TWI577442B - The method of removing bacterial endotoxin from biological products and the preparation of its biological products method - Google Patents

The method of removing bacterial endotoxin from biological products and the preparation of its biological products method Download PDF

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Description

去除生物製品中細菌內毒素的方法及其生物製品的製備 方法
本發明涉及生物製品的分離純化領域，特別是涉及一種去除生物製品中細菌內毒素的試劑盒、去除方法及去除內毒素的生物製品的製備方法。
隨著現代生物技術的廣泛應用，生物製品的安全性受到越來越多的重視，尤其是對生物製品中的熱原控制得越來越嚴格。但是在生物製品的生產過程中，常會因原輔料、生產環境以及個人操作等因素引入熱原，在採用發酵工藝的藥物生產過程中還會因為在生產過程中不可避免地需要將菌種破壁以釋放活性物質而引入大量熱原，污染生物製品。因此除了在生產環節中採取有效的工藝控制及嚴格的預防措施減少熱原的來源外，如何去除生物製品中的熱原成為本領域的重要研究課題，但是迄今為止沒有一個簡便、高效的方法。
熱原(pyrogen)指能引起恒溫動物體溫異常升高的致熱物質。它包括細菌性熱原、內源性高分子熱原、內源性低分子熱原及化學熱原等。通常提到的熱原，主要是指細菌性熱原，是某些細菌的代謝產物、細菌屍體及內毒素。細菌內毒素(endotoxin)是革蘭氏陰性菌細胞壁外膜的主要成分之一，其本質是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，在化學結構上主要由多糖(polysaccharide)和類脂A(lipid A)組成。它的特殊性在於它不是細菌或細菌的代謝產物，而是細菌死亡或解體後才釋放出來的一種具有生物活性的物質，而類脂A正是內毒素多種生物活性或毒性反應的主要基團。雖然不同的革蘭氏陰性 細菌，其LPS的化學組成有一定的差別，但它們都含有類脂A部分，也就是說這個基團沒有種屬特異性，因此各屬細菌內毒素的毒性反應相似，如發熱、血液流動力學改變、彌漫性血管內凝血、休克等。因此，為保證生物製品的使用安全，需要將其中的內毒素含量降低到安全範圍內[1][2]。比較公認的注射劑內毒素上限值是5EU/kg體重[3]。
內毒素的化學性質非常穩定，100℃煮沸條件下不會被破壞；250℃、30分鐘以上或者180℃、3小時以上才能被破壞；濃度為0.1M以上的強酸或者強鹼浸泡才能被破壞[2]。在生理條件下具有疏水性和電負性，通常分子量為十幾萬至上百萬道爾頓。通常採用的去除手段有超濾、各種柱層析(如疏水層析、離子交換)、親和吸附(多黏菌素B、L-組氨酸、多聚-L-賴氨酸、多聚Y-L-谷氨酸交聯介質)和濁點萃取法(Triton X-114)等，這些方法能去除或滅活部分內毒素，但是都存在著一定的缺點。比如超濾法只能應用於小分子藥物，如果藥物分子(譬如抗體)和內毒素分子大小接近，就無法有效分離；柱層析成本高、效率很低，不適合大規模生產中細菌內毒素的去除；陰離子交換樹脂對於同樣帶負電荷的生物分子就無法分離；濁點萃取法(Triton X-114)[4]也存在很大缺點如在操作過程中需要多次萃取，造成質粒中活性物質的損失；處理時需要轉換溫度，相變後Triton X-114形成極細小霧滴存在於水相，需要高速離心分離，難於工業化操作和控制等等。
綜上所述，研發一種既能高效率、低成本去除內毒素，又能最大限度地保持生物製品活性的方法是本領域當前的重要課題。
本發明的主要目的是針對現有技術中存在的技術缺陷，提供一種操作簡單、能夠有效去除生物製品中細菌內毒素的試劑盒；試劑盒包括鉀鹽和在足量所述鉀鹽存在下不能溶於水的陰離子表面活性劑。
較佳的，所述之陰離子表面活性劑包含，但不限於十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉、仲烷基硫酸鈉，脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯鈉、油醇硫酸鈉、N-油醯基多縮氨基酸鈉，烷基苯磺酸鈉、α-烯烴磺酸鈉、烷基磺酸鈉、α-磺基單羧酸酯、脂肪酸磺烷基酯、琥珀酸酯磺酸鹽、烷基萘磺酸鹽、石油磺酸鈉、木質素磺酸鈉或烷基甘油醚磺酸鈉。
更佳的，所述之陰離子表面活性劑是十二烷基硫酸鈉或去氧膽酸鈉。
較佳的，所述之陰離子表面活性劑在內毒素去除過程中使用的終濃度取決於溶液中細菌內毒素的濃度，高於內毒素的濃度即可，當內毒素濃度較高時所述陰離子表面活性劑濃度也應該提高。反之則可以使用較低濃度的所述陰離子表面活性劑。較佳的，所述之陰離子表面活性劑在內毒素去除過程中使用的終濃度不低於1wt%。更佳的，所述之陰離子表面活性劑在內毒素去除過程中使用的終濃度為5wt%至10wt%。
較佳的，所述之鉀鹽包含，但不限於氯化鉀、醋酸鉀、硫酸鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、磷酸鉀、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀和硝酸鉀中的一種或幾種的組合。
更佳的，所述之鉀鹽是醋酸鉀或氯化鉀。
較佳的，所述之鉀鹽在內毒素去除過程中使用的終濃度為不低於能使所述陰離子表面活性劑充分沉澱的濃度，也就是說，只要能使溶液中所述陰離子表面活性劑沉澱完全即可。較佳的，鉀鹽在內毒素去除過程中使用的終濃度不低於0.3莫耳體積濃度(M)；更佳的，所述之鉀鹽在內毒素去除過程中使用的終濃度為0.5M至1M。
較佳的，所述之所述陰離子表面活性劑和鉀鹽可以為固體，也可以為溶液，分別獨立包裝。
本發明的另一目的是提供一種能夠有效去除生物製品中細菌內毒素的方法，包括以下步驟：將含有內毒素的生物製品樣品與足量所述陰離子表面活性劑混合均勻靜置，再加入足量所述鉀鹽混勻使所述陰離子表面活性劑沉澱完全，靜置後離心或者過濾，收集清液得到去除內毒素的生物製品樣品溶液。
較佳的，所述之陰離子表面活性劑在其與含有內毒素的生物製品混合後的溶液中的濃度取決於溶液中細菌內毒素的濃度，高於內毒素的濃度即可，當內毒素濃度較高時所述陰離子表面活性劑濃度也應該提高。反之則可以使用較低濃度的所述陰離子表面活性劑。較佳的，所述之陰離子表面活性劑在其與含有內毒素的生物製品混合後的溶液中的濃度含量不低於1wt%。
較佳的，所述之鉀鹽加至溶液中的終濃度為不低於能使所述陰離子表面活性劑充分沉澱的濃度，也就是只要能使溶液中所述陰離子表面活性劑沉澱完全即可；較佳的，所述之鉀鹽加至溶液中的終濃度不低於0.3M；更佳的，所述之鉀鹽加至溶液中的終濃度0.5M至1M。
較佳的，所述之生物製品為蛋白或核酸。
本發明還有一個目的在於提供一種高效率、低成本去除內毒素的生物製品的製備方法，將含有內毒素的生物製品樣品與足量所述陰離子表面活性劑混合均勻至陰離子表面活性劑混合，靜置。再加入足量所述鉀鹽混勻至所述陰離子表面活性劑完全被鉀鹽沉澱完全，靜置後離心或過濾；收集清液即是去除內毒素的生物製品樣品溶液。再將所述生物製品樣品從去除內毒素的生物製品溶液中分離，即得去除內毒素後的生物製品樣品。
與現有技術相比，本發明的有益效果是：本試劑盒能夠簡便快捷地去除生物製品中的內毒素。本發明的去除內毒素的方法易於操作、成本低，內毒素去除效果顯著優於現有方法。而且不影響生物製品的生物活性，用 發明方法製備出的生物製品，其中的內毒素含量符合臨床用藥標準、活性物質損失少。
圖1所示為實驗例1中內毒素濃度-吸光度標準曲線圖。
本發明將由下列的實施例做為進一步說明，這些實施例並不限制本發明前面所揭示的內容。熟習本發明之技藝者，可以做些許之改良與修飾，但不脫離本發明之範疇。
本發明提供了一種去除生物製品中內毒素的試劑盒，及利用該試劑盒去除生物製品中內毒素的方法，還有利用這種去除內毒素的方法用來製備無內毒素生物製品的方法。本發明的核心原理是陰離子表面活性劑與內毒素能夠很好地結合，另一方面，陰離子表面活性劑在一定濃度鉀離子存在的條件下溶解度會變得足夠小；加入鉀離子能夠使與陰離子表面活性劑相結合的內毒素一同從水相以沉澱的形式析出，從而去除生物製品中的內毒素。再用常規方法將去除了內毒素的生物製品從水溶液中分離純化出來，即得到去除了內毒素的生物製品。
實施例中所用到的生物材料的來源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲取的生物材料都可以按照實施例中的提示替換使用。所用方法如無特別說明均為常規方法。如無特別說明，各實施例中相同名稱的材料或試劑內容相同。
實驗例1、生物製品樣品去除內毒素前的準備工作
一、內毒素標準品含量-吸光度標準曲線的繪製
1、實驗材料
顯色基質鱟試劑盒購自廈門市鱟試劑實驗廠有限公司；所用實驗器材均無內毒素。
2、內毒素溶液標準品的製備及標準曲線的繪製
均按照廈門市鱟試劑實驗廠有限公司提供的顯色基質鱟試劑盒使用說明書進行。
用光度測定法測得內毒素標準品的吸光度(見表1)，並以吸光度為Y軸，內毒素濃度為X軸，繪製出內毒素濃度-吸光度標準曲線(見圖1)，得到y=0.791X+0.084(R2=0.996)的標準曲線方程。
二、高濃度內毒素溶液的製備
由於購買的內毒素溶液標準品濃度很低，為便於實驗使用，製備了高濃度內毒素溶液。
將2mL大腸桿菌DH5α於離心管中過夜培養，然後在12000rpm下離心30秒，棄上清液，沉澱為菌體；向沉澱中加入200μL的PA溶液(PA溶液包含50mM的tris-HCl和10mM的EDTA，pH=7.5)充分混合均勻後，再加入200μL的PB溶液(PB溶液包含0.2M的NaOH和1wt%的十二烷基硫酸鈉(SDS))，混合均勻後室溫靜置2分鐘(mins)至3分鐘，再加入約70μL至80μL的PC溶液(PC溶液是5M的醋酸鈉溶液，pH=4.8)調節pH至7左右，15000rpm離心5mins，取上清液，即得高濃度內毒素溶液(該溶液中內毒素的濃度大概在50EU/mL至100萬EU/mL)。
三、待去除內毒素生物製品樣品的製備
所用試劑均為市售常規試劑。
1、待去除內毒素蛋白樣品的配製
取100mg的人血清白蛋白(HSA)溶於水中製成1mL的人血清白蛋白水溶液，再向其中加入2μL至10μL本實施例第二部分得到的高濃度內毒素溶液，並混合均勻，即得內毒素濃度大概在5000EU/mL至10000EU/mL的待去除內毒素蛋白樣品。
2、待去除內毒素DNA樣品的配製
取1mg PUC19質粒DNA溶於水中製成1mL的DNA溶液，再向其中加入2μL至10μL本實施例第二部分得到的高濃度內毒素溶液，並混合均勻，即得內毒素濃度大概在5000EU/mg至10000EU/mg的待去除內毒素DNA樣品。
四、待去除內毒素生物製品樣品中內毒素濃度的測定
為比較本發明在去除生物製品中內毒素的效果，需對待去除內毒素生物製品樣品中內毒素濃度進行測定。由於待去除內毒素生物製品樣品中內毒素(外加)的濃度太高，內毒素濃度與吸光度不成線性關係，因此需稀釋待去除內毒素生物製品樣品，使其中的內毒素濃度落在本實施例第一部分繪製出的標準曲線的內毒素濃度範圍內。
1、待去除內毒素蛋白樣品中內毒素濃度的測定
取25μL本實施例第三部分得到的待去除內毒素蛋白樣品，用無內毒素水稀釋20000倍後，按照廈門市鱟試劑實驗廠有限公司提供的顯色基質鱟試劑盒使用說明書中的測定方法，測定稀釋後的待去除內毒素蛋白樣品的吸 光度，並將得到的吸光度值代入按本實施例第一部分方法得到的標準曲線方程中，計算得到待去除內毒素蛋白樣品中的內毒素濃度。
2、待去除內毒素DNA樣品中內毒素濃度的測定
取25μL本實施例第三部分得到的待去除內毒素DNA樣品，用無內毒素水稀釋20000倍後，按照廈門市鱟試劑實驗廠有限公司提供的顯色基質鱟試劑盒使用說明書中的測定方法，測定稀釋後的待去除內毒素DNA樣品的吸光度，並將得到的吸光度值代入按本實施例第一部分方法得到的標準曲線方程中，計算得到待去除內毒素DNA樣品中的內毒素濃度。
實施例1、待去除內毒素生物製品樣品中內毒素的去除
1)、取實驗例1第三部分方法得到的待去除內毒素生物製品樣品，向其中加入陰離子表面活性劑至陰離子表面活性的終濃度不低於1wt%(陰離子表面活性劑濃度取決於內毒素濃度，內毒素濃度越高，陰離子表面活性劑濃度也需相應提高，一般在5wt%至10wt%左右)，混合均勻後靜置5mins；陰離子表面活性劑可選十二烷基硫酸鈉(SDS)、去氧膽酸鈉(SDC)、仲烷基硫酸鈉，脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯鈉、油醇硫酸鈉、N-油醯基多縮氨基酸鈉、烷基苯磺酸鈉、α-烯烴磺酸鈉、烷基磺酸鈉、α-磺基單羧酸酯、脂肪酸磺烷基酯、琥珀酸酯磺酸鹽、烷基萘磺酸鹽、石油磺酸鈉、木質素磺酸鈉或烷基甘油醚磺酸鈉等在足量鉀鹽存在下不能溶解於水的陰離子表面活性劑。
2)、向步驟1)得到的混合溶液中加入足量鉀鹽，至不再有沉澱生成，混合均勻後得到含沉澱的混合液，再靜置5mins；鉀鹽可選氯化鉀(KCl)、醋酸鉀(KAc)、碳酸鉀(K2CO3)、碳酸氫鉀(KHCO3)、磷酸鉀(K3PO4)、磷酸一氫鉀(K2HPO4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、硫酸鉀(K2SO4)等常用的鉀鹽固體或鉀鹽溶液；
3)、將步驟2)得到的含沉澱的混合液在14000rpm下離心5mins，棄沉澱，取清液；或者將含沉澱的混合液經孔徑為0.45μm的PP濾膜後，在4000rpm下離心過濾，取清液，所得清液即是去除內毒素的生物製品樣品溶液。
以下將以蛋白和DNA為例，詳述本發明提供的去除內毒素的方法。
實驗例2、內毒素檢測干擾試驗
為了排除生物製品吸光度對內毒素吸光度的影響，進行了干擾試驗，以篩選出對內毒素檢測干擾程度最小的生物製品濃度。干擾試驗的操作過程按照廈門市鱟試劑實驗廠有限公司提供的顯色基質鱟試劑盒使用說明書中的"供試品的干擾試驗"進行。
1.蛋白樣品溶液對內毒素檢測的干擾試驗
由於蛋白樣品溶液在去內毒素時加入了一定濃度的其他物質，因此需要在測定前將其稀釋至一定倍數以消除干擾。
將實施例1中步驟3)得到的去除內毒素的蛋白樣品溶液(pH7-8)，分別稀釋25倍、50倍和100倍，得到三個干擾試驗樣品；分別向三個干擾試驗樣品中加入0.5mL、1EU/mL的內毒素溶液；按上述試劑盒的使用說明對干擾試驗樣品進行測定，再用圖1標準曲線計算內毒素實測值，試驗結果見表2。
由表中試驗結果可以看出，當蛋白樣品溶液稀釋100倍以上時對測量無干擾。因此，後續進行的蛋白樣品溶液內毒素濃度測定前，均將樣品溶液用無內毒素水稀釋100倍以上再測定。
2. DNA樣品溶液對內毒素檢測的干擾試驗
由於將固體DNA從DNA樣品溶液中提取出來比蛋白的提取容易得多，因此在檢測DNA樣品溶液中的內毒素濃度時，先向實施例1中步驟3)得到的去除內毒素的DNA溶液中加入等體積的異丙醇，混勻後室溫靜置30mins，然後在14000rpm離心10mins，棄上清液，沉澱用適量70%乙醇洗滌；再14000rpm離心10mins，棄上清液，沉澱經重複洗滌和離心過程一次後，晾乾乙醇，即得去除內毒素的DNA。再將得到的去除內毒素的DNA溶解於無內毒素水，再進行內毒素濃度的檢測，這樣就消除了其它物質的干擾。為了消除DNA本身對內毒素檢測的影響，因此需要在測定前將DNA稀釋至一定濃度以消除干擾。
取無內毒素DNA，用無內毒素水配成DNA濃度為0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL、1.0mg/mL的五個DNA溶液，分別向這五個0.5mL的DNA溶液中加入0.5mL 1EU/mL的內毒素標準品，得到五個DNA干擾試驗樣品。按上述試劑盒的使用說明對干擾試驗樣品進行測定，再用圖1標準曲線計算內毒素實測值，試驗結果見表3。
由表3，當DNA濃度低於0.3mg/mL時對測量無干擾；因此，後續進行的內毒素濃度測定前，均將樣品用無內毒素水稀釋至DNA濃度低於0.3mg/mL。
實施例2、使用SDS和氯化鉀去除蛋白溶液中的內毒素
1)、取0.5mL按實驗例1第三部分製備的待去除內毒素白蛋白溶液樣品，(內毒素濃度約為8000EU/mL)向其中加入20wt%十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度分別為1wt%、5wt%、10wt%，混合均勻後靜置5mins。
2)、向步驟1)的混合溶液中加入0.4mL 3M氯化鉀溶液(pH=7.5)，混合均勻後得到含沉澱的混合液，並靜置5mins。
3)、將步驟2)得到的含沉澱的混合液在14000rpm下離心5mins，棄沉澱，取上清液，或者經0.45μm孔徑的PP濾膜，在4000rpm下離心過濾，所得清液即是去除內毒素的蛋白樣品溶液。
4)、取50μL步驟3)得到的去除內毒素蛋白樣品，用無內毒素水稀釋100倍後，按照廈門市鱟試劑實驗廠有限公司提供的顯色基質鱟試劑盒使用說明書中的測定方法，測定稀釋後的去除內毒素後蛋白樣品的吸光度，並將得到的吸光度值代入按實驗例1第一部分得到的標準曲線方程中，計算得到去除內毒素後蛋白樣品中的內毒素濃度。結果分別為3.5EU/mg、2.5EU/mg、1.1EU/mg。在280nm波長下檢測去除內毒素的蛋白樣品溶液中的蛋白濃度分別為91mg/mL(回收率91%)、86mg/mL(回收率86%)；79mg/mL(回收率79%)。
本實施例的結果可以看出，陰離子表面活性劑的濃度越高，去除內毒素的效果越好，當陰離子表面活性劑與待去除內毒素蛋白樣品混合後的終濃度達到1wt%時，就能將蛋白樣品中的內毒素濃度去除到臨床用藥標準[小於5EU/mg至10EU/mg(重組人生長激素中內毒素濃度須低於5EU/mg；重組人 胰島素中內毒素濃度須低於10EU/mg，中國藥典2005版二部，495頁)]，且回收率基本均能達到80%，本發明方法去除蛋白樣品中的內毒素效果好，蛋白損失少。
實施例3、使用SDS和醋酸鉀去除蛋白溶液中的內毒素
1)、取0.5mL按實驗例1第三部分製備的待去除內毒素白蛋白溶液樣品(內毒素濃度約為8000EU/mL)，向其中加入10wt%十二烷基硫酸鈉(SDS)0.5mL(終濃度為5wt%)，混合均勻後靜置5mins。
2)、向步驟1)的混合溶液中分別加入0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL 3.3M醋酸鉀溶液(pH=7.5)，使得醋酸鉀的終濃度分別為0.3M、0.55M、1.1M、1.65M，混合均勻後得到含沉澱的混合液，並靜置5mins。
3)、將步驟2)得到的含沉澱的混合液在14000rpm下離心5mins，棄沉澱，取上清液，或者經0.45μm孔徑的PP濾膜，在4000rpm下離心過濾，所得清液即是去除內毒素的蛋白樣品溶液。
4)、取50μL步驟3)得到的去除內毒素蛋白樣品，用無內毒素水稀釋100倍後，按照廈門市鱟試劑實驗廠有限公司提供的顯色基質鱟試劑盒使用說明書中的測定方法，測定稀釋後的去除內毒素後蛋白樣品的吸光度，並將得到的吸光度值代入按實驗例1第一部分得到的標準曲線方程中，計算得到去除內毒素後蛋白樣品中的內毒素濃度。結果分別1.5EU/mg、1.9EU/mg、1.2EU/mg、1.4EU/mg，去除內毒素後蛋白的回收率均可達到80%以上。
本實施例的結果表明，沉澱劑-鉀鹽的濃度對去除蛋白樣品中的內毒素無影響，說明在沉澱劑終濃度不低於0.3M的情況下，無論沉澱劑的濃度是多少，只要沉澱完全就能夠將蛋白樣品中的內毒素濃度降低到臨床用藥標 準。且去除內毒素後蛋白的回收率均可達到80%以上，說明沉澱劑在終濃度不低於0.3M的條件下，對蛋白樣品中的內毒素去除效果好，蛋白回收率高。
實施例4、使用SDC和醋酸鉀去除蛋白溶液中的內毒素
1)、取0.5mL按實驗例1第三部分製備的待去除內毒素白蛋白溶液樣品(內毒素濃度約為8000EU/mL)，向其中加入10wt%去氧膽酸鈉(SDC)至終濃度為5wt%，混合均勻後再靜置5mins。
2)、向步驟1)的混合溶液中加入0.4mL、3M醋酸鉀溶液(pH=7.5)，混合均勻後得到含沉澱的混合液，並靜置5mins。
3)、將步驟2)得到的含沉澱的混合液在14000rpm下離心5mins，棄沉澱，取上清液，或者經0.45μm孔徑的PP濾膜，在4000rpm下離心過濾，所得清液即是去除內毒素的蛋白樣品溶液。
4)、取50μL步驟3)得到的去除內毒素蛋白樣品，用無內毒素水稀釋100倍後，按照廈門市鱟試劑實驗廠有限公司提供的顯色基質鱟試劑盒使用說明書中的測定方法，測定稀釋後的去除內毒素後蛋白樣品的吸光度，並將得到的吸光度值代入按本實施例第一部分方法得到的標準曲線方程中，計算得到去除內毒素後蛋白樣品中的內毒素濃度。結果分別為1.5EU/mg。
結合實施例2和本實施例，說明SDS和SDC在去除蛋白樣品中內毒素上效果相當，並無顯著差別。
綜上所述，對蛋白樣品來說，陰離子表面活性劑的終濃度不低於1wt%，鉀鹽的終濃度不低於0.3M就能使蛋白樣品中的內毒素濃度達到臨床用藥標準[小於5EU/mg至10EU/mg(重組人生長激素中內毒素濃度須低於5EU/mg；重組人胰島素中內毒素濃度須低於10EU/mg，中國藥典2005版二部，495頁)]；陰離子表面活性劑或鉀鹽的種類則不影響去除效果。尤其是沉澱劑- 鉀鹽的終濃度對去除蛋白樣品中的內毒素無影響，只要沉澱完全就能夠將蛋白樣品中的內毒素濃度降低到臨床用藥標準。其它種類的陰離子表面活性劑和其它種類的鉀鹽的實驗結果與此結果類似，不一一列出。
實驗例3、去除內毒素後蛋白樣品的分離
將步驟3)得到的去除內毒素的蛋白樣品溶液經常規的沉澱法或透析法即可把其中的蛋白分離出來(如《生物工程學報》第20卷第6期，第943至947頁，疏水層析結合冷乙醇沉澱純化人血清白蛋白中提到的方法)，即得到去除內毒素的人血清白蛋白。
實施例5、使用SDS和醋酸鉀去除DNA溶液中的內毒素
1)、取0.5mL按實驗例1第三部分製備的待去除內毒素DNA溶液樣品(DNA濃度為1mg/mL，內毒素濃度約為8000EU/mL)，向其中加入20wt%十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度分別為1wt%、5wt%、10wt%，混合均勻後靜置5mins。
2)、向步驟1)的混合溶液中加入0.3mL、3M醋酸鉀溶液(pH=5)，混合均勻後得到含沉澱的混合液，並靜置5mins。
3)、將步驟2)得到的含沉澱的混合液在14000rpm下離心5mins，棄沉澱，取上清液，或者經0.45μm孔徑的PP濾膜，在4000rpm下離心過濾，所得清液即是去除內毒素的DNA溶液。
4)、向步驟3)得到的去除內毒素的DNA溶液中加入等體積的異丙醇，混勻後室溫靜置30mins，然後在14000rpm離心10mins，棄上清液，沉澱用適量70%乙醇洗滌；再14000rpm離心10mins，棄上清液，沉澱經重複洗滌和離心過程一次後，晾乾乙醇，即得去除內毒素的DNA。
5)、將步驟4)中得到的DNA溶解於無內毒素水，至DNA濃度低於0.3mg/mL。然後按照廈門市鱟試劑實驗廠有限公司提供的顯色基質鱟試劑盒使用說明書中的測定方法，測定去除內毒素的DNA的吸光度，並將得到的吸光度值代入按實驗例1第一部分得到的標準曲線方程中，計算得到去除內毒素的DNA中的內毒素濃度。結果分別為4.3EU/mg、2.1EU/mg、1.1EU/mg。在260nm波長下檢測DNA的濃度分別為0.87mg/mL(回收率87%)，0.82mg/mL(回收率82%)、0.77mg/mL(回收率77%)。
本實施例結果表明，與蛋白結果類似，當生物製品是DNA時，陰離子表面活性劑的濃度越高，去除內毒素的效果越好，當陰離子表面活性劑與待去除內毒素DNA樣品混合後的終濃度達到1wt%時，就能使DNA樣品中的內毒素濃度滿足臨床用藥標準(根據國家食品藥品監督管理總局2003年3月20日發佈的《預防用DNA疫苗臨床前研究技術指導原則》，其中第五部分9.熱源實驗：主要檢測製品中有無熱原物質，可用鱟試劑檢測細菌的內毒素，要求內毒素的含量不高於10EU/mg。)，並且DNA的回收率均在75%以上，說明用本方法去除DNA中的內毒素，去除效果好，DNA回收率高。
實施例6、使用SDS和醋酸鉀去除DNA溶液中的內毒素
1)、取0.5mL按實驗例1第三部分製備的待去除內毒素DNA溶液樣品(DNA濃度為1mg/mL，內毒素濃度約為8000EU/mL，向其中加入10wt%去氧膽酸鈉(SDC)0.50mL(終濃度為5wt%)，混合均勻後再靜置5mins。
2)、向步驟1)的混合溶液中分別加入0.1mL、0.2mL、0.5mL、1mL之3.3M醋酸鉀溶液(pH=5)，使得醋酸鉀的終濃度分別為0.3M、0.55M、1.11M、1.65M，混合均勻後得到含沉澱的混合液，並靜置5mins。
3)、將步驟2)得到的含沉澱的混合液在14000rpm下離心5mins，棄沉澱，取上清液，或者經0.45μm孔徑的PP濾膜，在4000rpm下離心過濾，所得清液即是去除內毒素的DNA溶液。
4)、向步驟3)得到的去除內毒素的DNA溶液中加入等體積的異丙醇，混勻後室溫靜置30mins，然後在14000rpm離心10mins，棄上清液，沉澱用適量70%乙醇洗滌；再14000rpm離心10mins，棄上清液，沉澱經重複洗滌和離心過程一次後，晾乾乙醇，即得去除內毒素的DNA。
5)、將步驟4)中得到的DNA溶解於無內毒素水，至DNA濃度低於0.3mg/mL。然後按照廈門市鱟試劑實驗廠有限公司提供的顯色基質鱟試劑盒使用說明書中的測定方法，測定去除內毒素後DNA樣品的吸光度，並將得到的吸光度值代入按實驗例1第一部分得到的標準曲線方程中，計算得到去除內毒素的DNA中的內毒素濃度。結果分別為1.2EU/mg、1.5EU/mg、1.8EU/mg、1.4EU/mg。
本實施例的結果表明，沉澱劑-鉀鹽的濃度對去除DNA樣品中的內毒素無影響，也就是在沉澱劑終濃度不低於0.3M的情況下，無論沉澱劑的濃度是多少，只要沉澱完全就能夠將DNA樣品中的內毒素濃度降低到臨床用藥標準。且去除內毒素後DNA的回收率均可達到75%以上，說明沉澱劑在終濃度不低於0.3M的條件下，對DNA樣品中的內毒素去除效果好，DNA回收率高。
實施例7、使用SDS和氯化鉀去除DNA溶液中的內毒素
1)、取0.5mL按實驗例1第三部分製備的待去除內毒素DNA溶液樣品(DNA濃度為1mg/mL，內毒素濃度約為8000EU/mL)，向其中加入10wt%十二烷基硫酸鈉(SDS)至終濃度為1wt%，混合均勻後靜置5mins。
2)、向步驟1)的混合溶液中加入0.2mL、3M氯化鉀溶液(用含10mM Tris-HCl的溶液配製，pH=7.5)，混合均勻後得到含沉澱的混合液，並靜置5mins。
3)、將步驟2)得到的含沉澱的混合液在14000rpm下離心5mins，棄沉澱，取上清液，或者經0.45μm孔徑的PP濾膜，在4000rpm下離心過濾，所得清液即是去除內毒素的DNA樣品溶液；
4)、向步驟3)得到的去除內毒素的DNA溶液中加入等體積的異丙醇，混勻後室溫靜置30mins，然後在14000rpm離心10mins，棄上清液，沉澱用適量70%乙醇洗滌；再14000rpm離心10mins，棄上清液，沉澱經重複洗滌和離心過程一次後，晾乾乙醇，即得去除內毒素的DNA。
5)、將步驟4)中得到的DNA溶解於無內毒素水，至DNA濃度低於0.3mg/mL。然後按照廈門市鱟試劑實驗廠有限公司提供的顯色基質鱟試劑盒使用說明書中的測定方法，測定去除內毒素後DNA樣品的吸光度，並將得到的吸光度值代入按實驗例1第一部分得到的標準曲線方程中，計算得到去除內毒素的DNA中的內毒素濃度結果為1.9EU/mg。
結合實施例6和本實施例，可以看出氯化鉀和醋酸鉀作為沉澱劑去除DNA樣品中內毒素的效果相當，並無顯著差異。
實施例8、使用SDC和醋酸鉀去除DNA溶液中的內毒素
1)、取0.5mL按實驗例1第三部分製備的待去除內毒素DNA溶液樣品(DNA濃度為1mg/mL，內毒素濃度約為8000EU/mL)，向其中加入10wt%去氧膽酸鈉(SDC)0.5mL(終濃度為5wt%)，混合均勻後靜置5mins。
2)、向步驟1)的混合溶液中分別加入0.4mL、3M醋酸鉀溶液(pH=5)，混合均勻後得到含沉澱的混合液，並靜置5mins。
3)、將步驟2)得到的含沉澱的混合液在14000rpm下離心5mins，棄沉澱，取上清液，或者經0.45μm孔徑的PP濾膜，在4000rpm下離心過濾，所得清液即是去除內毒素的DNA樣品溶液。
4)、向步驟3)得到的去除內毒素的DNA溶液中加入等體積的異丙醇，混勻後室溫靜置30mins，然後在14000rpm離心10mins，棄上清液，沉澱用適量70%乙醇洗滌；再14000rpm離心10mins，棄上清液，沉澱經重複洗滌和離心過程一次後，晾乾乙醇，即得去除內毒素的DNA。
5)、將步驟4)中得到的DNA溶解於無內毒素水，至DNA濃度低於0.3mg/mL。然後按照廈門市鱟試劑實驗廠有限公司提供的顯色基質鱟試劑盒使用說明書中的測定方法，測定去除內毒素後DNA樣品的吸光度，並將得到的吸光度值代入按實驗例1第一部分得到的標準曲線方程中，計算得到去除內毒素的DNA中的內毒素濃度結果為1.2EU/mg。
結合實施例5和本實施例，說明SDS和SDC在去除DNA樣品中內毒素上效果相當，並無顯著差別。
綜上所述，對DNA樣品來說，陰離子表面活性劑的終濃度不低於1wt%，鉀鹽的終濃度不低於0.3M，就能使DNA樣品中的內毒素濃度滿足臨床用藥標準(根據國家食品藥品監督管理總局2003年3月20日發佈的《預防用DNA疫苗臨床前研究技術指導原則》，其中第五部分9.熱源實驗：主要檢測製品中有無熱原物質，可用鱟試劑檢測細菌的內毒素，要求內毒素的含量不高於10EU/mg)；陰離子表面活性劑或鉀鹽的種類則不影響去除效果。尤其是沉澱劑-鉀鹽的終濃度在不低於0.3M的情況下，對去除DNA樣品中的內毒素並無影響，只要沉澱完全就能夠將DNA樣品中的內毒素濃度降低到臨床用藥標準。其它種類的陰離子表面活性劑和其它種類的鉀鹽的實驗結果與此結果類似，不一一列出。
由於RNA與DNA的性質類似，也可以採用上述方法去除其中的內毒素。
實驗例4、不同生物製品濃度的樣品對內毒素去除效果的影響
為了比較生物製品樣品中生物製品的濃度在去除其中內毒素時的影響程度，便於篩選出最優的實驗條件，按照實驗例1和實施例1的方法平行做了多組去除生物製品樣品中內毒素的實驗，僅是生物製品樣品中生物製品不同(如生物製品是人血清白蛋白，生物製品樣品就是蛋白樣品；生物製品是DNA，生物製品樣品就是DNA樣品)，實驗結果見表4和表5(內毒素去除前濃度和內毒素去除後濃度分別指去除內毒素前、後生物製品樣品中內毒素的濃度)。
其中，實施例1的步驟1)中陰離子表面活性劑選用SDS，終濃度為5wt%，鉀鹽選用醋酸鉀，終濃度為0.7M(陰離子表面活性劑和含鉀離子溶液的濃度均是指與待去除內毒素生物製品樣品混合後的終濃度)。
DNA樣品的回收率需要將去除內毒素的DNA樣品溶液按照常規方法將DNA從溶液中分離提取出來，稱重，再與待去除內毒素DNA樣品中加入的DNA重量比較得到。蛋白樣品的回收率是將去除內毒素的蛋白樣品溶液通過紫外分光光度計在280nm下檢測溶液中的蛋白濃度，再與待去除內毒素蛋白樣品中的蛋白濃度比較得到。
表5不同人血清白蛋白濃度的蛋白樣品對去除其中內毒素的影響
由表4和表5中的資料可以看出DNA或蛋白濃度對內毒素的去除無影響，也就是說無論待去除內毒素生物製品樣品中生物製品的濃度高或低，用本發明方法都能有效去除其中的內毒素，使其中的內毒素濃度達到臨床用藥標準，並且生物製品損失少。因此，用本發明方法在去除生物製品中內毒素的過程中，適用的生物製品濃度範圍廣。
參考文獻：
1、蔡慧麗，生物技術藥品分離純化過程中內毒素的去除Strait PharmaceuticalJournal 18 (2)，2006, P157-9。
2、Magalhaes PO, Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. , J Pharm Pharm Sci. 200710 (3):388-404.
3、Daneshian M，Guenther A, Wendel A, Hartung T，Von Aulock S. In vitro pyrogen test for toxic or immunomodulatory drugs. Journal of Immunological Methods 313:169-175.
4、Matt Cotten, et al, lipopolysaccharide is a frequent contaminant of plasmid DNA preparations and can be toxic to primary human cells in the presence of adenovirus. Gene Therapy 1(4),1994,239-45.

Claims (8)

  1. 一種去除生物製品中細菌內毒素的方法，其包括以下步驟：將含有內毒素的生物製品樣品與所述足量陰離子表面活性劑溶液混合均勻靜置，再加入所述足量鉀鹽混勻使所述陰離子表面活性劑沉澱完全，靜置後離心或者過濾，收集清液得到去除內毒素的生物製品樣品溶液；其中該陰離子表面活性劑包括十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉、仲烷基硫酸鈉、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯鈉、油醇硫酸鈉、N-油醯基多縮氨基酸鈉、烷基苯磺酸鈉、α-烯烴磺酸鈉、烷基磺酸鈉、α-磺基單羧酸酯、脂肪酸磺烷基酯、琥珀酸酯磺酸鹽、烷基藥磺酸鹽、石油磺酸鈉、木質素磺酸鈉、烷基甘油醚磺酸鈉中的一種或多種的組合。
  2. 如請求項1所述之方法，所述之陰離子表面活性劑是十二烷基硫酸鈉或去氧膽酸鈉。
  3. 如請求項1所述之方法，所述之陰離子表面活性劑在其與含有內毒素的生物製品混合後的溶液中的終濃度高於所述內毒素的濃度，其中陰離子表面活性劑的濃度為1wt%至飽和。
  4. 如請求項1所述之方法，所述之鉀鹽包括氯化鉀、醋酸鉀、硫酸鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、磷酸鉀、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀和硝酸鉀中的一種或多種的組合。
  5. 如請求項4所述之方法，所述之鉀鹽是醋酸鉀或氯化鉀。
  6. 如請求項5所述之方法，所述之鉀鹽加至其在溶液中的終濃度為不低於能使所述陰離子表面活性劑充分沉澱的濃度，其中鉀鹽之濃度為0.3M至飽和。
  7. 如請求項1至6中任一項所述之方法，所述生物製品為蛋白或核酸。
  8. 一種去除內毒素的生物製品的製備方法，其係將含有內毒素的生物製品樣品與所述足量陰離子表面活性劑混合均勻，靜置，再加入足量所述鉀鹽混勻至所述陰離子表面活性劑完全被鉀鹽沉澱完全，靜置後離心或過濾，收集清液即是去除內毒素的生物製品樣品溶液，再將所述生物製品樣品從去除內毒素的生物製品溶液中分離，即得去除內毒素後的生物製品樣品；其中該陰離子表面活性劑包括十二烷基硫酸鈉、去氧膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉、仲烷基硫酸鈉、脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯鈉、油醇硫酸鈉、N-油醯基多縮氨基酸鈉、烷基苯磺酸鈉、α-烯烴磺酸鈉、烷基磺酸鈉、α-磺基單羧酸酯、脂肪酸磺烷基酯、琥珀酸酯磺酸鹽。烷基萘磺酸鹽、石油磺酸鈉、木質素磺酸鈉、烷基甘油醚磺酸鈉中的一種或多種的組合。
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104370997B (zh) * 2014-09-24 2018-07-31 陈辉 去除生物制品中细菌内毒素的试剂盒、方法及其生物制品的制备方法
WO2019171173A1 (en) * 2018-03-08 2019-09-12 Catalent U.K. Swindon Zydis Limited Process to reduce endotoxin in gelatin
CN110845636B (zh) * 2019-12-02 2022-05-10 兰州生物制品研究所有限责任公司 一种去除细菌多糖中的内毒素的方法
CN111676215A (zh) * 2020-06-18 2020-09-18 沈阳德宇生物科技有限公司 一种去内毒素质粒提取试剂盒及质粒提取的方法
CN112014186B (zh) * 2020-09-07 2024-04-02 深圳华大医学检验实验室 一种空白血液基质的制备方法及其应用
CN115400809A (zh) * 2021-05-28 2022-11-29 深圳华大生命科学研究院 一种回收油包水液滴中内容物的方法及液滴生成装置
CN113607903B (zh) * 2021-07-30 2024-03-15 振德医疗用品股份有限公司 一种检测含有正电荷聚合物细菌内毒素的方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102031258A (zh) * 2004-04-19 2011-04-27 艾文蒂斯药品公司 纯化质粒dna的方法

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2374042A1 (fr) * 1976-06-04 1978-07-13 Merieux Inst Nouveau medicament immunostimulant et son procede de preparation
NO168989C (no) * 1985-08-20 1992-04-29 Neorx Corp Fremgangsmaate for aa oeke loeseligheten av f. eks. immunokonjugatpreparater
EP0743949B1 (de) * 1994-02-07 1999-12-15 QIAGEN GmbH Verfahren zur herstellung endotoxinfreier oder an endotoxin abgereicherter nucleinsäuren und/oder oligonucleotide für die gentherapie
GB9513074D0 (en) * 1995-06-27 1995-08-30 Cortecs Ltd Novel anigen
GB2327945A (en) * 1997-07-31 1999-02-10 Medeva Europ Ltd Removal of endotoxin from vaccines
US6194562B1 (en) * 1998-04-22 2001-02-27 Promega Corporation Endotoxin reduction in nucleic acid purification
US20060281658A1 (en) * 2005-06-08 2006-12-14 Kellar Kenneth E High water content liquid laundry detergent in water-soluble package
CN1307302C (zh) * 2005-08-15 2007-03-28 朱鸿飞 质粒dna大规模纯化工艺
JP5948673B2 (ja) * 2011-03-10 2016-07-06 ジーンフロンティア株式会社 リポ多糖混入量を低減した蛋白質合成用組成物、該組成物を用いた蛋白質製造方法
CN102901726B (zh) * 2012-09-14 2014-08-13 莫水晶 血液细菌内毒素检测试剂盒的制备和应用
CN104370997B (zh) * 2014-09-24 2018-07-31 陈辉 去除生物制品中细菌内毒素的试剂盒、方法及其生物制品的制备方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102031258A (zh) * 2004-04-19 2011-04-27 艾文蒂斯药品公司 纯化质粒dna的方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
1993-10-28,梁安鹏, "阴离子表面活性剂用于输液瓶洗涤的利弊分析, 中国药房", 1993年第4卷第5期,第43-44頁 *
2009-01-20,王贻杰,"提高内毒素去除效果的质粒DNA 层析纯化工艺的优化", 中国生物制品学杂志2009 年1 月第22 卷第1 期 *

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Publication number Publication date
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