DE3879575T2

DE3879575T2 - Alpha-Carotin zur Wachstumshemmung von Krebszellen.

Info

Publication number: DE3879575T2
Application number: DE88112392T
Authority: DE
Inventors: Ryozo Iwasaki; Hoyoku Nishino; Akio Okabe; Yuki Yogo
Original assignee: Lion Corp
Current assignee: Lion Corp
Priority date: 1987-07-30
Filing date: 1988-07-29
Publication date: 1993-10-14
Anticipated expiration: 2008-07-30
Also published as: ATE87203T1; EP0302421A2; EP0302421A3; DE3879575D1; US5008295A; EP0302421B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung des Wachstums von Krebszellen und die Verwendung von α-Carotin zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung des Wachstums von Krebszellen.
Derzeit wird Krebs im allgemeinen durch operativen Eingriff, Strahlentherapie oder Chemotherapie (Behandlung mit Medikamenten) behandelt.
Heutzutage ist die Chemotherapie mit Medikamenten, die direkt an den Tumorzellen wirken und sie töten, weitverbreitet, und somit sind in bezug auf derartige Mekikamente viele Vorschläge gemacht worden. Diese Medikamente wirken jedoch nicht nur auf Tumorzellen, um sie zu töten, sondern auch auf normale Zellen, und somit können sie nicht ihre hohe therapeutische Wirkung hervorrufen, ohne daß extrem ernste Nebenwirkungen einhergehen.
Unter diesen Umständen wurde die Aufmerksamkeit auf Medikamente gezogen, welche die immunologische Befähigung normaler Zellen erhöhen, um das Wachstum von Tumorzellen indirekt zu inhibieren. Beispiele derartiger Medikamente sind Krestin und Interferon. Die direkten Wirkungen derartiger Medikamente auf Tumorzellen sind klein, jedoch aufgrund geringer Nebenwirkungen vorteilhaft.
Kürzlich wurde vom Standpunkt der Dekarzinogenese von Tumorzellen (Karzinogenese ist nicht irreversibel sondern reversibel, d.h. Krebszellen können dazu gebracht werden, sich normalen Zellen anzugleichen oder sich zu normalen Zellen zurückzuverwandeln) die Aufmerksamkeit ebenso auf die Verwendung von Medikamenten gerichtet, welche in der Lage sind, eine Differenzierung induzierende Wirkung hervorzurufen, um Tumorzellen in normale Zellen umzuwandeln. Diese Medikamente haben eine direkte Wirkung auf Tumorzellen mit weniger Nebenwirkungen und lassen vielversprechende Antitumormittel erwarten, welche hohe therapeutische Wirkungen haben könnten.
Bisher wurden Mittel vorgeschlagen, die eine Differenzierung induzierende Aktivität besitzen wie Prostaglandin E&sub1;, welches eine Zunahme an c-AMP bewirkt. Allerdings ist prostaglandin E&sub1; so instabil im menschlichen Körper, daß es direkt an einer betroffenen Stelle zur Krebsbehandlung tropfinfundiert und in Kombination mit anderen Mekikamenten verwendet werden muß. Unter diesen Umständen sind Substanzen mit guter Differenzierung induzierender Aktivität, und welche wirkungsvoll als ein stabiles Antitumormedikament mit geringer Toxizität verwendet werden können, wünschenswert.
"Seminars in Oncology", Vol. X, Nr. 3, 1983, offenbart Vitamin A als Inhibitor von Krebs beim Menschen.
"The Lancet", 325 - 326, Aug. 11, 1984, offenbart ebenfalls Antikrebs- Eigenschaften von Vitamin A und darüberhinaus bedeutende medizinische Nebenwirkungen durch die längere Einnahme dieses Medikaments.
"The Merk Index", 10. Ausgabe, 1983, Seiten 258 - 259, erwähnt α- Carotin unter der therapeutischen Kategorie als Vitamin-A-Vorstufe.
Somit ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein hervorragendes Antitumormittel mit Differenzierung induzierender Aktivität bereitzustellen.
Die Erfinder haben eindringliche Studien zur Erreichung obiger Ziele durchgeführt und haben herausgefunden, daß α-Carotin starke wachstumsinhibierende Wirkungen auf Tumorzellen besitzt und eine Differenzierung induzierende Wirkung verursacht, wodurch Tumorzellen zu normalen Zellen umgewandelt werden, d.h. es bewirkt die Rückwandlung von Tumorzellen zu normalen Zellen. Deshalb kann α- Carotin als ein dekarzinogenes Mittel verwendet werden.
Die gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellten Arzneimittel sind zur Inhibierung des Wachstums von Krebszellen verwendbar, und zwar durch ein die Verabreichung einer wirkungsvollen Menge an α-Carotin als ein Antitumormittel an einen Säuger umfassendes Verfahren E es wird in Erwägung gezogen, daß dieses Verfahren zur Behandlung von Krebs bei verschiedenen Typen von warmblütigen Säugern, einschließlich niederer Tiere wie Raten und Mäusen, als auch beim Menschen nützlich sein wird.
Es ist bekannt, daß β-Carotin eine antitumorale Wirkung auf das System der Lymphozyten hat, wie es im Aufsatz "Oncology, 39, 33 - 37, 1982" offenbart ist. Die antitumorale Wirkungen von β-Carotin sind auch in Schwartz et al., "BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS", S. 1130 - 1135, 1986, offenbart. Es wurde keine Bericht mit der Aussage veröffentlicht, daß α-Carotin eine ähnliche Aktivität besitzt. Im Gegensatz zum β-Carotin, das eine geringe Wirkung der Inhibierung des Wachstums von Tumorzellen zeigt, bewies α-Carotin ausgezeichnete Charakteristiken als Antitumormittel, wie aus den später beschriebenen Beispielen offensichtlich ist. Die Erfinder legten ebenfalls neue Nachweise dafür vor, daß α-Carotin eine hervorragende dekarzinogene Aktivität besitzt und somit mit guter chemotherapeutischer Wirksamkeit eingesetzt werden kann.
Fig. 1 ist eine Mikroskop-Photographie, welche die morphologische Veränderung von GOTO-Zellen in einer Kontrollkultur ohne α-Carotin zeigt;
Fig. 2 ist eine Mikroskop-Photographie, welche die morphologische Veränderung von mit α-Carotin behandelten GOTO-Zellen nach 5 Tagen Kultivierung zeigt; und
Fig. 3 ist eine graphische Darstellung, die eine Wirkung von Palmcarotin auf die tumorfördernde Wirkung von TPA in DMBA- initiierten Mäusen zeigt.
TEXT FEHLT
emäß der Erfindung hergestellte Antitumormedikamente enthalten α- Carotin als einen wirksamen Bestandteil.
Zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignetes α-Carotin schließt natürliche und synthetische α-Carotine ein. Natürliche α- Carotine kommen für gewöhnlich als Mischungen mit anderen Carotinen vor, wie β-Carotin oder γ-Carotin. Die gemäß der Erfindung hergestellten Medikamente können eine derartige Carotin-Mischung enthalten. Ein zur Verwendung bei der Erfindung besonders geeignetes naturliches Carotin ist eine aus Palmöl extrahierte, konzentrierte und gereinigte Zubereitung (Palmcarotin), welche eine rote, undurchsichtige, pasten-ähnliche Mischung aus Carotinen ist, und welche aus 25 bis 40 Gew.-% α-Carotin, 50 bis 70 Gew.-% β-Carotin und aus weniger als 10 Gew.-% anderer Bestandteile einschließlich Carotinoiden gemischt ist. Die Zubereitung (Palmcarotin) hat eine bessere Löslichkeit in Ölen und eine gute Absorbierbarkeit im menschlichen Körper, wenn sie verabreicht wird. Das Herstellungsverfahren von Palmcarotin ist im GB- Patent Nr. 2 160 874 offenbart.
Aus verschiedenen Carotin-Mischungen gereinigtes und isoliertes α- Carotin kann bei der Erfindung verwendet werden. Es ist bemerkenswert, daß die Verwendung von isoliertem α-Carotin als einem erfindungsgemäßen wirksamen Bestandteil eine genauso starke Wirkung der Inhibierung des Wachstum von Tumorzellen und eine genauso gute Differenzierung induzierende Wirkung im Vergleich mit einer eine entsprechende Menge α-Carotin enthaltenden Carotin-Mischung zeigt.
Das gereinigte und isolierte α-Carotin kann gemäß herkömmlicher Verfahren hergestellt werden.
Gemäß der Erfindung hergestellte Antitumor-Zusammensetzungen, bei denen wie oben erwähnt eine wirksame Komponente α-Carotin (α- Carotin allein oder als α-Carotin enthaltende Carotinmischung) ist, können allein oder in Kombination mit anderen Arzneimitteln und über verschiedene Wege verabreicht werden. Zum Beispiel kann α-Carotin durch intravenöse, subkutane oder intramuskuläre Injektion, topisch oder oral durch ein in das Rektum eingeführtes Suppositorium verabreicht werden. Die Dosis kann in einem breiten Bereich angesetzt werden (z.B. 15 µg bis 3 g täglich pro 1 kg Körpergewicht oder 1 mg bis 10 g täglich beim Erwachsenen) entsprechend des Verabreichungsweges, der Anzahl der Verabreichungen und der Schwere der Symptome.
Gemäß der Erfindung hergestellte pharmazeutische Zusammensetzungen können in verschiedenen Kombinationen mit einer geeigneten Menge eines sterilen nicht toxischen Trägers und einer wirksamen Menge α- Carotin durch jedes beliebige bekannte Verfahren hergestellt werden. Für die orale Verabreichung werden die Zubereitungen z.B. in Form von weichen und harten Kapseln, Tabletten, Granulaten, Körnern, Pulver, welche die langsame Freisetzung des wirksamen Bestandteils erlauben, Flüssigkeit oder Suspension, und für die parenterale Verabreichung z.B. in Form von Injektionen, Tropfen und Suppositorien hergestellt. Geeignete Beispiele nicht toxischer Träger zur Verwendung bei der Erfindung sind folgende: Oberflächenaktive Mittel wie Saccharoserfettsäureester, Fettsäuremonoglyceride, Propylenglykolfettsäureester, Sorbitanfettsäureester oder Lecithin; Bindemittel wie Gummiarabikum, Gelatine, Sorbit, Tragantgummi oder Polyvinylpyrrolidon; Vehikel wie Saccharose, Lactose, Stärke, kristalline Cellulose, Manitol, leichtes (light) Kieselsäureanhydrid, Magnesiumaluminat, Magnesiummetasilicataluminat, sythetisches Aluminiumsilicat, Calciumcarbonat, Natriumbicarbonat, Calciumhydrogenphosphat oder Calciumcarboxymethylcellulose; Gleitmittel wie Magnesiumstearat, Talkum oder gehärtetes Öl; Würz- oder Geschmacksmittel wie Natriumchlorid, Saccharin, Orangenöl, Süßholzextrakt, Zitronensäure, Glukose, Menthol, Eukalyptusöl oder Äpfelöl; Suspendiermittel oder Netzmittel wie Kokusnußöl, Olivenöl, Sesamöl, Erdnußöl, Sojabohnenöl, nicht allzu langkettige Fettsäureglyceride, Safloröl oder Sojabohnenphospholipide; Kohlenhydratderivate wie Cellulosen (Acetatphthalat (GAP)) oder Sacchariden; Acrylsäurecopolymere wie Methylacrylat-Methacrylsäure- Copolymer oder Methylmethacrylat-Methacrylsäure-Copolymer; Polyvinylderivate wie Monoester zweiwertiger Säuren; filmbildende Mittel oder Beschichtungshilfsmittel. Jedes beliebige herkömmliche Verfahren kann eingesetzt werden, um diese Zubereitungen zu erhalten. Schleimhaut verwendende Zubereitungen und Injektionen können durch herkömmliche Verfahren hergestellt werden. Für die Suspension in Wasser oder für die Emulgierung mit destilliertem Wasser, falls angewendet, könen Sojabohnenöl, Erdnußöl oder nicht allzu langkettige Fettsäuretriglyceride als Suspensionsmittel verwendet werden und auch Saccachrosefettsäureester, Fettsäuremonoglyceride, Propylenglykolfettsäureester, Sorbitanfettsäureester oder Lecithin.
α-Carotin, welches ein gemäß der Erfindung wirksamer Bestandteil von Antitumormittel ist, hat eine starke inhibitorische Wirkung auf das Wachstum von Tumorzellen und gute Differenzierung induzierende Wirkung, und es kann deshalb als ein geeignetes dekarzinogenes Mittel eingesetzt werden. Die antitumoralen pharmazeutischen Zusammensetzungen, deren wirksamer Bestandteil α-Carotin ist, weisen eine so geringe Toxizität auf, daß keine Toxizität in Dosen von 3,5 g α-Carotin pro kg Körpergewicht bei Mäusen auftritt. Es ist im Körper stabil, wodurch die alleinige Verabreichung großer Dosen von α-Carotin, ohne daß eine Begleitbehandlung mit anderen Medikamenten nötig ist, erlaubt ist, und somit wird es nicht nur wirksam zur Behandung von Tumoren ektodermalen Ursprungs sondern auch endodermalen Ursprungs eingesetzt, wie Gehirntumoren, Leukämie, Magen-, Bauchspeicheldrüsen-, Leber- oder Gebärmutterhalskrebs, insbesondere Neuroblastoma.
Ausführungsformen der Erfindung, insbesondere Demonstrationen der Wirkungen der wirksamen Komponente, werden im Detail beschrieben.

Beispiel 1

Inhibitorische Wirkung auf das Tumorzellenwachstum

Menschliche Neuroblastoma-Zellen (GOTO-Zellen) wurden auf einer Petrischale (Innendurchmesser: 35 mm) verteilt, um eine Population von 4 x 10&sup4; Zellen/ml Kulturmedium/Schale zu erhalten, und 2 Tage lang inkubiert.
Andererseits wurde eine 1%ige Emulsion aus Palmcarotin (2,15 Volumenteile), das aus Palmöl extrahiert, konzentriert und gereinigt worden war, mit 95%igem Ethanol (7,85 Volumenteile) gemischt und sterilisiert.
Zu den mit Tumorzellen kultivierten Schalen wurden 10 µl des sterilisierten Palmcarotins (letztendliche Konzentration: 20 µM enthalten 6 µM α-Carotin und 14 µM β-Carotin) hinzugefügt und 5 Tage inkubiert. Die Kontrollkultivierung wurde mit den gleichen Arbeitsschritten vollzogen, außer daß eine Carotin-freie Emulsion verwendet wurde.
Nach Vervollständigung der Kultivierung wurde die Anzahl der Tumorzellen in jeder Schale gezählt und das Zahlenverhältnis zur Kontrolle wurde doppelt berechnet, wodurch die inhibitorische Wirkung von Palmcarotin auf das Wachstum von der Tumorzelle erhalten wurde Außerdem wurden die inhibitorischen Wirkungen von α-Carotin (2 µM hinzugesetzt) und β-Carotin (2 µM hinzugesetzt) auf das Wachstum von Tumorzellen auf die gleiche Weise wie beim Palmcarotin untersucht.

Differenzierung induzierende Wirkung

Die Betrachtung wurde bei der α-Carotinkultur (2 µM hinzugesetzt) und Kontrollkultur durchgeführt, um die morphologischen Veränderungen der GOTO-Zellen festzustellen, und die Wirkung des α- Carotins wurde als die durch nachfolgende Gleichung angegebene Zelldifferenzierungsrate (nachfolgend als Differenzierungs-Index bezeichnet) ausgedrückt:
Zelldifferenzierungsrate (%) = Anzahl der differenzierten Zellen/500 Auswahlzellen x 100
wobei der Begriff "differenzierte Zellen" jene von 500 Auswahlzellen (in einer Schale gefundene Zellen, die nach ihrem meßbaren Fortsatz (projection) ausgewählt wurden) welche eine mindestens zweimal so langen Fortsatz wie der Hauptdurchmesser der Zelle haben. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen 1 und 2 angegeben. Tabelle 1 Inhibitorische Wirkung auf das Wachstum von Tumorzellen Anzahl der Tumorzellen (10&supmin;&sup5; Zellen/Schale) Verhältnis der Tumorzellenanzahl zur Kontrolle (%) Kontrolle Palmcarotin (20 µM) Tabelle 2 Inhibitorische Wirkung auf das Wachstum von Tumorzellen Anzahl der Tumorzellen (10&supmin;&sup5; Zellen/Schale) Verhältnis der Tumorzellenanzahl zur Kontrolle (%) Differenzierung induzierende Wirkung (Differenzierungs-Index (%)) Kontrolle α-Carotin β-Carotin
Die Ergebnisse in Tabelle 1 zeigen, daß α-Carotin und β-Carotin enthaltendes Palmcarotin eine inhibitorische Wirkung auf das Wachstum von Tumorzellen (GOTO-Zellen) hat.
Die Ergebnisse in Tabelle 2 zeigen, daß α-Carotin eine starke inhibitorische Wirkung auf das Wachstum von Tumorzellen besitzt im Vergleich zum β-Carotin, das eine gleiche Wirkung in leichter Ausprägung besitzt. Somit wurde bewiesen, daß α-Carotin für die Wirkung des Palmcarotins verantwortlich ist.
Die Daten in Tabelle 2 zeigen ebenfalls, daß sich in der Anwesenheit von α-Carotin kultivierte Tumorzellen unter der Entwicklung von für Neuroblasten (morphologische Differenzierung) typische Fortsätze zu normalen Zellen durch die Wirkung von α-Carotin (2 µM) differenzieren.
Die Fig. 1 und 2 sind Mikroskop-Photographien (400fache Vergrößerung) der Kontrollzellen und der mit α-Carotin (2 µM) behandelten Zellen nach 5 Tagen Kultivierung, aus denen die von α-Carotin verursachte morphologische Veränderung der GOTO-Zellen (Neuroblasten), d. h. die Wirkung des α-Carotins Tumorzellen, in normale Zellen umzuwandeln, deutlich ersichtlich ist.

Beispiel 2

Mit menschlichen Tumorzellen (in Tabelle 3 dargestellt) und 20 µM α- 40 Carotin und β-Carotin wurde die Kultivierung in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, und anschließend wurde die Anzahl der Zellen in den Kulturen gezählt. Die Verhältnisse der Anzahl in diesen Kulturen zu der Kontrollkultur mit Carotin-freiem Kulturmedium wurden berechnet, um die inhibitorischen Wirkungen von Carotinen auf das Wachstum von Tumorzellen zu bestimmen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Tabelle 3 Inhibitorische Wirkung auf das Wachstum von verschiedenen Tumorzellen Tumorzellen α-Carotin 20 uM (%) β-Carotin 20 uM (%) Bauchspeicheldrüsenkrebs (PANC - 1) Magenkrebs (HGC - 27) Leberkrebs (HLF) Glioblastoma (A - 127)
Die Ergebnisse in Tabelle 3 zeigen, daß α-Carotin vorteilhafte inhibitorische Wirkungen auf verschiedenartige Tumorzellen besitzt, insofern als daß es verglichen mit β-Carotin wirkungsvoll ihr Wachstum inhibiert.

Beispiel 3

Mit menschlichen Tumorzellen (in Tabelle 4 dargestellt) und 10 µM α-Carotin wurde die Kultivierung in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 durchgeführt, und anschließend wurde die Anzahl der Zellen in den Kulturen gezählt. Die Verhältnisse der Anzahl in diesen Kulturen zu der Kontrollkultur mit Carotin-freiem Kulturmedium wurden berechnet, um die inhibitorische Wirkung des Carotins auf das Wachstum von Tumorzellen zu bestimmen, und die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Tumorzellen Verhältnis der Tumorzellenanzahl zur Kontrolle (%) Neuroblastoma (GOTO) Glioblastoma (A- 127) Leukämie (HL-60) Magenkrebs (HGC - 27) Bauchspeicheldrüsenkrebs (PANC-1) Leberkrebs (HLF) Gebärmutterhalskrebs (Hela)

Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen ebenfalls, daß α-Carotin eine inhibitorische Wirkung auf verschiedenartige Tumorzellen besitzt, unabhängig von ihrem embryonalem Ursprung, d.h. ektoderm oder endoderm. Sowohl solide Tumoren als auch Leukämiezellen sind gegenüber einer Behandlung mit α-Carotin empfänglich.

Beispiel 4

30 Mäuse wurden in zwei Gruppen zu je 15 Stück geteilt. Das Fell auf dem Rücken jeder Maus wurde auf einer relativ großen Fläche abrasiert. Eine Dimethylbenzoanthracen(DMBA) - Aceton -Lösung wurde auf die abrasierte Fläche jeder Maus aufgetragen (100 µg DMBA/Maus).
Eine Woche später wurde bei einer Gruppe als Kontrolle eine 12-0- Tetradecanol-phorbol-13-acetat(TPA) - Lösung auf der mit DMBA behandelten Fläche jeder Maus zweimal wöchentlich aufgetragen (0,5 µg TPA/Maus/Anwendung), und andererseits wurde eine Palmcarotinenthaltende TPA-Aceton-Lösung (30% α-Carotin, 65% β-Carotin und 5% andere Carotinoide) auf der mit DMBA behandelten Fläche jeder Maus der anderen Gruppe zweimal wöchentlich aufgetragen (162 nMol Palmcarotin/Maus/Anwendung und 0,5 µg TPA/Maus/Anwendung), und die Anzahl der Tumor-tragenden Mäuse wurde in jeder Gruppe untersucht.
Die Ergebnisse sind in Fig. 3 gezeigt.
Ein Ergebnis war, daß α-Carotin enthalten des Palmcarotin eine ausgezeichnete Wirkung in bezug auf die Inhibierung des Auftretens von Krebs hat.
Ein erfindungsgemäßes Antitumormittel enthaltende Zubereitungen werden z.B. nach folgenden Vorschriften hergestellt:

Vorschrift 1 (Kapsel):

Palmcarotin (100 g) wird in Öl aus embryonalen Weizenkeimlingen (1 kg) suspendiert und dann in 1000 Gelatinekapseln gefüllt. Eine bis zehn Kapseln werden täglich verabreicht.

Vorschrift 2 (Injektion)

Palmcarotin (100 g), Stearinsäuremonoglycerid (100 g), Erdnußöl (200 g), Saccharoseglycerinstearylester (50 g), Ascorbinsäurestearat (20 g) und destilliertes Wasser für die Injektion (9530 g) werden zur Bildung einer injizierbaren Lösung miteinander vermischt. Die Zubereitung wird in Ampullen zu Mengen von je 10 ml gefüllt.

Vorschrift 3 (Externe Salbe)

Polyethylenglykol 4000 (150 g), Polyethylenglykol 400 (150 g) und α- Carotin (1 g) werden unter Erwärmen zur Herstellung der Zubereitung vermischt. Die externe Salbe ist bei Hautkrebs wirksam.

Vorschrift 4 (Zäpfchen)

Methylsalycylat 0,0350 g
Pharmasol T - 115 (Nissan Chemical Industries, Ltd;) 2,0000 g
α-Carotin 0,0100 g

Claims

1. Verwendung einer α-Carotin und falls erwünscht, herkömmliche nicht toxische Träger. Vehikel und Additive umfassenden pharmazeutischen Zusammensetzung zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung des Wachstums von Krebszellen.

2. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach Anspruch 1 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Behandlung von Tumoren ektodermalen und/oder endodermalen Ursprungs.

3. Verwendung von α-Carotin zur Herstellung eines Arzneimittels zur Inhibierung des Wachstums von Krebszellen.

4. Verwendung nach Anspruch 3, gekennzeichnet durch die Verwendung von α-Carotin zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Tumoren ektodermalen und/oder endodermalen Ursprungs.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 3 und 4. dadurch gekenn zeichnet, daß α-Carotin in einer das Krebszellenwachstum inhibierenden oder die Krebszellendifferenzierung induzierenden Menge verwendet wird.