CN109207473B

CN109207473B - 一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法

Info

Publication number: CN109207473B
Application number: CN201811153649.1A
Authority: CN
Inventors: 肖晶; 李楠
Original assignee: Dalian Medical University
Current assignee: Dalian Medical University
Priority date: 2018-09-30
Filing date: 2018-09-30
Publication date: 2020-07-17
Anticipated expiration: 2038-09-30
Also published as: CN109207473A

Abstract

本发明提供了一种宫颈细胞裂解试剂盒及细胞裂解方法，属于细胞裂解技术领域，所述试剂盒包括裂解缓冲液和蛋白酶K；所述裂解缓冲液包括以下浓度的组分：10～500mM的Tris‑HCl、1～80mM的EDTA、0.05～2wt％SDS和100～250mM NaCl。所述细胞裂解方法包括以下步骤：PBS缓冲液清洗宫颈细胞样本液后，与裂解缓冲液混合均匀，加入蛋白酶K混合，53～58℃消化10～14h；然后涡旋震荡30～60s后，53～58℃继续消化1.5～2.5h完成细胞裂解；所述试剂盒及裂解方法能够充分裂解样品中的宫颈细胞，解离出高浓度和高质量的DNA，利于后续DNA的提取和扩增。

Description

一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法

技术领域

本发明属于细胞裂解技术领域，尤其涉及一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法。

背景技术

宫颈癌是威胁女性健康的常见恶性肿瘤之一，有效的筛查和早期诊断，能够显著降低宫颈癌的发生率与死亡率。宫颈液基薄层细胞学检测(TCT) 已经成为宫颈癌筛查和细胞学诊断的常用方法之一。TCT检测是一种将脱落细胞保存在保存液中，并通过专用制片仪器将细胞均匀分散黏附到载玻片上，进行染色观察的技术。临床采集样本时，应用特制的宫颈刷插入宫颈口，刷取宫颈口和宫颈管的脱落上皮细胞，将宫颈刷的刷头置于装有细胞保存液的小瓶中进行漂洗，获得细胞样本。之后，保存液中的细胞经混匀、过滤、转移，最终黏附于载波片上，染色固定后进行细胞学诊断。但由于检测人员主观因素等原因宫颈液基薄层细胞学检测仍存在漏检的情况，因此，目前宫颈癌的诊断，也不能单靠细胞学检查；此外，现阶段肿瘤治疗寻求的是精准个性化治疗，有必要从基因学角度对受试者进行宫颈癌相关基因的检测。

而提取高浓度高质量的细胞DNA的前提是充分裂解细胞，细胞裂解可通过机械作用、化学作用和酶作用来实现。TCT检测过程中，保存液能够很好的保存宫颈细胞，而且受检者承受痛苦小，无疑是宫颈癌基因学检测的最佳样本。TCT检测宫颈细胞保存液中含有细胞成分和非细胞成分；细胞成分包括上皮细胞和非上皮细胞，上皮细胞包括鳞状细胞和宫颈管细胞，非上皮细胞包括血细胞，如红细胞等，以及间质细胞。非细胞成分包括固有成分，如黏液、细菌等，以及污染物，如药物结晶、纤维物、真菌等。因此，保存液中除了上皮细胞，其他成分均为干扰项。另外，保存液中还含有固定细胞的化学成分，这类化学成分会使DNA与蛋白质发生交联，影响DNA的释放，因此保存液本身亦是提取宫颈细胞DNA的干扰项。

由于样本中的干扰项众多，现有的商业化试剂盒根本无法将DNA从宫颈TCT保存液中充分解离出，由此提取的DNA质量和浓度均不达标，无法进行后续的扩增实验，更无法获得准确的基因检测结果。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种针对宫颈液基薄层细胞学检测保存液样本的宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法；所述试剂盒及裂解方法能够充分裂解样品中的宫颈细胞，解离出高浓度和高质量的DNA，利于后续DNA的提取和扩增。

为了实现上述目的，本发明提供了一种宫颈细胞裂解试剂盒，包括裂解缓冲液和蛋白酶K；所述裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分： 10～500mM的Tris-HCl、1～80mM的EDTA、0.05～2wt％SDS和100～250mM NaCl。

优选的，所述裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：50～400mM 的Tris-HCl、5～60mM的EDTA、0.1～1wt％SDS和150～220mM NaCl。

优选的，所述裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：100mM的 Tris-HCl、50mM的EDTA、0.1wt％SDS和200mM NaCl。

优选的，所述Tris-HCl的pH值为8.0～8.3。

本发明还提供了所述试剂盒裂解宫颈细胞的方法，包括以下步骤：

1)PBS缓冲液清洗宫颈细胞样本液，固液分离，收集固相组分；

2)将所述固相组分与裂解缓冲液混合，获得混合液；

3)将所述混合液与蛋白酶K溶液混合，进行第一阶段消化，所述第一阶段消化的温度为53～58℃，时间为10～14h，获得消化液；

4)将所述消化液涡旋震荡30～60s后，继续进行第二阶段消化，所述第二阶段消化的温度为53～58℃，时间1.5～2.5h；

所述宫颈细胞样本液来源于临床宫颈TCT检测获得的含有宫颈细胞的保存液。

优选的，所述PBS缓冲液与宫颈细胞样本液的体积比为1～5:1。

优选的，步骤2)中所述的裂解缓冲液与步骤1)中所述的宫颈细胞样品液的体积比为(1～5)：(8～12)。

优选的，所述蛋白酶K溶液的浓度为0.1～2mg/ml。

优选的，步骤2)中所述的裂解缓冲液与步骤3)中所述的蛋白酶K溶液的体积比为(15～25)：1。

优选的，所述第一阶段消化和第二阶段消化的温度独立为54～56℃。

本发明的有益效果：本发明提供的宫颈细胞裂解试剂盒包括裂解缓冲液和蛋白酶K；所述裂解缓冲液中Tris-HCl提供缓冲体系；EDTA作为二价金属离子螯合剂，能够抑制细胞中DNase活性；表面活性剂SDS能够溶解脂质和蛋白质，破坏细胞膜和核膜结构，使细胞破裂，且SDS还能使蛋白质和多糖变性，使DNA与其相连的蛋白质分离，释放出来；NaCl利于DNA 溶解；所述蛋白酶K，在SDS和EDTA存在下保持很高的活性，能将所有蛋白降解成为多肽或小片段氨基酸，使DNA分子完整的被分离出来。本发明所述的试剂盒将上述成分有机组合，能够排除其他细胞、粘液、药物结晶、保存液中的化学成分等的干扰，有效地将临床宫颈TCT检测获得的保存液中的宫颈细胞完全裂解。

利用本发明提供的试剂盒以及裂解方法获得的临床宫颈TCT检测过程中的含有宫颈细胞保存液样本的细胞裂解液，进行常规DNA提取，获得的 DNA浓度可以达到100-300ng/μl，260/280值1.85-2.05，260/230值1.5-1.9；以提取的DNA为模板进行PCR扩增后，管家基因的扩增曲线良好，CT值在25-27之间。由此可见，利用本发明提供的试剂盒获得的裂解液进行DNA 提取，能够获得高质量、高浓度的DNA，有利于后续DNA的扩增和基因检测。

具体实施方式

细胞裂解是细胞DNA提取的首要关键步骤，细胞裂解是否充分，DNA 释放是否完全，直接决定DNA提取的纯度和浓度，影响后续PCR实验的结果。临床TCT检测保存液中的脱落宫颈细胞细胞量少，且后续要进行PCR 检测实验，常规的细胞裂解方法并不适用。本发明采用将化学作用与酶作用相结合的方法，可以降低对细胞量的需求，且较温和，能够获得完整的DNA 链。

本发明提供了一种宫颈细胞裂解试剂盒，所述试剂盒的裂解对象为宫颈液基薄层细胞学检测保存液样本中的宫颈细胞；所述试剂盒也可以用来裂解其他形式的细胞。本发明中，所述试剂盒包括裂解缓冲液和蛋白酶K；所述裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：10～500mM的Tris-HCl、 1～80mM的EDTA、0.05～2wt％SDS和100～250mM NaCl。

在本发明中，所述裂解缓冲液以水为溶剂，优选的包括以下浓度的组分： 50～400mM的Tris-HCl、5～60mM的EDTA、0.1～1wt％SDS和150～220mM NaCl；更优选的，包括以下浓度的组分：100mM的Tris-HCl、50mM的EDTA、 0.1wt％SDS和200mM NaCl。

在本发明中，所述裂解缓冲液中Tris-HCl的pH值优选为8.0～8.3，更优选为8.1～8.2；所述Tris-HCl的作用是提供缓冲体系，使整个体系的pH维持在弱碱性的范围内；本发明中所述EDTA作为二价金属离子螯合剂，能抑制细胞中DNase活性；SDS为强变性剂和蛋白溶解剂，去污剂，能溶解细胞膜和核膜，破坏细胞，并将DNA与其相连的蛋白质分离；NaCl利于DNA 溶解。本发明对所述裂解缓冲液中各个成分的来源没有特殊限定，采用市售产品即可。

本发明对所述蛋白酶K的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售蛋白酶K即可；本发明中，所述试剂盒中的蛋白酶K优选为市售蛋白酶K粉末或蛋白酶K溶液；所述蛋白酶K在使用时，优选的以蛋白酶K溶液的形式使用；所述蛋白酶K溶液优选的以超纯水为溶剂溶解蛋白酶K粉末获得。本发明中所述蛋白酶K溶液的浓度优选为0.1～2mg/ml，更优选为0.5～1.5mg/ml；本发明中所述蛋白酶K的作用为降解蛋白质，使DNA分子分离出来。本发明中所述蛋白酶K，在SDS和EDTA存在下仍能保持很高的活性，能将所有蛋白降解成为多肽或小片段氨基酸，使DNA分子完整的被分离出来。所述蛋白酶K的酶活力优选为40U/mg。

本发明还提供了利用所述试剂盒裂解宫颈细胞的方法，包括以下步骤： 1)PBS缓冲液清洗宫颈细胞样本液，固液分离，收集固相组分；2)将所述固相组分与裂解缓冲液混合，获得混合液；3)将所述混合液与蛋白酶K溶液混合，进行第一阶段消化，所述第一阶段消化的温度为53～58℃，时间为 10～14h，获得消化液；4)将所述消化液涡旋震荡30～60s后，继续进行第二阶段消化，所述第二阶段消化的温度为53～58℃，时间1.5～2.5h；所述宫颈细胞样本液来源于临床宫颈TCT检测获得的含有宫颈细胞的保存液。

在本发明中，所述宫颈细胞样本液来源于临床宫颈TCT检测过程中含有宫颈细胞的保存液。本发明中所述样本液无需另行制备，直接采用医院临床宫颈TCT检测的保存液即可，易于获得。在本发明中，所述样本液为含有脱落的宫颈细胞的保存液；所述样本液存放于-20℃条件下，为固态或液体，取决于不同公司的产品。本发明中所述样本液即宫颈TCT检测获得的保存液内成分复杂，除了目的细胞(宫颈细胞)，保存液中还会还有非上皮细胞、非细胞成分；并且每次临床获得的样本由于医生的操作差异、宫颈病变部位的差异性等因素，细胞含量也会存在很大的差异性。本发明得到的临床样本液中的保存液分别来自2个公司的产品，美国BD公司的Surepath和美国Hologic公司的ThinPrep。上述保存液中含有固定细胞的化学成分，这类化学成分会使DNA与蛋白质发生交联，影响DNA的释放，因此保存液自身也是宫颈细胞DNA释放的干扰项。

本发明在获得所述宫颈细胞样本液后，用PBS缓冲液清洗宫颈细胞样本液，固液分离，收集固相组分。在本发明中，所述PBS缓冲液与宫颈细胞样本液的体积比为1～5:1。本发明中所述PBS缓冲液清洗宫颈细胞即将所述宫颈细胞样本液与PBS缓冲液混合均匀。本发明中，所述固液分离的方式优选为离心；所述离心的离心力优选为4000～5000g，更优选为4600g，所述离心的时间优选为50～70min，更优选为55～65min，最优选为60min。本发明在所述离心后，去除上清液，收集固相组分，进行下一步操作。

本发明在获得所述固相组分后，将收集到的固相组分与裂解缓冲液混合均匀获得混合液。本发明中，所述裂解缓冲液与步骤1)中所述的宫颈细胞样品液的体积比优选为(1～5)：(8～12)，更优选为(2～4)：(9～11)。本发明对所述混合均匀的方法没有特殊要求，在具体实施过程中，优选的采用吹吸混匀的方法。

本发明在获得所述混合液后，将所述混合液与蛋白酶K溶液混合，进行第一阶段消化，所述第一阶段消化的温度为53～58℃，时间为10～14h，获得消化液。在本发明中所述裂解缓冲液与蛋白酶K的体积比优选为(15～25)： 1，更优选为20:1。本发明中所述第一阶段消化的温度优选为54～56℃，更优选为55℃，所述消化的时间优选为11～13h，更优选为12h。

本发明在获得所述消化液后，将所述消化液涡旋震荡30～60s后，继续进行第二阶段消化，所述第二阶段消化的温度为53～58℃，时间1.5～2.5h。本发明中所述涡旋震荡采用本领域常规的涡旋震荡仪即可，本发明对所述涡旋震荡的频率没有特殊限定，只能能够实现混匀的效果即可。本发明中所述继续消化的温度优选为54～56℃，更优选为55℃，所述继续消化的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h。本发明在所述继续消化结束后完成细胞裂解，实现细胞的完全裂解。

本发明中在高温条件下(53～58℃)应用表面活性剂SDS溶解脂质和蛋白质，破坏细胞膜和核膜结构使细胞破裂，且SDS还能使蛋白质和多糖变性，使DNA与其相连的蛋白质分离，释放出来；加入蛋白酶K，能将蛋白质水解成多肽或氨基酸，利于DNA完整的分离出来，提高后续操作DNA 获取量和纯度。本发明中所述的蛋白酶K在pH4～12.5以下及高温(50～70℃) 均有活性，且在EDTA和SDS存在时蛋白酶K酶活性也不受影响。高温条件下(53～58℃)，高浓度的SDS，蛋白酶K的作用，以及震荡作用，能使细胞充分裂解，使DNA与蛋白质更易分离。缓冲体系Tris-HCl提供一定pH 值(弱碱性)的环境，有利于DNA的稳定；二价金属离子螯合剂EDTA可螯合DNA酶活性所必需的Mg²⁺、Ca²⁺，从而抑制DNA酶活性，防止细胞破碎后DNA酶降解DNA；NaCl有利于DNA的溶解。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

宫颈上皮细胞裂解试剂盒

裂解缓冲液的制备：

蛋白酶K：20mg/ml。

细胞裂解方法：

临床宫颈TCT检测过程中含有宫颈细胞的保存液10ml加入等体积的 PBS清洗，4600g离心60min，小心去除上清，收集沉淀；

加入1ml上述裂解缓冲液，吹打混匀沉淀，加入50μl蛋白酶K，55℃ 消化12h；

涡旋震荡50s，55℃继续消化2h，至细胞裂解完全。

细胞裂解后，DNA提取按照石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(北京天根/DP331-02)中的第10步开始操作至完成(试剂盒说明书)，具体包括以下步骤：将裂解的液体分装到1.5ml EP管，每管为220μl，加入220μl GB，涡旋混匀，继续加入250μl无水乙醇，涡旋混匀并短暂离心；将以上液体分次加入离心管CR3中，12000rpm离心1min，弃液体；向离心柱中加入500μl GD，12000rpm离心1min，弃液体；向离心柱中加入600μl PW，12000rpm离心1min，弃液体；再次向离心柱中加入600μl PW，12000rpm离心1min，弃液体；开盖室温晾干5-10min，使无水乙醇充分挥发；将离心柱放入一个新1.5EP管，加入20μl TE，室温15min，12000rpm离心1min，将液体重新加入离心管，并重新加入40-60μl TE，12000rpm离心1min，测DNA浓度及纯度。

PCR体系

PCR程序：

PCR体系及程序如上所述

样本液来源BD公司保存液

样品1：DNA浓度为217.0ng/μl，260/280＝1.89，260/230＝1.87，PCR结果管家基因CT值为24.79。

样品2：DNA浓度为153.7ng/μl，260/280＝1.91，260/230＝1.77，PCR结果管家基因CT值为24.66。

样品3：DNA浓度为135.3.0ng/μl，260/280＝1.95，260/230＝1.67，PCR 结果管家基因CT值为25.15。

对比例1

样本来源BD公司保存液，样品1、样品2和样品3分别与实施例1中的样品1、样品2和样品3相同。

细胞裂解采用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(北京天根/DP331-02)细胞裂解试剂盒，具体方法参见试剂盒说明书。

样品1：浓度为1.5ng/μl，260/280＝3.2，260/230＝0.05，因浓度过低无法进行后续PCR实验。

样品2：浓度为2.2ng/μl，260/280＝3.32，260/230＝0.03，因浓度过低无法进行后续PCR实验。

样品3：浓度为13.5ng/μl，260/280＝1.45，260/230＝0.04，因浓度过低无法进行后续PCR实验。

实施例2

宫颈上皮细胞裂解试剂盒

裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：200mM的Tris-HCl、 50mM的EDTA、0.1wt％SDS和200mMNaCl

蛋白酶K：20mg/ml。

细胞裂解方法：

临床宫颈TCT检测过程中含有宫颈细胞的保存液12ml加入2倍体积的 PBS清洗，4600g离心60min，小心去除上清，收集沉淀；

涡旋震荡50s，55℃继续消化2h，至细胞裂解完全。

细胞裂解后，DNA提取按照石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(北京天根/DP331-02)中的第10步开始操作至完成(试剂盒说明书详)，具体包括以下步骤：将裂解的液体分装到1.5ml EP管，每管为220μl，加入220μl GB，涡旋混匀，继续加入250μl无水乙醇，涡旋混匀并短暂离心；将以上液体分次加入离心管CR3中，12000rpm离心1min，弃液体；向离心柱中加入500μl GD，12000rpm离心1min，弃液体；向离心柱中加入600μl PW，12000rpm离心1min，弃液体；再次向离心柱中加入600μl PW，12000rpm离心1min，弃液体；开盖室温晾干5-10min，使无水乙醇充分挥发；将离心柱放入一个新1.5EP管，加入20μl TE，室温15min，12000rpm离心1min，将液体重新加入离心管，并重新加入40-60μl TE，12000rpm离心1min，测DNA浓度及纯度。

样本液来源新柏氏公司保存液

样品1：浓度为63.8ng/μl，260/280＝2.00，260/230＝1.38，PCR结果管家基因CT值为24.2。

样品2：浓度为145.5ng/μl，260/280＝1.96，260/230＝1.61，PCR结果管家基因CT值为23.4。

样品3：浓度为324.7ng/μl，260/280＝1.94，260/230＝1.72，PCR结果管家基因CT值为23.6。

对比例2

样本液来源新柏氏公司保存液

样品1、样品2和样品3分别与实施例2中的样品1、样品2和样品3 相同。

样本1:浓度：54.5ng/μl，260/280＝1.36，260/230＝0.45，因浓度过低无法进行后续PCR实验。

样本2:浓度：3.9ng/μl，260/280＝0.93，260/230＝0.11，因浓度过低无法进行后续PCR实验。

样本3:浓度：16.3ng/μl，260/280＝1.48，260/230＝0.29，因浓度过低无法进行后续PCR实验。

由上述实施例可知，本发明提供的试剂盒和裂解方法获得的DNA在加入50～100μl TE后，浓度可以达到100～300ng/μl，260/280值1.85～2.05，260/230 值1.5～1.9，PCR扩增后，管家基因的扩增曲线良好，CT值在25～27之间；而其他常规裂解方法，采用同样的试剂盒提取，加入20～40μlTE后，浓度达不到20ng/μl，260/280值范围很大，不稳定，在1～3之间，260/230值在0～0.1 之间，浓度及纯度过低无法进行后续的PCR实验，无法进行PCR结果的比较。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种裂解宫颈细胞的方法，包括以下步骤：

2)将所述固相组分与裂解缓冲液混合，获得混合液；

所述宫颈细胞样本液来源于临床宫颈TCT检测获得的含有宫颈细胞的保存液；

所述裂解缓冲液以水为溶剂，包括以下浓度的组分：50～400mM的Tris-HCl、5～60mM的EDTA、0.1～1wt％SDS和150～220mM NaCl。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解缓冲液包括以下浓度的组分：100mM的Tris-HCl、50mM的EDTA、0.1wt％SDS和200mM NaCl。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Tris-HCl的pH值为8.0～8.3。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PBS缓冲液与宫颈细胞样本液的体积比为1～5:1。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的裂解缓冲液与步骤1)中所述的宫颈细胞样品液的体积比为(1～5)：(8～12)。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶K溶液的浓度为0.1～2mg/ml。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述的裂解缓冲液与步骤3)中所述的蛋白酶K溶液的体积比为(15～25)：1。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一阶段消化和第二阶段消化的温度独立为54～56℃。