CN109207473A - 一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法 - Google Patents
一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109207473A CN109207473A CN201811153649.1A CN201811153649A CN109207473A CN 109207473 A CN109207473 A CN 109207473A CN 201811153649 A CN201811153649 A CN 201811153649A CN 109207473 A CN109207473 A CN 109207473A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- liquid
- cervical cell
- proteinase
- lysis buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种宫颈细胞裂解试剂盒及细胞裂解方法,属于细胞裂解技术领域,所述试剂盒包括裂解缓冲液和蛋白酶K;所述裂解缓冲液包括以下浓度的组分:10~500mM的Tris‑HCl、1~80mM的EDTA、0.05~2wt%SDS和100~250mM NaCl。所述细胞裂解方法包括以下步骤:PBS缓冲液清洗宫颈细胞样本液后,与裂解缓冲液混合均匀,加入蛋白酶K混合,53~58℃消化10~14h;然后涡旋震荡30~60s后,53~58℃继续消化1.5~2.5h完成细胞裂解;所述试剂盒及裂解方法能够充分裂解样品中的宫颈细胞,解离出高浓度和高质量的DNA,利于后续DNA的提取和扩增。
Description
技术领域
本发明属于细胞裂解技术领域,尤其涉及一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂 解方法。
背景技术
宫颈癌是威胁女性健康的常见恶性肿瘤之一,有效的筛查和早期诊断, 能够显著降低宫颈癌的发生率与死亡率。宫颈液基薄层细胞学检测(TCT) 已经成为宫颈癌筛查和细胞学诊断的常用方法之一。TCT检测是一种将脱落 细胞保存在保存液中,并通过专用制片仪器将细胞均匀分散黏附到载玻片 上,进行染色观察的技术。临床采集样本时,应用特制的宫颈刷插入宫颈口, 刷取宫颈口和宫颈管的脱落上皮细胞,将宫颈刷的刷头置于装有细胞保存液 的小瓶中进行漂洗,获得细胞样本。之后,保存液中的细胞经混匀、过滤、 转移,最终黏附于载波片上,染色固定后进行细胞学诊断。但由于检测人员 主观因素等原因宫颈液基薄层细胞学检测仍存在漏检的情况,因此,目前宫 颈癌的诊断,也不能单靠细胞学检查;此外,现阶段肿瘤治疗寻求的是精准 个性化治疗,有必要从基因学角度对受试者进行宫颈癌相关基因的检测。
而提取高浓度高质量的细胞DNA的前提是充分裂解细胞,细胞裂解可 通过机械作用、化学作用和酶作用来实现。TCT检测过程中,保存液能够很 好的保存宫颈细胞,而且受检者承受痛苦小,无疑是宫颈癌基因学检测的最 佳样本。TCT检测宫颈细胞保存液中含有细胞成分和非细胞成分;细胞成分 包括上皮细胞和非上皮细胞,上皮细胞包括鳞状细胞和宫颈管细胞,非上皮 细胞包括血细胞,如红细胞等,以及间质细胞。非细胞成分包括固有成分, 如黏液、细菌等,以及污染物,如药物结晶、纤维物、真菌等。因此,保存 液中除了上皮细胞,其他成分均为干扰项。另外,保存液中还含有固定细胞 的化学成分,这类化学成分会使DNA与蛋白质发生交联,影响DNA的释 放,因此保存液本身亦是提取宫颈细胞DNA的干扰项。
由于样本中的干扰项众多,现有的商业化试剂盒根本无法将DNA从宫 颈TCT保存液中充分解离出,由此提取的DNA质量和浓度均不达标,无法 进行后续的扩增实验,更无法获得准确的基因检测结果。
发明内容
有鉴于此,本发明提供一种针对宫颈液基薄层细胞学检测保存液样本的 宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法;所述试剂盒及裂解方法能够充分裂解样品 中的宫颈细胞,解离出高浓度和高质量的DNA,利于后续DNA的提取和扩 增。
为了实现上述目的,本发明提供了一种宫颈细胞裂解试剂盒,包括裂解 缓冲液和蛋白酶K;所述裂解缓冲液以水为溶剂,包括以下浓度的组分: 10~500mM的Tris-HCl、1~80mM的EDTA、0.05~2wt%SDS和100~250mM NaCl。
优选的,所述裂解缓冲液以水为溶剂,包括以下浓度的组分:50~400mM 的Tris-HCl、5~60mM的EDTA、0.1~1wt%SDS和150~220mM NaCl。
优选的,所述裂解缓冲液以水为溶剂,包括以下浓度的组分:100mM的 Tris-HCl、50mM的EDTA、0.1wt%SDS和200mM NaCl。
优选的,所述Tris-HCl的pH值为8.0~8.3。
本发明还提供了所述试剂盒裂解宫颈细胞的方法,包括以下步骤:
1)PBS缓冲液清洗宫颈细胞样本液,固液分离,收集固相组分;
2)将所述固相组分与裂解缓冲液混合,获得混合液;
3)将所述混合液与蛋白酶K溶液混合,进行第一阶段消化,所述第一 阶段消化的温度为53~58℃,时间为10~14h,获得消化液;
4)将所述消化液涡旋震荡30~60s后,继续进行第二阶段消化,所述第 二阶段消化的温度为53~58℃,时间1.5~2.5h;
所述宫颈细胞样本液来源于临床宫颈TCT检测获得的含有宫颈细胞的 保存液。
优选的,所述PBS缓冲液与宫颈细胞样本液的体积比为1~5:1。
优选的,步骤2)中所述的裂解缓冲液与步骤1)中所述的宫颈细胞样 品液的体积比为(1~5):(8~12)。
优选的,所述蛋白酶K溶液的浓度为0.1~2mg/ml。
优选的,步骤2)中所述的裂解缓冲液与步骤3)中所述的蛋白酶K溶 液的体积比为(15~25):1。
优选的,所述第一阶段消化和第二阶段消化的温度独立为54~56℃。
本发明的有益效果:本发明提供的宫颈细胞裂解试剂盒包括裂解缓冲液 和蛋白酶K;所述裂解缓冲液中Tris-HCl提供缓冲体系;EDTA作为二价 金属离子螯合剂,能够抑制细胞中DNase活性;表面活性剂SDS能够溶解 脂质和蛋白质,破坏细胞膜和核膜结构,使细胞破裂,且SDS还能使蛋白 质和多糖变性,使DNA与其相连的蛋白质分离,释放出来;NaCl利于DNA 溶解;所述蛋白酶K,在SDS和EDTA存在下保持很高的活性,能将所有 蛋白降解成为多肽或小片段氨基酸,使DNA分子完整的被分离出来。本发 明所述的试剂盒将上述成分有机组合,能够排除其他细胞、粘液、药物结晶、 保存液中的化学成分等的干扰,有效地将临床宫颈TCT检测获得的保存液 中的宫颈细胞完全裂解。
利用本发明提供的试剂盒以及裂解方法获得的临床宫颈TCT检测过程 中的含有宫颈细胞保存液样本的细胞裂解液,进行常规DNA提取,获得的 DNA浓度可以达到100-300ng/μl,260/280值1.85-2.05,260/230值1.5-1.9; 以提取的DNA为模板进行PCR扩增后,管家基因的扩增曲线良好,CT值 在25-27之间。由此可见,利用本发明提供的试剂盒获得的裂解液进行DNA 提取,能够获得高质量、高浓度的DNA,有利于后续DNA的扩增和基因检 测。
具体实施方式
细胞裂解是细胞DNA提取的首要关键步骤,细胞裂解是否充分,DNA 释放是否完全,直接决定DNA提取的纯度和浓度,影响后续PCR实验的结 果。临床TCT检测保存液中的脱落宫颈细胞细胞量少,且后续要进行PCR 检测实验,常规的细胞裂解方法并不适用。本发明采用将化学作用与酶作用 相结合的方法,可以降低对细胞量的需求,且较温和,能够获得完整的DNA 链。
本发明提供了一种宫颈细胞裂解试剂盒,所述试剂盒的裂解对象为宫颈 液基薄层细胞学检测保存液样本中的宫颈细胞;所述试剂盒也可以用来裂解 其他形式的细胞。本发明中,所述试剂盒包括裂解缓冲液和蛋白酶K;所述 裂解缓冲液以水为溶剂,包括以下浓度的组分:10~500mM的Tris-HCl、 1~80mM的EDTA、0.05~2wt%SDS和100~250mM NaCl。
在本发明中,所述裂解缓冲液以水为溶剂,优选的包括以下浓度的组分: 50~400mM的Tris-HCl、5~60mM的EDTA、0.1~1wt%SDS和150~220mM NaCl;更优选的,包括以下浓度的组分:100mM的Tris-HCl、50mM的EDTA、 0.1wt%SDS和200mM NaCl。
在本发明中,所述裂解缓冲液中Tris-HCl的pH值优选为8.0~8.3,更优 选为8.1~8.2;所述Tris-HCl的作用是提供缓冲体系,使整个体系的pH维持 在弱碱性的范围内;本发明中所述EDTA作为二价金属离子螯合剂,能抑制 细胞中DNase活性;SDS为强变性剂和蛋白溶解剂,去污剂,能溶解细胞 膜和核膜,破坏细胞,并将DNA与其相连的蛋白质分离;NaCl利于DNA 溶解。本发明对所述裂解缓冲液中各个成分的来源没有特殊限定,采用市售 产品即可。
本发明对所述蛋白酶K的来源没有特殊限定,采用本领域常规市售蛋白 酶K即可;本发明中,所述试剂盒中的蛋白酶K优选为市售蛋白酶K粉末 或蛋白酶K溶液;所述蛋白酶K在使用时,优选的以蛋白酶K溶液的形式 使用;所述蛋白酶K溶液优选的以超纯水为溶剂溶解蛋白酶K粉末获得。 本发明中所述蛋白酶K溶液的浓度优选为0.1~2mg/ml,更优选为0.5~1.5mg/ml;本发明中所述蛋白酶K的作用为降解蛋白质,使DNA分子 分离出来。本发明中所述蛋白酶K,在SDS和EDTA存在下仍能保持很高 的活性,能将所有蛋白降解成为多肽或小片段氨基酸,使DNA分子完整的 被分离出来。所述蛋白酶K的酶活力优选为40U/mg。
本发明还提供了利用所述试剂盒裂解宫颈细胞的方法,包括以下步骤: 1)PBS缓冲液清洗宫颈细胞样本液,固液分离,收集固相组分;2)将所述 固相组分与裂解缓冲液混合,获得混合液;3)将所述混合液与蛋白酶K溶 液混合,进行第一阶段消化,所述第一阶段消化的温度为53~58℃,时间为 10~14h,获得消化液;4)将所述消化液涡旋震荡30~60s后,继续进行第二 阶段消化,所述第二阶段消化的温度为53~58℃,时间1.5~2.5h;所述宫颈 细胞样本液来源于临床宫颈TCT检测获得的含有宫颈细胞的保存液。
在本发明中,所述宫颈细胞样本液来源于临床宫颈TCT检测过程中含 有宫颈细胞的保存液。本发明中所述样本液无需另行制备,直接采用医院临 床宫颈TCT检测的保存液即可,易于获得。在本发明中,所述样本液为含 有脱落的宫颈细胞的保存液;所述样本液存放于-20℃条件下,为固态或液 体,取决于不同公司的产品。本发明中所述样本液即宫颈TCT检测获得的 保存液内成分复杂,除了目的细胞(宫颈细胞),保存液中还会还有非上皮细胞、非细胞成分;并且每次临床获得的样本由于医生的操作差异、宫颈病 变部位的差异性等因素,细胞含量也会存在很大的差异性。本发明得到的临 床样本液中的保存液分别来自2个公司的产品,美国BD公司的Surepath和 美国Hologic公司的ThinPrep。上述保存液中含有固定细胞的化学成分,这 类化学成分会使DNA与蛋白质发生交联,影响DNA的释放,因此保存液 自身也是宫颈细胞DNA释放的干扰项。
本发明在获得所述宫颈细胞样本液后,用PBS缓冲液清洗宫颈细胞样本 液,固液分离,收集固相组分。在本发明中,所述PBS缓冲液与宫颈细胞样 本液的体积比为1~5:1。本发明中所述PBS缓冲液清洗宫颈细胞即将所述宫 颈细胞样本液与PBS缓冲液混合均匀。本发明中,所述固液分离的方式优选 为离心;所述离心的离心力优选为4000~5000g,更优选为4600g,所述离心 的时间优选为50~70min,更优选为55~65min,最优选为60min。本发明在 所述离心后,去除上清液,收集固相组分,进行下一步操作。
本发明在获得所述固相组分后,将收集到的固相组分与裂解缓冲液混合 均匀获得混合液。本发明中,所述裂解缓冲液与步骤1)中所述的宫颈细胞 样品液的体积比优选为(1~5):(8~12),更优选为(2~4):(9~11)。本发明 对所述混合均匀的方法没有特殊要求,在具体实施过程中,优选的采用吹吸 混匀的方法。
本发明在获得所述混合液后,将所述混合液与蛋白酶K溶液混合,进行 第一阶段消化,所述第一阶段消化的温度为53~58℃,时间为10~14h,获得 消化液。在本发明中所述裂解缓冲液与蛋白酶K的体积比优选为(15~25): 1,更优选为20:1。本发明中所述第一阶段消化的温度优选为54~56℃,更 优选为55℃,所述消化的时间优选为11~13h,更优选为12h。
本发明在获得所述消化液后,将所述消化液涡旋震荡30~60s后,继续 进行第二阶段消化,所述第二阶段消化的温度为53~58℃,时间1.5~2.5h。 本发明中所述涡旋震荡采用本领域常规的涡旋震荡仪即可,本发明对所述涡 旋震荡的频率没有特殊限定,只能能够实现混匀的效果即可。本发明中所述 继续消化的温度优选为54~56℃,更优选为55℃,所述继续消化的时间优选 为1.5~2.5h,更优选为2h。本发明在所述继续消化结束后完成细胞裂解,实 现细胞的完全裂解。
本发明中在高温条件下(53~58℃)应用表面活性剂SDS溶解脂质和蛋 白质,破坏细胞膜和核膜结构使细胞破裂,且SDS还能使蛋白质和多糖变 性,使DNA与其相连的蛋白质分离,释放出来;加入蛋白酶K,能将蛋白 质水解成多肽或氨基酸,利于DNA完整的分离出来,提高后续操作DNA 获取量和纯度。本发明中所述的蛋白酶K在pH4~12.5以下及高温(50~70℃) 均有活性,且在EDTA和SDS存在时蛋白酶K酶活性也不受影响。高温条 件下(53~58℃),高浓度的SDS,蛋白酶K的作用,以及震荡作用,能使 细胞充分裂解,使DNA与蛋白质更易分离。缓冲体系Tris-HCl提供一定pH 值(弱碱性)的环境,有利于DNA的稳定;二价金属离子螯合剂EDTA可 螯合DNA酶活性所必需的Mg2+、Ca2+,从而抑制DNA酶活性,防止细胞 破碎后DNA酶降解DNA;NaCl有利于DNA的溶解。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把 它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
宫颈上皮细胞裂解试剂盒
裂解缓冲液的制备:
蛋白酶K:20mg/ml。
细胞裂解方法:
临床宫颈TCT检测过程中含有宫颈细胞的保存液10ml加入等体积的 PBS清洗,4600g离心60min,小心去除上清,收集沉淀;
加入1ml上述裂解缓冲液,吹打混匀沉淀,加入50μl蛋白酶K,55℃ 消化12h;
涡旋震荡50s,55℃继续消化2h,至细胞裂解完全。
细胞裂解后,DNA提取按照石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(北 京天根/DP331-02)中的第10步开始操作至完成(试剂盒说明书), 具体包括以下步骤:将裂解的液体分装到1.5ml EP管,每管为220μl, 加入220μl GB,涡旋混匀,继续加入250μl无水乙醇,涡旋混匀并短 暂离心;将以上液体分次加入离心管CR3中,12000rpm离心1min, 弃液体;向离心柱中加入500μl GD,12000rpm离心1min,弃液体; 向离心柱中加入600μl PW,12000rpm离心1min,弃液体;再次向离 心柱中加入600μl PW,12000rpm离心1min,弃液体;开盖室温晾干5-10min,使无水乙醇充分挥发;将离心柱放入一个新1.5EP管,加 入20μl TE,室温15min,12000rpm离心1min,将液体重新加入离心 管,并重新加入40-60μl TE,12000rpm离心1min,测DNA浓度及 纯度。
PCR体系
PCR程序:
PCR体系及程序如上所述
样本液来源BD公司保存液
样品1:DNA浓度为217.0ng/μl,260/280=1.89,260/230=1.87,PCR结 果管家基因CT值为24.79。
样品2:DNA浓度为153.7ng/μl,260/280=1.91,260/230=1.77,PCR结 果管家基因CT值为24.66。
样品3:DNA浓度为135.3.0ng/μl,260/280=1.95,260/230=1.67,PCR 结果管家基因CT值为25.15。
对比例1
样本来源BD公司保存液,样品1、样品2和样品3分别与实施例1中 的样品1、样品2和样品3相同。
细胞裂解采用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(北京天根/DP331-02)细 胞裂解试剂盒,具体方法参见试剂盒说明书。
样品1:浓度为1.5ng/μl,260/280=3.2,260/230=0.05,因浓度过低无法 进行后续PCR实验。
样品2:浓度为2.2ng/μl,260/280=3.32,260/230=0.03,因浓度过低无 法进行后续PCR实验。
样品3:浓度为13.5ng/μl,260/280=1.45,260/230=0.04,因浓度过低无 法进行后续PCR实验。
实施例2
宫颈上皮细胞裂解试剂盒
裂解缓冲液以水为溶剂,包括以下浓度的组分:200mM的Tris-HCl、 50mM的EDTA、0.1wt%SDS和200mMNaCl
蛋白酶K:20mg/ml。
细胞裂解方法:
临床宫颈TCT检测过程中含有宫颈细胞的保存液12ml加入2倍体积的 PBS清洗,4600g离心60min,小心去除上清,收集沉淀;
加入1ml上述裂解缓冲液,吹打混匀沉淀,加入50μl蛋白酶K,55℃ 消化12h;
涡旋震荡50s,55℃继续消化2h,至细胞裂解完全。
细胞裂解后,DNA提取按照石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(北 京天根/DP331-02)中的第10步开始操作至完成(试剂盒说明书详), 具体包括以下步骤:将裂解的液体分装到1.5ml EP管,每管为220μl, 加入220μl GB,涡旋混匀,继续加入250μl无水乙醇,涡旋混匀并短 暂离心;将以上液体分次加入离心管CR3中,12000rpm离心1min, 弃液体;向离心柱中加入500μl GD,12000rpm离心1min,弃液体; 向离心柱中加入600μl PW,12000rpm离心1min,弃液体;再次向离 心柱中加入600μl PW,12000rpm离心1min,弃液体;开盖室温晾干5-10min,使无水乙醇充分挥发;将离心柱放入一个新1.5EP管,加 入20μl TE,室温15min,12000rpm离心1min,将液体重新加入离心 管,并重新加入40-60μl TE,12000rpm离心1min,测DNA浓度及 纯度。
样本液来源新柏氏公司保存液
样品1:浓度为63.8ng/μl,260/280=2.00,260/230=1.38,PCR结果管家 基因CT值为24.2。
样品2:浓度为145.5ng/μl,260/280=1.96,260/230=1.61,PCR结果管 家基因CT值为23.4。
样品3:浓度为324.7ng/μl,260/280=1.94,260/230=1.72,PCR结果管 家基因CT值为23.6。
对比例2
样本液来源新柏氏公司保存液
样品1、样品2和样品3分别与实施例2中的样品1、样品2和样品3 相同。
细胞裂解采用石蜡包埋组织DNA提取试剂盒(北京天根/DP331-02)细 胞裂解试剂盒,具体方法参见试剂盒说明书。
样本1:浓度:54.5ng/μl,260/280=1.36,260/230=0.45,因浓度过低无 法进行后续PCR实验。
样本2:浓度:3.9ng/μl,260/280=0.93,260/230=0.11,因浓度过低无法 进行后续PCR实验。
样本3:浓度:16.3ng/μl,260/280=1.48,260/230=0.29,因浓度过低无 法进行后续PCR实验。
由上述实施例可知,本发明提供的试剂盒和裂解方法获得的DNA在加 入50~100μl TE后,浓度可以达到100~300ng/μl,260/280值1.85~2.05,260/230 值1.5~1.9,PCR扩增后,管家基因的扩增曲线良好,CT值在25~27之间; 而其他常规裂解方法,采用同样的试剂盒提取,加入20~40μlTE后,浓度达 不到20ng/μl,260/280值范围很大,不稳定,在1~3之间,260/230值在0~0.1 之间,浓度及纯度过低无法进行后续的PCR实验,无法进行PCR结果的比 较。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的 普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和 润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种宫颈细胞裂解试剂盒,其特征在于,包括裂解缓冲液和蛋白酶K;所述裂解缓冲液以水为溶剂,包括以下浓度的组分:10~500mM的Tris-HCl、1~80mM的EDTA、0.05~2wt%SDS和100~250mM NaCl。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,包括以下浓度的组分:50~400mM的Tris-HCl、5~60mM的EDTA、0.1~1wt%SDS和150~220mM NaCl。
3.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述裂解缓冲液包括以下浓度的组分:100mM的Tris-HCl、50mM的EDTA、0.1wt%SDS和200mM NaCl。
4.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,所述Tris-HCl的pH值为8.0~8.3。
5.利用权利要求1~4任意一项所述试剂盒裂解宫颈细胞的方法,包括以下步骤:
1)PBS缓冲液清洗宫颈细胞样本液,固液分离,收集固相组分;
2)将所述固相组分与裂解缓冲液混合,获得混合液;
3)将所述混合液与蛋白酶K溶液混合,进行第一阶段消化,所述第一阶段消化的温度为53~58℃,时间为10~14h,获得消化液;
4)将所述消化液涡旋震荡30~60s后,继续进行第二阶段消化,所述第二阶段消化的温度为53~58℃,时间1.5~2.5h;
所述宫颈细胞样本液来源于临床宫颈TCT检测获得的含有宫颈细胞的保存液。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述PBS缓冲液与宫颈细胞样本液的体积比为1~5:1。
7.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤2)中所述的裂解缓冲液与步骤1)中所述的宫颈细胞样品液的体积比为(1~5):(8~12)。
8.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,所述蛋白酶K溶液的浓度为0.1~2mg/ml。
9.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,步骤2)中所述的裂解缓冲液与步骤3)中所述的蛋白酶K溶液的体积比为(15~25):1。
10.根据权利要求6所述的方法,其特征在于,所述第一阶段消化和第二阶段消化的温度独立为54~56℃。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811153649.1A CN109207473B (zh) | 2018-09-30 | 2018-09-30 | 一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201811153649.1A CN109207473B (zh) | 2018-09-30 | 2018-09-30 | 一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN109207473A true CN109207473A (zh) | 2019-01-15 |
CN109207473B CN109207473B (zh) | 2020-07-17 |
Family
ID=64982569
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201811153649.1A Active CN109207473B (zh) | 2018-09-30 | 2018-09-30 | 一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN109207473B (zh) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110373410A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-10-25 | 江苏莱尔生物医药科技有限公司 | 一种核酸快速裂解液及制备工艺以及其应用方法 |
CN112626174A (zh) * | 2020-12-16 | 2021-04-09 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种细胞裂解液及其应用 |
CN113957122A (zh) * | 2020-07-21 | 2022-01-21 | 厦门希吉亚生物科技有限公司 | 一种在宫颈细胞样本中提取dna的方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101413018A (zh) * | 2008-12-09 | 2009-04-22 | 中南大学 | 一种基因组dna的提取方法 |
CN101747399A (zh) * | 2008-12-19 | 2010-06-23 | 华中科技大学 | 一种从福尔马林固定组织中提取dna的方法 |
CN101955992A (zh) * | 2010-04-27 | 2011-01-26 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 一种黑热病媒介白蛉种类的鉴别方法及其鉴别试剂盒 |
CN105368817A (zh) * | 2015-12-08 | 2016-03-02 | 苏州国科闻普生物科技有限公司 | 宫颈细胞保存及dna快速提取一体试剂盒和提取方法 |
CN107746843A (zh) * | 2017-10-20 | 2018-03-02 | 南通柯侎克生物科技有限公司 | 一种败血症专用细菌基因组dna提取试剂盒及方法 |
-
2018
- 2018-09-30 CN CN201811153649.1A patent/CN109207473B/zh active Active
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101413018A (zh) * | 2008-12-09 | 2009-04-22 | 中南大学 | 一种基因组dna的提取方法 |
CN101747399A (zh) * | 2008-12-19 | 2010-06-23 | 华中科技大学 | 一种从福尔马林固定组织中提取dna的方法 |
CN101955992A (zh) * | 2010-04-27 | 2011-01-26 | 中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所 | 一种黑热病媒介白蛉种类的鉴别方法及其鉴别试剂盒 |
CN105368817A (zh) * | 2015-12-08 | 2016-03-02 | 苏州国科闻普生物科技有限公司 | 宫颈细胞保存及dna快速提取一体试剂盒和提取方法 |
CN107746843A (zh) * | 2017-10-20 | 2018-03-02 | 南通柯侎克生物科技有限公司 | 一种败血症专用细菌基因组dna提取试剂盒及方法 |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110373410A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-10-25 | 江苏莱尔生物医药科技有限公司 | 一种核酸快速裂解液及制备工艺以及其应用方法 |
CN113957122A (zh) * | 2020-07-21 | 2022-01-21 | 厦门希吉亚生物科技有限公司 | 一种在宫颈细胞样本中提取dna的方法 |
CN113957122B (zh) * | 2020-07-21 | 2024-01-26 | 厦门赛尔吉亚医学检验所有限公司 | 一种在宫颈细胞样本中提取dna的方法 |
CN112626174A (zh) * | 2020-12-16 | 2021-04-09 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种细胞裂解液及其应用 |
CN112626174B (zh) * | 2020-12-16 | 2024-05-07 | 广州源井生物科技有限公司 | 一种细胞裂解液及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN109207473B (zh) | 2020-07-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109207473A (zh) | 一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法 | |
Ryan et al. | A new trichrome-blue stain for detection of microsporidial species in urine, stool, and nasopharyngeal specimens | |
DE69633940T2 (de) | Verfahren zur isolierung von zellen | |
Bogaert et al. | Bovine papillomavirus DNA can be detected in keratinocytes of equine sarcoid tumors | |
CN108918228A (zh) | 血清或血浆中的外泌体制备试剂盒及外泌体制备方法 | |
Bradley et al. | Composition and ultrastructure of Streptomyces venezuelae | |
EP0342128A1 (fr) | Sondes à papillomavirus (HPV49, HPV50, HPV54, HPV55), produits génétiquement et immunologiquement liés à ce papillomavirus et procédé de diagnostic in vitro d'infection à papillomavirus et de production d'anticorps contre ces papillomavirus | |
WO2016045601A2 (zh) | 去除生物制品中细菌内毒素的试剂盒、方法及其生物制品的制备方法 | |
CN111575228A (zh) | 一种能够得到完整外泌体的免疫磁珠分离方法 | |
Hernandez-Montes et al. | Selective solubilization of mammalian spermatozoa structures | |
JP5710969B2 (ja) | 糞便試料からの核酸回収方法 | |
CN108330125A (zh) | 一种骨骼或牙齿dna磁珠提取方法和试剂 | |
US6395512B1 (en) | DNA coding for a peptide of a papilloma virus main capside protein and use thereof | |
EP0939118A1 (en) | Method for isolating DNA and RNA from faeces | |
Abdelbadiaa et al. | Human papillomavirus (HPV) in Egyptian females: study by cytology, histopathology, colposcopy and molecular diagnosis of high risk types | |
Pesca et al. | Simultaneous Detection of Aspergillus nidulans, Aspergillus luchuensis and lichtheimia Sp. in a Bovine Abortion | |
JP2000501285A (ja) | 合成hpv11ウイルス様粒子 | |
Helwig et al. | Isolation of glomeruli and tubular fragments from rabbit kidney | |
Jäke et al. | Rejection, herpesvirus infection, and Ki-67 expression in endomyocardial biopsy specimens from heart transplant recipients | |
Shepard et al. | Preparation of suspensions of rickettsiae from infected yolk sacs without the use of ether | |
WO2008021502A2 (en) | Methods and compositions for removing cells from collection material | |
Howatson | Particulate material in extracts of normal and of tumour tissue: an electron microscope study | |
US20220356507A1 (en) | Methods and Devices for Obtaining Cellular and DNA Material from Human Female Reproductive System | |
CN114350610B (zh) | 一种用于分离脑和脊髓组织细胞核的试剂盒及细胞核的分离方法 | |
CA2064060A1 (fr) | Sonde a papillomavirus (hpv66), notamment pour le diagnostic in vitro d'infections a papillomavirus, pouvant s'accompagner de neoplasies genitales, et produits genetiquement genetiquement et immunologiquement lies a ce papillomavirus |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
GR01 | Patent grant | ||
GR01 | Patent grant |