JPH02160724A - ヘモグロビン複合乳剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 特定の性質を有するヘモグロビン複合乳剤は代用血液と
しての酸素の供給及びその他の酸素担持プロセスに適し
ている。外部の食塩水溶液中の生理的に適合しうる鉱油
または植物油に包まれた高ヘモグロビン含量水溶液の二
重乳剤は、血管から目的の体組織または器官への酸素流
を形成するために、充分に小さい液滴として提供される
。こわれやすい物質であるヘモグロビンを上記用途に必
要な高い酸素交換活性を維持させながら、ヘモグロビン
含量の高い水中油中水滴型複合乳剤（ｗａ　ｔ　ｅ　ｒ
ｉｎ　ｏｉｌ　ｉｎ　ｗａｔｅｒ　ｍｕｌｔｉｐｌｅ　
ｅｍｕｌｓｉｏｎ）に調合する。

多くの生理的及び工業的用途において、酸素消耗環境へ
酸素を供給するための酸素担持化学薬品を入手可能にす
ることは重要である。最も重要な態様の１つは効果的な
酸素担持代用血液を提供することである。全血の充分な
供給が無い緊急事態の他にも、合成代用血液の使用には
全血の使用を凌駕した利益が存在する。例えば、血管の
制限から生ずる組織または器官の血流不足による酸素供
給率低下は全血の使用によって治療することができない
が、かさ密度の小さい代用血液は収縮した血管を通して
酸素を供給することができるので、動脈の収縮によって
生ずる心臓発作を予防する。

代用血液の使用は例えば肝炎及び後天性免疫不全症候群
のような血液に起因する感染性疾患の伝染を阻止する。

血液に対する不耐性またはアレルギーの他の問題も合成
血液代用薬の使用によって解決される。

理想的な合成代用血液は肺における酸素負荷と組織にお
ける酸素放出とを可能にするために高い酸素担持能と低
い酸素親和力；血漿のコロイド浸透圧に近いコロイド浸
透圧：全血の粘度に比べて同じかまたは低い粘度；人体
に対する無害性；抗原性の影響の無い組織適合性；酸素
供給の好ましい必要性を満たすための循環系における充
分な寿命；化学的原因物質の比較的迅速な代謝または排
泄及び充分な貯蔵安定性を有さなければならない。

現在までに、アメリカ合衆国において使用を全面的に認
可された代用血液は存在しない。

代用血液供給の１つのアプローチは受動酸素溶解性の高
い媒質、主として過フッ化炭素乳剤の使用であったが、
この乳剤は不安定であり、不充分な酸素担持能を有し、
ヒトに対して有害であることが分っている。過フッ化炭
素乳剤に伴う問題はフッ化炭素が受動溶解性によって酸
素担持するために必要な高い酸素濃度と安定性を維持す
るために凍結状態で乳剤を保存する必要性である。

現在量も有望なアプローチには、種々な形式の化学的ヘ
モグロビンの使用がある。ストローマを含まない（ｓｔ
ｒｏｍａ−ｆｒｅｅ　）ヘモグロビン溶液は充分な酸素
担持能を有するが、これらは高い酸素親和力、高いコロ
イド浸透圧、可能な有害性、及び血管循環からの迅速す
ぎるクリアランスを有する。ストローマを含まないヘモ
グロビン溶液に伴う１つの問題は、これらの酸素親和力
が赤血球中の正常ヘモグロビンの酸素親和力よりはるか
に大きく、そのために酸素が細胞ヘモグロビンから抽出
されやすいことであった。エル・アール・セーガル（Ｌ
、　Ｒ，Ｓｅｈｇａｌ　）、ニス・エイ・ゴールド（Ｓ
、　Ａ、　Ｇｏｕｌｄ　）　、エイ＊ｘｈ＊’ａ−ゼン
（Ａ、Ｌ。

Ｒｏｓｅｎ　）、ジー拳ニス・モス（Ｇ、　Ｓ、　Ｍｏ
５ｓ　）　：赤血球代用薬の評価：ヘモグロビン溶液と
ペルフルオロケミカル乳剤（Ａｐｐｒａｉｓａｌ　ｏｆ
　Ｒｅｄ　Ｃｅ１ｌＳｕｂｓｔｉｔｕｔｅ　：　Ｈｅｍ
ｏｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　ａｎｄＰｅｒｆｌ
ｕｏｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｆｍｕｌｓｉｏｎｓ　）、
ラボラド巻、５４５頁（１９８３）；ニス・エイ・ゴー
ルド、エイ・エル・ローゼン、エル・アール奉ゼーガル
、ジー・ニス・モス：代用赤血球：ヘモグロビン溶液ま
たはフッ化炭素？　（Ｒｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｕｂ−ｓｔ
ｉｔｕｔｅｓ　：　Ｈｅｒｎｏｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌｕ
ｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｆｌｕ−ｏｒｏｃａｒｂｏｎ　？　）
、ジエイ・トラウ？　（Ｊ、Ｔｒａ−ｕｍａ）２２巻、
７３６頁（１９８２）；ニスゆエイ・ゴールド、エイ・
エル・ローゼン、エル・アールΦセーガル、ジー拳ニス
・モス：　代用赤血球としてのヘモグロビン溶液（Ｈｅ
ｍｏｇｌｏｂｉｎ　５ｏｌｕ−ｔｉｏｎｓ　ａｓ　Ｒｅ
ｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ　）、トランイ
・エム・ニス、チャンク（Ｔ−Ｍ−Ｓ、　、　Ｃｈａｎ
ｇ）　：代用血液としてのピリドキシル化ポリヘモグロ
ビンの製造とインビトロ特性（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
　ａｎｄＩｎ−ｖｉｔｒｏ　Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔ
ｉｃｓ　ｏｆ　Ｐｙｒｉｄｏｘｙ−巻、３５０ｊ（（１
９８０）。ピリドキシル化とその後のストローマを含ま
ないヘモグロビン溶液の重合は、高い酸素親和力と可能
な有害性とを除いて、上記問題の多くを減じている。ま
た、この方法は酸素を運搬できない形態のヘモグロビン
である、若干のメトヘモグロビンを発生する。エル、ア
ール寺セーガル、エイ・エル・ローゼン、ニス・エイ・
ゴールド、ジー拳ニス・モス：ピリドキシル化ヘモグロ
ビン重合体：正常な酸素容量を有する代用赤血球（Ｐｏ
ｌｙｍｅｒｉｚｅｄ　Ｐ）ｒｒｉｄｏｘｙｌａｔｅｄＨ
ｅｍｏｇｌｏｂｉｎ　：　Ａ　Ｒｅｄ　Ｃｅ１ｌ　５ｕ
ｂｓｔｉｔｕｔｅ　ＷｉｔｈＮｏｒｍａｌ　Ｏｘ）’ｇ
ｅｎ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　）　、サージエリ−（Ｓｕｒ
ｇｅｒｙ　）　９５巻、４３３頁、（１９８４）；ピー
・イー・ケイバート（Ｐ、　Ｅ、　Ｋｅｉｐｅｒｔ　）
−、テＢｉｏｔｅｃｈｎｏ、）　　１０巻、１３３頁（
１９８４）ナイロン膜、架橋蛋白質膜、ポリヘモグロビ
ン膜及び、リン脂質の５内にヘモグロビンを含むリボリ
ーム内にヘモグロビン溶液を封入することによって、合
成セルへのヘモグロビン封入が試みられている。アイ・
ミラーＣ１，Ｍｉｌｌｅｒ　）　：合成代用血液：現在
の状況と今後の進展（Ｓ）’ｎｔｈｅｔｉｃＢｌｏｏｄ
　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓ　：　Ｗｈｅｒｅ　Ａｒｅ　
Ｗｅ　ａｎｄＷｈｅｒｅ　Ｄｏ　Ｗｅ　Ｇｏ　Ｆｒｏｍ
　Ｈｅｒｅ　？　）、ジアールシー、クリト・レブ・パ
イオエング・（ＣＲＣＣｒｉｔ、　ＲｅＶ、ＢｉｏＥｎ
ｇ−）　１４９〜１７８頁、（１９７８年１２月号）。

架橋剤としてゲルタールアルデヒドを用いり重合ヘモグ
ロビン封入膜へのヘモグロビン溶液液滴の封入は、トー
ツス　エイ・デピス（Ｔｈｏｍａｓ　Ａ。

Ｄａｖｉｓ）、ウィリアム　ジエイ・アッシャ−（Ｗｉ
ｌｌｉａｍ　Ｊ、　Ａｓｈｅｒ　）及びバーパート　ダ
ブリュ・ワラス（Ｈｅｒｂｅｒｔ　Ｗ、　Ｗａｌｌａｃ
ｅ　）による「架橋ヘモグロビン膜を含む人工赤血球（
ＡｒｔｉｆｉｃｉａｌＲｅｄ　Ｃｅ１ｌｓ　ｗｉｔｈ　
Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ　Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ１２３
〜１３２頁ｒ１９８４）に述べられている。

リポソーム封入ヘモグロビンは、他の血液代用製品に見
られるような問題の多（を克服するが、まだ循環系から
あまりにも迅速に排除され、酸素担持能が限定されてお
り、封入効率が低（１０〜２（ｌのオーダーである。許
可された米国特許出願第９０１，７４０号（１９８６年
８月２９日出願）に述べられているリポソーム封入ヘモ
グロビンの大規模生産方法は上記問題の幾つかを克服し
ている。

油中水滴型乳剤を形成するために混合し、水中油滴型乳
剤を形成するために均質化することによる非イオン乳化
剤、脱イオン蒸留水及び液体パラフィンを用いた水中油
中水滴型乳剤の製造方法は、マツモトサチオ（５ａｃｈ
ｉｏ　Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ　）、キタヨシオ（Ｙｏｓｈ
ｉｏ　Ｋｉｔａ　）及びヨネザワダイゾー（Ｄａｉｚｏ
　Ｙｏｎｅｚａｗａ　）による「水中油中水滴型複合相
乳剤の製造における試み（Ａｎ　Ａｔｔｅｍｐｔ　ａｔ
Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ　Ｗａｔｅｒ　−ｉｎ　−Ｏｉｌ　
−ｉｎ　−ＷａｔｅｒＭｕｌｔｉｐｌｅ　Ｐｈａｓｅ　
Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ　）　Ｊ、ジャーナル５ｃｉｅｎｃ
ｅ　）　５７巻、２号、３５３〜３６１頁（１９７６）
によって開示されている。相互作用して油／水界面にお
いて粘弾性膜を形成し、外部水相にはスクロース−脂肪
酸エステルを形成する混合大豆レシチンとスパン（Ｓｐ
ａｎ）ｓｏ乳化剤とを用いる水中オリーブ油中水滴型乳
剤の製造法は、マツモトサチオ、ウエダヨシロー（Ｙｏ
ｓｈｉｒ。

Ｕｅｄａ　）、キトーヨシオ（Ｙｏｓｈｉｏ　Ｋｉｔｏ
　）　　及びヨネザワタイゾーによる［食用形でのオリ
ーブ油中水滴型複合相乳剤の製造（Ｐｒｅｐａｒａｔｉ
ｏｎ　ｏｆＷａｔｅｒ−ｉｎ−Ｏｌｉｖｅ　Ｏｉｌ　Ｍ
ｕｌｔｉｐｌｅ−ＰｈａｓｅＥｍｕｌｓｉｏｎｓ　ｉｎ
　ａｎ　Ｅａｔａｂｌｅ　Ｆｏｒｍ　）　Ｊ、アゲＣｈ
ｅｍ、　）　４２巻、４号、７３９〜７４２頁（１９７
８）。

本発明は外部水相中油中の例えばヘモグロビンのような
酸素担持物質の水溶液から成る二重液体乳剤に関する。

本発明の二重液体乳剤は油中ヘモグロビン水溶液の初乳
剤の形成と維持を容易にするための初乳化剤を有する。

外部水相中初乳創部型の二次乳剤の形成と維持には二次
乳化剤を用いる。従って、初乳剤は油相中のそれぞれが
ヘモグロビン水溶液の個別液滴または複数の個別小滴を
含む初乳剤液部から構成され、二次乳剤は第１図に示す
ように、各々が外部水相中に懸濁した初乳剤の個別液滴
または複数の個別小滴を含む二次乳剤液滴から構成され
る。

油相は充分な乳化安定性を示す鉱油または植物油から成
る。適当な植物油には、オリーブ油、べにはな油、ごま
油及び大豆油がある。Ａ４０ホワイトオイル、カーネー
ション軽油（ＣａｒｎａｔｉｏｎＬｉｇｈｔ　Ｏｆ　１
　）及びクレアロール軽油（ＫｌｅａｒｏｌＬｉｇｈｔ
　０ｉｌ）を含めた鉱油が好ましい。これらの油の混合
物も用いられる。

本発明の複合乳剤を製造するには、最初に初乳剤を調製
し、次に別のプロセスにおいて二次乳剤を調製すること
が必要である。初乳剤の製造では、最初に例えば電磁攪
拌機（ｍａｇｎｅｔｉｃ　５ｔｉｒｒｅｒ）のような攪
拌機を用いて成分を混合し、次に高ぜん断混合し、微細
流動化装置に通してキャビテーションすることが必要で
あることが判明した。二次乳剤は例えば電磁攪拌による
ような攪拌によって別に調製する、好ましい小サイズの
選択はｐ過によって達成される。二次乳剤の形成には高
ぜん断混合が適さないことが判明した。

本発明による複合乳剤は次の特性を有する：適切な最大
範囲　　好ましい範囲 粘　　　度　　　　　　　３〜９　　ｃｐ、　　　　　
３〜５　ｃｐ。

収　　　率　　　　　　８８〜９９％　　　９５〜９９
％酸素担持能　　　　　　７〜２０容量チ　１０〜２０
容量チ初乳剤と二次乳剤の液滴寸法は良好な安定性と両
立しうる程度に小さいことが好ましく、新しく製造した
初乳剤液部の５０％以上が０．５μより小さく、新しく
製造した二次乳剤液滴の５０チ以上は４μより小さい。

本発明で用いる乳剤はマクロ乳剤またはミクロ乳剤であ
る。

本発明の複合乳剤の初乳剤部分には酸素担持物質の水溶
液を用いることができる。ヒト血液またはウシ供給源か
らのヘモグロビンまたは例えばピリドキシル化ポリヘモ
グロビンのような［１ヘモグロビン等の酸素供給物質も
適している。酸素不活性化メトヘモグロビンの形成を減
するために、全プロセスを約り℃〜約８℃の低温条件下
で実施するのが好ましい。複合乳剤を代用血液として用
いる予定である場合には、プロセスを無菌条件下で実施
すべきである。複合乳剤の製造に用いる溶液は全て、代
用血液として用いる複合乳剤の製造中に滅菌フィルター
ならびに抗生物質の添加によって一過する。ヘモグロビ
ンは赤血球から技術上周知の手段によって単離し、ヘモ
グロビン濃度１１９６〜３５ｙ％、好ましくは約５ｙチ
〜約３５９チの比較的ストローマを含まないヘモグロビ
ン水溶液として調製する。代用血液として用いる場合の
ヘモグロビン水溶液はリン酸塩緩衝化生理的食塩水によ
って透析し、抗生物質、アルブミン、グルコース、ピリ
ド中ソ−ルー５−ホスフェート（ビタミンＡ）及びカル
ボニック・アンヒドラーゼを加えることができる。

鉱油または植物油を適当に用いて、初乳剤を調合する。

好ましい鉱油は＆４０ホワイトオイル（粘度４０℃にお
いて４−５　ｃａｔ、　ＳＧ　２５℃において０．８０
４〜０．８２０、最大流動点２℃、最低引火点１３５℃
）；カーネーション軽油（粘度４０℃において１１〜ｌ
　４　ｃｓｔ、　ＳＧ　２５℃において０．８３７〜０
．９５３、流動点−７℃、最低引火点１７７℃）；及び
クレアロール軽油（粘度４０℃において７〜１０　ｃｓ
ｔＳＳＧ　Ｏ，８２２〜０．８３３、流動点−７℃、最
低引火点１３８℃）であり、これらは全てヴイットコケ
ミカル社（Ｗｉｔｃｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐ、
　）から得られる。好ましい植物油はクロダ社（Ｃｒｏ
ｄａ　Ｉｎｃ、　）　（ニューヨーク州ニューヨーク）
から得られるゴマ油、オリーブ油及びべにはな油である
。例えばブリジ（Ｂｒｉｊ）９３のようなポリオキシエ
チレンアルコールまたは例、ｔばスパン８０のようなソ
ルビタン・モノオレエート〔両方ともアイシーアイアメ
リカ社（Ｉ　ＣＩ　　Ａｍｅｒｉｃａ　Ｉｎｃ、　）か
ら入手可能〕の初乳剤の乳化剤を初乳剤全体を基準にし
て２〜３０容量％、好ましくは５〜１５容量チの量で油
相中に溶解する。

鉱油を用いる初乳剤のためには、約４０〜約９０容量％
、好ましくは約６０〜約７０容量チの量でのヘモグロビ
ン水溶液；約８〜約５８容量％、好ましくは約１４〜約
２５容量チの量での鉱油；及び約２〜約３０容量％、好
ましくは約５〜約１５容量チの量での初乳化剤を混合す
る。植物油を用いる初乳剤のためには、約４０〜約９０
容量％、好ましくは約４０〜約６０容量チのヘモグロビ
ン水溶液、約５〜約３０容量係、好ましくは約２０〜約
３０容量チの量での植物油；及び約５〜約３０容量％、
好ましくは約２０〜約３０容量チの量での初乳化剤を混
合する。ヘモグロビン水溶液は迅速に攪拌される油相に
徐々に加えて、例えば電磁攪拌機を用いて、約１５〜６
０分間、好ましくは約２５〜約３５分間混合する。混合
した初乳剤に次に約１０００〜約３０００　ｐｓｉ　、
好ましくは約１８００〜約２０００　ｐｓｉの圧力低下
で例えば微細流動化装置を用いて、約１００，０００〜
約５，０００，００　ＯＳ”好ましくは約５００，００
０〜約１，０００，０００３−’のせん断力を及ぼす高
ぜん新札化を実施する。微細流動化装置に関するさらに
詳しく情報は米国特許筒４，５３３，２５４号に述べら
れている。例えば５ミクロン親水性ポリビニリデンジフ
ルオリドフィルター〔デュロポア−（Ｄｕｒｏｐｏｒｅ
　）、ミリポアー社（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＣｏｒｐ−）
　）を用いて、ｐ遇する。乳化する前のヘモグロビン溶
液に約１〜約５９％、好ましくは約２〜約３ｇ俤の量で
アル゛プミンを加える。

本発明の液体複合乳剤の製造に適切である鉱油または植
物油中ヘモグロビン水溶液の初乳剤は、５μ未満好まし
くは３μ未満の範囲内の直径を有する初乳剤液滴を生ず
る。

複合乳剤の外部水相は複合乳剤を用いる用途に依存して
何らかの水性液体でありうる。代用血液として用いるた
めには、外部水相は等張性リン酸塩緩衝化食塩水（ｐＨ
約７．４）であることが好ましい。例えばツイーン（Ｔ
ｗｅｅｎ　）　４０、ツイーン６０、ツイーン８０　（
ＩＣＩアメリカ社）のようなポリオキシエチレン脂肪酸
エステルまたは例えばプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ
）　Ｆ　６８　（ＢＡＳＦビャンドツテ社（ＢＡ　Ｓ　
Ｆ　Ｗ）’ａｎｄｏｔｔｅ　Ｃｏｒｐ、　）　）のよう
なエチレンオキシド、好ましくはツイーン６０またはプ
ルロニックＦ６８の二次乳剤乳化剤を外部水相に、外部
水相全体を基準にして、０．２５〜２重量％好ましくは
０．２５〜０．７５重量％の量で溶解する。

初乳剤、二次乳化剤及び外部水相を混合して、例えば電
磁攪拌機による約１５〜約６０分間、好ましくは約２５
〜約３５分間の分散によって均一な分散液を形成して、
二次乳剤を得る。二次乳剤を形成するために、外部相に
初乳剤を加えることが好ましい。二次乳剤の水相約１０
〜約９０容量％、好ましくは約５０〜約６５容量チに対
して、初乳剤約１０〜約９０容量％、好ましくは約３５
〜約５０容量チの割合である最終複合乳剤が適切である
。二次乳剤を公知の手段で一過して目的の二次乳剤液滴
寸法（液滴の最大寸法と平均寸法の両方）を有する最終
二次乳剤製品を得る。このような濾過を実施する前の二
次乳剤液滴は最大約２０〜約５０ミクロンサイズ、平均
約１０〜約２０ミクロン直径サイズであり、−過によっ
て最大液滴サイズｌＯミクロン未満、平均小滴サイズ５
ミクロン未満にまで減小し、５ミクロン親水性ボリビニ
リデンジフルオリド・フィルターのようなフィルターに
３回まで通すことによって代用血液として適した複合乳
剤が得られる。

例えばアルブミン０．５〜、５ｇ％量とデキストランＯ
６５〜、０　ｇ％量（これらはサイズ分布を狭くし、複
合乳剤を安定化することが分っている）及びヘモグロビ
ン溶液に対して上述したような、他の好ましい抗生物質
等の好ましい水溶性添加剤を外部水相に加えることがで
きる。

本発明の方法に従って製造した複合乳剤は非常に安定で
あることが分っている。ここで用いる“イールド（ｙｉ
ｅｌｄ　）”なる用語は外部水相に漏出したヘモグロビ
ン量に比べた初乳剤中に最初に存在するヘモグロビン量
を表す。調製後に、複合乳剤のイールドはｐ過前には約
９９ｑ６であるが、５ミクロンフィルターを３回通した
一過後には９７％より犬にまで減小した。イールドは貯
蔵中に減小するが、冷凍条件下で２３日間貯蔵した後に
８５チより大になることが判明した。複合乳剤の液滴サ
イズは冷凍温度における貯蔵によって増加し、例えば新
鮮な平均サイズ３．８ミクロンから１６日０の約１０ミ
クロンに及び２３日口の１５ミクロンにまで増加する。

最初の調製に用いた５ミクロンフィルターを１〜３回通
すことによって、新たに調製した二重乳剤と同じサイズ
分布が得られる。複合乳剤の酸素担持能は複合乳剤１０
０ｍにつき０２約１４−の酸素含量を生じ、２３日間貯
蔵後に約Ｉ　Ｑ　ａｒｔ　Ｑ　２にまで減小する。

本発明の複合乳剤は種々な酸素供給系に用いられるが、
本発明の重要な観点は複合乳剤の代用血液としての使用
への適合である。複合乳剤の液滴サイズは心血管系への
使用に適している。心血管系で予想されるせん断速度範
囲にわたる複合乳剤の安定しだせん断粘度は全血のせん
断粘度とほぼ同じであり、複合乳剤を上記せん断速度範
囲に暴露させると、イールドの無視できる変化すなわち
複合乳剤の外相へのヘモグロビン溶液の無視できる放出
が生ずる。本発明の複合乳剤の酸素担持能は血液の酸素
担持能と同じである。これらの特性と外部のリン酸塩緩
衝化食塩水相の生理的適合性とから、本発明の複合乳剤
が血液代用薬として適切であることが期待される。特定
の実施例に示すように、本発明によって製造した複合乳
剤は、マウスに代用血液として注入した場合に急性毒性
を示さない。本発明のヘモグロビン複合乳剤は提供され
た臓器の酸素添加保存に血液酸素供給体（ｏｘｙｇｅｎ
ａｔｏｒ）中の酸素交換液として及び咄乳動物細胞培養
に酸素供給体（ｏｘｙｇｅｎ　５ｕｐｐｌｉｅｒ）とし
て有用である。

次の特定の実施例は本発明の理解を容易にするために詳
述するが、これらを本発明を限定するものと見なすべき
ではない。

実施例　Ｉ 最初に扁４０ホワイトオイル中ヘモグロビンの初乳剤を
調製し、次にリン酸塩緩衝化食塩水溶液中初乳剤の二次
乳剤を調製することによって、ヘモグロビン二重乳剤を
製造した。第２図はこの例で用いた方法の概要を示す。

ヘモグロビン食塩水溶液はｌ：ｌの量比で脱イオン水中
、０重量％塩化ナトリウムによって赤血球をおだやかに
混合しながら洗浄し、次に低温遠心機で４０００）ｌに
おいて１０分間遠心分離することによって、調製した。

遠心分離後に、淡黄褐色の膜と上清を廃棄し、上清が透
明になるまで洗浄プロセスを通常１〜３回くり返した。

洗浄後に、パックした赤血球を４〜５倍量の脱イオン水
によって溶解し、生成した混合物を冷凍機内で電磁攪拌
機を用いて１２時間攪拌した。主として赤血球膜破片で
あるストローマは３０，０００）ｌでの３０分間の遠心
分離によって除去した。上清のヘモグロビン溶液を取出
し、ミニタン（Ｍｉｎｉｔａｎ）〔ミリボアー社（マサ
チュセツツ州ベツドフォード）〕横断流限外−過装置に
おいて８個のポリスルホン３０，０００公称分子量フィ
ルターノくケラトを用いて濃縮し、この全濃縮プロセス
中メトヘモグロビンの形成を減するために溶液を水浴中
に維持した。限外ｐ過系の最大に望ましい背圧を超えな
いために、横断−過流量を明白に減少、しなければなら
なくなるまで、濃縮処置を続けた。濃縮後のヘモグロビ
ン溶液は３５９チまで、すなわち溶液１００−につきヘ
モグロビン３５ｇまでを有した。外部水相との望ましい
浸透圧平衡を得るために、ヘモグロビン濃縮物を３０ｍ
ＭＩＪン酸塩緩衝化生理的食塩水に対して透析した。リ
ン酸塩緩衝液のｐＨは必要に応じて７．４〜８．０に調
節して、透析したヘモグロビン溶液のｐＨが約７．４で
あることを保証した。透析したヘモグロビン溶液を３０
、ＯＯＯＸｇにおいて３０分間遠心し、次に０．２０ミ
クロン滅菌フィルター〔フィッシャーケミカル社（Ｆｉ
ｓｈｅｒ　Ｃｈｅｍ、　Ｃｏ−）　）を用いて濾過して
、ｐＨ調節によって沈澱したストローマ物質を除去した
。１１基準でペニシリン５００単位、ゲンタマイシン４
０１１ｊｌ、ポリミキシン２５００単位、ストレプトマ
イシン５０曙となるように、抗生物質をヘモグロビン溶
液に加えた。ヒトアルブミンとグルコースの添加もそれ
ぞれ２．５ｇ％溶液と３，５ｇチ溶液を生じた。

電磁攪拌台を用いて、１５重ｉ１％ポリオキシエチレン
アルコール界面活性剤ブリジ９３（ＩＣＩアメリカ社）
を含む、激しく攪拌したホワイトオイル扁４０（グイッ
トコケミカル社）に上記で調製したヘモグロビン溶液を
徐々に加えることによって、油中ヘモグロビンの初乳剤
を調製した。激しく攪拌した油相にヘモグロビン溶液を
徐々に加えることによって、水相の高い負荷すなわち油
相へのヘモグロビン溶液の６０容量チ負荷が達成された
。ヘモグロビン−油混合物に対して、冷凍条件下、約Ｉ
　Ｘ　１０’Ｓ−’のせん断による２０００ｐｓｉの圧
力低下のＤ−２０インサート付きＭＩＩＯ微細流動化装
置モデル〔ミクロフルイデイツクス社（Ｍｉｃｒｏｆｌ
ｕｉｄｉｃｓ　Ｃｏｒｐ、）　］を用いた高エネルギー
乳化を実施し、複合乳剤の小さい液滴を得、初乳剤の安
定性を高めた。次に初乳剤を５ミクロン親水性ポリビニ
リデンジフルオリドフィルター（デュロボアー、ミリボ
アー社）によって濾過した。

複合乳剤の外部水相はその生理的適合性のために選択し
た、ｐＨ７，４の等張性リン酸塩緩衝化生理的食塩水で
あり、これに界面活性剤のポリオキシエチレン脂肪酸エ
ステルツイーン６０（ＩＣＩアメリカ社）０．５＆％、
アルブミン１ｇ％とデキストランｏ、ｓｇチ［：　６２
，４００ＭＷ、　シグマケミカル社（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈ
ｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ）　）を加えた。

上記で調製した油中ヘモグロビン初乳剤を次に上記で調
製した外部水相中に１＝１の量比で、電磁攪拌機による
３０分間の混合によって分散させた。この複合乳剤を５
ミクロン親水性ポリビニリデンジフルオリドフィルター
（デュロボアー、ミリポアー社）から回収フラスコへの
一過により、３回濾過して、最大液滴サイズを１０ミク
ロン未満に、平均サイズを５ミクロン未満に減じた。約
５−７分の一過速度を生ずる水吸引による２５ｋｐａの
器械圧下で一過を実施した。代用血液に適した方法で複
合乳剤を調製する場合に、複合乳剤の製造に用いる溶液
は全て、０．２ミクロンフィルターを通すことによって
殺菌した。

初乳剤の製造時の微細流動化装置の圧力低下の１０００
〜３０００ｐｓｉａ範囲の変化によって、イールドは８
５％より大きくなり、１８００〜２０００ｐｓｉａにお
ける９８％で最大に達した。

実施例　Ｉ 初乳剤にゴマ植物油を用いた点以外は、例Ｉと同様に、
ヘモグロビン二重乳剤を調製した。油相を基準にして５
０重量％のスパン８０を含む、迅速に攪拌した油相に、
ヘモグロビン３５９％とヒトアルブミン３ｇ％とを含む
ヘモグロビン水溶液をヘモグロビン溶液４０容量％／ゴ
マ油６０容量チの量比で徐々に（１−７分）約４０分間
にわたって加え、これに例Ｉに述べたような高エネルギ
ー乳化を実施した。ゴマ油中ヘモグロビ／水溶液の初乳
剤を、ヒトアルブミン、０重量％、デキストラン０．５
重量％及びプルロニックＦ６８　０．５重量％を含む等
張性リン酸塩緩衝化生理的食塩水中に１：ｌの量比で加
え、低速度攪拌によって約５分間混合することによって
分散させた。この複合乳剤を５ミクロンフィルターを通
して３回−過することによって、最大液滴寸法を１０μ
未満に、平均液滴寸法を５μ未満に感じた。

実施例　Ｉ 例１に述べたように調製した新しい複合乳剤サンプルを
外部水相で希釈して、ホワードセル（Ｈｏｗａｒｄ　Ｃ
ｅ１ｌ　）　　（ラッシャーアンドベトゾルド社（Ｒａ
ｓｈｅｒ　ａｎｄ　Ｂｅｔｚｏｌｄ　Ｉｎｃ、　）　　
イリノイ州シカゴ〕に装入して、オリンパス（Ｏｌｙｍ
ｐｕｓ）ＯＭＩ　カメラを用いるマイクロマスター（Ｍ
ｉｃｒ。

ｍａｓｔｅｒ　）位相差顕微鏡〔フィッシャーサイエン
ティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ　５ａｉｅｎｔｉｆｉｃ
　Ｉｎｃ、））によって撮影した。液滴寸法はＭＯＰ−
３平自動イメージアナライザー〔カールツアイス社（ｅ
ａｒｌＺｅｉｓｓ　Ｉｎｃ、　）　）によってネガティ
ブ（ｎｅｇａ−ｔｉｖｅ）　から測定した。初乳剤の最
大液滴直径は、５μ未満であり、平均サイズは０．５ミ
クロン未満であった。４℃での５日間貯蔵後に、初乳剤
の最大液滴直径と平均直径はそれぞれ２．５と０．５で
あった。初乳剤液滴寸法分布はアルブミン添加によって
経時的に狭くなり、安定化することが判明した。

複合乳剤液滴の最大寸法と平均寸法は新しい乳剤ではそ
れぞれ望７μと３．８μであり、４日経過した乳剤では
それぞれ１０μと４．８μであり、１５日経過した乳剤
ではそれぞれ１５μと１０μであり、２３日経過した乳
剤ではそれぞれ２０μと１５μであった（乳剤は全て５
℃に維持した）。

外部水相にアルブミンを添加すると、液滴寸法は減小し
、貯蔵中の液滴成長は有意に低下した。５ミクロンフィ
ルターを用いたフィルター通過数が重要で゛あることも
判明している。第２回カフイルター通過は最大寸法を約
３５μから約１５μに減じ、第３回フィルター通過は最
大寸法を約７μに減じた。

実施例■ 外相に漏れ出た量に対する初乳剤中に封入されタヘモグ
ロビンの量によって表される収率を、実施例■で調製し
た複合乳剤について測定した。５ミクロンのフィルター
の通過回数は収率を低下させた。ろ過前の収率は９９チ
近かったが、フィルターを３回通過した後は９ｌチ以上
に下がった。

また、複合乳剤の収率は貯蔵中に下がる。しかし、５℃
で７日間貯蔵した後の収率は９１％以上と測定され、５
℃で２３日間貯蔵した彼は８５チ以上と測定された。

実施例■ 実施例Ｉで調製した複合乳剤のバルク粘度を、ＣＰ−４
０型０．８°コーンを備えたＬＶＴ型ウエつルズーブル
ックフィールド　シンクロ−レフトリック　マイクロビ
スコメーター（Ｗｅｌｌｓ−Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ　５
ｙｎｃｒｏ−Ｌｅｃｔｒｉｃ　Ｍｉｃｒｏｖｉｓｃｏ−
ｍｅｔｅｒ）　（ブルックフィールドエンジニアリング
ラボラトリーズ社（Ｂｒｏｏｋｆｉｅｌｄ　Ｅｎｇｉｎ
ｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ−）
　＋　マサチューセッツ州ストートン〕、および１０ｃ
ｍ０．３°コーンおよび平定盤を備えたＲ１６／Ｒ１９
型ワイセンベルグレオゴニオメータ−（Ｗｅｉｓｓｅｎ
ｂｅｒｇ　Ｒｈｅｏｇｏｎ−ｉｏｍｅｔｅｒ）を用いて
測定した。複合乳剤の定常剪断粘度は、剪断速度ｓ　ｏ
　ｓ”に訃ける約５　ｃｐから、剪断速度ｓ　ｏ　ｏ　
ｓ−’における約３．５ｃｐまで変化した。この値は、
心臓血管系における全血の剪断速度に近い。また、この
ような剪断速度に訃いては収率はほぼ一定である。剪断
速度が４５８−１〜４５０Ｓ−’であるときは、剪断速
度は複合乳剤小滴の大きさの分布に影響を及ぼさない。

実施例Ｉで調製した複合乳剤の定常剪断粘度は３ｃｐで
あった。

実施例■ 実施例■で調製した複合乳剤の酸素運搬能、即ち酸素含
有量を、ウオーバーグ（Ｗａｒｂｅｒｇ）マノメーター
〔フィッシャーサイエンティフィック社（Ｆｉｓｈｅｒ
　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）イリノイ州イタスカ〕を用い
たネピーレ（Ｎｅｖｉ　ｌ　ｌｅ　）のバイオトノメト
リー法（ネビーレ、　Ｊ、　Ｒ−、Ｊ−Ａｐｐｌｉｅｄ
　Ｐｈｙｓ−ｉｏｌｏｇ）’、３７：９６７．１９７４
）を改良して測定した。新たに調製された乳剤は、約１
１！１０２／１０〇−複合乳剤であったのが、２３日間
貯蔵後は約１０１ｄ０２／１００−複合乳剤に低下する
のが測定された。

新たに調製された実施例Ｉの乳剤は、酸素含有Ｉｌｌ　
０ｔａ１０２／１００ｔ／複合乳剤テアツ？、：。

実施例■ ヘモグロビンの２倍モルのピリドキサルー５−ホスフェ
ートＰ−５−Ｐ（シグマケミカル社）も初乳剤中に含ま
れている点を除き、血液代替物として使用するために実
施例■に記載される方法で複合乳剤を調製した。全血の
Ｐ２Ｏ測定値が２６ｍｙａＨ’ｉであることと比較する
と、Ｐ−５−Ｐは酸素親和力を２０＋ｍＨｇ（Ｐｓｏ　
）に低下させた。この測定は、ｐＨ７，３５、Ｐｃｏｏ
ｌｌＨｇｌ、温度３７℃で行った。改良バイオトノメト
リー法によって、第３図に示すオキシヘモグロビンの解
離曲線を得た。第３図の結果は、全血に似た協同性を有
していることを示唆している。

実施例■ 初乳剤中に３２．８ｇ％のへそグロビン溶液とカーネー
ションホワイト鉱油を含有させる点を除き実施例Ｉに記
載されている方法で初乳剤を３０容積チ含有する複合乳
剤を調製した。この複合乳剤０．５５ＣＣを４匹のマウ
スに注射したところ、４匹とも生存し、注射後数日間健
康そうに生き続けた。

同様にして初乳剤を３５容積チ含有する複合乳剤を調製
した。これを３匹のマウスに、０ｃＣｆつ投与したとこ
ろ、３匹とも生存し、注射後数日間健康そうに生き続け
た。

すぐ上に記載したように、初乳剤を５０容積チ含有する
複合乳剤を調製した。これを５匹のマウスに０．５　Ｃ
Ｃずつ注射したところ、５匹とも生存し、注射後数日間
健康そうに生き続けた。

上記のすべての試験結果は、鉱油を使用したヘモグロビ
ン複合乳剤はマウスに対する急性毒性がないことを示し
ている。

実施例■ 実施例Ｉに記載したゴマ植物油を鉱油の代わりに使用す
る点を除き実施例■に記載された方法で複合乳剤を調製
した。初乳剤はヘモグロビン溶液を３５４７％含んでい
た。複合孔・剤は初乳剤５０チと水性外相５０％とから
なっていた。この複合乳剤０．５および、０　ＣＣを２
匹のマウスに注射したところ、２匹とも生存し、数日間
健康そうに生き続けた。

上記の試験結果は、ゴマ油を使用したヘモグロビン複合
乳剤はマウスに対する急性毒性がないことを示している
。

実施例Ｘ 実施例■に記載した方法で３５容量チの代用血液用の初
乳剤（ｐｒｉｍａｒｙ　ｅｍｕｌｓｉｏｎ）を有する複
合乳剤を調製し、これを５匹のマウスに注射した。

注射後直ちに、血液サンプルをミクロへマドクリット管
（ｍｉｃｒｏｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ　ｔｕｂｅ　）　に
集めた。

１０分間の遠心分離の後で、この複合乳剤の含有量を測
定したところ、マウスの全血液量の５容量チであった。

第４図に示されているように、複合乳剤は、マウスの体
内を８０時間循環した後に、当該動物の全血量の２容ｉ
％に下がった。マウスの体内中におけるこの複合乳剤の
循環半減期（ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ　ｈａｌｆ−１ｉ
ｆｅ）は約７０時間であることが測定結果かられかった
。

実施例Ｍ 実施例■に記載した方法で５０容Ｉ１％の代用血液用の
初乳剤を調製した。これを血小板含有量の多い血漿と混
合したところ、単面小板（ｓｉｎｇｌｅｐｌａｔｅｌｅ
ｔ　）の減少は観察されなかった。

これまでの記載で、本発明を種々の実施例に基づき詳細
に説明してきた。本発明はこのほかにも様々な具体例が
考えられること、及びこの明細書に記載した本発明の細
部は、本発、明の基本原理から逸脱することなく、かな
りの幅をもって変更することができることは、当業者に
とって明らかであろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明による外側水性相の液体二重乳剤中の
油中にある水性ヘモグロビンを示す模式図である。第２
図は、本発明による方法の各工程の単純化した図式であ
る。第３図は、全血及び本発明による外側水性相の液体
複合乳剤（ＭＥ）中における油中のヘモグロビンの酸素
解離を示すグラフである。第４図は、マウスの体内にあ
る本発明の外側水性相の液体二重乳剤中における油中の
ヘモグロビンの半減期を示すグラフである。 〔外４名） 図面の浄書（内容に変更なし） 纂ｌ　７ 暴３凹 鯉↓÷Ａ　　（ｍｍＨｇ） 未２ｍ 扉、４凹 謁藺　（端〕

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、鉱油、植物油およびそれらの混合物からなる群から
   選択された油の中の酸素担持物質の水溶液からなる初乳
   剤であつて初乳剤の液滴寸法を約５ミクロン以下とする
   初乳化剤によつて乳化されたもの、および外側水性相中
   の上記初乳剤からなる二次乳剤であつて二次乳剤の液滴
   寸法を約１０ミクロン以下にする二次乳化剤によつて乳
   化されたものからなる複合乳剤であつて、粘度約３〜約
   ９ｃｐ、収率約８５〜約９９％、および酸素担持能力約
   ７〜約２０容量％である複合乳剤。 ２、酸素担持物質がヘモグロビンである請求項１記載の
   酸素担持複合乳剤。 ３、油が鉱油である請求項１記載の酸素担持複合乳剤。 ４、鉱油がＮｏ．４０ホワイトオイル、カーネーション
   （Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）軽油、クレアロール（Ｋｌｅａ
   ｒｏｌ）軽油およびそれらの混合物からなる群から選択
   される請求項３記載の酸素担持複合乳剤。 ５、初乳剤が約４０〜約９０容量％の水性ヘモグロビン
   、約８〜約５８容量％の上記油、および約２〜約３０容
   量％の上記初乳化剤からなる請求項記載３の酸素担持複
   合乳剤。 ６、初乳剤が約６０〜約７０容量％の水性ヘモグロビン
   、約１４〜約２５容量％の上記油、および約５〜約１５
   容量％の初乳化剤からなる請求項３記載の酸素担持複合
   乳剤。 ７、上記油が植物油である請求項１記載の酸素担持複合
   乳剤。 ８、植物油がオリーブ油、サフラワー油、ゴマ油、大豆
   油およびそれらの混合物からなる群から選択される請求
   項７記載の酸素担持複合乳剤。 ９、初乳剤が約４０〜約９０容量％の水性ヘモグロビン
   、約５〜約３０容量％の上記油および約５〜約３０容量
   ％の初乳化剤からなる請求項７記載の酸素担持複合乳剤
   。 １０、初乳剤が約４０〜約６０容量％の水性ヘモグロビ
   ン、約２０〜約３０容量％の上記油および約２０〜約３
   ０容量％の初乳化剤からなる請求項７記載の酸素担持複
   合乳剤。 １１、初乳化剤がポリオキシエチレンアルコールおよび
   ソルビタンモノオレエートからなる群から選択される請
   求項１記載の酸素担持複合乳剤。 １２、初乳化剤がブリジ（Ｂｒｉｊ）９３およびスパン
   （Ｓｐａｎ）８０からなる群から選択される請求項１１
   記載の酸素担持複合乳剤。 １３、初乳剤の液滴寸法が約３ミクロン以下である請求
   項１記載の酸素担持複合乳剤。 １４、二次乳化剤がトウイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０、ト
   ウイーン６０、トウイーン８０およびプルロニツク（Ｐ
   ｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８からなる群より選択される請求
   項１記載の酸素担持複合乳剤。 １５、二次乳剤の小滴寸法が約８ミクロン以下である請
   求項１記載の酸素担持複合乳剤。 １６、複合乳剤が約１０〜約９０容量％の初乳剤、約１
   ０〜約９０容量％の外側水性相および約０．２５〜約２
   重量％の二次乳化剤からなる請求項１記載の酸素担持複
   合乳剤。 １７、複合乳剤が約３５〜約５０容量％の初乳剤、約５
   ０〜約６５容量％の外側水性相および約０．２５〜約０
   ．７５重量％の二次乳化剤からなる請求項１記載の酸素
   担持複合乳剤。 １８、収率が約９５〜約９９％である請求項１記載の酸
   素担持複合乳剤。 １９、酸素担持能力が約１０〜約２０容量％である請求
   項１記載の酸素担持複合乳剤。 ２０、酸素担持物質がヘモグロビンであり、油がＮｏ．
   ４０ホワイトオイル、カーネーション（Ｃａｒｎａｔｉ
   ｏｎ）軽油、クレアロール（Ｋｌｅａｒｏｌ）軽油、お
   よびこれらの混合物からなる群より選択される鉱油であ
   り、初乳化剤がブリジ（Ｂｒｉｊ）９３およぴスパン（
   Ｓｐａｎ）８０からなる群より選択され、初乳剤が約４
   ０〜約９０容量％の水性ヘモグロビン、約８〜約５８容
   量％の鉱油および約２〜約３０容量％の初乳化剤からな
   り、二次乳化剤がトウイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０、トウ
   イーン６０、トウイーン８０およびプルロニツク（Ｐｌ
   ｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８からなる群より選択され、複合乳
   剤が約１０〜約９０容量％の初乳剤、約１０〜約９０容
   量％の外側水性相および約０．２５〜約２重量％の二次
   乳化剤からなり、収率が約９５〜約９９％であり、そし
   て酸素担持能力が約１０〜約２０容量％である、請求項
   １記載の酸素担持複合乳剤。 ２１、酸素担持物質がヘモグロビンであり、油がオリー
   ブ油、サフラワー油、ごま油、大豆油およびこれらの混
   合物からなる群より選択される植物油であり、初乳化剤
   がブリジ（Ｂｒｉｊ）９３およびスパン（Ｓｐａｎ）８
   ０からなる群より選択され、初乳剤が約４０〜約９０容
   量％の水性ヘモグロビン、約５〜約３０容量％の植物油
   および約５〜約３０容量％の初乳化剤からなり、二次乳
   化剤がトウイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０、トウイーン６０
   、トウイーン８０及びプルロニツク（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ
   ）Ｆ６８からなる群より選択され、複合乳剤が約１０〜
   約９０容量％の初乳剤、約１０〜約９０容量％の外側水
   性相、および約０．２５〜約２重量％の二次乳化剤から
   なり、収率が約９５〜約９９％であり、そして酸素担持
   能力が約１０〜約２０容量％である、請求項１記載の酸
   素担持複合乳剤。 ２２、鉱油、植物油およびこれらの混合物からなる群よ
   り選択される油の中に酸素担持物質の水溶液を含み、初
   乳化剤によつて乳化された液滴寸法が約５ミクロン以下
   の初乳剤、および初乳剤を外側水性相の中に含み、二次
   乳化剤によつて乳化された液滴寸法が約１０ミクロン以
   下の二次乳剤からなる殺菌済の酸素担持複合乳剤からな
   る代用血液であつて、該複合乳剤の粘度は約３〜約９ｃ
   ｐであり、収率は約８５〜約９９％であり、そして酸素
   担持能力は約７〜約２０容量％である代用血液。 ２３、酸素担持物質がヘモグロビンである請求項２２記
   載の代用血液。 ２４、油がＮｏ．４０ホワイトオイル、カーネーシヨン
   （Ｃａｒｎａｔｉｏｎ）軽油、クレアロール（Ｋｌｅａ
   ｒｏｌ）軽油およびこれらの混合物からなる群より選択
   される鉱油である請求項２２記載の代用血液。 ２５、初乳剤が約４０〜約９０容量％の水性ヘモグロビ
   ン、約８〜約５８容量％の油および約２〜約３０容量％
   の初乳化剤からなる請求項２４記載の代用血液。 ２６、油がオリーブ油、サフラワー油、ゴマ油、大豆油
   およびこれらの混合物からなる群より選択される植物油
   である請求項２２記載の代用血液。 ２７、初乳剤が約４０〜約９０容量％の水性ヘモグロビ
   ン、約５〜約３０容量％の油および約５〜約３０容量％
   の初乳化剤からなる請求項２６記載の代用血液。 ２８、初乳化剤はブリジ（Ｂｒｉｊ）９３およびスパン
   （Ｓｐａｎ）８０からなる群より選択される請求項２２
   記載の代用血液。 ２９、初乳剤の液滴寸法が約３ミクロン以下である請求
   項２２記載の代用血液。 ３０、二次乳化剤がトウイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０、ト
   ウイーン６０）トウイーン８０およびプルロニツク（Ｐ
   ｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８からなる群より選択される請求
   項２２記載の代用血液。 ３１、複合乳剤が約１０〜約９０容量％の初乳剤、約１
   ０〜約９０容量％の外側水性相および約０．２５〜約２
   重量％の二次乳化剤からなる請求項２２記載の代用血液
   。 ３２、複合乳剤が約３５〜約５０容量％の初乳剤、約５
   ０〜約６５容量％の外側水性相および約０．２５〜約０
   ．７　５重量％の二次乳化剤からなる請求項２２記載の
   代用血液。 ３３、収率が約９５〜約９９％である請求項２２記載の
   代用血液。 ３４、酸素担持物質がヘモグロビンであり、油がＮｏ．
   ４０ホワイトオイル、カーネーション（Ｃａｒｎａｔｉ
   ｏｎ）軽油、クレアロール（Ｋｌｅａｒｏｌ）軽油、及
   びこれらの混合物からなる群より選択される鉱油であり
   、初乳化剤がブリジ（Ｂｒｉｊ）９３及ぴスパン（Ｓｐ
   ａｎ）８０からなる群より選択され、初乳剤が約４０〜
   約９０容量％の水性ヘモグロビン、約８〜約５８容量％
   の鉱油及ぴ約２〜約３０容量％の初乳化剤からなり、二
   次乳化剤がトウイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０、トウイーン
   ６０、トウイーン８０及びプルロニツク （Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ６８からなる群より選択され、
   複合乳剤が約１０〜約９０容量％の初乳剤、約１０〜約
   ９０容量％の外側水性相及び約０．２５〜約２重量％の
   二次乳化剤からなり、収率が約９５〜約９９％であり、
   そして酸素担持能力が約１０〜約２０容量％である、請
   求項２２記載の代用血液。 ３５、酸素担持物質がヘモグロビンであり、油がオリー
   ブ油、サフラワー油、ごま油、大豆油及びこれらの混合
   物からなる群より選択される植物油であり、初乳化剤が
   ブリジ（Ｂｒｉｊ）９３及びスパン（Ｓｐａｎ）８０か
   らなる群より選択され、初乳剤が約４０〜約９０容量％
   の水性ヘモグロビン、約５〜約３０容量％の植物油、及
   び約５〜約３０容量％の初乳化剤からなり、二次乳化剤
   がトウイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０、トウイーン６０、ト
   ウイーン８０及びプルロニツク（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ
   ６８からなる群より選択され、複合乳剤が約１０〜約９
   ０容量％の初乳剤、約１０〜約９０容量％の外側水性相
   及び約０．２５〜約２重量％の二次乳化剤からなり、収
   率が約９５〜約９９％であり、そして酸素担持能力が約
   １０〜約２０容量％である請求項２２記載の代用血液。 ３６、酸素担持物質の水性溶液約４０〜約９０容量％；
   鉱物油、植物油及びそれらの混合物からなる群より選択
   された油、鉱油の場合には約８〜約５８容量％、そして
   植物油の場合には約５〜約３０容量％；及び初乳化剤、
   鉱物油の場合には約２〜約３０容量％、そして植物油の
   場合には約５〜約３０容量％；を撹拌により混合して混
   合された初乳剤を形成し、 その混合された初乳剤を約１００，０００〜約５，００
   ０，０００／秒の高剪断速度に付して初乳剤を形成し、 この初乳剤をろ過して、約５ミクロン以下の最大液滴寸
   法を有する初乳剤を得、 この約５ミクロン以下の液滴寸法を有する初乳剤約１０
   〜９０容量％；水性外相約１０〜９０容量％；及びその
   水性外相の約０．２〜約２．０重量％の二次乳化剤；を
   撹拌により混合して、その外側水性相中に初乳剤を均一
   に分散させて二次乳剤を形成し、そして その二次乳剤をろ過して約１０ミクロン以下の最大液滴
   寸法を有する複合乳剤を得る、 ことからなる水性外相複合乳剤中の油中に水性酸素担持
   物質を導入する方法。 ３７、酸素運搬物質が約１〜約３５グラム％のヘモグロ
   ビンのヘモグロビン溶液からなる請求項３６に記載の方
   法。 ３８、方法を約４℃〜約８℃で実施する請求項３６に記
   載の方法。 ３９、複合乳剤の製造に用いるすべての溶液を乳化の前
   に滅菌フィルターに通す請求項３６に記載の方法。 ４０、高剪断速度は、約１０００〜約３０００ｐｓｉの
   圧力降下で運転されている微細流動化装置において約５
   ００，０００〜約１，０００，０００／秒である請求項
   ３６に記載の方法。 ４１、初乳剤のろ過を、５ミクロンの親水性ポリ二弗化
   ビニリデンフィルターを用いて行なう請求項３６に記載
   の方法。 ４２、初乳剤を撹拌された水性外相に約１５〜約６０分
   間連続的に攪拌しながら加える請求項３６に記載の方法
   。 ４３、二次乳剤のろ過を５ミクロンの親水性ポリ二弗化
   ビニリデンフィルターを用いて行なう請求項３６記載の
   方法。 ４４、外側水性相に約０．５〜約１．５グラム％のアル
   ブミンを添加する請求項３６記載の方法。 ４５、外側水性相に約０．５〜約１．０グラム％のデキ
   ストランを添加する請求項３６記載の方法。 ４６、初乳化剤がブリジ（Ｂｒｉｊ）９３およびスパン
   （Ｓｐａｎ）８０からなる群より選ばれ、二次乳化剤が
   トウイーン（Ｔｗｅｅｎ）４０、トウイーン６０、トウ
   イーン８０およびプルロニツク（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）Ｆ
   ６８からなる群より選ばれる請求項３６記載の方法。