DE69433933T2

DE69433933T2 - Verfahren und vorrichtung zur einkapselung biologisch aktiver substanzen in zellen

Info

Publication number: DE69433933T2
Application number: DE69433933T
Authority: DE
Inventors: Claude Yves NICOLAU; Ulrich Bruggemann; Yousef Mouneimne; Eric Conrad Roux
Original assignee: CBR Laboratories Inc Boston; CBR Laboratories Inc
Current assignee: CBR Laboratories Inc Boston; CBR Laboratories Inc
Priority date: 1993-03-23
Filing date: 1994-03-23
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2014-03-24
Also published as: EP1466968A2; JPH08511680A; AU6415094A; WO1994021117A1; US5612207A; EP0690671B1; AU680890B2; EP1466968A3; ATE272311T1; KR960700740A; DE69433933D1; EP0690671A4; EP0690671A1

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen zur Verkapselung von biologisch aktiven Substanzen in verschiedenen Zellpopulationen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verkapselung von allosterischen Effektoren des Hämoglobins in Erythrozyten mittels Elektroporation, um therapeutisch wünschenswerte Veränderungen bei den physikalischen Merkmalen das intrazellulären Hämoglobins zu erzielen.
Hintergrund der Erfindung
In dem vaskulären System eines erwachsenen Menschen besitzt Blut ein Volumen von etwa 5 bis 6 Litern. Ungefähr eine Hälfte dieses Volumens wird von Zellen, einschließlich roten Blutzellen (Erythrozyten), weißen Blutzellen (Leukozyten) und Blutplättchen eingenommen. Rote Blutzellen umfassen die Mehrheit der zellulären Komponenten des Blutes. Plasma, der flüssige Anteil des Blutes, stellt ungefähr 90 Prozent Wasser und 10 Prozent verschiedene aufgelöste Stoffe dar. Diese aufgelösten Stoffe schließen Plasmaproteine, organische Metaboliten und Abfallprodukte, sowie anorganische Verbindungen ein.
Die Hauptfunktion der roten Blutzellen besteht darin, Sauerstoff von den Lungen zu den Geweben des Körpers zu transportieren, und Kohlendioxid zur Entfernung von den Geweben zu den Lungen zu transportieren. Nur sehr wenig Sauerstoff wird durch das Blutplasma transportiert, da Sauerstoff nur spärlich in wässrigen Lösungen löslich ist. Der Großteil des vom Blut beförderten Sauerstoffs wird durch das Hämoglobin der Erythrozyten transportiert. Erythrozyten in Säugetieren enthalten keine Kerne, Mitochondrien oder andere intrazellulären Organellen, und sie verwenden keinen Sauerstoff in ihrem eigenen Metabolismus. Rote Blutzellen enthalten etwa 35 Gewichtsprozent Hämoglobin, welches für die Bindung und den Transport von Sauerstoff verantwortlich ist.
Hämoglobin ist ein Protein, welches ein Molekulargewicht von ungefähr 64.500 besitzt. Es enthält vier Polypeptid-Ketten und vier Hämprosthetische Gruppen, in denen Eisenatome im Eisen (II)-Zustand gebunden sind. Normales Globin, der Protein-Anteil des Hämoglobin-Moleküls, besteht aus zwei α-Ketten und zwei β-Ketten. Jede der vier Ketten besitzt eine charakteristische Tertiärstruktur, in der die Kette gefaltet ist. Die vier Polypeptid-Ketten passen in einer ungefähr tetraedrischen Anordnung zusammen, um die charakteristische Quartärstruktur des Hämoglobins auszubilden. An jeder Polypeptid-Kette ist eine Häm-Gruppe gebunden, welche reversibel ein Molekül molekularen Sauerstoff binden kann. Wenn Hämoglobin sich mit Sauerstoff verbindet, wird Oxyhämoglobin gebildet. Wenn Sauerstoff freigesetzt wird, wird Oxyhämoglobin zu Desoxyhämoglobin reduziert.
Die Lieferung von Sauerstoff zu den Geweben hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, dem Volumen des Blutflusses, der Zahl der roten Blutzellen, der Konzentrationen an Hämoglobin in den roten Blutzellen, der Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins und, in bestimmten Spezies, dem molaren Verhältnis des Hämoglobins in den Erythrozyten mit hoher und niedriger Sauerstoff-Affinität. Die Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins hängt ebenfalls von vier Faktoren ab, nämlich: (1) dem Partialdruck des Sauerstoffs; (2) dem pH; (3) der Konzentration an 2,3-Diphosphoglycerat (DPG) im Hämoglobin; und (4) der Konzentration an Kohlendioxid. In den Lungen, bei einem Sauerstoff-Partialdruck von 100 mm Hg, sind ungefähr 98% des zirkulierenden Hämoglobins mit Sauerstoff gesättigt. Dies stellt die Gesamt-Sauerstoff-Transportkapazität des Blutes dar. Bei vollständiger Oxygenierung können 100 ml des gesamten Säugetier-Blutes etwa 21 ml an gasförmigem Sauerstoff tragen.
Die Wirkung des Sauerstoff-Partialdrucks und des pH auf die Fähigkeit des Hämoglobins, Sauerstoff zu binden, wird am besten verdeutlicht durch Prüfung der Sauerstoff-Sättigungskurve des Hämoglobins. Eine Sauerstoff-Sättigungskurve verdeutlicht grafisch den Prozentsatz der gesamten Sauerstoff-Bindungsstellen eines Hämoglobin-Moleküls, welche durch Sauerstoff-Moleküle besetzt sind, wenn Lösungen des Hämoglobin-Moleküls im Gleichgewicht stehen, bei verschiedenen Partialdrücken des Sauerstoffs in der Gas-Phase.
Die Sauerstoff-Sättigungskurve für Hämoglobin ist sigmoid. Daher steigt bei Bindung des ersten Sauerstoff-Moleküls die Affinität des verbleibenden Hämoglobins für die Bindung weiterer Sauerstoff-Moleküle an. Wenn der Partialdruck des Sauerstoffs angehoben wird, wird ein Plateau angenähert, bei dem jedes der Hämoglobin-Moleküle gesättigt ist und welches die obere Grenze von vier Sauerstoff-Molekülen enthält.
Die irreversible Bindung des Sauerstoffs durch Hämoglobin wird begleitet von der Freisetzung von Protonen gemäß der Gleichung: HHb⁺ + O₂ ⎕ HbO₂ + H⁺
Daher wird eine Zunahme des pH das Gleichgewicht auf die rechte Seite verschieben und bewirken, dass Hämoglobin bei einem gegebenen Partialdruck mehr Sauerstoff bindet. Eine Verringerung des pH wird die Menge an gebundenem Sauerstoff verringern.
In den Lungen beträgt der Sauerstoff-Partialdruck in den Lufträumen ungefähr 90 bis 100 mm Hg, und der pH ist ebenfalls hoch im Vergleich zum normalen Blut-pH (bis zu 7,6). Daher wird das Hämoglobin dazu neigen, in den Lungen fast maximal mit Sauerstoff gesättigt zu werden. Bei diesem Druck und pH ist Hämoglobin ungefähr zu 98 Prozent mit Sauerstoff gesättigt. Andererseits beträgt der Sauerstoff-Partialdruck in den Kapillaren im Inneren der peripheren Gewebe nur etwa 25 bis 40 mm Hg und der pH ist ebenfalls relativ niedrig (etwa 7,2 bis 7,3). Da Muskelzellen Sauerstoff mit einer hohen Geschwindigkeit verwenden, wodurch die lokale Konzentration des Sauerstoffs verringert wird, ist die Freisetzung von einem Teil des gebundenen Sauerstoffs an das Gewebe bevorzugt. Während das Blut durch die Kapillaren in den Muskel strömt, wird Sauerstoff von dem nahezu gesättigten Hämoglobin in den roten Blutzellen in das Blutplasma freigesetzt und danach in die Muskelzellen. Hämoglobin wird etwa ein Drittel seines gebundenen Sauerstoffs freisetzen wenn es durch die Muskel-Kapillaren strömt, so dass wenn es den Muskel verlässt, es nur zu etwa 64 Prozent gesättigt sein wird. Im allgemeinen schwankt der Hämoglobin im venösen Blut, welches das Gewebe verlässt, zwischen etwa 65 und 97 Prozent Sättigung mit Sauerstoff bei seinen wiederholten Kreisläufen zwischen den Lungen und den peripheren Geweben. Daher wirken der Sauerstoff-Partialdruck und der pH zusammen, um die Freisetzung des Sauerstoffs vom Hämoglobin zu beeinflussen.
Ein dritter wichtiger Faktor bei der Regulierung des Oxygenierungsgrades des Hämoglobins stellt der allosterische Effektor 2,3-Diphosphoglycerat (DPG) dar. DPG stellt den normalen physiologischen Effektor des Hämoglobins in Säugetier-Erythrozyten dar. DPG reguliert die Sauerstoff-Bindungsaffinität des Hämoglobins in den roten Blutzellen im Verhältnis zum Sauerstoff-Partialdruck in den Lungen. Je höher die Konzentrationen an DPG in der Zelle, umso niedriger ist die Affinität des Hämoglobins für Sauerstoff.
Wenn die Lieferung des Sauerstoffs an die Gewebe chronisch verringert ist, ist die Konzentrationen an DPG in den Erythrozyten höher als in normalen Individuen. Z. B. ist in großen Höhen der Sauerstoff partialdruck signifikant niedriger. Entsprechend ist der Sauerstoffpartialdruck in den Geweben niedriger. Innerhalb weniger Stunden nachdem ein normales menschliches Subjekt sich in eine größere Höhen begibt, steigt der DPG-Level in den roten Blutzellen an, was dazu führt, dass mehr DPG gebunden wird, und dass die Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins abnimmt. Anstiege des DPG-Levels von roten Blutzellen treten ebenfalls bei Patienten auf, welch an Hypoxie leiden. Diese Anpassung erlaubt dem Hämoglobin, seinen gebundenen Sauerstoff leichter an die Gewebe abzugeben, um die verringerte Oxygenierung des Hämoglobins in den Lungen auszugleichen. Die umgekehrte Veränderung tritt auf, wenn Leute sich an große Höhen gewöhnt haben und auf niedere Höhen hinabsteigen.
Da es normalerweise vom Blut isoliert ist, enthält Hämoglobin eine beträchtliche Menge an DPG. Wenn Hämoglobin von seinem DPG "befreit" ist, zeigt es eine viel höhere Affinität für Sauerstoff. Wenn DPG ansteigt, nimmt die Sauerstoff-Bindungsaffinität des Hämoglobins ab. Ein physiologischer allosterischer Effektor wie DPG ist daher wesentlich für die normale Freisetzung des Sauerstoffs aus Hämoglobin in den Geweben.
Während DPG den normalen physiologischen Effektor des Hämoglobins in roten Blutzellen von Säugetieren darstellt, wurde herausgefunden, dass phosphorylierte Inositole die gleiche Rolle bei den Erythrozyten von einigen Vögeln und Reptilien spielen. Z. B. kann DPG durch Inositolhexaphosphat (IHP) ersetzt werden, welches sogar noch potenter als DPG bei der Verringerung der Sauerstoff-Affinität des Hämoglobins ist. Obwohl IHP nicht in der Lage ist, die Erythrozyten-Membran von Säugetieren zu passieren, ist es in der Lage, sich mit dem Hämoglobin der roten Blutzellen von Säugetieren an den Bindungsstellen des DPG zu verbinden, um die allosterische Konfirmation des Hämoglobins zu modifizieren, was bewirkt, dass die Affinität des Hämoglobins für Sauerstoff verringert wird. IHP besitzt eine 1000-fach höhere Affinität zu Hämoglobin als DPG (R. E. Benesch et al., Biochemistry, Vol. 16, Seiten 2594–2597 (1977)) und steigert den P50 des Hämoglobins bis auf Werte von 96,4 mm Hg bei pH 7,4 und 37 Grad C (J. Biol. Chem., Vol. 250, Seiten 7093–7098 (1975)).
Die Sauerstoff-Freisetzungskapazität von roten Blutzellen von Säugetieren kann verstärkt werden durch Einbringung bestimmter allosterischer Effektoren des Hämoglobins in die Erythrozyten, wobei die Affinität des Hämoglobins gegenüber Sauerstoff verringert und die Sauerstoffökonomie des Blutes verbessert wird. Dieses Phänomen regt verschiedene medizinische Anwendungen zur Behandlung von Individuen an, welche eine verringerte Oxygenierung ihrer Gewebe auf Grund der unzureichenden Funktion ihrer Lungen oder ihres Blutkreislaufsystems erfahren.
Auf Grund des potenziell zu erreichenden medizinischen Nutzens der Verwendung dieser modifizierten Erythrozyten, wurden im Stand der Technik verschiedene Techniken entwickelt, um die Verkapselung von allosterischen Effektoren des Hämoglobins in Erythrozyten zu ermöglichen. Entsprechend wurde eine Vielzahl von Vorrichtungen entworfen, um das Verkapselungsverfahren zu unterstützen oder zu vereinfachen. Die aus dem Stand der Technik bekannten Verkapselungsverfahren schließen osmotischen Puls (Schwellen) und Rekonstitution der Zellen, kontrollierte Lyse und Versiegelung, Einbringung von Liposomen und Elektroporation ein. Aktuelle Verfahren zur Elektroporation machen die Verfahrensweise kommerziell unpraktisch für einen Umfang, der zur kommerziellen Verwendung geeignet ist.
Die folgenden Quellen beschreiben die Einbringung von Polyphosphaten in rote Blutzellen mittels Wechselwirkung von mit IHP beladenen Liposomen: Gersonde et al., "Modifikation der Sauerstoffaffinität von intrazellulärem Hämoglobin durch in Inkorporierung von Polyphosphaten in intakte rote Blutzellen und verstärkte O₂-Freisetzung im kapillären System", Biblthca. Haemat., No. 46, S. 81–92 (1980); Gersonde et al., "Verstärkung der O₂-Freisetzungskapazität und des Bohr-Effektes von menschlichen roten Blutzellen nach Inkorporierung von Inositolhexaphosphat mittels Verschmelzen mit Effektor-enthaltenden Lipid-Vesikeln", Ursprünge der kooperativen Bindung von Hämoglobin, (1982); und Weiner "Rechtsverschiebung der Hb-O₂-Dissoziation in lebensfähigen roten Zellen mittels liposomaler Technik", Biology of the Cell, Vol. 47, (1983).
Zusätzlich beschreiben US Patent Nr. 4,192,869, 4,321,259 und 4,473,563 von Nicolau et al. ein Verfahren wodurch flüssigkeitsbeladene Lipid-Vesikel mit Erythrozyten-Membranen verschmolzen werden, unter Abscheidung ihrer Inhalte in die roten Blutzellen. Auf diese Weise ist es möglich, allosterische Effektoren wie Inositolhexaphosphat in Erythrozyten zu transportieren, wo auf Grund ihrer viel höheren Bindungskonstante IHP DPG an seinen Bindungsstellen im Hämoglobin ersetzt.
Gemäß der Liposom-Technik wird IHP in einem Phosphat-Puffer gelöst, bis die Lösung gesättigt ist, und eine Mischung von Lipid-Vesikeln wird in der Lösung suspendiert. Die Suspension wird anschließend einer Ultraschall-Behandlung oder einem Injektionsverfahren unterworfen und danach zentrifugiert. Die obere Suspension enthält kleine Lipid-Vesikel, die IHP enthalten, welche daraufhin gesammelt werden. Zu der gesammelten Suspension werden Erythrozyten zugegeben und inkubiert, wobei während dieser Zeit die Lipid-Vesikeln, die IHP enthalten, mit den Zellmembranen der Erythrozyten verschmelzen, wodurch sie ihre Inhalte in das Innere des Erythrozyten abscheiden. Die modifizierten Erythrozyten werden anschließend gewaschen und dem Plasma zugesetzt, um das Produkt zu vervollständigen.
Die mit der liposomalen Technik assoziierten Nachteile schließen eine schlechte Reproduzierbarkeit der in die roten Blutzellen eingebrachten IHP-Konzentrationen und eine der Behandlung folgende signifikante Hämolyse der roten Blutzellen ein. Zusätzlich ist eine Kommerzialisierung nicht praktisch, da die Vorgehensweise langwierig und kompliziert ist.
Bei einem Versuch, die mit der liposomalen Technik verbundenen Nachteile zu lösen, wurde ein Verfahren der Lyse und des wieder Verschließens von roten Blutzellen entwickelt. Dieses Verfahren wird in der folgenden Publikationen beschrieben: Nicolau, et al., "Einbringung von allosterischen Effektoren des Hämoglobins in rote Blutzellen. Physiologische Wirkungen", Biblthca. Haemat., Nr. 51, S. 92–107, (1985). Damit zusammenhängende US Patente Nr. 4,752,586 und 4,652,449 von Ropars, et al., beschreiben ebenfalls ein Verfahren zur Verkapselung von Substanzen mit biologischer Aktivität in menschlichen oder tierischen Erythrozyten mittels kontrollierter Lyse und Wiederverschließen der Erythrozyten, was die RBC-Liposom-Wechselwirkungen vermeidet.
Die Technik ist am besten charakterisiert als ein kontinuierliches Fluss-Dialyse-System, welches in einer ähnlichen Weise wie die osmotische Puls-Technik funktioniert. Insbesondere wird die erste Kammer von mindestens einem Dialyse-Element kontinuierlich mit einer wässrigen Suspension von Erythrozyten versorgt, während die zweite Kammer des Dialyse-Elementes eine wässrige Lösung enthält, welche im Hinblick auf die Erythrozyten-Suspension hypotonisch ist. Die hypotonische Lösung ruft bei den Erythrozyten Lyse hervor. Das Erythrozyten-Lysat wird anschließend mit der biologisch aktiven Substanzen in Kontakt gebracht, um in den Erythrozyten eingebracht zu werden. Um die Membranen der Erythrozyten wieder zu verschließen, wird der osmotische und/oder onkotische Druck des Erythrozyten-Lysates angehoben und die Suspension der wieder verschlossenen Erythrozyten wird zurückgewonnen.
In damit zusammenhängenden US Patenten Nr. 4,874,690 und 5,043,261 von Goodrich et al., ist eine damit zusammenhängende Technik offenbart, welche auf dem Lyophilisieren und der Rekonstitution von roten Blutzellen beruht. Als ein Teil des Verfahrens der Rekonstitution der roten Blutzellen ist die Zugabe verschiedener Polyanionen, einschließlich Inositolhexaphosphat beschrieben. Die Behandlung von roten Blutzellen gemäß dem offenbarten Verfahren resultiert in einer Zelle mit einer unbeeinflussten Aktivität. Vermutlich wird das IHP während des Rekonstitutionsverfahrens in die Zelle eingebracht, wodurch die Aktivität des Hämoglobins beibehalten wird.
In US Patenten Nr. 4,478,824 und 4,931,276 von Franco et al., wird einen zweites, damit zusammenhängendes Verfahren und eine Vorrichtung zur wirksamen Einbringung nicht-ionischer Mittel, einschließlich Inositolhexaphosphat, in rote Blutzellen von Säugetieren mittels wirksamer Lyse und wieder Verschließen der Zellen beschrieben. Das Verfahren wird beschrieben als die "osmotische Puls-Technik". Bei dem Praktizieren der osmotischen Puls-Technik wird ein Vorrat an gepackten roten Blutzellen in einer Lösung suspendiert und inkubiert, welche eine Verbindung enthält, die schnell in die Zellen hinein und aus den Zellen heraus diffundiert, wobei die Konzentration der Verbindung ausreichend ist, um deren Diffusion in die Zellen hervorzurufen, so dass der Gehalt der Zellen hypertonisch wird. Anschließend wird ein ionischer trans-Membran-Gradient erzeugt durch Lösen der die hypertonischen Zellen enthaltenden Lösung mit einem im wesentlichen isotonischen wässrigen Medium in der Gegenwart von zumindest einem Mittel, von dem gewünscht wird, dass es eingebracht wird, wodurch eine Diffusion von Wasser in die Zellen mit einem entsprechenden Schwellen und ein Ansteigen bei der Permeabilität der äußeren Membranen der Zellen hervorgerufen wird. Dieser "osmotische Puls" ruft die Diffusion von Wasser in die Zellen hervor und ein resultierendes Anschwellen der Zellen, welches die Permeabilität der äußeren Zellmembran für das gewünschte Mittel anhebt. Der Anstieg der Permeabilität der Membranen wird beibehalten für einen Zeitraum, der ausreichend ist, um nur den Transport zumindest eines Mittels in die Zellen und die Diffusion der Verbindung aus den Zellen heraus zu erlauben.
Polyanionen, welche bei dem Praktizieren der osmotischen Puls-Technik verwendet werden können, schließen Pyrophosphat, Tripolyphosphat, phosphorylierte Inositole, 2,3-Diphosphoglycerat (DPG), Adenosintriphosphat, Heparin und Polycarbonsäuren, welche wasserlöslich und gegenüber der äußeren Lipid-Doppelschicht-Membranen der roten Blutzellen nicht disruptiv sind.
Die osmotische Puls-Technik weist mehrere Unzulänglichkeiten auf, einschließlich einer geringeren Ausbeute der Verkapselung, unvollständigem Wiederherstellen, Verlust an Zellgehalt und eine entsprechende Abnahme der Lebenszeit der Zellen. Die Technik ist langwierig, kompliziert und ungeeignet für Automatisierung. Aus diesen Gründen besitzt die osmotische Puls-Technik nur einen geringen kommerziellen Erfolg.
Ein weiteres Verfahren zur Verkapselung verschiedener biologisch aktiver Substanzen in Erythrozyten stellt die Elektroporation dar. Elektroporation wurde zur Verkapselung von fremden Molekülen in verschiedenen Zellen-Arten, einschließlich IHP rote Blutzellen verwendet, wie in Mouneimne et al., "Durch Verkapselung von Inositolhexaphosphat in roten Blutzellen unter Verwendung von Elektroporation hervorgerufene stabile Rechtsverschiebungen der Oxyhämoglobin-Dissoziationskurve", FEBS, Vol. 275, Nr. 1, 2, Seiten 117–120 (1990) beschrieben.
Das Verfahren der Elektroporation beruht auf der Bildung von Poren in den Zellmembranen, oder in allen Vesikeln, mittels Anlegen elektrischer Feldpulse an flüssige Zelle-Suspension, welche die Zellen oder Vesikel enthalten. Während des Porationsverfahrens werden die Zellen in einem flüssigen Medium suspendiert und anschließend einem elektrischen Feldpuls unterworfen. Das Medium kann ein Elektrolyt, ein nicht-Elektrolyt oder eine Mischung aus Elektrolyten und nicht-Elektrolyten sein. Die Stärke des an die Suspension angelegten elektrischen Feldes und die Länge des Pulses (die Zeit, während der das elektrische Feld an einer Zell-Suspension angelegt ist) variiert gemäß der Zell-Art. Um eine Pore in der äußeren Membran einer Zelle zu erzeugen, muss das elektrische Feld für eine derartige Zeitdauer angelegt werden und bei einer derartigen Spannung, dass über die Zell-Membran für einen Zeitraum, der lang genug ist, um eine Pore zu erzeugen, ein vorgegebenes Potential hervorgerufen wird.
Vier Phänomene scheinen eine Rolle bei dem Verfahren der Elektroporation zu spielen. Das erste stellt das Phänomen des dielektrischen Durchschlags dar. Dielektrischer Durchschlag bezieht sich auf die Fähigkeit eines starken elektrischen Feldes, eine kleine Pore oder ein Loch in einer Zellmembran zu erzeugen. Wenn einmal eine Pore erzeugt ist, kann eine Zelle mit biologisch aktiven Substanzen beladen werden. Das zweite Phänomen stellt die dielektrische Bündelungswirkung dar, welche sich auf die durch das Platzieren von Vesikeln in einem einheitlichen elektrischen Feld hervorgerufene wechselseitige Selbstanziehung bezieht. Das dritte Phänomen ist das der Vesikelverschmelzung. Vesikelverschmelzung bezieht sich auf die Tendenz von Membranen biologischer Vesikel, welche durch dielektrischen Durchschlag ausgebildete Poren aufwiesen, sich miteinander an ihren wechselseitigen dielektrischen Durchschlagsstellen zu verbinden, wenn sie sich in großer Nähe befinden. Das vierte Phänomen stellt die Tendenz von Zellen dar, sich in der Gegenwart hochfrequenter elektrischer Felder in einer Linie entlang einer ihrer Achsen aufzustellen. Daher bezieht sich Elektroporation auf die Verwendung bei Vesikel-Rotationsvorausrichtung, Vesikel-Bündelung und Dielektrizitätskonstante oder Vesikel zum Zweck der Beladung und Entladung der Zell-Vesikel.
Elektroporation wurde erfolgreich zur Einbringung allosterischer Effektoren von Hämoglobin in Erythrozyten angewandt. In einem Artikel von Mouneimne, Y et al., "Durch Verkapselung von Inositolhexaphosphat in roten Blutzellen unter Verwendung von Elektroporation hervorgerufene stabile Rechtsverschiebungen der Oxyhämoglobin-Dissoziationskonstante", FEBS, Vol. 275, Nr. 1, 2, Seiten 11–120. Mounheimne und seine Kollegen berichteten, dass Rechtsverschiebungen der Hämoglobin-Sauerstoffdissoziation in behandelten Erythrozyten, welche eingebrachtes IHP aufweisen, erzielt werden können. Messungen 24 und 48 Stunden nach Beladung mit IHP zeigten einen stabilen P 50-Wert, welcher anzeigte, dass das Wiederverschließen der Erythrozyten dauerhaft war. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass mit Inositolhexaphosphat beladene rote Blutzellen eine normale Halbwertszeit von elf Tagen aufweisen. Die von Mounheimne und seinen Kollegen erhaltenen Ergebnisse zeigen jedoch, dass ungefähr 20% der retransfundierten Zellen innerhalb der ersten 24 Stunden der Transfusion verloren gingen.
Die im Stand der Technik offenbarten Elektroporationsverfahren sind weder geeignet zur Verarbeitung großer Probenvolumen noch zur Verwendung einer hohen oder wiederholten elektrischen Ladung. Darüber hinaus sind die Verfahren nicht geeignet zur Verwendung in einer kontinuierlichen oder "Fluss"-Elektroporationskammer. Verfügbare Elektroporationskammern sind nur zur statischen Verwendung konstruiert. Nämlich zur chargenweisen Verarbeitung von Proben. Eine kontinuierliche Verwendung einer "statischen" Kammer resultiert in einem Überhitzen der Kammer und verstärkter Zell-Lyse. Darüber hinaus ist die existierende Technologie nicht in der Lage, eine ausreichende Mengen von IHP in einem ausreichenden prozentualen Anteil der zu verarbeitenden Zellen einzubringen, um die Sauerstofftragfähigkeit des Blutes dramatisch zu verändern. Darüber hinaus erfordern die Verfahren des Standes der Technik eine umständliche Ausrüstung und sind nicht geeignet zur Beladung von roten Blutzellen bei einem Patienten vor Ort. Daher ist das Verfahren zeitintensiv und nicht geeignet zur Verwendung in einem kommerziellen Maßstab. Was benötigt wird ist ein einfaches, effizientes und schnelles Verfahren zur Verkapselung biologisch aktiver Substanzen in Erythrozyten unter Erhaltung der Integrität und der biologische Funktion der Zellen. Die potenziellen therapeutischen Anwendungen von biologisch veränderten Blutzellen lassen auf einen Bedarf an einfacheren und effizienteren sowie vollständigeren Verfahren zur Verkapselung von biologisch aktiven Substanzen schließen, einschließlich allosterischer Effektoren des Hämoglobins in intakten Erythrozyten. Es gibt eine Vielzahl von klinischen Zuständen, die von Behandlungen profitieren würden, welche den Gewebetransport von an Hämoglobin gebundenem Sauerstoff steigerten. Z. B. stellt die führende Todesursache in den Vereinigten Staaten heutzutage eine kardiovaskuläre Krankheit dar. Die akuten Symptome und die Pathologie vieler kardiovaskulärer Krankheiten, einschließlich kongestivem Herzversagen, Myokardinfarkt, Schlaganfall, intermittierendes Hinken und Sichelzellanämie resultieren von einer unzureichenden Sauerstoffversorgung in Flüssigkeiten, die die Gewebe versorgen. Ebenso resultiert der akute Blutverlust, der einer Hämorrhagie, einer traumatischen Verletzung oder einer Operation folgt in einer verringerten Sauerstofflieferung an die lebenswichtigen Organe. Ohne Sauerstoff können Gewebe an Stellen, die vom Herz weit entfernt liegen und sogar das Herz selber nicht genug Energie produzieren, um ihre normalen Funktionen aufrechtzuerhalten. Das Ergebnis eines Sauerstoffentzugs ist Gewebetod und Organversagen.
Obwohl die Aufmerksamkeit der amerikanischen Öffentlichkeit lange auf präventive Maßnahmen, die erforderlich sind, um Herzkrankheiten zu mildern, wie körperliche Bewegung, geeignete Ernährungsgewohnheiten und Mäßigung beim Alkoholkonsum, gerichtet waren, traten weiterhin Todesfälle in einer alarmierenden Rate auf. Da der Tod sich von einem Sauerstoffentzug ergab, welcher wiederum in der Zerstörung von Gewebe und/oder einer Funktionsstörung des Organs resultierte, besteht ein Ansatz zur Milderung der lebensbedrohenden Konsequenzen einer kardiovaskulären Krankheit darin, die Oxygenierung der Gewebe während akuter Belastung zu steigern. Derselbe Ansatz ist ebenfalls geeignet für Personen, die an Blutverlust oder chronisch hypoxischen Krankheiten wie kongestivem Herzversagen leiden.
Ein weiterer Zustand, der von einem Anstieg der Lieferung von Sauerstoff zu den Geweben profitieren könnte, ist Anämie. Ein signifikanter Anteil von Krankenhauspatienten erfährt eine Anämie oder einen niedrigen "Krit", der durch eine unzureichende Menge an roten Blutzellen oder Hämoglobin in ihrem Blut hervorgerufen wurde. Dies führt zu einer unzulänglichen Oxygenierung ihrer Gewebe und nachfolgenden Komplikationen. Typischerweise kann ein Arzt diesen Zustand zeitweise durch Transfusion der Patienten mit Einheiten von gepackten roten Blutzellen korrigieren.
Verstärkte Blutoxygenierung kann ebenfalls die Anzahl an heterologen Transfusionen verringern und in vielen Fällen die Verwendung von autologen Transfusionen erlauben. Das gängige Verfahren zur Behandlung von Anämie oder Ersatz von Blutverlust besteht in der Transfusion von menschlichem Vollblut. Es wird geschätzt, dass drei bis vier Millionen Patienten in den USA jedes Jahr auf Grund chirurgischer oder medizinischer Erfordernisse Transfusionen erhalten. In Situationen, in denen mehr Zeit zur Verfügung steht, ist es vorteilhaft, die Verwendung von Spender- oder heterologem Blut vollständig zu vermeiden und stattdessen autologes Blut zu verwenden.
Oft begrenzt die Menge an Blut, welches vor einer Operation entnommen und aufbewahrt werden kann, die Verwendung von autologem Blut. Typischerweise hat ein zu operierender Patient nicht genug Zeit, um eine ausreichende Menge an Blut vor der Operation zu spenden. Ein Chirurg hätte gerne mehrere Einheiten an Blut verfügbar. Da jede Einheit einen Zeitraum von mehreren Wochen zwischen den Spenden erfordert und nicht weniger als zwei Wochen vor der Operation erfolgen kann, ist es oft unmöglich, einen ausreichenden Vorrat an Blut zu isolieren. Durch Behandlung von autologem Blut mit IHP ist weniger Blut erforderlich, und es wird möglich, die Transfusion von heterologem Blut vollständig zu vermeiden.
Da mit IHP behandelte rote Zellen 2–3 mal mehr Sauerstoff transportieren als nicht behandelte rote Zellen, wird ein Arzt in vielen Fällen weniger Einheiten von IHP behandelten roten Zellen transfundieren müssen. Dies setzt den Patienten weniger heterologem Blut aus, verringert das Ausmaß, viralen Krankheiten von Blutspendern ausgesetzt zu sein, und minimiert die Störungen der Immunfunktion, die Transfusionen begleiten. Die Fähigkeit, wirksamere rote Blutzellen zu injizieren ist ebenfalls vorteilhaft, wenn das Blutvolumen des Patienten übermäßig ist. In anderen, schwereren Fällen, in denen der Sauerstofftransport versagt, ist die Fähigkeit, schnell die Gewebeoxygenierung eines Patienten zu verbessern lebensrettend.
Obwohl es offensichtlich ist, dass Verfahren zur Verstärkung des Sauerstofftransportes zu Geweben potenzielle medizinische Anwendungen besitzen, gibt es gegenwärtig keine klinisch verfügbaren Verfahren zur Steigerung des Gewebetransportes von an Hämoglobin gebundenem Sauerstoff. Es wurden vorübergehende, 6 bis 12 stündige Anhebungen der Sauerstoffablagerung in Tierversuchen unter Verwendung entweder von DPG oder Molekülen, die Vorläufer von DPG darstellen, beschrieben. Die natürliche Regulierung der DPG-Synthese in vivo und seine relativ kurze biologische Halbwertszeit beschränken jedoch die DPG-Konzentration und die Dauer des gestiegenen Gewebe-PO₂ und schränken daher dessen therapeutische Nützlichkeit ein.
Wie darüber hinaus in Genetic Engineering News, Vol. 12, Nr. 6, 15. April 1992 berichtet, versuchen verschiedene Gruppen, freien Sauerstoff tragendes Hämoglobin als einen Ersatz für menschliches Blut in die Wege zu leiten. Rekombinantes, genetisch modifiziertes menschliches Hämoglobin, das im Körper nicht zerfällt und welches schnell bis zu 30% seines gebundenen Sauerstoffs freisetzt, wird gegenwärtig von Somatogen, Inc., aus Boulder Colorado getestet. Während dieses Produkt nützlich sein könnte als Ersatz für Blutverlust bei einer traumatischen Verletzung oder Operation, wäre es nicht effektiv zur Steigerung der PO₂-Level in ischämischem Gewebe, da dessen Sauerstofffreisetzungskapazität gleich der von natürlichem Hämoglobin (27–30%) ist. Wie alle rekombinanten Produkte wird dieses synthetische Hämoglobin wahrscheinlich ebenfalls ein teures Therapeutikum sein.
Synthetisches, menschliches Hämoglobin wurde ebenfalls in neugeborenen Schweinen mittels Injektion von menschlichen Genen, die die Hämoglobin-Produktion kontrollieren, hergestellt. Dies kann ein weniger teures Produkt darstellen als das synthetische Somatogen Hämoglobin, aber Probleme im Zusammenhang mit der Sauerstoffaffinität und dem Zerfall des Hämoglobins im Körper werden durch dieses Verfahren nicht gelöst.
Was benötigt wird, ist ein einfaches, effizientes und schnelles Verfahren zur Verkapselung biologisch aktiver Substanzen, wie IHP, in Erythrozyten ohne Beschädigung der Erythrozyten.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Verkapselung biologisch aktiver Substanzen in verschiedenen Zellpopulationen gemäß Anspruch 7 beziehungsweise Anspruch 1. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung eine automatisierte, abgeschlossene, Fluss-Vorrichtung zur Verkapselung allosterischer Effektoren, wie Inositolhexaphosphat, in roten Blutzellen bereit, wodurch die Affinität des Hämoglobins für Sauerstoff verringert und der Transport von Sauerstoff mittels roter Blutzellen zu den Geweben verstärkt wird. Die Verkapselung wird durch Elektroporation erzielt. Das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung sind genauso geeignet zur Verkapselung von vielfältigen biologisch aktiven Substanzen in verschiedenen Zellpopulationen.
Die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung sind geeignet zur Einbringung einer Vielfalt an biologisch aktiven Substanzen in Zellen und Lipid-Vesikeln. Das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung können verwendet werden zur Einbringung einer Verbindung oder einer biologisch aktiven Substanzen in ein Vesikel, ob das Vesikel konstruiert wird oder natürlich auftritt. Z. B. können die Vorrichtung und das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden zur Einbringung von IHP in Erythrozyten.
Die Verkapselung von Inositolhexaphosphat in roten Blutzellen mittels Elektroporation gemäß der vorliegenden Erfindung resultiert in einer signifikanten Verringerung der Hämoglobinaffinität für Sauerstoff, ohne die Lebensdauer, die ATP-Level, die K⁺ Level oder die normale rheologische Kompetenz der Zellen zu beeinflussen. Darüber hinaus wird der Bohr-Effekt nicht verändert, abgesehen von der Verschiebung der O₂-Bindungskurve nach rechts. Eine Verringerung der Sauerstoffaffinität der Erythrozyten steigert die Fähigkeit der Erythrozyten, den gebundenen Sauerstoff abzutrennen und verbessert dadurch die Sauerstoffversorgung der Gewebe. Eine Verstärkung der Sauerstofffreisetzungskapazität der Erythrozyten bewirkt signifikante physiologische Effekte wie eine Verringerung der Herzleistung, einen Anstieg der arteriovenösen Unterschiede und eine verbesserte Gewebeoxygenierung.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten modifizierten Erythrozyten, welche verbesserte Sauerstofffreisetzungskapazitäten besitzen, können ihre Anwendung in Situationen wie jenen, die unten verdeutlicht sind, finden:

1. Unter Bedingungen eines niedrigen Sauerstoff-Partialdrucks, wie in hohen Höhen;
2. Wenn die Sauerstoff-Austauschfläche der Lunge verringert ist, wie es in Emphysemen auftritt;
3. Wenn ein gesteigerter Widerstand gegenüber Sauerstoffdiffusion in der Lunge vorliegt, wie es bei Pneumonien oder Asthma auftritt;
4. Wenn es eine Abnahme der Sauerstoff-Transportkapazität der Erythrozyten gibt, wie es bei Erythropenie oder Anämie auftritt, oder wenn ein arteriovenöser Shunt verwendet wird;
5. Um Störungen der Blutzirkulation zu behandeln, wie Arteriosklerose, thromboembolische Prozesse, Organinfarkt oder Ischämie;
6. Um Zustände hoher Sauerstoffaffinität des Hämoglobins zu behandeln, wie Hämoglobinmutationen, chemische Modifikationen der N-terminalen Aminosäuren in den Hämoglobin-Ketten oder Enzym-Defekte in Erythrozyten;
7. Um Entgiftungsprozesse durch Verbesserung der Sauerstoffversorgung zu beschleunigen;
8. Um die Sauerstoffaffinität von konserviertem Blut zu verringern; oder
9. Um die Wirksamkeit verschiedener Krebsbehandlungen zu verbessern.

Gemäß dem Verfahren und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ist es möglich, modifizierte Erythrozyten herzustellen, welche zu einer verbesserten Sauerstoffökonomie des Blutes beitragen. Diese modifizierten Erythrozyten werden erhalten durch Einbringung von allosterischen Effektoren, wie IHP, mittels Elektroporation der Erythrozytenmembranen.
Die Einbringung der biologisch aktiven Substanzen in die Zelle gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung, einschließlich der Verkapselung allosterischer Effektoren des Hämoglobins in Erythrozyten, wird außerhalb des Körpers über eine automatisierte, Fluss-Elektroporationsvorrichtung durchgeführt. Kurz gesagt wird eine Zellsuspension in die Trennungs- und Waschkammer der Fluss-Verkapselungsvorrichtung eingebracht. Die Zellen werden von der Suspension getrennt, gewaschen und in einer Lösung der in die Zelle einzubringenden biologisch aktiven Substanz resuspendiert. Diese Suspension wird in die Elektroporationskammer eingebracht und anschließend inkubiert. Nach der Elektroporation und Inkubation werden die Zellen gewaschen und getrennt. Optional wird eine Überprüfung der Kontamination durchgeführt, um zu bestätigen, dass jedwede nicht verkapselte biologisch aktive Substanz entfernt wurde. Anschließend werden die Zellen zur Lagerung oder Wiedereinführung in einen Patienten vorbereitet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung und unter Bezugnahme auf die bevorzugte Ausführungsform wird einem Patienten Blut entnommen, die Erythrozyten werden von dem entnommenen Blut getrennt, die Erythrozyten werden durch Einbringung von allosterischen Effektoren modifiziert und die modifizierten Erythrozyten und das Blutplasma werden rekonstituiert. Auf diese Weise ist es möglich, Blut, welches IHP-modifizierte Erythrozyten enthält, herzustellen und aufzubewahren.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung stellt ein verbessertes Verfahren zur Verkapselung biologisch aktiver Substanzen in Zellen bereit, einschließlich einer Vorrichtung, welche abgeschlossen und daher steril ist, eine Vorrichtung, welche große Zellvolumen innerhalb einer verkürzten Zeitdauer verarbeiten kann, eine Vorrichtung, welche eine verbesserte Kontaminationsdetektion, Kühlung und Inkubationselemente aufweist, eine Vorrichtung, welche vollständig automatisiert ist und welche nicht der Beaufsichtigung eines Technikers bedarf, wenn einmal eine Probe in die Vorrichtung eingebracht ist.
Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine automatisierte, kontinuierliche Fluss-Verkapselungsvorrichtung bereitzustellen.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine automatisierte, kontinuierliche Fluss-Elektroporationsvorrichtung zur Verfügung zustellen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine kontinuierliche Fluss-Verkapselungsvorrichtung zu liefern, welche eine homogene Population beladener Zellen oder Vesikel produziert.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine kontinuierliche Fluss-Elektroporationsvorrichtung bereitzustellen, welche eine homogene Population beladener Zellen oder Vesikel produziert.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein steriles und nicht pyrogenes Verfahren zur Verkapselung biologisch aktiver Substanzen in Zellen zur Verfügung zustellen.
Es stellt ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung dar, eine Vorrichtung und ein Verfahren zu liefern, welches im Anschluss an eine Elektroporation in einer stabilen Wiederverschließung von Zellen oder Vesikeln resultiert, um die Lyse der modifizierten Zellen oder Vesikel nach der Elektroporation zu minimieren.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Fluss-Verkapselungsvorrichtung bereitzustellen, welche eine modifizierte Zellpopulation erzeugt, aus der alle exogenen, nicht verkapselten biologisch aktiven Substanzen entfernt worden sind.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Elektroporationsvorrichtung zur Verfügung zu stellen, welche eine modifizierte Zellpopulation erzeugt, aus der alle exogenen, nicht verkapselten, biologisch aktiven Substanzen entfernt worden sind.
Es stellt ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung dar, ein Verfahren und eine Vorrichtung zu liefern, welche eine kontinuierliche Verkapselung von biologisch aktiven Substanzen in einer Population von Zellen oder Vesikeln erlaubt.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren und eine Vorrichtung bereitzustellen, welche die oben definierten Ziele, Merkmale und Vorteile in einem einzigen Zyklus erzielen.
Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes und effizienteres Verfahren zur Verkapselung biologisch aktiver Substanzen in Zellen zur Verfügung zu stellen als diejenigen Verfahren, die gegenwärtig verfügbar sind.
Es stellt ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung dar, eine Population künstlicher Zellen zu liefern, welche zur medizinischen Verwendung geeignet sind.
Andere Ziele, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden offensichtlich werden beim Lesen der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung in Verbindung mit der Zeichnung und den beigefügten Ansprüchen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt ein schematisches Diagramm einer ersten Ausführungsform einer kontinuierlichen Fluss-Verkapselungsvorrichtung dar.
2 ist ein schematisches Diagramm einer zweiten Ausführungsform einer kontinuierlichen Fluss-Verkapselungsvorrichtung.
3 stellt eine Draufsicht einer ersten Ausführungsform der Fluss-Elektroporationskammer mit Elektroden dar.
4 ist eine Draufsicht einer ersten Ausführungsform der Fluss-Elektroporationskammer ohne Elektroden.
5 stellt eine Seitenansicht einer ersten Ausführungsform der Fluss-Elektroporationskammer dar.
6 ist eine rückwärtige Ansicht einer ersten Ausführungsform der Fluss-Elektroporationskammer.
7 stellt eine Seitenansicht einer Elektrode zur Verwendung bei der ersten Ausführungsform der Fluss-Elektroporationskammer dar.
8 ist eine Vorderansicht der Elektrode aus 7.
9 stellt eine perspektivische Zeichnung einer zerlegten zweiten Ausführungsform der Fluss-Elektroporationskammer dar.
10 stellt eine perspektivische Ansicht der Fluss-Elektroporationskammer aus 9 dar, in der die Kammer zusammengebaut ist.
11 ist eine grafische Darstellung, die die Wirkung verschiedener Feldstärken unter statischen oder Fluss-Bedingungen auf die % Oxygenierung der IHP-verkapselten roten Blutzellen vergleicht.
12 stellt eine Tabelle dar, die die Wirkungen verschiedener Feldstärken unter statischen oder Fluss-Bedingungen auf den P₅₀-Wert der IHP-verkapselten roten Blutzellen vergleicht.
13 stellt eine Tabelle dar, die die Überlebensraten der roten Blutzellen, welche einer Elektroporation unter statischen und Fluss-Bedingungen bei verschiedenen Feldstärken unterworfen wurden, vergleicht.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine automatisierte, abgeschlossene Fluss-Vorrichtung zur Verkapselung allosterischer Effektoren, wie Inositolhexaphosphat, in roten Blutzellen bereit. Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kombiniert die Merkmale einer Plasmaphorese-Vorrichtung mit denjenigen einer Fluss-Elektroporationsvorrichtung, um eine automatisierte, abgeschlossene Fluss-Elektroporationsvorrichtung zu bilden. Die vorliegende Erfindung umfasst des Weiteren eine neue Fluss-Elektroporationskammer, welche die Verwendung der Kammer unter Flusseher als unter statischen Bedingungen erlaubt. Es wird erwartet, dass das Verfahren und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung zur Verkapselung einer Vielzahl von biologisch aktiven Substanzen in verschiedene Zellpopulationen verwendet werden kann.
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung eine Population modifizierter Zellen bereit, welche physikalische Merkmale besitzen, die die Zellen insbesondere nützlich machen zur Behandlung von Zuständen, welche einen Anstieg des Transportes von Sauerstoff zu den Geweben erfordern oder davon profitieren. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann eine homogene Population von mit IHP beladenen roten Blutzellen erhalten werden mit einer verringerten Kontamination und einer verringerten Neigung zur Lyse im Anschluss an eine Verkapselung. Die behandelten roten Blutzellen weisen normale Lebensdauern im Kreislauf auf. Unter Verwendung der vorliegenden Erfindung können rote Blutzellen eines Patienten mit Bedarf an der Behandlung schnell beladen und dem Kreislauf des Patienten wieder zugeführt werden.
Das Betriebsverfahren der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf die bevorzugte Verwendung der Vorrichtung beschrieben, d. h. der Verkapselung von allosterischen Effektoren des Hämoglobins in rote Blutzellen. Inositolhexaphosphat stellt den bevorzugten allosterischen Effektor zur Verwendung mit der vorliegenden Erfindung dar. Andere Zuckerphosphate, wie Inositolpentaphosphat, Inositoltetraphosphat, Inositoltriphosphat, Inositoldiphosphat und Diphosphatidylinositoldiphosphat können ebenfalls verwendet werden. Andere geeignete allosterische Effektoren schließen Polyphosphate wie Nucleotidtriphosphate, Nucleotiddiphosphate, Nucleotidmonophosphate und Alkoholphosphatester ein. Im Fall bestimmter Mutationen des Hämoglobins, z B. "Zürich" Hämoglobin, können organische Anionen wie Polycarbonsäuren als allosterische Effektoren verwendet werden. Schließlich ist es möglich, anorganische Anionen wie Hexacyanoferrat, Phosphat oder Chlorid als allosterische Effektoren zu verwenden.
Rote Blutzellen, welche mit Inositolhexaphosphat gemäß der vorliegenden Erfindung beladen worden sind, können verwendet werden, um eine große Vielfalt von Krankheiten und Krankheitszuständen zu behandeln. Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten, IHP beladenen roten Blutzellen können einem Patienten verabreicht werden, der einen Herzinfarkt erleidet, wodurch der Sauerstofftransport zu dem ischämischen Herzgewebe gesteigert und gleichzeitig die Herzleistung verringert wird. Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten, IHP beladenen roten Blutzellen können ebenfalls verwendet werden, um irgendeinen ischämischen Zustand zu behandeln, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, Schlaganfall, Diabetes, Sichelzell-Krankheit, Verbrennungen, intermittierendes Hinken, Emphyseme, Hypothermie, eine periphere vaskuläre Krankheit, kongestives Herzversagen, Angina, eine vorübergehende ischämische Krankheit, eine dissiminierte intravaskuläre Gerinnung, eine posttraumatische Lungeninsuffizienz (ARDS) und zystische Fibrose. Eine detaillierte Beschreibung der medizinischen Anwendungen der gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Zusammensetzungen wird ebenfalls unten zur Verfügung gestellt.
Kontinuierliche Fluss-Verkapselungsvorrichtung
Das Betriebsverfahren der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung wird unten unter Bezugnahme auf die bevorzugte Verwendung der Vorrichtung, d. h. die Verkapselung von allosterischen Effektoren des Hämoglobins in rote Blutzellen mittels Elektroporation beschrieben. Das soll heißen, dass die Vorrichtung angepasst werden kann, um andere Zellpopulationen oder Vesikel und andere biologisch aktive Substanzen aufzunehmen. Darüber hinaus kann die Vorrichtung angepasst werden, um andere Verkapselungsverfahren als die Elektroporation anzuwenden.
Kurz gesagt wird gemäß der vorliegenden Erfindung eine Blutprobe in die kontinuierliche Fluss-Verkapselungsvorrichtung eingebracht. Wenn rote Blutzellen gesammelt werden, kann das Blut entweder direkt von einem Patienten entnommen worden sein oder es kann sich um zuvor entnommenes Blut handeln. Das Blut wird zunächst in rote Blutzellen, Plasma und weiße Blutzellen, und Abfallprodukte aufgetrennt. Die Abfallprodukte schließen das Verdünnungsmittel und verschiedene im Blut gelöste Stoffe ein, welche nach der Zentrifugation in der überstehenden Flüssigkeit verbleiben. Sie werden in einem Abfall-Reservoir innerhalb der Vorrichtung aufbewahrt. Das Blutplasma und die weißen Blutzellen werden ebenfalls in einem Reservoir innerhalb des Systems aufbewahrt, während die roten Blutzellen mit der zu verkapselnden Substanz gemischt werden. Die Suspension der roten Blutzellen wird anschließend einer Elektroporation unterworfen. Im Anschluss an die Elektroporation werden die roten Blutzellen inkubiert unter Bedingungen, die den Zellen ein Wiederverschließen erlauben. Sie werden anschließend weiterverarbeitet und gewaschen, um exogene, nicht verkapselte, biologisch aktive Substanzen zu entfernen. Wenn die Zellen verarbeitet worden sind, können die die verkapselten Substanzen enthaltenden roten Blutzellen optional wieder mit dem Blutplasma und den weißen Blutzellen rekonstituiert werden. Das wiederhergestellte Blut kann anschließend direkt an den Patienten zurückgegeben oder zur späteren Verwendung aufbewahrt werden. Obwohl als getrennte Schritte beschrieben, ist das Verfahren im wesentlichen kontinuierlich.
Eine erste Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf 1 beschrieben, welche schematisch die Struktur der kontinuierliche Fluss-Verkapselungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung verdeutlicht.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Volumen Vollblut in das Elektroporationssystem 5 an Einlass 11 eingebracht. Die Blutprobe kann optional direkt von einem Patienten in das Elektroporationssystem 5 entnommen werden, oder das Blut kann zu einem früheren Zeitpunkt entnommen und vor der Einbringung in das System 5 aufbewahrt werden. Ventil 12 wird geöffnet, um die Probe in das System 5 einzulassen. Gleichzeitig wird Ventil 25 geöffnet und Pumpe 22 angeschaltet, um ein gerinnungshemmendes Mittel aus dem Reservoir 27 für das gerinnungshemmende Mittel einzulassen. Ein geeignetes gerinnungshemmendes Mittel stellt Heparin dar, obwohl andere gerinnungshemmende Mittel verwendet werden können. Das bevorzugte gerinnungshemmende Mittel stellt ACD dar. Ventile 15 und 36 werden ebenfalls geöffnet und Pumpe 40 wird angeschaltet. Die Beimengung des gerinnungshemmenden Mittels und des Vollbluts passiert einen Filter 18 und ein Druck-Evaluierungssystem 19, welches den Fluss durch die Vorrichtung überwacht, und wird in einer Blutauftrennungs- und Waschvorrichtung 44 gesammelt, welche aktiviert wird, wenn Pumpe 40 eingeschaltet wird. Ein Sensor zeigt an, wenn die Blutauftrennungs- und Waschvorrichtung 44 mit roten Blutzellen gefüllt worden ist. Wenn sie gefüllt worden ist, wird die Blutzufuhr gestoppt. Die Schritte, die mit der Trennung der Blutkomponenten verbunden sind, können mittels einer Plasmaphorese-Vorrichtung durchgeführt werden, wie der Plasmaphorese-Vorrichtung, die von der Haemonetics Corporation (Haemonetics Corporation, Braintree, MA) hergestellt wird.
Wie oben beschrieben, wird, wenn Pumpe 40 in Richtung des Uhrzeigersinns eingeschaltet wird, die Blutauftrennungs- und Waschflasche 44 eingeschaltet und das gerinnungshemmende Mittel und die Vollblut-Suspension werden zentrifugiert, um das Plasma, die weißen Blutzellen, die roten Blutzellen und den Abfall aufzutrennen. Ventil 87 wird geöffnet, um das Plasma und die weißen Blutzellen in das Plasmareservoir 89 einzulassen.
Optional und abhängig von der mittels der Vorrichtung zu verarbeitenden Zellpopulation, werden die in der Blutauftrennungs- und Waschflasche 44 zurückbehaltenen Zellen anschließend gewaschen. Ventile 33, 15 und 36 werden geöffnet, um Kochsalz-Puffer vom Verdünnungsmittel-Reservoir 30 in die Blutauftrennungs- und Waschvorrichtung 44 einzulassen, welche die roten Blutzellen enthält. Pumpe 40 ist immer noch eingeschaltet. Die roten Blutzellen werden anschließend gewaschen und zentrifugiert. Der bevorzugte Kochsalz-Puffer stellt eine 0.9% Natriumchlorid-Lösung dar, obwohl andere physiologisch isotonische Puffer verwendet werden können, um die roten Blutzellen zu verdünnen und zu waschen. Ventil 54 wird geöffnet, um den Abfall während des Waschvorgangs in das Abfallreservoir 57 einzubringen. Der Abfall wird wieder in dem Abfallreservoir 57 aufbewahrt, und die roten Blutzellen werden in der Blutauftrennungs- und Waschvorrichtung 44 zurückbehalten. Wenn nötig wird der Waschvorgang wiederholt.
Im Anschluss an die Auftrennung der roten Blutzellen wird Pumpe 40 umgekehrt, Pumpe 22 wird ausgeschaltet, Ventil 12, 15, 33, 36, 25, 87 und 54 werden geschlossen und Ventile 97 und 64 werden geöffnet. Die IHP-Lösung wird aus dem IHP-Reservoir 50 gepumpt, während gleichzeitig die roten Blutzellen aus der Blutauftrennungs- und Waschflasche 44 in Richtung der Kühlschlange 68 gepumpt werden. Die roten Blutzellen und die IHP-Lösung werden in der Rohrleitung der Vorrichtung bei Verbindungsstelle 67 gemischt und anschließend durch die Kühlschlange 68 gepumpt. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, und wie detailliert unten erklärt, können die IHP-Lösung und die roten Blutzellen in der Auftrennungs- und Waschflasche 44 gemischt werden bevor sie in die Kühlschlange 68 eingelassen werden.
Die bevorzugte Konzentration des IHP in der Lösung beträgt ungefähr zwischen 10 mMol und 100 mMol mit einer bevorzugteren Konzentration von ungefähr 23 bis 35 mMol und einer ganz besonders bevorzugten Konzentration von 35 mMol. Die bevorzugte IHP-Lösung umfasst die folgenden Verbindungen in den folgenden Konzentrationen:
35 mMol IHP-Salz, neutralisiert mit 35 mMol IHP-Säure auf einen pH von 7,3
33 mMol K₂HPO₄
7,0 mMol NaH₂
30,6 mMol KCl
6,4 mMol NaCl
7,3 mMol Saccharose
5,0 mMol ATP
Eine zweite IHP-Lösung zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung umfasst die folgenden Verbindungen in den folgenden Konzentrationen:
23 mMol IHP-Salz, neutralisiert mit HCl auf einen pH von 7,3
40 mMol K₂HPO₄
7 mMol NaH₂
Das IHP kann erhalten werden von Sigma Chemical Company aus St. Louis, Missouri.
Der Hämatokrit der Suspension liegt vorzugsweise ungefähr zwischen 30 und 80, wobei der am meisten bevorzugte Hämatokrit ungefähr 50 beträgt. Pumpe 40 ist so konstruiert, dass sie sowohl die roten Blutzellen als auch die IHP-Lösung pumpt, und kann derart eingestellt werden, dass der Endhämatokrit bei Eintritt in die Kühlschlange 68 vorbestimmt werden kann.
Nach dem Mischen wird die rote Blutzellen-IHP-Suspension anschließend durch eine Kühlschlange 68 gepumpt. Die Kühlung kann erzielt werden mit einem Wasserbad oder mit einem thermoelektrisch basierten Kühlsystem. Kühlschlange 68 wird z. B. in ein Kühlbad in Kühlreservoir 69 eingetaucht. Wenn die rote Blutzellen-IHP-Suspension die Kühlschlange 68 durchläuft, wird die Suspension auf eine Temperatur von ungefähr zwischen 1°C und 12°C gekühlt, vorzugsweise ungefähr 4°C. Das Kühlen der roten Blutzellen stellt das Überleben der in der Zellmembran während des Elektroporationsprozesses erzeugten Pore sicher. Die Verwendung einer Kühlschlange hilft bei der Geschwindigkeit der Kühlung mittels Vergrößerung der Oberfläche der Probe, die mit dem Kühlelement in Kontakt steht. Optional kann die Kühlschlange von einer thermoelektrischen Wärmepumpe umgeben sein.
Bestimmte Anwendungen können das Erhitzen der Zellsuspension vor der Elektroporation erfordern. In solch einem Fall kann eine Heizschlange die Kühlschlange 68 ersetzen. Die von den roten Blutzellen tolerierte maximale Temperatur beträgt ungefähr 37°C.
Eine thermoelektrische Wärmepumpe arbeitet mittels Extrahieren von thermischer Energie aus einer bestimmten Region, wodurch dessen Temperatur verringert wird, und anschließend Abstoßung der thermischen Energie in eine "Hitze-Senke"-Region höherer Temperatur. An der kalten Verbindungsstelle wird Energie von Elektronen absorbiert, wenn sie von einem niedrigen Energieniveau in dem Halbleiter-Element vom p-Typ auf ein höheres Energieniveau in dem Halbleiter-Element vom n-Typ übergehen. Die Stromversorgung liefert die Energie, um die Elektronen durch das System zu bewegen. An der heißen Verbindungsstelle, wird Energie in eine Hitze-Senke ausgestrahlt, während Elektronen von einem Element mit hohem Energieniveau (n-Typ) zu einem Element mit niedrigerem Energieniveau (p-Typ) übergehen.
Thermoelektrische Elemente befinden sich in einem vollständig festen Zustand und besitzen keine sich bewegenden mechanischen Teile oder erfordern eine Arbeitsflüssigkeit, wie dies bei Dampf-Kreislauf-Vorrichtungen der Fall ist. Thermoelektrische Wärmepumpen erfüllen jedoch dieselben Kühlfunktionen wie Dampfkompressions- oder Absorptions-Kühlgeräte auf Freon-Basis. Thermoelektrische Wärmepumpen sind in hohem Maße zuverlässig, von kleiner Größe und geringer Kapazität, mit niedrigen Kosten verbunden, von geringem Gewicht, intrinsisch sicherer als viele andere Kühlvorrichtungen, und sind in der Lage, präzise die Temperatur zu kontrollieren.
Die bevorzugten thermoelektrische Wärmepumpen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung werden von MELCOR Materials Electronic Products Corp. aus Trenton, New Jersey hergestellt. Die Thermoelemente werden aus einem kristallinen Hochleistungs-Halbleiter-Material hergestellt. Das Halbleiter-Material stellt Bismuttellurid dar, eine quaternäre Legierung von Bismut, Tellur, Selen und Antimon, dotiert und verarbeitet, um orientierte polykristalline Halbleiter mit Eigenschaften zu ergeben. Die Elemente, elektrisch in Reihe und thermisch parallel geschaltet, werden in Module integriert. Die Module werden zwischen metallisierte, keramische Platten gepackt, um eine optimale elektrische Isolierung und thermische Leitfähigkeit bei hoher mechanischer Festigkeit bei Kompression zu bieten. Die Module können parallel montiert sein, um die Hitzeübertragungswirkung zu steigern, oder können in Multilagen-Kaskaden gepackt sein, um hohe Differenztemperaturen zu erzielen. Das Durchleiten von Strom durch die Wärmepumpe erzeugt eine Temperaturdifferenz durch die Thermoelemente, mit maximalen Ratings von 70°C und höher.
Nach dem Kühlen tritt die rote Blutzellen-IHP-Suspension in die Elektroporationskammer 72 ein, wo von einem Pulsgenerator 75 ein elektrischer Puls auf die rote Blutzellen-IHP-Suspension appliziert wird, was die Ausbildung von Öffnungen innerhalb der Zellmembranen der roten Blutzellen hervorruft. Optional wird ein automatisches Detektionssystem den Pulsgenerator 75 einschalten wenn die Kammer 72 mit der rote Blutzellen-IHP-Suspension gefüllt ist. Ein elektrischer Puls wird jedes mal, wenn die Kammer 72 mit unverkapselten Zellen gefüllt ist, auf die Suspension appliziert. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine Fluss-Elektroporationskammer verwendet. In einer Ausführungsform wird eine Fluss-Elektroporationskammer 72 aus klarem Polyvinylchlorid konstruiert und enthält zwei gegenüberliegende Elektroden, die mit einer Entfernung voneinander von 7 mm räumlich angeordnet sind. Der Abstand zwischen den Elektroden wird abhängig von dem Flussvolumen und der Feldstärke variieren. Vorzugsweise handelt es sich um eine Einweg-Fluss-Elektroporationskammer 72. Die Elektroporationskammer kann ebenfalls aus Polysulfon konstruiert sein, welches bevorzugt zur Verwendung bei bestimmten Sterilisationsverfahren, wie Autoklavieren, ist. Eine detaillierte Beschreibung der Struktur und Konstruktion der Fluss-Elektroporationskammer wird unten bereitgestellt.
Die rote Blutzellen-IHP-Suspension passiert zwischen den zwei Elektroden der Elektroporationskammer 72. Wenn eine Suspension von nicht behandelten Zellen in die Kammer 72 eintritt, wird ein elektrisches Feld von 1 bis 3 KV/cm erzeugt und für einen Zeitraum von 1 bis 4 Millisekunden aufrechterhalten, vorzugsweise für einen Zeitraum von 2 Millisekunden bei einer 1,8 ml Flusskammer. Vorzugsweise wird die IHP-rote Blutzellen-Suspension drei Hochspannungspulsen pro Volumen bei einer Feldstärke von ungefähr 2600 bis 3200 V/cm pro Puls unterworfen. Der Strompuls durch die Zellmembranen ruft einen elektrischen Zusammenbruch der Zellmembranen hervor, welcher Poren in den Membranen erzeugt. IHP diffundiert dann durch diese Poren in die Zelle.
Im Anschluss an die Elektroporation tritt die rote Blutzellen-IHP-Suspension in eine Inkubationskammer 78 ein, wo die Suspension bei Raumtemperatur für eine Inkubationszeit von ungefähr zwischen 15 Minuten und 120 Minuten mit der bevorzugten Inkubationszeit von 30 bis 60 Minuten inkubiert wird. Optional wird die rote Blutzellen-IHP-Suspension für ungefähr 5 Minuten bei einer Temperatur von ungefähr 37°C inkubiert, und mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die Inkubationskammer 78 kann optional von einem Heizmittel 80 umgeben sein. Das Heizmittel 80 kann z. B. ein Wasserbad oder eine thermoelektrische Wärmepumpe sein.
Optional enthält der Inkubator 78 einen Wiederverschließungspuffer, welcher bei dem Wiederverschließen und der Rekonstitution der roten Blutzellen hilft. Die bevorzugte Zusammensetzung des Wiederverschließungspuffers wird unten bereitgestellt:
Wiederverschließungspuffer
In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird kein Wiederverschließungspuffer verwendet.
Im Anschluss an die Inkubation wird Ventil 51 geöffnet und Pumpe 40 eingeschaltet und die rote Blutzellen-IHP-Suspension wird von der Inkubationskammer 78 zur Blutauftrennungs- und Waschvorrichtung 44 zurückgeführt. Der Überschuss an IHP-Lösung wird von der rote Blutzellen-Suspension mittels Zentrifugation entfernt. Die Abfall-IHP-Lösung wird zum Abfallreservoir 57 geleitet. Ventile 33, 15 und 36 werden anschließend geöffnet, um ein Volumen eines Verdünnungsmittels in die Blutauftrennungs- und Waschvorrichtung 44 einzubringen. Die rote Blutzellen-IHP-Suspension wird dann zentrifugiert und die überstehende Lösung wird durch Ventil 54 in das Abfallreservoir 57 verworfen, wobei die roten Blutzellen in der Blutauftrennungs- und Waschvorrichtung 44 belassen werden. Ein physiologische Kochsalzlösung-Puffer wird aus dem Verdünnungsmittelreservoir 30 zu den modifizierten roten Blutzellen zugegeben. Die Zellen werden gewaschen und die überstehende Lösung wird im Anschluss an eine Zentrifugation verworfen. Der Waschvorgang wird wiederholt falls erforderlich.
Optional passiert der Abfall, während er aus der Auftrennungs- und Waschvorrichtung 44 entfernt wird, einen Kontaminationsdetektor 46, um jedwedes freie IHP in der Abfalllösung zu detektieren, wodurch bestätigt wird, dass exogenes, nicht verkapseltes IHP von den modifizierten roten Blutzellen entfernt worden ist. Das Kontaminationsdetektionssystem beruht auf optischen Veränderungen in dem Waschpuffer. Nachdem die modifizierten roten Blutzellen gewaschen und zentrifugiert worden sind, passiert die überstehende Flüssigkeit den Kontaminationsdetektor 46, bevor sie in dem Abfallreservoir 57 deponiert wird. Wenn exogenes, nicht verkapseltes IHP in dem Waschpuffer verbleibt, wird die überstehende Lösung trübe. Die Trübung ist zurückzuführen auf die Reaktion des IHPs mit Kalzium, welches eine Komponente des Waschpuffers darstellt. Der Kontaminationsdetektor 46 verwendet ein optisches Detektionssystem. Vorzugsweise handelt es sich bei der Lichtquelle um einen LED und der Detektor ist eine Fotodiode. Die Spannungsdifferenz der Fotodiode wird die Menge an IHP in der Waschlösung anzeigen. Der Kontaminationsdetektor 46 optional.
Im Anschluss an das Waschen, wird das IHP-rote Blutzellen-Produkt optional mit dem Plasma und den weißen Blutzellen, welche im Reservoir 89 zurückbehalten worden waren, vereinigt. Die behandelten roten Blutzellen können in einem Reinjektionsbeutel gesammelt werden, entweder in einem Konservierungsmedium oder in dem autologen Plasma des Patienten.
Die erhaltenen IHP-beladenen roten Blutzellen können dem Patienten direkt zurückverabreicht werden oder die Zellen können zur späteren Verwendung aufbewahrt werden. Das IHP in den roten Blutzellen wird während der normalen Aufbewahrungszeit nicht freigesetzt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird unter Bezugnahme auf 2 beschrieben, welche schematisch die Struktur der kontinuierlichen Fluss-Verkapselungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung verdeutlicht. Wiederum ist das Betriebsverfahren der Vorrichtung beschrieben unter Bezugnahme auf die bevorzugte Verwendung der Vorrichtung, d. h. die Verkapselung von allosterischen Effektoren des Hämoglobins in roten Blutzellen mittels Elektroporation. Das soll heißen, dass die Vorrichtung angepasst werden kann, um andere Zellpopulationen oder Vesikel und andere biologisch aktive Substanzen aufzunehmen. Darüber hinaus kann die Vorrichtung angepasst werden, um andere Verkapselungsverfahren einzuschließen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine Probe Vollblut beim Einlass 11 in das Elektroporationssystem 10 eingebracht. Ventil 12 wird geöffnet, um die Probe in das System 10 einzulassen. Gleichzeitig wird Ventil 25 geöffnet und Pumpe 22 wird eingeschaltet, um ein gerinnungshemmendes Mittel aus dem Reservoir für das gerinnungshemmende Mittel 27 einzulassen. Ventile 15 und 36 werden ebenfalls geöffnet und Pumpe 40 wird eingeschaltet.
Die Mischung des gerinnungshemmenden Mittels und des Vollbluts passiert einen Filter 18 und ein Druckevaluierungssystem 19 und wird in einer Blutauftrennungs- und Waschvorrichtung 44 gesammelt, welche aktiviert wird wenn Pumpe 40 eingeschaltet wird. Ein Sensor zeigt an, wenn die Blutauftrennungs- und Waschvorichtung 44 mit roten Blutzellen gefüllt worden ist.
Wenn die Pumpe 40 in Richtung des Uhrzeigersinns eingeschaltet wird, wird die Blutauftrennungs- und Waschvorrichtung 44 eingeschaltet und das gerinnungshemmende Mittel und die Vollblut-Suspension werden zentrifugiert, um das Plasma, die weißen Blutzellen, die roten Blutzellen und den Abfall aufzutrennen. Ventil 87 wird geöffnet, um das Plasma und die weißen Blutzellen in das Plasmareservoir 89 einzulassen.
Optional werden die Zellen in der Auftrennungs- und Waschvorrichtung 44 zurückbehalten und anschließend gewaschen und zentrifugiert. Ventile 33, 35, 15 und 36 werden geöffnet, um einen physiologische Kochsalzlösung-Puffer von dem Verdünnungsmittelreservoir 30 in die Blutauftrennungs- und Waschvorrichtung 44, welche die roten Blutzellen enthält, einzulassen. Ventil 12 wird geschlossen und Pumpe 40 bleibt eingeschaltet.
Während des Waschens wird Ventil 54 geöffnet, um den Abfall während des Waschvorganges in das Abfallreservoir 57 einzulassen. Der Abfall wird wieder in dem Abfallreservoir 57 aufbewahrt, und die roten Blutzellen werden in der Blutauftrennungs- und Waschvorrichtung 44 zurückbehalten. Falls erforderlich wird der Waschvorgang wiederholt. Zwischen der Auftrennungs- und Waschvorrichtung 44 und dem Abfallreservoir 57 kann optional ein Kontaminationsdetektionssystem installiert werden, um den Waschvorgang zu kontrollieren.
Im Anschluss an die Auftrennung der roten Blutzellen wird Pumpe 40 umgekehrt, Pumpe 22 wird ausgeschaltet, Ventile 12, 15, 33, 35, 36, 25, 87 und 54 werden geschlossen und Ventil 97 wird geöffnet. Falls die Zellen gewaschen wurden, wurde Pumpe 22 zuvor abgeschaltet und Ventile 12 und 25 waren geschlossen worden. Die IHP-Lösung wird aus dem IHP-Reservoir 50 und in die Auftrennungs- und Waschvorrichtung 44 gepumpt, welche die roten Blutzellen enthält. Dort werden die roten Blutzellen und das IHP gemischt, um eine Suspension auszubilden.
Die bevorzugte Konzentration von IHP in der Lösung beträgt ungefähr zwischen 10 mMol und 100 mMol mit einer bevorzugteren Konzentrationen von ungefähr 23 bis 35 mMol, und mit einer am meisten bevorzugten Konzentration von 35 mMol. Die bevorzugte IHP-Lösung umfasst die folgenden Verbindungen in den folgenden Konzentrationen:
35 mMol IHP-Salz, neutralisiert mit 35 mMol IHP-Säure auf einen pH von 7,3
33 mMol K₂HPO₄
7 mMol NaH₂
30,6 mMol KCl
6,4 mMol NaCl
7,3 mMol Saccharose
5,0 mMol ATP
Das IHP kann erhalten werden von Sigma Chemical Company aus St. Louis, Missouri.
Der Hämatokrit der Suspension liegt vorzugsweise ungefähr zwischen 30 und 60, mit dem am meisten bevorzugten Hämatokrit von ungefähr 50. Pumpe 40 ist konstruiert, um sowohl die roten Blutzellen als auch die IHP-Lösung zu pumpen und kann derart eingestellt werden, dass der Endhämatokrit bei Eintritt in die Kühlschlange 68 vorbestimmt werden kann.
Die Schritte des Sammelns der Probe, Auftrennung der Zellen aus der Probe, Waschen der Zellen und Vereinigung der Zellen mit IHP kann mit einer Apherese-Blutwaschmaschine erfolgen, wie die von Haemonetics Corporation hergestellte. Die Apherese-Blutwaschmaschine ist mit der hierin beschriebenen Fluss-Elektrophorese-Vorrichtung verbunden, um eine kontinuierliche Fluss-Elektroporationsvorrichtung auszubilden.
Nach der Vereinigung der roten Blutzellen mit der IHP-Lösung wird die Pumpe 40 wieder umgekehrt, Ventil 97 wird geschlossen und Ventil 64 wird geöffnet. Die rote Blutzellen-IHP-Suspension wird anschließend durch eine thermoelektrische Kühlschlange 68 gepumpt. Ein Blutbeutel von einem Bluterwärmungsset, wie der im Fenwal^® Bluterwärmungsset, hergestellt von Baxter Healthcare Corporation, bereitgestellte Blutbeutel kann als Kühlschlange 68 verwendet werden. Wenn die rote Blutzellen-IHP-Suspension die Kühlschlange 68 im Kühlreservoir 69 durchläuft, wird die Suspension auf eine Temperatur ungefähr zwischen 1°C und 12°C, vorzugsweise ungefähr 4°C gekühlt. Optional kann der Vorrichtung zwischen der Kühlschlange 68 und dem Reservoir 69 sowie der Elektroporationskammer 62 eine Pumpe hinzugefügt werden, um eine konstante Flussrate sicherzustellen und eine Volumenfluktuation, welche auftritt wenn die Kühlschlange 68 gefüllt ist, zu kompensieren.
Optional kann der Vorkühlungsschritt eliminiert werden, und die rote Blutzellen-IHP-Suspension kann direkt nach dem Mischen zur Elektroporationskammer 72 geleitet werden. In einem solchen Fall würden die Kühlschlange 68 und das Kühlreservoir 69 von der kontinuierlichen Fluss-Verkapselungsvorrichtung 10 entfernt werden. Ein Kühlen vor der Elektroporation kann nicht erforderlich sein, falls die Temperatur der Elektroporationskammer ausreichend kühl ist, um die Zellsuspension bei 4°C zu halten.
Nach dem Kühlen tritt die rote Blutzellen-IHP-Suspension in die Elektroporationskammer 72 ein. Die Kammer 72 wird bei einer Temperatur von ungefähr 4°C gehalten. Während die rote Blutzellen-IHP-Suspension die Fluss-Elektroporationskammer 72 durchläuft, wird der Suspension ein elektrischer Puls von einem Pulsgenerator 75 verabreicht, was die Ausbildung von Öffnungen innerhalb der Zellenmembranen der roten Blutzellen hervorruft.
Die rote Blutzellen-IHP-Suspension passiert zwischen zwei Elektroden der Elektroporationskammer 72. 3 bis 10 beschreiben die Elektro porationskammer. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird, wenn eine Suspension von nicht behandelten Zellen in die Kammer 72 eintritt, die IHP-rote Blutzellen-Suspension ungefähr drei Hochstrompulsen pro Volumen bei einer Feldstärke von ungefähr 2600 bis 3200 V/cm pro Puls unterworfen. Die quer durch die Zellmembranen hindurch hervorgerufene Ladung ruft einen elektrischen Zusammenbruch der Zellmembran hervor, was Poren in der Membran erzeugt. IHP diffundiert anschließend durch diese Poren in die Zelle.
Während der Elektroporation wird ein elektrisches Feld von 1 bis 3 KV/cm erzeugt und für einen Zeitraum von 1 bis 4 Millisekunden aufrechterhalten. Die bevorzugte Pulsdauer beträgt 3 bis 4 Millisekunden, mit einer am meisten bevorzugten Pulsdauer von 2 Millisekunden. Die Pulsdauer ist definiert als 1/e. Bei einer Flussrate von ungefähr 10,6 ml/Minute beträgt die bevorzugte Anzahl von Pulsen 3, bei der bevorzugten Pulsrate von 0,29 Hz. Die Feldstärke ist definiert als die Spannung über der Entfernung zwischen den Elektroden. Die Entfernung zwischen den Elektroden wird in Zentimetern gemessen. Die bevorzugten elektrischen Parameter sind wie folgt.
Exponentieller Puls: Pulsdauer = 1,5 bis 2,5 ms
Feldstärke = 2,73 KV/cm
Im Anschluss an die Elektroporation tritt die rote Blutzellen-IHP-Suspension in eine Inkubationskammer 78 ein, wo die Suspension bei Raumtemperatur für eine Inkubationszeit von ungefähr zwischen 10 Minuten und 120 Minuten mit einer bevorzugten Inkubationszeit von 30 Minuten inkubiert wird. Optional wird die rote Blutzellen-IHP-Suspension für ungefähr 5 Minuten bei einer Temperatur von ungefähr 37°C, und mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubationskammer 78 kann von einem Heizmittel 80 umgeben sein. Jedwedes Heizmittel 80 kann bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Das bevorzugte Heizmittel 80 stellt ein Wasserbad oder eine thermoelektrische Wärmepumpe dar.
Optional enthält der Inkubator 78 einen Wiederverschließungspuffer, welcher bei dem Wiederverschließen und der Rekonstitution der roten Blutzellen hilft. In der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird kein Wiederverschließungspuffer verwendet.
Im Anschluss an die Inkubation wird die rote Blutzellen-IHP-Suspension wieder zur Blutauftrennungs- und Waschflasche 44 zurückgeführt, wenn Ventil 51 geöffnet und Pumpe 40 eingeschaltet wird. Die überschüssige IHP-Lösung wird mittels Zentrifugation von der rote Blutzellen-Suspension entfernt. Die Abfall-IHP-Lösung wird zum Abfallreservoir 57 geleitet. Ventile 33, 37, 15 und 36 werden anschließend geöffnet, um ein Volumen einer Nachwaschlösung aus Reservoir 31 in die Blutauftrennungs- und Waschflasche 44 einzulassen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Nachwaschlösung eine 0,9% NaCl-Lösung, einschließlich 2,0 mM CaCl₂ und 2,0 mM MgCl₂. Jedwede physiologische Kochsalzlösung kann verwendet werden.
Nach Zugabe der Nachwaschlösung wird die rote Blutzellen-IHP-Suspension anschließend zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit wird durch Ventil 54 in das Abfallreservoir 57 verworfen, unter Zurücklassen der roten Blutzellen in der Blutauftrennungs- und Waschflasche 44. Der Waschvorgang wird wiederholt bis das gesamte nicht verkapselte IHP entfernt worden ist.
Optional durchläuft der Abfall, während er aus der Auftrennungs- und Waschvorrichtung 44 entfernt wird einen Kontaminationsdetektor 46, um jegliches freie IHP in der Abfalllösung zu detektieren, wodurch bestätigt wird, dass exogenes, nicht verkapseltes IHP von den modifizierten roten Blutzellen entfernt worden ist. Der Kontaminationsdetektor 46 ist optional.
Im Anschluss an das Waschen, können die IHP enthaltenden roten Blutzellen mit dem Plasma und den weißen Blutzellen, die im Reservoir 89 zurückbehalten worden sind, rekonstituiert werden. Pumpe 40 wird eingeschaltet und Ventile 87, 36 und 92 werden geöffnet. Die modifizierten roten Blutzellen und das Plasma und die weißen Blutzellen werden zum Reservoir 96 gepumpt. Ein Filter kann zwischen dem Reservoir 96 und Ventil 92 installiert werden, um jegliche Anhäufungen oder andere Verunreinigungen aus dem rekonstituierten modifizierten Blut zu entfernen.
Die gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung erhaltenen IHP-beladenen roten Blutzellen können direkt dem Patienten zurück verabreicht werden, oder die Zellen können zur späteren Verwendung aufbewahrt werden. Das IHP in den roten Blutzellen wird während der normalen Aufbewahrungszeit nicht freigesetzt.
Es ist zu erwägen, dass die kontinuierliche Fluss-Verkapselungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung modifiziert werden kann, um andere Verkapselungsverfahren zu verwenden.
Darüber hinaus ist zu erwägen, dass die kontinuierliche Fluss-Verkapselungsvorrichtung angepasst werden kann zur Verarbeitung verschiedener andersartiger Zellpopulationen. Darüber hinaus kann die Vorrichtung verwendet werden zur Verkapselung biologisch aktiver Substanzen in künstlichen Vesikeln.
Es ist ebenfalls zu erwägen, dass die kontinuierliche Fluss-Verkapselungsvorrichtung der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um einen breiten Bereich biologisch aktiver Substanzen zu verkapseln.
Die Fluss-Elektroporationsvorrichtung der vorliegenden Erfindung kann von der Plasmaphorese-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung getrennt sein. Das Blutkühlungssystem, die peristaltische Pumpe, die Elektroporationskammer, der Pulsgenerator und die Elektronik, die von der Fluss-Elektroporationsvorrichtung umfasst werden, können mit einer Plasmaphorese-Vorrichtung und einer Schnittstelle mit der Steuerung dieser Maschine verbunden sein.
Fluss-Elektroporationskammer
Während der Elektroporation hängt die Insertionsrate des IHP linear von der an die Zellen angelegten Spannung ab. Im allgemeinen wird umso mehr IHP verkapselt, je höher die Spannung ist; die Zelllyse wird jedoch auch gesteigert und das Zellüberleben nimmt ab. Die Effizienz eines Elektroporationssystems kann beurteilt werden anhand des Zellüberlebens nach Elektroporation. Ein schlechtes Zellüberleben zeigt eine sehr geringe Effizienz an. Die Amplitude und Dauer des elektrischen Pulses ist verantwortlich für den elektrischen Zusammenbruch der Zellmembran und erzeugt Poren in den Polkappen parallel zum elektrischen Feld. Daher schließen die Faktoren, die bei der Konstruktion eines Elektroporationssystems zu berücksichtigen sind, die Feldstärke, die Pulsdauer und die Anzahl der Pulse ein.
Ein perfektes Elektroporationsziel ist geformt wie eine Kugel, so dass dessen Orientierung die Effizienz des angelegten Feldes nicht beeinflusst. Wenn das Ziel kugelförmig ist, kann ein einzelner Puls mit einer Feldstärke oberhalb des Schwellenwertes 100% des Ziels galvanisieren. Rote Blutzellen weisen die Form einer Scheibe auf. Aufgrund ihrer Form und Orientierung in der Elektroporationskammer werden nur ungefähr 40% der Zellen während eines einzelnen Pulses galvanisiert. Um ebenfalls die anderen 60% zu galvanisieren, kann die Feldstärke erhöht werden. Dies steigert die Beanspruchung der roten Blutzellen in geeigneter Orientierung zum elektrischen Feld und führt zu geringeren Überlebensraten der Zellen.
Um eine effizientere Verkapselung zu erzielen bei Reduzierung des Auftretens von Zelllyse und Tod wurde eine Fluss-Elektroporationskammer entwickelt, die Kurzzeit Mehrfach-Pulse verwendet. Es wurde festgestellt, dass bei einer gleichmäßigen Durchflussrate und einer gleichmäßigen Feldspannung die Mehrzahl der Pulse maximale Mengen an IHP mit minimal 2 bis 24 Stunden Lyse insertieren würden. Ein Mehrfach-Pulssystem erlaubt eine Steigerung der Zellüberlebensrate ohne Anheben der Feldstärke. Wenn ein Mehrfach-Pulssystem verwendet wird, ist die Orientierung der Zellen nicht so kritisch wie sie es wäre, wenn ein System wie ein Einzel-Pulssystem verwendet wird. Die niedrigere Feldstärke ist wesentlich schonender zu den roten Blutzellen. Es ist wesentlich einfacher, jede einzelne Zelle in dem Mehrfach-Pulssystem zu elektroporieren, da das Timing zwischen der Flussrate der roten Blutzellen durch die Kammer und den Elektroporationspulsen sowie die Orientierung der Zellen nicht so kritisch ist wie in einem Einzel-Pulssystem. Das Fluss-Mehrfach-Puls-Elektroporationssystem erhöht zudem sowohl das Kurzzeit- als auch das Langzeitüberleben der roten Blutzellen im Vergleich zu dem Einzel-Puls-Verfahren.
11 bis 13 verdeutlichen die Auswirkungen verschiedener Feldstärken unter statischen oder Fluss-Bedingungen auf die % Oxygenierung der IHP-verkapselten roten Blutzellen über einen Bereich Sauerstoffdrücke; auf den P₅₀-Wert der IHP-verkapselten roten Blutzellen (zwei Konzentrationen von IHP-Lösungen wurden verglichen); und auf die Überlebensraten von roten Blutzellen, die einer Elektroporation unterworfen wurden. Alle Ablesungen wurden 24 Stunden nach der Elektroporation vorgenommen. Die Ergebnisse zeigen an, dass Mehrfach-Pulse bei vergleichsweise niedrigen Feldstärken optimale Verkapselungsergebnisse produzieren.
Eine gekühlte Elektroporationskammer ist bevorzugt, um die Zellen während des Elektroporationsvorganges bei einer konstanten Temperatur zu halten, wodurch ihre Überlebensraten erhöht werden.
Dies wird erzielt durch Entfernen des Überschusses an Wärme, der durch den elektrischen Puls während des Elektroporationsvorganges erzeugt wird. Der Überschuss an Wärme kann entweder durch Kühlen der Elektroden oder Kühlen der gesamten Fluss-Elektroporationskammer entfernt werden. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Elektroden selber gekühlt.
Während des Elektroporationsvorganges wird Blut durch einen Einlass in die Elektroporationskammer gepumpt und die roten Blutzellen werden einer Reihe von elektrischen Pulsen unterworfen während sie sich durch die Kammer bewegen. Sie treten am anderen Ende der Kammer aus. Die Kammer kann aus jedweder Art von isolierendem Material hergestellt sein, einschließlich aber nicht beschränkt auf Keramik, Teflon, Plexiglas, Glas, Plastik, Silizium, Gummi oder andere synthetische Materialien. Vorzugsweise setzt sich die Kammer zusammen aus Glas oder Polysulfon. Wie auch immer die Zusammensetzung der Kammer ist, die innere Oberfläche der Kammer sollte glatt sein, um Turbulenzen in der sie durchlaufenden Flüssigkeit zu verringern. Das Gehäuse der Kammer sollte nicht leitend und biologisch inert sein. Bei kommerzieller Verwendung wird erwartet, dass es sich um eine Einwegkammer handelt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können die Elektroden, die einen Teil der Elektroporationsvorrichtung ausmachen, aus jeglicher Art elektrisch oder thermisch leitendem, hohlem Grundmaterial, einschließlich aber nicht beschränkt auf Messing, Edelstahl, Gold-plattierter Edelstahl, Gold-plattiertes Glas, Gold-plattiertes Plastik oder Plastik enthaltendes Metall konstruiert sein. Vorzugsweise ist die Oberfläche der Elektrode Gold-plattiert. Plattierung mit Gold dient dazu, eine Oxidation zu beseitigen und verringert die Ansammlung von Hämoglobin und anderen Zellpartikeln an den Elektroden. Die Oberfläche der Elektroden sollte glatt sein.
Die Elektroden können hohl sein, um ein Kühlen mittels Flüssigkeit oder Gas zu erlauben, oder die Elektroden können massiv sein, um ein thermoelektrisches Kühlen oder irgend eine andere Art von konduktiver Kühlung zu erlauben. Die Kühlung könnte ebenfalls erreicht werden durch Kühlen der Elektroporationskammer selber, unabhängig von dem Kühlen der Elektroden.
Vorzugsweise handelt es sich um eine Einweg-Fluss-Elektroporationskammer. Eine detaillierte Beschreibung der zwei Ausführungsformen der Elektroporationskammer der vorliegenden Erfindung wird unten bereitgestellt.
In einer Ausführungsformen ist die Fluss-Elektroporationskammer aus klarem Polyvinylchlorid konstruiert und enthält zwei gegenüberliegende Elektroden, die in einem Abstand von ungefähr 7 mm räumlich voneinander entfernt sind. Die Elektroporationskammer stellt eine Modifikation einer von BTX Electronic Company aus San Diego, Kalifornien erhaltenen Kammer dar. Wenn die Elektroporationskammer jedoch kontinuierlich verwendet wird, überhitzt sie und die Überlebensrate der durch die Vorrichtung verarbeiteten Zellen nimmt im Laufe der Zeit ab. Um das Überhitzungsproblem, das auftrat, wenn die Vorrichtung in der Weise eines kontinuierlichen Flusses verwendet wurde, zu korrigieren, wurde eine kontinuierliche Fluss-Elektroporationskammer konstruiert. Eine detaillierte Beschreibung der Struktur der kontinuierlichen Fluss-Elektroporationskammer ist unten bereitgestellt.
3 bis 8 zeigen eine Ausführungsform der Fluss-Elektroporationskammer 72 der vorliegenden Erfindung. Wie in 3 zu sehen ist, schließt die Fluss-Elektroporationskammer 72 ein Gehäuse 100 mit zwei Elektroden 102, eingesetzt an gegenüberliegenden Seiten des Gehäuses 100 der Elektroporationskammer 72, ein. Das Gehäuse 100 schließt einen Einlasskanal 104 an einem Ende und einen Auslasskanal 106 an dem anderen Ende ein. Die Einlasskanäle 104 und Auslasskanäle 106 schließen Verbindungsstücke 108 beziehungsweise 109, vorzugsweise vom männlichen Luer-Sortiment, ein. Die Verbindungsstücke 108 und 109 sind hohl und bilden die Einlasskanäle 104 und Auslasskanäle 106 in das Innere der Elektroporationskammer 72 aus.
Wie in 4 und 5 zu sehen, erstreckt sich eine innere Kammer 110 entlang der überwiegenden Länge des Gehäuses 100 und ist derart dimensioniert, dass es die zwei Elektroden 102 aufnimmt. Die innere Kammer 110 schließt schräge Oberflächen 111 ein, um die inneren Ränder der Elektroden 102 aufzunehmen. Die innere Kammer 110 wird daher durch die inneren Oberflächen der Elektroden 102 und die inneren Oberflächen des Gehäuses 100 ausgebildet. Die innere Kammer 110 ist mit denen Einlasskanälen 104 und Auslasskanälen 106 verbunden.
Wie in 7 und 8 zu sehen ist, setzen sich die Elektroden 102 der Elektroporationskammern 72 aus 3 bis 6 zusammen aus flachen, gestreckten, hohlen Schalen. Die Elektroden 102 schließen Kühlungseinlässe 112 und Kühlungsauslässe 114 an ihren Enden ein. Wie oben beschrieben passen die rückseitigen Oberflächen der Elektroden 102 oder die linke Oberfläche in 7 bündig gegen die schräge Oberfläche 111 des Gehäuses 100.
Die Elektroporationskammer 72 ist derart konstruiert, dass die der Elektroporation zu unterwerfende Zellsuspension durch den Einlass 104 in die Elektroporationskammer 72 eintritt und sich ausdehnt, um die innere Kammer 110 zu füllen. Während die rote Blutzellen-Suspension durch die innere Kammer 110 fließt wird über die Breite der inneren Kammer 110 ein Puls oder eine Ladung verabreicht.
Um eine relativ konstante Temperatur während des Elektroporationsvorganges aufrechtzuerhalten, wird Kühlflüssigkeit oder Kühlgas in den Kühlungseinlass 112 eingepumpt und aus dem Kühlungsauslass 114 herausgepumpt, so dass die Elektroden 102 bei ungefähr 4°C gehalten werden.
9 und 10 zeigen eine zweite Ausführungsform der Fluss-Elektroporationskammer 172. Wie in 9 und 10 zu sehen ist, schließt die Fluss-Elektroporationskammer 172 ein hohles Gehäuse 200 mit im wesentlichen rechteckiger Form ein. Zwei Elektroden 202 werden direkt einander gegenüberliegend in das innere des Gehäuses 200 eingebracht, bündig gegen die Gehäusewände 200. Die Fluss-Elektroporationskammer 172 umfasst des Weiteren einen Einlasskanal 204 an einem Ende und einen Auslasskanal 206 an dem anderen Ende des Gehäuses 200. Die Einlasskanäle 204 und Auslasskanäle 206 schließen Verbindungsstücke 208 und 209 ein, welche mittels einer Rohrleitung 216 an eine Zellsuspensionszuführung, welche die Zellsuspension, d. h. die IHP-rote Blutzellen-Suspension, der Elektroporationskammer 172 zuführt, gebunden sind. Die Verbindungsstücke 208 und 209 und die Einlasskanäle 204 und Auslasskanäle 206 dienen dazu, die Zellsuspension in das und aus dem Gehäuse 200 zu leiten.
Wie in 10 zu sehen ist, dehnt sich ein Ende des Einlasskanals 204 und ein Ende des Auslasskanals 206 in das innere des Gehäuses 200 aus, unter Ausbildung einer inneren Kammer 210. Die innere Kammer 210 wird daher durch die inneren Oberflächen der Elektroden 202, die inneren Oberflächen des Gehäuses 200 und die inneren Oberflächen der Einlasskanäle 204 und Auslasskanäle 206 gebildet.
Wie in 9 und 10 zu sehen ist, umfassen die Elektroden 202 der Flusselektroporationskammer 172 flache, ausgedehnte, hohle Schalen. Die Elektroden 202 schließen Kühlungseinlässe 212 und Kühlungsauslässe 214 an ihren Enden ein, durch welche ein Gas oder eine Flüssigkeit durch die Elektroden 202 gepumpt werden kann, um eine konstante Temperatur während der Elektroporation aufrechtzuerhalten. Die Elektroden 202 sind über Kabel 220 mit einem Pulsgenerator verbunden.
Wie bei der oben beschriebenen Kammer, ist die Elektroporationskammer 172 der 9 und 10 derart konstruiert, dass die der Elektroporation zu unterwerfende Suspension durch den Flüssigkeitseinlass 204 in die Elektroporationskammer 172 eintritt und sich ausdehnt, um die innere Kammer 210 auszufüllen. Während die rote Blutzellen-Suspension durch die innere Kammer 210 fließt wird ein Puls oder eine Ladung über die Breite der inneren Kammer 210 zwischen den Elektroden 202 verabreicht. Um eine relativ konstante Temperatur während des Elektroporationsverfahrens aufrechtzuerhalten, wird eine Kühlflüssigkeit oder ein Kühlgas derart in den Kühleinlass 212 hinein- und aus dem Kühlauslass 214 der Elektroden 202 durch die Verbindungsstücke 208 und 209 herausgepumpt, dass die Elektroden 202 bei ungefähr 4°C gehalten werden. Es ist ebenfalls möglich, dass der Einlasskanal 204, der Auslasskanal 206 und die Verbindungsstücke 208 und 209 vielmehr als ein festes, integriertes Glasteil hergestellt werden, als als separate Komponenten.
Es ist in Betracht zu ziehen, dass die Flusselektroporationskammer 172 aus Ziehglas oder einem anderen, in hohem Maße polierten Material konstruiert werden kann. Es ist bevorzugt, dass die innere Oberfläche der Elektroporationskammer 172 so glatt wie möglich ist, um die Erzeugung von Oberflächenturbulenzen zu verringern. Ziehglas-Komponenten sind in hohem Maße vereinbar mit perfekten Oberflächenvergütungen. Darüber hinaus sind sie stabil und inert gegenüber Blutkomponenten. Sie sind ebenfalls relativ billig, was für eine Einweg-Elektroporationskammer wünschenswert ist.
Die Elektroden können ebenfalls mit kolloidalem Gold elektroplattiertes Ziehglas umfassen. Die Oberflächen der Elektroden sollten wieder in hohem Maße vergütet, in hohem Maße leitfähig, aber biologisch inert sein. Ein galvanischer Überzug aus Gold ist langlebig und billig. Ein Fluidverbindungsstück kann erhalten werden unter Verwendung herkömmlich erhältlicher Teile.
Die Flusselektroporationskammer ist konstruiert als ein Bestandteil der gesamten Flussverkapselungsvorrichtung. Die Flusselektroporationsvorrichtung kann anschließend mit einer kommerziell erhältlichen Plasmaphorese-Maschine zur Verkapselung spezieller Zellpopulationen verbunden sein. Z. B. kann die Flusselektroporationskammer mit einer kommerziell erhältlichen Plasmaphorese-Ausrüstung mittels elektronischer oder Übertragungshardware oder Software verbunden sein. Optional kann ebenfalls eine Quetschventilanordnung und ein von einem PC-Programm gesteuerter Controller verwendet werden, um die Flusselektroporationsvorrichtung zu steuern. In ähnlicher Weise sind gängige Stromversorgungen in der Lage, die Stromniveaus, die erforderlich sind, um die Flusselektroporationskammer oder Flussverkapselungsvorrichtung zu betreiben, herzustellen.
Anwendung der IHP-behandelten roten Blutzellen
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zur Steigerung der Sauerstoff-Transportkapazität von Erythrozyten bereit. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kombiniert das IHP mit Hämoglobin auf eine stabile Weise, und verschiebt dessen Sauerstoff-Freisetzungskapazität. Erythrozyten mit IHP-Hämoglobin können mehr Sauerstoff pro Molekül freisetzen als Hämoglobin alleine, und daher ist mehr Sauerstoff verfügbar, um in Gewebe zu diffundieren, in Bezug auf jede Bluteinheit, die zirkuliert. Unter gewöhnlichen Umständen ist IHP toxisch und kann nicht als üblicher Wirkstoff toleriert werden. Bindung des IHP an Hämoglobin in diesem neuen Verfahren neutralisiert jedoch dessen Toxizität. Bei Abwesenheit eines schweren, chronischen Blutverlusts könnte eine Behandlung mit einer Zusammensetzung, die gemäß dem vorliegenden Verfahren hergestellt wurde, in vorteilhaften Wirkungen resultieren, die ungefähr 90 Tage andauern.
Ein weiterer Vorteil von IHP-behandelten roten Blutzellen besteht darin, dass sie den Bohr-Effekt nicht verlieren, wenn sie aufbewahrt werden. Normale roten Blutzellen, die in herkömmlicher Weise aufbewahrt worden sind, erlangen für ungefähr 24 Stunden ihre maximale Sauerstoff-Transportkapazität nicht wieder. Dies liegt daran, dass das DGP in normalen roten Blutzellen während der Lagerung vom Hämoglobin-Molekül weg diffundiert und nach der Transfusion durch den Körper ersetzt werden muss. Im Gegensatz dazu bewahren gemäß der vorliegenden Erfindung behandelte rote Blutzellen ihre maximale Sauerstoff-Transportkapazität während der Aufbewahrung und können daher sofort nach der Transfusion in einen Menschen oder ein Tier maximalen Sauerstoff zu den Geweben transportieren.
Die Verwendungen von IHP-behandelten RBCs ist ziemlich umfassend, einschließlich der Behandlung von zahlreichen akuten und chronischen Zuständen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, ins Krankenhaus eingelieferten Patienten, kardiovaskulären Operationen, chronischer Anämie, einem großen chirurgischen Eingriff folgender Anämie, Koronarinfarkt und damit verbundener Probleme, chronischer Lungenkrankheit, kardiovaskulärer Patienten, autologer Transfusionen, als eine Verstärkung von Transfusionen gepackter roter Blutzellen (Hämorrhagie, traumatische Verletzung oder Operation), kongestives Herzversagen, myokardialem Infarkt (Herzinfarkt), Schlaganfall, peripherer vaskulärer Krankheit, intermittierendem Hinken, Kreislaufzusammenbruch, hämorrhagischem Schock, Anämie und chronischer Hypoxämie, respiratorischer Alkalämie, metabolischer Alkalose, Sichelzell-Anämie, durch Pneumonie verursachter verringerter Lungenkapazität, chirurgischem Eingriff, Pneumonie, Trauma, Thoraxpunktion, Gangrän, anaerober Infektionen, Blutgefäßerkrankungen wie Diabetes, Austausch oder Ergänzung der Behandlung mit hyperbaren Druckkammern, intraoperativer roter Zellgewinnung, Herzinsuffizienz, Anoxie – sekundäre bis chronische Indikation, Organtransplantation, Kohlenmonoxid-, Stickstoffoxid- und Zyanid-Vergiftung.
Die Behandlung eines Menschen oder eines Tieres bei einem oder mehreren der obigen Krankheitszustände erfolgt durch Transfusion von ungefähr zwischen 0,5 und 6 Einheiten (1 Einheit = 500 ml) des IHP-behandelten Bluts, welches gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt worden ist, in den Menschen oder das Tier. In bestimmten Fällen kann ein im wesentlichen vollständiger Austausch des gesamten normalen Blutes in einem Patienten mit IHP-behandeltem Blut erfolgen. Das Volumen der IHP-behandelten roten Blutzellen, welches dem Menschen oder Tier verabreicht wird, wird von der zu behandelnden Indikation abhängen. Darüber hinaus wird das Volumen der IHP-behandelten roten Blutzellen ebenfalls von der Konzentration der IHP-behandelten roten Blutzellen in der rote Blutzellen-Suspension abhängen. Das soll heißen, dass die Menge der IHP roten Blutzellen, die dem Patienten verabreicht wird, nicht kritisch ist und in großem Maße variieren und dennoch wirksam sein kann.
IHP-behandelte gepackte RBCs sind in jeder Hinsicht den normalen roten Blutzellen ähnlich außer, dass die IHP-behandelten gepackten roten Blutzellen 2 bis 3 mal mehr Sauerstoff pro Einheit zum Gewebe transportieren können. Ein Arzt würde daher eher die Verabreichung einer einzelnen Einheit von IHP-behandelten, gepackten roten Blutzellen wählen als zwei Einheiten der normalen roten Blutzellen. IHP-behandelte, gepackte roten Blutzellen könnten in Blutverarbeitungszentren analog zu den vorliegenden Blutverarbeitungsverfahren hergestellt werden, abgesehen vom Einschluss eines Verarbeitungsschritts, in dem das IHP in die Zellen verkapselt wird.

Claims

Eine geschlossene Apparatur mit kontinuierlichem Fluss zur Verkapselung einer biologisch aktiven Substanz in Zellen durch Elektroporation, umfassend: a. eine Einführungsvorrichtung zum Einführen der Zellen in die Apparatur; b. eine Trennvorrichtung in geschlossener Flussverbindung mit der Einführungsvorrichtung zum Isolieren der Zellen; c. eine Mischvorrichtung in geschlossener Flussverbindung mit der Trennungsvorrichtung zum Mischen der Zellen mit einer wirksamen Menge einer Lösung einer biologisch aktiven Substanz, um eine Zellsuspension bereitzustellen; d. eine Elektroporationsvorrichtung in geschlossener Flussverbindung mit der Mischvorrichtung, um die Zellsuspension einer Elektroporation zu unterwerfen, wodurch bewirkt wird, dass die biologisch aktive Substanz in die Zellen eingekapselt wird; e. eine Inkubierungsvorrichtung in geschlossener Flussverbindung mit der Elektroporationsvorrichtung zum Inkubieren der Zellen nach der Elektroporation, um modifizierte Zellen bereitzustellen; und f. eine Vorrichtung zum Waschen in geschlossener Flussverbindung mit der Inkubierungvorrichtung zum Waschen der modifizierten Zellen, um nicht eingeschlossene biologisch aktive Substanz von diesen zu entfernen.
Die Apparatur gemäß Anspruch 1, außerdem enthaltend eine Kühlungsvorrichtung zum Kühlen der Zellsuspension nach dem Element (c).
Die Apparatur gemäß Anspruch 1 oder 2, außerdem umfassend eine Vorrichtung zum Erwärmen der Inkubierungsvorrichtung.
Die Apparatur gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, außerdem enthaltend eine Detektionsvorrichtung zum Detektieren von nicht verkapselter biologisch aktiver Substanz nach dem Element (f).
Die Apparatur gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, außerdem enthaltend eine Sammelvorrichtung in geschlossener Flussverbindung mit der Waschvorrichtung und in geschlossener Flussverbindung mit der Haltevorrichtung zum Aufbewahren der gewaschenen, modifizierten Zellen nach Element (f).
Die Apparatur gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Trennungsvorrichtung in der Lage ist, das Plasma und die Leukozytenfraktion aus einer roten Blutzellfraktion abzutrennen.
Die Apparatur gemäß Anspruch 6, außerdem enthaltend eine Sammelvorrichtung in geschlossener Flussverbindung mit der Waschvorrichtung und in geschlossener Flussverbindung mit der Haltevorrichtung zum Kombinieren der modifizierten roten Blutzellen mit dem Plasma und den Leukozyten nach Element (f).
Ein Verfahren zum Einbringen einer biologisch aktiven Substanz in eine Zelle in einem geschlossenen kontinuierlichen Flusssystem, umfassend die Schritte: a. Einführen der Zellen in das geschlossene kontinuierliche Flusssystem; b. Isolieren der Zellen; c. Mischen der Zellen mit einer wirksamen Menge einer biologisch aktiven Substanz, um eine Zellsuspension bereitzustellen; d. Elektroporieren der Zellsuspension, wobei bewirkt wird, dass die biologisch aktive Substanz in den Zellen verkapselt wird; e. Inkubieren der Zellen, um sich die modifizierten Zellen wieder versiegeln zu lassen. f. Waschen der modifizierten Zellen, um nicht verkapselte biologisch aktive Substanz davon zu entfernen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 8, außerdem umfassend den Schritt des Kühlens der Zellsuspension, bevor die Zellsuspension elektroporiert wird.
Das Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, außerdem umfassend den Schritt des Erwärmens der Zellsuspension während des Inkubierungsschrittes.
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 10, außerdem umfassend den Schritt des Detektierens von extrazellulärer biologisch aktiver Substanz nach Schritt (f).
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, außerdem umfassend den Schritt des Sammelns der modifizierten Zellen nach Schritt (f).
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 12, wobei die Zellen rote Blutzellen sind, umfassend die Schritte: a) Einführen von Blut in das geschlossene kontinuierliche Flusssystem, b) Trennen der Komponenten des Blutes, um ein Plasma und eine Leukozytenfraktion und eine rote Blutzellfraktion bereitzustellen.
Das Verfahren gemäß Anspruch 13, außerdem umfassend den Schritt des Abtrennens des Plasmas und der Leukozytenfraktion von der roten Blutzellfraktion und Aufbewahren des Plasmas und der Leukozytenfraktion.
Das Verfahren gemäß Anspruch 14, außerdem umfassend den Schritt des Zurückbringens des Plasmas und der Leukozyten zu den modifizierten roten Blutzellen nach Schritt (f).
Das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 15, wobei die biologisch aktive Substanz Inositolhexaphosphat ist.
Eine geschlossene kontinuierliche Flussapparatur gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, enthaltend eine Vorrichtung, die umfasst: eine kontinuierliche interne Kammer, die sich in dieser erstreckt, wobei die interne Kammer interne Wände und einen Zugabekanal und einen Ausführkanal definiert, wobei der Zugabekanal der internen Kammer so konfiguriert ist, dass er einen kontinuierlichen Fluss einer Zellsuspension aufnimmt, welche durch die interne Kammer und durch den Ausführkanal fließt; eine erste Elektrode, die sich entlang einer spezifischen Länge der einen Seite der internen Kammer erstreckt; und eine zweite Elektrode, die sich entlang einer spezifischen Länge auf der anderen Seite der internen Kammer erstreckt, wobei die erste und die zweite Elektrode so beschaffen sind, dass sie Pulse von elektronischer Energie aus der ersten Elektrode durch die Zellsuspension, während die Zellsuspension durch die interne Kammer fließt, zu der zweiten Elektrode aussenden, wobei wenigstens eine der ersten und zweiten Elektrode eine innere Kammer entlang ihrer Länge einschließt, wobei die interne Kammer einen Eingang und einen Ausgang definiert, der Eingang der Elektrode so konfiguriert ist, dass er ein Kühlmittel aufnimmt, welches durch die innere Kammer der Elektrode und durch den Ausgang der Elektrode fließt; die Vorrichtung dergestalt ist, dass während der Verwendung mit Hilfe der Auswahl der Anzahl von Pulsen an Elektrizität durch die Elektroden je Minute, der spezifischen Länge der ersten Elektrode, der spezifischen Länge der zweiten Elektrode und des Volumens des Blutflusses durch die innere Kammer das kontinuierlich fließende Volumen der Zellsuspension elektroporiert werden kann, während es durch die innere Kammer fließt.
Die Apparatur gemäß Anspruch 17, worin die erste Elektrode und die zweite Elektrode der Vorrichtung jede wenigstens einen Teil der inneren Wand der internen Kammer der Vorrichtung bilden.
Ein Verfahren zum Elektroporieren von Blut unter Verwendung einer Apparatur gemäß einer der Ansprüche 17 oder 18, umfassend die Schritte: Einführen eines kontinuierlich fließenden Volumens von Blut in den Eingang der internen Kammer, durch die interne Kammer und aus dem Ausgang der internen Kammer heraus mit einem spezifischen Flussvolumen; und gleichzeitiges Aussenden eines kontinuierlichen pulsierenden elektronischen Stromes aus der ersten Elektrode durch das Blut zu der zweiten Elektrode.