CN115176798A - 一种液基细胞保存液及其配制方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种液基细胞保存液及其配制方法和应用，属于生物提取技术领域，液基细胞保存液包括pH缓冲液、渗透压维持剂、固定剂、抑菌剂、粘液消化剂、核酸保护剂及红细胞溶解剂；配制时，首先将渗透压维持剂、核酸保护剂、粘液消化剂加入pH缓冲液中，混合均匀后，再加入固定剂、抑菌剂和红细胞溶解剂。本发明的液基细胞保存液在保存宫颈脱落细胞时，可长时间保存细胞，确保细胞形态完整，并且能够保护核酸，提高TCT检查的阳性率；同时本发明的液基细胞保存液的原料和加工配制成本低、易于推广，可替代进口产品。

Description

一种液基细胞保存液及其配制方法和应用
技术领域
本发明属于生物提取技术领域，具体涉及一种液基细胞保存液及其配制方法和应用。
背景技术
作为宫颈病变的筛查方法，传统的巴氏涂片涉及到的取材、涂片质量、细胞分离等诸多过程都会严重降低细胞的阳性率。液基薄层细胞学检测技术（TCT）改变了以往巴氏涂片的操作方法，它将采集到的细胞几乎全部保存到保存液里，同时处理掉杂质，制出背景干净清晰、细胞重叠少、无退变或退变轻微的薄层细胞涂片。采用液基薄层细胞学检测技术对异常细胞的诊断正确率提高了13%，对鳞状上皮以上病变的检出率提高了65%，具有传统涂片无法比拟的优点。
TCT技术已成为宫颈癌筛检的最好方法之一，为宫颈癌的早期诊断和治疗提供了非常明确的诊断依据。TCT技术中最为关键的环节为液基细胞保存液，因此开发出合适的宫颈脱落细胞保存液尤为重要。目前，市场上出现了专门用于脱落细胞保存的溶液，如美国FDA1996年批准的新柏氏（ThinPrep Cytology Test）和1999年批准的Autocyte Prep（现称为SurePath，TripPath Imaging，Burlington，NC，现属于BD诊断公司），但是这些液基细胞保存液几乎无一例外存在：1、成本昂贵；2、宫颈粘液分解不充分，导致细胞重叠较多；3、不能溶解血细胞处理，同时有引起细胞核缩小的现象；4、细胞保存时间短；5、细胞的核酸容易降解等问题，这些缺点严重影响了TCT技术的应用和推广。
发明内容
本发明的目的在于解决上述TCT技术中的不足，提供一种细胞形态和核酸保存时间长、血细胞和黏液处理效果好，并且性价比更高的液基细胞保存液。
为了实现上述目的，本发明公开了一种液基细胞保存液，又称为脱落细胞保存液，包括pH缓冲液、渗透压维持剂、固定剂、抑菌剂、粘液消化剂、核酸保护剂及红细胞溶解剂；固定剂用于维持细胞的形态。
其中，pH缓冲液为MES（4-吗啉乙磺酸）、Bis-Tris（双(2-羟甲基)氨基-三(羟甲基)甲烷）、MOPS（3-吗啉丙磺酸）、PIPES（1,4-哌嗪二乙磺酸）中的一种或多种的混合物；优选的，pH缓冲液为浓度为10-50mmol/L的PIPES缓冲液；
其中，渗透压维持剂为氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠及葡萄糖等中的一种或多种的混合物；优选的，渗透压维持剂为质量百分数为4.4-5.5%的葡萄糖溶液。
其中，固定剂为无水乙醇、甲醇及多聚甲醛中的一种或多种的混合物；优选的，固定剂为体积百分数为45-65%的甲醇。
其中，抑菌剂为Proclin 150、Proclin 200、Proclin 300及Proclin 5000中的一种或多种的混合物；优选的，抑菌剂为体积百分数为0.01%-0.05%的Proclin300。
其中，粘液消化剂为DTT（二硫苏糖醇）、EDTA（乙二胺四乙酸二纳）、TCEP中的一种或多种；优选的，粘液消化剂为质量百分数为0.1%-0.5%的DTT和质量百分数为0.1%-0.5%的EDTA 的组合。
其中，核酸保护剂为焦磷酸二乙酯、氧钒核糖核苷复合物、RNA酶抑制剂（RNasin）、尿素、SDS、TCEP中的一种或多种；优选的，所述的核酸保护剂为0.1-10mmol/L的TCEP。
其中，红细胞溶解剂为Triton X-100、NP40及Tween 20中的一种或多种的混合物；优选的，红细胞溶解剂为体积百分数为0.01%-0.5%的Triton X-100。
本发明中，PIPES（哌嗪-1,4-二乙磺酸）的pKa接近生理pH值，因此PIPES非常适合用于生物pH缓冲液，如细胞培养等。
葡萄糖不能自由通过细胞膜，5%葡萄糖的渗透压为278mmol/L，人体的等渗环境为280-320mmol/L，两者相差不大，因此以5%左右的葡萄糖作为渗透压维持剂，能够维持环境渗透压和细胞形态稳定。
醇或醛作为固定剂，具有固定细胞的作用，其中甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态并保持细胞的活性，甲醇还可以提高细胞对染料的吸收作用，有利于后续的细胞染色。
Proclin系列的抑菌剂还具有防腐功能，与细胞接触几分钟后，即可渗透到细胞膜内并抑制微生物KREBS循环的核心酶，从而引起微生物内能量水平迅速下降，导致微生物能量代谢崩溃，其中Proclin300对下游的诊断用酶和抗体（比如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、IgM等）活性无影响，并且对人畜无害，因此Proclin300是理想的液基细胞保存液的抑菌剂。
宫颈粘液的主要成分为粘蛋白，而粘蛋白的粘性主要由分子间二硫键和一些金属离子维持，TCEP和DTT能够破坏粘蛋白的分子间二硫键和细胞间连丝，从而达到消化粘液的目的。而EDTA能够螯合金属离子，从而破坏细胞间的连接，也在一定程度上协助消化粘液。细胞离体后，核酸酶包括DNase和RNase很快就会发生作用导致核酸降解，而核酸酶的活性中心需要二硫键来维持，当二硫键处于还原状态下时，核酸酶将失去作用。TCEP和DTT是一种还原剂，能将-SH基保持在还原态，常用于还原蛋白和多肽中的二硫键。TCEP还原能力很强，在pH2.5-11的范围均具有很好的稳定性，并且TCEP的刺激性和毒性都处于安全水平。虽然TCEP是理想的核酸保护剂和粘液消化剂，但是浓度太高容易导致细胞形态变化。综上所述，TCEP和DTT具有相似的作用，为了达到消化粘液、抑制核酸酶同时保持细胞形态的目的，本发明选择DTT、EDTA和TCEP组合，这样一方面可以降低TCEP的使用浓度以保持细胞形态，另一方面可以充分消化粘液同时保护核酸不被降解。
非离子表面活性剂如Triton X-100、NP40和Tween 20都是比较温和的去垢剂，其中Triton X-100一方面可以提高真核细胞的通透性但不破坏核膜，从而使上皮细胞的核在上述5%葡萄糖形成的等渗环境中更加稳定；另一方面具有裂解细胞的作用，在0.1%的浓度时即可迅速溶解红细胞。在这两方面作用下，从而达到溶解血细胞的同时有效保护细胞核的形态。
本发明同时还要求保护一种上述液基细胞保存液的配制方法，包括如下步骤：
（1）配制pH缓冲液，备用；
（2）在pH缓冲液中，加入配方量的渗透压维持剂、核酸保护剂、粘液消化剂，溶解并混合均匀；
（3）向步骤（2）的溶液中加入固定剂、抑菌剂和红细胞溶解剂，溶解并混合均匀；
（4）用pH缓冲液加入步骤（3）的溶液中，补充至所需体积。
本发明同时还要求保护一种上述液基细胞保存液在保存宫颈脱落细胞中的应用。采用本发明的液基细胞保存液保存宫颈脱落细胞时，在粘液消化剂的作用下充分消化宫颈粘液，使宫颈液基细胞充分分散；在消化粘液的同时，红细胞溶解剂溶解红细胞；在粘液消化剂和溶细胞溶解剂的作用下，保证了在进行TCT检查时细胞处于薄层状态并且背景更干净，从而提高宫颈鳞状上皮内病变的检出率；在pH缓冲液、渗透压维持剂、细胞形态固定剂以及抑菌剂的作用下，达到较长时间内保存和固定细胞的目的；同时，核酸保护剂抑制核酸酶，实现了在一定时间内达到保存DNA的目的。
与现有技术相比，本发明的液基细胞保存液及其配制方法和应用具有如下优点：
（1）本发明的液基细胞保存液中，各组分均为常规化学品，且配制方法简单，因此原料和加工配制成本低，易于推广。
（2）本发明的液基细胞保存液在保存宫颈脱落细胞时，可在常温下最长可达28天保存细胞；同时，细胞形态完整，胞浆与细胞核分界清楚、层次分明，胞浆与细胞核透亮性好。
（3）本发明的液基细胞保存液在保持宫颈脱落细胞形态的同时，还能保护核酸，在最长28天的时间，HPV、衣原体和支原体等微生物的核酸不降解。
（4）本发明的液基细胞保存液能充分溶解粘液，释放有诊断价值的细胞成分、减少细胞重叠。
（5）本发明的液基细胞保存液可以破坏红细胞，提高制片背景的清晰度。
综上所述，一方面，本发明的液基细胞保存液能够提高TCT检查的阳性率，同时增加了细胞以及核酸的保存时间，使液基细胞样本的长途转运成为可能，保证了涂片常规染色之外的其他技术的顺利开展；另外一方面，本发明的液基细胞保存液的配制成本低、易于推广，可以替代进口产品。
附图说明
图1：样本1的宫颈脱落细胞在本发明的保存液中保存不同时间后的细胞形态保存效果图。
图2：样本2的宫颈脱落细胞在本发明的保存液中保存不同时间后的细胞形态保存效果图。
图3：样本1宫颈脱落细胞在本发明的保存液中保存不同时间后的HPV-DNA分型检测结果图。
图4：样本2宫颈脱落细胞在本发明的保存液中保存不同时间后的HPV-DNA分型检测结果图。
其中，图3和图4中，自上而下依次为样本保存7天、14天、21天和28天的HPV-DNA分型检测结果。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
实施例中涉及的实验材料：本发明中所使用的PIPES、葡萄糖、甲醇、DTT、EDTA、TCEP、Proclin300和Triton X-100等均外购于上海生物工程有限公司，本发明实施例中的液基细胞来自于无锡市第二人民医院妇科门诊。
实施例1
液基细胞保存液的配制
（1）PIPES缓冲液的配制：采用常规配制方法配制50mmol/L的 PIPES缓冲液，调节pH值至6.6；
（2）称取相应质量的葡萄糖、TCEP、DTT 和EDTA，使其最终浓度分别为5%、0.5mmol/L、0.3%和0.2%，用适量的PIPES缓冲液溶解；
（3）量取一定体积的甲醇、Proclin300和Triton X-100，使其最终浓度分别为55%、0.02%和0.1%；
（4）充分混匀后，调节pH至6.6；
（5）用pH6.6的PIPES缓冲液补充至需要的体积。
实施例2
宫颈脱落细胞的保存
（1）将配制完成的5mL液基细胞保存液分装至10mL离心管中；
（2）按照诊疗规范进行宫颈脱落细胞取样；
（3）将取完样的宫颈刷放入含有5mL液基细胞保存液的离心管中，将宫颈刷柄折断，旋紧管盖，充分混匀后，25℃放置。
采用上述方法，取两个样本，分别记为样本1和样本2，进行保存。
实施例3
宫颈脱落细胞保存效果的验证
以实施例2中的保存的宫颈脱落细胞样本1和样本2为验证对象，在保存的第7天、14天、21天和28天取样制片后染色，显微镜观察细胞形态。
具体实施步骤如下：
1、将保存的宫颈脱落细胞置于振荡器上，3000rpm振荡1分钟，混匀细胞。
2、从混匀的保存液中取2mL保存液置于离心管中，2000rpm离心2分钟。
3、取出离心管，弃去上清，根据细胞量的多少可以用PIPES缓冲液适量稀释细胞沉淀。
4、吸管吸取上述稀释的细胞悬浮液约1mL加入已装好的模具中，1300rpm甩片3分钟。
5、甩片结束后，用巴氏快速染液染色后观察细胞形态，如图1和图2所示。
从图1和图2可看出，无论是对于样本1，还是样本2，使用本发明保存液室温（25℃）保存宫颈脱落细胞时，细胞形态较好，即使在保存28天后，细胞形态仍然完整，胞浆与细胞核分界清楚、层次分明，并且制片背景的清晰度好。因此可见本发明的液基细胞保存液在保存宫颈脱落细胞时，具有良好的保存效果。
实施例4
以已知HPV型别的宫颈脱落细胞为样本，在室温（25℃）保存的第7天、14天、21天和28天取样，使用亚能HPV分型检测试剂盒按说明书操作检测HPV的型别，观察本发明保存液对DNA的保存效果。如图3所示，样本1在保存7天、14天、21天和28天时间点上，HPV分型结果完全一致，均为18、43、53、58和66型阳性；同样，如图4所示，样本2在保存7天、14天、21天和28天时间点上，HPV分型结果也完全一致，均为18、31、59和66型阳性。上述结果说明，本发明在28天保存期间内HPV的核酸没有降解。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用于限制发明，凡在本发明的设计构思之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种液基细胞保存液，其特征在于：包括pH缓冲液、渗透压维持剂、固定剂、抑菌剂、粘液消化剂、核酸保护剂及红细胞溶解剂。
2.如权利要求1所述的液基细胞保存液，其特征在于：所述pH缓冲液为MES、Bis-Tris、MOPS、PIPES中的一种或多种的混合物。
3.如权利要求1所述的液基细胞保存液，其特征在于：所述渗透压维持剂为氯化钠、氯化钾、碳酸氢钠、葡萄糖等溶液中的一种或多种的混合物。
4.如权利要求1所述的液基细胞保存液，其特征在于：所述固定剂为无水乙醇、甲醇、多聚甲醛中的一种或多种的混合物。
5.如权利要求1所述的液基细胞保存液，其特征在于：所述抑菌剂为Proclin 150、Proclin 200、Proclin 300、Proclin 5000中的一种或多种的混合物。
6.如权利要求1所述的液基细胞保存液，其特征在于：所述粘液消化剂为DTT、EDTA、TCEP中的一种或多种的混合物。
7.如权利要求1所述的液基细胞保存液，其特征在于：所述核酸保护剂为焦磷酸二乙酯、氧钒核糖核苷复合物、RNA酶抑制剂、尿素、SDS、TCEP中的一种或多种的混合物。
8.如权利要求1所述的液基细胞保存液，其特征在于：所述红细胞溶解剂为Triton X-100、NP40和Tween 20中的一种或多种的混合物。
9.一种如权利要求1-8中任一项所述的液基细胞保存液的配制方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）配制pH缓冲液，备用；
（2）在pH缓冲液中，加入配方量的渗透压维持剂、核酸保护剂、粘液消化剂，溶解并混合均匀；
（3）向步骤（2）的溶液中加入固定剂、抑菌剂和红细胞溶解剂，溶解并混合均匀；
（4）用pH缓冲液加入步骤（3）的溶液中，补充至所需体积。
10.一种如权利要求9所述的配制方法得到的液基细胞保存液在保存宫颈脱落细胞中的应用。
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