IT202100023375A1 - Dispositivo per la produzione di vescicole bioingegnerizzate dedicate e metodo correlato - Google Patents

Description

DESCRIZIONE DEL BREVETTO PER INVENZIONE INDUSTRIALE DAL TITOLO: ?Dispositivo per la produzione di vescicole bioingegnerizzate dedicate e metodo correlato?

TESTO DELLA DESCRIZIONE

AMBITO INVENTIVO

La presente invenzione si inserisce nella strumentazione utilizzata nell?ingegneria biochimica ed in particolare quelle attrezzature che permettono di processare campioni di materiale organico quale ad esempio sangue per poter ottenere una quantit? di materiale sufficiente per essere ingegnerizzata ed adoperata a fini industriali, in particolare nanoparticelle. A tal proposito si rende necessario un breve excursus sulla biologia coinvolta nella presente invenzione.

STATO DELL?ARTE

Le vescicole extracellulari (EVs) sono una specifica tipologia di nanoparticelle rilasciate da cellule procariotiche ed eucariotiche nell?ambiente circostante. Sono formate da un doppio foglietto lipidico come i liposomi ma hanno una struttura molto pi? complessa. Possono essere formate da centinaia di lipidi differenti, avere proteine integrate nella membrana o ancorate esternamente e avere contenuti estremamente variabili. Nell?ultimo decennio le vescicole extracellulari sono state descritte come sistema di scambio di informazioni tra cellula e cellula, sia a corto che lungo raggio. Sono state trovate e isolate in ogni fluido organico: sangue, plasma, siero e liquido cerebrospinale. Secondo gli studi recenti, sembra che ogni cellula sia in grado di formare EVs in modo attivo e selettivo, impacchettando le vescicole con materiale specificatamente selezionato.

Data la loro naturale presenza nel circolo sanguigno e nel liquido della matrice extracellulare, le EVs sono state proposte da molti autori come possibili strutture per veicolare terapeutici. Allo stato attuale dell?arte, sfortunatamente, non esiste ancora nessun tipo di terapia basata sull?utilizzo di vescicole extracellulari.

Date le loro scarse dimensioni (vengono considerate EVs, le vescicole dai 60 ai 500 nanometri di diametro) risulta difficile discriminare sotto-tipi o sotto-popolazioni con caratteristiche particolari, per questo motivo la nomenclatura delle EVs ? ancora confusa e in via di sviluppo. ? molto difficile modulare o ingegnerizzare il contenuto per conferire alle vescicole una possibile funzione terapeutica, la maggior parte delle terapie proposte si basa sull?isolamento di EVs che posseggano naturalmente delle caratteristiche utili.

Esistono numerosi problemi da risolvere per procedere con lo sviluppo di terapie basate sull?uso di vescicole extracellulari, tra cui:

? La scarsa resa della raccolta di EVs da colture cellulari: le cellule producono quantitativi modesti di vescicole, per ottenere materiale a sufficienza occorre a monte una mole di cellule in coltura davvero elevata.

? La difficile caratterizzazione del contenuto delle vescicole e dei possibili effetti collaterali: le EVs collezionate in modo naturale da cellule viventi sono estremamente variabili, sia in dimensioni che in contenuto, non ? attualmente possibile discriminare tra le varie sottopopolazioni di EVs per capire quale delle tante sia quella con effetti terapeutici. Questa eterogeneit? lascia aperta la possibilit? che le EVs utilizzate possano avere effetti collaterali sconosciuti e non facilmente osservabili in condizioni di laboratorio.

? Il mantenimento e l?immagazzinamento delle vescicole risulta complesso. Pensando all?uso canonico di un terapeutico bisogna considerare sia la produzione che il suo mantenimento. Le EVs hanno resistenze eterogenee a condizioni quali congelamento-scongelamento, trasporto, aggregazione e mantenimento a temperatura controllata. Questo rende ancora pi? complessa la caratterizzazione delle EVs possibilmente utili, non sapendo quale delle varie popolazioni sia quella con propriet? terapeutiche non ? facile decidere le condizioni di immagazzinamento corrette. Ad aggravare la situazione, una scelta errata potrebbe risultare in aggregazione o scoppio di alcune popolazioni di vescicole senza intaccarne altre, aumentando ancora di pi? la variabilit? del sistema.

? Entrando nel campo pionieristico dell?ingegnerizzazione delle EVs, ancora meno tecnologie sono state sviluppate in questo ambito.

Sono state proposti alcuni metodi per internalizzare molecole di varia natura nelle EVs e lo standard allo stato dell?arte ? l?elettroporazione delle vescicole. Purtroppo, svantaggiosamente, la resa finale del materiale internalizzato ? modesta, con limiti tecnici soprattutto per quanto riguarda le dimensioni del materiale da internalizzare (pi? la molecola ? grande, meno ? probabile che riesca ad entrare nelle vescicole), e per quanto riguarda il mantenimento della struttura delle vescicole (l?elettroporazione o altri sistemi chimici di apertura di pori nelle membrane delle EVs creano danni alle vescicole, causandone spesso anche lo scoppio, risultando in una resa estremamente bassa di vescicole cariche). Infine, anche quando la procedura di elettroporazione ha successo nell?internalizzare del materiale desiderato, la concentrazione di molecole all?interno delle vescicole risulta purtroppo essere sempre piuttosto modesta.

Attualmente non esistono terapie basate su vescicole, tantomeno quelle ingegnerizzate. La letteratura scientifica si basa su esperimenti in vitro e pochi dati preclinici su vescicole raccolte in modo naturale (no ingegneria, no modifiche alle vescicole stesse).

Il problema attualmente nell'uso di vescicole prodotte naturalmente e' soprattutto quello di produrne in quantita' sufficiente per un uso terapeutico, e in caso come immagazzinarle tra la produzione e l'uso.

Non c'e' nessuna procedura che ad oggi possa ingegnerizzare delle vescicole in modo efficiente, adattabile e con una resa tale da essere realmente utilizzabili in clinica.

Ad oggi l?utilizzo delle nanoparticelle ? sempre stato relegato ai laboratori specializzati, motivo per cui anche volendole utilizzare a largo spettro per terapie ospedaliere questo non sarebbe possibile data la scarsa resa in produzione e difficolt? di immagazzinamento.

E? dunque uno scopo della presente invenzione descrivere una macchina per la produzione di nanoparticelle o vescicole in quantit? tali da poter essere successivamente utilizzate a fini terapeutici.

E? un ulteriore scopo della presente invenzione descrivere una macchina per la produzione di nanoparticelle ?on demand? ovvero gi? ingegnerizzate per uno scopo terapeutico preciso.

Ancora uno scopo della presente invenzione ? quella di descrivere una macchina per la produzione di nanoparticelle che possa essere utilizzata direttamente nella sede in cui verr? messo in atto il trattamento terapeutico basato su dette nanoparticelle senza dover ricorrere a laboratori esterni. Un ulteriore scopo della presente invenzione ? quello di descrivere una macchina per produzione di nanoparticelle che possa processare il materiale biologico, dall?inizio alla fine, in totale sterilit? senza coinvolgimento di personale addetto.

E? ancora uno scopo della presente invenzione descrivere una macchina per produzione di nanoparticelle che, anche dopo la fase di produzione delle medesime, possa autoigienizzarsi. E? un ulteriore scopo della presente macchina per produzione di nanoparticelle che sia adatta a produrre nanoparticelle utilizzabili in una pluralit? di trattamenti.

BREVE DESCRIZIONE DELL?INVENZIONE

Questi ed ulteriori scopi saranno raggiunti grazie alla presente invenzione che descrive un innovativo metodo per la produzione di nanoparticelle specifiche, ovvero vescicole bioingegnerizzate dedicate dai globuli rossi del paziente stesso per produrre ad esempio terapie antitumorali ingegnerizzate e personalizzate.

La richiedente ha infatti sviluppato una metodica innovativa (che utilizza i globuli rossi del paziente per produrre una terapia mirata antitumorale

Tale metodica ? composta di quattro fasi principali:

? La raccolta e purificazione dei globuli rossi ? L?iniezione di materiale utile per fare terapia (genica o convenzionale/farmacologica) all?interno dei globuli rossi

? La trasformazione dei globuli rossi in vescicole tramite estrusione.

? L?attivazione delle vescicole tramite l?aggiunta di anticorpi bispecifici sulla superficie.

Ancora, in modo ulteriormente vantaggioso, ? stata realizzata una macchina che ? in grado di mettere in attuazione tale metodica, macchina senza la quale step fondamentali del metodo non potrebbero essere effettuati per uso clinico (non possibili manualmente) come vedremo qui di seguito. (Questo perch? alcuni passaggi non potrebbero essere effettuati in sterilit?, condizione necessaria per poter essere utilizzati in ambito clinico. La procedura manuale oltre ad essere lenta e limitata in quantit? essendo fatta a mano non ? iniettabile nel paziente per impossibilit? di mantenimento requisiti di sterilit? adeguati ed altro.)

Questi ed ulteriori scopi saranno raggiunti dalla innovativa macchina per produzione di vescicole bioingegnerizzate dedicate qui di seguito anche semplicemente ?macchina? che comprende almeno un primo blocco di filtraggio che converge in un blocco di microiniezione (4) che comprende almeno una od una pluralit? di camere di microiniezione (5) per globuli rossi detto blocco comprende un sistema microidraulico (6) e detto sistema microidraulico essendo atto a trasportare i globuli rossi in arrivo da una precedente filtrazione verso un?entrata (i??) di detta almeno una camera di microiniezione, un sistema di aspirazione (Ai) ed un sistema di iniezione (Si) ed almeno un regolatore di pressione (Rp) ed almeno una camera di collezione (C) , detta almeno un camera di microiniezione (5) comprendendo almeno un'entrata (i??) ed un?uscita (U?) per i globuli rossi (Gr) da microiniettare e sono compresi uno o pi? sensori (L1,L2) per comandare la chiusura e l?apertura di detta entrata (i??) ed uscita (u?) per riempire, mantenere chiusa e poi svuotare la camera di microiniezione, in ognuna di dette camera essendo presente almeno un globulo rosso alla volta quando essa ? piena, detto iniettore (Si) iniettando un reagente nel globulo rosso di una camera, detto sistema di aspirazione (Ai) trattenendo in posizione il globulo rosso in fase di iniezione, una volta iniettato detto globulo rosso essendo convogliato in una camera di collezione (C) per raccogliere i globuli rossi microiniettati con il reagente, a seguire il blocco di microiniezione ? compresa nella macchina (1) un secondo blocco di filtraggio (7), una camera di estrusione (10), una camera di incubazione (15), un terzo blocco di filtraggio (20) ed un aliquotatore (30).

In relazione alla camera di microfiltrazione, il sensore potendo essere un sensore luminoso che chiude l?entrata quando i globuli rossi all?interno della camera sono in numero sufficiente, ovvero quando un singolo globulo rosso ? presente all?interno della camera di microiniezione.

Dunque, in modo particolarmente vantaggioso, detta camera di microiniezione consente di realizzare ed ottenere risultati fino ad oggi mai possibili nella tecnica nota (mai prima ? stato pensato di microiniettare globuli rossi) infatti vantaggiosamente detta camera d? la possibilit? di:

- iniettare qualsiasi sostanza/agente nei globuli rossi, quindi terapie geniche di vario tipo, ma anche farmaci od applicare altre tecnologie;

- aumentare la concentrazione del materiale inserito anche di 100-1000 volte nei confronti delle tecniche attualmente in uso (elettroporazione o porazione chimica);

- conferire maggior stabilit?' del prodotto: i globuli rossi vengono microiniettati e poi successivamente ridotti in vescicole. Attualmente per caricare le vescicole di materiale terapeutico si prova a lavorare direttamente sulle vescicole stesse, che si ricorda essere di un diametro di 100-200 nanometri, quindi molto complicate da manipolare. Le attuali tecniche danneggiano le vescicole pesantemente, fino anche a scoppiare. Al contrario, i globuli rossi sono capaci di resistere allo stress dell'iniezione senza soffrirne particolarmente hanno diametro di 6-8 micrometri (6000-8000 nanometri) per cui dimensioni molto maggiori. Vengono poi prodotte le vescicole successivamente ottenendo un materiale molto piu' omogeneo e meno danneggiato.

Detta macchina comprendendo ulteriormente un primo blocco di filtraggio a monte del blocco di microiniezione comprendente due entrate una per ricevere il sangue ed una per un reagente di diluizione e due uscite, una diretta all?entrata di almeno una camera di microiniezione ed una per gli scarti di filtraggio. Detto blocco di filtraggio comprendendo pi? sezioni dotate di filtri progressivamente pi? strette in grado in una sezione intermedia, di trattenere i globuli rossi da inviare ad una delle uscite dette verso detto blocco di microiniezione.

Detta camera di collezione (di cui sopra) essendo connessa ad una secondo blocco di filtraggio comprendente un?entrata, preferibilmente due uscite ed almeno un filtro per depurare ulteriormente i globuli rossi attraverso il passaggio in detto filtro.

Detta macchina comprende inoltre una camera di estrusione comprendente un ingresso per l?entrata dei globuli rossi in una camera centrale uno o pi? pistoni ed uno o pi? filtri per produrre estrudendo dai globuli rossi delle vescicole cariche ed ? compresa inoltre un'uscita per dette vescicole.

Detta macchina comprendendo ancora una camera di incubazione comprendente due ingressi ed un'uscita, detti ingressi sono atti a far affluire vescicole cariche e un reagente; l?uscita serve per far uscire vescicole ancorate ad un reagente, ci? per mezzo della reazione tra vescicole e reagente in contatto in detta camera di incubazione.

Detta macchina comprendendo ancora un terzo blocco di filtraggio comprendete un'entrata ed un'uscita ed almeno un filtro. L?entrata ? connessa con l?uscita della camera di incubazione. Detto filtro depura ulteriormente le vescicole ancorate e produce vescicole ancorate purificate.

Detta macchina comprende ulteriormente un aliquotatore comprendente una entrata ed una o pi? uscite, detta entrata per ricevere le vescicole ancorate purificate e detto aliquotatore per distribuire verso l?una o pi? uscite le vescicole ancorate purificate in contenitori ermetici per somministrare/conservare il terapeutico (le vescicole ancorate purificate).

In sostanza, in modo particolarmente vantaggioso, la metodica innovativa qui descritta, automatizzata dallo strumento proposto, ha come pregi:

- essere altamente adattabile, la microiniezione permette di inserire ogni tipo di materiale in concentrazioni note e dalle 100 alle 1000 volte pi? alte se comparata alle tecniche attuali. Si possono selezionare farmaci, terapie geniche, materiale proteico o chemioterapici senza modificare la procedura.

- pu? essere modificata per riconoscere cellule di diverso tipo: l'aggiunta di anticorpi bispecifici sulla superficie delle vescicole prodotte dallo strumento che segue la metodica permette il riconoscimento di ogni tipo cellulare, per cui cambiando anticorpo si pu? cambiare cellula bersaglio. Nuovamente questa scelta non modifica la procedura in s?. - il materiale necessario perche' lo strumento processi il sangue in vescicole come da presente invenzione ? pochi ml di sangue intero del paziente. Vi ? dunque vantaggiosamente impatto zero sulla salute del paziente e quantitativo di materiale iniziale virtualmente illimitato.

- lo strumento permette di processare il sangue intero del paziente in vescicole ingegnerizzate come da invenzione direttamente in ospedale e al momento dell'inizio della terapia, questo permette di minimizzare lo spostamento e conservazione di materiale terapeutico fragile come le vescicole.

Dispositivo macchina per produzione di vescicole bioingegnerizzate comprende un sistema di lavaggio per effettuare una procedura di lavaggio del sistema fluidico e delle componenti, ovvero i blocchi indicati, in modo da ritornare pronto e sterile per l?avvio di una nuova produzione.

Descrizione breve delle figure.

In fig.1 ? rappresentata un esempio di forma di realizzazione dell?innovativa macchina per la produzione di nanoparticelle. In fig.2 ? rappresentato il blocco di filtraggio.

In fig.3a e 3b il blocco di microiniezione e dettaglio sulla camera di microiniezione.

In fig.4 il secondo blocco di filtraggio.

In fig.5a. 5b. 5c. 5d ? rappresentata la camera di estrusione e suo funzionamento.

In fig. 6 ? rappresentata la camera di incubazione.

In fig. 7 ? rappresentato il terzo blocco di filtraggio.

In fig. 8 ? rappresentato l?aliquotatore.

Descrizione dettagliata delle figure.

In fig.1 ? rappresentata la macchina 1 che sostanzialmente si pu? presentare come un corpo parallelepipedo o comunque copro sostanzialmente chiuso e trasportabile adatto allo scopo ovvero quello di contenere tutte le parti che sotto verranno meglio descritte.

Nelle seguenti figure sono rappresentati i blocchi/camere della macchina in ordine del loro funzionamento.

In fig. 2 ? rappresentato il primo blocco di filtraggio 2, questo blocco comprende due ingressi I1 e I2, pi? due uscite U1 e U2, al suo interno sono presenti dei filtri 3 con maglie di dimensioni variabili, progressivamente pi? strette. Il campione di sangue S viene inserito direttamente dalla siringa nel macchinario attraverso l?ingresso I1. Dall?ingresso I2 viene pompato il reagente (con tecnica nota) di diluizione del sangue (fornito in un kit annesso).

Il sangue diluito passa attraverso i filtri 3a,3b in modo da dividere le varie popolazioni cellulari presenti nel sangue per dimensioni. In questo modo le cellule pi? grandi del sistema immunitario restano intrappolate nel primo filtro 3a perch? troppo grandi per passare. La seconda sezione di filtraggio (secondo filtro 3b a maglie pi? strette) intrappola i globuli rossi (ovvero il materiale che si vuole collezionare) e lascia passare le piastrine e il materiale non cellulare presente nel sangue. A questo punto i filtri vengono chiusi (tramite appositi mezzi noti, quali pannelli di scorrimento) e viene recuperata solo la porzione di materiale comprendente i globuli rossi che giace tra il filtro 3a e il filtro 3b e detto materiale viene fatto scorrere fuori tramite l?uscita U1. L?uscita U1 si chiude dopo aver raccolto i globuli rossi, i filtri si aprono e tutto il contenuto di scarto viene pompato (ad esempio con una pompa non rappresentata in figura) fuori tramite l?uscita U2.

Il materiale in ingresso da I1 ? dunque sangue intero e da I2 il reagente di diluizione dal kit. Il materiale in uscita da U1 sono i globuli rossi purificati GR dalle altre componenti del sangue.

In fig. 3a, 3b ? invece rappresentato il blocco di microiniezione 4 nel suo complesso ed in figura 3b il dettaglio di una camera di microiniezione 5.

Detto blocco di microiniezione 4 comprende quindi camere di microiniezione 5 un sistema microidraulico 6; un'entrata Im ? collegata al sistema microidraulico 6 per ricevere i globuli rossi GR purificati provenienti dal blocco di filtraggio 2. I globuli rossi GR scorrono nel sistema microidraulico 6 e vengono aspirati all?interno delle camere 5 che possono essere presenti in numero variabile. Ogni camera di iniezione 5 comprende un ingresso Ii ed una uscita Ui ed un sistema di iniezione Si ed un sistema di aspirazione Ai entrambi collegati tramite tubi ad uno strumento di regolazione della pressione RP. All?ingresso della camera c?? una luce L1 e un sensore L2, se il flusso di luce viene interrotto (a significare che un singolo globulo rosso ? entrato nella camera di iniezione) la camera si chiude.

Quando le camere di iniezione sono pronte, ovvero quando un singolo globulo rosso ? presente all'interno della cameretta e la camera si chiude, si ? pronti per la procedura di iniezione e il globulo rosso presente viene microiniettato con un reagente Alpha.

In questa fase il sistema di iniezione S1 aspira il reagente Alpha e lo inietta successivamente nel globulo rosso GR. L?aspiratore Ai ha la funzione di trattenere il globulo rosso in posizione durante l?iniezione.

Pi? dettagliatamente: quando la camera di iniezione 5 ospita il globulo rosso, essa viene chiusa e l?aspiratore Ai si attiva, facendo aderire il globulo rosso alla parete inferiore della camera e permettendo all?ago dell?iniettore S1 di penetrare le membrane. L?iniettore S1 a questo punto pompa all?interno del globulo rosso il reagente Alpha.

Al termine di questa operazione l?aspiratore Ai rilascia il globulo rosso che torna a vagare nella camera di iniezione,quindi l?uscita Ui si apre e il globulo rosso caricato va nella camera di collezione C per mezzo dell?entrata Ic. L?uscita Ui si richiude, l?ingresso Ii di ogni camera di iniezione si riapre ed il processo descritto si ripete continuando a caricare i globuli rossi del reagente Alpha finch? la cameretta di collezione C non risulta piena. La cameretta di collezione C si apre quando diventa piena e tramite l?uscita Uc il liquido viene inviato al secondo blocco di filtraggio 7.

Si hanno quindi come materiale in ingresso alla camera 5 globuli rossi purificati e reagente Alpha; come materiale in uscita globuli rossi caricati di reagente Alpha.

In fig.4 ? rappresentato il secondo blocco di filtraggio 7 a cui giungono i globuli rossi attraverso una entrata IF2 dalla camera di collezione C. ? visibile un filtro 8 con maglie molto strette in modo da dividere i globuli rossi carichi, da qualunque residuo di cellule rotte durante la procedura di iniezione. ? presente inoltre una uscita UF2 verso la camera di estrusione 10 ed un'uscita UF2S per drenare gli scarti del filtraggio. Si entra quindi nel blocco 7 con globuli rossi carichi e potenziali residui di membrane rotte e scarti cellulari e si esce con globuli rossi carichi e ripurificati. In fig. 5a, 5b,5c, 5d sono visibili la camera di estrusione 10 ed i vari step di lavorazione: una camera centrale 11, un ingresso ICE e una uscita UCE, un filtro a micropori 13 ad esempio di dimensioni 100 nM (filtro che pu? essere cambiato per utilizzare dimensioni diverse, se necessario, e per rinnovarlo periodicamente) e due pistoni 12. I globuli rossi carichi e ripurificati entrano nella camera centrale 11 tramite l?ingresso ICE e l?ingresso ICE si chiude.

I due pistoni 12 spingono alternativamente tutto il materiale attraverso il filtro 13 in andata e ritorno numerose volte come mostrato nella figure 5b, 5c, 5d in posizione I e II, in modo da trasformare, i globuli rossi carichi, che sono forzati a passare attraverso un ?estrusore?, comprendente fori di passaggio di dimensioni molto ridotte, in vescicole V con le dimensioni medie di 150nM (o dimensioni maggiori o minori in base al filtro inserito). In sostanza i globuli rossi subiscono un?elevata pressione per essere forzati a passare in detti filtri, cos? ottenendo vescicole di dimensioni pi? ridotte del globulo di partenza.

Al termine della procedura l?uscita UCE si apre e permette alle vescicole V di passare verso una camera di incubazione 15 come mostrato nella posizione III.

Si entra quindi nella camera di estrusione 10 con globuli rossi carichi e purificati e si esce con vescicole V cariche. In fig. 6 ? visibile la camera di incubazione 15 con due ingressi I1B e I2B, e l?uscita U1B. Le vescicole cariche V arrivano nella camera di incubazione C attraverso l?ingresso I1B, dall?ingresso I2B viene invece fatto entrare un reagente Beta.

Si apre una parentesi: Il reagente Beta contiene gli anticorpi bispecifici selezionati, questi sono dei frammenti di anticorpi legati coda-testa tra loro. Una faccia riconosce delle proteine di membrana presenti sulle vescicole, mentre l'altra faccia opposta pu? essere scelta tra una lista infinita in commercio (o persino sviluppata indipendentemente) che riconosca una proteina sulla superficie della cellula tumorale.

In questo modo sulle vescicole vengono aggiunte una sorta di ancore, specifiche per il tipo di cellula tumorale che si deve trattare.

Nuovamente per cambiare cellula bersaglio basta cambiare una delle due teste (quella di riconoscimento del tumore) con una forma differente. Da qui' la grande potenzialit? di adattamento della terapia come da metodo ed apparecchio descritto.

Si definisce: testa la parte di riconoscimento, e le code le parti che si uniscono a formare l'anticorpo bispecifico. Testa (rivolta alla vescicola) - coda - coda - testa (rivolta all'esterno per riconoscere il tumore).

La camera di incubazione permette agli anticorpi bispecifici (reagente beta) di reagire con le vescicole unendosi ai recettori di membrana e formando delle ancore che permettono di direzionare le vescicole contro le cellule tumorali: in particolare gli anticorpi bispecifici riconoscono le proteine bersaglio in autonomia e ci si attaccano. Quello che succede lasciando le vescicole in presenza degli anticorpi per un tempo sufficiente e' che la testa che riconosce le proteine sulla vescicola viene a legarsi alla vescicola stessa, orientando l'altra testa nella direzione opposta. Questo permette alla vescicola di riconoscere il tumore tramite questa forma di ancora formata dagli anticorpi bispecifici.

Al termine della reazione si otterr? un liquido che comprende vescicole cariche e ancorate agli anticorpi bispecifici che esce tramite U1B verso il terzo modulo di filtraggio 20.

Si entra quindi nella camera di incubazione 15 con vescicole cariche e reagente Beta e si esce con vescicole VCA cariche e ancorate agli anticorpi bispecifici.

In fig.7 ? rappresentato un terzo blocco di filtraggio 20 con un ingresso IB3 ed uscita UB3, detto blocco comprende quindi un filtro 21 che ? realizzato per separare tutto il materiale di dimensioni troppo piccole (resti di membrane rotte durante l?estrusione, anticorpi che non hanno reagito ecc?) dalle vescicole VCA cariche e ancorate. Le vescicole purificate vengono fatte fuoriuscire tramite l?uscita UB3 verso l?ultimo blocco 30; il materiale in ingresso al blocco 20 sono vescicole cariche e ancorate VCA agli anticorpi bispecifici e potenziali residui di membrane rotte e scarti cellulari, mentre il materiale in uscita ? rappresentato da vescicole cariche e ancorate agli anticorpi bispecifici ripurificate dagli scarti che escono da un?uscita UB4.

In fig.8 ? rappresentato un aliquotatore 30 (noto in tecnica) con lo scopo di aliquotare il materiale prodotto nei vari contenitori 33 predisposti. ? presente una camera di aliquotazione 31 con un ingresso IAL ed un alloggiamento 34 per i contenitori presenti nel kit. Le vescicole cariche e ancorate entrano nella camera attraverso l?ingresso IAL e un sistema di pompaggio (qui non rappresentato) divide il materiale equamente nei vari contenitori 33 che l?operatore pu? recuperare e conservare per la terapia; il materiale in ingresso sono vescicole cariche e ancorate agli anticorpi bispecifici ripurificate VCA mentre il materiale in uscita sono i contenitori ermetici con terapeutico come da metodo descritto ottenendo vescicole ingegnerizzate innovative.

Al termine della produzione di vescicole ingegnerizzate, il macchinario avvia una procedura di lavaggio del sistema fluidico e delle componenti, in modo da ritornare pronto e sterile per l?avvio di una nuova produzione.

Questa metodica e la sua strumentazione dedicata risolvono numerosi problemi attualmente presenti nel campo biomedico di applicazione di terapeutici basati su EVs quali vantaggiosamente:

? Ottenimento dell?uniformit? delle vescicole. Partendo da un materiale purificato come i globuli rossi e producendo le vescicole tramite estrusione, ? possibile ottenere un prodotto uniforme in termini di caratteristiche di composizione della membrana, contenuto di proteine e contenuto interno. Inoltre la scelta di utilizzare globuli rossi come tipo cellulare ? assolutamente voluto, in quanto i globuli rossi non possiedono nucleo, rendendo impossibile un eventuale trasporto orizzontale di materiale genetico tra cellula e cellula.

? Miglioramento di quantitativo di materiale ottenuto: in un solo microlitro di sangue sono presenti circa 5 milioni di globuli rossi, ed ogni globulo rosso viene disgregato in milioni di vescicole. Un prelievo di sangue di circa 1 ml da un paziente potrebbe fornire abbastanza materiale allo strumento per produrre terapeutico per una o due settimane di trattamento. Il prelievo di sangue ? una procedura ad impatto pari a zero sul paziente, un prelievo singolo pu? arrivare anche a decine di ml di sangue intero senza causare alcun problema.

? Miglioramento nell?immagazzinamento del materiale: grazie alla realizzazione innovativa di una macchina che pu? portare a termine tutto il procedimento in automatico, per la prima volta in assoluto sar? possibile preparare il materiale direttamente in ospedale senza necessit? di personale iper specializzato. Quindi essendo preparato nell?ospedale, vantaggiosamente rispetto alla tecnica nota il terapeutico TRuTh non necessita di essere trasportato e mantenuto a temperatura controllata, le fiale prodotte in sterilit? possono essere mantenute in un frigo a 4? o -20? fino ad utilizzo in modo molto pi? semplice.

? Vantaggiosamente non vi sar? nessuna necessit? di donatori compatibili, nessuna risposta allergica o immunogenica al terapeutico. Il materiale di partenza ? il sangue del paziente stesso, questo riduce al minimo ogni tipo di possibile risposta allergica, di rigetto o immunogenica al momento dell?utilizzo delle vescicole TRuTh.

? Uniformit? del contenuto delle vescicole: micro Iniettando la terapia genica all?interno dei globuli rossi si possono raggiungere concentrazioni anche 1000 volte maggiori di quelle che si ottengono attualmente tramite elettroporazione e porazione chimica.

Questo innovativamente rendendo la singola vescicola TRuTh, derivata da globuli rossi microiniettati, molto pi? funzionale e con un contenuto ben conosciuto dato che ? selezionato e inserito dall?utente.

? Vi sar? un'alta resa di vescicole cariche rispetto al materiale di partenza. Di norma infatti recuperare EVs dalle colture cellulari, come detto in precedenza, necessita di quantitativi elevati di cellule per una resa veramente scarsa. Il metodo di produzione di vescicole bioingegnerizzate dal sangue del paziente innovativo qui descritto, grazie alla presente macchina, invece produce sufficienti vescicole cariche e pronte per l?utilizzo da un materiale iniziale di anche solo un ml.

? Vi sar? totale sterilit? del prodotto finale: Lo strumento o macchina ? ideato/a per trasformare una siringa di sangue in diverse fiale di vescicole bioingegnerizzate dedicate, completamente in autonomia e senza che il sangue entri in contatto con ambienti non controllati. Lo strumento rilascia le fiale di vescicole bioingegnerizzate dedicate con il contenuto completamente sterile.

? Il prodotto finale ? modificabile grazie alle diverse possibilit? di materiale, reagente etc. che si possono inserire nella macchina: contrariamente a qualsiasi tipo di medicinale, le vescicole bioingegnerizzate dedicate qui descritte hanno un altissimo livello di adattabilit?, cosa che rende questa terapia una piattaforma utile per attaccare qualsiasi tipo di patologia tumorale o genetica. Con l?appoggio di studi mirati e la produzione di kit specifici per le varie patologie, il metodo per la produzione di vescicole bioingegnerizzate dedicate al singolo paziente realizzata con questa macchina pu? essere riadattata e resa efficace contro virtualmente ogni tipo di tumore.

Appare evidente come la presente invenzione che si compone di apparecchiatura per la produzione di vescicole bioingegnerizzate dedicate e relativo metodo altrettanto innovativo siano in grado di dare una svolta al settore e risolvere i citati problemi e/o limiti d?arte nota: per cui modifiche nelle parti della macchina qualora non impattanti sul procedimento e/o nel procedimento o metodo stesso, cos? come forme di realizzazione integrative, purch? in linea con gli scopi e la tecnica della presente invenzione saranno da considerarsi compresi nell?ambito di tutela della presente invenzione cos? come meglio chiarito dalle annesse rivendicazioni.

Claims (10)

RIVEDICAZIONI

1. Dispositivo (1) macchina per produzione di vescicole bioingegnerizzate dedicate comprendente almeno un blocco di microiniezione (4) che comprende almeno una od una pluralit? di camere di microiniezione (5) per globuli rossi detto blocco comprende un sistema microidraulico (6) e detto sistema microidraulico essendo atto a trasportare i globuli rossi in arrivo da una precedente filtrazione verso un?entrata (i??) di detta almeno una camera di microiniezione, un sistema di aspirazione (Ai) ed un sistema di iniezione (Si) ed almeno un regolatore di pressione (Rp) ed almeno una camera di collezione (C) , detta almeno un camera di microiniezione (5) comprendendo almeno un'entrata (i??) ed un?uscita (U?) per i globuli rossi (Gr) da microiniettare e sono compresi uno o pi? sensori (L1,L2) per comandare la chiusura e l?apertura di detta entrata (i??) ed uscita (u?) per riempire, mantenere chiusa e poi svuotare la camera di microiniezione, in ognuna di dette camera essendo presente almeno un globulo rosso alla volta quando essa ? piena, detto iniettore (Si) iniettando un reagente nel globulo rosso di una camera, detto sistema di aspirazione (Ai) trattenendo in posizione il globulo rosso in fase di iniezione, una volta iniettato detto globulo rosso essendo convogliato in una camera di collezione (C) per raccogliere i globuli rossi microiniettati con il reagente, a seguire il blocco di microiniezione ? compresa nella macchina (1) un secondo blocco di filtraggio (7), una camera di estrusione (10), una camera di incubazione (15), un terzo blocco di filtraggio (20) ed un aliquotatore (30).

2. Dispositivo (1) macchina per produzione di vescicole bioingegnerizzate secondo la rivendicazione 1, in cui detto primo blocco di filtraggio 2 a monte del blocco di microiniezione 4 comprende almeno due entrate (I1,I2) una per ricevere il sangue ed una per un reagente di diluizione e due uscite U1,U2, una diretta all?entrata di almeno una camera di microiniezione ed una per gli scarti di filtraggio, detto blocco di filtraggio comprendendo pi? sezioni dotate di filtri (3) con maglie di dimensioni variabili, progressivamente pi? strette progressivamente pi? strette in grado, in una sezione intermedia, di trattenere i globuli rossi da inviare ad una delle uscite dette verso detto blocco di microiniezione (4).

3. Dispositivo (1) macchina per produzione di vescicole bioingegnerizzate secondo le rivendicazioni precedenti, in cui detta camera di collezione (C) di detto blocco (4) essendo connessa ad una secondo blocco di filtraggio (7) comprendente almeno un?entrata IF2 per detti globuli rossi provenienti da detta camera ( C), ed almeno un filtro (8) per depurare ulteriormente i globuli rossi attraverso il passaggio in detto filtro (8), detto filtro (8) avendo maglie molto strette in modo da dividere i globuli rossi carichi, da qualunque residuo di cellule rotte durante la procedura di iniezione, detto blocco di filtraggio comprendendo almeno due uscite, di cui una uscita (UF2) verso la camera di estrusione (10) ed un'uscita (UF2S) per drenare gli scarti del filtraggio, si entra quindi nel blocco 7 con globuli rossi carichi e potenziali residui di membrane rotte e scarti cellulari e si esce con globuli rossi carichi e ripurificati.

4. Dispositivo (1) macchina per produzione di vescicole bioingegnerizzate secondo le rivendicazioni precedenti, in cui a valle di detto blocco di filtraggio (7) ? presente una camera di estrusione (10) comprendente un ingresso (ICE) per l?entrata dei globuli rossi in una camera centrale (11) ed uno o pi? pistoni (12) ed uno o pi? filtri (13) per estrudere forzando i globuli rossi per mezzo dei pistoni (12) attraverso il filtri (13) e cos? ricavando da detti globuli rossi vescicole cariche, ? inoltre presente un'uscita (UCE) per dette vescicole, si entra quindi nella camera di estrusione (10) con globuli rossi carichi e purificati e si esce con vescicole (V) cariche.

5. Dispositivo (1) macchina per produzione di vescicole bioingegnerizzate secondo le rivendicazioni precedenti, in cui a valle di detta camera di estrusione (10) ? presente camera di incubazione (15) comprendente due ingressi (Iib, I2b) ed un'uscita (U1b), detti ingressi sono atti rispettivamente a far affluire vescicole cariche e un reagente, l?uscita serve per far uscire vescicole ancorate ad un reagente, ci? per mezzo della reazione tra vescicole (V) e reagente in contatto in detta camera di incubazione, la camera di incubazione permette al reagente di reagire con le vescicole (V) unendosi a recettori di membrana di dette vescicole e formando delle ancore che permettono di direzionare le vescicole contro determinate cellule, al termine della reazione si otterr? un liquido che comprende vescicole cariche e ancorate agli anticorpi bispecifici che esce tramite U1B verso il terzo blocco di filtraggio (20).

6. Dispositivo (1) macchina per produzione di vescicole bioingegnerizzate secondo le rivendicazioni precedenti, in cui il reagente contiene anticorpi bispecifici selezionati, questi sono dei frammenti di anticorpi legati coda-testa tra loro, una faccia riconosce delle proteine di membrana presenti sulle vescicole, mentre l'altra faccia opposta riconosce una proteina sulla superficie della cellula selezionata.

7. Dispositivo (1) macchina per produzione di vescicole bioingegnerizzate secondo le rivendicazioni precedenti, in cui a valle della camera di incubazione (15) ? connesso un terzo blocco di filtraggio (20) con un ingresso (IB3) ed uscita (UB3), detto blocco comprendendo almeno un filtro 21 che atto a separare tutto il materiale di dimensioni troppo piccole (resti di membrane rotte durante l?estrusione, anticorpi che non hanno reagito ecc?) dalle vescicole (V) cariche e ancorate, il materiale in ingresso al blocco (20) sono vescicole cariche e ancorate VCA ad anticorpi bispecifici e potenziali residui di membrane rotte e scarti cellulari, mentre il materiale in uscita ? rappresentato da vescicole cariche e ancorate agli anticorpi bispecifici ripurificate dagli scarti, i quali che escono da un?uscita UB4 del blocco (20).

8. Dispositivo (1) macchina per produzione di vescicole bioingegnerizzate secondo le rivendicazioni precedenti, in cui a valle del terzo blocco di filtraggio (20) ? presente un blocco aliquotatore (30), le vescicole purificate vengono tramite l?uscita (UB3) del blocco (20) convergono verso detto ultimo blocco (30) che ha lo scopo di aliquotare il materiale prodotto in contenitori (33) predisposti, ? presente una camera di aliquotazione (31) con un ingresso (IAL) ed un alloggiamento (34) per i contenitori (33), le vescicole cariche e ancorate entrano nella camera (31) attraverso l?ingresso (IAL) e un sistema di pompaggio divide il materiale ovvero le vescicole (V) equamente nei vari contenitori (33); il materiale in ingresso sono vescicole cariche e ancorate agli anticorpi bispecifici ripurificate, ovvero vescicole ingegnerizzate, (V) mentre il materiale in uscita sono i contenitori (33) ermetici con il prodotto.

9. Dispositivo (1) macchina per produzione di vescicole bioingegnerizzate secondo le rivendicazioni precedenti, in cui il dispositivo (1) comprende un sistema di lavaggio per effettuare una procedura di lavaggio del sistema fluidico e delle componenti, ovvero i blocchi indicati, in modo da ritornare pronto e sterile per l?avvio di una nuova produzione.

10. Metodo per la produzione di vescicole bioingegnerizzate dedicate a partire dai globuli rossi realizzato almeno dal dispositivo di cui alle rivendicazioni precedenti comprendente almeno le fasi di:

? La raccolta e purificazione dei globuli rossi da altre particelle presenti nel sangue;

Caratterizzato dal fatto che in detto globuli rossi purificati avviene

? l?iniezione di materiale utile per fare terapia (genica o convenzionale/farmacologica) all?interno dei globuli rossi;

? La trasformazione dei globuli rossi in vescicole tramite estrusione.

? L?attivazione delle vescicole tramite l?aggiunta di anticorpi bispecifici sulla superficie.