CN110387370A - 一种提取微量蝰蛇基因及其特异性检测方法 - Google Patents
一种提取微量蝰蛇基因及其特异性检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110387370A CN110387370A CN201910743574.0A CN201910743574A CN110387370A CN 110387370 A CN110387370 A CN 110387370A CN 201910743574 A CN201910743574 A CN 201910743574A CN 110387370 A CN110387370 A CN 110387370A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- adder
- primer pair
- pcr
- follows
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了提取微量蝰蛇基因及其特异性检测方法，属于生物技术领域。本发明通过提取微量蝰蛇组织及其毒素中基因，分别使用不同引物对作为特异性引物，获得PCR扩增产物，随后通过琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物经测序后为蝰蛇特异性基因序列。本发明的检测方法具有特异性高，稳定性好，检测迅速，易于操作等优点，有利于规模化和自动化检测分析，是快速、特异的鉴别蝰蛇及其毒素的一种方法。
Description
技术领域
本发明属生物技术领域，涉及国内常见毒蛇之一蝰蛇及其毒素微量基因提取及其检测方法。
背景技术
毒蛇伤害是一个全球性的公共卫生问题，可导致呼吸麻痹、致命性出血性败血症、不可逆性肾功能衰竭和导致永久性残疾的局部组织严重坏死。
圆斑蝰蛇，属蝰亚科蝰属，在我国主要分布于福建、广东、广西等地（赵尔宓．中国蛇类[M].合肥:安徽科学技术出版社,2006.148-149.），系血液毒类毒蛇，为中国十大毒蛇之一。圆斑蝰蛇咬伤后早期可导致严重的凝血功能障碍，易发生弥散性血管内凝血，颅内或内脏出血等并发症（张跃,唐荣德,李景新,et al.蝰蛇咬伤治疗期间肾功能指标动态变化分析[J].蛇志,2012,24(3).）。圆斑蝰蛇致死率为9.23%，仅次于眼睛王蛇和银环蛇（吴远冰,姚先明,伍侣新.抗蝰蛇毒血清治疗蝰蛇咬伤72例报告[J].蛇志,1996(2):43-45.）。
抗蛇毒血清是目前国内常用的治疗毒蛇咬伤的特效药物，目前我国常见的抗蛇毒血清包括抗蝮蛇毒血清、抗五步蛇毒血清、抗银环蛇毒血清、抗眼镜蛇毒血清等。但是在应用抗蛇毒血清治疗蛇伤之前必须根据肇事毒蛇种类选择正确种类的抗蛇毒血清，才能降低过敏反应的风险，提高毒素拮抗效率获得理想的疗效，否则将导致血清病等严重过敏反应的发生，错失救治的最佳时间。目前我国蛇伤临床诊断主要依靠病史和临床表现，缺乏快速、特异的实验室鉴别蛇毒种类的方法，往往造成治疗的盲目性。此前国内外尚未公布蝰蛇的全基因组序列，尚未见从样品尤其蛇毒中提取DNA 并扩增出靶标序列的特异性引物和方法。因此，本发明利用现代分子生物学技术，开发一种操作简单，快速鉴别，灵敏度高，特异性好的检测方法尤其重要。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于提供一种提取微量蝰蛇基因的方法。
本发明要解决的技术问题之二在于提供一种检测蝰蛇毒的PCR方法，该方法利用PCR技术使用特异性的引物扩增目的基因来鉴别蝰蛇及蝰蛇毒，本方法可以检测出来自样品的微量DNA，具有检测灵敏度高，方法快速，易操作的优点。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
在本发明的一方面，提供一种微量基因组DNA的提取方法，包括如下步骤：
步骤1，取适量圆斑蝰蛇组织或蝰蛇毒作为样品，置于离心管内，加入适量纯水及终浓度为100μg/ml的蛋白酶K，37℃孵育，离心；
步骤2，吸上清置于另一离心管内，随后加入等体积平衡酚，混匀，离心；
步骤3，吸取上清水相置于另一离心管内，加入等体积1：1混合平衡酚：氯仿，随后混匀，离心；
步骤4，吸取上清水相置于另一离心管内，加入等体积氯仿，混匀，离心；
步骤5，吸上清水相于另一离心管，加入2.5倍体积冷无水乙醇冷冻保存10min以上，离心；
步骤6，丢弃上清，室温凉干，加入纯水，室温溶解，备用。
作为本发明优选的技术方案，步骤1-步骤5中，所述离心的条件是12000g离心10min。
在本发明的另一方面，提供一种检测蝰蛇毒的PCR方法，包括如下步骤：
第一步，设计PCR引物序列和组合如下；
第二步，采用如权利要求1或2所述的方法提取微量蝰蛇毒基因DNA；
第三步，采用第一步设计的任意一对引物对和第二步骤的DNA模板，进行PCR扩增反应。
作为本发明优选的技术方案，第三步中，所述PCR扩增反应的PCR反应体系包括：总体积20μl，10XPCR 缓冲液2.0μl；10XdNTPs 2.0μl,0.2-1.5μl引物P-F1（终浓度：0.2μmol/l-1.5μmol/l）；0.2-1.5μl引物P-R1（终浓度：0.2μmol/l-1.5μmol/l）；0.4μl -2μl Taq酶（5U/μl, 终浓度：0.1 U/μl – 0.5U/μl）；DNA模板0.5μl；双蒸水10.5μl -14.7μl。
作为本发明优选的技术方案，第三步中，所述PCR扩增的PCR反应条件具体为：
采用引物对1，PCR反应条件为：
采用引物对2，PCR反应条件为：
采用引物对3，PCR反应条件为：
采用引物对4，PCR反应条件为：
采用引物对5，PCR反应条件为：
采用引物对6，PCR反应条件为：
采用引物对7，PCR反应条件为：
采用引物对8，PCR反应条件为：
作为本发明优选的技术方案，第三步所述PCR扩增反应通过琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图像可见扩增条带。
作为本发明优选的技术方案，第三步所述PCR扩增反应完成后，对PCR扩增产物进行测序，测序结果经blast分析结果显示皆为蝰蛇基因的特异性序列。
在本发明的另一方面，还提供快速检测蝰蛇及其毒素的特异性引物对，所述引物对选自以下引物对的任意一对，其序列为：
与现有技术相比，本发明的有益效果如下：本发明利用现代分子生物学技术，首次从圆斑蝰蛇组织或蝰蛇毒样品尤其蛇毒中提取基因组DNA，虽然经琼脂糖凝胶电泳难以检测出基因组DNA，但能够用于PCR检测。此外，通过设计多对引物对，并进行PCR扩增验证，但几对引物对PCR扩增出多条带或不能出扩增条带，特异性较差，难以或不适用于检测。而8对引物对扩增的产物条带单一，特异性较好，经测序，显示为蝰蛇的特异性基因序列。综上本发明是一种操作简单，快速鉴别，灵敏度高，特异性好，稳定性好的检测方法，有利于规模化和自动化检测分析，是快速、特异的鉴别蝰蛇及其毒素的一种方法。
附图说明：
图1是本发明实施例2中基因组DNA提取电泳凝胶图。泳道1-5依次为1:广西蝰蛇毒，2:云南蝰蛇毒，3:广东蝰蛇毒，4: 蝰蛇组织样本，5:DNA 分子量标准Ladder。
图2是本发明实施例3中基因组DNA PCR采用引物对1扩增后产物电泳凝胶图。 泳道1-5依次为1:广西蝰蛇毒，2:云南蝰蛇毒，3:广东蝰蛇毒，4: 蝰蛇组织样本，5:DNA 分子量标准Ladder。
图3是本发明实施例3中基因组DNA PCR采用引物对2扩增后产物电泳凝胶图。 泳道1-5依次为1:DNA 分子量标准Ladder，2:广西蝰蛇毒，3:云南蝰蛇毒，4:广东蝰蛇毒，5:蝰蛇组织样本。
图4是本发明实施例3中基因组DNA PCR采用引物对3扩增后产物电泳凝胶图。 泳道1-5依次为1:DNA 分子量标准Ladder，2:广西蝰蛇毒，3:云南蝰蛇毒，4:广东蝰蛇毒，5:蝰蛇组织样本。
图5是本发明实施例3中基因组DNA PCR采用引物对4扩增后产物电泳凝胶图。 泳道1-5依次为1:DNA 分子量标准Ladder，2:广西蝰蛇毒，3:云南蝰蛇毒，4:广东蝰蛇毒，5:蝰蛇组织样本。
图6是本发明实施例3中广西蝰蛇毒基因组DNA PCR分别采用引物对5，6，7，8扩增后产物电泳凝胶图。 泳道1-5依次为1: 引物对5 PCR扩增产物，2: 引物对6 PCR扩增产物，3: 引物对7 PCR扩增产物，4: 引物对8 PCR扩增产物，5:DNA 分子量标准Ladder。
图7是本发明实施例3中基因组DNA PCR采用引物对9扩增后产物电泳凝胶图。 泳道1-5依次为1:广西蝰蛇毒，2:云南蝰蛇毒，3:广东蝰蛇毒，4: 蝰蛇组织样本，5:DNA 分子量标准Ladder。
图8是本发明实施例3中基因组DNA PCR采用引物对10扩增后产物电泳凝胶图。 泳道1-5依次为1:DNA 分子量标准Ladder，2:广西蝰蛇毒，3:云南蝰蛇毒，4:广东蝰蛇毒，5:蝰蛇组织样本。
图9是本发明实施例3中基因组DNA PCR采用引物对11扩增后产物电泳凝胶图。 泳道1-5依次为1:DNA 分子量标准Ladder，2:广西蝰蛇毒，3:云南蝰蛇毒。
图10是本发明实施例3中基因组DNA PCR采用引物对12扩增后产物电泳凝胶图。泳道1-5依次为1:DNA 分子量标准Ladder，2:广西蝰蛇毒，3:云南蝰蛇毒，4:广东蝰蛇毒，5:蝰蛇组织样本。
具体实施方式
以下实施例来具体解释本发明，但实施例并不对本发明做任何限定。
实施例1：蝰蛇基因特异性引物设计
根据Gen Bank数据库中蝰蛇基因核苷酸序列，利用在线软件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）进行Blast同源性分析比较，筛选出保守且特异的核苷酸区域。运用引物设计软件对碱基序列做组成成分及稳定性等方面分析，并从引物设计等原则综合考虑，设计多对引物对，并交由上海生工合成，引物对序列如下：
表1
实施例2：微量基因组DNA提取
取适量圆斑蝰蛇组织或蝰蛇毒，置于离心管内，加入适量纯水及终浓度为100μg/ml PK(即蛋白酶K)，37℃孵育，12000g离心10min，吸上清置于另一离心管内，随后加入等体积平衡酚，振荡或颠倒彻底混匀，12000g离心10min，吸取上清水相置于另一离心管内，加入等体积1：1混合平衡酚：氯仿，随后振荡或颠倒彻底混匀，12000g离心10min，吸取上清水相置于另一离心管内，加入等体积氯仿，振荡或颠倒彻底混匀 ，12000g离心10min，吸上清水相于另一管，加入2.5倍体积冷无水乙醇冷冻保存10min以上，12000g离心10min，丢弃上清，室温凉干，加入10-20μl纯水，室温溶解，备用。
按照上述操作步骤，分别提取广西蝰蛇毒，云南蝰蛇毒，广东蝰蛇毒溶液的基因组DNA，同时提取圆斑蝰蛇组织样本用作对照。提取的基因组DNA用1%琼脂糖电泳检定，泳道1-4依次表示为广西蝰蛇毒，云南蝰蛇毒，广东蝰蛇毒和蝰蛇组织样本。泳道5为DNA 分子量标准Ladder，如图1所示，只有蝰蛇组织样本(泳道4)提取的基因组DNA能够在琼脂糖电泳中明显检出，蝰蛇毒提取的基因组DNA通过1%琼脂糖电泳未能检出。
实施例3：PCR 扩增反应
一 PCR 反应条件
PCR反应体系包括：总体积20μl，10XPCR 缓冲液2.0μl；10XdNTPs 2.0μl,0.2-1.5μl引物P-F（终浓度：0.2μmol/l-1.5μmol/l）；0.2-1.5μl引物P-R（终浓度：0.2μmol/l-1.5μmol/l）；0.4μl -2μl Taq酶（5U/μl, 终浓度：0.1 U/μl – 0.5U/μl）；DNA模板0.5μl；双蒸水10.5μl -14.7μl。
PCR反应条件为：
二 PCR反应条件优化
优选PCR反应体系为：总体积20μl，10X PCR 缓冲液2.0μl；10XdNTPs 2.0μl,引物P-F终浓度0.5μmol/l；引物P-R终浓度0.5μmol/l，Taq酶终浓度0.25U/μl；DNA模板0.5μl；双蒸水补足至20μl。
引物对1：优选的PCR反应温度和时间为：
引物对2优选的PCR反应温度和时间为：
引物对3优选的PCR反应温度和时间为：
引物对4优选的PCR反应温度和时间为：
引物对5优选的PCR反应温度和时间为：
引物对6 优选的PCR反应温度和时间为：
引物对7优选的PCR反应温度和时间为：
引物对8优选的PCR反应温度和时间为：
PCR扩增结果见图2至图10。利用琼脂糖凝胶电泳检测显示，引物对1-8（分别对应图2-图6）都能在蝰蛇基因组中扩增出特异性条带，且条带大小比较一致，无杂带，特异性较高。PCR扩增产物经上海生工测序，测序结果经blast分析结果显示皆为蝰蛇基因的特异性序列。引物对9-11（分别对应图7-图9）在蝰蛇基因组中扩增出多条带，特异性较差。引物对12（对应图10）在蝰蛇基因组中未能扩增出条带。本发明通过设计多对引物对，并进行PCR扩增验证，但引物对9-12的PCR扩增出多条带或不能出扩增条带，特异性较差，难以或不适用于检测。而8对引物对1-8扩增的产物条带单一，特异性较好，经测序，显示为蝰蛇的特异性基因序列。本发明设计了多对引物后比较多对引物的效果，发现其中某些引物（引物对1-8）的效果比较突出，是预料不到的。综上本发明是一种操作简单，快速鉴别，灵敏度高，特异性好的检测方法。
序列表
<110>上海赛伦生物技术股份有限公司
<120>一种提取微量蝰蛇基因的方法及其特异性检测方法
<130> WH-NP-19-100260
<160> 24
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 1
agcgtgcttt gagtataggc t 21
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 2
atggcaaaat gagagcccga 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 3
ctgaatggta aaataagtt 19
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 4
cgatatcccg ttctcaa 17
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 5
ggcttttgaa ctcggctggg 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 6
taaactgatg taagcctgcc 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 7
gctgggggac ccctcatctg 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 8
caatgtacca gtggtaataa 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 9
gagacataga cccttatata 20
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 10
aaaataacca cctcatcaaa aa 22
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 11
gcctcaagac ttcattactt 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 12
gatgatttta gattaccata t 21
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 13
gctgcaattc atccagggcc ccatt 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 14
ttgctttacc gtggagctaa cgcct 25
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 15
gttttctttt ctctcttctt 20
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 16
gcaaatatgg tagcagtagg cttt 24
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 17
agctttaagt ttggcactgg 20
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 18
gggatataga atatatgtac taat 24
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 19
tcccataacc tgaattataa 20
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 20
taataggagg gccgctattg ttgcta 26
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 21
gccatcggcg catccttatt 20
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 22
tacaaccacc catcctggta aa 22
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 23
ctacccccca taaaatttta agta 24
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(未知)
<220>
<221> misc_feature
<223> 引物
<400> 24
aagacctcct aatactgaca acc 23
Claims (8)
1.一种提取微量蝰蛇毒基因的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，取适量圆斑蝰蛇组织或蝰蛇毒作为样品，置于离心管内，加入适量纯水及终浓度为100μg/ml的蛋白酶K，37℃孵育，离心；
步骤2，吸上清置于另一离心管内，随后加入等体积平衡酚，混匀，离心；
步骤3，吸取上清水相置于另一离心管内，加入等体积1：1混合平衡酚：氯仿，随后混匀，离心；
步骤4，吸取上清水相置于另一离心管内，加入等体积氯仿，混匀，离心；
步骤5，吸上清水相于另一离心管，加入2.5倍体积冷无水乙醇冷冻保存10min以上，离心；
步骤6，丢弃上清，室温凉干，加入纯水，室温溶解，备用。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1-步骤5中，所述离心的条件是12000g离心10min。
3.一种检测蝰蛇毒的PCR方法，其特征在于，包括如下步骤：
第一步，设计PCR引物序列和组合如下；
第二步，采用如权利要求1或2所述的方法提取微量蝰蛇毒基因DNA；
第三步，采用第一步设计的任意一对引物对和第二步骤的DNA模板，进行PCR扩增反应。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：第三步中，所述PCR扩增反应的PCR反应体系包括：总体积20μl，10XPCR 缓冲液2.0μl；10XdNTPs 2.0μl,0.2-1.5μl引物P-F；0.2-1.5μl引物P-R；0.4μl -2μl Taq酶；DNA模板0.5μl；双蒸水10.5μl -14.7μl。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：第三步中，所述PCR扩增的PCR反应条件具体为：
采用引物对1，PCR反应条件为：
采用引物对2，PCR反应条件为：
采用引物对3，PCR反应条件为：
采用引物对4，PCR反应条件为：
采用引物对5，PCR反应条件为：
采用引物对6，PCR反应条件为：
采用引物对7，PCR反应条件为：
采用引物对8，PCR反应条件为：
。
6.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：第三步所述PCR扩增反应通过琼脂糖凝胶电泳检测，电泳图像可见扩增条带。
7.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：第三步所述PCR扩增反应完成后，对PCR扩增产物进行测序，测序结果经blast分析结果显示皆为蝰蛇基因的特异性序列。
8.快速检测蝰蛇及其毒素的特异性引物对，其特征在于，所述引物对选自以下引物对的任意一对，其序列为：
。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910743574.0A CN110387370A (zh) | 2019-08-13 | 2019-08-13 | 一种提取微量蝰蛇基因及其特异性检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910743574.0A CN110387370A (zh) | 2019-08-13 | 2019-08-13 | 一种提取微量蝰蛇基因及其特异性检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110387370A true CN110387370A (zh) | 2019-10-29 |
Family
ID=68288712
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910743574.0A Pending CN110387370A (zh) | 2019-08-13 | 2019-08-13 | 一种提取微量蝰蛇基因及其特异性检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110387370A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113801939A (zh) * | 2020-06-16 | 2021-12-17 | 上海赛伦生物技术股份有限公司 | 一种海蛇毒特异性检测方法和试剂盒 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104164493A (zh) * | 2014-07-21 | 2014-11-26 | 南方医科大学 | 基于dna条形码的鉴别赤链蛇的引物及pcr-rflp方法和试剂盒 |
| CN104164426A (zh) * | 2014-07-21 | 2014-11-26 | 晁志 | 扩增蝰科蛇类物种dna条形码coi序列的引物及pcr方法和试剂盒 |
-
2019
- 2019-08-13 CN CN201910743574.0A patent/CN110387370A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104164493A (zh) * | 2014-07-21 | 2014-11-26 | 南方医科大学 | 基于dna条形码的鉴别赤链蛇的引物及pcr-rflp方法和试剂盒 |
| CN104164426A (zh) * | 2014-07-21 | 2014-11-26 | 晁志 | 扩增蝰科蛇类物种dna条形码coi序列的引物及pcr方法和试剂盒 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| SMITH C F ET AL: "DNA barcodes from snake venom: a broadly applicable method for extraction of DNA from snake venoms", 《BIOTECHNIQUES》 * |
| SUNTRARACHUN ET AL: "Development of a polymerase chain reaction to distinguish monocellate cobra (Naja khouthia) bites from other common Thai snake species, using both venom extracts and bite-site swabs", 《TOXICON》 * |
| SUPIKAMOLSENI A ET AL: "Molecular barcoding of venomous snakes and species-specific multiplex PCR assay to identify snake groups for which antivenom is avaiable in Thailand", 《GENET MOL RES》 * |
| 肖树雄 等: "《中药现代检验新技术》", 31 January 2003 * |
| 蔡光先 等: "《单味中药超微饮片的质量标准研究》", 31 August 2007 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113801939A (zh) * | 2020-06-16 | 2021-12-17 | 上海赛伦生物技术股份有限公司 | 一种海蛇毒特异性检测方法和试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Løvendorf et al. | MicroRNA-223 and miR-143 are important systemic biomarkers for disease activity in psoriasis | |
| CN112501268A (zh) | 一种基于纳米孔测序的快速鉴别呼吸道微生物引物组、试剂盒及其应用 | |
| CN107557461A (zh) | 一种用于肝癌易感基因早筛的核酸质谱的检测方法 | |
| CN108977533B (zh) | 一种用于预测慢性乙肝炎症损伤的miRNA组合物 | |
| CN102634572A (zh) | 一种荧光定量RT-PCR检测融合基因E2A-PBX1 mRNA表达的试剂盒 | |
| Mlcochova et al. | Urinary microRNAs as a new class of noninvasive biomarkers in oncology, nephrology, and cardiology | |
| CN110387370A (zh) | 一种提取微量蝰蛇基因及其特异性检测方法 | |
| CN102925560A (zh) | HRM法检测突变型α-地中海贫血基因的试剂盒和方法 | |
| CN103937884A (zh) | 一种用于结核分枝杆菌检测的环介导等温扩增试剂盒及其使用方法 | |
| CN109628583B (zh) | 血浆/血清外泌体miRNA作为青光眼诊断标志物中的应用 | |
| CN109762883B (zh) | 血浆/血清外泌体hsa-miRNA-29-3p作为青光眼诊断标志物中的应用 | |
| CN110373457B (zh) | 一种用于溃疡性结肠炎诊断的mRNA标志物及其应用 | |
| CN102108420B (zh) | 一种检测登革1型病毒的荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN102399903B (zh) | 一种基孔肯雅病毒等温扩增检测试剂盒及其引物 | |
| CN111733227B (zh) | 特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用 | |
| CN110042161B (zh) | 一种用于筛查急性高原反应易感者的microRNA分子标志物及其应用 | |
| US11685950B2 (en) | Method of diagnosing and treating acute rejection in kidney transplant patients | |
| CN108315322A (zh) | 尿液ctDNA中EGFR基因突变位点的检测 | |
| CN111560422A (zh) | 一种靶向测序试剂盒和方法 | |
| US11021756B2 (en) | MiRNA markers for the diagnosis of osteosarcoma | |
| CN105331740A (zh) | 一种快速区分鸭甲肝病毒1型和3型pcr-hrm的引物和方法 | |
| CN107523641A (zh) | 血清miRNAs生物标志物及其筛选方法和应用 | |
| CN109880899B (zh) | hsa-miR-134-3p作为急性高原反应易感者分子标志物的应用和试剂盒 | |
| CN109868318B (zh) | hsa-miR-3654作为急性高原反应易感者分子标志物的应用和试剂盒 | |
| CN116064765B (zh) | 检测loxl1基因突变的物质在制备肝纤维化患者分子分型的产品中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20191029 |