CN104370997B - 去除生物制品中细菌内毒素的试剂盒、方法及其生物制品的制备方法 - Google Patents

去除生物制品中细菌内毒素的试剂盒、方法及其生物制品的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种去除生物制品中细菌内毒素的试剂盒、用该试剂盒去除生物制品中细菌内毒素的方法，以及一种去除内毒素的生物制品的制备方法，本发明的试剂盒包括阴离子表面活性剂和钾盐；本发明的方法是用阴离子表面活性剂与生物制品中的内毒素充分结合，形成结合物，再加入钾盐使结合物沉淀，过滤去除沉淀即得到去除内毒素的生物制品溶液，再从该生物制品溶液中分离出生物制品即可。本试剂盒能够简便、高效地去除生物制品中的内毒素、成本低，本发明的去除内毒素的方法易于操作、不影响生物制品的生物活性且只使用了医药工业准许使用的化合物。用发明方法制备出的生物制品，其中的内毒素含量符合临床用药标准、活性物质损失少。

Description

去除生物制品中细菌内毒素的试剂盒、方法及其生物制品的 制备方法
技术领域
本发明涉及生物制品的分离纯化领域，特别是涉及一种去除生物制品中细菌内毒素的试剂盒、去除方法及去除内毒素的生物制品的制备方法。
背景技术
随着现代生物技术的广泛应用，生物制品的安全性受到越来越多的重视，尤其是对生物制品中的热原控制得越来越严格。但是在生物制品的生产过程中，常会因原辅料、生产环境以及个人操作等因素引入热原，在采用发酵工艺的药物生产过程中还会因为在生产过程中不可避免地需要将菌种破壁以释放活性物质而引入大量热原，污染生物制品。因此除了在生产环节中采取有效的工艺控制及严格的预防措施减少热原的来源外，如何去除生物制品中的热原成为本领域的重要研究课题，但是迄今为止没有一个简便、高效的方法。
热原(Pyrogen)指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。通常提到的“热原”，主要是指细菌性热原，是某些细菌的代谢产物、细菌尸体及内毒素。细菌内毒素(Endotoxin)是革兰氏阴性菌细胞壁外膜的主要成分之一，其本质是脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)，在化学结构上主要由多糖(Polysaccharide)和类脂A(Lipid A)组成。它的特殊性在于它不是细菌或细菌的代谢产物，而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有生物活性的物质，而类脂A正是内毒素多种生物活性或毒性反应的主要基团。虽然不同的革兰氏阴性细菌，其LPS的化学组成有一定的差别，但它们都含有类脂A部分，也就是说这个基团没有种属特异性，因此各属细菌内毒素的毒性反应相似，如发热、血液流动力学改变、弥漫性血管内凝血、休克等。因此，为保证生物制品的使用安全，需要将其中的内毒素含量降低到安全范围内[1][2]。比较公认的注射剂内毒素上限值是5EU/kg体重[3]。
内毒素的化学性质非常稳定，100℃煮沸条件下不会被破坏；250℃30分钟以上或者180℃3小时以上才能被破坏；浓度为0.1M以上的强酸或者强碱浸泡才能被破坏[2]。在生理条件下具有疏水性和电负性，通常分子量为十几万至上百万道尔顿。通常采用的去除手段有超滤、各种柱层析(如疏水层析、离子交换)、亲和吸附(多粘菌素B、L-组氨酸、多聚-L-赖氨酸、多聚γ-L-谷氨酸交联介质)和浊点萃取法(Triton X-114)等，这些方法能去除或灭活部分内毒素，但是都存在着一定的缺点。比如超滤法只能应用于小分子药物，如果药物分子(譬如抗体)和内毒素分子大小接近，就无法有效分离；柱层析成本高、效率很低，不适合大规模生产中细菌内毒素的去除；阴离子交换树脂对于同样带负电荷的生物分子就无法分离；浊点萃取法(Triton X-114)[4]也存在很大缺点如在操作过程中需要多次萃取，造成质粒中活性物质的损失；处理时需要转换温度，相变后Triton X-114形成极细小雾滴存在于水相，需要高速离心分离，难于工业化操作和控制等等。
综上所述，研发一种既能高效率、低成本去除内毒素，又能最大限度地保持生物制品活性的方法是本领域当前的重要课题。
发明内容
本发明的主要目的是针对现有技术中存在的技术缺陷，提供一种操作简单、能够有效去除生物制品中细菌内毒素的试剂盒；试剂盒包括钾盐和在足量所述钾盐存在下不能溶于水的阴离子表面活性剂。
所述阴离子表面活性剂选自十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷基磺酸钠、仲烷基硫酸钠，脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠、油醇硫酸钠、N—油酰基多缩氨基酸钠，烷基苯磺酸钠、α-烯烃磺酸钠、烷基磺酸钠、α-磺基单羧酸酯、脂肪酸磺烷基酯、琥珀酸酯磺酸盐、烷基萘磺酸盐、石油磺酸钠、木质素磺酸钠、烷基甘油醚磺酸钠。优选十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠。
所述阴离子表面活性剂在内毒素去除过程中使用的终浓度取决于溶液中细菌内毒素的浓度，高于内毒素的浓度即可，当内毒素浓度较高时所述阴离子表面活性剂浓度也应该提高。反之则可以使用较低浓度的所述阴离子表面活性剂。通常为质量浓度不低于1wt％，优选5wt％-10wt％。
所述含钾盐选自氯化钾、醋酸钾、硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾和硝酸钾中的一种或几种的组合，优选醋酸钾、氯化钾。
所述钾盐在内毒素去除过程中使用的终浓度为不低于能使所述阴离子表面活性剂充分沉淀的浓度，也就是说，只要能使溶液中所述阴离子表面活性剂沉淀完全即可；一般不低于0.3M，优选0.5M-1M。
所述阴离子表面活性剂和钾盐可以为固体，也可以为溶液，分别独立包装。
本发明的另一目的是提供一种能够有效去除生物制品中细菌内毒素的方法，包括以下步骤：将含有内毒素的生物制品样品与足量所述阴离子表面活性剂混合均匀静置，再加入足量所述钾盐混匀使所述阴离子表面活性剂沉淀完全，静置后离心或者过滤，收集清液得到去除内毒素的生物制品样品溶液。
所述阴离子表面活性剂在其与含有内毒素的生物制品混合后的溶液中的浓度取决于溶液中细菌内毒素的浓度，高于内毒素的浓度即可，当内毒素浓度较高时所述阴离子表面活性剂浓度也应该提高。反之则可以使用较低浓度的所述阴离子表面活性剂。通常使用质量百分含量不低于1wt％。
所述钾盐加至溶液中的终浓度为不低于能使所述阴离子表面活性剂充分沉淀的浓度，也就是只要能使溶液中所述阴离子表面活性剂沉淀完全即可；一般不低于0.3M，优选0.5M-1M。
所述生物制品为蛋白或核酸。
本发明还有一个目的在于提供一种高效率、低成本去除内毒素的生物制品的制备方法，将含有内毒素的生物制品样品与足量所述阴离子表面活性剂混合均匀至阴离子表面活性剂混合，静置。再加入足量所述钾盐混匀至所述阴离子表面活性剂完全被钾盐沉淀完全，静置后离心或过滤；收集清液即是去除内毒素的生物制品样品溶液。再将所述生物制品样品从去除内毒素的生物制品溶液中分离，即得去除内毒素后的生物制品样品。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本试剂盒能够简便快捷地去除生物制品中的内毒素。本发明的去除内毒素的方法易于操作、成本低，内毒素去除效果显著优于现有方法。而且不影响生物制品的生物活性，用发明方法制备出的生物制品，其中的内毒素含量符合临床用药标准、活性物质损失少。
附图说明
图1所示为实验例1中内毒素浓度-吸光度标准曲线图。
具体实施方式
本发明提供了一种去除生物制品中内毒素的试剂盒，及利用该试剂盒去除生物制品中内毒素的方法，还有利用这种去除内毒素的方法用来制备无内毒素生物制品的方法。本发明的核心原理是阴离子表面活性剂与内毒素能够很好地结合，另一方面，阴离子表面活性剂在一定浓度钾离子存在的条件下溶解度会变得足够小；加入钾离子能够使与阴离子表面活性剂相结合的内毒素一同从水相以沉淀的形式析出，从而去除生物制品中的内毒素。再用常规方法将去除了内毒素的生物制品从水溶液中分离纯化出来，即得到去除了内毒素的生物制品。
以下结合附图和具体实施例，更具体地说明本发明的内容，并对本发明作进一步阐述，但这些实施例绝非对本发明有任何限制。本领域技术人员在本说明书的启示下对本发明实施例中所作的任何变动都将属于本发明权利要求书的范围内。
实施例中所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。所用方法如无特别说明均为常规方法。如无特别说明，各实施例中相同名称的材料或试剂内容相同。
实验例1、生物制品样品去除内毒素前的准备工作
一、内毒素标准品含量-吸光度标准曲线的绘制
1、实验材料
显色基质鲎试剂盒购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司；所用实验器材均无内毒素。
2、内毒素溶液标准品的制备及标准曲线的绘制
均按照厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的显色基质鲎试剂盒使用说明书进行。
用光度测定法测得内毒素标准品的吸光度(见表1)，并以吸光度为Y轴，内毒素浓度为X轴，绘制出内毒素浓度-吸光度标准曲线(见图1)，得到y＝0.791X+0.084(R2＝0.994)的标准曲线方程。
表1 内毒素标准品吸光度值
二、高浓度内毒素溶液的制备
由于购买的内毒素溶液标准品浓度很低，为便于实验使用，制备了高浓度内毒素溶液。
将2mL大肠杆菌DH5α于离心管中过夜培养，然后在12000rpm下离心30s，弃上清液，沉淀为菌体；向沉淀中加入200μL的PA溶液(PA溶液包含50mM的tris-HCl和10mM的EDTA，pH＝7.5)充分混合均匀后，再加入200μL的PB溶液(PB溶液包含0.2M的NaOH和1wt％的十二烷基硫酸钠(SDS))，混合均匀后室温静置2-3min，再加入约70-80μL的PC溶液(PC溶液是5M的醋酸钠溶液，pH＝4.8)调节pH至7左右，15000rpm离心5min，取上清液，即得高浓度内毒素溶液(该溶液中内毒素的浓度大概在50-100万EU/mL)。
三、待去除内毒素生物制品样品的制备
所用试剂均为市售常规试剂。
1、待去除内毒素蛋白样品的配制
取100mg的人血清白蛋白(HSA)溶于水中制成1mL的人血清白蛋白水溶液，再向其中加入2-10μL本实施例第二部分得到的高浓度内毒素溶液，并混合均匀，即得内毒素浓度大概在5000-10000EU/mL的待去除内毒素蛋白样品。
2、待去除内毒素DNA样品的配制
取1mg PUC19质粒DNA溶于水中制成1mL的DNA溶液，再向其中加入2-10μL本实施例第二部分得到的高浓度内毒素溶液，并混合均匀，即得内毒素浓度大概在5000-10000EU/mg的待去除内毒素DNA样品。
四、待去除内毒素生物制品样品中内毒素浓度的测定
为比较本发明在去除生物制品中内毒素的效果，需对待去除内毒素生物制品样品中内毒素浓度进行测定。由于待去除内毒素生物制品样品中内毒素(外加)的浓度太高，内毒素浓度与吸光度不成线性关系，因此需稀释待去除内毒素生物制品样品，使其中的内毒素浓度落在本实施例第一部分绘制出的标准曲线的内毒素浓度范围内。
1、待去除内毒素蛋白样品中内毒素浓度的测定
取25μL本实施例第三部分得到的待去除内毒素蛋白样品，用无内毒素水稀释20000倍后，按照厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的显色基质鲎试剂盒使用说明书中的测定方法，测定稀释后的待去除内毒素蛋白样品的吸光度，并将得到的吸光度值代入按本实施例第一部分方法得到的标准曲线方程中，计算得到待去除内毒素蛋白样品中的内毒素浓度。
2、待去除内毒素DNA样品中内毒素浓度的测定
取25μL本实施例第三部分得到的待去除内毒素DNA样品，用无内毒素水稀释20000倍后，按照厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的显色基质鲎试剂盒使用说明书中的测定方法，测定稀释后的待去除内毒素DNA样品的吸光度，并将得到的吸光度值代入按本实施例第一部分方法得到的标准曲线方程中，计算得到待去除内毒素DNA样品中的内毒素浓度。
实施例1、待去除内毒素生物制品样品中内毒素的去除
1)、取实验例1第三部分方法得到的待去除内毒素生物制品样品，向其中加入阴离子表面活性剂至阴离子表面活性的终浓度不低于1wt％(阴离子表面活性剂浓度取决于内毒素浓度，内毒素浓度越高，阴离子表面活性剂浓度也需相应提高，一般在5-10wt％左右)，混合均匀后静置5min；阴离子表面活性剂可选十二烷基硫酸钠(SDS)、脱氧胆酸钠(SDC)、仲烷基硫酸钠，脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠、油醇硫酸钠、N—油酰基多缩氨基酸钠，烷基苯磺酸钠、α-烯烃磺酸钠、烷基磺酸钠、α-磺基单羧酸酯、脂肪酸磺烷基酯、琥珀酸酯磺酸盐、烷基萘磺酸盐、石油磺酸钠、木质素磺酸钠、烷基甘油醚磺酸钠等在足量钾盐存在下不能溶解于水的阴离子表面活性剂；
2)、向步骤1)得到的混合溶液中加入足量钾盐，至不再有沉淀生成，混合均匀后得到含沉淀的混合液，再静置5min；钾盐可选氯化钾(KCl)、醋酸钾(KAc)、碳酸钾(K2CO3)、碳酸氢钾(KHCO3)、磷酸钾(K3PO4)、磷酸一氢钾(K2HPO4)、硫酸二氢钾(K2HPO4)、硫酸钾(K2SO4)等常用的钾盐固体或钾盐溶液；
3)、将步骤2)得到的含沉淀的混合液在14000rpm下离心5min，弃沉淀，取清液；或者将含沉淀的混合液经孔径为0.45μm的PP滤膜后，在4000rpm下离心过滤，取清液，所得清液即是去除内毒素的生物制品样品溶液。
以下将以蛋白和DNA为例，详述本发明提供的去除内毒素的方法。
实验例2、内毒素检测干扰试验
为了排除生物制品吸光度对内毒素吸光度的影响，进行了干扰试验，以筛选出对内毒素检测干扰程度最小的生物制品浓度。干扰试验的操作过程按照厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的显色基质鲎试剂盒使用说明书中的“供试品的干扰试验”进行。
1.蛋白样品溶液对内毒素检测的干扰试验
由于蛋白样品溶液在去内毒素时加入了一定浓度的其他物质，因此需要在测定前将其稀释至一定倍数以消除干扰。
将实施例1中步骤3)得到的去除内毒素的蛋白样品溶液(pH7-8)，分别稀释25倍，50倍和100倍，得到三个干扰试验样品；分别向三个干扰试验样品中加入0.5mL1EU/mL的内毒素溶液；按上述试剂盒的使用说明对干扰试验样品进行测定，再用图1标准曲线计算内毒素实测值，试验结果见表2。
表2 蛋白样品溶液中K+离子浓度对内毒素检测的干扰试验结果
由表中试验结果可以看出，当蛋白样品溶液稀释100倍以上时对测量无干扰。因此，后续进行的蛋白样品溶液内毒素浓度测定前，均将样品溶液用无内毒素水稀释100倍以上再测定。
2.DNA样品溶液对内毒素检测的干扰试验
由于将固体DNA从DNA样品溶液中提取出来比蛋白的提取容易得多，因此在检测DNA样品溶液中的内毒素浓度时，先向实施例1中步骤3)得到的去除内毒素的DNA溶液中加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置30min，然后在14000rpm离心10min，弃上清液，沉淀用适量70％乙醇洗涤；再14000rpm离心10min，弃上清液，沉淀经重复洗涤和离心过程一次后，晾干乙醇，即得去除内毒素的DNA。再将得到的去除内毒素的DNA溶解于无内毒素水，再进行内毒素浓度的检测，这样就消除了其它物质的干扰。为了消除DNA本身对内毒素检测的影响，因此需要在测定前将DNA稀释至一定浓度以消除干扰。
取无内毒素DNA，用无内毒素水配成DNA浓度为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的五个DNA溶液,分别向这五个0.5mL的DNA溶液中加入0.5mL1EU/mL的内毒素标准品，得到五个DNA干扰试验样品。按上述试剂盒的使用说明对干扰试验样品进行测定，再用图1标准曲线计算内毒素实测值，试验结果见表3。
表3 DNA浓度对内毒素检测的干扰试验结果
由表2的试验结果可以看出，当DNA浓度低于0.3mg/mL时对测量无干扰；因此，后续进行的内毒素浓度测定前，均将样品用无内毒素水稀释至DNA浓度低于0.3mg/mL。
实施例2、使用SDS和氯化钾去除蛋白溶液中的内毒素
1)、取0.5mL按实验例1第三部分制备的待去除内毒素白蛋白溶液样品，(内毒素浓度约为8000EU/mL)向其中加入20wt％十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度分别为1wt％、5wt％、10wt％，混合均匀后静置5min；
2)、向步骤1)的混合溶液中加入0.4mL 3M氯化钾溶液(pH＝7.5),混合均匀后得到含沉淀的混合液，并静置5min；
3)、将步骤2)得到的含沉淀的混合液在14000rpm下离心5min，弃沉淀，取上清液，或者经0.45μm孔径的PP滤膜，在4000rpm下离心过滤，所得清液即是去除内毒素的蛋白样品溶液；
4)取50μL步骤3)得到的去除内毒素蛋白样品，用无内毒素水稀释100倍后，按照厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的显色基质鲎试剂盒使用说明书中的测定方法，测定稀释后的去除内毒素后蛋白样品的吸光度，并将得到的吸光度值代入按实验例1第一部分得到的标准曲线方程中，计算得到去除内毒素后蛋白样品中的内毒素浓度。结果分别为3.5EU/mg、2.5EU/mg、1.1EU/mg。在280nm波长下检测去除内毒素的蛋白样品溶液中的蛋白浓度分别为91mg/mL(回收率91％)，86mg/mL(回收率86％)；79mg/mL(回收率79％)。
本实施例的结果可以看出，阴离子表面活性剂的浓度越高，去除内毒素的效果越好，当阴离子表面活性剂与待去除内毒素蛋白样品混合后的终浓度达到1wt％时，就能将蛋白样品中的内毒素浓度去除到临床用药标准(小于5-10EU/mg(重组人生长激素中内毒素浓度须低于5EU/mg；重组人胰岛素中内毒素浓度须低于10EU/mg，中国药典2005版二部，495页))，且回收率基本均能达到80％，本发明方法去除蛋白样品中的内毒素效果好，蛋白损失少。
实施例3、使用SDS和醋酸钾去除蛋白溶液中的内毒素
1)、取0.5mL按实验例1第三部分制备的待去除内毒素白蛋白溶液样品(内毒素浓度约为8000EU/mL)，向其中加入10wt％十二烷基硫酸钠(SDS)0.5mL(终浓度为5wt％)，混合均匀后静置5min；
2)、向步骤1)的混合溶液中分别加入0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL 3.3M醋酸钾溶液(pH＝7.5),使得醋酸钾的终浓度分别为0.3M、0.55M、1.1M、1.65M，混合均匀后得到含沉淀的混合液，并静置5min；
3)、将步骤2)得到的含沉淀的混合液在14000rpm下离心5min，弃沉淀，取上清液，或者经0.45μm孔径的PP滤膜，在4000rpm下离心过滤，所得清液即是去除内毒素的蛋白样品溶液；
4)取50μL步骤3)得到的去除内毒素蛋白样品，用无内毒素水稀释100倍后，按照厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的显色基质鲎试剂盒使用说明书中的测定方法，测定稀释后的去除内毒素后蛋白样品的吸光度，并将得到的吸光度值代入按实验例1第一部分得到的标准曲线方程中，计算得到去除内毒素后蛋白样品中的内毒素浓度。结果分别为1.5EU/mg、1.9EU/mg、1.2EU/mg、1.4EU/mg，去除内毒素后蛋白的回收率均可达到80％以上。
本实施例的结果表明，沉淀剂——钾盐的浓度对去除蛋白样品中的内毒素无影响，说明在沉淀剂终浓度不低于0.3M的情况下，无论沉淀剂的浓度是多少，只要沉淀完全就能够将蛋白样品中的内毒素浓度降低到临床用药标准。且去除内毒素后蛋白的回收率均可达到80％以上，说明沉淀剂在终浓度不低于0.3M的条件下，对蛋白样品中的内毒素去除效果好，蛋白回收率高。
实施例4：使用SDC和醋酸钾去除蛋白溶液中的内毒素
1)、取0.5mL按实验例1第三部分制备的待去除内毒素白蛋白溶液样品(内毒素浓度约为8000EU/mL)，向其中加入10wt％脱氧胆酸钠(SDC)至终浓度为5wt％、混合均匀后再静置5min；
2)、向步骤1)的混合溶液中加入0.4mL 3M醋酸钾溶液(pH＝7.5),混合均匀后得到含沉淀的混合液，并静置5min；
3)、将步骤2)得到的含沉淀的混合液在14000rpm下离心5min，弃沉淀，取上清液，或者经0.45μm孔径的PP滤膜，在4000rpm下离心过滤，所得清液即是去除内毒素的蛋白样品溶液；
4)取50μL步骤3)得到的去除内毒素蛋白样品，用无内毒素水稀释100倍后，按照厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的显色基质鲎试剂盒使用说明书中的测定方法，测定稀释后的去除内毒素后蛋白样品的吸光度，并将得到的吸光度值代入按本实施例第一部分方法得到的标准曲线方程中，计算得到去除内毒素后蛋白样品中的内毒素浓度。结果分别为1.5EU/mg。
结合实施例2和本实施例，说明SDS和SDC在去除蛋白样品中内毒素上效果相当，并无显著差别。
综上所述，对蛋白样品来说，阴离子表面活性剂的终浓度不低于1wt％，钾盐的终浓度不低于0.3M就能使蛋白样品中的内毒素浓度达到临床用药标准(小于5-10EU/mg(重组人生长激素中内毒素浓度须低于5EU/mg；重组人胰岛素中内毒素浓度须低于10EU/mg，中国药典2005版二部，495页))；阴离子表面活性剂或钾盐的种类则不影响去除效果。尤其是沉淀剂——钾盐的终浓度对去除蛋白样品中的内毒素无影响，只要沉淀完全就能够将蛋白样品中的内毒素浓度降低到临床用药标准。其它种类的阴离子表面活性剂和其它种类的钾盐的实验结果与此结果类似，不一一列出。
实验例3、去除内毒素后蛋白样品的分离
将步骤3)得到的去除内毒素的蛋白样品溶液经常规的沉淀法或透析法即可把其中的蛋白分离出来(如《生物工程学报》第20卷第6期，第943-947页，疏水层析结合冷乙醇沉淀纯化人血清白蛋白中提到的方法)，即得到去除内毒素的人血清白蛋白。
实施例5、使用SDS和醋酸钾去除DNA溶液中的内毒素
1)、取0.5mL按实验例1第三部分制备的待去除内毒素DNA溶液样品(DNA浓度为1mg/mL，内毒素浓度约为8000EU/mL)，向其中加入20wt％十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度分别为1wt％、5wt％、10wt％，混合均匀后静置5min；
2)、向步骤1)的混合溶液中加入0.3mL 3M醋酸钾溶液(pH＝5),混合均匀后得到含沉淀的混合液，并静置5min；
3)、将步骤2)得到的含沉淀的混合液在14000rpm下离心5min，弃沉淀，取上清液，或者经0.45μm孔径的PP滤膜，在4000rpm下离心过滤，所得清液即是去除内毒素的DNA溶液；
4)向步骤3)得到的去除内毒素的DNA溶液中加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置30min，然后在14000rpm离心10min，弃上清液，沉淀用适量70％乙醇洗涤；再14000rpm离心10min，弃上清液，沉淀经重复洗涤和离心过程一次后，晾干乙醇，即得去除内毒素的DNA。
5)将步骤4)中得到的DNA溶解于无内毒素水，至DNA浓度低于0.3mg/mL。然后按照厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的显色基质鲎试剂盒使用说明书中的测定方法，测定去除内毒素的DNA的吸光度，并将得到的吸光度值代入按实验例1第一部分得到的标准曲线方程中，计算得到去除内毒素的DNA中的内毒素浓度。结果分别为4.3EU/mg、2.1EU/mg、1.1EU/mg。在260nm波长下检测DNA的浓度分别为0.87mg/mL(回收率87％)，0.82mg/mL(回收率82％)，0.77mg/mL(回收率77％)。
本实施例结果表明，与蛋白结果类似，当生物制品是DNA时，阴离子表面活性剂的浓度越高，去除内毒素的效果越好，当阴离子表面活性剂与待去除内毒素DNA样品混合后的终浓度达到1wt％时，就能使DNA样品中的内毒素浓度满足临床用药标准(根据国家食品药品监督管理总局2003年3月20日发布的《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》，其中第五部分9.热源实验：主要检测制品中有无热原物质，可用鲎试剂检测细菌的内毒素，要求内毒素的含量不高于10EU/mg。)，并且DNA的回收率均在75％以上，说明用本方法去除DNA中的内毒素，去除效果好，DNA回收率高。
实施例6、使用SDS和醋酸钾去除DNA溶液中的内毒素
1)、取0.5mL按实验例1第三部分制备的待去除内毒素DNA溶液样品(DNA浓度为1mg/mL，内毒素浓度约为8000EU/mL)，向其中加入10wt％脱氧胆酸钠(SDC)0.5mL(终浓度为5wt％)，混合均匀后再静置5min；
2)、向步骤1)的混合溶液中分别加入0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL 3.3M醋酸钾溶液(pH＝5),使得醋酸钾的终浓度分别为0.3M、0.55M、1.1M、1.65M，混合均匀后得到含沉淀的混合液，并静置5min；
3)、将步骤2)得到的含沉淀的混合液在14000rpm下离心5min，弃沉淀，取上清液，或者经0.45μm孔径的PP滤膜，在4000rpm下离心过滤，所得清液即是去除内毒素的DNA溶液；
4)向步骤3)得到的去除内毒素的DNA溶液中加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置30min，然后在14000rpm离心10min，弃上清液，沉淀用适量70％乙醇洗涤；再14000rpm离心10min，弃上清液，沉淀经重复洗涤和离心过程一次后，晾干乙醇，即得去除内毒素的DNA。
5)将步骤4)中得到的DNA溶解于无内毒素水，至DNA浓度低于0.3mg/mL。然后按照厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的显色基质鲎试剂盒使用说明书中的测定方法，测定去除内毒素后DNA样品的吸光度，并将得到的吸光度值代入按实验例1第一部分得到的标准曲线方程中，计算得到去除内毒素的DNA中的内毒素浓度。结果分别为1.2EU/mg、1.5EU/mg、1.8EU/mg、1.4EU/mg。
本实施例的结果表明，沉淀剂——钾盐的浓度对去除DNA样品中的内毒素无影响，也就是在沉淀剂终浓度不低于0.3M的情况下，无论沉淀剂的浓度是多少，只要沉淀完全就能够将DNA样品中的内毒素浓度降低到临床用药标准。且去除内毒素后DNA的回收率均可达到75％以上，说明沉淀剂在终浓度不低于0.3M的条件下，对DNA样品中的内毒素去除效果好，DNA回收率高。
实施例7、使用SDS和氯化钾去除DNA溶液中的内毒素
1)、取0.5mL按实验例1第三部分制备的待去除内毒素DNA溶液样品(DNA浓度为1mg/mL，内毒素浓度约为8000EU/mL)，向其中加入10wt％十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度为1wt％混合均匀后静置5min；
2)、向步骤1)的混合溶液中加入0.2mL 3M氯化钾溶液(用含10mM Tris-HCl的溶液配制,pH＝7.5),混合均匀后得到含沉淀的混合液，并静置5min；
3)、将步骤2)得到的含沉淀的混合液在14000rpm下离心5min，弃沉淀，取上清液，或者经0.45μm孔径的PP滤膜，在4000rpm下离心过滤，所得清液即是去除内毒素的DNA样品溶液；
4)向步骤3)得到的去除内毒素的DNA溶液中加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置30min，然后在14000rpm离心10min，弃上清液，沉淀用适量70％乙醇洗涤；再14000rpm离心10min，弃上清液，沉淀经重复洗涤和离心过程一次后，晾干乙醇，即得去除内毒素的DNA。
5)将步骤4)中得到的DNA溶解于无内毒素水，至DNA浓度低于0.3mg/mL。然后按照厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的显色基质鲎试剂盒使用说明书中的测定方法，测定去除内毒素后DNA样品的吸光度，并将得到的吸光度值代入按实验例1第一部分得到的标准曲线方程中，计算得到去除内毒素的DNA中的内毒素浓度结果为1.9EU/mg。
结合实施例6和本实施例，可以看出氯化钾和醋酸钾作为沉淀剂去除DNA样品中内毒素的效果相当，并无显著差异。
实施例8、使用SDC和醋酸钾去除DNA溶液中的内毒素
1)、取0.5mL按实验例1第三部分制备的待去除内毒素DNA溶液样品(DNA浓度为1mg/mL，内毒素浓度约为8000EU/mL)，向其中加入10wt％脱氧胆酸钠(SDC)0.5mL(终浓度为5wt％)，混合均匀后静置5min；
2)、向步骤1)的混合溶液中分别加入0.4mL 3M醋酸钾溶液(pH＝5),混合均匀后得到含沉淀的混合液，并静置5min；
3)、将步骤2)得到的含沉淀的混合液在14000rpm下离心5min，弃沉淀，取上清液，或者经0.45μm孔径的PP滤膜，在4000rpm下离心过滤，所得清液即是去除内毒素的DNA样品溶液；
4)向步骤3)得到的去除内毒素的DNA溶液中加入等体积的异丙醇，混匀后室温静置30min，然后在14000rpm离心10min，弃上清液，沉淀用适量70％乙醇洗涤；再14000rpm离心10min，弃上清液，沉淀经重复洗涤和离心过程一次后，晾干乙醇，即得去除内毒素的DNA。
5)将步骤4)中得到的DNA溶解于无内毒素水，至DNA浓度低于0.3mg/mL。然后按照厦门市鲎试剂实验厂有限公司提供的显色基质鲎试剂盒使用说明书中的测定方法，测定去除内毒素后DNA样品的吸光度，并将得到的吸光度值代入按实验例1第一部分得到的标准曲线方程中，计算得到去除内毒素的DNA中的内毒素浓度结果为1.2EU/mg。
结合实施例5和本实施例，说明SDS和SDC在去除DNA样品中内毒素上效果相当，并无显著差别。
综上所述，对DNA样品来说，阴离子表面活性剂的终浓度不低于1wt％，钾盐的终浓度不低于0.3M，就能使DNA样品中的内毒素浓度满足临床用药标准(根据国家食品药品监督管理总局2003年3月20日发布的《预防用DNA疫苗临床前研究技术指导原则》，其中第五部分9.热源实验：主要检测制品中有无热原物质，可用鲎试剂检测细菌的内毒素，要求内毒素的含量不高于10EU/mg)；阴离子表面活性剂或钾盐的种类则不影响去除效果。尤其是沉淀剂——钾盐的终浓度在不低于0.3M的情况下，对去除DNA样品中的内毒素并无影响，只要沉淀完全就能够将DNA样品中的内毒素浓度降低到临床用药标准。其它种类的阴离子表面活性剂和其它种类的钾盐的实验结果与此结果类似，不一一列出。
由于RNA与DNA的性质类似，也可以采用上述方法去除其中的内毒素。
实验例4、不同生物制品浓度的样品对内毒素去除效果的影响
为了比较生物制品样品中生物制品的浓度在去除其中内毒素时的影响程度，便于筛选出最优的实验条件，按照实验例1和实施例1的方法平行做了多组去除生物制品样品中内毒素的实验，仅是生物制品样品中生物制品不同(如生物制品是人血清白蛋白，生物制品样品就是蛋白样品；生物制品是DNA，生物制品样品就是DNA样品)，实验结果见表4和表5(内毒素去除前浓度和内毒素去除后浓度分别指去除内毒素前、后生物制品样品中内毒素的浓度)。
其中，实施例1的步骤1)中阴离子表面活性剂选用SDS，终浓度为5wt％，钾盐选用醋酸钾，终浓度为0.7M(阴离子表面活性剂和含钾离子溶液的浓度均是指与待去除内毒素生物制品样品混合后的终浓度)。
DNA样品的回收率需要将去除内毒素的DNA样品溶液按照常规方法将DNA从溶液中分离提取出来，称重，再与待去除内毒素DNA样品中加入的DNA重量比较得到。蛋白样品的回收率是将去除内毒素的蛋白样品溶液通过紫外分光光度计在280nm下检测溶液中的蛋白浓度，再与待去除内毒素蛋白样品中的蛋白浓度比较得到；
表4 不同DNA浓度的DNA样品对去除其中内毒素的影响
DNA样品中的DNA浓度mg/mL 0.25 0.5 1 1.5 2
去除前内毒素浓度EU/mL 8000 8000 8000 8000 8000
去除后内毒素浓度EU/mgDNA 1.2 0.91 1.1 0.87 1.2
回收率％ 65 71 76 81 86
表5 不同人血清白蛋白浓度的蛋白样品对去除其中内毒素的影响
蛋白样品中的蛋白浓度mg/mL 5 10 15 20
去除前内毒素浓度EU/mL 8000 8000 8000 8000
去除后内毒素浓度EU/mL 1.3 1.1 2.3 2.1
回收率％ 93 91 94 90
由表4和表5中的数据可以看出DNA或蛋白浓度对内毒素的去除无影响，也就是说无论待去除内毒素生物制品样品中生物制品的浓度高或低，用本发明方法都能有效去除其中的内毒素，使其中的内毒素浓度达到临床用药标准，并且生物制品损失少。因此，用本发明方法在去除生物制品中内毒素的过程中，适用的生物制品浓度范围广。
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以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种去除生物制品中细菌内毒素的方法，其特征在于，包括以下步骤：将含有内毒素的生物制品与足量阴离子表面活性剂溶液混合，将得到的混合溶液静置，所述混合溶液中阴离子表面活性剂的终浓度为1wt%-10wt%；再加入终浓度为0.3M-1M的钾盐使阴离子表面活性剂沉淀，静置后离心或者过滤，收集清液得到去除内毒素的生物制品溶液；
所述阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠、脱氧胆酸钠、十二烷基磺酸钠、仲烷基硫酸钠、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯钠、油醇硫酸钠、N-油酰基多缩氨基酸钠、烷基苯磺酸钠、α-烯烃磺酸钠、α-磺基单羧酸酯、脂肪酸磺烷基酯、琥珀酸酯磺酸盐、烷基萘磺酸盐、木质素磺酸钠和烷基甘油醚磺酸钠中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述阴离子表面活性剂为十二烷基硫酸钠或脱氧胆酸钠。
3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述钾盐选自氯化钾、醋酸钾、硫酸钾、碳酸钾、碳酸氢钾、磷酸钾、磷酸一氢钾、磷酸二氢钾和硝酸钾中的一种或几种的组合。
4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述钾盐选自醋酸钾或氯化钾。
5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述混合溶液中阴离子表面活性剂的终浓度为5wt%-10wt%。
6.根据权利要求5所述方法，其特征在于，所述钾盐的终浓度为0.5M-1M。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，所述生物制品为蛋白或核酸。
8.一种去除内毒素的生物制品的制备方法，其特征在于，由权利要求1-7任一项所述的方法得到去除内毒素的生物制品溶液，再将生物制品从去除内毒素的生物制品溶液中分离出来，得到去除内毒素后的生物制品。
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