CN108342381A - 一种用于稳定保存外周血中循环游离dna的溶剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于稳定保存外周血中循环游离DNA的溶剂。所描述的保存溶剂质量体积百分比组成：超纯无菌水70～85％；抗凝剂3～9％；缓冲剂0.5～1.5％，防腐剂6～28％；代谢抑制剂0.5～1.5％；核酸酶抑制剂1～4％，蛋白酶抑制剂0.5～3.5％。本发明的溶剂可以确保将外周血中游离DNA在常温下稳定保存9天，在37℃环境下可达15天，避免受外来微生物的污染，并且能够抑制血液中细胞基因组DNA的释放，保证游离DNA的量在此期间内不会发生明显变化。

Description

一种用于稳定保存外周血中循环游离DNA的溶剂

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体的说是一种用于稳定保存外周血中循环游离DNA的溶剂。

背景技术

绝大多数人类DNA位于细胞中，但不管是健康的人群还是患病人群，都有小部分DNA游离于细胞之外，称为游离DNA(cell-free DNA)。外周血中也存在游离DNA,称为外周血循环DNA(Circulating DNA in plasma or serum)。近几年，随着基因组医学的发展，通过捕获血液中游离DNA进行无创产前检测或者肿瘤诊断，已逐步应用于临床。

在临床检测中，外周血的游离DNA量是检测成败及是否精准的重要指标。例如外周血中的白细胞由于破裂释放出的基因组DNA会混合在血浆中的游离DNA，导致检测结果的准确性。所以，在常规的检验过程中，外周血会快速的通过离心的手段将血浆进行分离，然后在低温的环境下，在有效的时间内运输到检测地点，这极大的限制了游离DNA检测手段的应用，尤其是在医学检测技术落后且偏远的地区。因此现有的技术须要有改进才能满足广泛的应用。

CN 104830831 A公开了一种外周血游离DNA保存剂，包括以下质量体积比的组分：超纯无菌水60-80％，抗凝剂5-8％，防腐剂10-25％，代谢抑制剂1-5％，核酸酶抑制剂0.5-3％，虽然含有代谢抑制剂及核酸酶抑制剂，但是该保存剂只可以保证外周血游离DNA在常温下保存7天，7天之后需要即刻处理血液样本，以保证实验结果的真实性。在很多情况之下，采血点并没有配套完善的设备处理血液样本，邮寄血液样本也不会很及时。为进一步缓解血液标本常温保存及不能及时邮寄的难题，急需一种能够增加外周血中游离DNA的稳定时间、并长期保存外周血中循环游离DNA的溶剂。

发明内容

本发明提供了一种用于稳定保存外周血中循环游离DNA的溶剂。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种用于稳定保存外周血中循环游离DNA的溶剂，溶剂按质量百分比计，抗凝剂3-9％、缓冲剂0.5-1.5％、防腐剂6-28％、代谢抑制剂0.5-1.5％、核酸酶抑制剂1-4％、蛋白酶抑制剂0.5-3.5％、余量为超纯无菌水。

所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾、草酸钠、草酸钾、草酸铵、肝素及枸杞酸钠中的一种或多种组合，其能够防止抽出来的血液的凝固，保持液体状态。

优选抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠、草酸钾及柠檬酸钠的组合。

更优选为，按质量百分比依次为1.5％、1.5％及0.5％将乙二胺四乙酸二钠、草酸钾及柠檬酸钠混合。

所述缓冲剂为氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾的中的一种或多种组合，其能够维持溶液一定的pH值。

优选地缓冲剂为磷酸氢二钠。

更优选缓冲剂为磷酸氢二钠，添加量按质量百分比为0.9％。

所述防腐剂为氟化钠、氯化锂、苯甲酸、二唑烷基脲，咪唑烷基脲，二羟甲基二甲基乙内酰脲，二羟甲基脲，2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇，恶唑烷，羟甲基甘氨酸钠，金刚季烷、己二烯酸钠的中的一种或多种组合，其能有效抑制细菌等污染，防止血液变质。

优选地防腐剂为氟化钠、氯化锂、苯甲酸、二唑烷基脲，咪唑烷基脲，二羟甲基二甲基乙内酰脲，二羟甲基脲，恶唑烷，羟甲基甘氨酸钠二烯酸钠的组合，

更优选为按质量百分比依次为0.7％、0.65％、1.8％、0.6％、0.95％、1.6％、0.8％，0.8％及0.8％将氟化钠、氯化锂、苯甲酸、二唑烷基脲，咪唑烷基脲，二羟甲基二甲基乙内酰脲，二羟甲基脲，恶唑烷，羟甲基甘氨酸钠二烯酸钠混合。

所述代谢抑制剂为溴丙酮酸，对溴四咪唑草酸盐，花萼海绵诱癌素，3-(3-吡啶基)-1-(4-吡啶基)-2-丙烯-1-酮，2-[(1,1-二氧代-1,2-苯并异噻唑-3-基)甲硫基]-苯甲酸，草氨酸钠的中的一种或多种组合；其能够抑制细胞代谢，阻止细胞裂解释放基因组DNA到游离DNA当中造成干扰。

优选地代谢抑制剂为溴丙酮酸，对溴四咪唑草酸盐，2-[(1,1-二氧代-1,2-苯并异噻唑-3-基)甲硫基]-苯甲酸，草氨酸钠的组合。

更优选为按质量百分比依次为0.3％、0.15％、0.25％及0.2％将溴丙酮酸，对溴四咪唑草酸盐，2-[(1,1-二氧代-1,2-苯并异噻唑-3-基)甲硫基]-苯甲酸，草氨酸钠的组合。

所述核酸酶抑制剂为乙二胺四乙酸(EDTA)，羟乙基哌嗪乙硫磺酸，氢氧化钾,氯化钾，甘油，特异性RNA酶抑制剂，氧钒核糖核苷复合物，二硫苏糖醇(DTT)的中的一种或多种组合，其能使核酸酶失活，防止游离DNA降解，恻然影响游离DNA的检测灵敏度。

优选地核酸酶抑制剂为羟乙基哌嗪乙硫磺酸，特异性RNA酶抑制剂，氧钒核糖核苷复合物，二硫苏糖醇(DTT)的组合。

更优选为按质量百分比依次为0.8％、1.7％、0.7％及0.3％将羟乙基哌嗪乙硫磺酸，特异性RNA酶抑制剂，氧钒核糖核苷复合物，二硫苏糖醇(DTT)的组合。

所述蛋白酶抑制剂为4-2-胺乙基苯磺酰氟盐酸盐，抑肽酶，苯丁抑制素，N-(反式-环氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂，苯甲基磺酰氟的中的一种或多种组合；

优选地蛋白酶抑制剂为4-2-胺乙基苯磺酰氟盐酸盐，苯丁抑制素，N-(反式-环氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺，苯甲基磺酰氟的组合。

更优选为按质量百分比依次为0.5％、0.35％、0.15％及0.5％将4-2-胺乙基苯磺酰氟盐酸盐，苯丁抑制素，N-(反式-环氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺，苯甲基磺酰氟的组合。

所述超纯无菌水，经过灭菌处理或者通过45μm滤膜过滤过的的超纯水。

一种用于稳定保存外周血中循环游离DNA的溶剂的制备方法，按上述比例将抗凝剂、缓冲剂、防腐剂、代谢抑制剂、核酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及超纯无菌水依次加入。

本发明所具有的优点：

本发明保存剂中添加了缓冲剂及蛋白酶抑制剂，缓冲剂可以维持生物细胞的正常pH值，在正常生理环境起重要作用，保证细胞形态的稳定性。蛋白酶抑制剂能够与酶结合而降低酶作用底物分解速率的物质，使组织细胞受到完全的保护，保证细胞完整性，进一步减少基因组DNA释放对游离DNA形成污染。进而采用本发明保存剂解决了现有的血浆游离DNA不便于一定温度下保存运输，保存期限短的难题，在常温保存外周血游离DNA的时间提高到9天以上，在4～30℃，甚至37℃下可至15天，并且游离DNA的量在此期间内不会发生明显变化。

本发明的保存剂能够在长期保存的前提下还能保证血液中游离DNA处于稳定状态，同时抑制血液中的细胞不释放出基因组DNA的作用。

同时，在采用本发明的游离DNA保存剂可以在不离心进行分离外周血血浆的前提下，充分保护血液样本中游离DNA。同时能够有效抑制血液中的核酸酶和细胞代谢有关系的酶类，固化血液白细胞与红细胞，避免基因组DNA(gDNA)释放，对游离DNA形成污染。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。所需要声明的是所描述的具体实施案例仅用以解释本发明技术内容，但并不用于限定本发明。

实施例1

保存外周血中循环游离DNA的溶剂，按质量百分比计，抗凝剂3.5％、缓冲剂0.9％、防腐剂8.7％、代谢抑制剂0.9％、核酸酶抑制剂3.5％、蛋白酶抑制剂1.5％，余量为超纯无菌水81％。

所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠、草酸钾及柠檬酸钠，其中，各物质添加量按质量百分比计，1.5％、1.5％及0.5％。采用的抗凝剂用于防止抽出来的血液的凝固，保持液体状态。

所述缓冲剂为磷酸氢二钠，缓冲剂用以维持溶液一定的pH值。

所述防腐剂为氟化钠、氯化锂、苯甲酸、二唑烷基脲，咪唑烷基脲，二羟甲基二甲基乙内酰脲，二羟甲基脲，恶唑烷，羟甲基甘氨酸钠二烯酸钠的组合，各组分的质量百分比分别为0.7％、0.65％、1.8％、0.6％、0.95％、1.6％、0.8％，0.8％及0.8％；防腐剂用以抑制细菌等污染，防止血液变质。

所述代谢抑制剂为溴丙酮酸，对溴四咪唑草酸盐，2-[(1,1-二氧代-1,2-苯并异噻唑-3-基)甲硫基]-苯甲酸和草氨酸钠，各组分的质量百分比分别为0.3％、0.15％、0.25％及0.2％。代谢抑制剂用以抑制细胞代谢，阻止细胞裂解释放基因组DNA到游离DNA当中造成干扰。

所述核酸酶抑制剂为羟乙基哌嗪乙硫磺酸，特异性RNA酶抑制剂，氧钒核糖核苷复合物，二硫苏糖醇(DTT)，各组分的质量百分比分别为0.8％、1.7％、0.7％及0.3％。核酸酶抑制剂用以使核酸酶失活，防止游离DNA降解，恻然影响游离DNA的检测灵敏度。

所述蛋白酶抑制剂为4-2-胺乙基苯磺酰氟盐酸盐，苯丁抑制素，N-(反式-环氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺，苯甲基磺酰氟各组分的质量百分比分别为0.5％、0.35％、0.15％及0.5％。

上述提供的代谢抑制剂及蛋白酶抑制剂可以维持细胞形态和防止细胞破解造成DNA降解及释放，同时核酸酶抑制剂也防止游离DNA遭受到Dnase(核酸酶)的降解影响，缓冲液的合适的pH值对于维持细胞形态亦有极大的帮助。

所述超纯无菌水，经过灭菌处理或者通过45μm滤膜过滤过的的超纯水。

保存外周血中循环游离DNA的溶剂的制备过程，将各成分按照上述比例混合，即可。

实施例2

保存外周血中循环游离DNA的溶剂，按质量百分比计，抗凝剂4.5％、缓冲剂1.2％、防腐剂6.2％、代谢抑制剂0.8％、核酸酶抑制剂2.9％、蛋白酶抑制剂2.5％，余量为超纯无菌水81.9％。

所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠、草酸钠、肝素及柠檬酸钠，其中，各物质添加量按质量百分比计1.5％、1.5％、1％及0.5％。采用的抗凝剂用于防止抽出来的血液的凝固，保持液体状态。

所述缓冲剂为磷酸氢二钾，缓冲剂用以维持溶液一定的pH值。

所述防腐剂为氯化锂、苯甲酸、二唑烷基脲，二羟甲基脲，2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇，恶唑烷，羟甲基甘氨酸钠，己二烯酸钠的组合，各组分的质量百分比分别为0.35％、0.65％、1.1％、0.6％、0.45％、1.45％、0.8％及0.8％；防腐剂用以抑制细菌等污染，防止血液变质。

所述代谢抑制剂为溴丙酮酸，对溴四咪唑草酸盐，花萼海绵诱癌素和草氨酸钠，各组分的质量百分比分别为0.25％、0.15％、0.2％及0.2％。代谢抑制剂用以抑制细胞代谢，阻止细胞裂解释放基因组DNA到游离DNA当中造成干扰。

所述核酸酶抑制剂为乙二胺四乙酸(EDTA)，氯化钾，特异性RNA酶抑制剂，氧钒核糖核苷复合物，二硫苏糖醇(DTT)，各组分的质量百分比分别为0.6％、0.5％，1％、0.5％及0.3％。核酸酶抑制剂用以使核酸酶失活，防止游离DNA降解，从而影响游离DNA的检测灵敏度。

所述蛋白酶抑制剂为4-2-胺乙基苯磺酰氟盐酸盐，抑肽酶，苯丁抑制素，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂，苯甲基磺酰氟各组分的质量百分比分别为0.4％、0.6％，0.2％，0.35％、0.45％及0.5％。

上述提供的代谢抑制剂及蛋白酶抑制剂可以维持细胞形态和防止细胞破解造成DNA降解及释放，同时核酸酶抑制剂也防止游离DNA遭受到Dnase(核酸酶)的降解影响，缓冲液的合适的pH值对于维持细胞形态亦有极大的帮助。

所述超纯无菌水，经过灭菌处理或者通过45μm滤膜过滤过的的超纯水。

保存外周血中循环游离DNA的溶剂的制备过程，将各成分按照上述比例混合，即可。

实施例3

保存外周血中循环游离DNA的溶剂，按质量百分比计，抗凝剂8.6％、缓冲剂1％、防腐剂10.5％、代谢抑制剂1.1％、核酸酶抑制剂1.2％、蛋白酶抑制剂0.9％，余量为超纯无菌水76.7％。

所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾、草酸钠、草酸钾、草酸铵及柠檬酸钠，其中，各物质添加量按质量百分比计2.5％、1.5％、1.1％,0.9％,1％及1.6％。采用的抗凝剂用于防止抽出来的血液的凝固，保持液体状态。

所述缓冲剂为氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾，其中，各物质添加量按质量百分比计的0.3％、0.4％、及0.3％.缓冲剂用以维持溶液一定的pH值。

所述防腐剂为氯化锂、苯甲酸、二唑烷基脲，二羟甲基脲，恶唑烷，羟甲基甘氨酸钠，金刚季烷、己二烯酸钠的组合，各组分的质量百分比分别为0.65％、1.65％、1.6％、1.4％、1.45％、1.95％、0.9％及0.9％；防腐剂用以抑制细菌等污染，防止血液变质。

所述代谢抑制剂为溴丙酮酸，对溴四咪唑草酸盐，花萼海绵诱癌素，3-(3-吡啶基)-1-(4-吡啶基)-2-丙烯-1-酮，2-[(1,1-二氧代-1,2-苯并异噻唑-3-基)甲硫基]-苯甲酸，草氨酸钠，各组分的质量百分比分别为0.25％、0.2％、0.15％、0.2％、0.2％及0.2％。代谢抑制剂用以抑制细胞代谢，阻止细胞裂解释放基因组DNA到游离DNA当中造成干扰。

所述核酸酶抑制剂为乙二胺四乙酸(EDTA)，羟乙基哌嗪乙硫磺酸，氢氧化钾,甘油，特异性RNA酶抑制剂，氧钒核糖核苷复合物，二硫苏糖醇(DTT)，各组分的质量百分比分别为0.1％、0.2％、0.2％、0.2％，0.1％、0.2％及0.2％。核酸酶抑制剂用以使核酸酶失活，防止游离DNA降解，从而影响游离DNA的检测灵敏度。

所述蛋白酶抑制剂为4-2-胺乙基苯磺酰氟盐酸盐，抑肽酶，苯丁抑制素，N-(反式-环氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂，苯甲基磺酰氟各组分的质量百分比分别为0.1％、0.1％、0.2％，0.1％，0.15％、0.05％及0.2％。

上述提供的代谢抑制剂及蛋白酶抑制剂可以维持细胞形态和防止细胞破解造成DNA降解及释放，同时核酸酶抑制剂也防止游离DNA遭受到Dnase(核酸酶)的降解影响，缓冲液的合适的pH值对于维持细胞形态亦有极大的帮助。

所述超纯无菌水，经过灭菌处理或者通过45μm滤膜过滤过的的超纯水。

保存外周血中循环游离DNA的溶剂的制备过程，将各成分按照上述比例混合，即可。

实施例4

保存外周血中循环游离DNA的溶剂，按质量百分比计，抗凝剂3.6％、缓冲剂0.9％、防腐剂8.5％、代谢抑制剂0.9％、核酸酶抑制剂3.2％、蛋白酶抑制剂2.8％，余量为超纯无菌水80.1％。

所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸三钾、草酸钠、草酸钾、草酸铵及柠檬酸钠，其中，各物质添加量按质量百分比计1％、0.3％、0.5％,0.4％,0.3％及1.1％。采用的抗凝剂用于防止抽出来的血液的凝固，保持液体状态。

所述缓冲剂为氯化钠，磷酸氢二钠,其中，各物质添加量按质量百分比计0.3％及0.6％.缓冲剂用以维持溶液一定的pH值。

所述防腐剂为氟化钠、苯甲酸、二唑烷基脲，二羟甲基二甲基乙内酰脲，二羟甲基脲，恶唑烷，羟甲基甘氨酸钠，金刚季烷、己二烯酸钠的组合，各组分的质量百分比分别为0.65％、1.25％、0.8％、1.25％、0.85％、1％、0.9％、0.9％及0.9％；防腐剂用以抑制细菌等污染，防止血液变质。

所述代谢抑制剂为溴丙酮酸，对溴四咪唑草酸盐，花萼海绵诱癌素，2-[(1,1-二氧代-1,2-苯并异噻唑-3-基)甲硫基]-苯甲酸，草氨酸钠，各组分的质量百分比分别为0.15％、0.2％、0.15％、0.2％、及0.2％。代谢抑制剂用以抑制细胞代谢，阻止细胞裂解释放基因组DNA到游离DNA当中造成干扰。

所述核酸酶抑制剂为乙二胺四乙酸(EDTA)，羟乙基哌嗪乙硫磺酸,甘油，特异性RNA酶抑制剂，氧钒核糖核苷复合物，二硫苏糖醇(DTT)，各组分的质量百分比分别为0.3％、0.5％、0.35％、0.6％，0.75％及0.7％。核酸酶抑制剂用以使核酸酶失活，防止游离DNA降解，从而影响游离DNA的检测灵敏度。

所述蛋白酶抑制剂为4-2-胺乙基苯磺酰氟盐酸盐，抑肽酶，苯丁抑制素，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂，苯甲基磺酰氟各组分的质量百分比分别为0.6％、0.45％、0.4％，0.6％，0.45％及0.3％。

上述提供的代谢抑制剂及蛋白酶抑制剂可以维持细胞形态和防止细胞破解造成DNA降解及释放，同时核酸酶抑制剂也防止游离DNA遭受到Dnase(核酸酶)的降解影响，缓冲液的合适的pH值对于维持细胞形态亦有极大的帮助。

所述超纯无菌水，经过灭菌处理或者通过45μm滤膜过滤过的的超纯水。

保存外周血中循环游离DNA的溶剂的制备过程，将各成分按照上述比例混合，即可。

应用例1

将上述实施例获得保存外周血中循环游离DNA的溶剂和对比例的抗凝剂与待保存的血液混合。血液与保存剂混合采取非剧烈的方式上下颠倒10次以上混匀，达到保存液与血液混匀充分接触的目的。

而后，采用本发明实施例获得保存剂混合血液，游离DNA的量在常温的环境之下，9天以后，不超过6％

而采用对比例混合血液，9天以后的血浆游离DNA量会急剧增加达15倍以上。细胞中的基因组DNA释放到血液中会和游离DNA进行混合，从而影响最终游离DNA检测的精确性。

采用对比例这样的抗凝剂会出现相应弊端，若是将待保存血液为产前诊断中母体细胞基因组DNA若未经过合适处理，与现有的保存剂混合母体DNA的释放会极大影响胎儿游离DNA的检测，从而极可能造成产前诊断数据的不准确。而采用本发明保存剂将不会出现这样的问题。

上述对比例的抗凝剂为含乙二胺四乙酸二钠的纯无菌水；其中，乙二胺四乙酸二钠所配制的抗凝剂的浓度为15g/L。

应用例2

对保存的外周血中循环游离DNA稳定性的测定：

具体为：

(1)静置实验

取10mL健康志愿者的血液置于EDTA抗凝剂(即，含乙二胺四乙酸二钠的纯无菌水；其中，乙二胺四乙酸二钠所配制的保存剂的浓度为15g/L。)、Streck BCT管及装有上述实施例获得保存液的采血管中，每个组合分别取3管，共计9管。血液采集后，马上上下颠倒10次混匀，然后在4℃、25℃、37℃不同温度的恒温箱中静置。静置0、3、7、9、15天后，分别进行游离DNA的提取。

(2)血浆分离

在4℃环境下、用1600g速度离心真空采血管10分钟，取上清到洁净离心管中。再次将上清以在4℃环境下，以1600g的速度离心10分钟，所收集的上清即为血浆。

(3)循环游离DNA提取实验

血液循环游离DNA的提取采用Qiagen公司的QIAamp Circulating Nucleic AcidKit试剂盒。

1)将100μl QIAGEN Proteinase K加入到50ml的离心管中。

2)再将1ml血浆加入到50ml的离心管中。

3)再加入0.8ml，1.6ml或者2.4ml的Buffer ACL(含有1.0μg carrier RNA)。盖上管盖，涡旋30s。

4)60℃孵育30min。

5)将离心管取回实验台，拧开管盖。

6)加入1.8ml、3.6ml、5.4ml的Buffer ACB到离心管的裂解液中。盖上管盖，彻底涡旋15-30s。

7)将裂解液-Buffer ACB的混合溶液在冰上孵育5min。

8)将QIAamp Mini column插入到QIAvac 24Plus真空泵系统的VacConnector上，在QIAamp Mini column上放置20ml的补充管。

9)小心地将第G步得到的裂解液-Buffer ACB的混合液加入到在QIAamp Minicolumn上的补充管中，打开真空泵。当所有的裂解液完全通过柱子后，关掉真空泵，压力释放到0mbar。小心取下补充管，丢弃。

10)将600μl Buffer ACW1加入到QIAamp Mini column中，保持柱子是打开状态，打开真空泵。在所有的Buffer ACW1完全通过了QIAamp Mini column后，关掉真空泵，压力释放为0mbar。

11)将750μl Buffer ACW2加入到QIAamp Mini column中，保持柱子是打开状态，打开真空泵。在所有的Buffer ACW2完全通过了QIAamp Mini column后，关掉真空泵，压力释放为0mbar。

12)将750μl的乙醇(96-100％)加入到QIAamp Mini column中，保持柱子是打开状态，打开真空泵。在所有的乙醇完全通过了QIAampMini column后，关掉真空泵，压力释放为0mbar。

13)关闭上QIAamp Mini column，从真空泵上取下，弃VacConnector。将QIAampMini column放置在一个干净的2ml收集管中，全速(20,000x g；14,000rpm)离心3min。

14)将QIAamp Mini Column置于一个2ml收集管中，打开盖子，56℃孵育10min使膜完全干燥。

15)将QIAamp Mini column置于一个干净的1.5ml洗脱管(试剂盒中提供)，弃第14步的2ml收集管。

16)小心地将20-150μl的Buffer AVE加入到QIAamp Mini膜中央，盖上盖子，室温孵育3min。

17)全速(20,000x g；14,000rpm)离心1min，洗脱核酸，管底溶液即为所提取的血液循环游离DNA。

(4)Taqman技术检测TERT基因：扩增引物序列是5’TGACACCTCACCTCACCCAC 3’，另外一条扩增引物序列是5’CACTGTCTTCCGCAAGTTCAC 3’，探针序列是5’-CCCTGGTCCGAGGTGTCCCTGAG-3’。

所述PCR反应的条件为：50-55℃1.5-2.5分钟，1个循环；90-95℃15-25秒，55-60℃25-35秒，30-40个循环。

4℃、25℃、37℃不同温度静置，Taqman探针法检测第0、3、7、9、15天真空采血管中游离DNA的TERT基因CT值如表1、表2和表3所示。

表1为4℃环境下健康人血液样本中游离DNA的TERT基因CT值

表2为25℃环境下健康人血液样本中游离DNA的TERT基因CT值

表3为37℃环境下健康人血液样本中游离DNA的TERT基因CT值

实验结果显示，在4℃的环境下，EDTA真空采血管中游离DNA中TERT基因的CT值随着时间不断下降，意味着血液中细胞释放出了大量的基因组DNA。但是商用的Streck BCT管及本发明保证了良好稳定的保存作用，7天的时候都显示不出游离DNA的数量有变化，但是15天之后，商用的Streck BCT管开始发现变化，但是本发明依旧让游离DNA保持稳定状态。

在25℃的环境下，EDTA真空采血管中游离DNA中TERT基因的CT值随着时间迅速下降。商用的Streck BCT管虽然7天都显示不出游离DNA的数量有变化，但是9天及15天两个时间节点的结果显示，商用的Streck BCT管中保存的游离DNA有了很大的变化，但是本发明依旧让游离DNA保持稳定状态。

在37℃的环境下，EDTA真空采血管中游离DNA中TERT基因的CT值随着时间更加迅速下降。商用的Streck BCT管虽然7天都显示不出游离DNA的数量有变化，但是9天及15天两个时间节点的结果显示，商用的Streck BCT管中保存的游离DNA有了很大的变化，同25℃的环境下比，变化更加明显，但是本发明依旧让游离DNA保持稳定状态

综上所述：装有本发明保存液的真空采血管在4、25、37℃不同温度条件下效果更理想，甚至优于商用的常温保存的Streck BCT管

另外，上述利用特定试剂盒提取的游离DNA，可以应用于产前诊断、癌症筛查、器官移植等多个领域。本发明不限制任何核酸检测方式，包括：聚合酶链反应(PCR)，定量实时聚合酶链反应(Q-PCR)，数字PCR(digitalPCR)，质谱(Mass Spectrometry)，基因芯片(GeneChip)，小测序法(SNaPshot),高通量测序(NGS)，或它们的任意组合。

上述各实施例应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于稳定保存外周血中循环游离DNA的溶剂，其特征在于，溶剂按质量百分比计，抗凝剂3-9％、缓冲剂0.5-1.5％、防腐剂6-28％、代谢抑制剂0.5-1.5％、核酸酶抑制剂1-4％、蛋白酶抑制剂0.5-3.5％、余量为超纯无菌水。

2.根据权利要求1所述的用于稳定保存外周血中循环游离DNA的溶剂，其特征在于：所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、乙二胺四乙酸三钾、草酸钠、草酸钾、草酸铵、肝素及枸杞酸钠中的一种或多种组合。

3.根据权利要求1所述的用于稳定保存外周血中循环游离DNA的溶剂，其特征在于：所述缓冲剂为氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾的中的一种或多种组合。

4.根据权利要求1所述的用于稳定保存外周血中循环游离DNA的溶剂，其特征在于：所述防腐剂为氟化钠、氯化锂、苯甲酸、二唑烷基脲，咪唑烷基脲，二羟甲基二甲基乙内酰脲，二羟甲基脲，2-溴-2-硝基丙烷-1,3-二醇，恶唑烷，羟甲基甘氨酸钠，金刚季烷、己二烯酸钠的中的一种或多种组合。

5.根据权利要求1所述的用于稳定保存外周血中循环游离DNA的溶剂，其特征在于：所述代谢抑制剂为溴丙酮酸，对溴四咪唑草酸盐，花萼海绵诱癌素，3-(3-吡啶基)-1-(4-吡啶基)-2-丙烯-1-酮，2-[(1,1-二氧代-1,2-苯并异噻唑-3-基)甲硫基]-苯甲酸，草氨酸钠的中的一种或多种组合。

6.根据权利要求1所述的用于稳定保存外周血中循环游离DNA的溶剂，其特征在于：所述核酸酶抑制剂为乙二胺四乙酸(EDTA)，羟乙基哌嗪乙硫磺酸，氢氧化钾,氯化钾，甘油，特异性RNA酶抑制剂，氧钒核糖核苷复合物，二硫苏糖醇(DTT)的中的一种或多种组合。

7.根据权利要求1所述的用于稳定保存外周血中循环游离DNA的溶剂，其特征在于：所述蛋白酶抑制剂为4-2-胺乙基苯磺酰氟盐酸盐，抑肽酶，苯丁抑制素，N-(反式-环氧丁二酰基)-L-亮氨酸-4-胍基丁基酰胺，亮抑酶肽，胃蛋白酶抑制剂，苯甲基磺酰氟的中的一种或多种组合。

8.一种权利要求1所述的用于稳定保存外周血中循环游离DNA的溶剂的制备方法，其特征在于：按上述比例将抗凝剂、缓冲剂、防腐剂、代谢抑制剂、核酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂及超纯无菌水依次加入。