DE69633940T2

DE69633940T2 - Verfahren zur isolierung von zellen

Info

Publication number: DE69633940T2
Application number: DE69633940T
Authority: DE
Inventors: Kenneth Ian Great Shelford O'NEILL; Alexandre Loktionov
Original assignee: NEILL IAN KENNETH O; O'Neill Ian Kenneth Grantchester
Current assignee: NEILL IAN KENNETH O; O'Neill Ian Kenneth Grantchester
Priority date: 1995-09-06
Filing date: 1996-09-05
Publication date: 2005-12-22
Anticipated expiration: 2016-09-06
Also published as: GB9518156D0; US6187546B1; EP0873502B1; EP0873502A2; ATE283473T1; JPH11511982A; WO1997009600A3; WO1997009600A2; AU6883096A; DE69633940D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Isolieren von Zellen, insbesondere von abgeblätterten oder abgeschuppten Epithelzellen.
Abgeblätterte Epithelzellen bestehen aus zellulären Komponenten, wie z. B. DNA, RNA und Proteinen, die möglicherweise eine Vielzahl an Möglichkeiten bieten, Krankheitszustände des Epithels zu identifizieren und zu überwachen; Beispiele dafür sind Kolorektal-Karzinom, Polypen und ulzeröse Kolitis. Die problemlose Gewinnung solcher Zellen ermöglicht die Durchführung einer Vielzahl an Testverfahren für die qualitative und/oder quantitative Analyse von z. B. DNA-Veränderungen, Gen-Expression und Enzymaktivität.
Die Früherkennung zellulärer, genetischer und anderer Biomarker von Tumorgenese oder Malignität ist ein entscheidender Faktor bei der Prophylaxe und Behandlung von Krebs und anderen Krankheitszuständen. Verschiedene Karzinome wie etwa Kolorektal-, Lungen-, orales, Pankreas-, Gallengang, Harnblasen- und einige andere Epithelgewebe-Karzinom treten in substanzieller Inzidenz auf (Cancer Incidence in five Continents, Bd. VI, Hg. Parkin, D. M. et al., IARC Scientific Publications Nr. 20, IARC, Lyon, Frankreich) und sind mit substanzieller Mortalität verbunden, da in vielen Fällen aufgrund des Fehlens nichtinvasiver, kostengünstiger und allgemein verfügbarer Screening-Verfahren Tumoren zu spät diagnostiziert werden, um heilbar zu sein. Derzeit werden zahlreiche Krebsfälle erst dann erkannt, wenn eine Tumormasse, Blutung oder ein andere Fehlfunktion zur Durchführung diagnostischer Verfahren führt, die nur ein fortgeschrittenes Stadium neoplastischer Prozesse bestätigen können, die oft drastische Behandlungsschritte – häufig mit geringen Erfolgsaussichten – erfordern. Ein Beispiel für diese Problematik ist Pankreaskarzinom, dessen frühe Symptome leicht mit jenen häufigerer Krankheiten verwechselt werden können; wenn aber die Krebsdiagnose schließlich erstellt wird, beträgt die durchschnittliche Lebenserwartung freilich nur mehr drei Monate. Ein weiteres Beispiel dafür ist kolorektales Karzinom, das 5% der Bevölkerung befällt und dem 3% zum Opfer fallen. Laut Studien ist dieser Krebs nur im Falle früher Eingriffe heilbar. Das Fehlen von Verfahren, die die Früherkennung von Neoplasie in Stadien vor invasiven Eingriffen oder sogar noch vor der Malignität ermöglichen, ist eklatant, obwohl kürzlich entwickelte Verfahren zur Detektion von mit Krebs zusammenhängenden genetischen Veränderungen (Mao L. et al., Cancer Research (Suppl.) 54, 1939s–1940s (1990)) und erste Erkenntnisse über eine Sequenz genetischer Läsionen, die zu Neoplasie führen (Fearon E. R. et al., Cell 67, 757–767), zu Optimismus Anlass geben.
Bei der Entwicklung eines Programms zum Massen-Screening zwecks Früherkennung und Behandlung von präkanzerösen oder kanzerösen Zuständen sind einfache Verfahren zum Erhalten von Gewebe-, Zell- oder DNA-Proben, auf denen diagnostische Tests durchgeführt werden können, von grundsätzlicher Bedeutung. Für Individuen, in denen Karzinom, Polypen oder eine präneoplastische Läsion identifiziert wurde oder die offenkundig aufgrund ihrer genetischen Prädisposition einem erhöhten Risiko ausgesetzt sind, ist es ferner wichtig, mehrmals Gewebeproben zu entnehmen, um das Ansprechen auf die Behandlung oder ein allfälliges Wiederauftreten von Symptomen zu ermitteln. Zu solchen Behandlungen zählen jene, die einen Tumor eliminieren oder präventive metabolische Veränderungen induzieren sollen.
Herkömmliche Probenziehverfahren sehen üblicherweise die Entnahme einer Gewebeprobe (Biopsie) aus dem Patienten vor. Biopsieverfahren sind jedoch invasiv, erfordern häufig lokale Anästhesie oder Vollnarkose und führen zumindest zu massivem Unbehagen des Patienten. Außerdem entnimmt man bei einer Biopsie – außer man zieht eine Probe eines Tumors oder Polypen – eine kleine Gewebeprobe, die a priori für das Organ oder Gewebe insgesamt nicht repräsentativ ist. Solche Techniken sind daher für routinemäßig durchgeführtes Massen-Screening ungeeignet.
Eine Screening-Methode zur Früherkennung von kolorektalen Tumoren basiert auf „fecal occult blood testing" (FOBT; Test auf verborgenes Blut im Stuhl). Der wesentliche Vorteil von FOBT ist, dass dieser Test nichtinvasiv, einfach und kostengünstig ist. Allerdings das Fehlen oder Vorhandensein von Blut im Stuhl nicht notwendigerweise mit dem Fehlen oder Vorhandensein eines Tumors in Zusammenhang. Daher ist diese Methode nicht frei von fälschlicherweise positiven Ergebnissen, und sie kann auch in vielen Fällen Krebs – und insbesondere Polypen – nicht nachweisen.
Mehrere Studien belegten, dass es möglicherweise eine Korrelation zwischen erhöhter Kolonozyten-Proliferation und kolorektalem Krebsrisiko und/oder dem Vorhandensein kolorektaler Tumoren gibt (Terpstra O. T. et al., Gastroeneterology 92, 704–708 (1987); Soalmati A. et al., Cancer Res. 50, 7937–7941 (1990); Risio M. et al., Cancer Res. 51 (1991); Al-Sheneber I. F. et al., Cancer 71, 1954–1959 (1993)). Diese Ergebnisse konnten jedoch keine statistische Signifikanz erzielen und waren in Bezug auf einige Patienten kontroversiell. Die bislang publizierten Daten und Methoden konnten die erhöhte Kolonozyten-Proliferation als Grundlage für einen zuverlässigen oder praktikablen diagnostischen Test auf kolorektales Krebsrisiko und/oder Vorhandensein kolorektaler Tumoren noch nicht bestätigen.
Ein Verfahren zum Isolieren von Humanzellen aus homogenisierten Fäzes wurde bereits veröffentlicht (Albaugh G. P. et al., Int. J. Cancer 52, 347–250 (1992); lyengar V. et al., FASEB J. 5, 2856–2859). Das beschriebene Verfahren sieht die Verwendung einer homogenisierten Stuhlprobe vor und erwies sich in der Reproduktion als schwierig; außerdem ist es in Bezug auf Geschwindigkeit, Ausbeute und Selektivität mangelhaft und kommt daher für das routinemäßige Massen-Screening nicht in Frage. Dutta S. K. et al. (AGA Abstracts, Gastroenterology 108 (1995) A463) wandten dieses Verfahren auf der Basis der Dichtegradient-Trennung an, um die Anzahl an Kolonozyten, die pro Gramm homogenisierter Stuhlprobe in Patienten mit kolorektalem Karzinom und Vergleichsprobanden gewonnen wurden, zu vergleichen. Obwohl eine Tendenz zu höherer Gewinnung bei Krebspatienten bestand (die Rate betrug etwa das Doppelte jener der Vergleichsprobanden), konnte diese Differenz keine statistische Signifikanz erreichen.
Ein Verfahren zum Isolieren metastatischer maligner Epithelzellen aus Blut wurde ebenfalls beschrieben (Hardingham et al., Cancer Research 53, 3455–3458 (1993)). Das Verfahren sah die Verwendung von Immunmagnetperlen vor, die mit einem für Epithelzellen spezifischen monoklonalen Antikörper markiert sind, um Zellen zu isolieren, die auf die Gegenwart einer Punktmutation im K-ras-Tumormarker-Gen unter Anwendung von PCR analysiert wurden. Man kann jedoch aufgrund der Wahrscheinlichkeit nichtspezifischer Bindungs-Wechselwirkungen zwischen den Immunomagnetperlen und dem im Körperabfallprodukt oder der Gastrointestinal-Flüssigkeit vorhandenen Material nicht davon ausgehen, dass die direkte Nutzung von Immunomagnetperlen allgemein auf die Isolierung von Epithelzellen aus Körperabfallprodukten oder Gastrointestinal-Flüssigkeiten anwendbar ist.
Die Extraktion von DNA direkt aus menschlichem Stuhl zur Detektion von krebsassozierten Gen-Modifikationen durch Verdünnen kleiner Mengen homogenisierter gefrorener Fäzes mit einer Zelllyse-Lösung, gefolgt von der Zentrifugation der resultierenden Suspension und Reinigung mit Glaspulver, ist ebenfalls Gegenstand einer Publikation (Sidransky D. et al., Science 256, 102–105 (1992)). Loktionov und O'Neill (Int. J. Oncology 6, 437–445 (1995)) berichteten über die Isolierung von DNA aus Rattenstuhl durch Inkubieren von Fäzes mit Zelllysepuffer und ein anschließendes Phenol-Chloroform-Extraktionsverfahren. In beiden Fällen wurden nur begrenzte Mengen reiner DNA für die PCR-Amplifikation erhalten.
Es besteht daher weiterhin die Notwendigkeit, Verfahren zur Entnahme von Zellen zu entwickeln, die (a) nichtinvasiv oder minimal invasiv sind, (b) rasch durchgeführt werden, um intakte Zellen zu gewinnen, (c) eine ausreichende Menge an für mehrere Tests geeigneten Zellen bereitstellen, (d) selektiv sind, um irrelevantes Material zurückzulassen, das die Probe möglicherweise verdünnt oder die Tests beeinträchtigt und (e) eine repräsentative Zellsammlung liefern können. Eine weitere Anforderung, die für zahlreiche Testverfahren gilt, besteht darin, dass tatsächlich Zellen erhalten werden und es sich nicht um eine einfache Gewinnung von DNA oder einer anderen zellulären Komponente, die in den Zellen von Interesse vorhanden ist, handelt.
Gemäß der Erfindung ist ein Verfahren zum Isolieren von Zellen aus fäkalem Stuhl bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: das Abkühlen des Stuhls auf eine Temperatur unter seinem Gel-Gefrierpunkt; das Entnehmen von Zellen von der Oberfläche des Stuhls, während der Stuhl auf einer Temperatur unter seinem Gel-Gefrierpunkt gehalten wird, so dass der Stuhl im Wesentlichen intakt bleibt.
Die vorliegende Erfindung ist auf die Isolierung von Säugetierzellen aus dem Stuhl jedes beliebigen Tiers (inklusive des Menschen) anwendbar, wobei sie sich besonders für die Entnahme von Zellen aus der Stuhloberfläche eignet. Menschen produzieren im Bergleich zum pelletförmigen Stuhl einiger Tiere, wie z. B. Nagetiere, weiche Fäzes. Es stellte sich heraus, dass die Abkühlung des Stuhls auf eine Temperatur unterhalb seines Gel-Gefrierpunkts die Stuhlstruktur stabilisiert und dadurch die selektive Entnahme von Humanzellen ermöglicht, insbesondere von der Stuhloberfläche. Beim oder unter dem Gel-Gefrierpunkt geht der Stuhl von einem weichen in ein relativ hartes Material über, das formbeständig ist und manipuliert werden kann. Die genaue Temperatur der Gelbildung variiert von Stuhl zu Stuhl und wird von Faktoren wie der Ernährung beeinflusst. Die Beschaffenheit von Fäzes wurde von Degan und Phillips charakterisiert (Gut 39, 109–113 (1996)), wobei sie eine Skala von 7 (wässrig, keine Festkörper) bis 1 (voneinander getrennte, harte Klumpen) verwenden. Wenn Stuhl unter seinen Gel-Gefrierpunkt abgekühlt wird, geht er von seiner üblichen Beschaffenheit zwischen 6 (flockige Stückchen, ausgefranste Ränder, weich) und 2 (wurstförmig und klumpig) auf 1 (voneinander getrennte, harte Klumpen) über.
Vorzugsweise wird der Stuhl während der gesamten Entname von Zellen aus dem Stuhl bei einer Temperatur unter seinem Gel-Gefrierpunkt gehalten. Es stellte sich ferner heraus, dass die Oberflächenschichten des intakten Stuhls eine besonders ergiebige Quelle abgeblätterter Zellen darstellen.
Die vorliegende Erfindung bietet ein Verfahren zum Isolieren einer Population von Epithelzellen, die direkt repräsentativ für In-vivo-Zellen sind und mit denen sowohl quantitative als auch qualitative Analysen von krebsassoziierten Phänomenen durch geführt werden können. Es sind eine Vielzahl an mit Krebs in Zusammenhang stehenden Phänomenen bekannt, die in Gewebe und seinen Zellbestandteilen und -komponenten auftreten, die mehrere Phasen neoplastischer Transformation durchlaufen. Die vorliegende Erfindung bietet einen nichtinvasiven Zugang zu solchen Zellen und subzellulären Komponenten, wodurch die Überwachung vieler Phänomene ermöglicht wird, die für die Krebserkennung, -behandlung und -prophylaxe wichtig sind.
Die Oberflächenschichten des Stuhls stellen eine besonders ergiebige von für die Isolierung geeigneten abgeblätterten Zellen dar. Typischerweise blättern zwischen einem Sechstel und einem Drittel der Epithelzellen im Darm pro Tag ab. Ohne die vorliegende Erfindung einzuschränken, geht man davon aus, dass einige dieser abgeblätterten Zellen möglicherweise eine „Hülle" um den Stuhl bilden, die einen geringen Anteil an bakteriellen Zellen und anderen fäkalen Materialien enthält. Außerdem geht man davon aus, dass die Lebensfähigkeit der Zellen in den Oberflächenschichten des Stuhls durch folgende Faktoren gefördert wird: (i) die Neigung der Zellen, sich zu Plaques zusammenzuballen; (ii) die Verfügbarkeit von Sauerstoff an der Stuhloberfläche; und (iii) ihre einzigartige Fähigkeit, Butyrat, das lokal in hohen Konzentrationen durch mikroflorale Fermentation gebildet wird, als Energieträger zu nutzen. In Ermangelung der Versorgung über das Blut im Anschluss an das Abblättern führt offenbar die Oxidation von Butyrat den Zellen Energie zu. Es stellte sich heraus, dass die Isolierung von Zellen aus den Oberflächenschichten des Stuhls beträchtliche Vorteile in Bezug auf Ausbeute, Reinheit und Leichtigkeit der Gewinnung nach sich zieht (im Vergleich zur Isolierung von Zellen aus homogenisiertem Stuhl).
Der Ausdruck „Oberflächenschichten" bezieht sich hierin auf die Schicht von fäkalem Material innerhalb von 1,0 mm, vorzugsweise 0,25 mm, von der Stuhloberfläche.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auf die Fäzes jedes Tiers, vorzugsweise Säugetiers, noch bevorzugter des Menschen, angewendet werden.
Zellen können aus dem gekühlten und gelierten Stuhl durch Abschaben (z. B. mit einem Messer oder Skalpell), Abtupfen (z. B. mit einem Glasobjektträger, um für die histologische Analyse einen „Abstrich" zu liefern), Abstreichen, Abschmieren oder sonstigen physikalischen Abrieb oder durch Abwaschen entnommen werden. Vorzugsweise werden die Zellen selektiv aus dem Stuhl entnommen, während die Stuhlstruktur im Wesentlichen intakt bleibt. Vorzugsweise werden die Zellen durch Waschen aus dem Stuhl entfernt.
Es ist ein besonderes Merkmal der Erfindung, dass abgeblätterte Zellen aus dem Stuhl isoliert werden können, indem ein aus den folgenden Schritten bestehendes Verfahren durchgeführt wird:

(a) Abkühlen des Stuhls auf eine Temperatur unter seinem Gel-Gefrierpunkt; und
(b) Abwaschen von Zellen von der Stuhloberfläche mittels einer wässrigen Lösung, während der Stuhl bei einer Temperatur unter seinem Gel-Gefrierpunkt gehalten wird, so dass der Stuhl im Wesentlichen intakt bleibt.

Es zeigte sich, dass beim Abwaschen von Stuhl, der über seinem Gel-Gefrierpunkt liegt, mit einer geringen Menge wässriger Lösung Wasser rasch durch den Stuhl absorbiert wird und kein Waschergebnis vorliegt. Wenn hingegen ein Überschuss wässriger Lösung zugesetzt wird, absorbiert der Stuhl Wasser und bildet eine Aufschlämmung oder Suspension aus fäkalem Material. Die Isolierung abgeblätterter Zellen aus einer derartigen Aufschlämmung oder Suspension erwies sich aufgrund von Schwierigkeiten beim Abtrennen solcher Zellen von großen Mengen an Schleim, bakteriellem Material und Nahrungsabfallstoffen im Stuhl als unpraktisch.
In der Erfindung sorgt der Schritt des Abkühlens des Stuhls auf eine Temperatur unter seinem Gel-Gefrierpunkt für die Stabilisierung der Stuhlstruktur. Vorzugsweise wird der Stuhl auf eine Temperatur von –80°C bis 15°C, noch bevorzugter –10°C bis 15°C, noch bevorzugter –10°C bis 10°C, am bevorzugtesten 0°C bis 5°C, abgekühlt. Es ist zu beachten, dass der Stuhl – um ihn bei einer Temperatur unter seinem Gel-Gefrierpunkt zu halten – mit einer wässrigen Lösung gewaschen werden kann, die auf eine Temperatur unterhalb des Gel-Gefrierpunkts vorgekühlt ist. Vorzugsweise ist die wässrige Lösung eiskalt. Der Stuhl kann zwecks Lagerung vor dem Isolieren von Zellen auf einen Wert deutlich unter dem Gel-Gefrierpunkt (z. B. –20°C bis –80°C) gekühlt werden. Der Stuhl und die Lösung können während des Waschens extern gekühlt werden, um die Temperatur unter dem Gel-Gefrierpunkt zu halten. Es stellte sich heraus, dass beim Waschen des gekühlten Stuhls mit einer wässrigen Lösung keine signifikante Wasserabsorption (typischerweise weniger als 10%) erfolgt. Wenn die wässrigen Waschlösungen vom Stuhl getrennt werden (beispielsweise mittels Dekantieren oder Filtrieren), enthalten die Waschlösungen eine hohe Konzentration abgeblätterter Zellen und eine stark reduzierte Kontamination an bakteriellen Materialien oder Nahrungsabfallstoffen im Stuhl.
Der Stuhl kann mit der wässrigen Lösung ein- oder mehrmals gewaschen und die Waschlösungen kombiniert werden. Das Waschverfahren kann auch leichtes Rühren vorsehen. Übermäßiges Waschen und/oder Rühren ist zu vermeiden, da ansonsten der Stuhl aufbricht oder die an abgeblätterten Zellen reiche Oberflächenschicht zu stark erodiert. Vorzugsweise bleibt der Stuhl während des Waschvorgangs im Wesentlichen intakt. Typischerweise sind die durch das Waschverfahren der Erfindung erhaltenen Waschlösungen blassgelb. Auffällige braune Verfärbungen der Waschlösungen und/oder sichtbare Hinweise auf feste Teilchen in den Waschlösungen sind ein Indikator für signifikante Kontamination durch Schleim, bakterielle Materialien oder Nahrungsabfallstoffe infolge von exzessivem waschen oder Rühren der Probe. Vorzugsweise umfasst das Verfahren der Erfindung das Waschen des Stuhls unter leichtem Rühren, so dass man keine braune Verfärbung der Waschlösungen beobachten kann.
Vorzugsweise wird der Stuhl mit einer wässrigen Lösung gewaschen, die eine kurzkettige Fettsäure oder ein Salz davon enthält, noch bevorzugter eine C_1-6-Fettsäure oder ein Salz davon, noch bevorzugter ein Salz von Buttersäure, am bevorzugtesten Natriumbutyrat. Es stellte sich heraus, dass das Waschen mit einer derartigen wässrigen Lösung zu erhöhter Gewinnung abgeblätterter Zellen führt.
Vorzugsweise wird der Stuhl mit einer wässrigen Suspensionslösung auf der Basis eines Zellkulturmediums, noch bevorzugter eines isotonischen Mediums wie z. B. Minimum Essential Eagle's Medium (MEM), gewaschen. Vorzugsweise enthält die wässrige Lösung außerdem eine oder mehrere der folgenden Komponenten: ein Mukolytikum, wie z. B. N-Acetylcystein; ein Antibiotikum, wie z. B. Penicillin, Streptomycin, Amphotericin B oder Gentamycin; ein anorganisches Salz, wie z. B. Natriumbicarbonat; einen Chelatbildner, wie z. B. EDTA und/oder ein Antikoagulans, wie z. B. Heparin, um Blutgerinnung zu verhindern, sollte sich Blut im Stuhl befinden; ein Protein, wie z. B. Hitzeschock unterzogenes Rinderserumalbumin, das offenbar das Aufbrechen von Zellklumpen unterstützt.
Das oben beschriebene wässrige Waschverfahren liefert eine Probe abgeblätterter Zellen in Suspension, deren Reinheit für zahlreiche Assays und diagnostische Tests in Frage kommt. Die Suspension ist jedoch typischerweise nach wie vor mit Schleim, bakteriellen Materialien und Nahrungsabfallstoffen verunreinigt. Die Zellsuspension kann unter Anwendung einer oder mehrerer der folgenden Techniken gereinigt werden:

(a) Die Zellsuspension kann mit relativ niedriger Geschwindigkeit (z. B. 250 g) zentrifugiert werden. Eine derartige Zentrifugation führt zu einem Pellet, das vor allem die gewünschten abgeblätterten Zellen enthält. Ein Großteil der bakteriellen Zellen und des Schleims sammelt sich im Überstand, der vom Pellet dekantiert werden kann. Das Pellet kann auf Wunsch in der Suspensionslösung resuspendiert werden.
(b) Die Zellsuspension kann mit einem Überschuss Borsäure behandelt werden. Vorzugsweise wird die Suspension mit pulverförmiger Borsäure behandelt, wobei eine ausreichende Menge verwendet wird, so dass ein Teil ungelöst bleibt. Die Suspension aus Zellen und Borsäure wird mehrere Minuten lang gerührt oder geschüttelt, bevor die Borsäure absetzen gelassen wird. Die überschüssige Borsäure kann dann durch Dekantieren oder Filtrieren des Überstands entfernt werden. Es zeigte sich, dass die Behandlung mit Bor säure für das Aufbrechen und Entfernen von Schleim aus der Zellsuspension vorteilhaft ist.
(c) Die Zellsuspension kann mit Immunomagnetperlen behandelt werden, die Magnetperlen umfassen, an die Antikörper gebunden sind, die zur selektiven Bindung an die Zellen von Interesse fähig sind. Daran schließt sich die magnetische Sammlung der Magnetperlen an, an die die Zellen gebunden sind. Verunreinigungen bleiben in der wässrigen Suspension zurück. Vorzugsweise wird ein Überschuss an Immunomagnetperlen dazu verwendet, die Gewinnung von Zellen zu maximieren.

Es ist zu beachten, dass die Schritte (b) und/oder (c) durch Zugabe von Borsäure und/oder Immunmagnetperlen zu einer wässrigen Suspension der durch Waschen des Stuhls erhaltenen Zellen durchgeführt werden können. Alternativ dazu kann die zum Waschen des Stuhls herangezogene wässrige Lösung überschüssige Borsäure und/oder die Immunomagnetperlen enthalten.
Es ist ferner zu beachten, dass jeder der Schritte (a), (b) und (c) optional ist und entfallen kann, wenn z. B. der Stuhl während des Waschens im Wesentlichen intakt bleibt und verbleibender Schleim die anschließenden Testverfahren nicht beeinträchtigt.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Abtrennen abgeblätterter Zellen von Schleim bereitgestellt, umfassend die Behandlung einer wässrigen Suspension von Zellen und Schleim mit Borsäure. Vorzugsweise wird ein Borsäure-Überschuss verwendet. Der Ausdruck „überschüssige Borsäure" oder „Borsäure-Überchuss" bezieht sich hierin auf eine ausreichende Menge, so dass etwas Borsäure ungelöst bleibt.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zum Isolieren von Zellen aus einem Säugetier-Körperabfallprodukt oder einer Flüssigkeit des Verdauungstrakts bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte:

(a) das Mischen der Probe des Körperabfallprodukts oder der Flüssigkeit des Verdauungstrakts mit Immunomagnetperlen, die Magnetperlen umfassen, an die Antikörper gebunden sind, die zur selektiven Bindung an die Zellen fähig sind; und
(b) das magnetische Einsammeln der Magnetperlen, an die die Zellen gebunden sind.

Entgegen den Erwartungen stellte sich heraus, dass Säugetierzellen aus einem Säugetier-Körperabfallprodukt oder einer Flüssigkeit des Verdauungstrakts unter Verwendung von Immunomagnetperlen isoliert werden können. Die Verwendung von Antikörpern, die zur spezifischen Bindung an eine bestimmte Zellart fähig sind, erleichtert die Isolierung dieser bestimmten Zellart, z. B. von Epithelzellen, Lymphozyten oder Makrophagen bzw. von abnormalen Zellen wie z. B. Tumorzellen mit Antigen-Markern. Vorzugsweise wird ein Überschuss an Immunomagnetperlen verwendet, um das Einsammeln von Zellen zu maximieren.
Verfahren zur Herstellung von Immunomagnetperlen wurden von Hardingham et al. (Cancer Research 53, 3455–3458 (1993)) beschrieben. Geeignete Magnetperlen sind bei Dynal (Oslo, Norwegen) erhältlich. Die Perlen können mit jedem beliebigen Antikörper beschichtet sein, der zur Bindung an die Zellen von Interesse fähig ist. Beispielsweise kann die Isolierung von Epithelzellen unter Verwendung von Perlen erfolgen, die mit einem Antikörper beschichtet sind, der zur Bindung von Epithelzellen fähig ist; ein Beispiel dafür ist Antikörper Ber-EP4 (im Handel bei Dako aus Gestrop, Dänemark, erhältlich). Die Isolierung von Lymphozyten und Makrophagen kann mittels für CD8 spezifischer Antikörper stattfinden. Die Isolierung anderer Zelltypen kann unter Verwendung eines geeigneten für Zielzellen spezifischen Antikörpers erfolgen.
Die Antikörper können direkt (z. B. kovalent) oder indirekt (z. B. über einen weiteren Antikörper) an die Perlen gebunden sein. Ein Beispiel für die indirekte Bindung wird von Hardingham et al. (ebda.) beschrieben, wo Magnetperlen (Dynabeads M-450), die kovalent mit Schaf-Anti-Mäuse-IgG beschichtet sind, mit Ber-EP4 inkubiert wurden.
Die Verwendung von Immunomagnetperlen kann auf die Isolierung von Zellen aus jedem Säugetier-Körperabfallprodukt oder jeder Flüssigkeit des Verdauungstrakts angewendet werden. Der Ausdruck „Flüssigkeit des Verdauungstrakts" bezieht sich hierin auf jede Flüssigkeit, die aus dem Verdauungstrakt eines Tiers stammt, z. B. Speichel, Gall-, Pankreas-, Duodenal- und Intestinalflüssigkeiten. Der Ausdruck „Körperabfallprodukt" bezieht sich auf jedes Abfallprodukt des Tierkörpers, z. B. Fäzes, Harn und Sputum. Beispielsweise können Fäzes als Quelle von Zellen aus dem Darmtrakt verwendet werden, insbesondere Kolorektalzellen; Harn kann als Quelle von Harnblasen- und Prostatazellen verwendet werden; Speichel oder Sputum kann als Quelle von Mundschleimhaut-, Tracheal-, Bronchial- und Lungenzellen verwendet werden; und Pankreas-, Gall- oder Duodenalflüssigkeiten können als Quelle von Pankreas- und Cholangiolenzellen verwendet werden. Vorzugsweise werden Harn, Duodenalflüssigkeiten oder Fäzes, noch bevorzugter Fäzes, im Verfahren der Erfindung verwendet.
Die Anzahl der verwendeten Perlen hängt vom jeweiligen Anwendungszweck ab. Beispielsweise wird ein Überschuss an Perlen dazu verwendet, das Einsammeln von Epithelzellen zu maximieren, wenn die Probe eine begrenzte Anzahl an Zellen enthält (wie etwa in Harn); er dient auch zur Quantifizierung, wenn ein hohes Verhältnis zwischen Perlen und Zellen maximale Zellgewinnung innerhalb eines Bereichs von Zellüberfluss, der von klinischem Interesse ist (z. B. bei der DNA-Quantifizierung aus der Stuhloberfläche), sicherstellt. Eine fixe Anzahl von 3 × 10⁷ Perlen stellte sich für die meisten Anwendungen als günstig heraus.
Die oben beschriebenen Techniken der vorliegenden Erfindung können dazu dienen, Zellen jeder beliebigen Art zu isolieren. Dazu zählen Epithelzellen, Lymphozyten und Makrophagen. Vorzugsweise sind die Zellen Epithelzellen. Epithelgewebe sind im Allgemeinen für Krebs im menschlichen Körper am anfälligsten. Dies ist wahrschein lich (a) der Sperrfunktion der Epithelgewebe, die zum Kontakt mit genotoxischen Mitteln, bedingt durch Ernährung und/oder Tabakkonsum und/oder sexuelle Gewohnheiten und/oder das berufliche Umfeld, führt, und (b) den hohen Proliferationsraten zuzuschreiben, die einige der DNA-Schäden in Mutationen umwandeln, die die Zellzykluskontrolle durch DNA-Reparatur und Apoptose-Mechanismen beeinträchtigen. Der Ausdruck „Epithelzellen" umfasst hierin andere Zelltypen, die in großer Menge in Epithelgeweben vorkommen und selbst neoplastische Veränderungen erfahren oder dazu dienen können, auf ungünstige Bedingungen hinzuweisen, die möglicherweise zu Neoplasie in den Epithelgeweben führen könnten.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betriff die Verwendung einer Probe von Zellen, die gemäß einem Verfahren der Erfindung in einem Test zur Diagnose oder Überwachung eines präkanzerösen oder kanzerösen Zustands erhalten werden. Jeder herkömmliche histologische oder immunologische Test bzw. diagnostisches Verfahren kommt für die Zellprobe in Frage. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung einer Probe von Zellen, die gemäß einem Verfahren der Erfindung als DNA-Quelle zur Verwendung in einem Test für die Diagnose oder Überwachung eines präkanzerösen oder kanzerösen Zustands erhalten werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zum Isolieren von DNA aus fäkalem Stuhl bereitgestellt, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst:

(a) Isolieren von Zellen aus dem fäkalen Stuhl durch ein erfindungsgemäßes Verfahren; und
(b) Extrahieren von DNA aus den Zellen.

Es zeigte sich, dass die DNA-Menge, die aus abgeblätterten, aus Stuhl isolierten Zellen extrahiert werden kann, und insbesondere der „Stuhl-DNA-Index" (definiert als Gewicht von isolierter DNA, dividiert durch das Gewicht des Stuhls) ein Indikator dafür ist, ob der Proband, aus dem der Stuhl stammt, einen kolorektalen neoplastischen (kanzerösen oder präkanzerösen) Krankheitszustand aufweist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung bietet daher einen diagnostischen Test auf kolorektale Neoplasie in einem Probanden, umfassend den Schritt des Bestimmens der DNA-Menge, die aus dem fäkalen Stuhl des Probanden isoliert wurde. Der diagnostische Test der Erfindung findet in vitro statt.
DNA kann aus abgeblätterten Zellen extrahiert werden, die mittels eines erfindungsgemäßen Verfahrens aus dem fäkalen Stuhl isoliert werden.
Der Vergleich der Menge isolierter DNA – oder vorzugsweise des Stuhl-DNA-Index – mit Werten für die Menge an isolierter DNA oder dem Stuhl-DNA-Index aus fäkalem Stuhl von Probanden, die kolorektale Neoplasie (kanzeröse oder präkanzeröse Zustände) aufweisen oder von deren Gesundheit ausgegangen werden kann, ist ein Indikator dafür, ob der Proband kolorektales Karzinom oder einen kolorektalen präkanzerösen Zustand aufweist oder gesund ist. Außerdem kann der Stuhl-DNA-Index für die postoperative Überwachung von Krebspatienten herangezogen werden.
Es stellte sich heraus, dass bei Befolgung der unten beschriebenen Arbeitsvorschrift für die Isolierung von DNA und Berechnung des Stuhl-DNA-Index ein Index von unter 600 (im Allgemeinen zwischen 100 und 250 für ein Alter von < 55 Jahren und zwischen 200 und 600 für ein Alter von > 55 Jahren) typischerweise für die Fäzes gesunder Probanden beobachtet wird, ein Index von über 1400 (im Allgemeinen zwischen 1500 und 6000) typischerweise in den Fäzes von Probanden mit kolorektalem Karzinom beobachtet wird und ein Wert dazwischen (zwischen den Werten für gesunde Individuen und jene mir Krebs) für die Fäzes von Personen mit kolorektalen Polypen beobachtet wird, was mit dem biologischem Zwischenstadium von Polypen in der kolorektalen Tumorgenese übereinstimmt, wobei der Stuhl-DNA-Index in ng isolierter DNA, dividiert durch das in g angegebene Gewicht des Stuhls, angegeben wird.
Die signifikante Differenz zwischen dem Stuhl-DNA-Index bei Probanden mit kolorektaler Neoplasie und gesunden Probanden stellt die Grundlage für einen diagnosti schen Test bereit, mit dem man zwischen Probanden, die starke Darm-Neoplasie aufweisen, und gesunden Probanden unterscheiden kann. Außerdem macht die nichtinvasive Beschaffenheit der Verfahren zum Isolieren von DNA aus den Probanden diese Methode attraktiv für Massen-Screening-Programme. Eine Aufwärtstendenz im Stuhl-DNA-Index wird mit zunehmendem Alter des Patienten beobachtet. Dies schränkt jedoch das Potenzial der Technik, Personen mit Neoplasie zu identifizieren, nicht ein.
Es wurde aufgezeigt, dass die Sensitivität und Spezifität der Arbeitsvorschrift für Karzinome jeweils typischerweise über 0,90 (90%) liegt. Im Gegnsatz dazu weist der herkömmliche FOBT üblicherweise eine Sensitivität und Spezifität im Bereich von 0,4 bis 0,7 auf. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Arbeitsvorschrift liegt darin, dass sie eine DNA-Probe bereitstellt, die für weitere Analysen oder bestätigende Tests verwendet werden kann.
Aufgrund ihrer allgemeinen Anwendbarkeit sind die erfindungsgemäßen Verfahren zum Isolieren von Zellen nicht auf die Verwendung von Zellen beschränkt, die in Einklang mit der Erfindung bei der Diagnose von Krebs oder neoplastischen Prozessen erhalten werden; sie umfassen auch Tests auf andere ungünstige Prozesse, die Epithelgewebe betreffen, wobei die Untersuchung abgeblätterter Zellen Informationen über den Einsatz in der Diagnose, Behandlung oder Prophylaxe liefern. Zu den angesprochenen Zuständen bzw. Krankheiten zählen u. a. ulzeröse Kolitis, entzündliche Zustände der relevanten Epithelgewebe und die Inkorporation von viraler DNA in das Genom einiger Epithelzellen. Erfindungsgemäß erhaltene Zellen können auch in Tests verwendet werden, um günstige Veränderungen zu bewerten, z. B. innerhalb des kolorektalen Epithels, etwa absichtlich induzierte metabolische Veränderungen aufgrund von prophylaktischen Mitteln. Die günstigen Veränderungen, für die die Zellen als Biomarker fungieren, betreffen u. a. Proliferation, Phase I-Karzinogen-aktivierende Enzymaktivitäten und Schutzenzyme wie z. B. Glutathion-S-Transferase und NADPH-Chinon-Reductase.
Expositions-Biomarker wurden umfassend untersucht, um die Karzinom-Ätiologie zu ermitteln und die tatsächliche Exposition eines Individuums gegenüber Wirkkomponenten (Karzinogene, Mitogene, Promotoren) im beruflichen oder privaten Umfeld zu bestätigen. Die problemlose Extraktion abgeblätterter Epithelzellen liefert Gewebe, das häufig nicht zur Verfügung steht oder nur schwierig bzw. in kleinen Mengen erhältlich ist. Zu den untersuchten Expositions-Biomarkern zählen DNA-Addukte mit Teilen der Karzinogenmoleküle, oxidative DNA-Schädigung, DNA-Strangbrüche und DNA-Reparatur-Enzymaktivität. Die Analyse einiger dieser Biomarker erfordert die größtmögliche DNA-Probe, da Addukte nur in kleinen Mengen zur Verfügung stehen. Die vorliegende Erfindung bietet ein praktikables Verfahren zum Isolieren abgeblätterter Zellen zu diesem Zweck.
Die relativen Aktivitäten von Enzymen, die Karzinogene aktivieren (Phase I) oder ihre reaktive Metaboliten abfangen (Phase II), sind für die Krebsprophylaxe und die Bestimmung der angeborenen Krebs-Prädisposition eines Individuums von großem Interesse. Das Gewinnen von Epithelzellen für diesen die Enzymaktivitäten betreffenden Test ist demnach von besonderem Interesse, da zahlreiche Experimente mit Nagetieren aufzeigten, dass die krebsbekämpfende Wirkung von Anti-Karzinogenen eng mit der Modifikation zu diesen Aktivitäten assoziiert ist; insbesondere trifft dies auf Phase II-Enzyme zu. Ein typisches Beispiel (Rao et al., Cancer Res. 53, 2502–2506 (1993)) belegte, dass Otipraz (eine Substanz, die mit natürlich vorkommenden Verbindungen in Kraut verwandt ist) die Inzidenz von AOM-induzierten kolorektalen Tumoren in F344-Ratten auf ein Viertel reduzierte, während die nachfolgenden Phase II-Enzymaktivitäten im durch Dissektion entnommenen Darmgewebe um das Zwei- bis Sechsfache gesteigert wurden: (a) Gesamt-Glutathion-S-Transferase (anschließend als GST abgekürzt), getestet gemäß dem Verfahren von Habig et al., J. Biol. Chem. 249, 7130–7139 (1974); (b) NADP(H): Chinon-Reductase (anschließend als QR abgekürzt), getestet gemäß dem Verfahren von Benson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 5216–5220 (1980); (c) UDP-Glucoronyl-Transferase, getestet gemäß dem Verfahren von Temple et al., J. Lab. Clin. Med. 77, 1015–1019 (1971). Es sind zahlreiche Phase II-Enzyme bekannt, wobei die meisten davon dazu dienen, das Karzinogen mit einem wasserlöslichen Molekül zu verbinden (z. B. Glutathion-Konjugation durch GST). Andere Enzyme von besonderem Interesse und ähnlicher Wirkung sind N-Sulfotransferase und N-Acetyltransferase (NAT), die ein Karzinogen sulfatieren oder acetylieren und die ungünstige Wirkung besitzen, eine Klasse von mit kolorektalem Karzinom assoziierten Karzinogenen weiter zu aktivieren. Eine weitere Gruppe von Enzymen reparieren DNA-Schädigung. Die Bestimmung dieser Phase I- oder II-Reparatur-Enzymaktivitäten in Epithelgewebe ist ein Gebiet der Krebsforschung, auf dem sehr viele Fortschritte erzielt werden und das praktische Anwendung hat.
Phase I- und II-Enzyme werden in Humangeweben in Einklang mit genetisch bestimmten Werten und auch in Einklang mit jenen, die durch Umwelt- oder Ernährungsexposition induziert werden können, exprimiert. Die Defizienz bestimmter Typen von GST-Enzym wurde in zahlreichen Studien mit Menschen mit dem erhöhten Risiko von Kolorektal- und anderen Karzinomen assoziiert, so dass die absichtliche Induktion einer zusätzlichen GST-Aktivität im Kolonepithel Krebs verhindern müsste, wenn man annimmt, dass die mit Nagetieren erzielten Ergebnisse auf Menschen extrapoliert werden können. Ebenso sollte die Suppression von Phase I-Enzymen protektive Wirkung ausüben. Die Detektion von GST- oder QR-Aktivitäten in abgeblätterten Kolonepithelzellen des Menschen wird hierin in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, die ja ein Verfahren zum Isolieren dieser Zellen aus Fäzes betrifft, beschrieben.
Gemäß der Erfindung wird ein Verfahren zur Abschätzung der Enzymaktivität oder Gen-Expression von Epithelzellen bereitgestellt, umfassend das Isolieren abgeblätterter Epithelzellen durch ein Verfahren der Erfindung und das Testen der Zellen auf Enzymaktivität bzw. das Isolieren von RNA und Testen auf Gen-Expression. Die Erfindung bietet überdies ein nichtinvasives Verfahren zur Überwachung einer biologischen oder biochemischen Eigenschaft von Epithelgewebe, umfassend die Schritte des Isolierens von Epithelzellen gemäß einem Verfahren der Erfindung und das Testen der isolierten Epithelzellen auf die biologische oder biochemische Eigenschaft.
Das Genotypisieren eines Individuums ist eine immer wichtiger Aufgabe bei der Bestimmung der genetischen Prädisposition, wobei abgeblätterte Zellen für diesen Zweck ausreichend DNA bereitstellen. Das forensische DNA-Fingerabdruckverfahren ist ein weiteres Anwendungsbeispiel.
Die vorliegende Erfindung vereinfacht die Bereitstellung einer Zellprobe, z. B. aus abgeblätterten Epithelzellen, die sich für einen Test auf Indikatoren genetischer, morphologischer oder anderer Anomalien eignen, die eine oder mehrere Phasen der Karzinogenese signalisieren (zwischen der sehr frühen präneoplastischen und fortgeschrittenen Tumorgenese). Die Erfindung erleichtert das routinemäßige Massen-Screening der Population offenbar gesunder Personen, die aufgrund der allgemein bekannten Faktoren (genetische Prädisposition und/oder risikofördernde Exposition) ein erhöhtes Krebsrisiko aufweisen. Die Erfindung umfasst aber auch die Anwendung dieser Techniken, um potenziell indikative Symptome zu untersuchen, ohne einen invasiven Eingriff vorzunehmen. Beispielsweise gibt es identifizierbare Subpopulationen wie z. B. alle Männer über 50 Jahre, für die kolorektales Screening in einigen Ländern empfohlen wird (aber infolge der hohen Kosten konventioneller Kolonoskopie nicht in anderen Ländern; siehe Hart A. R. et al., Gut 36, 590–598 (1995)). Andere unten als Beispiele genannte Subpopulationen weisen auch ein substanziell höheres Risiko auf und sollten vom frühen Screening profitieren:

(i) Genetische GST 1-null-Personen – alle Stellen (Idle, J. R., Mutat. Res. 247, 259–266 (1991));
(ii) GST 1 null und schneller Oxidator und/oder Acetylator – kolorektale Stellen (Kadlubar, F. F. et al., Env. Health Persp. 98 69–74 (1992);
(iii) GST 1 null und langsamer Oxidator und/oder Acetylator – Harnblase (Hein, D. W., Biochem. Biophys. Acta 948, 37–66 (1988);
(iv) Raucher – Lunge, Pankreas und Blase (US Dept. of Health and Human Services, Publikationsummer 82-50179 (1982));
(v) Personen mit einem oder mehreren nahen Verwandten mit kolorektalem Karzinom oder Polymen – kolorektale Stellen (Utsunomiya, J. et al., Hg., Hereditary Colorectal Cancer, Tokio Springer-Verlag (1990));
(vi) Personen mit einem oder mehreren verwandten mit Gallenblasen- oder Pankreaskarzinom – Gallenblase und Pankreas (Fernandez et a., Can. Epi. Brom. & Prev. 3, 209–212 (1994);
(vii) Personen mit berufsbedingter Exposition gegenüber aromatischen Aminen – Blase (Chernozemsky, I. N. et al., Environmental Carcinogens; Selected Methods of Analysis, Bd. 4, IARC Scientific Publications Nr. 40, Hg. Gichbein et al., IARC, Lyon, Frankreich, 3–12 (1981));
(viii) Personen mit berufsbedingter Exposition gegenüber aerogenen Karzinogenen, insbesondere polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen, Radon, Tabakrauch in der Umgebungsluft, Kochaerosolen, Holzstaub, Formaldehyd – Lunge und Sinus/Nasengang (IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans Col. 1–62, IARC, Lyon, Frankreich);
(ix) Frauen mit zahlreichen Sexualpartnern und/oder Partnern, die zuvor mit vielen anderen Personen Geschlechtsverkehr hatten – Zervikalepithel (Bosch, F. X. et al., Can. Epi. Brom. & Prev. 3, 375–379 (1984)).

Jede Kombination derartiger genetischer Prädispositionen und risikofördernder Umweltexposition (s. o.) erhöht die Gefahr, dass das Individuum an Krebs der Epithelgewebe erkrankt, und signalisiert daher die Notwendigkeit des wiederholten Screenings bereits ab dem 35. Lebensjahr.
Chemopräventive Verfahren (Kelloff et al., Can. Epi. Brom. & Prev. 3, 85–98 (1994)) werden entwickelt, um entweder das Wiederauftreten von Dysplasie, Polypen oder Karzinom oder das Auftreten der Frühstadien der Karzinogenese vor diesen detektierbaren Phänomenen zu verhindern. Das Screening bildet die Grundlage und eine wichtige klinische Richtschnur bei der Auswahl des jeweils wirksamsten Chemoprophylaktikums (Szarka et al., Current Problems in Cancer, R. Ozols Hg., 13 –16, Mosby-Year Book Inc.). Das Screening unter Anwendung des Verfahrens der Erfindung bildet auch die Grundlage für die nachfolgende nichtinvasive Routineüberwachung, um zu überprüfen, ob die prophylaktischen Verfahren weiterhin wirksam sind. Besonders wichtig für dieses Screening ist der mit Zellen durchgeführte Test auf Enzymaktivität, die Anzahl von Zellen und morphologische Eigenschaften; alle diese Tests erfordern die hierin bereitgestellten Zellen.
Außerdem werden, je mehr genetische Prädispositionen und lebensstilbedingte, familiäre oder berufsbedingte Krebs-Risikofaktoren entdeckt werden, immer mehr derzeit asymptomatische Individuen, die Kombinationen solcher Prädispositionen bzw. Faktoren aufweisen und somit zur Hochrisikogruppe zählen, identifiziert. Die Verfahren der Erfindung sind besonders dazu geeignet, die für diese Patienten benötigten diagnostischen Tests sowie die Routineüberwachung solcher Krankheitszustände zu erleichtern.
Ein großer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass natürlich abgeblätterte Zellen in ausreichender Menge vorhanden sind, wenn sie durch das Verfahren der Erfindung gewonnen und isoliert werden; auf diese Weise werden genügend Zellen für verschiedene Tests betreffend die Unterscheidung von Indikatoren der Karzinogenese bereitgestellt. Die seit kurzer Zeit zur Verfügung stehenden Verfahren zur Detektion der Frühstadien der Karzinogenese (z. B. PCR-basierende Tests von Mutationen in mit der Tumorgenese assoziierten Onkogenen (siehe Mullis K. B. et al., Hg., The Polymerase Chain Reaction, Birkhauser, Boston) wie z. B. K-ras oder H-ras (Boson, J. L., Cancer Res. 49, 4682–4689 (1989) oder APC (Powell, S. M. et al., Nature 359, 235–237 (1991) oder p53 (Greenblatt et al., Cancer Res. 54, 4855–4878 (1994)) machen das vorliegende Zellisolierungsverfahren zur Grundlage der Überprüfung dieser Zellen auf Anomalien zum geeigneten Zeitpunkt und ohne Notwendigkeit einer Biopsie. Die durch das Verfahren der Erfindung isolierten abgeblätterten Zellen können im Prinzip für jede Art von PCR-basiertem Test verwendet werden. Erfindungsgemäß isolierte abgeblätterte Zellen können auch bestehenden Verfahren für morphologische Tests unterzogen werden, für die bislang keine Zellen – oder keine Zellen in ausreichend reinem Zustand – zur Verfügung standen.
Ein zweiter damit in Zusammenhang stehender Vorteil ist, dass die Abblätterung von der gesamten Epitheloberfläche eine bessere Probe liefert (außer wenn die Tumorposition bekannt ist) als eine Biopsie, die a priori eine nichtrepräsentative Gewebeprobe ist. Das Verfahren der Erfindung betrifft die Gewinnung der Epithelzellen, die sich auf der Gewebeoberfläche befanden, wobei die folgenden Überlegungen aufzeigen, dass auf diese Weise das gesamte Epithelgewebe repräsentiert ist:

(i) Die Menge an DNA-Addukten in Epithelzellen auf der Gewebeoberfläche, d. h. in leicht zugänglichen Zellen, ist quantitativ ähnlich oder größer und qualitativ gleich wie jene in den gleichen Geweben, aus denen eine Biopsie verwendet wurde, um tief gelegene Nicht-Oberflächenzellen zu entnehmen (Stone, J. G. et al., Cancer Res. 55, 1267–1270 (1995)).
(ii) Die normalen biologischen Prozesse der Epithelproliferation und des Epithelwachstums führen zu tieferen Zellen, die etwas später an der Oberfläche ankommen, so dass eine permanente DNA- oder eine andere Läsion in diesen Zellen zwecks Abblätterung zur Oberfläche zykliert wird; sie stellt den Zustand des darunter liegenden Gewebes dar. Obwohl eine temporäre Läsion – vor kurzem gebildet aufgrund der Wirkung von Substanzen im Hohlraum – nur die Oberflächenzellen betreffen und keine Langzeitfolgen haben kann, da diese Zellen in kurzer Zeit abblättern werden, dienen die natürlichen Prozesse der DNA-Reparatur (Hanawalt, P. C. et al., Mutat. Res. 247, 203–211 (1991)), Apoptose (Hoffman, B. et al., Oncogene 9, 1802–1807 (1994)) usw. dazu, den Fortbestand nur eines sehr kleinen Teils genotoxischer Wirkungen zu minimieren. Obwohl die Schaffung einer mutierten Zelle, die nicht durch Apoptose eliminiert wird, entweder durch Teilung von Stammzellen oder Mutation während der Zellteilung in einem späteren Stadium näher der Gewebeoberfläche erfolgen kann, stellt dieser zweifache Ursprung keinen Unterschied für einen genetischen Test dar, ob nun die Zellen durch Biopsie oder Abblätterung erhalten wurden.

Somit umfasst der Test der abgeblätterten und erfindungsgemäß isolierten Oberflächenzellen die Untersuchung der Gewebe, die Aufschluss über bereits festgelegte Langzeitwirkungen und auch über zu Langzeitwirkungen führende Kurzzeitwirkungen gibt. Indem sich das Verfahren auf die abgeblätterten Zellen konzentriert, zeigt es wichtige Merkmale des gesamten risikobehafteten Gewebes auf und ist nicht mit den Nachteilen einer lokalen Biopsie (wissenschaftliche Nicht-Repräsentativität) verbunden. Erfindungsgemäß isolierte Zellen können einer Vielzahl herkömmlicher Testverfahren zugeführt werden, die auf die Charakterisierung von Krankheiten und Anomalien in der klinischen Praxis abzielen. Dazu zählt die Einfärbung für pathologische und histologische Studien.
DNA, die aus erfindungsgemäß erhaltenen Zellen gewonnen wird, kann PCR-basierten Tests hinsichtlich der Detektion präkanzeröser oder kanzeröser genetischer Indikatoren unterzogen werden. Beispielsweise kann man PCR-Tests auf Gegenwart oder Häufigkeit von mutiertem K-ras, H-ras und/oder anderer mutierter Gene durchführen.
Es folgt eine Beschreibung der vorliegenden Erfindung anhand von Beispielen. Es ist zu beachten, dass diese die Erfindung keinesfalls einschränken und dass Modifikationen innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung möglich sind.
Beispiele
A. Isolierung abgeblätterter Epithelzellen aus Fäzes
Das folgende Verfahren wurde in einem Labor durchgeführt, das zur Arbeit mit Fäzes ausgestattet war; es wurden in Einklang mit den HSWA und COSHH-Anforderungen Vorkehrungen getroffen, um Infektion, Kontamination usw. zu vermeiden.
Für einen typischen Stuhl mit einem Gewicht von 100 g, einer Länge von etwa 20 cm, einem Durchmesser von 2,5 cm und einer Fläche von etwa 170 cm² bestand die Vorgangsweise aus den folgenden Schritten:

(i) Die Stuhlprobe wird direkt in einen durchsichtigen Stuhlsammelbeutel aus Kunststoff (30 × 30 cm) ausgeschieden, der mittels einer Vorrichtung unterhalb des Toilettensitzes in Einklang mit bekannten Verfahren befestigt wird (Bingham et al., Carcinogenesis 13, 683–690 (1992)); anschließend wird der Beutel sofort mit einem Gummiband verschlossen.
(ii) Der Stuhl und der Beutel werden gewogen; das Stuhlgewicht beträgt üblicherweise 40 bis 200 g.
(iii) Aus praktischen Gründen und zwecks besserer Verwertbarkeit sollten die Stuhlproben mindestens 50 g wiegen und geformt sein – Diarrhoe sollte vermieden werden.
(iv) Innerhalb einiger Minuten nach dem Ausscheiden wird der mit dem Stuhl gefüllte Beutel in Eiswasser gelegt, wobei das offene Ende des Beutels an der Seite des Eiswasserbehälters befestigt ist, so dass der hydrostatische Druck keine Luft im Beutel ermöglicht und dadurch zufrieden stellender thermischer Kontakt des gesamten Stuhls gewährleistet ist. Die Kühlung erfolgt zumindest 30 Minuten lang.
(v) Anschließend können Proben für andere Verwendungszwecke gezogen werden, insbesondere zur Beobachtung von Zellen auf der Stuhloberfläche, indem diese leicht mit einem Mikroskopobjektträger berührt wird, oder um Teile der Fäzes anderen Tests zuzuführen (z. B. auf N-Nitroso-Verbindungen und Nitrosierungsmittel (Bingham et al., Gastroenterology 104, A389 (1993)), für die die folgenden Verfahrensschritte problematisch wären. Proben können zu diesem Zeitpunkt gezogen werden, da die Fes tigkeit des gelierten Stuhls eine Freilegung des Hauptmaterials aus dem Inneren minimiert.
(vi) 50 ml eiskalte Suspensionslösung, pH 7,4, umfassend Minimum Essential Eagle's-Medium (MEM) mit Phenolrot-Farbstoff (ein Produkt von Sigma) und den unten angeführten Substanzen, wird dem Stuhl zugesetzt. Der Beutel wird dann 5 Minuten vorsichtig in Eiswasser geschüttelt, um die Stuhloberfläche zu waschen: N-Acetylcystein 50 mM, 3 mM Natriumbutyrat, Antibiotika: Penicillin (500 Einheiten/l), Streptomycinsulfat (500 mg/l), Amphotericin B (1,25 mg/l), Gentamycin (50 mg/l), Natriumbicarbonat 1 g/l und hitzegeschocktes Rinderserumalbumin 10 g/l. Wenn die Suspensionslösung gelagert werden soll, kann sie wie oben hergestellt sein, jedoch ohne N-Acetylcystein (das bei Lagerung oxidieren kann). Am Tag der Verwendung werden 0,1 Volumen 50 mM N-Acetylcystein 1,0 Volumen der gelagerten Lösung zugesetzt. Die resultierende Lösung, in der die Konzentration von Komponente 9% niedriger als in der herkömmlichen Suspensionslösung ist, kann anstelle dieser verwendet werden. Die Lösung ist ursprünglich hellrosa gefärbt (infolge des Phenolrot-Farbstoffs), und im Allgemeinen sind die Stuhlwaschlösungen rosa-gelb gefärbt. Das Rühren erfolgt vorsichtig, so dass der Stuhl nicht aufbricht – das Aufbrechen wird durch eine sofortige Verdunklung und bräunliche Verfärbung der Waschlösung angezeigt.
(vii) Die die Zellsuspension enthaltenden Waschlösungen werden aus dem Beutel durch ein 250-μm-Sieb dekantiert, das auf einem 125-μm-Sieb aufsitzt, das wiederum auf einem großen Behälter angeordnet ist. 5 g Eis und 20 g feinteilige Borsäure werden den gesiebten Waschlösungen zugesetzt. Der Stuhl wird ein zweites Mal in gleicher Weise gewaschen. Die Waschlösungen werden dekantiert, durch die Siebe geschickt und mit den ersten Waschlösungen vereinigt.
(viii) Diese Vorgangsweise sieht die Verwendung von 1 ml Lösung pro g Stuhl vor, doch es können mehr Zellen unter weiterem Waschen bis zu zumindest 2 ml/g extrahiert werden. Das Waschen mit einem größeren Nettovolumen oder mehreren Waschvorgängen liefert mehr Material, wobei die genauen Volumen einstellbar sind, um an die Stuhlgröße und den jeweiligen Verwendungszweck angepasst zu sein. Die Waschlösungen werden innerhalb des Behälters gewirbelt, um den Kontakt mit der ungelösten Borsäure zu verstärken. Diese setzt sich, und die Überstandswaschlösungen werden dekantiert. Die Waschlösungen verfärben sich – von rosa-gelb zu gelb – infolge der teilweisen Auflösung der Borsäure, wodurch sich auch der pH-Wert verändert.
(ix) Die Waschlösungen werden bei 250 g 10 Minuten lang bei 0°C vorzugsweise in 50 ml durchsichtigen graduierten Kunststoffröhrchen mit konischem Boden (z. B. Falcon-Röhrchen) zentrifugiert.
(x) Dann werden die Überstände sorgfältig verworfen, um den oberen Teil der Pellets nicht zu verlieren. Die Pellets besitzen im Allgemeinen ein Volumen von 1 bis 2 ml pro 50 ml Waschlösung; im unteren Teil sind sie dunkelbraun (wahrscheinlich Faser und assoziierte Zellen) und im oberen Teil eine heller.
(xi) Jedes Pellet wird in einer 5-ml-Aliquote der eiskalten Suspensionslösung resuspendiert, indem es vorsichtig ein grobes Pastette-Einwegröhrchen aufgezogen und hinabgelassen wird. Dann werden die resuspendierten Teilchen vereint und mit einer weiteren Suspensionslösung in einem der 50-ml-Röhrchen verdünnt (es eignet sich z. B. ein Gesamtvolumen von 25 ml).
(xii) Mittels Stößel und Mörser zerriebene Borsäure wird mit kalter Suspensionslöung zu einer 1 : 1 (Gew./Vol.) Aufschlämmung gebildet. 10 ml dieser Aufschlämmung werden den suspendierten Pellets zugesetzt. Dann wird das Röhrchen vorsichtig kopfüber 5 Minuten lang geschüttelt, bevor sich die dichte ungelöste Borsäure als weißes oder lederfarbenes Pellet setzen kann.
(xiii) 3 × 10⁷ BerEP-4-Immunomagnetperlen werden dann sofort zugesetzt. Sie können in jeder praktikablen Weise wie z. B. in Suspension in Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) zugesetzt werden. Die gemischte Suspension von Zellen, Perlen und unerwünschten Teilchen wird dann vorsichtig 5 Minuten lang gerührt (bei vertikal in Eiswasser gehaltenem Röhrchen). BerEP-4-Magnetperlen können von Dynal bezogen oder aus M-450-Dynabeads, beschichtet mit Anti-Mäuse-IgG1 (erhältlich bei Dynal; Produktnummer 110.12), durch Inkubation mit Ber-EP4 (einem bei Dako erhältlichen Mäuse-Anti-Human-Antikörper, der für Epithelzellen spezifisch ist) gemäß dem Verfahren von Hardingham et al., Cancer Research 53, 3455–3458 (1993), erzeugt werden.
(xiv) Das Röhrchen mit dem Gemisch aus resuspendierten Pellets und Perlen wird dann vorsichtig durch Drehen und Schütteln des Behälters 10 Minuten lang auf einer Vorrichtung wie z. B. Dynal MX-1 gerührt. Die magnetische Isolierung des Zellen-Perlen-Komplexes erfolgt mit einer magnetischen Vorrichtung, wie z. B. Dynal MPC-1, wobei ein sehr starker Magnet gegen die Seite des vertikalen Röhrchens gehalten wird und die Zell-Perlen-Komplexe einen braunen Streifen auf der Röhrchenseite bilden. Die ungelöste Borsäure fällt auf den Boden des Röhrchens.
(xv) Saugwirkung wird an ein breites Röhrchen mit sich verjüngendem Ende angelegt, um zuerst das Borsäure-Pellet und dann den Überstand (mit dem restlichen bakteriellen Material und Nahrungsabfallstoffen) aus dem Röhrchen zu saugen; auf diese Weise bleibt der magnetisch auf der Röhrchenseite festgehaltene braune Zell-Perlen-Streifen zurück.
(xvi) Der Magnet wird entfernt, und die zusätzlichen 25 ml Suspensionslösung werden dazu verwendet, die Zell-Perlen-Komplexe zu resuspendieren. Diese werden durch vorsichtiges Rühren durch Drehen und Schütteln 2 Minuten lang gewaschen, bevor die magnetische Isolierung wiederholt wird. Der Überstand wird verworfen und der Waschvorgang wiederholt; anschließend sollte der verworfene Überstand die gleiche hellrosa Farbe aufweisen wie die ursprüngliche Waschlösung. Eine braune Farbe zeigt an, dass irrelevantes fäkales Material während des Waschens aus dem Stuhl entfernt wurde, dass es nach wie vor die Zellen kontaminiert und dass die letzten Waschschritte (Stadium xvii) mehrmals wiederholt werden müssen.
(xvii) Die Waschung des Zell-Perlen-Komplexes wird mit zwei weiteren Aliquoten der Suspensionslösung wiederholt (15 ml), wobei die letzte die unveränderte hellrosa Farbe aufweisen sollte, nachdem die Zell-Perlen-Komplexe magnetisch festgehalten wurden.
(xviii) Typischerweise werden dann die Zell-Perlen-Komplexe nochmals in einem Mindestvolumen jedes geeigneten Mediums resuspendiert und in Eppendorf-Röhrchen in Aliquoten aufgeteilt.

B. Isolierung abgeblätterter Epithelzellen unterhalb der Stuhloberfläche
Um unterhalb der Oberfläche liegende Säugetierzellen zu extrahieren, wird das oben geschilderte Verfahren wie folgt modifiziert:

(i) Zunächst wird eine eiskalte Stuhlprobe gründlich – wie in obigem Schritt vi – mit vier Waschlösungen von jeweils 0,5 ml pro g Stuhl gewaschen. Diese Waschlösungen werden dann beiseite gestellt und anschließend eine Stuhlmenge (typischerweise 10–20 g) mit 50 g Eis in einen großen Stomacher-Kunststoffbeutel von 30 × 40 cm gefüllt.
(ii) Die gleiche eiskalte Suspensionslösung wie oben wird zugesetzt (typischerweise 6 ml pro g Fäzes).
(iii) Der Beutel wird in eine Stomacher-Maschine gelegt (z. B. Colworth Stomacher 3500) und zumindest 15 Sekunden lang behandelt. Der Beutel wird entnommen, und man lässt die Probe kurze Zeit setzen und kontrolliert dann, ob der Stuhl in kleine Stücke im Millimeterbereich aufgebrochen ist (ohne vollständige Homogenisierung, die zu einer permanenten braunen Lösung/Suspension führt).
(iv) Der gesamte Beutelinhalt wird dann dekantiert und durch ein 500-μm-Sieb gefiltert, das auf einem 250-μm-Sieb aufsitzt, das wiederum auf einem 125-μm-Sieb aufsitzt, das auf dem gleichen Behälter wie oben angeordnet ist. 5 g Eis werden zugesetzt und die Suspension wie in obigem Schritt ix (Abschnitt A) zentrifugiert.
(v) Die obigen Schritte x bis xvii (Abschnitt A) werden durchgeführt.

C. Verfahren zur Isolierung abgeblätterter Epithelzellen für die quantitative Analyse vorhandener Voll-DNA
Die folgende Vorgangsweise dient dazu, abgeblätterte Epithelzellen aus Stuhlproben für die quantitative Analyse vorhandener Voll-DNA einzusammeln. Dieses Verfahren, das eine verkürzte Version des in obigem Abschnitt A dargelegten Verfahrens ist (insbesondere ohne Behandlung mit Borsäure), kann auch zum Einsammeln von Zellen dienen, die anderen Tests zugeführt werden sollen, in denen die Gegenwart von Schleim nicht störend ist.

(i) Schritte i bis v (Abschnitt A) wie oben.
(ii) Für ein Stuhlgewicht von zumindest 30 g werden 0,5 ml eiskalte Suspensionslösung (definiert in Abschnitt A, Schritt vi) pro g Stuhlgewicht dem die Stuhlprobe enthaltenden Beutel zugesetzt und der Beutel vorsichtig 5 Minuten lang in Eiswasser geschüttelt, um die Stuhloberfläche zu waschen. Für ein Stuhlgewicht von 10 bis 30 g verwendet man 15 ml eiskalte Suspensionslöung.
(iii) Die wässrige Suspensionslösung wird aus dem Beutel dekantiert und der Waschschritt wiederholt.
(iv) Die vereinten dekantierten Waschlösungen werden dann durch ein 250-μm-Sieb und anschließend ein 125-μm-Sieb geschickt.
(v) Das Filtrat wird dann in durchsichtige 50-ml-Röhrchen gefüllt und hinsichtlich seiner Farbe untersucht:
– Wenn es rot oder rotgelb und somit relativ unverschmutzt ist, werden die Waschlösungen direkt mit den BerEP-4-Immunomagnetperlen behandelt (Gesamtmenge wie in Schritt xiii, Abschnitt A, 3 × 10⁷).
– Wenn es deutlich verschmutzt ist (braune Farbe des fäkalen Materials vorherrschend), werden die Waschlösungen wie in obigem Schritt ix, Abschnitt A, zentrifugiert und die Pellets gesammelt und resuspendiert (wie in Schritten x und xi, Abschnitt A), bevor Immunomagnetperlen (insgesamt 3 × 10⁷) wie in Schritt xiii, Abschnitt A, zugesetzt werden.
(vi) Schritte xiv bis xvii wie in obigem Abschnitt A.

D. Extraktion von DNA aus aus Fäzes isolierten Zellen
Die in Einklang mit den Schritten i bis vi, Abschnitt C, erhaltenen Zell-Perlen-Komplexe werden in 120 μl* Zelllysepuffer (400 mM TrisHCl; pH 8,0; 60 mM EDTA; 150 mM NaCl; 1% SDS) resuspendiert.

(i) Zusetzen von 5% Hexadecyltrimethxlammoniumbromid (CTAB, Endkonzentration – 2%)** und gründliches Vermischen.
(ii) 10-minütiges Inkubieren bei 70°C.
(iii) Zusetzen von 20 μl Proteinase K (20 mg/ml Lösung) und 200 μl Puffer AL (QIAmp Blood Kit, QIAGEN) und gründliches Vermischen.
(iv) Inkubieren bei 70°C über den Zeitraum von zumindest 30 Minuten.
(v) Zentrifugieren bei zumindest 5000 g über den Zeitraum von 1 Minute.***
(vi) Füllen des Überstands in ein sauberes Röhrchen.***
(vii) Zusetzen von 210 μl Isopropanol und gründliches Vermischen.
(viii) Aufbringen der Probe auf ein QIAmp-Zentrifugensäule und 1-minütiges Zentrifugieren bei zumindest 5000 g. Verwerfen des Filtrats.
(ix) Waschen der Säule mit 500 μl Puffer AW (1-minütiges Zentrifugieren bei zumindest 5000 g). Verwerfen des Filtrats.
(x) Wiederholen von Schritt ix. Zentrifugationszeit 3 Minuten.
(xi) Eluieren der DNA mit sterilem, auf 70°C vorerhitzem Wasser (150 μl) und 1-minütiges Zentrifugieren bei zumindest 5000 g.

Anmerkungen

* In einigen Fällen ist mehr Lysepuffer notwendig, um abgeblätterte Zellen wirkungsvoll zu resuspendieren, da Proben mit einer sehr großen Menge an abgeblätterten Zellen häufig sind, insbesondere bei Krebspatienten. Sobald die Zellen resuspendiert sind, sind 120 μl der Suspension einer weiteren Extraktion zuzuführen und Korrekturen bezüglich des geänderten Volumens vorzunehmen, wenn die gesamte DNA-Menge in der Probe bestimmt wird.
** Dieser Schritt eliminiert einige PCR-hemmende Komponenten von fäkalem Schleim, die ansonsten gemeinsam mit DNA gereinigt werden.
*** Diese Schritte können wiederholt werden.

E. Test der DNA-Ausbeute aus abgeblätterten Zellen
Die DNA-Konzentration in der Probe wird durch Messen des UV-Absorptionswerts bei 260 nm bestimmt. Vor der Messung kann die Probe 1 : 20 mit Wasser verdünnt werden (z. B. 40 μl DNA-Lösung + 760 μl Wasser). Die Messungen bei 260 nm und 280 nm ermöglichen die Bewertung der DNA-Reinheit (das 260/280-Verhältnis liegt für reine DNA-Präparate bei 1,7–1,8).
Danach wird die DNA-Gesamtmenge für die jeweilige Stuhlprobe berechnet. Eine Division dieses Werts durch das Stuhlgewicht ergibt die DNA-Menge in abgeblätterten Zellen in ng pro g Stuhl (Stuhl-DNA-Index). Vorläufige Ergebnisse zeigen, dass dieser Index bei gesunden Menschen unter 600 ng/g und bei Polypen- und Karzinompatienten deutlich höher liegt (im Bereich von 1500–6000 in den meisten Fällen von kolorektalem Karzinom).
Die verbleibende DNA kann jeder Art von Molekularanalyse zugeführt werden (siehe Abschnitt F).
Es wurden Stuhlproben von 24 gesunden Personen (12 mit einem Alter von < 55 Jahren; 12 mit einem Alter von > 55 Jahren), 12 Patienten mit kolorektalem Karzinom, 10 Krebspatienten, deren Tumoren chirurgisch entfernt worden waren, 9 Patienten mit Polypen und 5 Patienten, deren Polypen entfernt worden waren, erhalten. Der Ausdruck „Polyp" bezieht sich hierin auf eine Neoplasie, die morphologisch ein Tumor mit dem charakteristischen makroskopischen Aussehen ist; üblicherweise handelt es sich um einen gestielten Polypen. Mikroskopisch kann ein Polyp als benigner adenomatöser Tumor charakterisiert werden.
Tabelle 1: Stuhlgewicht, DNA-Menge pro Stuhlprobe und Stuhl-DNA-Index
Schlussfolgerungen
Diese Daten zeigen eine hochsignifikante Differenz zwischen den Stuhl-DNA-Indizes, die für Patienten mit kolorektalem Tumor (sowohl Karzinom als auch Polyp) berechnet wurden, und gesunden Personen; es wird ein neuartiger nichtinvasiver diagnostischer Test für kolorektale Tumoren bereitgestellt. Außerdem scheint der Index als Instrument der postoperativen Überwachung von Krebspatienten geeignet zu sein. Der in Krebspatienten nach der Operation gemessene Stuhl-DNA-Index ist viel niedriger als vor dem Eingriff und liegt in den meisten Fällen im normalen Bereich. Der Test eignet sich daher für die Effizienzsteuerung operativer Eingriffe und die Detektion wieder auftretender Symptome.
F. Verwendung von aus abgeblätterten Zellen extrahierter DNA für genetische Analysen
DNA – mittels des in Abschnitt D beschriebenen Verfahrens aus abgeblätterten Zellen isoliert – wurde erfolgreich PCR-Amplifikation zugeführt. Es wurden die folgenden Tests unter Anwendung herkömmlicher Verfahren durchgeführt:
1. Genotyp-Bestimmung

i) Genotypisieren für N-Acetyltransferase 1-(NAT-1)Gen einschließlich der Amplifikation des 118 bp-Fragments, gefolgt von RFLP (Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus-Analyse), was die Unterscheidung von 4 Genotypvarianten ermöglicht.
ii) Genotypisieren für Glutathion-S-Transferase-Theta-(GST-T)Gen: simultane Amplifikation des 78 bp-Fragments des GST-Theta-Gens (vorhanden in GST-T-positiven Probanden und abwesend in GST-T-null-Personen) und der Vergleichssequenz. Sowohl NAT-1 als auch GST-T besitzen mit erhöhtem Krebsrisiko assoziierte Genotypvarianten.

2. Genmutations-Detektion
K-ras-Gen-Mutationen wurden unter Anwendung einer hochsensitiven Technik auf PCR-Basis analysiert. Es zeigte sich, dass das Verfahren problemlos mit aus Fäzes extrahierter DNA durchgeführt werden kann. Substanzielle Mengen an mutiertem K-ras wurden sowohl in Krebspatienten als auch in gesunden Personen in einigen DNA-Proben detektiert.
Diese Beispiele zeigen, dass genomische DNA (extrahiert aus abgeblätterten Zellen aus fäkalen Proben unter Anwendung der hierin beschriebenen Technik) für praktisch jede Art genetischer Analyse geeignet ist. Ähnliche Methoden kommen für Mitochondrien-DNA in Frage.
G. Isolierung abgeblätterter Epithelzellen aus Harn, Sputum, Speichel und Fäzes
Abgeblätterte Zellen in Harn werden wie folgt selektiv getrennt:

(i) Harn, vorzugsweise der erste Harn des Tages, wird in einer 1-l-Kunststoffflasche, einem Krug oder einem anderen sauberen Behälter mit einer Öffnung von zumindest 12 cm gesammelt, der ausreichend Eis enthält, um die Temperatur auf weniger als 5°C zu senken.
(ii) Nach dem Wirbeln des Behälters zur Senkung der Harntemperatur durch Schmelzen des Eises werden 3 × 10⁷ Ber-EP4-Immunomagnetperlen (s. o.) zugesetzt und der Behälter vorsichtig 5–20 Minuten lang gedreht, um die Perlen in Suspension zu halten und ihre Bindung an die Epithelzellen zu ermöglichen.
(iii) Eine Magnetplatte (z. B. die 6 × 4-Anordung von Sm-Co-Magneten von Advanced Magnetics Inc.), abgedeckt mit einem eng anliegen den Kunststoffbeutel, wird in den Harn eingelegt und langsam 1 Minute lang gedreht, um die Perlen-Zell-Komplexe einzufangen.
(iv) Es erfolgt das Zurückziehen der Platte bzw. des Beutels aus dem Harn. Dann lässt die Platte aus dem Beutel die Perlen-Zell-Komplexe auf der Beuteloberfläche zurück, von der sie mit 2 10-ml-Aliquoten der Suspensionslösung in einem durchsichtigen 50-ml-Kunststoffröhrchen resuspendiert werden.
(v) Die an den Perlen anhaftenden Zellen werden dann zwei Mal mit 10-ml-Aliquoten der Suspensionslösung gewaschen und dann im Mindestvolumen in ein Speicherröhrchen gefüllt, um den nächsten Test durchführen zu können.

Das Sammeln von Epithelzellen wurde durch Isolieren von DNA aus den Perlen-Zell-Komplexen in Einklang mit obigem Abschnitt D und Amplifikation von K-ras des Wildtyps bestätigt.
Abgeblätterte Zellen im Sputum oder Speichel werden wie folgt selektiv getrennt:

(vi) Speichel oder Sputum wird in einer Flasche gesammelt und mit eiskalter isotonischer Lösung verdünnt, die ein Mukolytikum wie z. B. die oben erwähnte Suspensionslösung enthält. Um die Epitheloberflächen von Mund und Zahnfleisch zu untersuchen, wird der Verzehr von Nahrung mehrere Stunden lang vor der Probenziehung vermieden; eine herkömmliche Zahnbürste dient dazu, die Oberflächen von Interesse abzureiben. Dazu zählen u. a. die Mundschleimhaut oder ähnliche Regionen, die Kautabak, Tabak, Betelpriem oder Tabak-durchlässigen Beuteln ausgesetzt sind, die ein lokales Tumorgenese-Risiko erzeugen.
(vii) Damit man Epithelzellen des Atmungssystems, die normalerweise entweder durch muko-ziliare Ausscheidung oder Husten in die Mundhöhle gelangen, untersuchen kann, wird der Mund vorzugsweise zunächst gesäubert, indem die Person mehrere Stunden lang nichts isst, bevor sie ihn mit Wasser ausspült, um Epithelzellen des Munds zu eliminieren. Die Person befördert dann Sputum durch Husten in das Sammelröhrchen. Die Prozedur findet am besten nach dem Aufstehen am Morgen statt, wenn eine große Menge an Epithelzellen aus dem Atmungssystem in natürlicher Weise vorhanden ist, insbesondere bei jenen Personen, für die diese Prozedur am ehesten indiziert ist, d. h. Raucher oder Menschen mit berufsbedingter Exposition. Allerdings ist die Prozedur nicht auf diese Personen beschränkt und kann auf eine Vielzahl von Individuen angewendet werden (s. o.), die ein Risiko neoplastischer und anderer Atmungserkrankungen aufweisen.
(viii) Nachdem sichergestellt ist, dass der Speichel oder das Sputum ausreichend verdünnt ist, um seine Viskosität zu reduzieren, werden immunomagnetische Ber-EP4-Perlen der Suspension dem verdünnten Speichel oder Sputum zugesetzt und die Reinigung wie beim Harn durchgeführt.

Abgeblätterte Zellen in Fäzes werden selektiv wie folgt getrennt:

(ix) Die Stuhlprobe wird direkt in einen durchsichtigen Kunststoff-Stuhlsammelbeutel mit den Maßen 30 × 40 cm ausgeschieden, der durch eine Vorrichtung unter dem Toilettensitz angebracht ist, wie in bekannten Verfahren. Der Beutel wird anschließend sofort mit einem Gummiband verschlossen.
(x) Der Stuhl und der Beutel werden gewogen; das Stuhlgewicht beträgt üblicherweise 40 bis 200 g.
(xi) Aus praktischen Gründen und zwecks besserer Verwertbarkeit sollten die Stuhlproben mindestens 50 g wiegen und geformt sein – Diarrhoe sollte vermieden werden.
(xii) Innerhalb einiger Minuten nach dem Ausscheiden wird der mit dem Stuhl gefüllte Beutel in Eiswasser gelegt, wobei das offene Ende des Beutels an der Seite des Eiswasserbehälters befestigt ist, so dass der hydrostatische Druck keine Luft im Beutel ermöglicht und dadurch zufrieden stellender thermischer Kontakt des gesamten Stuhls gewährleistet ist. Die Kühlung erfolgt zumindest 30 Minuten lang.
(xiii) 50 ml der oben erwähnten wässrigen Suspensionslösung mit 4 × 10⁷ Ber-EP4-Magnetperlen (s. o.) werden zugesetzt und der Beutel vorsichtig 5 Minuten lang geschüttelt, wobei er im Eiswasser verbleibt.
(xiv) Die Suspension wird vorsichtig durch ein 250 μm-Sieb in einen Behälter mit 5 g Eis dekantiert. Schritt (v) wird wiederholt, und die vereinigten Waschlösungen werden in die MPC-1-Magnetvorrichtung gefüllt.
(xv) Die magnetische Isolierung des Zellen-Perlen-Komplexes erfolgt wie oben. Wenn die Suspension eine überschüssige Menge an irrelevantem fäkalem Material enthält, kann die magnetische Isolierung durch Verdünnen der Suspension mit der wässrigen Suspensionslösung verbessert werden.

Tests mit an Perlen befestigten Zellen werden problemlos unter Anwendung konventioneller histologischer Techniken oder herkömmlicher PCR-Techniken durchgeführt, wobei zuvor ein Zelllyseschritt mit verlängertem anfänglichem Erhitzen (5 Minuten lang bei 95°C oder einer ähnlichen Temperatur) in der PCR-Vorrichtung stattfindet, um die DNA freizusetzen.
H. Tests hinsichtlich der Enzymaktivitäten in abgeblätterten Zellen und Detektion von darin befindlichen Enzymproteinen

(i) Abgeblätterte Zellen werden in Einklang mit den Ausführungen in obigem Abschnitt A oder G isoliert. Um Komponenten der Suspensionslösung zu entfernen und Tests hinsichtlich der Enzymaktivität zu vereinfachen, werden die an den Perlen befestigten Zellen in 10 ml einer auf 0°C abgekühlten wässrigen Lösung in einem durchsichtigen 15-ml-Röhrchen resuspendiert. Die Lösung kann (a) 50 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA und 3 mM DTT oder (b) eine konventionelle Phosphat-gepufferte Salzlösung, pH 7,4, umfassen. Nach vorsichtigem 30 Sekunden langem Mischen werden die Zellen – wie oben beschrieben – durch magnetische Trennung oder durch 5-minütige Zentrifugation bei 250 g gesammelt. Die Überstandslösung wird dann entfernt und verworfen.
(ii) Dieser Waschschritt wird dann ein oder mehrere Male wiederholt. Die gesammelten Zellen-Perlen-Komplexe werden anschließend mit dem Drei- bis Zehnfachen des Volumens des Mediums (0,3–1,0 ml in einem Eppendorf-Röhrchen), in dem sie aufgebrochen werden sollen, suspendiert.
(iii) a) In einem Verfahren kann jede für den nachfolgenden Enzymschritt geeignete isotonische Lösung verwendet werden, z. B. 3 Volumina eines der oben in Schritt (i) erwähnten Puffer; anschließend wird die Suspension in Eiswasser gekühlt. Die Zellen werden mit einem leistungsstarken, mit Titanhorn ausgestatteten Ultraschallgerät aufgebrochen, wobei mehrere 5 Sekunden dauernde Behandlungen stattfinden, starke Temperaturanstiege zu vermeiden sind und das Röhrchen während der gesamten Dauer in Eiswasser gehalten wird.
(b) In einem alternativen Verfahren werden die Zellen in 10 Volumina eines Lysepuffers suspendiert, wie er in obigem Abschnitt B verwendet wird. Durch wiederholtes Hindurchschicken durch eine feine Pipettenspitze sorgt die Kombination von Lyselösung und mechanischem Aufbrechen für das Aufbrechen von Zellen ohne Verwendung eines leistungsstarken Ultraschallgeräts, das einige der Perlen fragmentieren könnte. Dies ist besonders für Anwendungen vorzuziehen, in denen Eisenverbindungen u. dgl. auszuschließen sind.
(iv) Die resultierende Suspension von Zellfragmenten kann dann mit einer Lösung von Protease-Inhibitor, z. B. 1 Teil einer Protease-Inhibitor-Lösung (z. B. 8 mg/ml Polymethylsulfonylfluorid oder Phenylmethylsulfonylfluorid in Ethanol oder Dimethylsulfoxid) pro 50 Teile Suspension, behandelt werden. Dies ist besonders dann wichtig, wenn die Zellen große Mengen an Protease-Enzym enthalten, wie dies bei einigen Zellen des Intestinalepithels der Fall ist.
(v) Die resultierende Suspension wird anschließend unter Kühlung bei zumindest 5000 g 10 Minuten lang zentrifugiert und der Überstand in ein frisches Röhrchen gefüllt.
(vi) Die Probe kann danach in festen CO₂ oder flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zum Test bei –80°C gelagert werden.
(vii) Tests hinsichtlich der Enzymaktivität im Überstand und auch hinsichtlich der Proteinkonzentration werden anschließend durchgeführt und die Ergebnisse in herkömmlicher Form als Aktivitätseinheiten pro mg Protein ausgedrückt. Zu diesen Enzymaktivitäten zählen jene von Glutathion-S-Transferase (GST), Chinon-Reductase (QR), Atase und FaPY-Glycosylase, wobei im Prinzip jedes Enzym von Interesse verwendet werden kann.
(viii) Isolierte abgeblätterte Zellen aus Fäzes von 7 Personen wurden dieser Vorgangsweise unterzogen, um einen Test auf Gesamt-GST (unter Verwendung des CDNB-Substrats) und QR-Aktivitäten durchzuführen. Die Ergebnisse sind aus nachstehender Tabelle 3 ersichtlich.

Tabelle 3: Ergebnisse von Phase II-Enzym- und Protein-Tests in aus menschlichen Fäzes isolierten abgeblätterten Zellen
Diese Ergebnisse zeigen, dass abgeblätterte Zellen eingesammelt und dazu verwendet werden können, repräsentative Phase II-Enzym-Aktivitäten von Intestinalepithel zellen zu überwachen, was für die Krebsprophylaxe infolge der erwiesenen Induzierbarkeit dieser Enzyme durch diese Anti-Krebsmittel und ihre Rolle bei der Verhinderung von DNA-Schädigung von Bedeutung ist.

(i) Der Test des Überstands durch Gelelektrophorese und Visualisierung der getrennten Proteine, z. B. mittels Einfärbung mit Page Blue oder durch Western Blot, bietet ein Verfahren zum spezifischen Detektieren der Gegenwart des Enzyms in den abgeblätterten Zellen, selbst wenn man keine Aktivität feststellt. Dies kann für Epithelzellen von Interesse sein, wenn Expositionen an der Epithelgrenzfläche zum Aufbrauchen des Enzyms (z. B. Atase) oder Hemmung (z. B. GST) führen. Dieses Verfahren bietet auch die Kontrollmöglichkeit, dass externes Protein, z. B. das im Isolierungsverfahren verwendete BSA, entfernt wurde.
(x) Alternativ dazu bietet das Einsammeln von RNA aus dem Überstand unter Anwendung bekannter Verfahren, gefolgt vom Test der spezifischen RNA auf das Enzym, eine Möglichkeit, Expression und Induktion des Enzyms zu detektieren, selbst wenn keine Aktivität oder kein Protein zu beobachten ist.

Claims

Verfahren zum Isolieren von Zellen aus fäkalem Stuhl, wobei das Verfahren umfasst: a) das Abkühlen des Stuhls auf eine Temperatur unter seinem Gel-Gefrierpunkt; b) das Entnehmen von Zellen von der Oberfläche des Stuhls, während der Stuhl auf einer Temperatur unter seinem Gel-Gefrierpunkt gehalten wird, so dass der Stuhl im Wesentlichen intakt bleibt.
Verfahren nach Anspruch 1, folgende Schritte umfassend: a) das Abkühlen des Stuhls auf eine Temperatur unter seinem Gel-Gefrierpunkt; b) das Waschen von Zellen von der Oberfläche des Stuhls mit einer wässrigen Lösung, während der Stuhl auf einer Temperatur unter seinem Gel-Gefrierpunkt gehalten wird, so dass der Stuhl im Wesentlichen intakt bleibt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin der Stuhl auf eine Temperatur von –10°C bis 10°C abgekühlt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, worin der Stuhl auf eine Temperatur von 0°C bis 5°C abgekühlt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, worin der Stuhl mit einer wässrigen Lösung gewaschen wird, die eine kurzkettige Fettsäure oder ein Salz davon enthält.
Verfahren nach Anspruch 5, worin der Stuhl mit einer wässrigen Lösung gewaschen wird, die Natriumbutyrat enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Zellen von den Oberflächenschichten des Stuhls durch Abschaben, Abtupfen, Abstreichen, Abschmieren oder anderen physikalischen Abrieb entfernt werden.
Verfahren nach Anspruch 7, worin weniger als 1,0 mm der Oberflächenschichten des Stuhls entfernt werden.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, weiters folgende Schritte umfassend: c) das Mischen einer wässrigen Suspension der zuvor erhaltenen Zellen mit Immunomagnetperlen, die Magnetperlen umfassen, an die Antikörper gebunden sind, die zur selektiven Bindung an die Zellen fähig sind; d) das magnetische Einsammeln der Magnetperlen, an die die Zellen gebunden sind.
Verfahren nach Anspruch 9, worin die Antikörper Ber-EP4-Antikörper umfassen, die zur Bindung an Epithelzellen fähig sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Zellen menschliche Zellen sind.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin die Zellen abgeblätterte Epithelzellen umfassen.
Verfahren zum Isolieren von DNA aus fäkalem Stuhl, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) das Isolieren von Zellen aus fäkalem Stuhl nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12; b) das Extrahieren der DNA aus den Zellen.
Diagnosetest auf kolorektale Neoplasie bei einem Probanden, folgende Schritte umfassend: (a) das Isolieren von DNA aus einem fäkalen Stuhl von einem Probanden nach dem Verfahren nach Anspruch 13, und (b) das Bestimmen der Menge an isolierter DNA.
Diagnosetest auf kolorektale Neoplasie nach Anspruch 14, weiters den folgenden Schritt umfassend: (c) das Vergleichen der Menge an isolierter DNA mit den DNA-Mengen, die zuvor aus fäkalen Stühlen gesunder Personen und von Personen mit kolorektalen Neoplasien isoliert wurden.
Diagnosetest auf kolorektale Neoplasie nach Anspruch 14 oder 15, der zur postoperationalen Überwachung von Krebspatienten eingesetzt wird.
Verfahren zum Bestimmen der Enzymaktivität oder Genexpression von Epithelzellen, umfassend das Isolieren abgeblätterter Epithelzellen nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und das Testen der Zellen auf Enzymaktivität oder das Isolieren von RNA und Testen auf Genexpression.
Nichtinvasives Verfahren zum Überwachen einer biologischen oder biochemischen Eigenschaft von Epithelgewebe, folgende Schritte umfassend: a) das Isolieren von Epithelzellen nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12; und b) das Testen der isolierten Epithelzellen auf die biologische oder biochemische Eigenschaft.
Test zum Anzeigen genetischer Anomalien, folgende Schritte umfassend: (a) das Isolieren von DNA aus einem fäkalen Stuhl nach dem Verfahren nach Anspruch 13; und (b) das Testen der DNA auf das Vorhandensein von mit Krebsrisiko verbundenen Genmutationen und/oder Genotypen.