CN114621950B - 无内毒素质粒快速提取试剂盒及质粒提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出一种无内毒素质粒快速提取试剂盒及质粒提取方法，属于分子生物学领域，能够解决现有的内毒素去除方法存在操作复杂、成本高、去除效果差且有RNA残留的技术问题。其中，本发明无内毒素质粒快速提取试剂盒包括裂解试剂组、杂质去除试剂、内毒素清除试剂、洗脱试剂组和至少一个吸附柱；质粒提取方法包括：样品重悬与裂解、内毒素清除、杂质去除、杂质漂洗和质粒DNA洗脱步骤。利用本发明的无内毒素质粒快速提取试剂盒提取的质粒内毒素含量低于0.1EU/μg，能够满足细胞转染、基因治疗、基因工程等需较低水平内毒素的实验和研究要求。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种无内毒素质粒快速提取试剂盒及质粒提取方法。
背景技术
质粒DNA的提取纯化是现代分子生物学研究和应用中最基本且尤为关键的实验技术之一，高纯度的质粒DNA是基因克隆、基因序列分析的重要前提，尤其是涉及核酸疫苗、基因治疗等对内毒素含量要求极高的研究领域尤为关键。
本领域最常用的提取质粒方法是碱裂解法，该方法是分子克隆研究中最常用的方法之一。内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分脂多糖，细菌裂解时会随之释放出来，该物质能显著降低内毒素敏感细胞株的转染效率，因此，利用常规试剂盒提取的质粒DNA无法满足细胞转染、基因治疗、基因工程等需较低水平内毒素的实验和研究。目前，内毒素去除策略有两种：一是在质粒DNA结合阶段去除；二是在质粒DNA洗脱后去除，其中，去除方法主要有液相分离法和固相介质法，如分子筛等。但是，目前市场上液相分离法的优点是成本低，但去内毒素效果差且有RNA残留；而固相介质法成本高，操作复杂，优点是去内毒素效果好，可见，现有的内毒素去除方法各有优劣。
因此，对于无内毒素高纯质粒DNA提取而言亟需一款成本低、纯度高、效率高、去内毒素效果佳的试剂盒。
发明内容
本发明针对现有的内毒素去除方法存在操作复杂、成本高、去除效果差且有RNA残留的技术问题，提出一种无内毒素质粒快速提取试剂盒及质粒提取方法，具有成本低、纯度高、提取效率高且去内毒素效果佳等特点。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
无内毒素质粒快速提取试剂盒，包括裂解试剂组、杂质去除试剂、内毒素清除试剂、洗脱试剂组和至少一个吸附柱；
其中，所述内毒素清除试剂含有pH＝6.5-7.5、浓度为10-200mmo/L的Tris-HCl缓冲液、浓度为10-200mmo/L氯化钠、体积分数为10％-20％的Triton X-114、质量体积比为0.0001％-0.005％的溴酚蓝。
在一实施方式中，裂解试剂组包括菌体重悬剂、碱性裂解液和中和溶液。
在一实施方式中，菌体重悬剂含有pH＝8.0、浓度为20-50mM的Tris-HCl缓冲液、pH＝8.0，25℃，浓度为10-20mM的EDTA，浓度为100mg/mL的RNase A；
碱性裂解液含有浓度为150-200mM的NaOH和1％-10％的SDS；
中和溶液含有浓度为4-6M的盐酸胍和pH＝4.2，浓度为0.5-1.0M的醋酸钾溶液。
在一实施方式中，杂质去除试剂为去蛋白液，其含有pH＝7.0-7.5，浓度为4-6M盐酸胍、浓度为10-200mM的Tris-HCl缓冲液和体积分数为40％-60％的异丙醇。
在一实施方式中，洗脱试剂组包含漂洗液和洗脱液。
在一实施方式中，漂洗液含有pH＝7.0-7.5，浓度为10-100mM的氯化钠、浓度为10-100mM的Tris-HCl缓冲液、体积分数为50％-80％的无水乙醇；
洗脱液含有pH＝8.0-8.5，浓度为0.01-0.1mM的EDTA和浓度为10-100mM的Tris-HCl缓冲液。
在一实施方式中，利用无内毒素质粒快速提取试剂盒提取的质粒内毒素含量低于0.1EU/μg。
本发明还提供了一种质粒提取方法，该方法利用上述任一实施方式所述的无内毒素质粒快速提取试剂盒进行质粒提取。
在一实施方式中，质粒提取方法，具体包括以下步骤：
样品重悬与裂解：采用菌体重悬剂进行样品重悬后，依次利用碱性裂解液温和裂解菌液，中和溶液中和残留的碱性裂解液，离心，取上清液；
内毒素清除：向所述样品重悬与裂解步骤中获得的上清液中加入一定体积的内毒素清除试剂，冰浴、室温放置后离心，取上清液后，向上清液中加入0.2-0.5倍体积的异丙醇混匀，随后移入吸附柱中，离心，弃废液；
杂质去除：向所述吸附柱中加入杂质去除试剂，离心，弃废液；
杂质漂洗：向经过杂质去除步骤后的吸附柱中加入漂洗液，离心，弃废液，重复该步骤1次，离心空甩2-3min；
质粒DNA洗脱：向经过杂质漂洗后的吸附柱中加入洗脱液，离心，收集质粒DNA于新的离心管中。
在一实施方式中，在内毒素清除步骤中，内毒素清除试剂的添加量为上清液体积的0.1-0.3倍。
与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：
1、本发明提供的无内毒素质粒快速提取试剂盒，通过优化内毒素清除试剂中各组分的配比，最终得到一款内毒素去除效果理想的质粒提取试剂盒，利用该试剂盒提取出的内毒素水平低于0.1EU/μg，能够满足细胞转染、基因治疗、基因工程等需较低水平内毒素的实验和研究要求；
2、本发明提供的无内毒素质粒快速提取试剂盒及质粒提取方法具有成本低、纯度高、提取效率高且去内毒素效果佳等特点。
附图说明
图1为本发明实施例所提供的质粒DNA电泳图。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例提供了一种无内毒素质粒快速提取试剂盒，包括裂解试剂组、杂质去除试剂、内毒素清除试剂、洗脱试剂组和至少一个吸附柱；
其中，内毒素清除试剂含有pH＝6.5-7.5、浓度为10-200mmo/L的Tris-HCl缓冲液、浓度为10-200mmo/L氯化钠、体积分数为10％-20％的Triton X-114、质量体积比为0.0001％-0.005％的溴酚蓝。
在上述实施例中，本发明提供了一种无内毒素质粒快速提取试剂盒，该款试剂盒中包含了内毒素清除试剂，共含有4种组分，分别是提供缓冲作用的Tris，提供阳离子的氯化钠、特异结合细菌内毒素的Triton X-114、提供沉降指示作用的溴酚蓝，在缓冲液及盐阳离子的共同作用下，Triton X-114和内毒素的脂质部分结合，通过液相分离的方法萃取内毒素从而使后者有效地去除，溴酚蓝便于具体操作步骤中的可视化。
在一具体实施方式中，裂解试剂组包括菌体重悬剂、碱性裂解液和中和溶液。
在一具体实施方式中，菌体重悬剂含有pH＝8.0、浓度为20-50mM的Tris-HCl缓冲液、pH＝8.0，25℃，浓度为10-20mM的EDTA，浓度为100mg/mL的RNase A；
碱性裂解液含有浓度为150-200mM的NaOH和1％-10％的SDS；
中和溶液含有浓度为4-6M的盐酸胍和pH＝4.2，浓度为0.5-1.0M的醋酸钾溶液。
在一具体实施方式中，杂质去除试剂为去蛋白液，其含有pH＝7.0-7.5，浓度为4-6M盐酸胍、浓度为10-200mM的Tris-HCl缓冲液和体积分数为40％-60％的异丙醇。
在一具体实施方式中，洗脱试剂组包含漂洗液和洗脱液。
在一具体实施方式中，漂洗液含有pH＝7.0-7.5，浓度为10-100mM的氯化钠、浓度为10-100mM的Tris-HCl缓冲液、体积分数为50％-80％的无水乙醇；
洗脱液含有pH＝8.0-8.5，浓度为0.01-0.1mM的EDTA和浓度为10-100mM的Tris-HCl缓冲液。
在一具体实施方式中，利用无内毒素质粒快速提取试剂盒提取的质粒内毒素含量低于0.1EU/μg。
本发明还提供了一种质粒提取方法，该方法利用上述任一具体实施方式所述的无内毒素质粒快速提取试剂盒进行质粒提取。
在一具体实施方式中，质粒提取方法，具体包括以下步骤：
S1、样品重悬与裂解：采用菌体重悬剂进行样品重悬后，依次利用碱性裂解液温和裂解菌液，中和溶液中和残留的碱性裂解液，离心，取上清液；
S2、内毒素清除：向所述样品重悬与裂解步骤中获得的上清液中加入一定体积的内毒素清除试剂，冰浴、室温放置后离心，取上清液后，向上清液中加入0.2-0.5倍体积的异丙醇混匀，随后移入吸附柱中，离心，弃废液；
S3、杂质去除：向所述吸附柱中加入杂质去除试剂，离心，弃废液；
S4、杂质漂洗：向经过杂质去除步骤后的吸附柱中加入漂洗液，离心，弃废液，重复该步骤1次，离心空甩2-3min；
S5、质粒DNA洗脱：向经过杂质漂洗后的吸附柱中加入洗脱液，离心，收集质粒DNA于新的离心管中。
在一具体实施方式中，在内毒素清除步骤中，内毒素清除试剂的添加量为上清液体积的0.1-0.3倍。
为了更清楚详细地介绍本发明实施例所提供的无内毒素质粒快速提取试剂盒及质粒提取方法，下面将结合具体实施例进行描述。
实施例1
本实施例提供了一种质粒提取方法，该方法利用无内毒素质粒快速提取试剂盒进行，具体为：
(1)取5-15mL过夜培养的菌液，9,000rpm离心1-2min，收集菌体；
(2)用500μL菌体重悬剂重悬菌体沉淀，涡旋振荡，全部转入一个2mL离心管中；
(3)加500μL的碱性裂解液，温和地上、下翻转6-8次，室温放置4min；
(4)加500μL中和溶液，立即温和地上、下翻转6-8次，充分混匀，12,500rpm离心10min，小心取上清至新管；
(5)加入0.1体积的内毒素清除试剂到步骤(4)所得上清中，颠倒旋转混匀，冰浴放置5min直到浑浊变清亮透明，中间偶尔混匀几次；
(6)常温放置3-5min，温度恢复室温溶液很快变为浑浊，颠倒混匀；
(7)室温12,500rpm离心10min分相，上层水相含DNA，下层蓝色油状相含内毒素和杂质，将含DNA的上层水相转移到新管(注意不要吸到蓝色油状层)，弃油状层；
(8)向上层水相中加入0.5体积异丙醇后充分颠倒混匀后分多次(每次不超过700μL)转入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心1min，弃废液，直到所有混合溶液通过此吸附柱；
(9)加入500μL去蛋白液，12,000rpm离心30s，弃废液(注：此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应加此步骤；如所用菌株为XL-1Blue、Top10和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可略过此步骤)；
(10)加入600μL漂洗液WB，12,000rpm离心30s，弃废液，重复此步骤；
(11)将吸附柱放回空收集管中，12,000rpm离心2min；
(12)取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100-200μL洗脱缓冲液EB，室温2min，12,000rpm离心1min；如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，离心1min。
实施例2
本实施例提供了一种质粒提取方法，该方法利用无内毒素质粒快速提取试剂盒进行，具体为：
(1)分别取5-15mL过夜培养的Plenti CRISPRV2、303M、pcmv-SPORT-6、pshutlle-CMV、PTRE-Tight、pBR322质粒的菌液，9,000rpm离心1-2min，收集菌体；
(2)用500μL菌体重悬剂重悬菌体沉淀，涡旋振荡，全部转入一个2mL离心管；
(3)加500μL的碱性裂解液，温和地上、下翻转6-8次，室温放置4min；
(4)加500μL中和溶液，立即温和地上、下翻转6-8次，充分混匀，12,500rpm离心10min，小心取上清至新管；
(5)加入0.1体积的内毒素清除试剂到步骤(4)所得上清中，颠倒旋转混匀，冰浴放置5min直到浑浊变清亮透明，中间偶尔混匀几次，其中，内毒素清除试剂含有pH＝7.0、浓度为10mmo/L的Tris-HCl缓冲溶液、浓度为100mmo/L氯化钠、体积分数为10％的Triton X-114、质量体积比为0.002％的溴酚蓝；
(6)常温放置3-5min，温度恢复室温溶液很快变为浑浊，颠倒混匀；
(7)室温12,500rpm离心10min分相。上层水相含DNA，下层蓝色油状相含内毒素和杂质，将含DNA的上层水相转移到新管(注意不要吸到蓝色油状层)，弃油状层；
(8)向上层水相中加入0.5体积异丙醇后充分颠倒混匀后分多次(每次不超过700μL)转入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中)，12,000rpm离心1min，弃废液。直到所有混合溶液通过此吸附柱；
(9)加入500μL去蛋白液PE，12,000rpm离心30s，弃废液(注：此步骤为了去除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应加此步骤；如所用菌株为XL-1Blue、Top10和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可略过此步骤)；
(10)加入600μL漂洗液，12,000rpm离心30s，弃废液。重复此步骤；
(11)将吸附柱放回空收集管中，12,000rpm离心2min；
(12)取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加100-200μL洗脱液EB，室温2min，12,000rpm离心1min，如果需要较多量质粒，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，离心1min。
(13)将提取的Plenti CRISPRV2、303M、pcmv-SPORT-6、pshutlle-CMV、PTRE-Tight、pBR322质粒DNA进行Nano-300浓度测定、内毒素水平测定和琼脂糖凝胶电泳，浓度测定数据见表1，琼脂糖凝胶电泳见图1。
表1内毒素水平测定结果
| 样本名称 | 浓度(ng/μl) | A260/280 | A260/230 | 内毒素水平(EU/μg) |
| Plenti CRISPRV2 | 608 | 1.86 | 2.31 | ＜0.1 |
| 303M | 468 | 1.85 | 2.17 | ＜0.1 |
| pcmv-SPORT-6 | 362 | 1.84 | 2.23 | ＜0.1 |
| pshutlle-CMV | 132 | 1.85 | 2.42 | ＜0.1 |
| PTRE-Tight | 281 | 1.87 | 2.53 | ＜0.1 |
| pBR322 | 60 | 1.8 | 2.07 | ＜0.1 |
由上表所示数据可知，本实施例采用无内毒素质粒快速提取试剂盒对6种不同质粒进行了提取，从这6种质粒的Nano-300浓度数据以及内毒素水平的数据可知，说明了本发明的质粒提取试剂盒提取6种质粒纯度均在标准范围内，内毒素水平均在标准范围内(内毒素水平均低于0.1EU/μg)，浓度足以满足客户实验需求，且样本适用性强。
图1所示电泳图的泳道信息如下：泳道1、3、5、7、9、11为Spark 1Kb DNA Marker，作为分子量标记；泳道2、4、6、8、10、12分别为Plenti CRISPRV2、303M、pcmv-SPORT-6、pshutlle-CMV、PTRE-Tight、pBR322，从图1所示胶图可见清晰的超螺旋质粒主带，且无RNA残留，超螺旋质粒占比95％以上，由此可见，本发明的质粒提取试剂盒不仅能够有效去除内毒素，还能够保证质粒DNA纯度且无RNA残留。
内毒素清除试剂中Triton X-114组分配比优化实验
本发明对内毒素清除试剂中Triton X-114组分进行了配比优化实验，具体选取体积分数10％(v/v)、20％(v/v)、30％(v/v)、40％(v/v)、50％(v/v)进行质粒提取，具体操作步骤同实施例2，不同之处仅在于内毒素清除试剂中Triton X-114的体积分数不同，将提取的质粒DNA进行Nano-300浓度测定、内毒素水平测定，浓度测定数据见表2。
表2内毒素水平测定结果
由表2所示数据可知，本发明通过比对不同体积分数的Triton X-114对内毒素含量的影响，结果表明：当Triton X-114的体积分数为30％(v/v)、40％(v/v)、50％(v/v)时，其内毒素水平并不理想，其水平＜0.4EU/μg，而当Triton X-114的体积分数为10％(v/v)、20％(v/v)时，其内毒素水平＜0.1EU/μg。由此可见，利用本发明所限定的Triton X-114体积分数能够实现的内毒素有效去除。
Claims (8)
1.无内毒素质粒快速提取试剂盒，其特征在于，由裂解试剂组、杂质去除试剂、内毒素清除试剂、洗脱试剂组和至少一个吸附柱组成；
其中，所述内毒素清除试剂含有pH＝6.5-7.5、浓度为10-200mmo/L的Tris-HCl缓冲液、浓度为10-200mmo/L氯化钠、体积分数为10％-20％的Triton X-114、质量体积比为0.0001％-0.005％的溴酚蓝；
所述杂质去除试剂为去蛋白液，其含有pH＝7.0-7.5，浓度为4-6M盐酸胍、浓度为10-200mM的Tris-HCl缓冲液和体积分数为40％-60％的异丙醇；
利用所述无内毒素质粒快速提取试剂盒提取的质粒无RNA残留且内毒素含量低于0.1EU/μg。
2.根据权利要求1所述的无内毒素质粒快速提取试剂盒，其特征在于，所述裂解试剂组包括菌体重悬剂、碱性裂解液和中和溶液。
3.根据权利要求2所述的无内毒素质粒快速提取试剂盒，其特征在于，所述菌体重悬剂含有pH＝8.0、浓度为20-50mM的Tris-HCl缓冲液、pH＝8.0，25℃，浓度为10-20mM的EDTA，浓度为100mg/mL的RNase A；
所述碱性裂解液含有浓度为150-200mM的NaOH和1％-10％的SDS；
所述中和溶液含有浓度为4-6M的盐酸胍和pH＝4.2，浓度为0.5-1.0M的醋酸钾溶液。
4.根据权利要求1所述的无内毒素质粒快速提取试剂盒，其特征在于，所述洗脱试剂组包含漂洗液和洗脱液。
5.根据权利要求4所述的无内毒素质粒快速提取试剂盒，其特征在于，所述漂洗液含有pH＝7.0-7.5，浓度为10-100mM的氯化钠、浓度为10-100mM的Tris-HCl缓冲液、体积分数为50％-80％的无水乙醇；
所述洗脱液含有pH＝8.0-8.5，浓度为0.01-0.1mM的EDTA和浓度为10-100mM的Tris-HCl缓冲液。
6.质粒提取方法，其特征在于，利用如权利要求1-5中任一项所述的无内毒素质粒快速提取试剂盒进行质粒提取。
7.根据权利要求6所述的质粒提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
样品重悬与裂解：采用菌体重悬剂进行样品重悬后，依次利用碱性裂解液温和裂解菌液，中和溶液中和残留的碱性裂解液，离心，取上清液；
内毒素清除：向所述样品重悬与裂解步骤中获得的上清液中加入一定体积的内毒素清除试剂，冰浴、室温放置后离心，取上清液后，向上清液中加入0.2-0.5倍体积的异丙醇混匀，随后移入吸附柱中，离心，弃废液；
杂质去除：向所述吸附柱中加入杂质去除试剂，离心，弃废液；
杂质漂洗：向经过杂质去除步骤后的吸附柱中加入漂洗液，离心，弃废液，重复该步骤1次，离心空甩2-3min；
质粒DNA洗脱：向经过杂质漂洗后的吸附柱中加入洗脱液，离心，收集质粒DNA于新的离心管中。
8.根据权利要求7所述的质粒提取方法，其特征在于，所述内毒素清除步骤中，内毒素清除试剂的添加量为上清液体积的0.1-0.3倍。
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