CN107034212A - 一种质粒提取试剂盒以及提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种质粒提取试剂盒，其包括用于裂解细胞的裂解试剂组、用于去除杂质的洗涤试剂组、质粒溶解试剂和内毒素去除试剂，还涉及使用所述质粒提取试剂盒进行提取质粒的方法。本发明的质粒提取试剂盒成分简单，所有试剂均无毒，可以方便的得到。质粒提取的效率高。内毒素的去除效率可以达到98％，可以满足真核转染的要求，对药学相关试验比较有优势。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学领域，更特别地，涉及一种质粒提取试剂盒以及质粒提取方法。
背景技术
质粒提取是分子生物学和药用质粒研究领域中常见的操作。近年来，基因治疗和DNA疫苗在癌症、单基因遗传病、艾滋病、心血管疾病、关节炎等重大疾病的诊断和治疗方面显示了突出的优势，其应用研究正日益发展。目前质粒逐渐成为基因治疗的最重要的基因传递系统，应用于基因治疗的药用质粒的提取技术的发展目前已成为该领域研究的重点之一。这进一步促进了高纯度质粒提取技术的发展。
在许多研究中，尤其是药学相关试验中，所用的质粒中不能含有内毒素，因此，常常需要先对质粒进行内毒素去除操作，。然而，目前尚未有质粒提取试剂盒涉及这方面的试剂，研究人员不得不自己配制相关试剂，造成了巨大的不方便，并且内毒素去除效果也不理想。因此，需要一种新的质粒提取试剂盒，以及提取方法。
发明内容
为解决以上问题，本发明提供了一种质粒提取试剂盒，其包括用于裂解细胞的裂解试剂组、用于去除杂质的洗涤试剂组、质粒溶解试剂和内毒素去除试剂。
优选地，所述裂解试剂组由裂解液I、II和III组成，
所述裂解液I为包含10mM EDTA、0.1067mg/ml RNase A和25mM Tris-HCl的水溶液，所述裂解液I的pH为8.0；
所述裂解液II为包含0.2M NaOH和质量分数1％的SDS的水溶液；
所述裂解液III为包含2-6M盐酸胍和0.5M醋酸钾的水溶液，所述裂解液III的pH为4.2。
优选地，所述洗涤试剂组由洗液A和洗液B组成，
所述洗液A为包含6-8M盐酸胍、20mM Tris-HCl和体积分数30-50％乙醇的水溶液，所述洗液A的pH为6.0；
所述洗液B为体积分数75-90％的乙醇水溶液。
优选地，所述内毒素去除试剂为包含5-20％TritonX-114的水溶液。
在另一个实施方案中，还包括内毒素检测试剂。
本发明还提供了一种质粒提取方法，使用上述质粒提取试剂盒进行质粒提取，包括以下步骤：
S1：使用所述细胞裂解试剂组裂解包含质粒的宿主细胞，得到细胞破碎液；
S2：将所述细胞破碎液上载于质粒吸附柱上，使用所述洗涤试剂组洗涤上载了细胞破碎液的质粒吸附柱，使用所述质粒溶解试剂从洗涤后的质粒吸附柱溶出质粒，得到质粒粗提液；
S3：使用所述内毒素去除试剂去除所述质粒粗提液中的内毒素，得到去除了内毒素的质粒溶液。
优选地，所述裂解试剂组由裂解液I、II和III组成，并且S1包括以下步骤：
S11：将包含宿主细胞的培养物离心去上清，并用所述250体积份的裂解液I重悬所述宿主细胞；
S12：加入250体积份的裂解液II，上下翻转混匀，室温静置，使宿主细胞充分裂解；
S13：加入350体积份的裂解液III，上下翻转混匀，至形成白色聚集物，冰浴2min；
S14：离心得到澄清液体即所述细胞破碎液。
优选地，所述洗涤试剂组由洗液A和洗液B组成，并且S2包括以下步骤：
S21：将所述细胞破碎液上载于所述质粒吸附柱上，离心并去除滤过所述质粒吸附柱的液体；
S22：用洗液A洗涤所述质粒吸附柱：向所述质粒吸附柱中加入500体积份的洗液A，离心并去除滤过所述质粒吸附柱的液体；
S23：用洗液B洗涤所述质粒吸附柱两次：每次向所述质粒吸附柱中加入700体积份的洗液B，离心并去除滤过所述质粒吸附柱的液体；
S24：使用所述质粒溶解试剂从洗涤后的质粒吸附柱溶出质粒，静置1min，离心得到的滤液即为所述质粒粗提液。质粒溶解试剂可为水或TE缓冲液。
优选地，所述内毒素去除试剂为包含5-20％TritonX-114的水溶液，并且S3包括以下步骤：
S31：向所述质粒粗提液中加入所述述内毒素去除试剂，至TritonX-114浓度为1％，并快速混匀,得到混合液；
S32：将S31得到的混合液冰浴10min，然后于42℃孵育10min；
S33：将经S32处理的混合液于20℃、10000rpm下离心5min，所得上清液即所述去除了内毒素的质粒溶液。
在另一个实施方案中，所述质粒提取试剂盒还包括内毒素检测试剂，在得到所述去除了内毒素的质粒溶液后，还进行步骤S4：使用所述内毒素检测试剂检测所述质粒溶液的内毒素含量，以验证内毒素去除效果。
本发明的质粒提取试剂盒成分简单，所有试剂均无毒，可以方便的得到。质粒提取的效率高。内毒素的去除效率可以达到98％，可以满足真核转染的要求，对药学相关试验比较有优势。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.得到细胞破碎液
将菌株接种到含有4ml培养基的试管中，37℃过夜培养，180rpm。前一天4pm开始。
将培养好菌液封装在2个2ml离心管中，12000rpm，2min。弃上清。
加入250μl的裂解液Ⅰ(含RNaseA1)，用移液器吹打几次，充分混匀。
加入250μl的裂解液Ⅱ，轻轻上下翻转5-6次，室温静置2min，使菌液充分裂解，形成透明溶液(时间不可过长，5min以内)。
加入350μl的裂解液Ⅲ，上下翻转5-6次，直至形成致密的白色聚集物，冰浴2min。
12000rpm，离心10min，上清液即为细胞破碎液。
2.得到质粒粗体液
将细胞破碎液吸入安放在收集管上的硅胶膜吸附柱中，不能吸到沉淀。
12000rpm，1min。弃掉收集管中的滤液。
向吸附柱中加入500μl的洗液A，12000rpm，30s，弃滤液。
向吸附柱中加入700μl的洗液B，12000rpm，30s，弃滤液，本操作进行两次。
空离12000rpm，1min。弃掉所有液体。
将吸附柱转移至超净工作台中灭菌后的EP管中，加入TE溶液60μl，室温静置1min(加液时注意滴加在吸附柱底部中心)。
12000rpm，1min。去掉吸附柱，目的DNA溶解在EP管滤液中，即得到质粒粗提液，做好标记，-20°保存。
3.去除内毒素
向质粒粗提液中加入缓冲液配置的内毒素去除液至终浓度为1％。
快速混匀，冰浴10min。42°孵育10min。于20°，10000rpm离心5min，于超净工作台中将上清液体吸入EP管中。
4.检测内毒素去除效果
利用鲎试剂检测热源，符合要求的质粒于-20°或-70°保存。
注意事项：试剂一定要提前预热和预冷。
菌液的培养时间要控制在12-16h左右。
加入SolutionⅡ后，裂解时间一定要控制，最好1min。
TE缓冲液的pH值要控制在8.0.(酸性条件质粒易分解)。
以下为本实施例中各试剂的配方及配制方法：
裂解液I：25mM Tris-Hcl、10mM EDTA，将PH调至8.0高温高压灭菌，添加RNase A0.1067mg/ml；
裂解液II：0.2M NaOH，1％SDS，先分别配制10X的NaOH溶液和10X的SDS溶液，使用前稀释到1X的混合溶液；
裂解液III：2-6M盐酸胍，0.5M醋酸钾，PH调至4.2；
洗液A：6-8M盐酸胍，20mM Tris-Hcl，30-50％乙醇，pH 6.0；
洗液B：75-90％乙醇；
TE：10mM Tris-Hcl，1mM EDTA，pH 8.0，高温高压灭菌；
内毒素去除试剂：磷酸盐缓冲系统配置的10％TritonX-114。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种质粒提取试剂盒，其特征在于，包括用于裂解细胞的裂解试剂组、用于去除杂质的洗涤试剂组、质粒溶解试剂和内毒素去除试剂。
2.根据权利要求1所述的质粒提取试剂盒，其特征在于，所述裂解试剂组由裂解液I、II和III组成，
所述裂解液I为包含10mM EDTA、0.1067mg/ml RNase A和25mM Tris-HCl的水溶液，所述裂解液I的pH为8.0；
所述裂解液II为包含0.2M NaOH和质量分数1％的SDS的水溶液；
所述裂解液III为包含2-6M盐酸胍和0.5M醋酸钾的水溶液，所述裂解液III的pH为4.2。
3.根据权利要求1所述的质粒提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤试剂组由洗液A和洗液B组成，
所述洗液A为包含6-8M盐酸胍、20mM Tris-HCl和体积分数30-50％乙醇的水溶液，所述洗液A的pH为6.0；
所述洗液B为体积分数75-90％的乙醇水溶液。
4.根据权利要求1所述的质粒提取试剂盒，其特征在于，所述内毒素去除试剂为包含5-20％TritonX-114的水溶液。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的质粒提取试剂盒，其特征在于，还包括内毒素检测试剂。
6.一种质粒提取方法，其特征在于，使用权利要求1-5中任一项所述的质粒提取试剂盒进行质粒提取，包括以下步骤：
S1：使用所述细胞裂解试剂组裂解包含质粒的宿主细胞，得到细胞破碎液；
S2：将所述细胞破碎液上载于质粒吸附柱上，使用所述洗涤试剂组洗涤上载了细胞破碎液的质粒吸附柱，使用所述质粒溶解试剂从洗涤后的质粒吸附柱溶出质粒，得到质粒粗提液；
S3：使用所述内毒素去除试剂去除所述质粒粗提液中的内毒素，得到去除了内毒素的质粒溶液。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述裂解试剂组由裂解液I、II和III组成，并且S1包括以下步骤：
S11：将包含宿主细胞的培养物离心去上清，并用所述250体积份的裂解液I重悬所述宿主细胞；
S12：加入250体积份的裂解液II，上下翻转混匀，室温静置，使宿主细胞充分裂解；
S13：加入350体积份的裂解液III，上下翻转混匀，至形成白色聚集物，冰浴2min；
S14：离心得到澄清液体即所述细胞破碎液。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述洗涤试剂组由洗液A和洗液B组成，并且S2包括以下步骤：
S21：将所述细胞破碎液上载于所述质粒吸附柱上，离心并去除滤过所述质粒吸附柱的液体；
S22：用洗液A洗涤所述质粒吸附柱：向所述质粒吸附柱中加入500体积份的洗液A，离心并去除滤过所述质粒吸附柱的液体；
S23：用洗液B洗涤所述质粒吸附柱两次：每次向所述质粒吸附柱中加入700体积份的洗液B，离心并去除滤过所述质粒吸附柱的液体；
S24：使用所述质粒溶解试剂从洗涤后的质粒吸附柱溶出质粒，静置1min，离心得到的滤液即为所述质粒粗提液。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述内毒素去除试剂为包含5-20％TritonX-114的水溶液，并且S3包括以下步骤：
S31：向所述质粒粗提液中加入所述述内毒素去除试剂，至TritonX-114浓度为1％，并快速混匀,得到混合液；
S32：将S31得到的混合液冰浴10min，然后于42℃孵育10min；
S33：将经S32处理的混合液于20℃、10000rpm下离心5min，所得上清液即所述去除了内毒素的质粒溶液。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述质粒提取试剂盒还包括内毒素检测试剂，在得到所述去除了毒素的质粒溶液后，还进行步骤S4：使用所述内毒素检测试剂检测所述质粒溶液的内毒素含量，以验证内毒素去除效果。
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