DE4319492A1

DE4319492A1 - Dicarbonsäureester

Info

Publication number: DE4319492A1
Application number: DE4319492A
Authority: DE
Inventors: Carl Dr Eugster; Conrad Hans Prof Dr Eugster; Walter Dr Haldemann; Giorgio Prof Rivara; Guiseppe Prof Zina
Original assignee: Marigen SA
Current assignee: Marigen SA
Priority date: 1992-10-09
Filing date: 1993-06-11
Publication date: 1994-04-14
Also published as: GB2285805A; GB9400882D0; CH681891A5

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue, antitumorale Ester von gesättigten und ungesättigten Dicarbonsäuren mit Sterolen, Vitamin-D-, und Vitamin-E- Verbindungen, sowie Verfahren zu ihrer Herstellung und zur Bildung von spontan dispergierbaren Konzentraten und von pharmazeutischen Prä paraten mit diesen neuen Dicarbonsäureestern. Die neuen Dicarbon säureester haben überraschenderweise eine sehr gute antitumorale Wirkung, insbesondere dann, wenn sie in spontan dispergierbare Konzentrate eingearbeitet worden sind.

Beschreibung der Erfindung

Die neuen Ester von gesättigten und ungesättigten Dicarbonsäuren mit Sterolen, Vitamin-D- und Vitamin-E-Verbindungen haben die allgemeinen Formeln (I) bis (VI):

wobei in den Formeln (I) bis (II) n die Zahlen 1 bis 18, sowie in den Formeln (I) bis (VI) R₁ C₁- bis C₂₀-Alkyl oder C₂- bis C₂₀-Alkenyl, R₂ Wasserstoff oder Methyl und R₃ eines der Radikale der Formeln (VII) bis (XXIV) bedeuten:

wobei in den Formeln (VII) bis (XVI) das Radikal R₄ für eine C₁- bis C₁₀- Alkyl- oder eine C₂- bis C₁₀-Alkenylgruppe steht,

und wobei in den Formeln (XVII) und (XVIII) die Radikale R₅, R₆ und R₇ für Wasserstoff oder Methyl stehen,

wobei in den Formeln (XXIII) und (XXIV) m die Zahlen 1, 2, 3, 4 oder 5 meint und R₈ für eines der Radikale der Formeln:

steht.

Die Alkyl- und Alkenylgruppen bei R₁ und R₄ können geradkettig oder verzweigt sein. Bei R₁ haben die Alkylgruppen bevorzugt 1 bis 4 Kohlen stoffatome.

Bei R₄ in den Formeln (VII) bis (XVI) haben die Alkyl- und die Alkenylgruppen zumeist 8 bis 10 Kohlenstoffatome. Beispiele solcher Ver bindungen sind u. a.:

Die Verbindungen der Formeln (III) und (IV) liegen gemäß den Ausgangsprodukten Maleinsäure, bzw. Fumarsäure in ihrer cis- oder trans form vor. Die Radikale der Formeln (XXIX) und (XXX) können in verschiedenen stereoisomeren oder Drehformen vorhanden sein.

Unter Vitamin-D-Verbindungen sind folgende Verbindungen zu verstehen:
Cholecalciferol: (5Z,7E)-(3S)-9,10-seco-5,7,10 (19)-cholestatrien- 3-ol
25-Hydroxycholecalciferol [Calcidiol]: (5Z,7E)-(3S)-9,10-seco-5,7,10 (19)-cholestatrien-3,25-diol
1a-Dihydroxy-cholecalciferol [Calcitriol]: (5Z,7E)-(1S,3R)-9,10-seco- 5,7,10 (19)-cholestatrien-1,3,25-triol
Ergocalciferol [Calciol]: (5Z,7E,22E)-(3S)-9,10-seco-5,7,10 (19),22- ergostatetraen-3-ol
Tachysterol: (6E)-(3S)-9,10-seco-5, (10)-6,8-cholestatrien-3-ol
Dihydrotachysterol: (5E,7E)-(3S,10S)-9,10-seco-5,7-cholestatrien- 3-ol.

Unter Vitamin-E-Verbindungen sind alle Tocol- und Tocotrienolverbindun gen, wie z. B.:
Tocol [2-Methyl-2(4,8,12-Trimethyltridecyl)chroman-6-ol] α-Tocopherol [5,7,8-Trimethyltocol],
welches in folgenden Konfigurationen vorliegen kann:
12,12,12-α-Tocopherol
2-epi-α-Tocopherol
2-ambo-α-Tocopherol
all-rac-α-Tocopherol
4-ambo-8-ambo-α-Tocopherol
β-Tocopherol [5,8-Dimethyltocol]
γ-Tocopherol [7,8-Dimethyltocol]
δ-Tocopherol [8-Methyltocol]
Tocotrienol [2-Methyl-2-(4,8,12-Trimethyldeca-3,7,11-(trianyl)chro man-6-ol]
ρ1- oder ρ2-Tocopherol [5,7,8-Trimethyltocotrienol] und
ε-Tocopherol [5 8-Dimethyltocotrienol oder ε-Tocotrienol] begriffen.

Das wichtigste Radikal der Formel (XXIII) ist bestimmt durch die Formel (XXV):

Das wichtigste Radikal der Formel (XXV) liegt in verschiedenen stereoiso meren Formen, so z. B. als all trans, 9-cis oder als 13-cis Form vor.

Von besonderer Bedeutung sind Verbindungen der Formeln (I) bis (VI), worin n die Zahlen 1 bis 8 meint, R₁ für Methyl oder Äthyl steht, R₂ Wasserstoff darstellt und R₃ eines der Radikale der Formeln (XXV) bis (XXX) wiedergibt:

Beispiele von erfindungsgemäßen, neuen Doppelestern der Formeln (I) bis (VI) sind u. a.:

Malonsäure-bis-Stigmasterylester
Bernsteinsäure-bis-Stigmasterylester
Glutarsäure-bis-Stigmasterylester
Adipinsäure-bis-Stigmasterylester
Pimelinsäure-bis-Stigmasterylester
Suberinsäure-bis-Stigmasterylester
Azelainsäure-bis-Stigmasterylester
Sebacinsäure-bis-Stigmasterylester

Azelainsäure-bis-β-Sitosterylester
Sebacinsäure-bis-β-Sitosterylester
Azelainsäure-bis-Ergosterylester
Sebacinsäure-bis-Ergosterylester
Azelainsäure-bis-Cholesterylester
Sebacinsäure-bis-Cholesterylester.

Maleinsäure-bis-Stigmasterylester
Fumarsäure-bis-Stigmasterylester
Maleinsäure-bis-β-Sitosterylester
Fumarsäure-bis-β-Sitosterylester
Maleinsäure-bis-Ergosterylester
Fumarsäure-bis-Ergosterylester
Maleinsäure-bis-Cholesterylester
Fumarsäure-bis-Cholesterylester

Azelainsäure-Calciferyl-diester
Sebacinsäure-Calciferyl-diester
Azelainsäure-Cholecalciferyl-diester
Sebacinsäure-Cholecalciferyl-diester
Azelainsäure-DL-α-Tocopheryl-diester
Sebacinsäure-DL-α-Tocopheryl-diester

Glutarsäure-äthyl-Calciferylester
Glutarsäure-Calciferyl-methylester
Fumarsäure-äthyl-Calciferylester
Fumarsäure-Calciferyl-methylester
Azelainsäure-äthyl-Calciferylester
Azelainsäure-Calciferyl-methylester
Azelainsäure-äthyl-Cholecalciferylester
Azelainsäure-Cholecalciferyl-methylester
Sebacinsäure-äthyl-Calciferylester
Sebacinsäure-Calciferyl-methylester
Sebacinsäure-äthyl-Cholecalciferylester
Sebacinsäure-Choleclaciferyl-methylester.

HERSTELLUNG

Die Verbindungen der Formeln (I), (III), (V) und (VI) lassen sich allgemein nach folgenden, an sich bekannten Verfahren herstellen:

a) Umsetzung einer Verbindung der Formeln (XXXI) bis (XXXIV) worin n die Zahlen 1 bis 18 und R₂ Wasserstoff oder Methyl bedeuten, mit N,N′-Carbonyldiimidazol bei 25 bis 70 °C unter Zusatz einer katalytischen Menge eines Alkoholates in einem indifferenten Lösungsmittel, wie z. B. Tetrahydrofuran, Benzol, Toluol oder Chloroform, und anschließender Al koholyse der gebildeten Imidazolide mit einem erfindungsgemäß zu ver wendenden Sterol, einer Vitamin-D- oder Vitamin-E-Verbindung.
b) Bildung des Dichlorides, bzw. des Dibromides der Verbindungen der Formeln (XXXI) bis (XXXIV) mit einem Chlorierungsmittel, bzw. Bro mierungsmittel wie z. B. Thionylchlorid, Oxalylchlorid oder Oxalylbromid, und anschließender Reaktion der entstandenen Dichloride, bzw. Dibromide mit einem erfindungsgemäß zu verwendenden Sterol, einer Vitamin-D- oder Vitamin-E-Verbindung in einem inerten Lösungsmittel wie z. B. Toluol oder Tetrahydrofuran bei einer Reaktionstemperatur von 40 bis 80°C unter Zusatz eines Katalysators wie z. B. Dimethylformamid oder Pyridin.
c) Verfahren zur Herstellung der Verbindungen der Formeln (II) und (IV). Umsetzung einer Verbindung der Formeln (XXXV) und (XXXVI): worin n die Zahlen 1 bis 18 darstellt, R₁ für Alkyl oder Alkenyl steht und R₂ Wasserstoff oder Methyl bedeutet, mit einem erfindungsgemäß zu verwendenden Sterol, einer Vitamin-D- oder Vitamin-E-Verbindung in einem inerten Lösungsmittel wie z. B. Toluol oder Tetrahydrofuran bei einer Reaktionstemperatur von 40 bis 80°C unter Zusatz eines Katalysators wie z. B. Dimethylformamid oder Pyridin. Die Verbindungen der Formeln (XXXV) und (XXXVI) werden auf bekannte Weise hergestellt, indem man zuerst das Dihalogenid der Formeln (XXX) und (XXXI) gemäß b) herstellt und anschließend die gebildeten Dihalogenide mit einer halbstöchiometrischen Menge eines Alkyl- oder Alkenylalkohols in Gegenwart eines Katalysators wie z. B. Dimethylformamid oder Pyridin halbverestert und das Reaktions produkt entweder durch Destillation oder durch Chromatographie reinigt.

Die neuen Dicarbonsäureester der Formeln (I) bis (VI) haben über raschenderweise eine ausgezeichnete antitumorale Wirkung. Sie sind besonders gut wirksam gegen Tumore der Haut, bzw. von Epithelgeweben, vor allem dann, wenn sie erfindungsgetreu in spontan dispergierbare Kon zentrate eingearbeitet worden sind. Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind deshalb auch spontan dispergierbare Konzentrate mit den neuen Dicarbonsäureestern der Formeln (I) bis (VI). Solche Konzentrate ergeben, mit Wasser versetzt, Mikroemulsionen von hervorragender Phasenstabilität und überaus deutlich erhöhtem Permeations- und Spreitungsvermögen. Kontrollmessungen, durchgeführt am Institut für Polymere der E.T.H., Zürich, haben ergeben, daß die hydrodynamischen Radien für die sich bildenden Mizellen um 1-2,4 nm betragen. (Prof. Dr. Pier Luigi LUISI und Prof. Dr. Peter SCHURTENBERGER).

Die erfindungsgemäß spontan dispergierbaren Konzentrate enthalten:
0,001 bis 25 Gewichts-% einzelner Dicarbonsäureester der Formeln (I) bis (VI), bzw. Kombinationen dieser Komponenten, sowie
0,1 bis 40 Gewichts-% eines als Hydrotrop, bzw. Co-Emulgator dienenden, pharmaverträglichen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches
0,1 bis 90 Gewichts-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Tensid gemisches
0 bis 10 Gewichts-% eines Vitamins oder Provitamins
0 bis 10 Gewichts-% einer freien Fettsäure oder einer Aminosäure und pharmazeutisch zugelassene Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel.

Die erfindungsgemäß einzusetzenden Tenside oder Tensidgemische können anionaktiv, kationaktiv, amphoter oder nicht-ionogen sein. Am besten sind sie nicht-ionogen oder amphoter und haben ein HLB-Verhältnis (d. h. eine "hydrophilic-lipophilic-balance") zwischen 2 bis 18; bevorzugt liegt es zwischen 2 bis 6 einerseits und 10 bis 15 anderseits. HLB-Verhältnisse geben Auskunft über die hydrophilen und lipophilen Eigenschaften eines Emulgators. Vgl. dazu "Hydrophile-Lipophile Balance: History and recent Developments" von Paul Becher im Journal of Dispersion Science and Technology. 5 (1), 81-96 (1984).

Geeignete anionische Tenside können sowohl sog. wasserlösliche Seifen als auch wasserlösliche synthetische Verbindungen sein. Als Seifen eignen sich die Alkali-, Erdalkali- oder gegebenenfalls sub stituierten Ammoniumsalze von höheren Fettsäuren (C₁₀ bis C₂₂), wie z. B. die natürlichen Na- oder k-Salze der Öl- oder Stearinsäure, oder von natürlichen Fettsäuregemischen, welche sich u. a. aus Kokosnuß- oder Talgöl gewinnen lassen. Ferner sind als Tenside auch die Fettsäure- Methyltaurinsalze, sowie modifizierte und nicht-modifizierte Phospholipide zu erwähnen.

Häufiger werden jedoch sogenannte synthetische Tenside verwendet, ins besondere Fettsulfonate, Fettsulfate, sulfonierte Benzimidazolderivate oder Alkylarylsulfonate.

Die Fettsulfonate und -sulfate liegen in der Regel als Alkali-, Erdalkali- oder gegebenenfalls substituierte Ammoniumsalze vor und weisen im allge meinen einen Alkylrest mit 8 bis 22 C-Atomen auf, wobei Alkyl auch den Alkylteil von Acylresten einschließt. Beispiele hiefür sind das Na- oder Ca- Salz der Ligninsulfosäure, des Dodecylschwefelsäureesters und Sulfon säuren von Fettalkohol-Äthylenoxyd-Addukten. Die sulfonierten Benzimid azol-Derivate enthalten vorzugsweise zwei Sulfonsäuregruppen und einen Fettsäurerest mit etwa 8-22 C-Atomen. Alkylarylsulfonate sind z. B. die Na-, Ca- oder Triäthanolaminsalze der Dodecylbenzolsulfonsäure, der Dibutyl naphthalinsulfonsäure oder eines Naphthalinsulfonsäure-Formaldehydkon densationsproduktes.

Als nichtionische Tenside stehen in erster Linie zur Wahl die Polyglykol ätherderivate von aliphatischen oder cycloaliphatischen Alkoholen, gesät tigten oder ungesättigten Fettsäuren und Alkylphenolen, welche 3 bis 30 Glykoläthergruppen und 8 bis 20 C-Atome im (aliphatischen) Kohlenwas serstoffrest und 6 bis 18 C-Atome im Alkylrest enthalten können. Weiterhin kommen als nichtionische Tenside in Frage die wasserlöslichen, 20 bis 250 Äthylenglykoläthergruppen und 10 bis 100 Propylenäthergruppen ent haltenden Polyäthylenoxydaddukte an Polypropylenglykol und Alkylpoly propylenglykol mit 1 bis 10 C-Atomen in der Alkylkette. Die genannten Verbindungen enthalten üblicherweise pro Propylenglykol-Einheit 1 bis 5 Äthylenglykoleinheiten.

Als Beispiele nicht-ionischer Tenside seien erwähnt:

Nonylphenolpolyäthoxyäthanole, Ricinusölpolyglykoläther, Polypropylen- Polyäthylenoxyd-Addukte, Tributylphenoxypolyäthoxyäthanol, Polyäthylen glykol und Octylphenoxypolyäthoxyäthanol. Überdies kommen auch Fett säureester von Polyoxyäthylensorbitan, wie das Polyoxyäthylensorbitantri oleat, in Betracht.

Bei den kationischen Tensiden handelt es sich vor allem um quaternäre Ammoniumsalze, welche als N-Substituenten mindestens einen Alkylrest mit 8 bis 22 C-Atomen enthalten und als weitere Substituenten niedrige, gegebenenfalls halogenierte Alkyl-, Benzyl- oder niedrige Hydroxyalkylreste aufweisen. Die Salze liegen vorab als Halogenide, Methylsulfate oder Äthylsulfate vor, z. B. das Stearyltrimethylammoniumchlorid oder das Benzyldi-(2-chloräthyl)-äthylammoniumbromid. In hohem Maße bevorzugt zur Herstellung von erfindungsgemäßen, spontan dispergierbaren Konzentraten sind einerseits Phosphorsäureester tenside, wie z. B.:
Tristyrylphenolpolyoxyäthylen-18-mono/dimethyl-Phosphorsäureester (Soprophor® FL, Rhône-Poulenc);
Nonylphenol-10-polyoxyäthylenmono/dimethylphosphorsäureester (Diphasol® 3873, CIBA-GEIGY), bzw. das Identische Sermul® EA 188 (SERVO)

Tinovetin® JU (CIBA-GEIGY), ein Hydroxybiphenyl-10-Äthoxy-Phosphor säureester;
Butyl-mono-4-Äthoxy-Phosphorsäureester (Zerostat® AT, CIBA-GEIGY), bzw.

und anderseits Betainverbindungen, d. h. amphotere, salz- und wasserfreie Imidazolderivate, wie z. B.:

worin Me^[+] für Wasserstoff, Alkali- und Erdalkaliatome und R_x für C₁- bis C₃₂-Alkyl oder C₂- bis C₃₂-Alkenylgruppen stehen.

Als Hydrotrop, bzw. Co-Emulgator dienende, pharmaverträgliche Lösungs mittel lassen sich einsetzen, z. B.: Ester eines aliphatischen Alkohols (C₃- C₁₈) mit einer aliphatischen Carbonsäure (C₁₀-C₂₂), wie etwa Isopropyl laurat, Hexyllaurat, Decyllaurat, Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat und Laurylmyristat; Kohlenwasserstoffe mit einer geraden Kohlenstoffkette (C₁₂-C₃₂), welche mit 6 bis 16 Methylgruppen substituiert ist und bis 6 Doppelbindungen aufweisen kann, wofür Terpene wie Polymethylbutane und Polymethylbutene als Beispiele dienen mögen. Monoester aus Äthylenglykol oder Propylenglykol mit einer aliphatischen Carbonsäure (C₆-C₂₂), wie etwa Propylenglykolmonolaurat und Propylen glykolmonomyristat. Ester aus einem aliphatischen Alkohol (C₁₂-C₂₂) mit Milchsäure, wie z. B. Myristyl- oder vorzugsweise Lauryl-Lactat; Mono-, Di- oder Triester des Glycerins mit einer aliphatischen Carbonsäure (C₆-C₂₂), wie z. B. Glyceryl- Caprylat, oder Miglyol® 812 Neutralöl (Oleum neutrale). Ester aus einem Poly(2-7)äthylenglykolglyzerinäther mit mindestens einer freien Hydroxylgruppe mit einer aliphatischen Carbonsäure (C₆-C₂₂), wie z. B. aliphatische Alkohole (C₁₂ bis C₂₂), somit u. a. Dodecanol, Tetradeca nol, Oleylalkohol, 2-Hexyldecanol und 2-Octyldecanol. Ester mit mindestens einer freien Hydroxylgruppe, aus Poly-(2-10)glykol mit einer aliphatischen Carbonsäure (C₆ bis C₂₂), Monoäther aus einem Poly äthylenglykol mit einem aliphatischen Alkohol (C₁₂ bis C₁₈), wie z. B. Poly oxyäthylen-(C₁₀)octyläther. Heterocyclische Verbindungen, wie z. B. 1-Methyl-2-Pyrrolidon.

Alle technischen Tenside wurden vor dem Eintrag in die spontan dis pergierbaren Konzentrate mittels Filtration, bzw. Chromatographie über neutralem Aluminiumoxyd mit einem inerten Lösungsmittel wie z. B. Tetra hydrofuran, Äthylalkohol oder Methylenchlorid gereinigt.

Als Zusätze in die erfindungsgemäßen spontan dispergierbaren Konzen trate eignen sich ausgewählte Lichtschutzmittel und Radikalfänger, ferner Vitamine und Provitamine (wie z. B. Vitamin A, Retinol, Carotine, Tocophe role), sowie auch freie Fettsäuren wie etwa: Valeriansäure, Isovaleriansäure, Sorbinsäure, Isocapronsäure, Pelargonsäure, Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, Arachidsäure, Behensäure, Hexacosansäure, Octacosansäure, Pentadecansäure, Decenylsäure, Undecenylsäure, Dode cenylsäure, Oleinsäure, Linolsäure, Linolensäure, Arachidonsäure, Erucasäure, etc. In Frage kommen auch Benzoe-, Zitronen-, Äpfel-, Mandel- oder β-Glycyrrhetinsäure, etc. oder Dicarbonsäuren wie z. B. Malonsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure, Azelainsäure, Sebacinsäure.

Die zur pharmazeutischen Anwendung erforderliche Tagesdosis beträgt 0,001 bis 25 mg/kg Körpergewicht, wenn möglich verteilt auf 2-3 Einzel dosen. Hierfür lassen sich die Dicarbonsäureester von Sterolen, Vitamin D- und Vitamin E-Verbindungen, sowie von speziellen Alkoholen oder die spontan dispergierbaren Konzentrate mit diesen Estern in die gängigen pharmazeutischen Zubereitungen und Darreichungsformen wie Dragees, Tabletten, Kapseln, Pulver, Granulat, Pellets, Lösungen, Ampullen, Emulsionen, Cremes oder Zäpfchen zusammen mit den üblichen Träger stoffen und/oder Verdünnungs- und Stabilisierungsmitteln einarbeiten. Die Gegenstand der Erfindung bildenden Wirkstoffe, sowie die spontan dispergierbaren Konzentrate, welche diese Wirkstoffe oder Wirkstoff mischungen enthalten, können dem Menschen oral, durch Injektion (intravenös, subkutan oder intramuskulär) oder in anderer Weise verabreicht werden. Wenn sie als feste Darreichungsformen für die orale Verwendung aufbereitet werden, kann dies in Form von Tabletten, Granulaten, Pellets, Pulvern oder Kapseln, usw. geschehen. Die Aufbereitungen können Zusatzstoffe enthalten, z. B. einen Arzneimittelträger wie eine Saccharid- oder Cellulose-Grundlage, ein Bindemittel wie Stärkepaste oder Methyl- Cellulose, ein Füllmittel oder ein Desintegriermittel, usw. - wobei Zusatzstoffe eingesetzt werden, wie sie üblicherweise bei der Herstellung medizinischer oder paramedizinischer Formulierungen verwendet werden.

Wenn die erfindungskonformen Wirkstoffe als flüssige Darreichungsformen zu oraler Verabreichung gelangen, so können sie irgend eine aus wäßrigen Zubereitungen für innere Verwendung, aus Suspensionen, Emulsionen und Sirups usw. ausgewählte Form haben, und sie können außerdem in der Form getrockneter Präparate vorliegen, welche vor ihrer Verwendung in Lösung oder Emulsion gebracht werden.

Wenn die erfindungsgemäßen Wirkstoffe oder Wirkstoffmischungen in der Form wäßriger Lösungen, Suspensionen oder öliger, bzw. wäßriger Emulsionen, vorzugsweise als Mikroemulsionen aus den erfindungs konformen, spontan dispergierbaren Konzentraten aufbereitet sind, können sie auch injiziert werden. Die Injektionslösungen werden jedoch übli cherweise kurz vor der Anwendung hergestellt, indem man die Extrakte oder Konzentrate in wäßrigen, flüssigen Medien wie sterilem Wasser, Glucoselösung oder physiologischer Kochsalzlösung auflöst oder sus pendiert.

Falls erforderlich, können zu einem Injektionspräparat üblicherweise ver wendete Lösungsmittel, Stabilisierungsmittel, Konservierungsmittel und Zu sätze für die Herstellung isotonischer Lösungen hinzugegeben werden. Die auf diese Weise erhaltenen Injektionspräparate werden intravenös, intra muskulär, subkutan oder in einer anderen geeigneten Weise verabreicht.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls pharmazeutische Präparate, welche die Wirkstoffe und/oder die beschriebenen, spontan dispergierbaren Konzentrate zur Bekämpfung des Wachstums von Tumorzellen enthalten. Bei den der Erfindung entsprechenden pharmazeutischen Präparaten handelt es sich um solche zur enteralen (wie oralen oder rektalen), sowie zur parenteralen oder topischen Verabreichung an Warmblüter, welche das spontan dispergierbare Konzentrat allein oder zusammen mit einem pharmazeutisch anwendbaren Trägermaterial enthalten.

Die Dosierung der erfindungsgemäßen Konzentrate hängt von der Warmblüterspezies, dem Alter und dem individuellen Zustand, sowie von der Verabreichungsart ab. So werden z. B. zur Erzielung eines Abtötungseffektes von Tumorzellen an Warmblütern mit geringem Körpergewicht, wie z. B. Mäusen, Ratten und Hamstern, bei sukutaner Verabreichung Dosen im Bereich von ca. 0,1-50 mg/kg Körpergewicht, und bei intraperitonealer Verabreichung Dosen im Bereich von 0,05-5 mg/kg Körpergewicht angewandt.

Die oralen und rektalen Formen der neuen pharmazeutischen Präparate enthalten zwischen 1-95%, vorzugsweise zwischen 10-95%, insbesondere zwischen 20-95% des erfindungsgemäßen, spontan dispergierbaren Konzentrates. Sie können z. B. in Dosis-Einheitsform vorliegen, also als Dragees, Micropellets, Tabletten, Suppositorien oder Ampullen und vor allem als Kapseln. Geeignete pharmazeutisch anwendbare Trägerstoffe für die oralen Formen sind hauptsächlich Füllstoffe, wie Zucker (z. B. Lactose, Saccharose, Mannit oder Sorbit), Cellulosepräparate und/oder Calciumphosphate (z. B. Trical cium- oder Calciumhydrogenphosphat), ferner Bindemittel wie Stärkekleister unter Verwendung von u. a. Mais-, Weizen-, Reis- oder Kartoffelstärke, Gelatine, Traganth, Methylcellulose, Hydroxyl-Methylcellulose, Natrium carboxymethylcellulose und/oder Polyvinylpyrrolidon und/oder Spreng mittel (wenn erwünscht), wie die obgenannten Stärken, ferner Carboxy methylstärke, quervernetztes Polyvinylpyrrolidon, Agar, Alginsäure oder ein Salz davon, wie z. B. Natriumalginat. Als Fließreguliermittel sind z. B. die Polyäthylenglykole Nr. 200 bis 600 geeignet.

Die beim Menschen als Darreichungsform bevorzugten Gelatinekapseln wer den mit geeigneten Überzügen versehen, wobei man u. a. konzentrierte Zuckerlösungen - welche gegebenenfalls arabischen Gummi, Talk, Polyvinyl pyrrolidon, Polyäthylenglykol und/oder Titandioxid enthalten - Lacklösun gen (wäßrige oder solche, die unter Verwendung organischer Lösemittel aufbereitet worden sind), oder magensaft-resistente Überzüge aus Lösungen von geeigneten Cellulosepräparaten, wie mikrokristalliner Cellulose (Avicelä), Acetylcellulosephthalat, Hydroxymethylcellulosephtha lat, Metolose®, AQOAT® oder einem Copolymerisat wie Eudragit® L 30 D verwendet.

Als erfindungsgemäß besonders geeignete, oral anwendbare pharma zeutische Darreichungsform eignen sich Steckkapseln aus Gelatine und einem Weichmacher, wie Glyzerin oder Sorbitol. Vorzügliche Tauglichkeit wiesen auch Steckkapseln aus Hydroxylpropyl-Methylcellulose-Acetat- Succinat auf. Die Weich- bzw. Hartgelatine-Kapseln können das erfin dungsgemäße, spontan dispergierbare Konzentrat im Gemisch mit Füllstoffen, wie Laktose, Bindemitteln wie Stärke und/oder Gleitmitteln wie Talk oder Magnesium-Stearat und gegebenenfalls mit Stabilisatoren und Antioxydantien wie z. B. α-, β-, γ-Tocopherol oder β-Carotin enthalten. Der Einsatz von geeigneten Flüssigkeiten wie flüssigen Polyäthylenglykolen No. 200-600 als Verdünnungsmittel kann sich empfehlen, wobei sich ebenfalls Stabilisatoren, Antioxydantien oder Lichtschutzmittel, bzw. Radikalfänger zufügen lassen.

Zur parenteralen Verabreichung werden die erfindungskonformen Konzen trate mit destilliertem Wasser versetzt. Der entstehenden wäßrigen In jektions-Mikroemulsion können viskositätserhöhende Stoffe, wie z. B. Na- Carboxymethylcellulose, Sorbit, Mannit und/oder Dextran, und gegebenen falls auch Stabilisatoren und Antioxydantien zugefügt werden. Die pharmazeutischen Präparate für die parenterale Anwendung enthalten vorzugsweise zwischen 0,1 bis 60%, vorab zwischen 1 bis 40% des erfindungsgemäßen, spontan dispergierbaren Konzentrates. Als topisch anwendbare Präparate, welche sich vornehmlich zur Prophylaxe von Hautkrebsarten eignen, kommen z. B. Gele, Cremen, Salben, Pasten, Schäume, Tinkturen und Lösungen in Betracht, welche zwischen 0,01 und 100% des erfindungsgemäßen Konzentrates enthalten. Für Crmen und Öl-in-Wasser-Emulsionen, welche mehr als 50% Wasser aufweisen, verwendet man als ölige Grundlage in erster Linie Fettalkohole, z. B. Lauryl-, Cetyl- oder Stearylalkohol, flüssige bis feste Wachse, z. B. Isopropylmyristat, Woll- oder Bienenwachs und/oder Kohlenwasserstoffe wie z. B. Vaseline (Petrolatum) oder Paraffinöl. Zur Emulgierung dieser öligen Grundlagen eignen sich in erster Linie oberflächenaktive, pharma verträgliche Substanzen mit vorwiegend hydrophilen Eigenschaften, wie z. B. nicht-ionogene Emulgatoren, vorab Fettsäureester von Polyalkoholen oder Äthylenoxydaddukten (etwa Polyglycerinfettsäureester oder Polyäthylen sorbitan-Fettsäureester) mit einem HLB-Verhältnis von unter 8. Zusätze zur Wasserphase sind u. a. Mittel, die die Austrocknung der Cremen vermindern, z. B. Polyalkohole wie Glyzerin, Sorbit, Propylenglykol und/oder Poly äthylenglykole No. 200-600, ferner Konservierungsmittel, Riechstoffe, etc. Salben sind Wasser-in-Öl Emulsionen, die bis zu 70%, vorzugsweise je doch zwischen 20 und 50% Wasser oder wäßrige Phasen enthalten. Als Fettphase kommen in erster Linie Kohlenwasserstoffe, z. B. Vaselin, Pa raffinöl und/oder Hartparaffine in Frage, welche zur Verbesserung des Wasserbindungsvermögens geeignete Hydroxydverbindungen, wie z. B. Fett alkohole oder Ester, davon etwa Cetylalkohol oder Wollwachsalkohole, enthalten.

Fallweise werden noch Emulgatoren mit einem HLB-Wert von 8 bis 16, wie z. B. Sorbitan-Fettsäureester (etwa Sorbitanisostearol) zugesetzt. Zusätze zur Wasserphase sind u. a. Feuchthaltungsmittel, wie Polyalkohole (Glycerin, Propylenglykol, Sorbit und/oder Polyäthylenglykole No. 200, 400, 600); ferner Konservierungsmittel, Riechstoffe, etc. Fettsalben sind wasserfrei und enthalten als Grundlage vornehmlich Koh lenwasserstoffe, z. B. Paraffin, Vaselin und/oder flüssige Paraffine; überdies natürliche oder partial synthetische Fette wie z. B. Kokosfettsäure triglycerid, ferner: Fettsäurepartialester des Glycerins, wie z. B. die im Zusammenhang mit den Salben erwähnten, die Wasseraufnahmefähigkeit steigernden Fettalkohole, Emulgatoren und/oder Zusätze. Verwendung finden auch sog. "multi-functional Glucose Derivatives", wie z. B. Glucate® SS (Methyl-Glucose-Sesquistearat) und Glucamate® SSE-20 (PEG-20 Methyl- Glucose-Sesquistearat) von Amerchol, Edison, N.J. Pasten sind Crèmen und Salben mit sekretabsorbierenden Puderbestand teilen, wie beispielsweise Metalloxide (etwa Titanoxid oder Zinkoxid), ferner Talk und/oder Aluminiumsilikate, welche die Aufgabe haben, vorhandene Feuchtigkeit oder Sekrete zu binden. Schäume werden aus Druckbehältern verabreicht und sind in Aerosolform vorliegende Öl-in-Wasser Emulsionen der erfindungsgemäßen, spontan dispergierbaren Konzentrate, wobei halogenierte Kohlenwasserstoffe (wie z. B. Chlorfluorniederalkane: etwa Dichlordifluormethan und Dichlortetra fluoräthan) als Treibmittel verwendet werden. Dazu kommen gegebenenfalls die üblichen Zusätze wie Konservierungsmittel, usw.

Verfahrensbeispiele zur Herstellung von erfindungsgemäßen Dicarbon säureestern der Formeln (I) bis (VI) 1. Herstellung von Azelainsäure-bis-Ergosterylester

a) Zu 9,5 g Azelainsäure in 100 ml Toluol tropft man bei 10°C 15 g Oxalylchlorid (Überschuß) in 50 ml Toluol. Die Reaktionslösung wird bei 20°C während 12 Stunden stehen gelassen. Anschließend werden unter Vakuum das Lösungsmittel, wie auch das überschüssige Oxalylchlorid abdestilliert. Man erhält 10,5 g Azelainsäuredichlorid mit einem Siedepunkt von 243-248°C.

b) Zu 800 mg Ergosterol in 50 ml Toluol werden 250 mg Azelain säuredichlorid und 200 mg Dimethyldformamid zugetropft. Nach zwei stündiger Erhitzung bei 50°C wird das Lösungsmittel durch Vakuum destillation entfernt. Der Rückstand wird mit Acetonitril/Chloroform 2 : 1 umkristallisiert.

Man erhält den Azelainsäure-bis-Ergosterylester als weiße Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 183,7°C.

Auf entsprechende Weise werden auch folgende Verbindungen hergestellt:

Azelainsäure-bis-Cholesterylester
Smp. 138-139°C
IR 2942 cm^-1 γ (CH)
2868 cm^-1 γ (CH)
1723 cm^-1 Ester (C=O)
1467 cm^-1 δ (CH)
1376 cm^-1 δ (CH₃)
1188 cm^-1 ν(C-O) Ester
1010 cm^-1 ν (C-O)

Sebacinsäure-bis-Ergosterylester Bl 1.52514
Sebacinsäure-bis-Cholesterylester Smp. 172,8-173,4°C
Sebacinsäure-bis-Stigmasterylester Smp. 158,5-160,5°C
Glutarsäure-bis-Stigmasterylester Smp. 168,5°C
Glutarsäure-bis-β-Sitosterolester Smp. 179,9°C
Glutarsäure-bis-Cholesterylester Smp. 196,8°C
Glutarsäure-bis-Ergosterylester Smp. 216,7°C
Adipinsäure-bis-Cholesterylester Smp. 194,8°C
Adipinsäure-bis-Ergosterylester Smp. 222,5-223,5°C
Adipinsäure-bis-Stigmasterylester Smp. 216,2°C
Fumarsäure-bis-Stigmasterylester Smp. 277,5-278,5°C
Fumarsäure-bis-Cholesterylester Smp. 240,0-240,5°C
Fumarsäure-bis-Ergosterylester Smp. 181,4-182,8°C

2. Herstellung von Azelainsäure-Ergocalciferyldiester

Zu 800 mg Ergocalciferol (Calciol) in 40 ml Toluol werden bei Raumtemperatur 250 mg Azelainsäuredichlorid und 300 mg Pyridin in 25 ml Toluol zugetropft. Nach einstündiger Erhitzung auf 50°C wird das Lösungs mittel durch Vakuumdestillation entfernt. Der Rückstand wird auf einer Silicagelsäule mit Cyclohexan/Essigester (90 : 10) als Eluiermittel chroma tographiert. Man erhält den Azelainsäure-Ergocalciferyldiester mit einem Brechungs index n_D 20°C (BI) von 1,51860.

IR 2932 cm^-1 ν (CH)
2870 cm^-1 ν (CH)
1721 cm^-1 ν (C=O)
1630 cm^-1 ν (C=C)
1466 cm^-1 δ (CH)
1370 cm^-1 δ (CH3)
1187 cm^-1 ν (C-O)
958 cm^-1 δ (CH)
trans C=C von (D3)

Auf entsprechende Weise werden auch folgende Verbindungen hergestellt:

Azelainsäure-Retinyl-diester Bl 1.56858
(chromatographiert mit n-Hexan/Essigester 80 : 20)
Azelainsäure-Cholecalciferyl-diester Bl 1.54920
Bernsteinsäure-Cholecalciferyl-diester Bl. 1.53252
Fumarsäure-Ergocalciferyl-diester Bl 1.53774
Glutarsäure-Ergocalciferyl-diester Bl 1.54224
Azelainsäure-Ergocalciferyl-diester Bl 1.52340
Sebacinsäure-Ergocalciferyl-diester Bl 1.53528

Die charakteristischen Esterbindungen lassen sich im Infrarotspektrum bei einer Wellenlänge von ca. 1730 cm^-1 nachweisen.

IR-SPEKTREN, gemessen am Spektrometer Perkin Elmer 983G:

Azelainsäure-Ergocalciferyl-diester
IR 2958 cm^-1 ν (CH)
2930 cm^-1 ν (CH)
2870 cm^-1 n (CH)
1723 cm^-1 ν (C=O) Ester
1635 cm^-1 ν (C=C) von D₂
1459 cm^-1 δ (CH)
1370 cm^-1 δ (CH₃)
1185 cm^-1 ν (C-O) Ester
973 cm^-1 δ (CH) trans

Azelainsäure-Retinyl-diester
IR 2982 cm^-1 ν (CH)
2961 cm^-1 ν (CH)
2865 cm^-1 ν (CH)
1728 cm^-1 ν (C=O) Ester
1653 cm^-1 ν (C=C)
1630 cm^-1 ν (C=C)
1605 cm^-1 ν (C=C)
1455 cm^-1 δ (CH)
1377 cm^-1 δ (CH₃)
1360 cm^-1 δ (CH₃)
960 cm^-1 δ (CH) von trans
(C=C)

Struktur von Azelainsäure-Retinyl-Diester bestätigt durch FT Raman-Spek troskopie. Die Ester-Carbonyl-Gruppe ist nicht sichtbar.

Sebacinsäure-Ergocalciferyldiester
IR 2957 cm^-1 ν (CH)
2871 cm^-1 ν (CH)
1723 cm^-1 ν (C=O) Ester
1459 cm^-1 δ (CH)
1371 cm^-1 δ (CH₃)
1183 cm^-1 ν (C-O) Ester
973 cm^-1 δ (CH)

3. Herstellung von Glutarsäure-äthyl-Ergocalciferylester

Zu 400 mg Ergocalciferol (Calciol, Vitamin D₂) in 30 ml Toluol werden bei Raumtemperatur 200 mg (Überschuß) Glutarsäure-monoäthylesterchlorid (Kp_0,07 68-70°C) und 150 mg N,N-Dimethylformamid in 25 ml Toluol zugetropft. Nach zweistündiger Erhitzung auf 60°C wird das Lösungsmittel durch Vakuumdestillation entfernt. Der Rückstand wird auf einer Silica gelsäule mit Cyclohexan/Essigester (90 : 10) als Eluiermittel chromato graphiert. Man erhält den

Glutarsäure-äthyl-Ergocalciferylester Bl 1.51656

Auf entsprechende Weise lassen sich auch andere (asymmetrische) Dicarbonsäure-Methyl- und -Äthyldiester mit Sterolen, bzw. Vitamin-Verbin dungen herstellen, wie z. B.:

Azelainsäure-Ergosteryl-methylester Bl 1.49260
Azelainsäure-Cholecalciferyl-methylester Bl 1.49418
Azelainsäure-äthyl-Cholecalciferyl-ester Bl. 1.52722

Zusammensetzungsbeispiele für erfindungsgemäße, spontan dispergier bare Mittel, welche als antitumorale Wirkstoffe neue Dicarbonsäureester der Formeln (I) bis (VI) enthalten:

a) 2,5 bis 25 Gewichts-% eines oder mehrerer Dicarbonsäureester der Formeln (I) bis (VI)

0,1 bis 40 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Miglyol® 812 (Dynamit Nobel)
20 bis 45 Gewichts-% Diphasol® 3873 (CIBA-GEIGY), bzw. des identischen Produktes Sermul EA 188 (SERVO)
20 bis 45 Gewichts-% Invadin® JFC 800% (CIBA-GEIGY)
0 bis 50 Gewichts-% multifunktionelle Glucose-Derivate wie Glucate® SS und Glucamate® SSE-20 (Amerchol)

b) 2,5 bis 25 Gewichts-% eines oder mehrerer Dicarbonsäureester der Formeln (I) bis (VI)

0,1 bis 40 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Miglyol® 812 (Dynamit Nobel)
20 bis 45 Gewichts-% Invadin® JFC 800% (CIBA-GEIGY)
20 bis 45 Gewichts-% SOPROPHOR® FL (Rhône-Poulenc)
0 bis 50 Gewichts-% multifunktionelle Glucose-Derivate wie Glucate® SS und Glucamate® SSE-20 (Amerchol).

Miglyol® 812-Neutralöl ist ein Neutralöl (Oleum neutrale) der Firma Dynamit Nobel, das einem gemischtsäurigen Triglycerid der fraktionierten Kokos fettsäuren C₈ bis C₁₀ entspricht.
Diphasol® 3873 = Sermul® EA 188 ist ein Mischemulgator, bestehend aus je 50% der beiden Verbindungen mit den Formeln:

c) 2,5 bis 25 Gewichts-% eines oder mehrerer Dicarbonsäureester der Formeln (I) bis (VI)

0,1 bis 40 Gewichts-% Isopropylmyristat, Isopropylpalmitat oder Miglyol® 812 (Dynamit Nobel)
20 bis 60 Gewichts-% Invadin® JFC 800% (CIBA-GEIGY)
20 bis 40 Gewichts-% Amphonyl® CAA, bzw. CA-AA (Oranienburger Chemikalien A.G., bzw. Christ A.G., Aesch/BL)
Invadin® JFC 800% (CIBA-GEIGY) ist ein tert. Octylphenylpolyoxyäthylen äther mit 9 bis 10 Oxyäthylengruppen.
Soprophor® FL (Rhône-Poulenc) ist ein Tristyrylphenolpolyoxyäthylen-18- mono/dimethyl-Phosphorsäureester.
Amphonyl® CAA, bzw. CA-AA (Oranienburger Chemikalien A.G.) ist ein am photeres, salz- und wasserfreies Imidazolderivat auf Basis von Cocos fettsäure mit Formel:

Beispiel für die pharmazeutische Herstellung eines Systempräparates mit erfindungsgemäßen Konzentraten in der Form von "multiple units".

a) Granulierung
Metolose® 90 Sh-4000 (Shin-Etsu Chemical)	90,0 g
Avicel® PH-101	80,3 g
Erfindungsgemäßes MARIGENOL®-KONZENTRAT	139,4 g
Aerosil® 200	80,3 g
Σ	390,0 g

Granulieren/Formen im Schnellmixer oder im Rotationsbett unter Zusatz von 110 g Ethanol, brechen, sieben 18 bis 42 mesh, trocknen 24 h bei 40°C.

b) MSR- und RETARD-Ausrüstung im Rotationsbett mit AQOAT® AS-HG (Shin-Etsu Chemical) und Talk

c) Zusammensetzung fertiges Granulat/bzw. Micropellets
Kernmaterial	44%
Erfindungsgemäßes MARIGENOL®-KONZENTRAT	25%
MSR-Beschichtung	31%
Σ	100%

N.B.: MSR = Magensaft-Resistenz. Die Pellets/Granulate gemäß a) können auch ohne Befilmung unmittelbar in Kapseln abgefüllt werden, welche aus AQOAT® (HPMC-AS-M oder HPMC-AS-N) hergestellt sind, mit Aceton/Ethanol 1 : 1 verschlossen werden und so die Funktionen der MSR und der verzöger ten Abgabe (Retard) angemessen steuern.

BIOLOGISCHE PRÜFUNGEN

Die antitumorale Wirkung von spontan dispergierbaren Konzentraten mit Wirkstoffen gemäß den Aufarbeitungsbeispielen No. 1 bis 4 wird anhand folgender Prüfungsergebnisse bestätigt:

In vitro-Tests mit geeigneten Tumorzell-Linien

Es wurde ein biologisches Assay-System entwickelt, das mit Mikrotiter platten und Verdünnungsreihen arbeitet. Angesetzt werden je 10⁴/ml Tumorzellen in Kulturmedium RPMI 1640 mit 10% fötalem Kalbserum -inak tiviert (GIBCO); sie werden so undicht ausgesät, daß sie während des Assays wachsen können, in sog. nichtkonfluenten Monolayers. Die Proben zugabe erfolgt nach 6-24 Stunden, mit 100 µl pro Reihe, die man im 1. Loch mit 100 µl Medium versetzt. Davon wird die Hälfte entnommen und in das folgende Loch eingebracht, wieder mit 100 µl Medium versetzt, usf. Es entsteht eine geometrische Verdünnungsreihe n½.

Die Proben werden im Plaque Assay während 3-5 Tagen bei 37° C mit 3½% CO₂ inkubiert. Anschließend färben/fixieren mit 0,1% kristallviolett (Fluka, Buchs) in einer Lösung von 70% Methanol, 1% Formaldehyd, 29% Wasser. Die Auswertung wird am Mikroskop vorgenommen; Vergrößerung 300fach. Man bestimmt die größte cytotoxische Verdünnung. Die quantitative Auswertung läßt sich auch mittels Scanning und Absorptionsmessung am Spektrophotometer vornehmen.

AUSWERTUNG DER ERGEBNISSE

FORTSETZUNG

DOSIS-WIRKUNGS-ERMITTLUNGEN an der Maus

Verwendet wurden alte Zuchttiere Balb-c fem. (Charles River, Calco, Italien) Tumor-Zell-Linie TSA (spontanes murines Mammellen-Adenocarcinom), sub kutan gesetzt mit 4 × 10⁴ Zellen
Wirksubstanz mit Sonde verabreicht als wäßrige Mikroemulsion 1 : 100 000 (= 10 ppm Wirksubstanzgehalt), Dosis: 0,5 ml/per os 1 Mal/Tg, bzw. 2 Mal pro/Tg.
Gruppen von je 5 Versuchstieren. (Der Tumor faßt ausnahmslos und wächst subkutan als feste Masse in regelmäßiger Weise). Die statistischen Gruppen können somit verhältnismäßig klein gehalten werden. Als Leitsubstanz wurde der Crotonsäure-Cholecalciferyl-Ester (C 4 : 1-D₃) in der Form eines erfindungsgemäßen Konzentrates, bzw. der daraus herge stellten wäßrigen Mikroemulsion verwendet.

Messung: feste Tumormasse palpieren : Σ ½[ Länge + Breite] in mm

ERGEBNIS IN-VIVO PER OS

Durchführung der Versuche: Prof. Dott. Guido FORNI, Università degli Studi di TORINO, Scuola di Medicina, Istituto di Microbiologia. Das Adenocarcinom TSA ist eine äußerst aggressive Tumorlinie und wird als Vergleichs-Maßstab bei der Beurteilung von Cytostatica verwendet.

Wirkungsweise der MARIGENOL®-Konzentrate bei topischer Anwendung

Zur Gewinnung erster Erkenntnisse über die Wirkungsweise erfin dungsgetreuer Konzentrate bei topischer Anwendung wurde mit den Leitsubstanzen: Ergosterol-10-Undecenoat und Ergosterol-Crotonat an der nackten Maus experimentiert (Topi nu/nu f., Charles River, Calco, lt.), welche immununterdrückt waren mittels Splenectomie und subletaler Bestrahlung 4,5 Gy Cs¹³⁷, Dosis 0,5 Gylmin.

Setzung des Tumors, des humanen Lungencarcinoms ADK-P, (einer äußerst malignen Zell-Linie) 3 Tage danach, inguinal subkutan mit 10⁶ Zellen. Diese Tumorart faßt ausnahmslos sicher, wächst an und bildet in regelmäßiger Progression subkutan eine feste Tumormasse aus. Latenzzeit für die Entwicklung des soliden Tumors 10 ± 2 Tg, dann Wachstum von 3 auf 10 mm innert 61 ± 5 Tg. Keine feststellbaren Metastasen, keine spontane Regression. Tötung der Tiere, wenn die Tumormasse 15 mm erreicht. Injektion der Wirksubstanz-haltigen Mikroemulsion (1 : 100′000 = 10 ppm W.S.-Gehalt), sobald der Tumor 4 mm Größe aufweist, mit 1 ml Mikroemulsion 2-3 Mal/Tag direkt in die Tumormasse und deren Umfeld.

Ergebnisse: Verzögerung des Tumorwachstums um ca. 15 Tg. Eine vollständige Regression auf 4, nach 20-tägiger Behandlung. Beobachtung dieser Tiere während weiterer 90 Tage. Es sind keine Metastasen und keine Rezidive aufgetreten. Organbefund normal. Keine neoplastischen Gewebe.

Dies läßt den Schluß zu, daß die dargelegten Ergebnisse ohne die unmittelbare Beteiligung des oder die Vermittlung seitens des Immunsystems erzielt werden konnten.

ANTIKÖRPERBILDUNG

Proben zur Ermittlung einer möglichen Immunreaktion bei Verabreichung von erfindungsgemäßen Sterolestern wurden von der Readysysteme A.G., Bad Zurzach/Gamma, Universit´ de Liège, Belgien am Kaninchen vorgenommen und zwar mit:
CALCIOL-LINOLEAT [C 18 : 2-D₂-Ester]
als Leitsubstanz, dem Coemulgator C 11 : 1-Citronellylester und der "Kombination" Sterolester/Terpenester 25/75. Im Serum konnte mittels der ELISA-Methode keine Antikörperbildung in Form von Immunoglobulinen nachgewiesen werden. Es traten auch keine Allergene auf.

BLUTWERTE

Gemessen wurde die Oberflächenspannung am peripheren humanen Blut unmittelbar nach Entnahme und Versetzung mit einem erfindungsgemäßen Konzentrat, aus dem durch Zugabe von destilliertem Wasser wie vorstehend beschrieben eine Mikroemulsion hergestellt wurde.

N.B.: Messungen durchgeführt am Krüss Digital-Tensiometer K1OT Vacutainer Becton Dickinson

Die Oberflächenspannung des Normalblutes beträgt 56,2 mNm^-1 (Mittel wert). Vgl. Wissenschaftliche Tabellen Geigy, Hämatologie und Human genetik, 8. A., Basel, 1979, p. 70.

METABOLISMUS

Beim gesunden Menschen konnte nach Einnahme von 2 Kapseln/Tag während 5 Tagen mit je 600 mg eines erfindungsgemäßen Konzentrates mit 10%-STEROLESTERGEHALT (Im konkreten Falle: RETINSÄURE-ERGO- STERYLESTER als analytisch gut geeignete Leitsubstanz) mittels Dünn schicht-Chromatographie nachgewiesen werden:
* a) daß ein Teil der Sterolester unverändert im Urin ausgeschieden wird, d. h. in der Esterform
* b) daß ein Teil der Sterolester sich, ebenfalls unverändert, im Blut feststellen ließ.
* c) daß das Blutbild keinerlei Veränderung aufwies, was auch einen wichtigen Hinweis auf die Verträglichkeit des mizellaren Transport systems abgibt.

Hervorgehoben sei, daß das Diffusionsverhalten der erfindungskonformen Konzentrate und Mikroemulsionen einem generellen physikalischen Prinzip folgt, auf das hin ihre Zusammensetzung optimiert worden ist. Die Penetration an der Zellmembran von Tumorzellen (und anschließende Transfusion) wird anhand von 2%-Konzentraten mit den beiden Leit substanzen ERGOSTEROL-10-UNDECENOAT und ERGOSTEROL-all trans-RE- TINAT mittels Elektronen-Mikroskop-Aufnahmen aufgezeigt. Vgl. dazu die Fig. 1/4 und 2/4.

Der Feinnachweis läßt sich auch unter Einsatz eines geeigneten Puffersystems und Mithilfe von sorgfältig ausgewählten Bedingungen zur Erfassung des elektroosmotischen Fluxes mit der Methode der "Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography - MECC" erbringen. Im aufkon zentrierten Urin und im Blut konnten die Sterolester eindeutig nachge wiesen werden. Vgl. dazu die Fig. 3/4 und 4/4.

Fig. 1/4 zeigt die Penetration an der Membran von Py6-Zellen (Fibro blasten) mit ERGOSTEROL-10-UNDENCENOAT

Fig. 2/4 zeigt die Penetration an der Membran von Py6-Zellen (Fibro blasten) mit ERGOSTEROL-all trans-RETINAT

Fig. 3/4 gibt die Abbildung des MECC-Diagramms für das Referenz- Muster von ERGOSTEROL-all trans-RETINAT-WIRKSUBSTANZ

Fig. 4/4 zeigt als Abbildungen die MECC-Diagramme für die Blutprobe und die Urinprobe.

SIMULIERUNG des elektroosmostichen Austausches der MIKROMIZELLEN

Die Überprüfung der Diffusion einer erfindungsgetreuen Mikroemulsion mit hilfe des Dialyseschlauches zeigte einen eher langsamen Verlauf, mit abgeschwächter Tendenz zum Ausgleich. Dauer 12-20 h, je nach Polarität der Tensidmischung. Es wird jedoch kein voller Konzentrationsausgleich erreicht; die Membran hat eine Barrierenwirkung.

Dasselbe ist der Fall bei Einsatz einer (abgeänderten) Franzzelle, in die eine rohe, ungebleichte, gespaltene Kalbshaut eingeführt wurde. Zwar wandert die gesamte Konzentratmenge, aber ohne Nachwaschen adsorbiert bei Raum temperatur ein Teil des Konzentrates in der Membran selber.

Die Beobachtung im elektrischen Feld brachte eine kombinierte Chromato graphie-Elektrophorese-Filtertechnik zum Einsatz. Die Versuchsanlage umfaßte ein 3-Kammer-Elektrophoresegerät, bei dem die einzelnen Komparti mente unter sich durch Glasfasermikrofilter (Whatman GF/D No. 1823) abge trennt sind, welche je mit einer präparierten Hornhaut aus frischem Schweinsohr beschichtet wurden. Man gibt 10 mM H₃PO₄ oder Acetat pufferlösung pH 4,65 in die Kammer mit der Anode und 10 mM NaOH oder Na-Tetraboratpufferlösung pH 8,5 für HPCE (Fluka No. 82′602) zu jener mit der Kathode, spritzt die (markierte) Mikroemulsion in die mittlere Kammer, setzt ein elektrisches Feld an mit 25 V und 1-2 mA und läßt während 1 h ausgleichen. Dann kann man die Spannung erhöhen auf 40 V und mit 5-10 mA limitieren. Die mit einem Tensidmantel umhüllten Ultramikromizellen einer erfindungsgemäßen Mikroemulsion 1 : 100, gebildet aus einem 2%- MARIGENOL®-Konzentrat, enthaltend 200 ppm Wirksubstanz, beginnen lang sam und stetig in Richtung der Anode (bzw. der Kathode) zu wandern, sintern vorerst vollständig in die Hornhaut ein und durchdringen sie anschließend mindestens zum Teil, je nach Zusammensetzung des Konzentrates.

In Analogie zur Wirkungsweise des osmotischen Druckes beim Wachstum und der Nährstoffaufnahme der Pflanzen findet bei der Transmembran- Elektrophorese mit Kammern ein gerichteter Transportvorgang durch die Naturmembranen (als Filter und Widerstand) statt; es entstehen deutliche Niveauunterschiede zwischen den Trennstufen. Die an sich ungeladenen Esterverbindungen werden also dergestalt im elektrischen Feld beweglich gemacht und bekommen ihre Zielrichtung.

TOPISCHE ANWENDUNG von MARIGENOL® -KONZENTRATEN am MENSCHEN

Am Spital für Infektionskrankheiten Amadeo di Savoia, Turin (Leitung Prof. Dott. Walter GRILLONE) wurden bei freiwilligen Patienten erfindungsgemäße Konzentrate mit Erfolg gegen das Kaposi-Sarkom bei AIDS-Kranken eingesetzt. Die klinischen Versuche wurden mit Konzentraten vorgenommen, welche als Wirksubstanzen, bzw. Coemulgatoren und Emulsionsbildner enthielten:

Präparat No. 1:
1 Gewichts-% Retinyl-dicyclohexyl-ureaester
14 Gewichts-% C 11 : 1-Citronellylester
85 Gewichts-% Tensidmischung
Präparat No. 2:
2 Gewichts-% C 18 : 1-DL-α-Tocopherylester
12 Gewichts-% C 11 : 1-Phytylester
86 Gewichts-% Tensidmischung
Präparat No. 3:
10 Gewichts-% C 4 : 1-Cholecalciferylester
(D₃-Crotonat)
10 Gewichts-% C 11 : 1-Citronellylester
80 Gewichts-% Tensidmischung
Präparat No. 4:
10 Gewichts-% C 4 : 1-Ergosterylester
(ERGO-CROTONAT)
20 Gewichts-% C 11 : 1-Phytylester
70 Gewichts-% Tensidmischung
Präparat No. 5:
10 Gewichts-% Azelainsäure-Chole- calciferyl-diester
(D₃-bis-Azelat)
10 Gewichts-% C 11 : 1-Citronellylester
80 Gewichts-% Tensidmischung

Vorläufiges Ergebnis: Innerhalb von zwei Wochen ist eine vollständige Rückbildung des Syndroms festzustellen; die äußerlich sichtbaren Symp tome der tumoralen Infiltration und der charakteristischen Pigmentierung sind abgeklungen. Die Prüfungen werden fortgesetzt. N.B. MARIGENOL® ist ein eingetragenes Markenzeichen (^TM) der Firma MARIGEN S.A., RIEHEN.

Claims

1. Dicarbonsäureester der Formeln (I) bis (VI) wobei in den Formeln (I) und (II) n die Zahlen 1 bis 18 meint, in den Formeln (II) und (IV) R₁ für C₁- bis C₂₀-Alkyl oder C₂- bis C₂₀-Alkenyl steht, in den Formeln (III) und (IV) R₂ Wasserstoff oder Methyl bedeutet und R₃ in allen 6 Formeln (I) bis (VI) eines der Radikale der Formeln (VII) bis (XXIV) und (XXX) bezeichnet wobei in den Formeln (VII) bis (XVI) das Radikal R₄ eine C₁- bis C₁₀-Alkyl- oder eine C₂- bis C₁₀-Alkenylgruppe darstellt, und wobei in den Formeln (XVII) und (XVIII) die Radikale R₅, R₆ und R₇ für Wasserstoff oder Methyl stehen, wobei in den Formeln (XXIII) und (XXIV) m die Zahlen 1, 2, 3, 4 oder 5 meint und R₈ für eines der Radikale der Formeln figuriert.

2. Die Verbindungen gemäß Anspruch 1, wobei in den Formeln (I) bis (II) n die Zahlen 1 bis 8 meint, R₁ Methyl oder Äthyl bezeichnet, R₂ Wasserstoff ist und R₃ für die Radikale der Formeln (XXV) bis (XXX) steht

3. Die Verbindungen gemäß Anspruch 2 Malonsäure-bis-Stigmasterylester
Bernsteinsäure-bis-Stigmasterylester
Glutarsäure-bis-Stigmasterylester
Adipinsäure-bis-Stigmasterylester
Pimelinsäure-bis-Stigmasterylester
Suberinsäure-bis-Stigmasterylester
Azelainsäure-bis-Stigmasterylester
Sebacinsäure-bis-StigmasterylesterAzelainsäure-bis-β-Sitosterylester
Sebacinsäure-bis-β-Sitosterylester
Azelainsäure-bis-Ergosterylester
Sebacinsäure-bis-Ergosterylester
Azelainsäure-bis-Cholesterylester
Sebacinsäure-bis-CholesterylesterMaleinsäure-bis-Stigmasterylester
Fumarsäure-bis-Stigmasterylester
Maleinsäure-bis-β-Sitosterylester
Fumarsäure-bis-β-Sitosterylester
Maleinsäure-bis-Ergosterylester
Fumarsäure-bis-Ergosterylester
Maleinsäure-bis-Cholesterylester
Fumarsäure-bis-CholesterylesterAzelainsäure-Calciferyl-diester
Sebacinsäure-Calciferyl-diester
Azelainsäure-Cholecalciferyl-diester
Sebacinsäure-Cholecalciferyl-diester
Azelainsäure-DL-α-Tocopheryl-diester
Sebacinsäure-DL-α-Tocopheryl-diesterGlutarsäure-äthyl-Calciferylester
Glutarsäure-Calciferyl-methylester
Fumarsäure-äthyl-Calciferylester
Fumarsäure-Calciferyl-methylester
Azelainsäure-äthyl-Calciferylester
Azelainsäure-Calciferyl-methylester
Azelainsäure-äthyl-Cholecalciferylester
Azelainsäure-Cholecalciferyl-methylester
Sebacinsäure-äthyl-Calciferylester
Sebacinsäure-Calciferyl-methylester
Sebacinsäure-äthyl-Cholecalciferylester
Sebacinsäure-Cholecalciferyl-methylester.

4. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formeln (I), (III), (V) und (VI) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbin dung der Formeln (XXXI) bis (XXXIV) in welchen n die Zahlen 1 bis 18 bezeichnet und R₂ Wasserstoff oder Methyl bedeutet, mit N,N′-Carbonyldiimidazol bei 25 bis 70°C unter Zusatz einer katalytischen Menge eines Katalysators in einem indifferenten Lösungs mittel und anschließender Alkoholyse der gebildeten Imidazolide mit einem erfindungsgemäß zu verwendenden Sterol, einer Vitamin-D- oder einer Vitamin-E-Verbindung umsetzt.

5. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formeln (I), (III), (V) und (VI) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Ver bindung der Formeln (XXXI) bis (XXXIV) in welchen n die Zahlen 1 bis 18 darstellt und R₂ für Wasserstoff oder Methyl steht, mit einem Chlorierungsmittel, bzw. Bromierungsmittel in das Dichlorid, bzw. das Dibromid überführt und die entstandenen Carbon dichloride, bzw. Carbondibromide mit einem erfindungsgemäß zu verwen denden Sterol, einer Vitamin-D- oder einer Vitamin-E-Verbindung in einem inerten Lösungsmittel bei einer Reaktionstemperatur von 40-80°C reagieren läßt.

6. Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der Formeln (II) und (IV) gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Verbindung der Formeln (XXXV) oder (XXXVI) worin n die Zahlen 1 bis 18 bezeichnet, R₁ für Alkyl oder Alkenyl und R₂ für Wasserstoff oder Methyl stehen, mit einem erfindungsgemäß zu ver wendenden Sterol einer Vitamin-D- oder Vitamin-E-Verbindung in einem inerten Lösungsmittel bei einer Temperatur von 40 bis 80°C und unter Zusatz eines Katalyten umsetzt.

7. Spontan dispergierbares Konzentrat, dadurch gekennzeichnet, daß es als antitumorale und biotenside Komponenten
0,001 bis 25 Gewichts-% einer Verbindung der Formeln (I) bis (VI) gemäß Anspruch 1, bzw. einer Kombination solcher Wirkstoffe, sowie
0,1 bis 40 Gewichts-% eines als Hydrotrop, bzw. Co-Emulgator dienenden, pharmaverträglichen Lösungsmittels oder Lösungsmittelgemisches,
0,1 bis 90 Gewichts-% eines pharmaverträglichen Tensides oder Tensidge misches,
0 bis 10 Gewichts-% eines Vitamines oder Provitamines,
0 bis 10 Gewichts-% einer freien Fettsäure oder einer Aminosäure und zugelassene Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel enthält.

8. Therapeutisches Systempräparat, welches 1 bis 95 Gewichts-% des spontan dispergierbaren Konzentrates gemäß Anspruch 7 enthält und bis zu 10 Gewichts-% eines pharmaverträglichen Zusatzstoffes, Lösemittels oder Stabilisators, oder eines Gemisches davon.

9. Therapeutisches Systempräparat gemäß Anspruch 8, welches 44 Teile Kernmaterial für die Granulat-, bzw. Pellet-Bildung, 25 Teile eines erfindungsgemäßen Konzentrates und 31 Teile magensaftresistente und retardierende Beschichtung mit Hydroxylpropyl-Methylcellulose-Acetat- Succinat enthält.

10. Therapeutisches Systempräparat gemäß Anspruch 8, welches 64 Teile Kernmaterial für die Granulat-, bzw. Pellet-Bildung und 36 Teile eines erfindungsgemäßen Konzentrates enthält und in pharmazeutisch brauchbare Kapseln aus Hydroxylpropyl-Methylcelluose-Acetat-Succinat ab gefüllt ist.