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Die vorliegende Erfindung betrifft
neue pharmazeutische Zusammensetzungen für die Verabreichung auf oralem
Wege.
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Heutzutage müssen zahlreiche Arzneimittel
parenteral verabreicht werden, entweder durch intramusculäre, subcutane
oder intravenöse
Injektion oder durch Verabreichung in Form einer Perfusion. Im Allgemeinen
ist ein solcher Verabreichungsweg erforderlich wegen:
- • einer
Instabilität
des aktiven Moleküls
unter den physikalisch-chemischen und biologischen Bedingungen des
Gastrointestinaltrakts (pH-Wert, Enzyme ...),
- • einer
Nichtdurchlässigkeit
der Gastrointestinalspenschicht für das aktive Molekül,
- • einer
Toxizität
oder einer zu starken Reizwirkung des aktiven Moleküls auf die
Gastrointestinal-Schleimhäute.
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Unter den Molekülen, die zur Kategorie der
Moleküle
gehören,
für die
eine parenterale Verabreichung obligatorisch ist, können beispielsweise
genannt werden:
- • die Peptide und Polypeptide,
insbesondere die Hormone, die durch die Gastrointestinalmedien zersetzt (abgebaut)
werden,
- • Heparin,
das die Sperrschicht nicht passiert,
- • zahlreiche
Zytostatika, die bekannt sind für
ihre Toxizität
und für
die Undurchlässigkeit
der Gastrointestinalspenschicht ihnen gegenüber.
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Andererseits werden andere Schleimhautgewebe,
die bevorzugte Stellen für
die Verabreichung von Arzneimitteln sein könnten, als solche nicht verwendet
wegen ihrer geringen Durchlässigkeit
für die
in Betracht gezogenen aktiven Moleküle. Dies erfordert gelegentlich
die Anwendung einer systemischen Verabreichung oder einer starken Überdosierung
des Wirkstoffes. In beiden Fällen
ist die zu verabreichende Dosis deutlich höher als die erforderliche Dosis,
was zahlreiche Nachteile mit sich bringt, sowohl in Bezug auf die
Kosten als auch in Bezug auf die Sicherheit des Arzneimittels.
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Darüber hinaus stellen die Akzeptanz
der Behandlung durch den Patienten sowie der Komfort für letzteren
mehr und mehr Parameter dar, die in Betracht gezogen werden müssen bei
der Entwicklung neuer Arzneimittel. Diesbezüglich stellt eine nicht-invasive
Verabreichung auf oralem Wege einen deutlichen Fortschritt in diesem
Sinne dar.
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Es wurden bereits mehrere Versuche
unternommen, um die Verabreichung von Arzneimitteln auf oralem Wege
zu erleichtern.
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Der klassischste Weg, den Wirkstoff
gegenüber
der Acidität
und der enzymatischen Wirkung, die im Magen anzutreffen sind, zu
schützen,
besteht darin, das aktive Molekül
in einer Tablette zu umhüllen,
deren äußerer dünner Überzug (Film)
beständig
gegenüber
einem solchen Medium ist. Im Allgemeinen löst sich die Umhüllung auf,
wenn sie neutralen pH-Bedingungen ausgesetzt wird, wie sie im Intestinum
anzutreffen sind, wodurch der Wirkstoff freigesetzt werden kann.
Diese Arbeitsweise ist wirksam für
Moleküle,
die entweder direkt in dem Intestinum ihre Wirkung entfalten oder
keine Schwierigkeiten haben, durch die intestinalen Schleimhäute hindurch
in den allgemeinen Kreislauf zu gelangen. Sie ist jedoch nicht wirksam,
um den transmembranen Transport zu begünstigen, der für bestimmte
Moleküle,
wie Heparin, erforderlich ist. Sie ist auch nicht anwendbar auf
Moleküle,
die gegenüber
den im Intestinum vorhandenen Enzymen (insbesondere Proteasen, welche
die Proteine zerstören)
empfindlich sind.
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Abgeleitet von dieser Technologie
erlauben Mikrokapseln, die von Polymeren umhüllt sind, außer dem Schutz
des Wirkstoffes seine kontrollierte oder verzögerte Freisetzung im Intestinum
und somit eine bessere Pharmakokinetik, die es beispielsweise ermöglicht,
die Nebenwirkungen des Produkts zu verringern. In dem Europäischen Patent
EP 0 709 087 der Firma Flamel
ist eine solche Erfindung beschrieben. Der Durchmesser der Teilchen
(in der Größenordnung
von einigen Hundert bis zu einigen Tausend μm) kann so modifiziert werden,
dass die Dicke der Umhüllung
Variationen in den kinetischen Freisetzungsprofilen erlaubt.
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Es wurden bereits zahlreiche Versuche
unter Anwendung verschiedener Technologien auf der Basis von Mikrovesikula
oder auf der Basis von Mikrokugeln oder Nanokugeln von Polymeren
durchgeführt,
um den Wirkstoff zu schützen,
aber auch um seinen Durchgang durch die Gastrointestinal-Membran
in den Kreislauf zu erleichtern. Diesbezüglich können genannt werden die Liposome
(siehe M. Ueno et al., "Chem.
Pharm. Bull." 30,
Seiten. 2245–2247,
1982), die verwendet werden, um den Durchgang von Heparin zu erleichtern, oder
die Nanokugeln aus Poly(alkylcyanoacrylaten), die verwendet werden
für die
orale Verabreichung von Insulin (C. Damgé et al., "J. Pharma. Sc.", 86, Seiten. 1403–1409, 1997). Auf der Basis
einer anderen Technologie wurden auch bereits Adjuvantien wie die
acetylierten Aminosäure-Derivate
oder Hydrogele verwendet, um die orale Verabreichung von Heparin
zu erleichtern (A. Leone-Bay et al., "J. Controlled Release", 50, Seiten 41–49, 1998)
bzw. (J. M. Dunn & A.
S. Hollister, "Cunent
Therap. Res.", 56,
Seiten 738–745,
1995).
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Unter den Vesikula, kugelförmigen Objekten,
die durch molekulare Anordnungen von amphiphilen Molekülen gebildet
werden, waren die multilamellaren Vesikula das Ziel wichtiger Forschungsarbeiten
und sie haben zu mehreren Anwendungen geführt. Beispielsweise können genannt
werden die Internationalen Patentanmeldungen WO 93/19735, WO 95/18601,
WO 97/00623, WO 98/02144, WO 99/16468. Solche Vesikula, die als
multilamellare Vesikula mit einer Zwiebel-Struktur in den oben genannten
Dokumenten bezeichnet werden, unterscheiden sich von Liposomen durch:
- • ihre
Art der Herstellung, bei der man von einer lamellaren Flüssigkristallphase,
d.h. einer Phase im thermodynamischen Gleichgewicht ausgeht, die
eine Längenausrichtung
aufweist,
- • ihre
innere lamellare Flüssigkristall-Struktur.
Diese Struktur entsteht durch Aufeinanderstapelung von konzentrischen
Doppelschichten aus amphiphilen Agentien, die mit Schichten aus
Wasser oder wässrigen
Lösungen
oder Lösungen
einer polaren Flüssigkeit
(z.B. Glycerin) vom Zentrum bis zur Peripherie dieser Vesikula abwechseln.
Vor ihrer Dispersion in einem Anwendungsmedium liegen diese Vesikula
in einem Zustand des thermodynamischen Gleichgewichts vor. Die spezifische
Struktur dieser Vesikula kann durch optische Mikroskopie, insbesondere
durch optische Mikroskopie im polarisierten Licht, leicht nachgewiesen werden,
- • die
vielfältige
Natur der amphiphilen Moleküle,
die allein oder im Gemisch zu ihrer Herstellung verwendet werden
können,
- • die
Medien, in denen sie dispergiert werden können, die sowohl hydrophil
als auch lipophil sein können
in Abhängigkeit
von der Formulierung.
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Die Größe dieser multilamellaren Vesikula
liegt im Mikrometer-Bereich, in der Regel beträgt sie 0,1 bis 20 μm im Durchmesser.
Ihre Verwendung für
die Verabreichung eines Arzneimittels auf oralem Wege wurde bisher
weder erläutert
noch dargestellt.
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Die Erfinder der vorliegenden Erfindung
haben jetzt gefunden, dass die Verabreichung von multilamellaren
Vesikula, deren spezifische Struktur vorstehend definiert worden
ist, auf oralem Wege erfolgen kann, die ein Molekül enthalten,
das bekannt dafür
ist, dass es auf diesem Wege nicht verabreicht werden kann entweder
aufgrund seiner Instabilität
oder aufgrund seines Unvermögens,
die gastrointestinale Sperrschicht zu überwinden, wenn sie nicht in
diesen multilamellaren Vesikula enthalten sind. Eine solche Einarbeitung
fördert
den Durchgang des Moleküls
durch die Gastrointestinalwand und erlaubt es, das Molekül im Blutkreislauf
nachzuweisen. Diese Entdeckung wurde gemacht aufgrund von Versuchen,
die mit Molekülen
sehr unterschiedlicher Natur und Charakteristik, wie z.B. Heparin
einerseits und Calcitonin andererseits durchgeführt wurden.
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Ein Vorteil der Erfindung besteht
darin, dass diese multilamellaren Vesikula aus biologisch kompatiblen
Bestandteilen hergestellt werden, die für ihre Unschädlichkeit
bekannt sind.
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Ein weiterer Vorteil der Erfindung
besteht darin, dass das Verfahren zur Herstellung der Vesikula auf einfache
Weise durchgeführt
wird und unter Verwendung nur solcher Apparaturen, die in der Chemie
gängig sind.
Darüber
hinaus verleiht der Umstand, dass das Verfahren Gebrauch macht von
einer lamellaren Phase, die anfänglich
im thermodynamischen Gleichgewicht vorliegt, ihm eine ausgezeichnete
Reproduzierbarkeit sowie eine große Stabilität der erhaltenen Vesikula.
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Gemäß einer ihrer wesentlichen
Charakteristika betrifft die vorliegende Erfindung somit die Verwendung
von multilamellaren Vesikula, die eine innere Flüssigkristall-Lamellenstruktur
aufweisen, die vom Zentrum bis zum Umfang (der Peripherie) der Vesikula
besteht aus übereinander
angeordneten konzentrischen Doppelschichten auf Basis von amphiphilen
Agentien, die mit Schichten aus Wasser, einer wässrigen Lösung oder einer Lösung einer
polaren Flüssigkeit
abwechseln und in deren Innern mindestens ein Wirkstoff enthalten
ist, für
die Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die für eine Verabreichung
auf oralem Wege bestimmt ist.
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Unter dem Ausdruck "eingearbeitet", dessen Verwendung
hier bevorzugt ist gegenüber
dem Ausdruck "eingekapselt", ist zu verstehen,
dass der oder die Wirkstoffe einen integralen Bestandteil der aus
dem Vesikulum aufgebauten Einheit bildet (bilden). Man kann nämlich Moleküle des Wirkstoffes
in jeder beliebigen Schicht zwischen dem Zentrum und der Peripherie
des genannten Vesikulums antreffen.
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Der hier verwendete Ausdruck "Verabreichung auf
oralem Wege" wird
in seinem üblichen
Sinne verwendet und bedeutet, dass das Produkt durch den Mund in
den Organismus eingeführt
wird, im Gegensatz beispielsweise zu einer Art der Verabreichung
auf parenteralem Wege.
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Im Verlaufe von Versuchen, die von
den Erfindern durchgeführt
wurden, hat sich gezeigt, dass die Einarbeitung eines Wirkstoffes
in das Innere von Vesikula verschiedene Vorteile bietet, die bereits
weiter oben angegeben sind. Die Vesikula wirken insbesondere als
echte Vektoren (Träger)
des Wirkstoffes, welche seinen Durchgang durch die gastrointestinale
Sperrschicht erlauben und/oder ihn gegen Abbau, insbesondere gegen den
Abbau durch die in dem gastrointestinalen Medium vorhandenen Enzyme,
schützen.
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Die verwendeten Vesikula haben im
Allgemeinen Durchmesser zwischen 0,1 und 25 μm, vorzugsweise zwischen 0,2
und 15 μm.
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Insbesondere bestehen die erfindungsgemäß verwendeten
Vesikula vorzugsweise aus mehreren Schichten von amphiphilen Agentien,
die sich abwechseln mit Schichten aus einer wässrigen oder polaren Phase.
Die Dicke jeder dieser Schichten ist eine molekulare Dicke und liegt
in der Regel in der Größenordnung von
5 bis 10 nm. Wenn man etwa 10 bis zu einigen 100 derartiger Schichten übereinander
anordnet, erhält man
einen Durchmesser zwischen 0,1 und und einigen 10 μm. Dies wurde
auch experimentell festgestellt, wobei die Vesikula im optischen
Mikroskop (unter Verwendung von polarisiertem Licht, um einen besseren
Kontrast aufgrund ihrer Doppelbrechung zu erzielen) betrachtet werden,
entweder als nicht-aufgelöste
Punkte für die
kleineren unter ihnen, oder als doppelbrechende Kugeln für die größeren. Das
Profil der Teilchengrößenverteilung
kann mit Hilfe eines Laser-Granulometers
untersucht werden (bei dem die statische Diffusion eines Laserstrahls
ausgenutzt wird, die unter mehreren Winkeln analysiert wird). Man
erhält
allgemein ein Gauss'sches
Profil, das über
einem Wert zentriert ist, der zwischen 0,1 und 25 μm variiert,
was eine geringe Heterogenität
der Teilchengröße für eine gegebene
Formulierung unter den gegeben Herstellungsbedingungen anzeigt.
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Die Vesikula, in die der Wirkstoff
eingearbeitet ist, haben, wie weiter oben angegeben, eine multilamellare
Struktur, eine so genannte Zwiebel-Struktur, und sie bestehen von
ihrem Zentrum bis zu ihrer Peripherie (ihrem äußeren Umfang) aus einer Aufeinanderfolge
von lamellaren Schichten, die durch ein flüssiges Medium voneinander getrennt
sind. Diese Vesikula können
erhalten werden nach einem Verfahren, das umfasst die Herstellung
einer flüssigkristallinen
lamillaren Phase und ihre Umwandlung durch Anwendung einer Scherkraft.
Ein solches Verfahren ist insbesondere in dem Patent WO 93/19735,
abgeleitet von dem französischen Patent
FR 2 689 418, oder in dem Patent WO 95/18601, auf deren Inhalt hier
Bezug genommen wird, beschrieben.
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Nach dem französischen Patent FR 2 689 418
kann diese Umwandlung durchgeführt
werden in einer Stufe, in der eine homogene Scherwirkung auf die
Flüssigkristallphase
einwirkt, was zu Vesikula mit einer kontrollierten Größe führt, die
auch als Mikrokapseln bezeichnet werden. Durch Variieren der Formulierung
der flüssigkristallinen
lamellaren Phase, insbesondere der Art der in seiner Zusammensetzung
enthaltenen Tenside, kann die Umwandlung dieser flüssigkristallinen
Phase in Vesikula durch einfaches Einwirkenlassen einer mechanischen
Kraft, insbesondere beim Vermischen der Bestandteile, erhalten werden.
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Diese Vesikula weisen unter anderem
den Vorteil auf, dass sie nach einem besonders einfachen Verfahren
hergestellt werden können,
das die Verwendung einer großen
Vielzahl von Tensiden erlaubt.
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Ein weiterer Vorteil, der ebenfalls
im Wesentlichen verbunden ist mit dem angewendeten Verfahren zur Herstellung
der erfindungsgemäß verwendeten
Vesikula mit so genannter Zwiebel-Struktur, beruht darin, dass man
die Wirkstoffe und die Zusätze
vor der Bildung der Vesikula einarbeitet, wodurch es möglich ist,
eine ausgezeichnete Einkapselungsausbeute und damit eine verbesserte
Wirksamkeit und eine sehr hohe Wirtschaftlichkeit für kostspielige
Moleküle
zu erzielen.
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Solche Strukturen werden in vorteilhafter
Weise erhalten durch Einarbeitung mindestens eines Wirkstoffes in
eine flüssigkristalline
lamellare Phase, die mindestens ein Tensid enthält, und durch anschließende Umwandlung
dieser lamellaren flüssigkristallinen
Phase in eine dichte Phase von multilamellaren Vesikula geringer
Teilchengröße.
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Es ist wichtig darauf hinzuweisen,
dass durch diese Umwandlung die flüssigkristalline Symmetrie der Anfangsphase,
welche die multilamellaren Vesikula charakterisiert, nicht modifiziert
wird. Diese flüssigkristalline
Symmetrie zeigt sich in makroskopischen Beobachtungen, wie z.B.
der. Doppelbrechung im optischen Mikroskop oder in der Anwesenheit
von Beugungspeaks bei der Röntgenanalyse.
Es sei jedoch darauf hingewiesen, dass solche Beobachtungen erschwert
werden können
entweder durch den geringen Kontrast im optischen Mikroskop, der
mit einer sehr geringen Teilchengröße der Vesikula verbunden ist,
oder durch die Verdünnung
und somit durch die geringe Stärke
des Signals bei der Röntgenbeugung.
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Die erfindungsgemäß verwendeten Vesikula können somit
erhalten werden nach einem Verfahren, bei dem man eine lamellare
flüssigkristalline
Phase herstellt, die mindestens einen Wirkstoff enthält, und
die Umlagerung der genannten flüssigkristallinen
Phase in multilamellare Vesikula bewirkt durch Einwirkenlassen einer
Scherkraft oder einer mechanischen Kraft, die beispielsweise resultiert
aus dem Mischen der Bestandteile der genannten lamellaren flüssigkristallinen
Phase.
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Diese Scherkraft kann eine homogene
Scherkraft sein, was den Vorteil bietet, dass man Vesikula mit einer
vollständig
homogenen Teilchengröße erhält. Es kann
sich aber auch ein einfaches mechanisches Rühren als ausreichend erweisen
zur Herstellung der erfindungsgemäßen multilamellaren Vesikula.
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Die für die Herstellung der Vesikula
verwendeten amphiphilen Moleküle
werden, ohne dass dies ein zwingendes Erfordernis ist, unter den
Molekülen
ausgewählt,
die den Gegenstand einer Beschreibung in der Pharmcopöe (dem pharmazeutischen
Arzneibuch) sind oder bereits in Arzneimitteln verwendet worden
sind, die für
eine orale Verabreichung bestimmt sind. Diesbezüglich können, ohne dass die Erfindung
darauf beschränkt
ist und ohne dass die Produkte vorher zwingend in der Pharmazie
verwendet worden sind, solche aus der Gruppe genannt werden, die
besteht aus:
- – Glycerolipiden, insbesondere
Phospholipiden, die hygriert oder nicht-hydriert sind,
- – C6-C30-Fettsäuren, die
gesättigt
oder einfach oder mehrfach ungesättigt,
linear oder verzweigt, ethoxyliert oder nicht-ethoxyliert sind,
in Form der Säure
oder des Salzes eines Alkalimetalls, Erdalkalimetalls oder eines
Amins,
- – ethoxylierten
oder nicht-ethoxylierten Estern von Saccharose oder Sorbit oder
Mannit oder Glycerin oder Polyglycerin, die 2 bis 20 Glycerin- oder
Glycol-Einheiten der genannten Fettsäuren enthalten,
- – Mono-,
Di- oder Triglyceriden oder Mischungen von Glyceriden der oben genannten
Fettsäuren,
- – C6-C30-Fettalkoholen,
die gesättigt
oder einfach oder mehrfach ungesättigt,
linear oder verzweigt, ethoxyliert oder nicht-ethoxyliert sind,
- – Cholesterin
und seinen Derivaten, insbesondere geladenen oder neutralen Cholesterinestern
wie das Cholesterinsulfat,
- – anderen
Derivaten mit einem Sterin-Grundgerüst, insbesondere solche pflanzlichen
Ursprungs, wie Sitosterin oder Stigmasterin
- – ethoxylierten
oder nicht-ethoxylierten Ethern von Saccharose oder Sorbit oder
Mannit oder Gycerin oder Polyglycerin, die 2 bis 20 Glycerin- oder
Glycol-Einheiten enthalten, und den oben genannten Fettalkoholen,
- – pflanzlichen Ölen, die
polyethoxyliert, hydriert oder nicht hydriert sind,
- – Polymeren
mit Polyoxyethylen- und Polyoxypropylen-Sequenzen (Poloxamere),
- – Polyethylenglycolhydroxystearat,
- – Sphingolipiden
und Sphingosin-Derivaten,
- – Polyalkylglucosiden,
- – Ceramiden,
- – Copolymeren
von Polyethylenglycol und Allcylglycol, wie z.B. die Copolymeren
der Familie ELFACOS der Firma AKZO NOBEL,
- – Copolymeren
von Di- oder Tri-Block-Ethern von Polyethylenglycol und Polyalkylenglycol,
wie z.B. die Copolymeren aus der Familie der Produkte ARLACELL der
Firma ICI.
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Diese amphiphilen oder oberflächenaktiven
Agentien können
einzeln oder im Gemisch verwendet werden. Unter diesen amphiphilen
Agentien können
bestimmte unter ihnen allein eine lamellare flüssigkristalline Phase bilden
durch Mischen mit einem polaren Lösungsmittel. Andere werden
nur im Gemisch verwendet in einem geringeren Mengenanteil, um Eigenschaften
in Bezug auf Steifheit oder Dichtheit gegenüber der lamellaren flüssigkristallinen
Phase zu erzielen.
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In der Formulierung verwendet man
zweckmäßig eine
Mischung von oberflächenaktiven
Molekülen. Im
Allgemeinen werden mindestens zwei verschiedene Tenside mit unterschiedlichen
hydrophilen-lipophilen Gleichgewichten verwendet, wodurch es möglich ist,
die Eigenschaften der Doppelschichten kontinuierlich zu steuern
und damit das Auftreten einer Instabilität zu kontrollieren, welche
die Bildung von multilamellaren Vesikula beherrscht.
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Zweckmäßig wählt man dabei unter den oben
genannten Tensiden zwei Tenside aus, die verhältnismäßig verschiedene Eigenschaften
aufweisen, insbesondere ein unterschiedliches hydrophiles-lipophiles Gleichgewicht
(HLB) haben. Das erste Tensid weist zweckmäßig ein hydrophiles-lipophiles
Gleichgewicht zwischen 1 und 6, vorzugsweise zwischen 1 und 4 auf,
während
das zweite Tensid ein hydrophiles-lipophiles Gleichgewicht zwischen
3 und 15, vorzugsweise zwischen 5 und 15, aufweist.
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Ein weiterer Vorteil der erfindungsgemäß verwendeten
Vesikula besteht darin, dass man der Formulierung natürliche oder
künstliche
Polymere, z.B. amphiphile Polysaccharide (Alginate, Chitosan und
dgl.) zusetzen kann, um die Festigkeit des Vesikulums zu erhöhen und
ihm eine bessere Beständigkeit
gegen die physikalisch-chemischen
Beanspruchungen des Verabreichungsmediums (pH-Wert, mechanischer
Einfluss, osmotischer Druck...) zu verleihen. Diese Polymeren können sowohl
in das Vesikulum eingearbeitet werden als auch in Form einer Umhüllung auf
demselben abgeschieden werden. In diesem Fall hat das Vesikulum
oder das Teilchen, das durch mit einer Polymermatrix umhüllte Vesikula
gebildet worden ist, einen größeren Durchmesser
als die Vesikula allein. Diese Polymeren können gegebenenfalls vernetzt
werden, um ihre Festigkeit noch zu erhöhen.
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Die erfindungsgemäß verwendeten Vesikula haben
zweckmäßig einen
Durchmesser zwischen 0,1 und 25 μm,
vorzugsweise zwischen 0,2 und 15 μm.
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In den erfindungsgemäß verwendeten
Zusammensetzungen sind die Vesikula zweckmäßig im Innern eines pharmazeutisch
akzeptablen Mediums dispergiert, das im Allgemeinen aus Wasser oder
einem Puffer besteht, wobei dieses Medium identisch mit oder verschieden
ist von demjenigen, das sich zwischen den Lamellen der Vesikula
befindet.
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Die erfindungsgemäßen Vesikula können außerdem in
einem hydrophoben Medium dispergiert werden, beispielsweise in einem Öl, das für die pharmazeutische
Verwendung akzeptabel ist, beispielsweise in einem Pflanzenöl oder Mineralöl, in einem
synthetischen Fettsäureester
oder in Squalan oder Squalen. Dies kann den Vorteil haben, dass
die Anwesenheit von Wasser vermieden oder eingeschränkt wird
für den
Fall, dass ein Wirkstoff beispielsweise hydrolysierbar ist. Diese
Dispersion in Öl
kann selbst in einem wässrigen
Medium emulgiert werden, um eine angenehmer einzunehmende Formulierung
zu erhalten. Aufgrund der Anwesenheit der öligen Zwischenphase ist das
kontinuierliche äußere Medium,
beispielsweise das wässrige
Medium, getrennt von dem inneren Medium der Vesikula, wodurch ein
zusätzlicher
Schutz für
den in die Vesikula eingearbeiteten Wirkstoff gewährleistet
wird.
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Gemäß einem anderen ihrer Aspekte
betrifft die Erfindung außerdem
ein Verfahren zur Herstellung von Vesikula und Zusammensetzungen,
die erfindungsgemäß verwendet
werden.
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Das Herstellungsverfahren besteht
in einer ersten Stufe, in der man durch Mischen eine flüssigkristalline
lamellare Phase herstellt, welche die verschiedenen Bestandteile
enthält.
Diese erhält
man durch einfaches Mischen der Bestandteile in einer vom Experimentator
festgelegten Reihenfolge in Abhängigkeit
von den Mischbarkeiten jedes der Bestandteile. Es kann erforderlich
sein, bestimmte pastöse
oder feste Bestandteile zu erwärmen,
um ihre Einarbeitung zu erleichtern. In diesem Falle setzt man das
aktive Molekül
vorzugsweise am Ende der Mischung zu, um zu vermeiden, dass es einer
zu hohen Temperatur ausgesetzt wird, wenn es temperaturempfindlich
ist. Man kann auch eine Mischung aus allen Bestandteilen mit Ausnahme
des aktiven Moleküls
oder seiner wässrigen
Lösung
in Form einer "Vorrats"-Mischung herstellen,
die man bei Bedarf verwendet zur Herstellung der lamellaren Phase.
Die wässrige
Lösung
kann verschiedene Bestandteile enthalten, die dazu bestimmt sind,
ihre biologische Kompatibilität
zu gewährleisten,
und insbesondere kann sie Puffer-Mischungen aber auch mehrere synergistische
aktive Moleküle
enthalten. Die so hergestellte lamellare Phase wird anschließend einer
mäßigen Scherkraft
(von 0 bis 100 s–1) während einer begrenzten Zeitdauer
(0 bis 60 min) ausgesetzt.
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In der Mehrzahl der Fälle wird
diese Scherkraft direkt erhalten durch Einwirkung der Vorrichtung,
die zum Mischen verwendet wird.
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In einer dritten Stufe wird die einer
Scherkraft unterworfene lamellare Phase in einem Endmedium dispergiert,
im Allgemeinen in Wasser oder in einem Puffer, das identisch mit
oder verschieden ist von demjenigen, das für die Herstellung der lamellaren
Phase verwendet worden ist. Dieses Dispersionsmedium kann auch ein
nicht-wässriges
Medium sein, entweder ein polares Medium (Glycerin, Polyethylenglycol,
Alkylenglycol ...) oder ein hydrophobes Medium (Öle...). Diese Dispersion wird
im Allgemeinen bei Umgebungstemperatur (20 bis 25 °C) hergestellt
durch langsame Zugabe des Mediums zu der lamellaren Phase unter
konstantem Rühren.
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Dem Produkt können ein Konservierungsmittel
und gegebenenfalls weitere Zusätze,
die dazu bestimmt sind, die galenische Formulierung zu vervollständigen,
zugegeben werden.
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In den folgenden Beispielen werden
die Vorteile der Erfindung näher
erläutert
anhand des Nachweises des Übergangs
des vorher den erfindungsgemäßen Vesikula
einverleibten Heparins (Beispiel 1) in den Blutkreislauf, während dieses
Produkt in Form einer einfachen Lösung die gastrointestinale
Sperrschicht nicht überwindet,
und für
Calcitonin, das ebenfalls in erfindungsgemäße Vesikula eingearbeitet worden
ist, während das
gleiche Produkt, das nicht in Vesikula eingearbeitet ist, in dem
gastrointestinalen Medium instabil ist (vgl. Beispiel 2).
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Diese Beispiele werden erläutert durch
die 1 bis 4, was das Heparin angeht,
wobei die 1 bis 3 die Ergebnisse von Versuchen
wiedergeben, die mit Ratten durchgeführt wurden, und wobei die 4 die Ergebnisse von Versuchen
wiedergibt, die mit Hunden durchgeführt wurden, und die 5, in der die Ergebnisse
im Falle von Calcitonin (Versuche mit Ratten) angegeben sind.
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In den folgenden Beispielen sind
die für
die Bestandteile der verschiedenen Formulierungen angegebenen Mengen,
wenn nichts anderes angegeben ist, in Gew.-% angegeben.
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Beispiel 1: Vesikula,
die Heparin enthalten
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1.a Formulierung und Herstellung
von Vesikula, die Heparin enthalten
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Das in diesen Beispielen verwendete
Heparin ist ein nicht-fraktioniertes Heparin, das aus Intestinalschleimhäuten eines
Schweins (SIGMA H-9399, 188 USP-Einheiten/mg) extrahiert wurde.
Formulierung
A
| ➀ Ethoxylierter
Laurylalkohol (SEPPIC, Simulsol P4) | 4,0
% |
| ❸ Lanolincholesterin
(FLUKA): | 3,0
% |
| ➂ Steriles
entmineralisiertes Wasser | 10,0
% |
| ➃ Heparin
in einer Konzentration von 25 % in sterilem entmineralisiertem Wasser | 40,0
% |
| ➄ Sojalecithin
(NATTERMANN, Phospholipon 90): | 43,0
% |
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Arbeitsweise
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Die Bestandteile ➀, ➁ und ➂ werden
in eine sterile Tablettenflasche von 2 ml in einer beliebigen Reihenfolge
eingeführt,
dann bei Umgebungstemperatur mit Hilfe eines vorher mit der Flamme
sterilisierten Spatels gemischt. Die vollständige Auflösung des Bestandteils ➁ wird
durch Betrachten im Mikroskop überprüft. Anschließend führt man
den Bestandteil ➃ ein und homogenisiert mit dem Spatel,
dann gibt man den Bestandteile ➄ zu.
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Das Ganze wird mit dem Spatel homogenisiert,
dann eine Nacht lang bei Umgebungstemperatur stehen gelassen.
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Anschließend wird das Präparat in
einer Menge von 16,7 % in sterilem entmineralisiertem Wasser dispergiert.
Der Heparintiter der Dispersion der Vesikula beträgt somit
1,67 % (16,7 mg/ml).
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- Formulierung
B
| ➀ Ethoxylierter
Laurylalkohol (SEPPIC, Simulsol P4): | 4,8
% |
| ➁ Lanolincholesterin
(FLUKA): | 3,6
% |
| ➂ Sojalecithin
(NATTERMANN, Phospholipon 90): | 51,6
% |
| ➃ Lösung von
25 % Heparin in PBS × | 40,0
% |
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Arbeitsweise
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Die Bestandteile ➀, ➁ und ➂ werden
in eine sterile Pillenflasche von 2 ml eingeführt in einer beliebigen Reihenfolge,
dann werden sie in Dichlormethan aufgelöst. Das Lösungsmittel wird anschließend vollständig verdampft.
Bei Umgebungstemperatur gibt man den Bestandteil ➃ zu.
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Das Ganze wird mit Hilfe einer sterilen
Nadel homogenisiert, dann in einer Menge von 16,7 % in sterilem
PBS 1× dispergiert.
Der Heparintiter der Dispersion der Vesikula beträgt somit
1,67 % (16,7 mg/ml).
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- Formulierung
C
| ➀ Ethoxylierter
Laurylalkohol (SEPPIC, Simulsol P4): | 4,8
% |
| ➁ Lanolincholesterin
(FLUKA): | 3,6
% |
| ➂ Sojalecithin
(NATTERMANN, Phospholipon 90) | 51,6
% |
| ➃ Heparin
50 %ige Lösung
von Heparin in PBS 1× | 40,0
% |
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Arbeitsweise
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Die Bestandteile ➀, ➁ und ➂ werden
in eine sterile Pillenflasche von 2 ml eingeführt in einer beliebigen Reihenfolge,
dann werden sie in Dichlormethan aufgelöst. Das Lösungsmittel wird anschließend vollständig verdampft.
Dann gibt man bei Umgebungstemperatur den Bestandteil ➃ zu.
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Das Ganze wird mit Hilfe einer sterilen
Nadel homogenisiert, eine Nacht lang bei 4° stehen gelassen, dann in einer
Menge von 16,7 % in sterilem PBS 1× dispergiert. Der Heparintiter
der Dispersion für
die Vesikula beträgt
somit 3,34 % (33,4 mg/ml).
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1.b Physikalisch-chemische
Charakterisierung der Vesikula, die Heparin enthalten
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Die Vesikula werden einerseits durch
Bestimmung des granulometrischen Profils und andererseits durch
die Einkapselungsausbeute charakterisiert.
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Teilchengrößenprofil
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Das Profil der Teilchengröße wird
durch Lasergranulometrie unter Verwendung einer Mastersizer S-Apparatur der Firma
Malvern untersucht.
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Für
die Probe A zeigt das Teilchengrößenprofil
einen Hauptpeak, der um 0,34 μm
zentriert ist und sich von 50 nm bis 20 μm erstreckt mit einem sekundären Maximum
um 6 μm.
Etwa 60 Vol.-% der Probe haben eine Teilchengröße von weniger als 10 μm.
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Für
die Probe B zeigt das Teilchengrößenprofil
einen Hauptpeak, der um 0,32 μm
zentriert ist und sich von 50 nm bis 20 μm erstreckt mit einem sekundären Maximum
bei 3,5 μm.
Etwa 60 Vol. % der Probe haben eine Teilchengröße von kleiner als 10 μm.
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Für
die Probe C zeigt das Teilchengrößenprofil
einen einzigen Peak, der um 0,33 μm
zentriert ist und sich von 50 nm bis zu 3 μm erstreckt. Etwa 85 Vol. %
der Probe haben eine Teilchengröße von kleiner
als 1 μm.
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Die Analyse durch Laser-Diffusion
wird vervollständigt
durch eine Betrachtung im optischen Mikroskop im polarisierten Licht,
wodurch die Vesikula direkt sichtbar gemacht werden können. Die
Betrachtung zeigt für die
Proben A und B die Anwesenheit einer sehr großen Mehrheit von Objekten mit
einer Größe im Mikrometerbereich
und von einigen Objekten, die größer sind.
Man stellt außerdem
eine Tendenz zur Aggregation der Objekte untereinander fest, ohne
dass eine Tendenz zur Koaleszenz besteht.
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Ausbeute der Einarbeitung
in die Vesikula
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Die Einarbeitungsausbeute wird bestimmt
durch Trennen der Vesikula von ihrem Dispersionsmedium durch Zentrifugieren,
anschließendes
Analysieren der Heparin-Konzentration in der überstehenden Flüssigkeit.
Der Heparintiter wird bestimmt durch einen colorimetrischen Test
(SIGMA Heparine AccucolorTM CRS 106).
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Man erhält eine Ausbeute der Einarbeitung
von 47 ± 5
% für die
Formulierung A, dies bedeutet, dass etwa 50 % Heparin in der Probe
in das Innere der Vesikula dieser Formulierung A eingeführt worden
sind. Für die
Formulierungen B und C beträgt
die Einarbeitungsausbeute, die auf ähnliche Weise bestimmt wurde,
90 ± 5
%.
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1.e Untersuchung der Verabreichung
der Heparin enthaltenden Vesikula an Ratten Verabreichung
-
Die Untersuchung wurde mit Wistarratten
durchgeführt.
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Die Vesikula, die Heparin enthalten,
und eine negative Vergleichslösung
werden auf oralem Wege durch Füttern
des nicht-anästhesierten
Tieres unter Verwendung einer Intubationsnadel verabreicht.
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Ein positives Vergleichsmaterial
(eine wässrige
Heparin-Lösung)
wird auf subcutanem Wege injiziert.
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Die Tiere sind 24 h vor der Behandlung
nüchtern
(Wasserdiät).
Die Verabreichung erfolgt zum Zeitpunkt T0,
die Probenentnahmen finden statt zum Zeitpunkt T0 (vor
der Verabreichung), dann zu verschiedenen späteren Zeitpunkten wie in den
beiliegenden Figuren dargestellt.
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Die verabreichten Dosen und die Versuchsprotokolle
sind in der folgenden Tabelle für
jede Formulierung angegeben.
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Blutprobenentnahme
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Die Probenentnahmen werden durchgeführt durch
einen Schwanz-Einschnitt (Formulierung A) oder durch retro-orbitale
Probenentnahme (Formulierungen B und C). Es wird ein Blutvolumen
von 0,50 ml (Formulierung A) oder von 1 ml (Formulierungen B und
C) in einem Röhrchen
mit 3,8 % Natriumcitrat gewonnen.
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Das Plasma wird von dem Gesamtblut
durch Zentrifugieren bei 92 g für
10 min bei +4°C
unmittelbar nach der Entnahme abgetrennt. Das Plasma wird bis zur
Analyse durch sofortiges Einfrieren bei –18 °C nach der Abtrennung konserviert.
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Die quantitative Mengenbestimmung
des Heparins in dem Plasma der Ratte oder des Hundes wird unter
Anwendung eines colorimetrischen Verfahrens durchgeführt (SIGMA
Diagnostics® Heparin
AccucolorTM, Verfahren Nr. CRS 106). Man
stellt eine Eichkurve auf, um die erhaltenen Ergebnisse in optischer
Dichte bei 405 nm als Heparinämie
ausdrücken
zu können.
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Eichkurve
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Zur Herstellung von Heparinstandards
verwendet man einen Pool von Plasmata, die aus nüchternen Tieren auf die gleiche
Weise wie die zu testenden Proben entnommen worden sind. Man stellt
vier Heparinstandards mit einer Konzentration von 0; 0,226; 0,452
und 0,905 Einheiten/ml her.
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Man gibt die erhaltene Extinktion
bei 405 nm für
jeden Heparinstandard als Funktion der Heparin-Konzentration (Einheiten/ml) an. Der
Heparin-Gehalt einer Probe kann unter Verwendung dieser Standardkurve bestimmt
werden.
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Ergebnisse
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Die Ergebnisse sind in den 1 bis 3 dargestellt, in denen die Heparinämie (in
Einheiten/ml), normalisiert auf 0 zum Zeitpunkt T = 0, als Funktion
der Zeit aufgetragen sind.
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Formulierung A (1)
-
Man stellt fest, dass die durch orale
Verabreichung von Heparin, das den erfindungsgemäßen Vesikula einverleibt worden
ist, erhaltene Kurve ansteigt, um ein Maximum zu erreichen und anschließend wieder
abnimmt.
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Dieses Phänomen ist ähnlich demjenigen, das bei
der subcutanen Injektion einer Heparin-Lösung festzustellen ist, die
zum Vergleich angegeben ist. Dagegen zeigt die Verabreichung der
nicht-eingekapselten Heparin-Lösung
auf oralem Wege keinen signifikanten Effekt auf die Heparinämie der
Tiere.
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Formulierung B (2)
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Man stellt fest, dass die durch orale
Verabreichung von Heparin, das den erfindungsgemäßen Vesikula einverleibt worden
ist, erhaltene Kurve ansteigt, um ein Maximum etwa 1 h nach der
Entnahme zu erreichen, und anschließend wieder abfällt. Dieses
Phänomen
ist ähnlich,
jedoch viel ausgeprägter
als dasjenige, das bei der subcutanen Injektion der positiven Vergleichs-Heparin-Lösung, die
zum Vergleich angegeben ist, beobachtet wurde.
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Formulierung C (3)
-
Man stellt fest, dass in diesem Fall
eine langsamere Zunahme der durch orale Verabreichung von Heparin,
das den erfindungsgemäßen Vesikula
einverleibt worden ist, erhaltenen Kurve auftritt, deren Maximum 6
h nach der Entnahme noch nicht erreicht ist. Diese lange Aktivitätsdauer
ist bemerkenswert und deutlich besser als diejenige, die im Falle
der subcutanen Injektion festgestellt wird.
-
Darüber hinaus wird beim Vergleich
der für
die Dosen I und II erhaltenen beiden Kurven ein "Dosis-Effekt" festgestellt, wobei die durch die Dosis
II (18 600 USP-Einheiten/kg) erhaltene Heparinämie deutlich höher ist
als die entsprechende Heparinämie
bei der Dosis I (5460 USP-Einheiten/kg).
-
1.d Untersuchung
der Verabreichung von Heparin enthaltenden Vesikula an Hunde
-
Eine Untersuchung analog zu derjenigen
des vorhergehenden Beispiels wurde bei einem Hund mit der nachstehend
angegebenen Formulierung D durchgeführt: Formulierung
D
| ➀ Ethoxylierter
Laurylalkohol (SEPPIC, Simulsol P4): | 4,0
% |
| ➁ Lanolincholesterin
(FLUKA): | 3,0 |
| ➂ steriles
PBS 1× | 10,0 |
| ➃ 25
% Heparin in sterilem PBS 1× | 40,0
% |
| ➄ Sojalecithin
(NATTERMANN, Phospholipon 90): | 43,0
% |
-
Arbeitsweise
-
Die Bestandteile ➀, ➁ und ➂ werden
in eine sterile Pillenflasche von 2 ml in beliebiger Reihenfolge eingeführt, dann
mit einem Magnetrührer
2 h lang gemischt. Die vollständige
Auflösung
des Bestandteils (2) wird durch Betrachten im Mikroskop überprüft. Anschließend führt man
den Bestandteil ➃ ein und homogenisiert mit einem Spatel,
dann gibt man den Bestandteil ➄ zu.
-
Das Ganze wird mit dem Spatel homogenisiert,
dann über
Nacht bei 4°C
stehen gelassen.
-
Das Präparat wird anschließend in
einer Konzentration von 10 % in sterilem PBS 1× dispergiert, wobei man einen
Heparintiter der Dispersion von 10 mg/ml erhält.
-
Versuchsprotokoll
-
Die Hunde waren weibliche Beagle-Hunde
mit einem Gewicht von 10 bis 12 kg. Das Versuchsprotokoll war das
folgende:
- • verabreichtes
Volumen pro Speiseröhren-Sonde
3 ml/kg entsprechend bei den verwendeten Hunden einem Volumen von
30 ml, entsprechend einer Heparindosis in den Vesikula von 300 mg
(30 mg/kg), d.h. 56 400 USP-Einheit pro Hund (5 640 USP-Einheiten/kg),
- • die
Tiere sind 24 h vor der Behandlung nüchtern (Wasserdiät). Die
Verabreichung findet statt zum Zeitpunkt T0,
die Probenentnahmen werden durchgeführt im Bereich der Jugular-Vene
zum Zeitpunkt T0 (vor der Verabreichung),
T0 + 1 h, T0 + 2
h oder T0 + 3 h, T0 +
6 h,
- • negatives
Vergleichsmaterial: wässrige
Heparin-Lösung
mit einer Konzentration von 10 mg/ml; verabreichtes Volumen 30 ml
entsprechend 300 mg Heparin (30 mg/kg), entsprechend 56 400 USP-Einheiten pro
Hund (5 640 USP-Einheiten/kg),
- • positives
Vergleichsmaterial durch subcutane Injektion, Lösung mit einer Konzentration
von 10 mg/ml und Injektionsvolumen 0.2 ml/kg entsprechend bei den
verwendeten Hunden von 2 ml, dies entspricht einer Dosis von 20
mg Heparin (2 mg/kg), entsprechend 3800 USP-Einheiten pro Hund (380
USP-Einheiten/kg),
- • bei
der Untersuchung des Teilchengrößenprofils
der Vesikula durch Granulometrie tritt ein sekundäres Maximum
bei etwa 4,5 μm
auf, das stärker
ist als im Falle der Formulierungen A und B.
-
Ergebnisse
-
Die Ergebnisse sind wie im Falle
der Ratte in der 4 darstellt.
-
Man stellt fest, dass wie im Falle
der Ratte die bei dem Hund erhaltene Kurve, dem Heparin auf oralem Wege
in Vesikula verabreicht worden ist, unter ähnlichen Bedingungen ansteigt
wie dies bei der auf subcutanem Wege injizierten Lösung festzustellen
ist. Man stellt jedoch eine geringe Verschiebung zu späteren Zeitpunkten
der Kurve als Funktion der Zeit fest, wenn Heparin in Vesikula eingearbeitet
ist und auf oralem Wege verabreicht wird.
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Die Verabreichung einer Heparin-Lösung auf
oralem Wege hat dagegen keinen Einfluss auf die Heparinämie.
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Beispiel 2: Vesikula,
die Calcitonin enthalten
-
2.a Herstellung und Charakterisierung
von Vesikula, die Calcitonin enthalten
-
Es wurden ähnliche Versuche mit einer
Ratte durchgeführt
durch Verabreichung von Calcitonin, bei dem es sich um ein Peptid
handelt. In diesem Fall war die Hauptschwierigkeit die Instabilität des Moleküls, das in
einem Gastrointestinal-Medium im normalen Verdauungsprozess sehr
schnell abgebaut wird.
-
Das verwendete Calcitonin ist ein
Lachs-Calcitonin (BACHEM H-2260), das in PBS 1× in eine wässrige Lösung überführt wird. Die Formulierung
und die Arbeitsweise bei der Herstellung der Vesikula sind ähnlich denjenigen,
die im Falle des Heparins angewendet wurden (Formulierung D).
| ➀ Ethoxylierter
Laurylalkohol (SEPPIC, Simulsol P4): | 4,00
% |
| ➁ Lanolincholesterin
(FLUKA): | 3,00
% |
| ➂ steriles
PBS 1× | 10,00
% |
| ➃ Calcitonin-Lösung mit
einer Konzentration von 12 000 IU/ml in sterilem PBS 1× | 40,00
% |
| ➄ Sojalecithin
(NATTERMANN, Phospholipon 90): | 43,00
% |
-
Die Vesikula werden in einer Konzentration
von 10 % in sterilem PBS 1× dispergiert,
dies entspricht einem Calcitonintiter von 480 UI/ml.
-
Das granulometrische Profil der Vesikula
zeigt eine Verteilung der Teilchengröße, die sich von 50 nm bis
10 μm erstreckt
und ein Hauptmaximum aufweist, das bei etwa 0,3 μm zentriert ist, und ein sekundäres Maximum
aufweist, das wenig ausgeprägt
ist bei etwa 3 μm.
85 % der Probe haben eine Teilchengröße von weniger als 1 μm.
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2.b Untersuchung der Verabreichung
der Calcitonin enthaltenden Vesikula an Ratten
-
Der Versuch wurde mit weiblichen
Wistarratten von 150 g durchgeführt,
die auf Gruppen zu 4 Ratten aufgeteilt waren. Die Verabreichung
auf oralem Wege wurde durchgeführt
unter Verwendung einer Speiseröhren-Sonde mit einem Verabreichungsvolumen
von 300 μl,
dies entspricht 144 UI, die pro Tier verabreicht wurden.
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Eine positive Vergleichsgruppe erhielt
auf subcutanem Wege ein Volumen von 100 μl einer wässrigen Calcitonin-Lösung mit
20 UI/ml, dies entspricht einer Dosis von 2 UI Calcitonin pro Tier.
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Eine negative Vergleichsgruppe erhielt
auf oralem Wege ein Volumen von 300 μl einer wässrigen Calcitonin-Lösung mit
einer Konzentration von 240 UI/ml, dies entspricht einer Dosis von
72 UI pro Tier.
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Die Tiere wurden 24 h vor dem Versuch
nüchtern
gehalten (Wasserdiät).
Die Probenentnahmen wurden auf retro-orbitalem Wege im Allgemeinen
unter Anästhesie
zum Zeitpunkt T0 (vor der Verabreichung),
T0 + 1 h, T0 + 2
h oder T0 + 3 h, T0 +
5 h durchgeführt.
50 μl Blut
werden in Heparin-haltigen Mikrokapillaren entnommen.
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Die Bestimmung des Calcium-Gehaltes
und des Blut-pH-Wertes werden sofort nach der Probenentnahme direkt
mit der Mikrokapillar-Probe unter Verwendung eines automatischen
Analysators CIBA-CORNING, Modell 634, durchgeführt, wobei die Calcämie erhalten
wird.
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Die Ergebnisse sind in der 5 zusammengefasst. Im Falle
des Calcitonins, das in erfindungsgemäßen Vesikula enthalten war,
die auf oralem Wege verabreicht wurden, stellt man eine Abnahme
der Calcämie im
Verlaufe der ersten Stunde auf etwa 75 % seines Anfangswertes fest,
dann stellt man einen allmählichen Anstieg
in der darauffolgenden Stunde fest. Dieses Verhalten ähnelt demjenigen,
das bei der subcutanen Injektion von Calcitonin in wässriger
Lösung
erhalten wurde. Dagegen ist dieses Phänomen nicht festzustellen bei
der Verabreichung einer nicht-eingekapselten Calcitonin-Lösung auf
oralem Wege. Man kann somit daraus schließen, dass die Einkapselung
des Calcitonins gemäß der vorliegenden
Erfindung einen Schutz dieses Peptids gegen Verdauung im Gastrointestinal-Medium
sowie einen Durchgang durch die Intestinal-Schleimhaut ermöglicht.
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Erläuterung der Figuren
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1
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2
-
-
3
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4
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5
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