CN111944804A - 一种血液中微生物核酸新型保存液 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种血液中微生物核酸新型保存液，其包括如下按质量份计算的组份5～15％核酸酶抑制剂、1.5～5％pH值稳定剂、0.8～1.5％代谢抑制剂、1～2％蛋白酶抑制剂、15～25％防腐剂、15～25％抗凝剂、10～20％甲醛猝灭剂，余量为灭菌水。本发明所述血液中微生物核酸新型保存液能够快速稳定血液样本，保持血液稳定性，较好的维持血液中的核酸状态，可以提高血液核酸的检测稳定性，且保存时间久。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及一种血液中微生物核酸新型保存液。
背景技术
血液是流动在人的血管和心脏中的一种红色不透明的粘稠液体，血液的功能包含血细胞功能和血浆功能两部分，有运输、调节人体温度、防御、调节人体渗透压和酸碱平衡四个功能。血液储存着人体健康信息，很多疾病的诊断均可通过验血来实现，血液检测也是目前医疗上使用最为广泛的体液检测手段。核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。游离核酸是一种新型的医疗诊断标志物，与肿瘤学、产前遗传学诊断的发展有着非常密切的联系，在疾病早期诊断、分期、治疗监测、预后判断以及产前基因诊断等许多方面有着重要意义，血液循环中的游离核酸能够提供用常规标准方法难以检测到疾病的关键信息。
对于血液的采取和收集，在医疗上普通是通过针头抽血再用采血管收集的方式。现有采血管主要分为两类，一类是仅含有抗凝剂成分，如EDTA、肝素、枸橼酸钠等成分，虽可以防止血液凝集，但并没有抑制细胞破裂的作用，因此只能在采血后短时间内(6-48h)分离血浆，提取游离核酸，保证其不被降解。但由于其仅含有抗凝剂成分，没有防止细胞破裂的保护剂，并且要求分离血浆时间较为苛刻，因此此种方法不适用于长时间的血液保持。另一类采血管包含了抗凝剂以及细胞稳定剂，但含有甲醛成分，虽然甲醛能够在较长时间内固定细胞不破裂、保护血液不变质，但游离的甲醛会导致DNA与蛋白质、蛋白质与蛋白质、DNA与DNA之间的交联，同时有可能使核酸甲基化和磷酸二酯键断裂，从而影响提取和检测效果。
目前已有部分专利公开了用于稳定血液游离DNA的溶剂或者保护剂，然而，现有的专利涉及的技术对于血液样本的实用性较差，大多还存在以下问题：现有的溶剂或者保护剂难以同时兼顾抑制核酸酶的活性和防止细胞裂解；抑菌效果差，微生物易滋生；保存时间不够长或保存温度要求低温等。
发明内容
本发明旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷，提供一种血液中微生物核酸新型保存液，所述血液中微生物核酸新型保存液能够快速稳定血液样本，保持血液稳定性，较好的维持血液中的核酸状态，可以提高血液核酸的检测稳定性，且保存时间久。
本发明采取的技术方案如下：
一种血液中微生物核酸新型保存液，包括如下按质量份计算的组份：
核酸酶抑制剂5～15％；
pH值稳定剂1.5～5％；
代谢抑制剂0.8～1.5％；
蛋白酶抑制剂1～2％；
防腐剂15～25％；
抗凝剂15～25％
甲醛猝灭剂10～20％；
余量为灭菌水。
本发明所述血液中的微生物核酸新型保存液使用核酸酶抑制剂能够抑制体系中的核酸酶活性，防止血液样本中的核酸被降解；pH值稳定剂能够保持血液样本为中性或弱碱性，为血液样本中的核酸提供相对稳定的pH值环境，保证细胞形态的稳定性；代谢抑制剂能够进一步抑制游离核酸的降解，稳定血液中的游离核酸；蛋白酶抑制剂能够与酶结合而降低酶作用底物分解速率的物质，使组织细胞受到完全的保护，保证细胞完整性，进一步减少基因组DNA释放对游离DNA形成污染；防腐剂能够较好地稳定血液在常温条件下不变质；抗凝剂用于抑制血液凝固；甲醛猝灭剂主要是与游离的自由醛反应，猝灭游离甲醛等自由醛，避免其对游离核酸造成损伤，使得血液中的核酸能够维持自身结构的稳定，同时避免了自由醛抑制聚合酶链式反应和测序过程中的酶反应。本发明通过合理配制各组份，使得所制备的血液中微生物核酸新型保存液能够快速稳定血液样本，避免核酸降解，维持核酸的稳定性，还能够有效抑制核酸酶的活性并防止细胞裂解，且样品不会凝血。
优选地，所述的血液中微生物核酸新型保存液，包括如下按质量份计算的组份：
核酸酶抑制剂5～10％；
pH值稳定剂1.5～5％；
代谢抑制剂0.8～1.5％；
蛋白酶抑制剂1～2％
防腐剂15～20％；
抗凝剂20～25％
甲醛猝灭剂10～15％；
余量为灭菌水。
优选地，所述核酸酶抑制剂为乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸、羟乙基哌嗪乙硫磺中的一种或多种。
优选地，所述pH值稳定剂为三羟甲基氨基甲烷或双(2-(羟甲基)氨基-三(羟甲基)甲烷。
优选地，所述代谢抑制剂为溴丙酮酸、3-(3-吡啶基)-1-(4-吡啶基)-2-丙烯-1-酮、2-[(1,1-二氧代-1,2-苯并异噻唑-3-基)甲硫基]-苯甲酸、金精三羧酸中的一种或多种。
优选地，所述蛋白酶抑制剂为抑肽酶、亮肽素，抗痛素、抑弹性蛋白酶醛、抑胃蛋白酶素、磷酰胺素中的一种或多种。
优选地，所述防腐剂为咪唑烷基脲。
优选地，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、草酸钠、草酸钾、枸杞酸钠中的一种或多种。
优选地，所述甲醛猝灭剂为精氨酸、赖氨酸、甘氨酸中的一种和乙二胺的混合物。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明所述的血液中微生物核酸新型保存液能够快速稳定血液样本，稳定核酸，避免核酸被降解，有效抑制核酸酶的活性并防止细胞裂解；本发明所述的核酸新型保存液成分相对简单且成本低，同时能够在室温条件下保持核酸，非常适合在临床广泛使用；本发明所述的核酸新型保存液储存常温状态下稳定性好，能够提供充足的送检、受检时间。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
下述实施例中所用的实验原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为普通市售产品。
以下实施例所述的灭菌水均为不含核酸酶的去离子灭菌水。
实施例1
一种血液中微生物核酸新型保存液，其组份如下：核酸酶抑制剂5％；pH值稳定剂3％、代谢抑制剂1％、蛋白酶抑制剂1％、防腐剂18％、抗凝剂20％、甲醛猝灭剂15％，余量为灭菌水；其中，所述核酸酶抑制剂乙二胺四乙酸，所述pH值稳定剂为三羟甲基氨基甲烷；所述蛋白酶抑制剂为抑肽酶和亮肽素，质量比为1:1，所述防腐剂为咪唑烷基脲；所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠；所述甲醛猝灭剂为和甘氨酸和乙二胺的混合物，甘氨酸和乙二胺的质量比为2:1。
实施例2
一种血液中微生物核酸新型保存液，其组份如下：核酸酶抑制剂8％；pH值稳定剂1.5％、代谢抑制剂1.5％、蛋白酶抑制剂2％、防腐剂20％、抗凝剂22％、甲醛猝灭剂10％，余量为灭菌水；其中，所述核酸酶抑制剂乙二胺四乙酸，所述pH值稳定剂为三羟甲基氨基甲烷；所述蛋白酶抑制剂为抑肽酶和亮肽素，质量比为1:1，所述防腐剂为咪唑烷基脲；所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠；所述甲醛猝灭剂为和甘氨酸和乙二胺的混合物，甘氨酸和乙二胺的质量比为2:1。
实施例3
一种血液中微生物核酸新型保存液，其组份如下：核酸酶抑制剂10％；pH值稳定剂5％、代谢抑制剂1.5％、蛋白酶抑制剂1.2％、防腐剂15％、抗凝剂25％、甲醛猝灭剂12％，余量为灭菌水；其中，所述核酸酶抑制剂乙二胺四乙酸和羟乙基哌嗪乙硫磺的混合物，质量比为1:1，所述pH值稳定剂为三羟甲基氨基甲烷；所述蛋白酶抑制剂为抑肽酶和磷酰胺素，质量比为1:1，所述防腐剂为咪唑烷基脲；所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠和枸杞酸钠的混合物，质量比为1：1；所述甲醛猝灭剂为和甘氨酸和乙二胺的混合物，甘氨酸和乙二胺的质量比为2:1。
采用标准静脉穿刺技术从志愿者体内各采集血液，用采血管收集。其中编号为A、B、C的3个真空采血管内分别装有1m实施例1、实施例2、实施例3所述的保存液混合，编号为D的采血管装有抗凝剂EDTA和灭菌水，抗凝剂EDTA的质量百分比为63％。按照血液与保存液的体积比为5:1的比例将血液与A、B、C中的保存液混合，按照血液与抗凝剂溶液的体积比为5:1的比例将血液与D中的抗凝剂混合，然后分别再上下颠倒10次使其充分混合均匀。将A、B、C、D所得的混合液再通过真空针头抽液方法分别均分为4等份，记为A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、C4、D1、D2、D3、D4，在25℃条件下静置保存。第0天分别分离A1、B1、C1、D1的血浆，第3天分别分离A2、B2、C2、D2的血浆、第9天分别分离A3、B3、C3、D3的血浆，第14天分别分离A4、B4、C4、D4的血浆，对分离的血浆再提取游离核酸。
血浆分离方法如下：在4℃环境下、用1200g速度离心真空采血管10分钟，取上清到洁净离心管中。再次将上清以在4℃环境下，以1600g的速度离心10分钟，所收集的上清即为血浆。
游离核酸提取方法：
提取试剂盒：Qiagen公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit；
上游扩增引物序列：5’-TGACACCTCACCTCACCCAC-3’；
下游扩增引物序列：5’-CACTGTCTTCCG CAAGTTCAC-3’；
探针序列：5’-CCCTGGTCCGAGGTGTCCCTGAG-3’；
PCR反应的条件为：50～55℃1.5～2.5分钟，1个循环；90～95℃15～25秒，55～60℃25～35秒，30～40个循环。
进行PCR扩增，通过Taqman探针法检测不同采集管的血液在不同保存时间条件下的Ct值，测试结果见表1。
表1不同处理液保持的血液样品在不同保存时间条件下的Ct值
| 0天 | 3天 | 9天 | 14天 | |
| 实施例1 | 32.52 | 32.43 | 32.12 | 31.83 |
| 实施例2 | 33.24 | 33.11 | 32.83 | 32.67 |
| 实施例3 | 33.15 | 33.00 | 32.87 | 32.56 |
| 对照组 | 32.48 | 26.01 | 18.29 | 12.97 |
从表1的数据可知，实施例1至实施例3所述的脑脊液中微生物核酸新型保存液所保存的患者的脑脊液的Ct值比较稳定，保存0天～14天差别不大，说明使用了本发明所述微生物核酸新型保存液对血液液进行保存后，可以在较长时间内稳定血液核酸。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种血液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，包括如下按质量份计算的组份：
核酸酶抑制剂5～15％；
pH值稳定剂1.5～5％；
代谢抑制剂0.8～1.5％；
蛋白酶抑制剂1～2％；
防腐剂15～25％；
抗凝剂15～25％
甲醛猝灭剂10～20％；
余量为灭菌水。
2.根据权利要求1所述的血液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，包括如下按质量份计算的组份：
核酸酶抑制剂5～10％；
pH值稳定剂1.5～5％；
代谢抑制剂0.8～1.5％；
蛋白酶抑制剂1～2％
防腐剂15～20％；
抗凝剂20～25％
甲醛猝灭剂10～15％；
余量为灭菌水。
3.根据权利要求1或2所述的血液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，所述核酸酶抑制剂为乙二胺四乙酸、乙二醇四乙酸、羟乙基哌嗪乙硫磺中的一种或多种。
4.根据权利要求1或2所述的血液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，所述pH值稳定剂为三羟甲基氨基甲烷或双(2-(羟甲基)氨基-三(羟甲基)甲烷。
5.根据权利要求1或2所述的血液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，所述代谢抑制剂为溴丙酮酸、3-(3-吡啶基)-1-(4-吡啶基)-2-丙烯-1-酮、2-[(1,1-二氧代-1,2-苯并异噻唑-3-基)甲硫基]-苯甲酸、金精三羧酸中的一种或多种。
6.根据权利要求1或2所述的血液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂为抑肽酶、亮肽素，抗痛素、抑弹性蛋白酶醛、抑胃蛋白酶素、磷酰胺素中的一种或多种。
7.根据权利要求1或2所述的血液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，所述防腐剂为咪唑烷基脲。
8.根据权利要求1或2所述的血液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，所述抗凝剂为乙二胺四乙酸二钠、乙二胺四乙酸二钾、草酸钠、草酸钾、枸杞酸钠中的一种或多种。
9.根据权利要求1或2所述的血液中微生物核酸新型保存液，其特征在于，所述甲醛猝灭剂为精氨酸、赖氨酸、甘氨酸中的一种和乙二胺的混合物。
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|---|---|---|---|---|
| CN115413649A (zh) * | 2021-12-13 | 2022-12-02 | 南京兔牙生物科技有限公司 | 一种血浆保存液、采血管以及其在ctDNA检测中的用途 |
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