NL8702598A - Immunoregulator die een estradiolderivaat bevat. - Google Patents

Description

873071/vdKl/MW λ -1-

Korte aanduiding:

Immunoregulator die een estradiolderivaat bevat.

De uitvinding heeft betrekking op een immuno-regulator die een estradiolderivaat bevat, die wordt weergegeven met de algemene formule 1 van het formuleblad.

5 De immunoregulator volgens de onderhavige uitvinding bezit een kleine invloed op de niet-specifieke immunoreacties en is in het bijzonder werkzaam voor de immunoreactie tegen een iso-antilichaam.

De immuno-onderdrukker zoals cyclofosfamide, 10 azathiopurine, prednisolon, cyclosporine A, enz., die tot nu toe is toegepast als immunoregulator voor het. onderdrukken van de afstotingsreactie tegen een vreemd lichaam,de zogenoemde immuno-afstoting, wat een probleem is in een orgaantransplantatie, onderdrukt eveneens de niet-speci-15 fieke immunoreactie die geen verband bezit met de immuno-afstoting. Het bezit derhalve een krachtig neveneffect doordat het immunologische vermogen van een patiënt is verminderd en een ernstige infectieziekte wordt veroorzaakt, en verschillende beperkingen aanwezig zijn bij het 20 klinische gebruik daarvan. De ontwikkeling van een stof die de immunoreactie tegen een iso-antilichaam dat de immuno-afstoting regelt, wat een probleem vormt in een orgaantransplantatie, onderdrukt is derhalve gewenst.

Als resultaat van onderzoekingen voor het 25 verkrijgen van een immunoregulator die de immunoreactie niet onnodig onderdrukt, de immunoreacties in de vereiste mate op specifieke wijze onderdrukt, een geringe giftigheid bezit en een uitstekend effect bezit, is gevonden dat een immunoregulator die het derivaat van estradiol 30 met de eerder vermelde formule 1 van het formuleblad bevat, doelmatig is voor het bovenstaande oogmerk, en de onderhavige uitvinding heeft derhalve hierop betrekking.

Het oogmerk van de onderhavige uitvinding is het verschaffen van een immunoregulator die het derivaat 35 van estradiol bevat, dat wordt weergegeven met de formule 8702598 s -2- 1 van het formuleblad.

Voorts beoogt de onderhavige uitvinding een immunoregulator te verschaffen die een gering neveneffect bezit en bijzonder doelmatig is.

5 Eveneens beoogt de onderhavige uitvinding een immunoregulator te verschaffen die niet op niet-speci-fieke wijze de immuniteit regelt, doch specifiek werkzaam is voor de immunoreactie tegen een iso-antilichaam.

Tevens beoogt de uitvinding een geneesmiddel 10 te verschaffen dat doelmatig is in ent versus afstotings-ziekte (graft versus host) na een beenmergtransplantatie, bij het onderdrukken van'de immuno-afstoting in de transplantatie-operatie van beenmerg, nier, huid, hart, enz., en bij de behandeling van verschillende nieraandoe-15 ningen, schildklieraandoeningen, chronische articulaire rheuma, thrombocytopenie, systemische lupus erythematosus, ernstige myasthenie, hepatische aandoeningen, autoimmuun-aandoeningen, polymyositis, enz.

De uitvinding heeft betrekking op het gebruik 20 van het derivaat van estradiol met de algemene formule 1 van het formuleblad als immunoregulator.

Zoals blijkt uit formule 1 is het derivaat van estradiol een dubbele ester waarin een benzoylgroep is gebonden aan de OH-groep op plaats 3 van estradiol 25 en een chloorambucil (bekend als kankerwerend geneesmiddel) aan de OH-groep op plaats 17 van estradiol via een bindingsgroep met bepaalde lengte.

Om de LD^q waarde daarvan te bepalen is het derivaat van estradiol (hierna aangeduid als de stof vol-30 gens de uitvinding) oraal toegediend aan ratten, doch zelfs bij de maximaal toe te dienen dosis van 6000 mg/kg werd geen dood waargenomen. Anderzijds is de acute orale LD5q waarde van chloorambucil bij mannelijke ratten 98 mg/kg en bij vrouwelijke ratten 76 mg/kg. Het zal derhalve dui-35 delijk zijn hoe veilig de stof volgens de uitvinding is.

De stof volgens de uitvinding is 3-benzoyloxy-1,3,5(10)-estratrieen-17-[4-£p-(bis (2-chloorethyl)amino)feny]| butanoyloxy]acetaat, weergegeven met de algemene formule 1 van het formuleblad.

870 2 59 8 *- ♦ -3-

De onderhavige stof kan eveneens worden aangeduid als estra-1,3,5(10)-trieen~3,17-diol,3-benzoaat, 17-[4-{4-(bis(2-chloorethyl)amino)fenyl| -1-oxobutoxy]acetaat.

Bovendien kan het estradiol estradiol-17/3, 5 estradiol-lTX of een mengsel daarvan zijn, waarbij echter de onderhavige stof waarbij estradiol-17/ï is toegepast de voorkeur verdient.

De in de onderhavige uitvinding vermelde immu-noregulator betekent het geneesmiddel dat een immunoregu-10 lerende werkzaamheid en gelijktijdig eveneens een immuno-onderdrukkende werkzaamheid bezit. De onderhavige stof is derhalve doelmatig ter voorkoming en behandeling van verschillende aandoeningen die hun oorsprong vinden in de immunoreactie. De onderhavige stof wordt bijvoorbeeld 15 toegepast ter behandeling van de volgende aandoeningen zoals immuno-afstoting bij de transplantatie van beenmerg, nier, huid, hart, enz., verschillende nierziekten, schild-klieraandoeningen, chronische articulaire rheuma, throm-bocytpenie,systemische plaatselijke erythematosus, ernstige 20 myasthenie, hepatische aandoeningen, autoimmuun ziekten, polymyositis, enz.

Het belangrijke verschijnsel van de giftigheid van de onderhavige stof is te wijten aan de aanwezigheid van een geringe hoeveelheid estradiol, dat een meta-25 boliet van de onderhavige stof is en een zekere invloed bezit op de geslachtsorganen, de vermindering van de mate van vruchtbaarheid en abortus»

Voorts is, als werking van chloorambucil dat eveneens een metaboliet van de onderhavige stof is, de 30 vermindering van een aantal lymfocyten waargenomen bij een hoge dosering van de onderhavige stof, waarbij echter de kenmerkende giftigheid van chloorambucil zoals hypo-plasie van beenmerg, hepatisch gebrek, teratogenese, muta-genese, enz. niet waargenomen bij dieren waaraan de onder-35 havige stof is toegediend.

Anderzijds is, hoewel chloorambucil kankerverwekkend is voor lymfoom, longkanker, huidkanker, enz., wanneer de onderhavige stof gedurende lange tijd wordt toegediend aan ratten^ geen duidelijke toename van 8702 59 8

J

* -4- de snelheid van carcinogenese waargenomen.

De onderhavige stof is een bijzonder unieke immuno-onderdrukker die selectief de immunoreactie onderdrukt die specifiek is voor een iso-antigeen in verge-5 lijking met de invloed op de niet-specifieke immunoreac-ties.

De niet-specifieke immunoreacties werden onderzocht met de PHA reactie en de specifieke immunoreactie voor een antigeen werd onderzocht met de MLC (gemengde 10 lymfocyte kweek)-reactie.

De onderhavige stof wordt aangebogen in de vorm van een eenheidstoedieningsvorm als geneesmiddel, bijvoorbeeld tablet, korrel, poeder, capsule enz. voor orale toediening en de geneeskundige samenstelling kan 15 een bindmiddel,een excipiens,een verzachtingsmiddel,een smeermiddel, een oppervlakte-actief middel en een het uiteenval len-bevorder end middel bevatten. De vloeibare geneeskundige samenstelling voor orale toediening van de onderhavige stof kan aanwezig zijn in de vorm van een wa-20 terige of olie-achtige suspensie, een oplossing, een siroop of een schudmengsel. In het geval van een supposito-rium kan een oleofiel of hydrofiel basismateriaal worden gemengd met een stabilisator, een desintegratiemiddel, een pigment, enz. In de injectievloeistof kan een solubi-25 lisator, een voedingsmiddel, een stabilisator, een oppervlakte-actief middel, enz. worden bijgemengd. In verband met de lichtstabiliteit en het gemak van het innemen verdient de onderhavige stof in de vorm van een capsule de voorkeur.

30 Als voorbeeld van deze dragers kunnen de vol gende stoffen worden genoemd: lactose, saccharose, sorbitol, mannitol, aardappelzetmeel, maïszetmeel, amylopectine, andere verschillende zetmelen, kristallijne cellulose, 35 derivaten van cellulose (bijvoorbeeld carboxy- methylcellulose en methylcellulose), gelatine, magnesiumstearaat, polyvinylalcohol, natrium-alginaat, calciumstearaat, polyethyleenglycol, propyleenglycol, was, arabische gom, talk, 870 2 59 8 * * -5- titaandioxyde, lichte kiezelzuuranhydride, plantaardige olie zoals olijfolie, arachideolie, sesamolie, enz., paraffine-olie, cacaoboter, alcoholen (bijvoorbeeld, ethanol en benzylalcohol}, 5 fysiologische zoutoplossing, gesteriliseerd water, glycerol, vaseline, polysorbaat, natrium-chloride, kaliumchloride, enz.

De bereide geneeskrachtige samenstelling wordt toegediend op verschillende wijzen zoals oraal, percutaan, 10 intramusculair, intraperitoneaal, intraveneus, intrarec-taal en plaatselijk.

Hoewel de dosering van de onderhavige stof afhangt van de wijze van toediening en de omvang van de behandeling, bedraagt de dagelijkse dosering in het 15 gevaal van orale toediening voor een volwassene ongeveer 0,1 mg/kg tot 50 mg/kg, bij voorkeur 0,5 mg/kg tot 18 mg/kg.

De onderhavige uitvinding zal nader worden toegelicht aan de hand van de volgende niet-beperkende 20 voorbeelden, en voor zover niet anders is vermeld werd 3-benzoyloxy-l,3,5(10)-estratrieen-17£-[4-^p-(bis(2-chloorethyl)amino)fenyl^-butanoloxy]acetaat toegepast als onderhavige stof.

Voorbeeld I.

25 Bestudering van een immunoreactie van de on derhavige stof in vitro.

(1) PHA reactie.

De PHA reactie werd uitgevoerd om de invloed van de onderhavige stof te onderzoeken op de blaasvor-30 mingsreactie van het lymfocyt door PHA (fytohemaglutine) wat de factor is die de niet-specifieke blaasvorming tot gevolg heeft.

Menselijke lymfocyten werden afgescheiden uit periferaal bloed door een soortelijk gewicht 35 centrifugale precipitatiemethode, enz. en 3 maal gewassen met een fosforzuur bufferoplossing. Met de afgeschei- 5 den lymfocyten werd een suspensie gevormd die 5 x 10 lymfocyten/ml bevat onder toepassing van RPMI 1640 (ontwikkeld door Rosewell Park Memorial Institute, zie J.A.

8702 59 8 s

V

-6- M.A., 199, 519 (1967)).

Na het toevoegen van 200 jul van de bereide suspensie van het lymfocyt in elk der proefbronnen werd

eveneens PHA en de onderhavige stof, opgelost in DMSO

5 in de in tabel A weergegeven concentratie in elk der proefbronnen gebracht.

Daarna werden de behandelde lymfocyten

3 dagen gekweekt in een kooldioxydekweekbox (op 37°C

gehouden,die een mengsel van 5% C00 en 95% lucht bevat).

3 Δ 10 Daarna werd H-thymidine toegevoegd aan elk der proefbronnen zodat de eindconcentratie daarvan 1 uci/ml werd, en na nogmaals 24 uren kweken van de lymfo- 3 cyten werden de cellen die H-thymidme hadden opgenomen verzameld op een glasvezelfilter met een autocel oogst-15 inrichting en de radio-activiteit van de verzamelde lymfocyten gemeten. De resultaten zijn weergegeven in tabel A.

(2) Gemengde lymfocytekweek (MLC) reactie.

Een suspensievloeistof van totale lymfocyten, 20 afgescheiden uit het bloed van één persoon (A) werd onderworpen aan een bestralingsbehandeling en de vloeistof verdund met RPMI 1640 zodat de vloeistof 5 x 105 cellen/-ml bevatte en werd aangeduid als A.

Daarnaast werd een suspensievloeistof van 25 totale lymfocyten, afgescheiden uit het bloed van een andere persoon (B) verdund met RPMI 1640 zodat de vloei- 5 stof 5 x 10 cellen/ml bevatte en werd aangeduid als B.

In elk der proefbronnen werd 100 yul van de 30 suspensievloeistoffen A en B gebracht en na het toevoegen van een oplossing van de onderhavige stof in DMSO in een concentratie die is weergegeven in tabel A in elk der proefbronnen werden de lymfocyten in elke bron 3 7 dagen in kooldioxyde geïncubeerd. H-thymidine werd 35 aan elk der proefbronnen toegevoegd in een hoeveelheid van 0,25 jaci voor ongeveer 12 tot 16 uren van het oogsten.

De gekweekte lymfocyten werden verzameld op glasvezelfliters met een celoogstinrichting en de radio- 87 0 2 59 8 „V.

3 -7- activiteit van de lymfocyten gemeten. De resultaten zijn weergegeven in tabel A.

Tabel A: Het effect van de stof volgens de uitvinding op PHA en MLC reacties.

5 _______________

Stof volgens de uitvinding PHA reactie MLC reactie (KM 2210) (ug/ml) (%)* (%)* 10 0 (controle) 100 100 25 59,9 7,3 50 87,3 10,2 100 75,7 7,2 200 66,4 2,2 15 ______;______

Opmerking: * A waarde van in de lymfocyten opgenomen 3 H-thymidine, weergegeven in %,waarbij de waarde van de controle op 100 is gesteld.

In de PHA reactie werd geen groot verschil 3 20 van de in het lymfocyte opgenomen hoeveelheid H-thymidme waargenomen tussen controle en elke concentratie (25, 50, 100 en 200 jug/ml) van de stof volgens de uitvinding (verondersteld wordt dat er geen duidelijk verschil is tenzij het percentage kleiner is dan 50). Anderzijds 25 werd in de MLC reactie de opmerkelijke vermindering van 3 de in de lymfocyten opgenomen hoeveelheid H-thymidme waargenomen bij elke concentratie van de stof volgens de uitvinding.

Dit feit suggereert dat de stof volgens de 30 uitvinding een sterke onderdrukkende werkzaamheid bezit die selectief is voor de reactie die specifiek is voor het isoantigeen. Men kan derhalve uit dit feit afleiden dat de onderhavige stof bijzonder nuttig is wanneer het isoantigeen een probleem vormt, dat wil zeggen bij het 35 onderdrukken van de immunoreactïe zoals in het geval van de transplantatie van organen.

Voorbeeld II.

Beenmergtransplantatie-experiment onder toepassing van een muis.

8 7 0 2;·. G

f

V

-8-

Het effect van de stof volgens de uitvinding bij de reactie van het isoantigeen werd onderzocht.

De beenmergcellen en miltcellen uit een mannelijke C3H/He muis (leeftijd 10 weken en lichaamsgewicht 5 25-30 g) werden verzameld in RPMI 1640 dat 10% FBS bevat te. De beenmergcellen en miltcellen werden met elkaar vermengd in de verhouding 1:1 en een vloeistofsuspensie van de cellen werd bereid in de concentratie van 8 x 10^ cellen/ml.

10 Daarnaast werd een groep mannelijke B6C3F^ muizen (leeftijd 10 weken, lichaamsgewicht 23-29 g, 6 muizen/groep) blootgesteld aan straling van 900 rad en op dezelfde dag werd de gemengde vloeistofsuspensie toegediend aan elk der bestraalde muizen in de staartader 15 van de muis in een dosering van 0,5 ml/muis.

Na het dispergeren van de stof volgens de uitvinding in een 0,5%'s suspensie van methylcellulose in een waterige fysiologische zoutoplossing werd de gevormde suspensie oraal toegediend aan elk der ingeente 20 muizen in een dosering van 0 en 2 mg/kg/dag, uitgaande van één dag vóór het inenten en elke dag daarna, en de behandelde muizen werden waargenomen op de verlenging van de levensduur. De resultaten zijn weergegeven in tabel B.

25 Tabel B: Levensduurverlenging van de stof volgens de uitvinding op de muis die is blootgesteld aan straling en was getransplanteerd met de beenmergcellen.

2Q Toegediende toegediende aantal dagen levensduur- stof hoeveelheid dieren verlenging (ge- (mg/kg/dag) (n) middelde waarde)

Controle 06 8 35 -----

Stof volgens de uitvinding 2 6 >27 670 2 59 8 -9- /

Zoals blijkt uit tabel B werd, in het geval van toediening de onderhavige stof in een dosering van 2 mg/kg, de gemiddelde levensduurverlenging van meer dan 27 dagen waargenomen in tegenstelling tot slechts 5 8 dagen in het geval van de controle en het levensduur verlengende effect van de onderhavige stof werd duidelijk waargenomen.

Voorbeeld III.

Bereiding van de geneeskundige samenstelling.

10 (Recept 1).

De volgende bestanddelen werden goed gemengd en verpoederd en de poedervormige samenstelling samengeperst tot tabletten met een diameter van 10 mm.

Recept van de samenstelling: 15 Stof volgens de uitvinding 40 gew.delen

Mannitol 35 gew.delen

Sorbitol 25 gew.delen

Carboxymethylcellulose 5 gew.delen

Magnesiumstearaat 5 gew.delen 20 Talk 40 gew.delen (Recept 2).

De volgende bestanddelen werden goed gemengd en de gemengde samenstelling gevuld in de capsules Nr.

2 van de Japanse Pharmacopeia die waren gekleurd met 25 titaanoxyde, volgens de uitvoeringsmethode ter vorming van hard, tot een capsule gevormd geneesmiddel volgens de algemene regel voor de geneesmiddelbereiding van de Japanse Pharmacopeia en werd het harde capsule-genees-middel bereid.

30 Recept van de samenstelling:

Stof volgens de uitvinding 50 gew.delen

Aardappelzetmeel geschikte hoe veelheid

Maïszetmeel 23 gew.delen 35 Kristallijne cellulose 46,5 gew.delen

Lage dichtheidskiezelzuuranhy- 5,5 gew.delen dride

Talk 18 gew. delen 8702 i'S δ

Claims (3)

1. Toepassing van een estradiolderivaat met de algemene formule 1 van het formuleblad voor het regu- 5 leren van de immunorespons van een patiënt.

2. Toepassing volgens conclusie 1, m e t het kenmerk, dat het estradiolderivaat 3-benzoyloxy-1,3,5(10)-estratrieen-17 β-[4-£p-(bis(2-chloorethy1)amino)-fenyl^butanoyloxy]acetaat is. 10

3. Farmaceutische samenstelling in de vorm van een capsule die voornamelijk bestaat uit: een estradiolderivaat met de formule 1 van het formuleblad: 50 gew.delen maïszetmeel 23 gew.delen 15 kristallijne cellulose 46,5 gew.delen lage dichtheidskiezelzuur- anhydride 5,5 gew.delen talk 18 gew.delen. 870 2 59 8 f * O-lctVO-icH^CH >-f\riCStC1 <1 > Aj vch2ch2ci 0 c=o 6 87 0 2 59 8