DE3736691C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung eines Östradiolderivates gemäß Anspruch 1.

Aus der GB-OS 20 28 335 sind Chlorambucilderivate, darunter auch 3-Benzoylo­ xy-1,3-5(10)-östratrien-17β-[4-(p-(bis(2-chlorethyl)-amino)-phenyl)-butanoy­ loxyl-acetat bekannt, für welche eine Antitumorwirkung angegeben wird.

Immunsuppressoren, wie Cyclophosphamid, Azathiopurin, Prednisolon, Cyclo­ sporin A und dergleichen, die bisher als Immunregulatoren zur Unterdrückung der Fremdkörperabwehrreaktion, der sogenannten Immunabwehr, die ein Problem bei der Organtransplantation darstellt, verwendet worden sind, unter­ drücken sogar die nicht-spezifische Immunreaktion, die mit der Immunabwehr in keinem Zusammenhang steht. Dieses führt zu der erheblichen Nebenwirkung, daß die immunologische Kraft eines Patienten vermindert wird und somit ernst­ zunehmende Infektionskrankheiten hervorgerufen werden, so daß die her­ kömmlichen Präparate im Hinblick auf ihr klinische Anwendbarkeit einge­ schränkt sind. Demzufolge bestand ein Bedürfnis hinsichtlich der Entwicklung einer Substanz, die die Immunreaktion gegen die Isoantikörper, welche die Im­ munabwehr, die ein Problem bei der Organtransplantation darstellt, steuern, spezifisch unterdrückt.

Es ist daher Aufgabe der Erfindung, eine Verbindung auszuwählen, die zur Pro­ phylaxe und Behandlung von Krankheiten, die sich aus Immunreaktionen ergeben, geeignet ist, die nicht unnötigerweise die Immunreaktion unterdrückt, sondern die Immunreaktion im notwendigen Ausmaß spezifisch unterdrückt, nur eine geringe Toxizität besitzt und außerdem eine hervorragende Wirksamkeit auf­ weist. Diese Verbindung soll weiterhin nur geringe Nebenwirkungen hervorrufen, die Immunität spezifisch steuern und eine spezifische Aktivität bei der Im­ munreaktion gegenüber Isoantikörpern aufweisen und insbesondere eingesetzt werden gegen Reaktionen eines Transplantatempfängers gegen das Transplantat nach Knochenmarktransplantationen, bei der Unterdrückung von Immunabwehrreaktionen bei Transplantationen von Knochenmark, Nieren, Haut, Herz und dergleichen sowie bei der Behandlung von verschiedenen Krank­ heiten, die sich aus Immunreaktionen ergeben, wie Nierenkrankheiten, Schild­ drüsenkrankheiten, chronischem Gelenkrheumatismus, Thrombozytenver­ minderung, allgemeiner Schmetterlingsflechte, schwerer Muskelschwäche, He­ patitiskrankheiten, Autoimmunkrankheiten, Polymyositis und dergleichen.

Diese Aufgabe wird nun gelöst durch die Verwendung eines Östradiolderivats der allgemeinen Formel (I)

zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten, die sich aus Immunreaktionen ergeben.

Gegenstand der Erfindung ist daher die Verwendung gemäß Hauptanspruch. Die Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsge­ genstandes.

Das erfindungsgemäß verwendete Östradiolderivat besitzt nur einen geringen Einfluß auf nicht-spezifische Immunreaktionen und ist daher spezifisch aktiv bei Immunreaktionen gegen Isoantikörper.

Wie man deutlich aus der obigen Formel (I) erkennen kann, handelt es sich bei dem Östradiolderivat um eine Art Doppelester, worin eine Benzoylgruppe an die OH-Gruppe der 3-Position des Östradiols und Chlorambucil (bekannt als Anti­ krebsmittel) über eine Verbindungsgruppe gewisser Länge an die OH-Gruppe der 17-Position des Östradiols gebunden sind.

Zur Bestimmung seines LD₅₀-Werts wurde das Östradiolderivat oral an Ratten verabreicht, wobei festgestellt wurde, daß sogar bei der maximal verabreichbaren Dosis von 6000 mg/kg kein Todesfall eintritt. Der akute orale LD₅₀-Wert von Chlorambucil beträgt jedoch bei männlichen Ratten 98 mg/kg und bei weiblichen Ratten 76 mg/kg. Aus diesem Vergleich ist festzustellen, daß es sich bei der ver­ wendeten Substanz um eine sehr sichere Substanz handelt.

Das Verfahren zur Herstellung der verwendeten Substanz und die Einzelheiten ihrer akuten Toxizität sind in der GB-OS 20 28 335 beschrieben.

Bei der erfindungsgemäß verwendeten Substanz handelt es sich um 3-Benzoylo­ xy-1,3,5(10)-östratrien-17-[4-(p-(bis(2-chlorethyl)-amino)-phenyl)-b-utanoylo­ xy]-acetat, die auch als Östra-1,3,5(10)-trien-3,17-diol-3-benzoat-17-[4-{-(bis(2- chlorethyl)-amino)-phenyl}-1-oxobutoxy]-acetat bezeichnet werden kann, der folgenden Formel (I):

Das in dem verwendeten Östradiolderivat enthaltene Östradiol kann 17β-Östra­ diol, 17α-Östradiol oder eine Mischung daraus sein, wobei jedoch ein Östradiol­ derivat auf der Grundlage von 17β-Östradiol bevorzugt ist.

Toxische Erscheinungen der verwendeten Substanz werden durch eine sehr kleine Menge Östradiol hervorgerufen, das als Metabolit in der verwendeten Substanz vorhanden ist und einen gewissen Einfluß auf die Genitalorgane, die Ver­ minderung der Schwangerschaftsrate und Aborte ausübt.

Man hat weiterhin festgestellt, daß das Chlorambucil, welches ebenfalls ein Metabolit der vorliegenden Erfindung ist, bei hohen Dosen der vorliegenden Substanz eine Verminderung der Lymphozytenzahl bewirkt. Jedoch sind die typischen toxischen Erscheinungen von Chlorambucil, wie die Hy­ poplasie (Unterentwicklung) des Knochenmarks, hepatitische Störungen, Entstehung von Mißgeburten, Mutagenese und der­ gleichen, bei Tieren, denen die vorliegende Substanz verab­ reicht wurde, nicht beobachtet worden.

Obwohl andererseits Chlorambucil zu krebsartiger Entartung des Lymphoms, der Lunge, der Haut und dergleichen, neigt, ist bei Ratten, denen für eine lange Zeit die vorliegende Substanz verabreicht worden ist, kein bedeutsamer Anstieg der Krebsneigungsrate beobachtet worden.

Bei der erfindungsgemäß verwendeten Substanz handelt es sich um einen außergewöhnlich einzigartigen Immunsuppressor, der die Immun­ reaktion gegenüber einem Isoantigen spezifisch unterdrückt, während nicht-spezifische Immunreaktionen unbeeinflußt bleiben.

Die nicht-spezifischen Immunreaktionen wurden anhand der PHA-Reaktion untersucht, während die spezifische Immunreaktion gegenüber einem Isoantigen mit Hilfe der MLC-(gemischte Lymphozytenkultur)-Reaktion untersucht wurde.

Die verwendete Substanz wird als Arzneimittel in verschiedenen Verarbeitungsformen dargereicht, z. B. als Tablette, Granula, Pulver, Kapsel und dergleichen, für die orale Ver­ abreichung, wobei die Zusammensetzung ein Bindemittel, eine Trägersubstanz, ein Einhüllmittel, ein Schmiermittel, ein oberflächenaktives Mittel und einen Desintegrator enthalten kann. Die flüssige medizinische Zusammensetzung für die orale Verabreichung der verwendeten Substanz kann in Form einer wäßrigen oder öligen Suspension, einer Lösung, eines Sirups oder einer Schüttelmixtur vorliegen. Bei den Suppositorien kann eine in Öl lösliche oder hydrophile Base mit einem Stabilisator, einem Zersetzungsmittel, einem Pig­ ment und dergleichen, kombiniert werden. Zu Injektionsflüssigkeiten können ein Lösungsvermittler, ein Nährstoff, ein Stabilisator, ein oberflächenaktives Mittel und dergleichen, zugemischt werden. Die vorliegende Substanz ist in der verkapselten Form im Hinblick auf die Stabilität und der bequemsten Darreichungsform bevorzugt.

Als Beispiele dieser Trägersubstanzen können die folgenden Substanzen erwähnt werden: Lactose, Saccharose, Sorbit, Mannit, Kartoffelstärke, Getreidestärke, insbesondere Mais­ stärke, Amylopectin, verschiedene andere Stärken, kristalline Cellulose, Cellulosederivate (z. B. Carboxymethylcel­ lulose und Methylcellulose), Gelatine, Magnesiumstearat, Polyvinylalkohol, Natriumalginat, Calciumstearat, Polyethy­ lenglykol, Polypropylenglykol, Wachs, Gummi arabicum, Talk, Titandioxid, leichtes Siliciumanhydrid, pflanzliches Öl, wie Olivenöl, Erdnußöl, Sesamöl, und dergleichen, Paraffin­ öl, Kakaobutter, Alkohole (z. B. Ethanol und Benzylalkohol), physiologische Salzlösung, sterilisiertes Wasser, Glycerin, Vaseline, Polysorbat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid und dergleichen.

Die fertige medizinische Zusammensetzung wird in ver­ schiedenartiger Darreichungsform, wie oral, percutan, in­ tramuskulär, intraperitoneal, intravenöse, intrarektal, und örtlich verabreicht.

Obwohl die Dosis der vorliegenden Substanz jeweils vom Ver­ abreichungsmodus und dem Ausmaß der Behandlung abhängt, beträgt bei der oralen Verabreichung die tägliche Dosis für Erwachsene etwa 0,1 mg/kg bis 50 mg/kg, vorzugsweise 0,5 mg/kg bis 18 mg/kg.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand der Beispiele erläutert. Sofern nichts anderes angegeben ist, wird als vorliegende Substanz 3-Benzoyloxy-1,3,5(10)-östratrien-17β-[4-{p- (bis(2-chlorethyl)-amino)-phenyl}-butanoyloxy]-acetat ver­ wendet.

Beispiel 1 Untersuchung der Immunreaktion der vorliegenden Substanz in vitro (1) PHA-Reaktion

Man führt die PHA-Reaktion durch, um den Einfluß der vor­ liegenden Substanz auf die Bildungsreaktion kernhaltiger Erythrozyten aus Lymphozyten durch PHA (Phytohämagglutinin), das als Faktor für die Bildung nicht-spezifischer kernhaltiger Erythrozyten verantwortlich ist, zu untersuchen.

Dazu trennt man Humanlymphozyten nach einer speziellen Aus­ fällungsmethode unter Verwendung einer Schwerkraftzentrifuge und dergleichen aus peripherem Blut und wäscht diese dreimal mit einer Phosphorpufferlösung. Aus den abgetrennten Lymphozyten bereitet man unter Verwendung von RPMI 1640 eine Suspension, die 5×10⁵ Lymphozyten/ml enthält (diese Methode wurde im Rosewell Park Memorial Institute entwickelt und ist in J.A.M.A. 199 (1967) 519, beschrieben).

Nachdem man jeweils 200 µl der in der Weise hergestellten Lymphozytsuspension auf Teströhrchen verteilt hat, fügt man ebenfalls PHA und die in DMSO gelöste vorliegende Substanz in den in Tabelle 1 gezeigten Konzentrationen jeweils in die einzelnen Teströhrchen.

Man kultiviert dann, die in dieser Weise behandelten Lympho­ zyten während 3 d in einem Kohlendioxid-Kulturkasten (der bei einer Temperatur von 37°C gehalten wird und eine Mischung aus 5% CO₂ und 95% Luft enthält).

Man fügt dann in jedes Teströhrchen ³H-Thymidin hinzu, so daß eine Endkonzentration von 3,7 · 10⁴ Bq/ml erreicht wird. Nach­ dem man die Lymphozyten weitere 24 h kultiviert hat, sammelt man die Zellen, die das ³H-Thymidin aufgenommen haben, auf einem Glasfaserfilter mit einer automatischen Zellsammelvorrichtung und mißt die Radioaktivität der gesammelten Lymphozyten. Die Ergebnisse sind der Tabelle 1 zu entnehmen.

(2) Reaktion gemischter Lymphozytenkulturen (MLC)

Man unterwirft eine flüssige Suspension aus den gesamten Lymphozyten, die man aus dem Blut einer Person (A) entnommen hat, einer Strahlungsbehandlung und verdünnt die Flüssigkeit mit RPMI 1640, bis die Lösung 5×10⁵ Zellen/ml enthält und bezeichnet diese als A.

Daneben verdünnt man eine flüssige Suspension aus den Ge­ samtlymphozyten, die man aus dem Blut einer anderen Person (B) entnommen hat, mit RPMI 1640, bis die Flüssigkeit 5×10⁵ Zellen/ml enthält und nennt diese B.

Man verteilt jeweils 100 µl der Suspensionsflüssigkeiten A und B auf die Teströhrchen. Nachdem man eine Lösung der vorliegenden Substanz in DMSO in einer in Tabelle 1 gezeigten Konzentration in jedes der Teströhrchen hinzugefügt hat, inkubiert man die Lymphozyten in jedem Teströhrchen während 7 Tage in einer Kohlenstoffdioxidatmosphäre. Man fügt dann ³H-Thymidin in einer Menge von 9,25 · 10³ Bq etwa 12 bis 16 h vor der Ernte der Zellen in jedes Teströhr­ chen.

Man sammelt die kultivierten Lymphozyten auf Glasfaserfil­ tern unter Verwendung einer Zellsammelvorrichtung und mißt die Radioaktivität der Lymphozyten. Die Ergebnisse sind aus Tabelle 1 zu entnehmen.

Tabelle 1

Wirkung der vorliegenden Substanz auf PHA- und MLC-Reaktionen

Bei der PHA-Reaktion ist zwischen der Kontrolle und der je­ weiligen Konzentration (25, 50, 100 und 200 µg/ml) der vor­ liegenden Substanz kein großer Unterschied bezüglich der Menge des ³H-Thymidins, das von den Lymphozyten aufgenommen worden ist, zu erkennen (es ist davon auszugehen, daß kein bedeutsamer Unterschied vorliegt, wenn die Prozentwerte nicht weniger als 50 betragen). Bei der MLC-Reakion jedoch ist eine bedeutsame Verminderung der Menge des von den Lymphozyten aufgenommenen ³H-Thymidins bei jeder einge­ setzten Konzentration der vorliegenden Substanz zu erkennen.

Aus diesen Versuchsergebnissen ist zu entnehmen, daß die vorliegende Substanz eine starke unterdrückende selektive Wirkung auf die Reaktion besitzt, die spezifisch gegenüber Isoantigenen ist. Aus dieser Tatsache läßt sich außerdem ableiten, daß die vorliegende Substanz eine besondere nütz­ liche Wirkung entfaltet, wenn Isoantigene zu einem Problem werden, was bei der Unterdrückung von Immunreaktionen, beispielsweise bei Organtransplantationen, der Fall ist.

Beispiel 2 Knochenmarktransplantation bei Mäusen

Bei diesem Experiment wird die Wirkung der vorliegenden Substanz auf die Reaktion gegenüber dem Isoantigen unter­ sucht.

Man sammelt in RPMI 1640 mit 10% FBS die Knochenmarkzellen und Milzzellen aus einer männlichen C3H/He-Maus, die ein Alter von 10 Wochen und ein Körpergewicht von 25 bis 30 g aufweist. Man vermischt die Knochenmarkzellen und die Milz­ zellen im Verhältnis von 1 : 1 und stellt eine flüssige Zell­ suspension mit einer Konzentration von 8×10⁶ Zellen/ml her.

Man setzt nebenher eine Gruppe von männlichen B6C3F₁-Mäusen, die ein Alter von 10 Wochen und ein Körpergewicht von 23 bis 29 g aufweisen, in Gruppen zu sechs Mäusen einer Strahlung von 9 Gy aus und verabreicht jeder bestrahlten Maus die vermischte flüssige Suspension in die Kaudalvene der Maus in einer Dosis von 0,5 ml pro Maus.

Nachdem man die vorliegende Substanz in einer 0,5%igen Suspension aus Methylcellulose in einer wäßrigen physiologischen Kochsalzlösung dispergiert hat, wird die fertige Suspension jeder geimpften Maus in einer Dosis von 0 und 2 mg/kg · d oral verabreicht, wobei man damit einen Tag vor der Impfung beginnt und an jedem weiteren Tag verabreicht.

Die in dieser Weise behandelten Mäuse werden im Hinblick auf die lebensverlängernde Wirkung untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgezeigt.

Tabelle 2

Lebensverlängernde Wirkung der vorliegenden Substanz bei Mäusen, die einer Strahlung ausgesetzt wurden und ein Kno­ chenmarkzellentransplantat empfangen haben

Wie aus Tabelle 2 zu erkennen ist, hat man im Fall, daß die vorliegende Substanz in einer Dosis von 2 mg/kg verabreicht wird, eine mittlere Lebensverlängerung von mehr als 27 d beobachtet, was im Gegensatz zu nur 8 d im Fall der Kontrolle steht, womit die lebensverlängernde Wirkung der vorliegenden Substanz eindeutig belegt ist.

Beispiel 3 Herstellung der medizinischen Zusammensetzung (Rezeptur 1)

Die folgenden Bestandteile werden gut vermischt und pulverisiert, wonach die pulverisierte Zusammensetzung in Tabletten von 10 mm Durchmesser verdichtet wird.
Bestandteile und Gewichtsteile der Zusammensetzung:

Vorliegende Substanz
40 Gew.-Teile
Mannit	35 Gew.-Teile
Sorbit	25 Gew.-Teile
Carboxymethylcellulose	5 Gew.-Teile
Magnesiumstearat	5 Gew.-Teile
Talk	40 Gew.-Teile

(Rezeptur 2)

Die folgenden Bestandteile werden gut vermischt, wonach die Zusammensetzung in Kapseln Nr. 2 gemäß der japanischen Pharmacopö gefüllt werden, die vorher mit Titanoxid angefärbt worden sind, wobei man sich der Methode für die Herstellung von hartverkapselten Arz­ neimitteln nach den allgemeinen Vorschriften über medizinische Präparationen der japanischen Pharmacopö be­ dient und somit das hartverkapselte Arzneimittel herstellt.
Bestandteile und Gewichtsteile der Zusammensetzung:

Vorliegende Substanz
50 Gew.-Teile
Kartoffelstärke	angemessene Menge
Maisstärke	23 Gew.-Teile
Kristalline Cellulose	46,5 Gew.-Teile
Siliciumdioxid geringer Dichte	5,5 Gew.-Teile
Talk	18 Gew.-Teile

Claims (3)

1. Verwendung eines Östradiolderivats der allgemeinen Formel (I) zur Prophylaxe und Behandlung von Krankheiten, die sich aus Immunreaktionen ergeben.

2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Östradi­ olderivat 3-Benzoyloxy-1,3,5(10)-östratrien-17β-[4-{p-(bis(2-chlorethyl)amino)- phenyl}-butanoyloxy]-acetat eingesetzt wird.

3. Verwendung der Östradiolderivate nach den Ansprüchen 1 und 2 in Form einer in Kapseln vorliegenden pharmazeutischen Zusammensetzung, die im wesent­ lichen aus 50 Gew.-Teilen des Östradiolderivats der Formel (I) 23 Gew.-Teilen Maisstärke,
46,5 Gew.-Teilen kristalliner Cellulose,
 5,5 Gew.-Teilen Siliciumdioxid geringer Dichte und
18 Gew.-Teilen Talk
besteht.