemulsion kann eine beliebige wäßrige Lösung sein, die von der Verwendung der Mehrfachemulsion abhängt. Damit die Mehrfachemulsion als Blutersatz verwendet werden kann, besteht die wäßrige Außenphase vorzugsweise aus isotonischen, mit Phosphat gepufferten Salzen mit einem pH-Wert von etwa 7,4. In der wäßrigen Außenphase ist ein Sekundär-Emulgator eines Polyoxyäthylen-Fettsäureesters, wie Tween 40, Tween 60, Twen 80 (Handelsname ICI America Inc.) oder ein Äthylenoxyd, wie Pluronic F 68 (Handelsname BASF Wyandotte Corp.), vorzugsweise Tween 60 oder Pluronic F 68 mit einem Anteil von etwa 0,25 bis etwa 2 Gewichtsprozent, vorzugsweise etwa 0,25 bis etwa 0,75 Gewichtsprozent, bezogen auf die gesamte wäßrige Außenphase, gelöst.

Die Primäremulsion, der Sekundär-Emulgator und die wäßrige Außenphase werden durch Dispersion vermischt, z. B. mit einem Magnetrührer, und zwar etwa 15 bis etwa 60 Minuten, vorzugsweise etwa 25 bis etwa 35 Minuten lang, um eine gleichförmige Dispersion zu bekommen. Dabei ist bevorzugt vorgesehen, die Primäremulsion der Außenphase beizugeben, um die Sekundäremulsion zu bilden. Die fertige Mehrfachemulsion enthält in geeigneter Weise ein Verhältnis von etwa 10 bis 90, vorzugsweise etwa 35 bis etwa 50 Volumenprozent Primäremulsion und etwa 10 bis 90, vorzugsweise 50 bis 65 Volumenprozent wäßrige Außenphase der Sekundäremulsion. Die Sekundäremulsion kann in einer beliebigen bekannten Technik gefiltert werden, so daß ein fertiges Sekundäremulsionsprodukt mit einer Sekundäremulsionströpfchengröße entsteht, die sowohl maximale als auch durchschnittliche Tröpfchengröße umfaßt. Die Tröpfchen der Sekundäremulsion haben vor dem Filtern eine Größe von etwa 20 bis etwa 50 Mikron und einen mittleren Durchmesser von etwa 10 bis etwa 20 Mikron. Beim Filtern wird die Größe der Tröpfchen auf eine maximale Tröpfchengröße unter 10 Mikron und auf eine durchschnittliche Tröpfchengröße unter 5 Mikron reduziert. Dabei wird die Sekundäremulsion bis zu dreimal durch ein Filter, z. B. ein 5 Mikron-Filter aus hydrophilem Polyvinylidendifluorid, geleitet, was zu einer für einen Blutersatz geeigneten Mehrfachemulsion führt.

Der wäßrigen Außenphase können beliebige wasserlösliche Zusätze, wie Albumine mit einem Anteil von 0,5 bis 1,5 g% und Dextran mit einem Anteil von 0,5 bis 1,0 g%, die die Größenverteilung einengen und die Mehrfachemulsion stabilisieren, sowie beliebige andere gewünschte Antibiotika, wie sie vorher bei der Hämoglobin- Lösung erwähnt wurden, beigegeben werden.

Es hat sich gezeigt, daß eine nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Mehrfachemulsion sehr stabil ist. Der Begriff "Ausbeute", der hier benutzt wird, gibt den Anteil des Hämoglobins, der ursprünglich in der Primäremulsion enthalten war, im Verhältnis zu dem Anteil des Hämoglobins an, der in die wäßrige Außenphase übergeht. Die Ausbeute der Mehrfachemulsion ergab bei dieser Herstellung etwa 99 Prozent vor dem Filtern und etwa 97 Prozent nach dreimaligem Filtern durch ein 5 Mikron-Filter. Die Ausbeute fällt während des Speicherns ab, sie beträgt aber nach 23 Tagen unter abgekühlten Bedingungen noch über 85 Prozent. Die Tröpfchengröße steigt während der Speicherung unter kühlen Temperaturen an, z. B. von einer durchschnittlichen Tröpfchengröße bei frisch hergestellten Mehrfachemulsionen von 3,8 Mikron nach 16 Tagen auf etwa 10 Mikron und nach 23 Tagen auf etwa 15 Mikron.

Eine Größenverteilung wie bei einer frisch hergestellten Doppel- Emulsion kann durch ein- oder dreimaliges Filtern durch ein 5 Mikron-Filter, wie es bei der ursprünglichen Herstellung verwendet wurde, erhalten werden. Die Sauerstoffaufnahmekapazität der Mehrfachemulsion beträgt etwa 14 ml O₂ auf 100 ml der Mehrfachemulsion und fällt nach 23 Tagen auf etwa 10 ml ab.

Obwohl die Mehrfachemulsion nach der Erfindung für verschiedene Sauerstoffversorgungssysteme verwendet werden kann, ist die Eignung als Blutersatz ein wichtiger Aspekt der Erfindung. Die Tropfengröße der Mehrfachemulsion ist für die Verwendung in einem cardiovaskulären System geeignet.

Die Viskosität der Mehrfachemulsion im Teilchengrößenbereich, wie er in einem cardiovaskulären System erwartet wird, ist etwa dieselbe wie bei Vollblut und bringt man die Mehrfachemulsion in diesen Teilchengrößenbereich, dann führt dies zu einer vernachlässigbaren Änderung der Ausbeute, d. h. einem vernachlässigbaren Rückgang der in die Außenphase der Mehrfachemulsion gelangenden Hämoglobin-Lösung. Die Sauerstoffaufnahmekapazität der Mehrfachemulsion dieser Erfindung entspricht der von Vollblut. Aus diesen Eigenschaften und der physiologischen Kompabilität der wäßrigen Außenphase aus mit Phosphat gepufferten Salzen kann erwartet werden, daß die Mehrfachemulsion sich als Blutersatz eignet. Wie anhand von spezifischen Beispielen gezeigt wird, haben nach der Erfindung hergestellte Mehrfachemulsionen keine akute Giftigkeit, wenn sie in eine Maus als Blutersatz eingespritzt werden. Die Hämoglobin-Mehrfachemulsion nach der Erfindung kann auch bei der sauerstoffgesättigten Konservierung von Spenderorganen, da der Sauerstoffaustausch in die Blutoxygenatoren fließt, und für die Sauerstoffversorgung von Säugetier-Zellstrukturen verwendet werden.

Die nachfolgenden spezifischen Beispiele werden zum besseren Verständnis der Erfindung näher erläutert.

Beispiel I

Eine Hämoglobin-Doppel-Emulsion wurde dadurch hergestellt, daß zunächst eine Primäremulsion aus Hämoglobin und Weißöl Nr. 40 hergestellt wurde, an das sich die Herstellung einer Sekundäremulsion aus der Primäremulsion in einer wäßrigen Lösung von mit Phosphat gepuffertem Salz angeschlossen hat. Fig. 2 zeigt das Verfahren gemäß diesem Beispiel.

Durch Waschen von roten Blutkörperchen mit 1 Gewichtsprozent Natriumchlorid in deionisiertem Wasser im Volumenverhältnis 1 : 1 wurde durch leichtes Mischen eine Hämoglobin-Salz-Lösung hergestellt. Danach folgte eine 10 Minuten Lange Zentrifugierung bei 4.000 × g in einer gekühlten Zentrifuge. Nach dem Zentrifugieren wurde die obere Schicht und die ausgeschiedene Ware entfernt und der Waschvorgang wiederholt, bis die überstehende Flüssigkeit klar ist. Dies ist gewöhnlich ein- bis dreimal. Nach dem Waschen werden die zusammengebackenen roten Blutkörperchen durch Verdünnen mit 4 bis 5 Volumen Wasser gelöst und die erhaltene Mischung 12 Stunden lang mit einem Magnetrührer in einem Kühlschrank gerührt. Das Stroma, in der Hauptsache Membranfragmente der roten Blutkörperchen, wird durch 30-minütiges Zentrifugieren bei 30.000 × g entfernt. Die überfließende Hämoglobin-Lösung wurde entfernt und in einem Minitan-(Millipore Corp., Bedford, MA) Kreuzstrom-Ultrafiltrationssystem konzentriert, das acht Filterpakete aus Polysulfon mit einem Nenn-Molekulargewicht von 30.000 verwendet, wobei die Lösung während des gesamten Konzentrationsprozesses in einem Eisbad verbleibt, um die Bildung von Methämoglobin zu reduzieren. Das Konzentrationsverfahren wurde solange durchgeführt, bis die Kreuzstrom-Filtrationsrate drastisch reduziert war, um den maximal zulässigen Gegendruck des Ultrafiltrationssystems nicht zu überschreiten. Nach der Konzentration betrug der Anteil des Hämoglobins in der Hämoglobin- Lösung bis zu 35 g%, d. h. 35 Gramm Hämoglobin in 100 ml-Lösung. Das Hämoglobin-Konzentrat wurde mit 30 mM Phosphat gepuffertem Salz dialysiert, um das gewünschte osmotische Gleichgewicht mit der wäßrigen Außenphase zu erhalten. Der pH-Wert des Phosphatpuffers war wie erforderlich, von 7,4 bis 8 eingestellt, um sicherzustellen, daß der pH-Wert der dialysierten Hämoglobin- Lösung etwa 7,4 betrug. Die dialysierte Hämoglobin-Lösung wurde 30 Minuten lang bei 30.000 × g zentrifugiert und dann über ein 0,2 Mikron-Sterilisationsfilter (Fisher Chem. Co.) gefiltert, um das aufgrund der pH-Einstellung ausgeschiedene Stroma-Material zu entfernen. Der Hämoglobin-Lösung wurden Antibiotika zugegeben, so daß sie auf die Literbasis bezogen, 5.000 Einheiten Penicillin, 40 mg Gentamicin, 2.500 Einheiten Polymyxin und 50 mg Streptomycin enthalten hatte. Außerdem wurden menschliches Albumin und Glukose mit 2,5% bzw. 3,5 g% der Lösung beigegeben.

Die Primäremulsion von Hämoglobin in Öl wurde unter Verwendung eines Magnetrührtisches dadurch hergestellt, daß die vorstehend beschriebene Hämoglobin-Lösung Langsam einem kräftig gerührten Weißöl Nr. 40 (Witco Chemical Corp.), das 15 Gewichtsprozent oberflächenaktivem Polyoxyäthylen-Alkohol Brij 93 (ICI America Inc.) enthielt. Das langsame Zugeben der Hämoglobin-Lösung zu der kräftig gerührten Ölphase bringt einen hohen Gehalt in der wäßrigen Phase (60 Volumenprozent der Hämoglobin-Lösung in der Ölphase). Die Hämoglobin-Öl-Mischung wurde einer Hochenergie-Emulgierung unter abgekühlten Bedingungen mit einem M 110-Microverflüssiger Model B 04 mit D-20-Einsätzen (Microfluidics Corp.) bei einem Druckabfall von 138 bar mit einem Verkleinerungsfaktor von etwa 1 × 10⁶ s^-1 unterzogen, um kleine Mehrfachemulsionströpfchen zu bekommen und um die Stabilität der Primäremulsion zu erhöhen. Die Primäremulsion wurde dann durch ein 5 Mikron-Filter aus hydrophilem Polyvinylidendifluorid (Duropore, Millipore Corp.) gefiltert.

Die wäßrige Außenphase der Mehrfachemulsion war eine isotonische, mit Phosphat gepufferte Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,4, der für die physiologische Kompatibilität gewählt wurde. Dieser Salzlösung war 0,5 g% oberflächenaktiver Polyoxyäthylen-Fettsäureester Tween 60 (ICI America Inc.), 1 g% Albumin und 0,5 g% Dextran (62.400 MW, Sigma Chemical Company) beigegeben.

Diese vorgefertigte Primäremulsion von Hämoglobin in Öl wurde dann in die vorgefertigte wäßrige Außenphase im Volumenverhältnis 1 : 1 durch 30-minütiges Mischen mit einem Magnetrührer eingebracht. Die Mehrfachemulsion wurde dreimal in eine Sammelflasche gefiltert, um die maximale Tröpfchengröße unter 10 Mikron und die durchschnittliche Tröpfchengröße unter 5 Mikron zu reduzieren. Dazu wurde ein 5 Mikron-Filter aus hydrophilem Polyvinylidendifluorid (Durapore, Millpore Corp.) benutzt. Die Filtration wurde unter einem Leichten Vakuum von 25 kPa durchgeführt, das durch Wasseransaugen erzeugt wurde und eine Filtrationsrate von etwa 5 ml pro Minute ergab. Wenn die Mehrfachemulsion in einer für den Blutersatz geeigneten Weise hergestellt wird, werden alle, zur Herstellung der Mehrfachemulsion verwendeten Lösungen durch den Durchgang durch ein 0,2 Mikron-Filter sterilisiert.

Die Veränderung des Druckabfalles im Mikroverflüssiger zwischen 69 und 207 bar bei der Herstellung der Primäremulsion führt zu einer Ausbeute, die größer als 85 Prozent ist und Spitzenwerte von 98 Prozent bei 124 bis 138 bar annimmt.

Beispiel II

Eine Hämoglobin-Doppel-Emulsion wurde wie im Beispiel I hergestellt mit der Ausnahme, daß Sesamöl als Pflanzenöl für die Primäremulsion verwendet wurde. Die wäßrige Hämoglobin- Lösung mit 35 g% Hämoglobin und 3 g% Albumin wurde Langsam (1 ml/min) der etwa 40 Minuten lang kräftig gerührten Ölphase mit 50 Gewichtsprozent Span 80, bezogen auf die Ölphase, in einem Volumenverhältnis von 40 Volumenprozent Hämoglobin und 60 Volumenprozent Sesamöl beigegeben und dann der Hochenergie- Emulgierung, wie im Beispiel I, unterzogen. Die Primäremulsion aus wäßrigem Hämoglobin in Sesamöl wurde dann in die wäßrige Außenphase dispergiert, die aus isotonischer, mit Phosphat gepufferter Salzlösung mit 1,0 Gewichtsprozent menschlichem Albumin, 0,5 Gewichtsprozent Dextran und 0,5 Gewichtsprozent Pluronic F 68 bestand. Das Volumenverhältnis von Primäremulsion und Außenphase war 1 : 1 und die Mischung erfolgte durch etwa 5-minütiges langsames Rühren. Die Mehrfachemulsion wurde dreimal durch ein 5 Mikron-Filter gefiltert, um eine maximale Tröpfchengröße unter 10 Mikron und eine durchschnittliche Tröpfchengröße unter 5 Mikron zu erhalten.

Beispiel III

Eine nach dem Beispiel I frisch hergestellte Mehrfachemulsion wurde mit der wäßrigen Außenphase verdünnt und in eine Howard- Zelle (Rascher & Betzold, Inc., Chicago, Illin.) gebracht und durch ein MicrOmaster-Phasenkontrastmikroskop (Fischer Scientific Inc.) mit einer Olympus OM1-Kamera fotographiert. Die Tröpfchengrößen wurden von einem halbautomatischen Bildanalysator MOP-3 (Carl Zeiss Inc.) gemessen. Der maximale Tröpfchendurchmesser der Primäremulsion war kleiner als 1,5 Mikron mit einer mittleren Größe von kleiner als 0,5 Mikron. Nach der Speicherung (Lagerung) von 5 Tagen bei 4°C war der maximale bzw. durchschnittliche Tröpfchendurchmesser 2,5 bzw. 0,5 Mikron. Es wurde herausgefunden, daß sich die Größenverteilung der Primäremulsionströpfchen eingeengt und sich mit der Zeit durch Hinzufügen von Albumin stabilisiert hatte.

Die maximale und durchschnittliche Tröpfchengröße der frisch hergestellten Primäremulsion war etwa 7 und 3,8 Mikron, bei einer 4 Tage alten Emulsion 10 und 4,8 Mikron, bei einer 15 Tage alten Emulsion 15 und 10 Mikron und bei einer 23 Tage alten Emulsion 20 und 15 Mikron, wobei eine Temperatur von 5°C eingehalten wurde. Das Hinzufügen von Albumin in die wäßrige Außenphase resultiert in einer abnehmenden Tröpfchengröße und in einer beachtlichen Abnahme des Tröpfchenwachsens während der Speicherung. Es wurde auch herausgefunden, daß die Anzahl der Filterdurchläufe unter Verwendung eines 5 Mikron-Filters sehr wichtig war. Ein zweiter Filterdurchlauf führt zu einer Reduzierung der maximalen Größe von etwa 35 auf etwa 15 Mikron und ein dritter Durchlauf reduziert die maximale Größe auf etwa 7 Mikron.

Beispiel IV

Die Ausbeute, ausgedrückt durch den Anteil des in der Primäremulsion eingeschlossenen Hämoglobins im Vergleich zu dem in die Außenphase eingedrungenen Anteil, wurde mit der nach dem Beispiel I hergestellten Mehrfachemulsion gemessen. Die Anzahl der Filterdurchläufe mit dem 5 Mikron-Filter reduziert die Ausbeute von gerade unter 99 Prozent vor dem Filtern auf üben 97 Prozent nach drei Filterdurchläufen. Die Ausbeute der Mehrfachemulsion nimmt während der Speicherung (Lagerung) ab, aber nach 7 Tagen bei einer Lagerung bei 5°C wurde noch ein Wert über 91 Prozent und nach 23 Tagen ein Wert über 85 Prozent gemessen.

Beispiel V

Die Volumen-Viskosität der nach dem Beispiel I hergestellten Mehrfachemulsion wurde mit einem Wells-Brockfield-Syncro-Lectric- Mikroviskometer Modell LVT, der mit einem 0,8°-Konus Modell CP-40 (Brockfield Engineering Laboratories, Inc., Stoughton, Massachusetts) versehen war, und mit einem Weissenberg-Rheogoniometer Modell R 16/R 19, der mit einem 10 cm Konus mit 0,3° und Platten ausgerüstet war, gemessen. Die Viskosität der Mehrfachemulsion variierte von etwa 5 cp bei einer Scher-Rate von 50 s^-1 bis zu 3,5 cp bei einer Scher- Rate von 500 s^-1. Dies nähert sich der Scher-Rate von Vollblut in einem cardiovaskulären System. Bei derartigen Scher-Raten bleibt die Ausbeute etwa konstant und die Scher-Rate von 45 s^-1 bis 450 s^-1 hat nur geringen Einfluß auf die Größenverteilung der Mehrfachemulsionströpfchen. Die dynamische Scher-Viskosität (steady shear viscosity) der Mehrfachemulsion, die nach dem Beispiel II hergestellt wurde, war 3 cp.

Beispiel VI

Die Sauerstoffaufnahmekapazität, das ist der Sauerstoffinhalt, der nach dem Beispiel I hergestellten Mehrfachemulsion mit einer Modifikation eines biotonometrischen Verfahrens nach Neville (Neville, J. R., Journal Applied Physiology, 37: 967, 1974) in einem Warberg-Manometer (Fisher Scientific, Itasca, Illin.) gemessen wurde. Bei frisch hergestellter Emulsion wurde etwa 14 ml O₂/100 ml der Mehrfachemulionsprobe gemessen, dieser Wert fiel nach einer Lagerung von 23 Tagen bei 5°C auf etwa 10 ml O₂/100 ml ab.

Die frisch hergestellte Emulsion nach Beispiel II hatte einen Sauerstoffinhalt von 10 ml O₂/100 ml der Mehrfachemulsion.

Beispiel VII

In der im Beispiel I beschriebenen Weise wurde eine als Blutersatz verwendbare Mehrfachemulsion hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Primäremulsion auch Pyridoxal-5-phosphat P-5-P (Sigma Chemical Comp.) bei einem molaren Verhältnis von zwei zu Hämoglobin enthielt. P-5-P reduzierte die Sauerstoffaffinität auf einen P₅₀-Wert von 26,66 mbar im Vergleich zu einem gemessenen P₅₀-Wert von 34,66 mbar bei Vollblut. Die Messungen wurden bei einem pH-Wert von 7,35, P₅₀ von 0 mbar und einer Temperatur von 37°C gemessen. Die Oxyhämoglobin- Zersetzungskurve wurde mit dem modifizierten biotonometrischen Verfahren gemessen und die in Fig. 3 gezeigten Ergebnisse lassen eine ähnliche Kooperativität erkennen, die der von Vollblut entspricht.

Beispiel VIII

In der im Beispiel I beschriebenen Weise wurde eine Mehrfachemulsion hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Primäremulsion 32,8 g% Hämoglobin-Lösung und Carnation-Leichtöl mit bis zu 30 Volumenprozent Anteil an der Mehrfachemulsion enthielt. 0,55 cm³ dieser Mehrfachemulsion wurden vier Mäusen eingespritzt. Alle Tiere überlebten und zeigten bis 7 Tage nach den Injektionen ein gesundes Aussehen.

Eine andere Mehrfachemulsion wurde ähnlich hergestellt und enthielt 35 Volumenprozent Primäremulsion und 1 cm³ wurde drei Mäusen verabreicht, die alle überlebten und auch mehrere Tage nach den Injektionen gesund aussahen.

Eine Mehrfachemulsion wurde mit einem Anteil von 50 Volumenprozent Primäremulsion hergestellt. Diese Emulsion wurde in einem Anteil von 0,5 cm³ fünf Mäusen eingespritzt. Alle Tiere überlebten und zeigten mehrere Tage nach den Injektionen ein gesundes Aussehen.

Alle vorstehenden Tests zeigen keine akute Giftigkeit der Hämoglobin-Mehrfachemulsion in Mineralöl, die bei diesen Mäusen zu beobachten gewesen wäre.

Beispiel IX

In der im Beispiel VIII beschriebenen Weise wurde eine Mehrfachemulsion hergestellt, mit der Ausnahme, daß anstelle von Mineralöl, wie im Beispiel II beschrieben wurde, Sesamöl verwendet wurde. Die Primäremulsion enthielt 35 g% Hämoglobin- Lösung. Die Mehrfachemulsion enthielt 50 Prozent Primäremulsion und 50 Prozent wäßrige Außenphase. Zwei Mäusen wurde 0,5 und 1 cm³ dieser Mehrfachemulsion eingespritzt. Beide Mäuse überlebten und zeigten mehrere Tage Lang ein gesundes Aussehen.

Diese Versuche zeigen keine akute Giftigkeit der Hämoglobin- Mehrfachemulsion mit Sesamöl, die bei diesen Mäusen aufgetreten wäre.

Beispiel X

Nach der im Beispiel VIII beschriebenen Weise wurde eine Mehrfachemulsion mit 35 Volumenprozent Primäremulsion als Blutersatz hergestellt und fünf Mäusen eingespritzt. Unmittelbar nach der Injektion wurde eine Blutprobe in einer Mikrohämatokrit- Röhre gesammelt. Die Mehrfachemulsion wurde nach einer 10-minütigen Zentrifugierung mit 5 Volumenprozent des gesamten Tierblutvolumens gemessen. Wie in Fig. 4 gezeigt ist, fällt die Mehrfachemulsion nach 80 Stunden der Zirkulation in der Maus auf 2 Volumenprozent des gesamten Tierblutvolumens ab. Die Halbwertzeit der Mehrfachemulsion in der Maus wurde mit etwa 70 Stunden bestimmt.

Beispiel XI

Nach der im Beispiel VIII beschriebenen Weise wurde eine Mehrfachemulsion mit 50 Volumenprozent Primäremulsion als Blutersatz hergestellt. Beim Mischen mit platelet-reichem Plasma wurde keine Abnahme in einzelnen Platelets beobachtet.

In der vorstehenden Beschreibung ist die Erfindung an bevorzugten Ausführungsbeispielen beschrieben und viele Einzelheiten sind zum Zwecke der Illustration erläutert, es ist aber für den Fachmann auf diesem Gebiet selbstverständlich, daß die Erfindung auf weitere Ausführungsbeispiele anwendbar ist und daß viele der erläuterten Einzelheiten beträchtlich variiert werden können, ohne das Wesen der Erfindung aufzugeben.

Claims

1. Sauerstoff tragende flüssige Mehrfachemulsion, bestehend aus einer Pri märemulsion mit einer wässrigen Lösung von Sauerstoff aufnehmendem Material in Öl, das aus der Gruppe Mineralöle, Pflanzenöle und Mischun gen davon ausgewählt und mit einem Primär-Emulgator in einer Tröpf chengröße von ungefähr 5 µm emulgiert ist, und aus einer Sekun däremulsion, die die Primäremulsion in einer wässrigen Außenphase ent hält, welche mit einem Sekundär-Emulgator in Tröpfchengröße bis zu 10 µm emulgiert ist, wobei die Mehrfachemulsion eine Viskosität von etwa 3 bis etwa 9 cp, einen Anteil des Sauerstoff tragenden Materials in der Primäremulsion von etwa 85 bis 99 Prozent und eine Sauerstoffauf nahmekapazität von etwa 7 bis etwa 20 Volumenprozent hat.

2. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das sauerstoffhaltige Material Hämoglobin ist.

3. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Mineralöl aus der Gruppe von Weißöl Nr. 40, Carnation-Leichtöl, Klearol-Leichtöl und Mischungen davon gewählt ist.

4. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn das Öl Mineralöl ist, die Primäremulsion etwa 40 bis etwa 90 Volumenprozent Hämoglobin, etwa 8 bis etwa 58 Volumenprozent Öl und etwa 2 bis etwa 30 Volumenprozent des Primär-Emulgators enthält.

5. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Primäremulsion etwa 60 bis etwa 70 Volumenprozent Hämoglo bin, etwa 14 bis etwa 25 Volumenprozent Öl und etwa 5 bis 15 Volu menprozent des Primär-Emulgators enthält.

6. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Pflanzenöl aus der Gruppe von Olivenöl, Safloröl, Sesamöl, Sojabohnenöl und Mischungen davon gewählt ist.

7. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach Anspruch 1 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn das Öl Pflanzenöl ist, die Primäremulsion etwa 40 bis etwa 90 Volumenprozent Hämoglobin, etwa 5 bis etwa 30 Volumenprozent Öl und etwa 5 bis etwa 30 Volumenprozent des Primär-Emulgators enthält.

8. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Primäremulsion etwa 40 bis etwa 60 Volumenprozent Hämoglo bin, etwa 20 bis etwa 30 Volumenprozent Öl und etwa 20 bis etwa 30 Volumenprozent des Primär-Emulgators enthält.

9. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Primär-Emulgator aus der Gruppe von Polyoxyäthylen-Alkohol und Sorbitan-Monooleat gewählt ist.

10. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Primär-Emulgator aus der Gruppe von Brij 93 (Handelsname) und Span 80 (Handelsname) gewählt ist.

11. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Tröpfchengröße der Primäremulsion bis zu etwa 3 µm be trägt.

12. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Sekundär-Emulgator aus der Gruppe von Tween 40 (Handels name), Tween 60 (Handelsname), Tween 80 (Handelsname) und Pluronic F 68 (Handelsname) gewählt ist.

13. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Tröpfchengröße der Sekundäremulsion bis zu etwa 8 µm be trägt.

14. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass sie etwa 10 bis etwa 90 Volumenprozent Primäremulsion, etwa 10 bis etwa 90 Volumenprozent der wässrigen Außenphase und etwa 0,25 bis etwa 2 Gewichtsprozent des Sekundär-Emulgators enthält.

15. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie etwa 35 bis 50 Volumenprozent Primäremulsion, etwa 50 bis etwa 65 Volumenprozent der wässrigen Außenphase und etwa 0,25 bis etwa 0,75 Gewichtsprozent des Sekundär-Emulgators enthält.

16. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Anteil des Sauerstoff tragenden Materials in der Primäremulsion etwa 95 bis etwa 99 Prozent beträgt.

17. Sauerstoff tragende Mehrfachemulsion nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Sauerstoffaufnahmekapazität etwa 10 bis etwa 20 Volumen prozent beträgt.

18. Verwendung der Sauerstoff tragenden Mehrfachemulsion nach einem der vorhergehenden Ansprüche als Blutersatz.

19. Verfahren zum Herstellen einer flüssigen Mehrfachemulsion mit einem Sauerstoff aufnehmenden Material in Öl mit einer wässrigen Außenphase nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch gekennzeichnet,
dass eine gemischte Primäremulsion gebildet wird, indem eine wässrige Lösung von Sauerstoff tragendem Material mit einem Anteil von etwa 40 bis etwa 90 Volumenprozent in Öl durch Rühren vermischt wird, wobei als Öl Mineralöl, Pflanzenöl oder eine Mischung davon mit einem Anteil von etwa 8 bis etwa 58 Volumenprozent bei Mineralöl und mit etwa 5 bis etwa 30 Volumenprozent bei Pflanzenöl und ein Primär-Emulgator mit einem Anteil von etwa 2 bis etwa 30 Volumenprozent bei Mineralöl und von etwa 5 bis etwa 30 Volumenprozent bei Pflanzenöl verwendet wer den,
dass die gemischte Primäremulsion auf eine hohe Scher-Rate von etwa 100.000 bis etwa 5.000.000 s^-1 gebracht wird,
dass die Primäremulsion gefiltert wird, um eine maximale Tröpfchengröße von kleiner als etwa 5 µm zu erhalten,
dass diese Primäremulsion in einem Anteil von etwa 10 bis etwa 90 Volumenprozent, eine wässrige Außenphase in einem Anteil von etwa 10 bis etwa 90 Volumenprozent und ein Sekundär-Emulgator in einem Anteil von etwa 0,2 bis etwa 2,0 Gewichtsprozent durch Rühren vermischt werden, um eine gleichförmige Dispersion der Primäremulsion in der wässrigen Außenphase zu erhalten und um eine Sekundäremulsion zu bilden, und
dass die Sekundär-Emulsion gefiltert wird, um eine Mehrfachemulsion mit einer maximalen Tröpfchengröße kleiner als etwa 10 µm zu erhalten.

20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass als Sauerstoff tragendes Material eine Hämoglobin-Lösung mit einem Anteil von etwa 1 bis etwa 35 Gewichtsprozente Hämoglobin verwendet wird.

21. Verfahren nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass es bei einer Temperatur von etwa 4°C bis etwa 8°C ausgeführt wird.

22. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass alle Lösungen zur Herstellung der Mehrfachemulsion vor der Emul gierung durch einen Sterilisationsfilter geleitet werden.

23. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass die hohen Scher-Raten von etwa 500.000 bis etwa 1.000.000 s^-1 in einem Mikroverflüssiger erzeugt werden, der mit einem Druckabfall von etwa 69 bis etwa 207 bar arbeitet.

24. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Filtern der Primäremulsion mit einem 5 µm-Filter aus hydro philem Polyvinylidendifluorid ausgeführt wird.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass die Primäremulsion der gerührten wäßrigen Außenphase unter Wei terführung des Rührvorganges für etwa 15 bis etwa 60 Minuten zuge geben wird.

26. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass das Filtern der Sekundäremulsion mit einem 5 µm-Filter aus hy drophilem Polyvinylidendifluorid ausgeführt wird.

27. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 26, dadurch gekennzeichnet, dass der wässrigen Außenphase etwa 0,5 bis etwa 1,5 Gewichtsprozent Albumin beigegeben wird.

28. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 27, dadurch gekennzeichnet, dass der wässrigen Außenphase etwa 0,5 bis etwa 1,5 Gewichtsprozent Dextran beigegeben wird.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 19 bis 28, dadurch gekennzeichnet, dass der Primär-Emulgator aus der Gruppe von Brij 93 (Handelsname) und Span 80 (Handelsname) und der Sekundär-Emulgator aus der Gruppe von Tween 40 (Handelsname), Tween 60 (Handelsname), Tween 80 (Han delsname) und Pluronic F 68 (Handelsname) ausgewählt wird.