CN109593824B - 一种游离核酸保存剂及采血保存装置 - Google Patents
一种游离核酸保存剂及采血保存装置 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109593824B CN109593824B CN201910006163.3A CN201910006163A CN109593824B CN 109593824 B CN109593824 B CN 109593824B CN 201910006163 A CN201910006163 A CN 201910006163A CN 109593824 B CN109593824 B CN 109593824B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- nucleic acid
- free nucleic
- blood
- cfdna
- acid preservative
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/24—Methods of sampling, or inoculating or spreading a sample; Methods of physically isolating an intact microorganisms
Abstract
本发明提供了一种游离核酸保存剂及相应采血保存装置,所述游离核酸保存剂是通过将所需量的以下试剂以无RNase酶活的纯净水溶解制备得到:谷氨酰胺10mg/ml、原钒酸钠8000mg/ml、亮抑酶肽5mg/ml、染料木黄酮5mg/ml、氟化铝1mg/ml、乙酰半胱氨酸40mg/ml、重氮烷基脲100mg/ml、EDTA‑3K 1.5mg/ml、EDDHA‑Na 0.8mg/ml、鼠李糖10mg/ml。本发明游离核酸保存剂能有效减缓血细胞的破裂,防止血细胞中的DNA稀释和污染目标cfDNA,同时阻止核酸酶降解目标cfDNA,提高含有目标游离核酸的血液样本的保存期。
Description
技术领域
本发明涉及血液检测领域,尤其涉及一种游离核酸保存剂及采血保存装置
背景技术
cfDNA(cell Free DNA)又称循环核酸,是指游离于细胞之外的DNA分子,这些DNA分子主要来源于正常细胞某些特定释放过程、细胞凋亡、细胞坏死、以及癌细胞生长浸润过程中的释放,其大小主要集中在几十到数百bp,半衰期在数小时左右。
血液中的cfDNA水平和种类与包括肿瘤在内的多种疾病相关,此外,在母体血液中也能找到胎儿的cfDNA。血液中的cfDNA检测已经被广泛用于各种癌症、某些自身免疫疾病如红斑狼疮的筛查,以及胎儿遗传疾病如唐氏综合征的无创检测。
目前,cfDNA检测实践中的一大问题在于血液样本的保存:一方面,保存过程中cfDNA不断被血液中的核酸酶降解;另一方面,更重要的是保存过程中血细胞的不断破裂释放的基因组DNA也在不断稀释cfDNA。因此,cfDNA的提取和检测应在采血后数小时完成才能保证结果准确,这给实际临床使用带来了很大的局限性,目前多采用含肝素、EDTA、表面活性剂、核酸酶抑制剂成分的保护剂/采血管在低温下保存血样,国产普通抗凝产品可以提供2日左右的保存时间,效果最好的Streck无创唐氏筛选真空采血管标注可以提供72h(常温)或长至120h(低温)保存时间。但这些现有的保护剂/采血管在保存时间和要求的保存条件上仍不能完全满足临床检测和研究的需要,特别是大规模疾病筛查和特殊地区/特殊疾病的检测要求,而且高性能采血管如Streck产品每只数十元的价格同样阻碍了cfDNA筛查/检测的广泛应用。
因此,寻找一种不使用特殊昂贵试剂,能在常温下长时间稳定保存血液,维持其中cfDNA状况的核酸保存剂并以此制备采血管等血液收集保存装置,对大规模推广cfDNA疾病筛查/检测具有重要意义。同时有助于克服cfDNA检测中细小操作/方法差异带来结果差异的不稳定弊端。
发明内容
针对背景技术中存在的问题,本发明提供一种游离核酸保存剂,防止游离核酸降解或被破坏以及血细胞破裂,提高保存期限;本发明的另一目的在于提供包含该游离核酸保存剂的采血保存管。
为了实现上述的发明目的,本发明采用了以下的技术方案:
一种游离核酸保存剂,包括如下组分制备得到:谷氨酰胺10-50mg/ml、原钒酸钠200-1000mg/ml、亮抑酶肽1-5mg/ml、染料木黄酮1-5mg/ml、氟化铝1-5mg/ml、乙酰半胱氨酸10-40mg/ml、重氮烷基脲100-500mg/ml、抗凝剂1-3mg/ml、膜保护剂5-20mg/ml。
进一步的改进,一种游离核酸保存剂包括如下组分制备得到:谷氨酰胺20-40mg/ml、原钒酸钠400-8000mg/ml、亮抑酶肽2-4mg/ml、染料木黄酮2-4mg/ml、氟化铝2-4mg/ml、乙酰半胱氨酸15-30mg/ml、重氮烷基脲200-400mg/ml、抗凝剂1.5-2.5mg/ml、膜保护剂8-15mg/ml
进一步的,所述的抗凝剂选择EDTA-3K和EDDHA盐中一种或多种,所述的膜保护剂选择山梨醇、鼠李糖、海藻糖中一种或多种。
进一步的,其中抗凝剂为EDTA-3K,膜保护剂为山梨醇和海藻糖。
进一步的,所述的山梨醇和海藻糖的质量比为1:2~2:1。
作为一个实施方式,一种游离核酸保存剂,包括如下组分制备得到:谷氨酰胺30mg/ml、原钒酸钠500mg/ml、亮抑酶肽3mg/ml、染料木黄酮3mg/ml、氟化铝3mg/ml、乙酰半胱氨酸20mg/ml、重氮烷基脲300mg/ml、EDTA-3K含量为2.0mg/ml,山梨醇含量为6mg/ml,海藻糖含量为6mg/ml。
进一步的,其中抗凝剂为EDTA-3K和EDDHA–Na,膜保护剂为鼠李糖。
进一步的,其中EDTA-3K和EDDHA–Na的质量比为1:1~4:1。
作为一个实施方式,一种游离核酸保存剂,包括如下组分制备得到:谷氨酰胺10mg/ml、原钒酸钠800mg/ml、亮抑酶肽5mg/ml、染料木黄酮5mg/ml、氟化铝1mg/ml、乙酰半胱氨酸40mg/ml、重氮烷基脲100mg/ml、EDTA-3K含量1.5mg/ml,EDDHA–Na含量为0.8mg/ml,鼠李糖含量为10mg/ml。
另一方面,本发明提供含有上述游离核酸保存剂的采血保存装置。
本发明游离核酸保存剂,有效减缓血细胞的破裂,防止血细胞中的DNA稀释和污染目标cfDNA,阻止核酸酶降解目标cfDNA,提高含有目标游离核酸的血液样本的保存期。
针对上述问题,申请人以选择新种类抗凝剂和膜保护剂为重点研究新型血液稳定剂。基于EDDHA中多种价键提供的独特螯合性能以及与血液/试剂中其他成分良好的兼容性申请人以部分EDDHA–Na替换常用抗凝剂EDTA-3K;基于鼠李糖、海藻糖对细胞低毒和高盐条件下良好的张力和表面活性剂性能,选用山梨醇、海藻糖、鼠李糖的膜保护剂。实验证明上述策略制成的新型游离核酸保存剂能实现优异的保护效果,使用本申请游离核酸保存剂的采血管保护性能优于市面上常用的国产肝素钠真空采血管以及价格高昂的进口真空采血管如Streck无创检测采血管,在常温下可以为cfDNA提供接近3周的保护时间,在4摄氏度低温下保存时间更长。
成本上,虽然EDDHA-Na和鼠李糖成本较EDTA、肝素、海藻糖稍高,但由于血液保存试剂中各试剂用量/成本占比很低,也不会对产品成本造成显著影响。
本领域技术人员可以理解,本申请核酸保存剂还可以包含如pH调节剂、等渗剂、防冻剂等其他试剂,具体种类本领域技术人员可以以常规知识合理选择和验证。
本领域技术人员可以同样可以理解,本申请核酸保存剂可用于多种类型的血液收集保存装置,包括但不限于玻璃类/塑料类材质采血管/真空采血管、采血袋、血液标本保存盒、血液检测仪器中的容器部件。
由于钾离子相比钠离子有更好的细胞保护作用,我们推测如果采用EDDHA-K(目前市场上尚无现有产品)可能会实现更好的保存效果。
具体实施方式
使用的试剂和仪器:
EDTA-3K、鼠李糖、海藻糖、山梨醇、谷氨酰胺、原钒酸钠、亮抑酶肽、染料木黄酮、氟化铝、乙酰半胱氨酸、重氮烷基脲、由SIGMA生产;
EDDHA–Na由TRC生产;
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit cfDNA提取试剂盒由Qiagen生产
引物由上海生工合成;
含有肝素锂的采血管由江苏康捷生产;
Streck无创真空采血管由Streck生产(抗凝剂,保护剂不明,推测为EDTA和糖类等);
其余试剂和仪器均为常规国产或进口型号。
在研究阶段试剂多采用知名进口试剂,本领域技术人员可以理解,出于价格/获取便利性等原因这些试剂可以被近似/更高品质的国产/进口试剂替代,实现的效果相同或近似。
实施例1试剂的配制
按照采用的抗凝剂不同,将配方分为三组,为简化因素起见,以下实验配方中均采用谷氨酰胺10mg/ml、原钒酸钠800mg/ml、亮抑酶肽5mg/ml、染料木黄酮5mg/ml、氟化铝1mg/ml、乙酰半胱氨酸40mg/ml、重氮烷基脲100mg/ml。下表显示的也仅是最后总结验证时使用的有代表性的成分配比,前期部分方向不对或无代表性的配比种类也未显示。
配制中将所需量的各种试剂以无RNase酶活的纯净水溶解。
表1基于EDTA-3K抗凝剂的配方
表2基于EDDHA–Na抗凝剂的配方
表3基于EDTA-3K和EDDHA–Na抗凝剂的配方
将上述核酸保存剂按照每毫升采血量0.02ml灌装入玻璃采血管中,抽真空,制成负压采血管。
实施例2各配方性能比较
征集3名22-25岁的男性志愿者(经过体检:血常规指标正常,无体检肿瘤指症,无炎症指症),分别采血170ml(配方1-14采血管、康捷肝素锂采血管、Streck无创真空采血管、空白玻璃采血管)。静置于23摄氏度室温恒温箱中保存直至开始实验。
在第0(采血后2小时内)、2、5、10、14、21日对每份样本进行如下检测:
溶血情况,检测414nm OD值。计算三个样本平均值。
按照试剂盒的说明使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit cfDNA提取试剂盒提取样品中的cfDNA,使用qPCR方法检测样本中的cfDNA总浓度,检测对象为GAPDH,引物序列为:上游引物5’-GAAGGTCGGAGTCAACGG-3’,下游引物:5’-GGAAGATGGTGATGGGATTT-3’,以基因组DNA为标准品,从Ct值换算cfDNA总量。计算三个样本平均值。
结果如下:
表4溶血情况
结果表明,除康捷肝素锂采血管和空白玻璃采血管外,其他采血管溶血状况在21日,特别是15日内均较好,效果最好的是Streck无创真空采血管以及基于EDTA-3K和EDDHA–Na抗凝剂的配方9-14。
表5 cfDNA含量
结果表明,EDTA-3K配合糖类保存效果均较好,特别是EDTA-3K与海藻糖和山梨醇的组合。虽然EDDHA–Na的螯合效果适合血液保存,但其中的钠离子的渗透过程对细胞损害较大(推测),单纯使用EDDHA–Na,特别是较高浓度的EDDHA–Na效果不佳。以一定比例组合EDDHA–Na和EDTA-3K效果较好,两者比例0.8:1.5时达到最佳。上述配方中有多个在21日尺度上仍然能维持DNA数量增长不超过50%,理论上应仍然可以用于cfDNA相关诊断。相比之下,康捷肝素锂采血管和空白玻璃采血管在第2日上均已由于细胞破裂释放基因组DNA严重干扰了cfDNA数量,Streck无创真空采血管在15日内效果较好,但在第20日时DNA数量已经增长到初期的3倍。
实施例3优选配方实际检测应用
将本申请的配方3、配方12保存剂制成的真空采血管与Streck无创真空采血管一同用于肿瘤患者EGFR T790M实际检测(QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit试剂盒提取cfDNA,EGFR Mutation Test试剂盒检测,操作按试剂盒标准流程),共涉及40名患者,每位患者使用三种采血管采样,采血后48小时内进行首次检测,常温保存14日和21日后再进行两次检测,比较检测结果。
表6 EGFR T790M检测结果
除配方3组中48小时内和14日三种保存方式的检测结果一致,在第21日Streck无创真空采血管出现了3例不一致(假阳性)的情况,而配方3和12检测结果仍然未改变。这初步证实了本申请配方3和12的核酸保存剂完全可以在常温下稳定血液样本中的游离核酸长达3周,检测结果仍然可靠。
此外,进行10位患者样本的低温保存实验(48小时内、14日、21日、30日),结果表明,配方12的核酸保存剂制成的采血管在4摄氏度保存30日后仍然能得到与48小时检测时相同的结果(突变:13例,无突变17例),而配方3与Streck无创真空采血管分别在30日和21日时出现了2例和2例假阳性情况。配方12的核酸保存剂经过进一步优化和统计完全可以再次扩展使用时间范围。
Claims (2)
1.一种游离核酸保存剂,其特征在于,所述游离核酸保存剂是通过将所需量的以下试剂以无RNase酶活的纯净水溶解制备得到:谷氨酰胺10mg/ml、原钒酸钠800mg/ml、亮抑酶肽5mg/ml、染料木黄酮5mg/ml、氟化铝1mg/ml、乙酰半胱氨酸40mg/ml、重氮烷基脲100mg/ml、EDTA-3K 1.5mg/ml、EDDHA-Na 0.8mg/ml、鼠李糖10mg/ml。
2.一种采血保存装置,其特征在于,所述采血保存装置含有根据权利要求1所述的游离核酸保存剂。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910006163.3A CN109593824B (zh) | 2019-01-04 | 2019-01-04 | 一种游离核酸保存剂及采血保存装置 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201910006163.3A CN109593824B (zh) | 2019-01-04 | 2019-01-04 | 一种游离核酸保存剂及采血保存装置 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109593824A CN109593824A (zh) | 2019-04-09 |
CN109593824B true CN109593824B (zh) | 2022-03-18 |
Family
ID=65964926
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201910006163.3A Active CN109593824B (zh) | 2019-01-04 | 2019-01-04 | 一种游离核酸保存剂及采血保存装置 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109593824B (zh) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN109566602A (zh) * | 2019-01-04 | 2019-04-05 | 宁波艾捷康宁生物科技有限公司 | 一种红细胞保存液及保存装置 |
CN111363793A (zh) * | 2020-03-27 | 2020-07-03 | 宁波艾捷康宁生物科技有限公司 | 一种免提取全血pcr扩增反应体系及其扩增试剂盒和扩增方法 |
CN112322615B (zh) * | 2020-11-18 | 2022-08-19 | 威高集团有限公司 | 核酸保存液、核酸提取保存液、采血管和提取核酸的方法 |
Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1108964A (zh) * | 1993-11-19 | 1995-09-27 | 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 | 液体分离装置与方法 |
CN106900692A (zh) * | 2017-03-06 | 2017-06-30 | 上海迅伯生物科技有限公司 | 一种血液dna的保存剂组合物 |
CN108244094A (zh) * | 2016-12-28 | 2018-07-06 | 江苏为真生物医药技术股份有限公司 | 血液保存剂及其配套的采血管 |
CN108342381A (zh) * | 2017-01-24 | 2018-07-31 | 梁建国 | 一种用于稳定保存外周血中循环游离dna的溶剂 |
WO2018145005A1 (en) * | 2017-02-03 | 2018-08-09 | Streck, Inc. | Sample collection tube with preservative |
CN109055353A (zh) * | 2018-07-17 | 2018-12-21 | 无锡百泰克生物技术有限公司 | 一种血液游离dna的保护剂 |
-
2019
- 2019-01-04 CN CN201910006163.3A patent/CN109593824B/zh active Active
Patent Citations (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1108964A (zh) * | 1993-11-19 | 1995-09-27 | 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 | 液体分离装置与方法 |
CN108244094A (zh) * | 2016-12-28 | 2018-07-06 | 江苏为真生物医药技术股份有限公司 | 血液保存剂及其配套的采血管 |
CN108342381A (zh) * | 2017-01-24 | 2018-07-31 | 梁建国 | 一种用于稳定保存外周血中循环游离dna的溶剂 |
WO2018145005A1 (en) * | 2017-02-03 | 2018-08-09 | Streck, Inc. | Sample collection tube with preservative |
CN106900692A (zh) * | 2017-03-06 | 2017-06-30 | 上海迅伯生物科技有限公司 | 一种血液dna的保存剂组合物 |
CN109055353A (zh) * | 2018-07-17 | 2018-12-21 | 无锡百泰克生物技术有限公司 | 一种血液游离dna的保护剂 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109593824A (zh) | 2019-04-09 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109593824B (zh) | 一种游离核酸保存剂及采血保存装置 | |
CN107083382B (zh) | 一种用于保护游离dna的血液保存剂及其应用 | |
JP2020100652A (ja) | 周囲温度における血液サンプル中の変性されていないポリペプチド、核酸、およびエキソソームの安定化 | |
CN109679946B (zh) | 一种血液病毒rna保护剂及采血管 | |
CN106614525A (zh) | 一种细胞保存液及其制备方法和使用方法 | |
EP4116401A1 (en) | Storage container for cell-containing solution and storage solution | |
CN109055353A (zh) | 一种血液游离dna的保护剂 | |
CN107509722A (zh) | 样本保存液 | |
CN108949748B (zh) | 一种痰液液化及核酸保护试剂 | |
CN110859177A (zh) | 一种宫颈细胞保存液及其制备方法和宫颈细胞保存方法 | |
CN104041484A (zh) | 一种细胞保存液 | |
CN109750087A (zh) | 一种血液cfDNA提取试剂盒 | |
US20130059330A1 (en) | Fixing solution for biological cells | |
CN105716917B (zh) | 一种用于保护并稳定粪便中血红蛋白的收集液及其应用 | |
CN112322615B (zh) | 核酸保存液、核酸提取保存液、采血管和提取核酸的方法 | |
CN109852539A (zh) | 一种血液游离dna保存管 | |
WO2021216353A1 (en) | Nucleic acid and cell preservative compositions and methods of use | |
CN110616218B (zh) | 血液rna保存液及其制备方法、血液rna保存管、保存提取方法 | |
CN113265443A (zh) | 血液游离dna保护试剂、保护方法和采血管 | |
US20230046381A1 (en) | Nucleic acid and cell preservative compositions and methods of use | |
CN106047864B (zh) | 一种血液中提取rnc-rna的rnc固定剂及其提取方法 | |
CN102620950B (zh) | 血小板护维剂 | |
CN114467914B (zh) | 一种细胞保存液及其制备方法和应用 | |
CN113373031B (zh) | 一种喷雾型的游离dna样本保存管及应用 | |
WO2023288115A1 (en) | Preservative composition for nucleic acids and biological samples and methods of use |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |