CN114467914B - 一种细胞保存液及其制备方法和应用 - Google Patents

一种细胞保存液及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种细胞保存液及其制备方法和应用。该细胞保存液将特定的缓冲体系KH2PO4‑NaOH与特定种类、比例的渗透压维持剂、粘液溶解剂等组分进行组合，使得所述细胞保存液能够有效降低细胞保存过程中核酸的降解，便于后续核酸研究，可实现‑80℃～30℃条件下对细胞的稳定保存。实验结果显示，在10‑30℃下可稳定保存宫颈脱落细胞长达6个月。同时，本发明提供的细胞保存液的制备方法操作简单，成本低廉，便于工业化生产。

Description

一种细胞保存液及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医学检测技术领域，尤其涉及一种细胞保存液及其制备方法应用。
背景技术
全球范围的研究结果显示，在99.7％的宫颈癌患者体内检测到高危型HPV(humanpapillomavirus)DNA的存在，将HPV用作检测宫颈癌的指标可提高诊断准确率，保证患者得到最及时的治疗。
检测HPV的方法主要有巴氏涂片、原位杂交、细胞学检测、HPV核酸检测等。目前，HPV核酸检测以及TCT检测是比较有效的检测方法，在宫颈癌筛查中发挥着很大的作用。HPV核酸检测的成效在宫颈癌预防的各个领域均已得到证实，包括宫颈癌初级筛查、对细胞学异常不确定的患者进行筛选，以及治疗后的随访等。
液基细胞学技术是将细胞收集于保存液中以维持细胞形态，然后通过自动化检测系统技术制备细胞涂片并进行细胞学检测的过程，是现在较为先进的宫颈细胞检测技术。液基细胞学技术具有代表性的便是TCT(ThinPrep Cytology Test)，该技术在1996年已被美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准用于临床，相对于常规的巴氏涂片而言，TCT提高了宫颈异常细胞的检出率，能够检测出更多的癌前病变，已被广泛应用于宫颈癌筛查。HPV核酸检测包括PCR-荧光探针法或其他分子生物学方法在内的核酸检测技术，以特定HPV核酸(包括DNA和RNA)序列为检测目的，对人宫颈样本(如人宫颈脱落上皮细胞或分泌物等)进行体外定性检测。
因此，无论是对于HPV核酸检测还是细胞学检测，宫颈脱落细胞的保存都至关重要，否则会影响后续检查的结果。国内外许多厂家已经研发出多种宫颈细胞保存液以便于保存细胞，保证细胞的DNA以及HPV DNA的完整性。但市场上大多数细胞保存液用于细胞学检测，能够很好地保存细胞结构，对于HPV核酸的保存存在一定不足。并且现有大多数细胞保存液样本保存时间较短，便会导致检出率较低，影响判断。
在公开号为CN101999343A的专利申请中，提供了一种细胞保存液，包括固定剂、固定剂辅助剂、抗凝剂、缓冲液、以及离子维持剂，其中：固定剂为甲醇、乙醇或异丙醇(45％-60％，v/v)、固定剂辅助剂为醋酸或醋酸盐(0.1％-15％，w/w)、抗凝剂为EDTA或EDTA的水溶性盐(0.01％-1.5％，w/w)、缓冲液为磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液等、以及离子维持剂为NaCl或KCl(0.01％-1％，w/w)，虽然能够有效地保存DNA，但保存时间不够长。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种细胞保存液及其制备方法和应用。该细胞保存液在10-30℃下可稳定保存宫颈脱落细胞长达6个月。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
一种细胞保存液，每100ml细胞保存液由如下组分组成：
Figure BDA0003429825640000021
甲醇、乙醇为固定剂，可以快速对细胞进行固定，能够有效地保留细胞的形态结构，有助于核酸的稳定性保存，以便更好地检测细胞。
EDTA·2Na为抗凝剂，能够有效防止细胞堆积，便于细胞分散。
KH2PO4和NaOH构成本发明细胞保存液的缓冲体系，本发明采用特定的缓冲体系KH2PO4-NaOH缓冲液，能够保持细胞保存液的pH值稳定，以便维持细胞形态，除此之外，申请人研究发现该缓冲体系相比其他缓冲体系，如磷酸二氢钾-磷酸氢二钠缓冲液等，更有利于DNA的稳定保存，对保存期更长，便于后续核酸检测。
KCl或NaCl为渗透压维持剂，能够调节细胞保存液内Na+、K+浓度以调节溶液的渗透压，从而有效维持细胞形态。
Tween20、N-乙酰-L-半胱氨酸为粘液溶解剂，减少粘液对后续核酸检测的影响。
本发明缓冲体系合理搭配特定种类、比例的渗透压维持剂、粘液溶解剂等组分，获得细胞保存液能够有效降低细胞保存过程中核酸的降解，便于后续核酸研究，可实现-80℃～30℃条件下对细胞的稳定保存，有效解决了现有技术保存液常温保存时间短的问题，该细胞保存液对脱落的宫颈细胞的保存效果尤为明显。实验表明，该细胞保存液在10-30℃下可稳定保存宫颈脱落细胞长达6个月。
一些实施方案中，每100ml细胞保存液由如下组分组成：
Figure BDA0003429825640000031
一些实施方案中，每100ml细胞保存液由如下组分组成：
Figure BDA0003429825640000032
Figure BDA0003429825640000041
一些实施方案中，每100ml细胞保存液由如下组分组成：
Figure BDA0003429825640000042
一些实施方案中，所述防腐剂为Proclin300和/或Proclin950，一些具体实施例中，防腐剂包括Proclin300和Proclin950，该防腐剂能够有效地杀灭样品中的细菌、真菌、酵母菌等病原体，以延长细胞保存液的保存时间。
一些实施方案中，所述消泡剂为硅酮，该消泡剂消泡能力强，用量少，同时不影响细胞保存液的基本性质，能够有效减少震荡过程中产生的气泡。
本发明还提供一种细胞保存液的制备方法，包括：
1)将KH2PO4、NaOH溶解于水中，获得KH2PO4-NaOH缓冲液；
2)将Tween-20、EDTA·2Na、KH2PO4、NaOH、NaCl、KCl、防腐剂、N-乙酰-L-半胱氨酸、消泡剂加入到所述KH2PO4-NaOH缓冲液中，混匀；再加入甲醇、乙醇，混匀，获得细胞保存液。
本发明还提供了所述的细胞保存液在保存细胞中的应用，或在制备检测HPV的试剂中的应用。
一些实施方案中，所述细胞为脱落细胞，优选为宫颈脱落细胞。
本发明提供的细胞保存液主要用于保存宫颈脱落细胞，可在-80℃～30℃条件下进行保存，在10-30℃下可稳定保存6个月。
本发明还提供了一种细胞的保存方法，利用所述的细胞保存液保存细胞。
本发明还提供了一种检测HPV的试剂盒，包括本发明所述的细胞保存液。
本发明将特定的缓冲体系与等其他组分组合获得细胞保存液，该细胞保存液有效降低细胞保存过程中核酸的降解，便于后续核酸研究，可实现-80℃～30℃条件下对细胞的稳定保存。实验结果显示，在10-30℃下可稳定保存宫颈脱落细胞长达6个月。同时，本发明提供的细胞保存液的制备方法操作简单，成本低廉，便于工业化生产。
附图说明
图1示实施例1细胞保存液在不同保存时间下的细胞样品的DNA检测结果；
图2示实施例2细胞保存液在不同保存时间下的细胞样品的DNA检测结果；
图3示实施例3细胞保存液在不同保存时间下的细胞样品的DNA检测结果；
图4示对比例1细胞保存液在不同保存时间下的细胞样品的DNA检测结果；
图5示对比例2细胞保存液在不同保存时间下的细胞样品的DNA检测结果。
具体实施方式
本发明提供了一种细胞保存液及其制备方法和应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
每100ml细胞保存液组成如下：
甲醇：8ml、乙醇：32ml、Tween-20：0.2ml、EDTA·2Na：0.1g、KH2PO4：0.407g、NaOH：0.071g、NaCl：0.3g、KCl：0.1g、Proclin300：0.001ml、Proclin950：0.001m；、N-乙酰-L-半胱氨酸：0.2g、硅酮消泡剂0.001ml，超纯水：定容至总体积100ml；调pH值为6.0。
制备方法：
将所述的KH2PO4、NaOH溶解于水中，获得KH2PO4-NaOH缓冲液；
将Tween-20、EDTA·2Na、KH2PO4、NaOH、NaCl、KCl、防腐剂、N-乙酰-L-半胱氨酸、消泡剂加入到所述KH2PO4-NaOH缓冲液中，混匀；再加入甲醇、乙醇，混匀，获得细胞保存液。
实施例2
每100ml细胞保存液组成如下：
甲醇：10ml、乙醇：30ml、Tween-20：0.2ml、EDTA·2Na：0.1g、KH2PO4：0.407g、NaOH：0.071g、NaCl：0.3g、KCl：0.1g、Proclin300：0.001ml、Proclin950：0.001ml、N-乙酰-L-半胱氨酸：0.2g、硅酮消泡剂0.001ml，超纯水：定容至总体积100ml；调PH值为6.5。
制备方法同实施例1。
实施例3：
每100ml细胞保存液组成如下：
甲醇：15ml、乙醇：25ml、Tween-20：0.2ml、EDTA·2Na：0.1g、KH2PO4：0.407g、NaOH：0.071g、NaCl：0.3g、KCl：0.1g、Proclin300：0.001ml、Proclin950：0.001ml、N-乙酰-L-半胱氨酸：0.2g、硅酮消泡剂0.001ml，超纯水：定容至总体积100ml；调PH值为7.0。
对比例1
组成：
甲醇：10ml、乙醇：30ml、Tween-20：0.2ml、EDTA·2Na：0.1g、KH2PO4：0.217g、Na2HPO4：1.277g、NaCl：0.3g、KCl：0.1g、Proclin300：0.001ml、Proclin950：0.001ml、N-乙酰-L-半胱氨酸：0.2g、硅酮消泡剂0.001ml，超纯水：定容至总体积100ml；调PH值为6.5。
制备方法同实施例1。
对比例2
组成如下：
甲醇：5ml、乙醇：35ml、Tween-20：0.2ml、EDTA·2Na：0.1g、KH2PO4：0.407g、NaOH：0.071g、NaCl：0.3g、KCl：0.1g、Proclin300：0.001％、Proclin950：0.001％、N-乙酰-L-半胱氨酸：0.2g、硅酮消泡剂0.001ml，超纯水：定容至总体积100ml；调PH值为5.5。
制备方法同实施例1。
测试例1
采用本发明提供的细胞保存液对宫颈脱落细胞进行保存，并在37℃条件下进行加速试验，采用本公司高危型人乳头瘤病毒核酸检测与1618分型试剂盒(PCR-荧光探针法)进行HPV DNA检测，下表为采用实施例1细胞保存液保存宫颈脱落细胞的加速试验，在不同加速试验点进行样本提取扩增，其对应Ct值，根据阿伦尼乌斯公式可推算出此保存液可保存宫颈脱落细胞至6个月。
表1实施例1保存液扩增结果
0天 3天 7天 14天 21天 28天 35天 42天
样本1 29.85 30.19 29.62 30.44 29.64 29.39 30.71 30.35
样本2 27.91 28.04 27.56 28.07 27.83 27.7 27.63 27.86
样本3 29.52 29.77 30.01 30.36 29.14 29.77 29.96 29.68
表2为实施例2中保存宫颈脱落细胞室温保存试验，在不同加速试验点进行样本提取扩增，其对应Ct值，结果表明此保存液可保存宫颈脱落细胞至6个月。
表2实施例2保存液扩增结果
Figure BDA0003429825640000071
Figure BDA0003429825640000081
表3为实施例3中保存宫颈脱落细胞加速试验，在不同加速试验点进行样本提取扩增，其对应Ct值，根据阿伦尼乌斯公式可推算出此保存液可保存宫颈脱落细胞至6个月。
表3实施例3保存液扩增结果
0天 3天 7天 14天 21天 28天 35天 42天
样本1 26.67 26.46 26.61 26.28 27.16 26.93 26.65 26.83
样本2 31.38 32.31 31.12 32.17 31.67 31.97 31.38 32.18
样本3 31.02 31.15 32.01 30.67 30.83 31.63 30.73 31.02
样本4 28.09 28.04 28.34 27.58 28.36 28.02 28.13 27.73
表4为对比例1保存宫颈脱落细胞加速试验，在不同加速试验点进行样本提取扩增，其对应Ct值，结果各实验Ct值变化较大，DNA有所降解，此保存液保存样本不稳定。
表4对比例1保存液扩增结果
0天 1天 3天 5天 7天 10天
样本1 28.49 29.14 29.17 30.05 30.52 31.17
样本2 28.78 29 29.14 30.33 31.32 29.26
样本3 29.15 28.53 29.12 29.72 31.45 30.89
表5为对比例2中保存宫颈脱落细胞加速试验，在不同加速试验点进行样本提取扩增，其对应Ct值，结果各实验Ct值变化较大，DNA有所降解，此保存液保存样本不稳定。
表5对比例2保存液扩增结果
0天 3天 7天 14天
样本1 23.75 25.21 24.8 25.32
样本2 23.66 25.2 25.16 25.21
样本3 27.72 28.77 28.84 28.96
样本4 30.24 32.68 31.57 无Ct
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种细胞保存液，其特征在于，每100ml细胞保存液由如下组分组成：
Figure FDA0004044453670000011
所述防腐剂为Proclin300和/或Proclin950；所述消泡剂为硅酮；pH为6.0～7.0。
2.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，每100ml细胞保存液由如下组分组成：
Figure FDA0004044453670000012
pH为6.5。
3.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，每100ml细胞保存液由如下组分组成：
Figure FDA0004044453670000013
/>
Figure FDA0004044453670000021
pH为7.0。
4.根据权利要求1所述的细胞保存液，其特征在于，每100ml细胞保存液由如下组分组成：
Figure FDA0004044453670000022
pH为6.0。
5.权利要求1～4任一项所述的细胞保存液的制备方法，其特征在于，包括：
1)将KH2PO4、NaOH溶解于水中，获得KH2PO4-NaOH缓冲液；
2)将Tween-20、EDTA·2Na、KH2PO4、NaOH、NaCl、KCl、防腐剂、N-乙酰-L-半胱氨酸、消泡剂加入到所述KH2PO4-NaOH缓冲液中，混匀；再加入甲醇、乙醇，混匀，获得细胞保存液。
6.权利要求1～4任一项所述的细胞保存液在保存细胞中的应用，或在制备检测HPV的试剂中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述细胞为宫颈脱落细胞。
8.一种细胞的保存方法，其特征在于，利用权利要求1～4任一项所述的细胞保存液保存细胞。
9.一种检测HPV的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～4任一项所述的细胞保存液。
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SE01 Entry into force of request for substantive examination
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GR01 Patent grant
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