TR201816369T4 - Endotoksin tayinine yönelik iyileştirilmiş bakteriyel endotoksin testi. - Google Patents
Endotoksin tayinine yönelik iyileştirilmiş bakteriyel endotoksin testi. Download PDFInfo
- Publication number
- TR201816369T4 TR201816369T4 TR2018/16369T TR201816369T TR201816369T4 TR 201816369 T4 TR201816369 T4 TR 201816369T4 TR 2018/16369 T TR2018/16369 T TR 2018/16369T TR 201816369 T TR201816369 T TR 201816369T TR 201816369 T4 TR201816369 T4 TR 201816369T4
- Authority
- TR
- Turkey
- Prior art keywords
- sample
- endotoxin
- rituximab
- dialysis
- antibody
- Prior art date
Links
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 title claims abstract description 228
- 238000003556 assay Methods 0.000 title description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 177
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims abstract description 111
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 85
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 85
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 31
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 31
- 239000012480 LAL reagent Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229960004641 rituximab Drugs 0.000 claims description 248
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 204
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 165
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 130
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 96
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 96
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 81
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 70
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 claims description 54
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 claims description 54
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 claims description 54
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 claims description 54
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 48
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 39
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 claims description 39
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 claims description 32
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 claims description 27
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 claims description 17
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 16
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 8
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 4
- 235000013312 flour Nutrition 0.000 claims 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 33
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 388
- 238000004325 capillary sieving electrophoresis Methods 0.000 description 90
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 64
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 49
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 48
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 43
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 40
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 37
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 35
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 32
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 30
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 27
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 25
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 24
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 19
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 16
- 108010002601 epoetin beta Proteins 0.000 description 15
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 15
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 14
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 14
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 14
- 229940068977 polysorbate 20 Drugs 0.000 description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 235000011389 fruit/vegetable juice Nutrition 0.000 description 12
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 12
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 11
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 11
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 9
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 8
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 7
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 239000013026 undiluted sample Substances 0.000 description 6
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 5
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 5
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 5
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 5
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 5
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 5
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 5
- 229950008882 polysorbate Drugs 0.000 description 5
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 5
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 4
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000277284 Salvelinus fontinalis Species 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N dodecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960004579 epoetin beta Drugs 0.000 description 4
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 4
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 4
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940091250 magnesium supplement Drugs 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 4
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000002223 garnet Substances 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 3
- 238000011212 kinetic chromogenic method Methods 0.000 description 3
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 3
- 238000012552 review Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 3-(3,4-DICHLOROPHENYL)-1,1-DIMETHYLUREA Chemical compound CN(C)C(=O)NC1=CC=C(Cl)C(Cl)=C1 XMTQQYYKAHVGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 2
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 239000005639 Lauric acid Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 2
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000005293 duran Substances 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 2
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 2
- -1 lauric acid Chain fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000010297 mechanical methods and process Methods 0.000 description 2
- 230000005226 mechanical processes and functions Effects 0.000 description 2
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 2
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004438 BET method Methods 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 1
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000893640 Carcharhinus longimanus Species 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 241000520130 Enterococcus durans Species 0.000 description 1
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000889990 Homo sapiens Apolipoprotein(a) Proteins 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 238000011050 LAL assay Methods 0.000 description 1
- 241000239220 Limulus polyphemus Species 0.000 description 1
- 208000028018 Lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 229910020095 MgCl2 a Inorganic materials 0.000 description 1
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241000239224 Tachypleus tridentatus Species 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 230000032823 cell division Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 208000019065 cervical carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000536 complexating effect Effects 0.000 description 1
- 238000007596 consolidation process Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001236 detergent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000003113 dilution method Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012525 endotoxin sample Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JEGUKCSWCFPDGT-UHFFFAOYSA-N h2o hydrate Chemical compound O.O JEGUKCSWCFPDGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 150000004687 hexahydrates Chemical class 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 102000045903 human LPA Human genes 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 150000004677 hydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000003747 lymphoid leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 229960002337 magnesium chloride Drugs 0.000 description 1
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 1
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 159000000003 magnesium salts Chemical class 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229940043515 other immunoglobulins in atc Drugs 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000012113 quantitative test Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229960000999 sodium citrate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 125000005480 straight-chain fatty acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/579—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving limulus lysate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/38—Diluting, dispersing or mixing samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56911—Bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
- G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- G01N2400/50—Lipopolysaccharides; LPS
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
Burada, (bakteri hücreleriyle üretilmiş) bir antikorun bir numunesinde düşük konsantrasyonlarda bakteriyel endotoksin tayinine yönelik olarak, şu adımları belirtilen sırayla içeren bir yöntem bildirilir: i) magnezyum iyonlarının numuneye ilave edilmesi, ii) numunenin seyreltilmesi, iii) 5.7-8.0'lik bir pH seviyesine sahip numunenin bir endotoksinsiz sulu solüsyona karşı diyaliz edilmesi ve iv) numunedeki bakteriyel endotoksinin bir bakteriyel endotoksin testiyle, özellikle limulus amebosit lizat analiziyle belirlenmesi.
Description
Tarifnamenin bir yönüne göre numune
(yani bir antikor içeren numune), bir çözünmüs kati numunedir.
Tarifnamenin baska bir yönüne göre numune (yani bir antikor
içeren numune), bir sivi numunedir. Burada saglanan numune
hazirlama yönteminde ve endotoksin belirleme yönteminde,
antikorun (yani numuneye dahil edilen antikorun) bir terapötik
antikor olmasi öngörülür. Antikor (yani numuneye dahil edilen
antikor) tercihen bir monoklonal antikordur. Ancak, burada
saglanan yöntemlerde antikor (numuneye dahil edilen antikor),
bir poliklonal antikor da olabilir. Burada, arzu edilen
biyolojik aktiviteyi sergiledikleri sürece multispesifik
antikorlar (örnegin bispesifik antikorlar) veya antikor
fragmanlari da "antikor" teriminin kapsamina. girer. Antikor
insan kökenli, hümanize veya kamelize olabilir.
Burada saglanan yöntemler, avantajli bir sekilde, bir
farmasötik. formülasyonun LER egilimli numunelerini enzimatik
LAL kaskatinda faktör C'ye karsi reaktif hale getirir. LER
etkisi, iyonik olmayan deterjanlar gibi amfifilik bilesiklerle
birlikte formüle edilen, özellikle tampon olarak sitrat veya
fosfat ile birlestirilen biyolojik ürünlerde bildirilmistir.
Ekli Örnekler, burada saglanan yöntemlerin bu tip terapötik
formülasyonlarda LER etkisini güvenilir bir biçimde astigini
gösterir. Dolayisiyla, burada saglanan numune hazirlama
yöntemi ve endotoksin belirleme yöntemi baglaminda, söz konusu
terapötik antikorun (yani terapötik numuneye dahil edilen
antikorun), en az bir deterjan (tercihen bir polisorbat) ile
birlikte formüle edilmesi öngörülür.
Ancak söz konusu terapötik antikorun, LAL kaskatindaki C
reaktif proteinde lipit A oyuguna yönelik bir yapisal motif
içermeyen bir polisorbat ile birlikte formüle edilmesi
öngörülür. Daha özel bir ifadeyle, laurik asit gibi düz
Zincirli yag asitleri, LAL kaskatindaki lipit A Inolekülünde
bulunan yag asitlerini taklit edebilir, çünkü bu molekül
ayrica 12 karbon atomuna sahip olan ve herhangi bir ikili
baglar içermeyen (yani C:D = 1220) yag asitleri içerir. Bu tip
düz Zincirli yag asitleri LAL kaskatina olumsuz yönde müdahale
edebilir. Dolayisiyla, burada saglanan yöntemlerde, söz konusu
terapötik antikorun, laurik asit gibi düz Zincirli yag
asitleri içeren bir deterjan ile birlikte formüle edilmemesi
öngörülür. Polisorbat 20, laurik asit içerir. Dolayisiyla,
burada saglanan yöntemlerde numunenin (özellikle bir terapötik
antikor numunesinin) polisorbat 20 ile birlikte formüle
edilmemesi öngörülür. Fosfat tamponu ve özellikle de sodyum
fosfat tamponu da LAL kaskatina müdahale edebilir. Dolayisiyla
bu tamponlar, burada saglanan numune hazirlama yöntemlerinde
daha az faydalidir. Buna göre tarifname, burada saglanan
numune hazirlama yöntemi veya endotoksin belirleme yöntemi ile
ilgili olup, burada numuneye dahil edilen (terapötik) antikor
bir fosfat tamponuyla seyreltilmez. Mevcut tarifnamenin bir
yönü itibariyla numune, 0.1 mM'den fazla fosfat tamponu
içermez ve kritik misel konsantrasyonunun (CMC) 100'ünden
yüksek bir polisorbat 20 konsantrasyonuna sahip olmaz. Mevcut
tarifnamenin tercih edilen bir yönüne göre numune, fosfat
tamponu ve polisorbat 20 içermez ya da standart saptama
yöntemleri kullanildiginda tayin sinirinin altinda bir
miktarda fosfat tamponu ve/veya polisorbat 20 içerir.
Ekli Örneklerde burada tarif edilen yöntemlerle gösterildigi
üzere, formüle edilmis rituksimab numunelerinde ve ayrica
rituksimab plasebo numunelerinde LER etkisi asilabilir.
Rituksimab plasebo numuneleri rituksimab numunelerinden tek
farki antikor içermemesidir. Bu farkin disinda, rituksimab
plasebo numuneleri, rituksimab formülasyonunun deterjan ve
tampon gibi tüm diger bilesenlerini içerir. Bu, burada
saglanan yöntemlerin, belirli bir monoklonal antikor içeren
bir formülasyona bagimli olmadigini ve örnegin LER etkisi
sergileyen her formülasyonda bu etkinin üstesinden gelmek için
kullanilabilecegini gösterir. Bu tip formülasyonlar,
polisorbat 80 ve bir kelatlayici tampon (örnegin sodyum
sitrat) içeren formülasyonlari kapsar. Bu formülasyon
antikorlar, özellikle monoklonal antikorlar için tipiktir.
Dolayisiyla, yukarida tarif edilen yöntemin, her monoklonal
antikor formulasyonunda LER etkisinin asilmasinda faydali
olmasi beklenir. Rituksimab, bir polisorbat 80 ve sodyum
sitrat tamponu karisimi (yani 25 mM sodyum sitrat tamponu (pH
6.5): 700 mg/l polisorbat 80 ve ile birlikte
formüle edilir. Mevcut bulus baglaminda bir antikor içeren
numunenin bu formulasyona sahip olmasi öngörülür.
Ekli Örnekler, polisorbat 80 ve sitrat tamponu ile birlikte
formüle edilen terapötik antikorlarin örnek numunelerinde LER
etkisinin burada saglanan yöntemlerle asilabilecegini
gösterir. Dolayisiyla, burada saglanan numune hazirlama
yönteminde veya endotoksin belirleme yönteminde numunenin
(yani bir antikor içeren numunenin) polisorbat 80 ile birlikte
formüle edilmesi tercih, edilir. Dolayisiyla, burada. saglanan
yöntemlerde, numunenin (yani bir antikor içeren numunenin)
polisorbat 80 içermesi öngörülür. Numune tercihen 500-1000
mg/l oraninda polisorbat 80 ve daha çok tercih edildigi
haliyle yaklasik 700 mg/l oraninda polisorbat 80 içerir.
Ayrica, burada saglanan yöntemlerde numunenin (yani bir
antikor içeren numunenin) bir kelatlayici tampon (örnegin
sitrat tamponu) ile birlikte formüle edilmesi öngörülür. Söz
konusu sitrat tamponu, 5-50 mM'lik bir sitrat tamponu (pH 6.0-
7.0) ve tercihen 25 mM'lik bir sitrat tamponu (pH 6.5)
olabilir. sitrat tamponu tercihen bir sodyum sitrat
tamponudur. Örnegin burada saglanan yöntemlerde numune (yani
bir antikor içeren numune) 5-50 mM Na-sitrat ve tercihen 25 mM
Na-sitrat içerebilir. Numune en çok tercih edildigi haliyle
polisorbat 80 ve sodyum sitrat tamponu içerir. Numune örnegin
yaklasik 700 mg/l polisorbat 80 ve 5-50 mM, tercihen yaklasik
mM sodyum sitrat tamponu içerebilir. En çok tercih edildigi
haliyle, burada saglanan. yöntemlerde numune, yaklasik. 25 mM
Na-sitrat tamponu ve yaklasik 700 mg/l polisorbat 80 ile
birlikte formüle edilen ve yaklasik 6.5'lik bir pH seviyesine
sahip olan bir antikor numunesidir.
Burada saglanan numune hazirlama yönteminde veya endotoksin
belirleme yönteminde söz konusu antikorun (yani numuneye dahil
edilen antikorun) bir anti-CD20 antikor olmasi tercih edilir.
Antikor daha çok tercih edildigi haliyle anti-CD20 rituksimab
antikorudur. Rituksimab agir ve hafif zincirlerinin amino asit
sekanslari burada sirasiyla SEQ ID NOlari: l ve 2 ile
gösterilir. Teknikte uzman kisi bir kodlayici nükleik asit
sekansinin belirli bir amino asit sekansindan nasil elde
edilecegini bilir. Dolayisiyla, SEQ ID NOlari: l ve 2
bilindiginde, rituksimab için bir kodlayici nükleik asit
sekansi kolayca elde edilebilir. Rituksimab piyasadan örnegin
Rituxan® ve MabTheraß veya Zytux® olarak temin edilebilir.
Burada saglanan numune hazirlama yönteminin veya endotoksin
belirleme yönteminin (a) adiminda, örnegin MgCl2 formunda
bulunan. magnezyuni iyonlari (Mgzü numuneye (yani bir antikor
içeren numuneye) ilave edilir. Burada "magnezyum klorür" veya
bilesikleri ve ayrica bunlarin MgClz (H20)X (yani MgClz 0 x H2O)
ile gösterilen çesitli hidratlarini ifade eder. Örnegin burada
saglanan yöntemlerin (a) adiminda numuneye MgCla heksahidrat
(yani MgClz o 6 HzO) ilave edilebilir. Açiklayici ekli
Örneklerde gösterildigi üzere, (a) adiminda magnezyum
iyonlarinin lO-lOO mM'lik (MgÜW bir nihai konsantrasyonda
ilave edilmesi LER etkisini belirgin sekilde azaltir. Ekli
Örneklerde ayrica en iyi endotoksin geri kazanim oranlarinin
numunedeki tampon konsantrasyonunun iki katina karsilik gelen
bir Mgß' konsantrasyonu ile saglandigi gösterilir. Örnegin,
numune olarak rituksimab kullanildiginda, en iyi endotoksin
geri kazanim oranlari, (a) adiminda magnezyum tuzu (MgCln
ilavesinin, sodyum sitrat konsantrasyonunun iki katina
karsilik gelen bir nihai Mg2+ konsantrasyonuyla sonuçlandigi
durumlarda elde edilmistir (yani 50 mM Mgßö. Dolayisiyla,
burada saglanan yöntemlerin (a) adiminda, bir tuz (örnegin
MgClg) formundaki magnezyum iyonlarinin, tampon (örnegin sodyum
sitrat tamponu) konsantrasyonunun iki katina karsilik gelen
bir nihai Mg2+ konsantrasyonu saglayacak sekilde ilave edilmesi
öngörülür. Örnegin burada saglanan yöntemlerde magnezyum
iyonlari numuneye tercihen nihai Mgß' konsantrasyonunun [(a)
adiminda] lO-lOO mM, daha çok tercih edildigi haliyle 25-75
mM, daha da çok tercih edildigi haliyle 40-75 mM ve en çok
tercih edildigi haliyle yaklasik 50 mM (yani
olmasini saglayacak sekilde ilave edilir. Ya da, numune
halihazirda magnezyum iyonlari içeriyorsa, ilave edilen Mg2+
miktari, elde edilen nihai Mg2+ konsantrasyonunun [(a)
adiminda] tercihen lO-lOO mM, daha çok tercih edildigi haliyle
-75 mM, daha da çok tercih edildigi haliyle 40-75 mM ve en
çok tercih. edildigi haliyle yaklasik 50 mM (yani
olmasini saglayacak sekilde ayarlanir. (a) adimindan sonra,
yani (b) adiminda numune seyreltilir. Ancak (a) adiminda,
ifadesi veya bunun dilbilgisel varyasyonlari ve "magnezyum
iyonlarinin bir nihai m konsantrasyonuna ilave edilmesi"
ifadesi veya bunun dilbilgisel varyasyonlari (a) adiminda
nihai Mg2+ konsantrasyonunu ifade eder. Örnegin, (a) adiminda
MgCl2'nin konsantrasyonda ilave
edilmesi, (a) adiminda MgClz ilave edildikten sonra MgClz
konsantrasyonunun 45-55 mM oldugu anlamina gelir. Dolayisiyla,
örnegin (b) adiminda numune 1:10 (numuneztampon/su) oraninda
seyreltildiginde, magnezyum iyonlarinin ve benzer sekilde
MgClz'nin konsantrasyonu 4.5-5.5 mM olur.
Ekli Örneklerde, magnezyum iyonlari ilave edildikten sonra
gerçeklestirilen bir inkübasyon adiminin LAL analizinde geri
kazanim oranlarini daha da iyilestirdigi gösterilir.
Dolayisiyla, burada saglanan yöntemlerde, magnezyum, iyonlari
ilave edildikten sonra numune tercihen 30 dakika ila 6 saat,
daha çok tercih edildigi haliyle 1-4 saat. ve en çok tercih
edildigi haliyle yaklasik 1 saat inkübe edilir. Burada
saglanan yöntemlerin (a) adiminin öncelikli bir yönüne göre,
magnezyum iyonlari ilave edildikten sonra numune oda
sicakliginda yaklasik 1 saat inkübe edilir. Numune söz konusu
inkübasyon adimindan önce ve sonra çalkalanabilir [örnegin
Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037
rpm)]. Örnegin numune inkübasyon adimindan önce ve sonra 30
saniye ila 10 dakika, tercihen 1 dakika çalkalanabilir.
Burada saglanan numune hazirlama yönteminin veya endotoksin
belirleme yönteminin (b) adiminda numune (yani bir antikor
içeren numune) seyreltilir. Numune endotoksinsiz su ile
seyreltilebilir. Ekli Örnekler, diyaliz esnasinda numunenin
.7-8.0'lik bir pH seviyesine sahip oldugu durumlarda iyi geri
kazanim oranlarinin elde edilebilecegini gösterir. Diyaliz
esnasinda numunenin 6.0-8.0'lik bir pH seviyesine sahip oldugu
durumlarda daha iyi geri kazanim oranlari elde edilmistir. En
iyi geri kazanim oranlari, diyaliz esnasinda numunenin 6.5-
7.5'1ik bir pH seviyesine sahip oldugu durumlarda elde
edilmistir. Dolayisiyla, bir yönü itibariyla tarifname, burada
saglanan yöntemler ile ilgili olup, burada (b) adiminda numune
endotoksinsiz su ile seyreltilir ve burada seyreltme
isleminden sonra ve diyaliz isleminden önce numunenin pH
seviyesi 5.7-8.0 olarak, daha çok tercih edildigi haliyle 6.0-
8.0 olarak ve en çok tercih edildigi haliyle 6.5-7.5 olarak
ayarlanir. Dolayisiyla, tarifnamenin bir yönü itibariyla,
burada saglanan yöntemlerin (b) adiminda numunenin pH seviyesi
.7-8.0 olarak ve daha çok tercih edildigi haliyle 6.0-8.0
olarak ayarlanir. Burada saglanan yöntemlerin (b) adiminda
numunenin pH seviyesi en çok tercih edildigi haliyle 6.5-7.5
olarak ayarlanir. Numunenin pH seviyesi örnegin 5.7, 5.8, 5.9,
olarak ayarlanabilir. Ancak, burada numunenin pH seviyesinin
(b) adiminda numunenin 10-50 mM'lik tampon, Örnegin Tris/HCl
tamponu (pH 6.0-9.0), daha çok tercih edildigi haliyle ile
seyreltilmesi yoluyla ayarlanmasi tercih edilir. Dolayisiyla,
burada saglanan yöntemlerin tercih edilen bir yönü itibariyla,
(c) adiminda numunenin pH seviyesinin, numunenin 10-50 mM'lik
Tris/HCl tamponu (pH 6.0-9.0) ile seyreltilmesi yoluyla
ayarlanmasi öngörülür. Numunenin pH seviyesi daha çok tercih
edildigi haliyle numunenin 10-50 mM'lik bir Tris/HCl tamponu
(pH 6.0-8.0) ile seyreltilmesi yoluyla ayarlanir. Numunenin pH
seviyesi en çok tercih edildigi haliyle numunenin ((b)
adiminda) 50 mM'lik Tris/HCl (pH ~7.0) ile seyreltilmesi
yoluyla ayarlanir. Dolayisiyla, burada saglanan yöntemlerde,
(c) adiminda diyaliz esnasinda numune 5.7-8.0'lik, tercihen
6.0-8.0'lik ve daha çok tercih edildigi haliyle 6.5-7.5'lik
bir pH seviyesine sahiptir.
Yukarida belirtildigi üzere numune bir deterjan, örnegin
polisorbat 80 içerebilir. Açiklayici ekli Örneklerde,
digerlerinin yani sira, bir deterjan (örnegin polisorbat 80)
içeren bir numunenin seyreltilmesinin endotoksin moleküllerini
LAL analizinde erisilebilir kildigini gösterir. Teori ile
sinirli kalmamak kaydiyla, bir deterjan içeren bir numunenin
CMC civarindaki konsantrasyonlara seyreltilmesinin, numunenin
miseller` halinde bölümlesmesini azalttigi ve dolayisiyla LER
etkisini azalttigi düsünülmektedir.
Ekli Örneklerde l:5 ila l:20'lik bir seyreltme oraninin bir
LAL analizinde geri kazanim oranini anlamli ölçüde etkiledigi
gösterilir. Dolayisiyla tarifname, burada saglanan numune
hazirlama yöntemi ve endotoksin belirleme yöntemi ile ilgili
olup, burada (b) adiminda numune l:5 ila l:20'lik
(numuneztampon/su) ve tercihen l:lO'luk (numune:tampon/su) bir
oranda seyreltilir. Burada saglanan yöntemlerde antikor
tercihen yaklasik 25 mM sodyum sitrat tamponu ve yaklasik 700
mg/l polisorbat 80 ile birlikte formüle edilir. Dolayisiyla,
burada saglanan yöntemlerde numune (b) adiminda tampon
konsantrasyonunun 5-l.25 mM'ye ve tercihen 2.5 mM'ye düsmesini
saglayacak sekilde seyreltilebilir. Bunlarin yani sira numune
(b) adiminda deterjan konsantrasyonunun 140-35 mg/l'ye ve
tercihen 70 mg/l'ye düsmesini saglayacak sekilde
seyreltilebilir. Ekli Örneklerde numune olarak yaklasik 10
mg/ml'lik bir antikor konsantrasyonuna sahip antikor
formülasyonlari kullanilmistir. Bu numuneler, burada saglanan
yöntemlerin (b) adiminda, 2-0.5 mg/ml'lik bir antikor
konsantrasyonu saglayacak sekilde seyreltilmistir.
Dolayisiyla, burada saglanan yöntemlerde numune (b) adiminda
antikor konsantrasyonunun 2-0.5 mg/ml'ye ve tercihen l
mg/ml'ye düsmesini saglayacak sekilde seyreltilebilir. Burada
saglanan yöntemlerde ayrica bir seyreltilmemis kontrol
hazirlanabilir. Söz konusu seyreltilmemis kontrol, test
edilecek numuneyle ayni sekilde muamele edilir, ancak burada
seyreltilmemis kontrol ((b) adiminda) seyreltilmez. Burada
Burada saglanan numune hazirlama yönteminin ve endotoksin
belirleme yönteminin (c) adiminda numune bir endotoksinsiz
sulu solüsyona karsi diyaliz edilir. Endotoksinsiz sulu
solüsyon, endotoksinsiz su olabilir. Ancak söz konusu
endotoksinsiz sulu solüsyon, örnegin MgClz tuzu formunda ilave
edilen magnezyum iyonlari içeren bir endotoksinsiz sulu
solüsyon da olabilir. Dolayisiyla, bir yönü itibariyla
tarifname, burada saglanan yöntemler ile ilgili olup, burada
(c) adiminda kullanilan endotoksinsiz sulu solüsyon magnezyum
iyonlari, örnegin 2.5-l0 mM MgClz içerir.
Diyaliz baslamadan önce numuneler [örnegin oda sicakliginda
bir Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037
rpm)] mesela 30 saniye ila 10 dakika ve tercihen 1 dakika
çalkalanabilir. Tercihen (c) adiminda diyaliz 1-48 saat, daha
çok tercih edildigi haliyle 4-24 saat, en çok tercih edildigi
haliyle yaklasik 24 saat sürer. Dolayisiyla, (c) adiminda
diyalizin yaklasik 24 saat sürmesi tercih edilir. Diyaliz l5-
°C'de ve tercihen oda sicakliginda (yani 21 ± 2°C)
gerçeklestirilebilir. Diyalizden sonra numune [örnegin oda
sicakliginda bir Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda yüksek
hizda (2,037 rpm) mesela 20 dakika ila 1 saat ve tercihen (en
Diyaliz, bir Döndürmeli Diyaliz Araci (örnegin Harvard
SpinDIALYZER, katalog no.74-03l4) veya bir Hizli Döndürmeli
Diyaliz Araci (örnegin Harvard Fast Spin Dialyzer, katalog
no.74-0412) ile gerçeklestirilebilir. Özellikle bir Hizli
Döndürmeli Diyaliz Araci kullanildiginda, karistiricinin dönme
frekansinin yüksek olmasi tercih edilir, yani karistiricinin
Karistirici tercihen 20-60 mm'lik bir uzunluga ve 5-25 mm'lik
bir çapa (yani kesit boyutu) sahiptir. Karistirici daha çok
tercihr edildigi haliyle yaklasik 40 mm'likr bir uzunluga ve
yaklasik 14 mm'lik bir çapa sahiptir. Karistirici, en çok
tercih edildigi haliyle, yaklasik 40 mm'lik bir uzunluga ve
yaklasik 14 mm'lik bir çapa sahip olan isiyla sterilize
edilmis (örnegin 250°C'de 4 saat) bir manyetik karistiricidir.
Bu tip karistiricilar OMNILAB firmasindan temin edilebilir.
Aslinda diyaliz genellikle diyaliz membranindan difüzyonu
kolaylastirmasi nedeniyle yüksek bir karistirici frekansinda
gerçeklestirilir. Dolayisiyla, yüksek bir karistirici frekansi
ile diyaliz islemi standart diyaliz prosedürüdür. Diyaliz için
kullanilan kap tercihen 500-5000 ml, daha çok tercih edildigi
2500 ml'lik bir hacme sahiptir. Bu kap 120 mm'lik bir çapa ve
240 mm'lik bir yükseklige sahip olabilir. Diyaliz için
kullanilan kap örnegin 2000 ml'lik uzun bir DURAN® salteri
(örnegin OMNILAB, Almanya, P/N: 5013163) olabilir. Bir Hizli
Döndürmeli Diyaliz Aracinin kullanimi tercih edilir, çünkü bu
cihazin iki kat diyaliz membrani alanina sahip olmasindan
dolayi daha etkili ve hizli bir diyaliz için uygun oldugu
düsünülür.
(c) adiminda diyaliz için 100 Da ila 16 kDa, tercihen 500 Da
ila 10 kDa ve en çok tercihen IOkDa'lik bir molekül agirligi
esik degerine sahip bir membranin kullanilmasi öngörülür. (c)
adiminda diyaliz için bir selüloz ester veya bir selüloz
asetat membran kullanilabilir. (c) adiminda diyaliz için
tercihen bir selüloz asetat membran kullanilir. Diyaliz
esnasinda en çok tercih edildigi haliyle 10 kDa'lik bir
molekül agirligi esik degerine sahip bir selüloz asetat
membran kullanilir.
Dolayisiyla, burada saglanan yöntemlerin (c) adiminda, diyaliz
tercihen yaklasik 24 saat boyunca 10 kDa'lik bir molekül
agirligi esik degerine sahip bir selüloz asetat nembran ile
gerçeklestirilir. Diyalizden önce, diyaliz membrani tercihen
endotoksinsiz su içinde yikanabilir. Daha özel bir ifadeyle,
diyaliz membrani endotoksinsiz su içinde (örnegin Shaker SG
. IDL GmbH, Almanya veya esdeger bir çalkalayiciyla 50 ila
300 rpm'de ve tercihen 100 rpm'de) çalkalanabilir. Diyaliz10
membrani örnegin endotoksinsiz su içinde 10 dakika ila 3 saat,
tercihen 1 saat boyunca çalkalanarak yikanabilir. Bu yikama
adimindan sonra diyaliz membrani tercihen taze endotoksinsiz
su içerisine aktarilir` ve 10 dakika ila 3 saat, tercihen 1
saat boyunca çalkalanarak tekrar yikanir.
Diyaliz l ml'lik haznelerde, örnegin 500 Da ila 10 kDa
araliginda bir molekül agirligi esik degerine (örnegin 10
kDa'lik bir molekül agirligi esik degerine) sahip bir membran
(örnegin selüloz asetat membran) ile donatili l ml'lik
döndürmeli diyaliz araci (Harvard) haznelerinde
gerçeklestirilebilir. Diyaliz esnasinda su tercihen
degistirilir, daha çok tercih edildigi haliyle su iki kere
degistirilir. Su örnegin diyaliz basladiktan 2 ve 20 saat
sonra ya da diyaliz basladiktan 18 ve 22 saat sonra
degistirilebilir. Su tercihen diyaliz basladiktan 2 ve 4 saat
sonra degistirilir.
Burada saglanan yöntemler baglaminda (c) adiminda diyalizden
sonra numune çalkalanmasi [örnegin oda sicakliginda bir
Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037 rpm)]
tercih edilir. Numune (yani bir antikor içeren numune)
diyalizden sonra tercihen 10 dakika ila 1 saat ve daha çok
tercih edildigi haliyle 20 dakika çalkalanir. Çalkalamaya
alternatif veya ek olarak, numune diyalizden sonra ultrason
ile muamele edilebilir. Dolayisiyla, bir yönü itibariyla
tarifname, burada saglanan yöntemler ile ilgili olup, burada
(0) adiminda numune diyalizden sonra ultrason ile muamele
Burada saglanan numune hazirlama yöntemi bir LAL analiziyle
birlestirildiginde, bu birlesik yöntem, avantajli bir sekilde,
bir numuneye katilan tanimli bir miktar CSE'nin nicel ve
tekrarli tayinine yönelik FDA gereksinimlerini karsilar.
Burada saglanan yöntemlerin LAL analizi tercihen asagida tarif
edilen bir LAL analizidir.
Ekli Örneklerde gösterildigi üzere, Mgß' (yani magnezyum
iyonlari) ilavesinin bir diger avantaji, endotoksini diyaliz
haznesinin iç bölmesinde tutmasidir. Dolayisiyla, (c) adiminda
gerçeklestirilen diyaliz sadece tamponun (örnegin sodyum
sitrat tamponunun) uzaklasmasini ve endotoksinin kalmasini
saglar. Seyreltme adiminda deterjan (örnegin polisorbat 80)
konsantrasyonu, LAL kaskatinin deterjan tarafindan
inhibisyonunu elimine edecek sekilde düsürülebilir. Ekli
Örneklerde gösterildigi üzere LER etkisi özellikle burada
saglanan yöntemlerin adimlari su sirayla uygulandiginda
tekrarlanabilir sekilde asilabilir: (1) MgE' ilavesi; (2)
seyreltme ve (3) diyaliz. Dolayisiyla, (1), (2) ve (3)
numarali adimlarin kombinasyonu veya koruma talep edilen (a),
(b) ve (c) adimlarinin kombinasyonu LER etkisinin üstesinden
tekrarlanabilir sekilde gelir. Ilave edilecek tercihli Mg”
miktari, tercih edilen seyreltme derecesi ve diyaliz için
tercih. edilen. parametrelerin, ayrintilari yukarida. ve asagida
Tercih edilen bir yönü itibariyla tarifname, bir antikor
içeren bir numunenin bir LAL analizi için hazirlanmasina
yönelik burada saglanan yöntem ile ilgili olup, burada yöntem
asagidaki adimlari belirtilen sirayla içerir:
(a) örnegin MgClz formundaki magnezyum iyonlarinin numuneye
-100 mM, tercihen 40-75 mM ve en çok tercih edildigi
haliyle 45-55 mM'lik bir nihai konsantrasyonda ilave
edilmesi,
(b) numunenin. ,
tercihen 50 mM Tris/HCl tamponuyla (pH ~7.0) 1:5
(numuneztampon) ila 1:20 (numuneztampon), tercihen 1:10
(numuneztampon) oraninda seyreltilmesi,
(c) 5.7-8.0'lik (tercihen 6.5-7.5) bir pH seviyesine sahip
numunenin endotoksinsiz suya karsi 1-48 saat, tercihen 4-24
saat, en çok tercih edildigi haliyle 24 saat diyaliz
edilmesi. Tercihen 10 kDa'lik bir molekül agirligi esik
degerine sahip bir selüloz asetat membran kullanilir ve 2
ve 4 saat sonra su degistirilir. En çok tercih edildigi
haliyle, bir Hizli Döndürmeli Diyaliz Araci kullanilir ve
karistirici frekansi 50 ila 300 rpm, tercihen 200 rpm
olarak ayarlanir.
Yukarida belirtildigi üzere antikor tercihen bir monoklonal
antikordur. Antikor daha çok tercih edildigi haliyle
rituksimab olmaktadir. En çok tercih edildigi haliyle, burada
saglanan yöntemlerde numune, yaklasik 25 mM sodyum sitrat
tamponu ( ve yaklasik 700 mg/l polisorbat 80 ile
birlikte formüle edilen ve yaklasik 6'lik bir pH seviyesine
sahip olan bir antikor numunesidir.
Burada birbirlerinin yerine kullanilan "yaklasik" terimi ve
~" sembolü, verilen spesifik degerin belirli bir aralikta
degisebilecegini belirtir. Örnegin "yaklasik“ veya "~"
(Örnegin yaklasik/~25 mM sodyum sitrat tamponu baglaminda), ±
araliktaki varyasyonlarin verilen degerin kapsamina girdigini
ifade eder.
Belirtildigi üzere, mevcut tarifname baglaminda, burada
saglanan numune hazirlama yönteminin bir LAL analiziyle
birlestirilmesi öngörülür. LAL analizinin avantaji,
endotoksini düsük konsantrasyonda saptamasidir.
Standart CSE egrisiyle verildigi üzere, kinetik kromojenik LAL
tekniklerinde endotoksin tayininin geçerlenmis alt siniri
0.005 EU/mL'dir. Bu tekniklerde kullanilan LAL reaktifi,
Limulus yengecinden saflastirilan serin proteazlarin tam
enzimatik amplifikasyon kaskadini içerir.
Daha. yakin zamanda› gelistirilen. EndoLISAC> analizinde (Hyglos
GmbH, Almanya) endotoksin (CSE) tayininin alt sinirinin 0.05
EU/mL oldugu üretici firma tarafindan belirtilmistir
(Advertisment of Hyglos: Grallert ve ark., Nature Methods,
http://www.hyglos.de/fileadmin/media/Application_note_EndoLISA
sadece Limulus kaskadinin ilk enziminin, yani faktör C'nin bir
rekombinant formu kullanilir. Lisansli LAL testlerinden farkli
olarak, EndoLISA® analizi, ilaveten, mikrotitre plaginin, LAL
yöntemiyle saptandigi iyi bilinen. bakteriyel endotoksinlerin
genis spektrumuna baglandigi henüz kanitlanmamis olan
bakteriyofaj tarafindan kodlanmis bir protein ile önceden
kaplanmasi yoluyla saglanan bir baslangiç endotoksin
adsorpsiyon adimi içerir.
Daha özel bir ifadeyle, tercih edilen bir yönü itibariyla
mevcut tarifname, bir polipeptit içeren bir numunede bir
bakteriyel endotoksinin belirlenmesine yönelik bir yöntem ile
ilgili olup, burada yöntem asagidaki adimlari belirtilen
sirayla içerir:
(a) tercihen MgC12 formundaki magnezyum iyonlarinin
numuneye 10-100 mM, tercihen. 40-75 mM ve en çok tercih
edildigi haliyle 45-55 mM'lik. bir nihai konsantrasyonda
ilave edilmesi,
(b) numunenin ,
tercihen 50 mM Tris/HCl tamponuyla (pH ~7.0) 1:5
(numuneztampon) ila 1:20 (numuneztampon), tercihen 1:10
(numuneztampon) oraninda seyreltilmesi,
(c) 5.7-8.0'lik (tercihen 6.5-7.5) bir pH seviyesine sahip
numunenin endotoksinsiz suya karsi 1-48 saat, tercihen 4-24
saat, en çok tercih edildigi haliyle 24 saat diyaliz
edilmesi. Tercihen 10 kDa'lik bir molekül agirligi esik
degerine sahip bir seluloz asetat membran kullanilir ve 2
ve 4 saat sonra su degistirilir. En çok tercih edildigi
haliyle, bir Hizli Döndürmeli Diyaliz Araci kullanilir ve
karistirici frekansi 50 ila 300 rpm, tercihen 200 rpm
olarak ayarlanir.
(d) Numunedeki bakteriyel endotoksinin bir LAL analiziyle
belirlenmesi.
Yukarida belirtildigi üzere antikor tercihen. bir monoklonal
antikordur. Antikor daha çok tercih edildigi haliyle
rituksimab olmaktadir. En çok tercih edildigi haliyle, burada
saglanan yöntemlerde numune, yaklasik 25 mM sodyum sitrat
tamponu ve yaklasik 700 mg/l polisorbat 80 ile birlikte
formüle edilen ve yaklasik 6.5'lik bir pH seviyesine sahip
olan bir antikor numunesidir.
Ekli Örneklerde gösterildigi üzere, burada saglanan endotoksin
belirleme yönteminin (d) adimindaki LAL analizinde bir
kontrolü", burada tarif edilen yöntemlerin (a) ila (c)
adimlarinin uygulanmadigi durumlarda test edilecek numunenin
(yani bir antikor içeren numunenin) LER etkisi sergileyecegini
kanitlamaya yönelik bir göstergedir. Ya da baska bir ifadeyle,
endotoksinin (test edilecek numunede) sadece bir LAL analizi
kullanilarak (yani burada saglanan yöntemlerin (a) ila (c)
adimlarini uygulamadan) geri kazanilamayacagini göstermek için
bir LAL analizinde pozitif kontrol olarak kullanilir. Mevcut
tarifname baglaminda, bir pozitif LER etkisinin sadece
numuneye CSE katildiktan sonra numunenin 45 dakika ila 2 saat,
tercihen yaklasik 60 dakika ila 2 saat ve en çok tercih
edildigi haliyle yaklasik 60 dakika çalkalandigi durumlarda
elde edilebilecegi sasirtici ve beklenmedik bir sekilde
bulunmustur. Dolayisiyla, mevcut tarifname baglaminda "pozitif
LER kontrolü", endotoksin için test edilecek numunenin bir
örnegine (örnegin bir antikor içeren numunenin bir örnegine)
bilinen miktarda. endotoksinin. katilmasi. ve katkili numunenin
45 dakika ila 2 saat, tercihen yaklasik 60 dakika ila 2 saat
ve en çok tercih edildigi haliyle yaklasik 60 dakika
çalkalanmasi yoluyla hazirlanir. Dolayisiyla tarifname, burada
saglanan endotoksin belirleme yöntemi ile ilgili olup, bu
yöntem, ilaveten, bir numune örnegine bilinen miktarda
endotoksinin katilmasi ve endotoksin katkili numune örneginin
60 dakika veya daha uzun bir süre boyunca (daha çok tercih
edildigi haliyle 60 dakika ila 2 saat) çalkalanmasi yoluyla
bir pozitif LER kontrolünün hazirlanmasini içerir.
Tercihen, burada saglanan bakteriyel endotoksin tayinine
yönelik yöntemde "pozitif LER. kontrolü", test edilecek
numunenin bir örnegine 5.0 EU/ml'lik bir nihai konsantrasyonda
CSE katilmasi yoluyla hazirlanir. Akabinde, katkili örnek 60
dakika veya daha uzun bir süre boyunca, en çok tercih edildigi
haliyle 60 dakika boyunca çalkalanir [örnegin oda sicakliginda
bir Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037
rpm)]. Çalkalama isleminden sonra, endotoksin katkili örnek
tercihen burada saglanan yöntemlerin (b) adiminda test
edilecek numuneyle ayni oranda seyreltilir. Katkili örnek
tercihen endotoksinsiz su ile seyreltilir. Seyreltme
isleminden sonra, katkili örnek tercihen mesela 1 dakika
boyunca çalkalanir [örnegin oda sicakliginda bir Heidolph
Multi Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037 rpm)].
Dolayisiyla, "pozitif LER kontrolü" tercihen asagidaki
prosedüre göre belirtilen sirayla hazirlanir:
- Test edilecek numunenin bir örnegine 5.0 EU/ml'lik bir
nihai konsantrasyonda CSE katilmasi. "Pozitif LER kontrolü"
tercihen 1.5-5 ml'lik distan geçme kapakli, düz tabanli
seffaf bir cam kap içerisinde ve daha çok tercih edildigi
haliyle bir Macherey-Nagel GmbH (1.5 ml veya 4 ml) marka
Vida kapakli cam flakon içerisinde hazirlanir.
- Katkili örnegin 60 dakika veya daha uzun bir süre boyunca
(daha çok tercih edildigi haliyle 60 dakika ila 2 saat
boyunca) ve en çok tercih edildigi haliyle 60 dakika
boyunca çalkalanmasi. Katkili örnek tercihen oda
sicakliginda (yani 21 ± 2°C) yüksek hizda (2,037 rpm)
çalkalanir. Katkili örnek en çok tercih edildigi haliyle
oda sicakliginda bir Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda
yüksek hizda (2,037 rpm) çalkalanir.
- Katkili örnegin endotoksinsiz su ile seyreltilmesi. Katkili
örnek, burada saglanan yöntemlerin (b) adiminda test
edilecek numuneyle ayni oranda seyreltilir (yani test
edilecek numune (b) adiminda lle oraninda seyreltiliyorsa,
katkili örnek de 1:10 oraninda seyreltilir).
- Katkili örnegin çalkalanmasi (örnegin 1 dakika boyunca).
Yukarida tarif edildigi üzere, "pozitif LER kontrolü"
hazirlanirken bir seyreltme islemi gerçeklestirilir. Ancak
konusu seyreltme islemi disinda, burada saglanan yöntemlerin
(a) ila (c) adimlarinda tarif edildigi gibi muamele edilmemesi
öngörülür. Ancak söz konusu "pozitif LER kontrolü", bakteriyel
endotoksin tayinine yönelik yöntemin (d) adiminda, burada
tarif edilen yöntemlerin (a) ila (c) adimlari uygulanmadiginda
test edilecek numunenin (yani bir antikor içeren numunenin)
LER etkisi sergileyecegini göstermek için kullanilir. "Pozitif
LER kontrolü", (a) ila (c) adimlarindan herhangi biri
esnasinda (örnegin diyaliz esnasinda) hazirlanabilir, böylece
LAL analizi gerçeklestirilirken hazir bulunur.
Belirli bir materyalin (örnegin bir tampon veya bir terapötik
antikor numunesi) LER. etkisi sergiledigini belirlemek için,
endotoksin içerikleri örnegin bir endotoksinl bekleme süresi
çalismasinda belirli bir süre boyunca izlenebilir. Endotoksin
bekleme süresi çalismalari, bir seyreltilmemis numuneye
endotoksin katilmasini ve endotoksin katkili numunenin bir
süreligine saklanmasini gerektirir. Numune örnegin birkaç ay
depolanabilir. Bir bekleme süresi çalismasinda endotoksin
katkili numune tercihen birkaç (örnegin 7 ila 28) gün saklanir
ve belirli zaman noktalarinda bir LAL analizi
gerçeklestirilir. Katkili endotoksin miktarinin %50'sinden
düsük geri kazanim oranlari numunenin bir LER etkisi
sergiledigini gösterir.
Yukarida belirtildigi üzere, LAL analizi genelde bilinen
miktarda katilmis CSE içeren bir numune olarak bir
seyreltilmis pozitif kontrol (PPC) içeren bir seyreltik test
numunesi ile gerçeklestirilir. Dolayisiyla, burada saglanan
endotoksin belirleme yönteminin (d) adiminda gerçeklestirilen
LAL analizinde, her bir numunenin her seferinde bir katilmis
standart kontrol endotoksini (PPC) ile birlikte ve katilmis
endotoksin olmadan iki kopya halinde ölçülmesi öngörülür.
Sonuç olarak, verilen her bir numuneyle, burada saglanan
numune hazirlama yönteminin veya burada saglanan endotoksin
belirleme yönteminin, numunede bulunan endotoksinin (veya
FDA'nin gerektirdigi üzere bunun en az %50-200'ünün) LAL
analiziyle saptanabilmesine yönelik elverisli etkiye sahip
olup olmadigi kolayca analiz edilebilir. Dolayisiyla, burada
saglanan endotoksin belirleme yönteminin (d) adiminda
gerçeklestirilen LAL analizinde, test edilecek numune (yani
bir antikor içeren test edilecek numune) ile birlikte bir
pozitif kontrolün (PPC) de test edilmesi öngörülür. Söz konusu
pozitif kontrol, PPC'ye bilinen miktarda CSE katilmasi disinda
test edilecek numuneyle özdestir. Ya da baska bir ifadeyle,
burada saglanan yöntemlerin (a) ila (c) adimlarinin test
edilecek numuneyle ayni sekilde PPC ile de gerçeklestirilmesi
gerekir. Dolayisiyla PPC, burada saglanan yöntemlerin (a)
adimindan önce hazirlanir.
Mevcut tarifname baglaminda, bir pozitif LER etkisinin sadece
numuneye CSE katildiktan sonra numunenin 45 dakika ila 2 saat,
tercihen yaklasik 60 dakika ila 2 saat ve en çok tercih
edildigi haliyle yaklasik 60 dakika çalkalandigi durumlarda
elde edilebilecegi sasirtici ve beklenmedik bir sekilde
bulunmustur. Dolayisiyla, mevcut tarifname baglaminda PPC,
katim isleminden sonra 45 dakika ila 2 saat, tercihen yaklasik
60 dakika ila 2 saat ve en çok tercih edildigi haliyle
yaklasik 60 dakika boyunca çalkalanir [örnegin bir Heidolph
Multi Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037 rpm)]. PPC
daha çok tercih edildigi haliyle katim isleminden sonra oda
sicakliginda yaklasik. 60 dakika boyunca çalkalanir [örnegin
bir Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037
Dolayisiyla, tercih edilen bir yönü itibariyla tarifname, bir
antikor içeren bir numunede bir bakteriyel endotoksinin
belirlenmesine yönelik burada saglanan yöntem ile ilgili olup,
burada yöntem asagidaki adimlari belirtilen sirayla içerir:
(aO) bir PPC'nin su sekilde hazirlanmasi:
- bir antikor içeren numunenin bir birinci örnegine
bilinen miktarda endotoksinin katilmasi ve
- endotoksin katkili örnegin 60 dakika ila 2 saat
(tercihen oda sicakliginda yaklasik 60 dakika) boyunca
çalkalanmasi,
(a) magnezyum iyonlarinin, test edilecek numunenin ikinci
bir örnegine ve ayrica PPC'ye ilave edilmesi,
(b) test edilecek numunenin ikinci örneginin ve ayrica
PPC'nin seyreltilmesi,
(c) 5.7-8.0'lik (tercihen 5.8-7.0) bir pH seviyesine sahip
test edilecek numunenin ikinci örneginin ve ayrica PPC'nin
bir endotoksinsiz sulu solüsyona karsi diyaliz edilmesi
(burada test edilecek numune ve ayrica PPC, 5.7-9.0'lik bir
pH seviyesine sahiptir) ve
(d) test edilecek numunenin ikinci örneginde ve ayrica
PPC'de bakteriyel endotoksinin bir LAL analiziyle
belirlenmesi.
Tarifnamenin bir yönü itibariyla, endotoksin PPC'ye 5.0
EU/ml'lik bir nihai endotoksin konsantrasyon saglayacak
sekilde katilir.
Burada saglanan bakteriyel endotoksin tayinine yönelik yöntem
ile baglantili tüm özellikler ve tanimlar, gerekli
degisikliklerin yapilmasi kaydiyla, bir PPC'nin uygulandigi
durumlarda da söz konusu yöntem için geçerlidir. Dolayisiyla,
tercih edilen bir yönü itibariyla tarifname, bir antikor
içeren bir numunede bir bakteriyel endotoksinin belirlenmesine
yönelik burada saglanan yöntem ile ilgili olup, burada yöntem
asagidaki adimlari belirtilen sirayla içerir:
(aO) bir PPC'nin su sekilde hazirlanmasi:
- bir antikor içeren numunenin bir birinci örnegine
bilinen miktarda endotoksinin katilmasi ve
- endotoksin katkili örnegin 60 dakika veya daha uzun bir
süre boyunca (tercihen oda sicakliginda 60 dakika
boyunca) çalkalanmasi,
(a) tercihen MgClz formundaki magnezyum iyonlarinin ikinci
bir numune örnegine 10-100 mM, tercihen 40-75 mM ve en çok
tercih edildigi haliyle 45-55 mM'lik bir nihai
konsantrasyonda ilave edilmesi,
(b) ikinci numune örneginin 10-50 mM 'Tris/HCl tamponuyla
(pH 6.0-8.0), tercihen 50 mM Tris/HCl tamponuyla (pH ~7.0)
1:5 (numuneztampon) ila 1:20 (numuneztampon), tercihen 1:10
(numune:tampon) oraninda seyreltilmesi,
(c) 5.7-8.0'lik (tercihen 6.5-7.5) bir pH seviyesine sahip
numunenin endotoksinsiz suya karsi 1-48 saat, tercihen 4-24
saat, en çok tercih edildigi haliyle 24 saat diyaliz
edilmesi. Tercihen 10 kDa'lik. bir molekül agirligi esik
degerine sahip bir selüloz asetat membran kullanilir ve 2
ve 4 saat sonra su degistirilir. Daha çok tercih edildigi
haliyle, bir Hizli Döndürmeli Diyaliz Araci kullanilir ve
karistirici frekansi yüksektir.
(d) Numunedeki bakteriyel endotoksinin bir LAL analiziyle
belirlenmesi.
Burada saglanan endotoksin belirleme yönteminde ilaveten su
kontrolleri uygulanabilir. Tercihen en az iki su kontrolü
kullanilir; bunlardan biri endotoksinsiz sudan olusur, digeri
ise içine bilinen miktarda endotoksin (örnegin 5.0 EU/ml'lik
bir nihai CSE konsantrasyonu saglamak üzere) katilmis
endotoksinsiz sudan olusur. Su kontrolleri, test edilecek
numuneyle ayni sekilde muamele edilir.
Yukarida belirtildigi üzere, burada saglanan numune hazirlama
yönteminde ve ayrica burada saglanan endotoksin belirleme
yönteminde, (a) adiminda numunenin 30 dakika ila 6 saat,
tercihen 1-4 saat ve en çok tercih edildigi haliyle 1 saat
inkübe edilmesi öngörülür. Ayrica, diyalizden sonra numunenin
örnegin 10 dakika ila 1 saat ve tercihen 20 dakika boyunca
çalkalanmasi [örnegin oda sicakliginda bir Heidolph Multi Reax
Çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037 rpm)] öngörülür.
Dolayisiyla, bir yönü itibariyla tarifname, bir antikor içeren
bir numunenin bir LAL analizi için hazirlanmasina yönelik
burada saglanan yöntem ile ilgili olup, burada yöntem
asagidaki adimlari belirtilen sirayla içerir:
(a) tercihen MgC12 formundaki magnezyum iyonlarinin
numuneye lO-lOO mM, tercihen. 40-75 mM ve en çok tercih
edildigi haliyle 45-55 mM'likr bir nihai konsantrasyonda
ilave edilmesi ve numunenin 30 dakika ila 6 saat, tercihen
l-4 saat ve en çok tercih edildigi haliyle 1 saat inkübe
edilmesi,
(b) numunenin. ,
tercihen 50 mM Tris/HCl tamponuyla (pH ~7.0) l:5
(numuneztampon) ila l:20 (numuneztampon), tercihen lle
(numuneztampon) oraninda seyreltilmesi,
(c) 5.7-8.0'lik (tercihen 6.5-7.5) bir pH seviyesine sahip
numunenin endotoksinsiz suya karsi l-48 saat, tercihen 4-24
saat, en çok tercih edildigi haliyle 24 saat diyaliz
edilmesi. (Tercihen 10 kDa'lik bir nmlekül agirligi esik
degerine sahip bir selüloz asetat membran kullanilir ve 2
ve 4 saat sonra su degistirilir. Daha çok tercih edildigi
haliyle, bir Hizli Döndürmeli Diyaliz Araci kullanilir ve
karistirici frekansi yüksektir). Diyalizden sonra numuneler
dakika ila 1 saat ve tercihen 20 dakika boyunca
çalkalanir.
Benzer bir sekilde, baska bir yönü itibariyla tarifname, bir
LER etkisi sergileyen ve bir antikor içeren bir numunede bir
bakteriyel endotoksinin belirlenmesine yönelik burada saglanan
yöntem ile ilgili olup, burada yöntem asagidaki adimlari
belirtilen sirayla içerir:
(a) tercihen MgCl2 formundaki magnezyum iyonlarinin
numuneye lO-lOO mM, tercihen 40-75 mM ve en çok tercih
edildigi haliyle 45-55 mM'lik bir nihai konsantrasyonda
ilave edilmesi ve numunenin 30 dakika ila 6 saat, tercihen
1-4 saat ve en çok tercih edildigi haliyle 1 saat inkübe
edilmesi (burada numune inkübasyondan önce ve sonra
çalkalanabilir),
(b) numunenin ,
tercihen 50 mM Tris/HCl tamponuyla (pH ~7.0) l:5
(numuneztampon) ila 1:20 (numuneztampon), tercihen 1:10
(numuneztampon) oraninda seyreltilmesi,
(c) 5.7-8.0'lik (tercihen 6.5-7.5) bir pH seviyesine sahip
numunenin endotoksinsiz suya karsi 1-48 saat, tercihen 4-24
saat, en çok tercih edildigi haliyle 24 saat diyaliz
edilmesi. (Tercihen 10 kDa'lik bir molekül agirligi esik
degerine sahip bir selüloz asetat membran kullanilir ve 2
ve 4 saat sonra su degistirilir. Daha çok tercih edildigi
haliyle, bir Hizli Döndürmeli Diyaliz Araci kullanilir ve
karistirici frekansi yüksektir). Diyalizden sonra numuneler
dakika ila 1 saat ve tercihen 20 dakika boyunca
çalkalanir ve
(d) numunedeki bakteriyel endotoksinin bir LAL analiziyle
belirlenmesi.
Ayrica, yukarida belirtildigi üzere, burada saglanan
endotoksin belirleme yönteminde bir PPC'nin hazirlanmasi ve
PPC'nin katim isleminde sonra 60 dakika ila 2 saat boyunca
çalkalanmasi öngörülür. Dolayisiyla mevcut tarifname, bir LER
etkisi sergileyen bir antikor içeren bir numunede bir
bakteriyel endotoksinin belirlenmesine yönelik burada saglanan
yöntem ile ilgili olup, burada yöntem asagidaki adimlari
belirtilen sirayla içerir:
(aO) bir PPC'nin su sekilde hazirlanmasi:
- bir antikor içeren numunenin bir birinci örnegine
bilinen miktarda endotoksininv katilmasi (örnegin ve
- endotoksin katkili örnegin 60 dakika ila 2 saat
(tercihen oda sicakliginda 60 dakika) boyunca
çalkalanmasi,
(a) tercihen MgClz formundaki magnezyum iyonlarinin ikinci
bir numune örnegine ve ayrica PPC'ye 10-100 mM, tercihen
40-75 mM ve en çok tercih edildigi haliyle 45-55 mM'lik bir
nihai konsantrasyonda ilave edilmesi (ve tercihen ikinci
numune örneginin ve PPC'nin 30 dakika ila 6 saat, tercihen
1-4 saat ve en çok tercih edildigi haliyle 1 saat inkübe
edilmesi (burada numune inkübasyondan önce ve sonra
çalkalanabilir)),
(b) numunenin ve PPC'nin 10-50 mM Tris/HCl tamponuyla (pH
(numune/PPC:tampon) ila , tercihen
oraninda seyreltilmesi,
(c) 5.7-8.0'lik (tercihen 6.5-7.5) bir pH seviyesine sahip
numunenin ve PPC'nin endotoksinsiz suya karsi 1-48 saat,
tercihen 4-24 saat, en çok tercih edildigi haliyle 24 saat
diyaliz edilmesi. (Tercihen 10 kDa'lik bir molekül agirligi
esik degerine sahip bir selüloz asetat membran kullanilir
ve 2 ve 4 saat sonra su degistirilir. Daha çok tercih
edildigi haliyle, bir Hizli Döndürmeli Diyaliz Araci
kullanilir ve karistirici frekansi yüksektir). Diyalizden
sonra numuneler ve PPC 10 dakika ila l saat ve tercihen 20
dakika boyunca çalkalanir ve
(d) numunedeki ve PPC'deki bakteriyel endotoksinin bir LAL
analiziyle belirlenmesi.
Bunlarin yani sira, yukarida belirtildigi üzere, burada
saglanan endotoksin belirleme yönteminde bir “pozitif LER
kontrolünün" hazirlanmasi ve (d) adiminda LER etkisini
göstermek için kullanilmasi öngörülür. Dolayisiyla, tercih
edilen bir yönü itibariyla tarifname, bir LER etkisi
sergileyen ve bir antikor içeren bir numunede bir bakteriyel
endotoksinin belirlenmesine yönelik burada saglanan yöntem ile
ilgili olup, burada yöntem asagidaki adimlari belirtilen
sirayla içerir:
(aO) bir PPC'nin su sekilde hazirlanmasi:
- bir antikor içeren numunenin bir birinci örnegine
bilinen miktarda endotoksinin. katilmasi (örnegin ve
- endotoksin katkili örnegin 60 dakika ila 2 saat
(tercihen oda sicakliginda 60 dakika) boyunca
çalkalanmasi,
(a) tercihen MgCl2 formundaki magnezyum iyonlarinin ikinci
bir numune örnegine ve ayrica PPC'ye lO-lOO mM, tercihen
40-75 mM ve en çok tercih edildigi haliyle 45-55 mM'lik bir
nihai konsantrasyonda ilave edilmesi (ve tercihen ikinci
numune örneginin ve PPC'nin 30 dakika ila 6 saat, tercihen
l-4 saat ve en çok tercih edildigi haliyle 1 saat inkübe
edilmesi (burada numune inkübasyondan önce ve sonra
çalkalanabilir)),
(b) numunenin ve PPC'nin 10-50 mM Tris/HCl tamponuyla (pH
6.0-8.0), tercihen 50 mM Tris/HCl tamponuyla (pH ~7.0) l:5
(numune/PPC:tampon) ila , tercihen
oraninda seyreltilmesi,
(c) 5.7-8.0'lik (tercihen 6.5-7.5) bir pH seviyesine sahip
numunenin ve PPC'nin endotoksinsiz suya karsi 1-48 saat,
tercihen 4-24 saat, en çok tercih edildigi haliyle 24 saat
diyaliz edilmesi. (Tercihen 10 kDa'lik bir molekül agirligi
esik degerine sahip bir selüloz asetat membran kullanilir
ve 2 ve 4 saat sonra su degistirilir. Daha çok tercih
edildigi haliyle, bir Hizli Döndürmeli Diyaliz Araci
kullanilir ve karistirici frekansi yüksektir). Diyalizden
sonra numuneler ve PPC 10 dakika ila 1 saat ve tercihen 20
dakika boyunca çalkalanir ve
(d) numunede ve PPC'de bakteriyel endotoksinin bir LAL
analiziyle belirlenmesi, burada LAL analizinde su sekilde
hazirlanan bir "pozitif LER kontrolü" kullanilir:
- test edilecek numunenin üçüncü bir örnegine 5.0
EU/ml'lik bir nihai konsantrasyonda CSE katilmasi;
- katkili örnegin 60 dakika veya daha uzun bir süre
boyunca ve en çok tercih edildigi haliyle 60 dakika
boyunca çalkalanmasi;
- katkili örnegin endotoksinsiz su ile seyreltilmesi
(katkili örnek burada saglanan yöntemlerin (b) adiminda
test edilecek numuneyle ayni oranda seyreltilir);
- katkili örnegin çalkalanmasi (örnegin 1 dakika).
Dolayisiyla, tercih edilen bir yönü itibariyla tarifname, bir
LER etkisi sergileyen ve bir antikor içeren bir numunede bir
bakteriyel endotoksinin belirlenmesine yönelik burada saglanan
yöntem ile ilgili olup, burada yöntem asagidaki adimlari
belirtilen sirayla içerir:
(aO) bir PPC'nin su sekilde hazirlanmasi:
- bir antikor içeren numunenin bir birinci örnegine
bilinen miktarda endotoksinin örnegin 5.0 EU/ml'lik bir
nihai konsantrasyonda katilmasi ve
- endotoksin katkili örnegin oda sicakliginda yaklasik 60
dakika çalkalanmasi,
(a) tercihen MgClz formundaki magnezyum iyonlarinin ikinci
bir numune örnegine ve PPC'ye 45-55 mM'lik bir nihai
konsantrasyonda ilave edilmesi, numunenin ve PPC'nin 1
dakika çalkalanmasi, numunenin ve PPC'nin 1 saat inkübe
edilmesi ve numunenin ve PPC'nin inkübasyondan sonra tekrar
çalkalanmasi,
(b) numunenin ve PPC'nin 50 mM Tris/HCl tamponuyla (pH
~ oraninda seyreltilmesi,
(c) 5.7-8.0'lik (tercihen 6.5-7.5) bir pH seviyesine sahip
numunenin ve PPC'nin 10 kDa'lik bir molekül agirligi esik
degerine sahip bir selüloz asetat membran kullanarak
endotoksinsiz suya karsi 24 saat diyaliz edilmesi; burada
su 2 ve 4 saat sonra degistirilir (tercihen bir Hizli
Döndürmeli Diyaliz Araci kullanilir ve karistirici frekansi
yüksektir) ve numunenin ve PPC'nin 20 dakika çalkalanmasi
(d) numunede ve PPC'de bakteriyel endotoksinin bir LAL
analiziyle belirlenmesi, burada LAL analizinde su sekilde
hazirlana bir "pozitif LER kontrolü“ kullanilir:
- test edilecek numunenin üçüncü bir örnegine 5.0
EU/ml'lik bir nihai konsantrasyonda CSE katilmasi,
- katkili örnegin 60 dakika çalkalanmasi,
- katkili örnegin endotoksinsiz su ile 1:10 oraninda
seyreltilmesi,
- katkili örnegin çalkalanmasi (örnegin 1 dakika).
Bunlarin yani sira, yukarida belirtildigi üzere, LAL
analizinde su kontrollerinin uygulanmasi öngörülür. Örnegin,
burada saglanan endotoksin belirleme yönteminin (d) adiminda
gerçeklestirilen LAL analizinde endotoksinsiz sudan olusan bir
su kontrolü uygulanabilir. Baska bir su kontrolü, endotoksin
katkili endotoksinsiz sudan olusabilir. Endotoksin katildiktan
sonra su tercihen 60 dakika veya daha uzun bir süre boyunca
(örnegin oda sicakliginda 60 dakika boyunca) çalkalanir
(2,037 rpm)]. Bunlarin yani sira, bir LAL analizinde normalde
kullanilan kitin talimatlarina göre bir standart hazirlanir.
(aO), (a), (b), (c) ve (d) adimlari, (a0)a(a)a(b)a(c)a(d) ile
gösterilen siraya göre gerçeklestirilecektir. Ancak diyaliz
membraninin yikanmasi, adimin diyaliz basladiginda yürütülmesi
kaydiyla, herhangi bir zaman noktasinda gerçeklestirilebilir.
Benzer bir sekilde, pozitif LER kontrolünün hazirlanmasi,
adimin LAL analizi basladiginda yürütülmesi kaydiyla herhangi
bir zaman noktasinda gerçeklestirilebilir. Tarifnamenin tercih
edilen bir yönü itibariyla, burada saglanan endotoksin
belirleme yöntemi asagidaki adimlari içerir.
Adim (aOO): Numunelerin hazirlanmasi
~ Test edilecek numunenin konsantrasyonu PPC'ye uyarlanir
(örnegin 900 ul antikor + 100 ul endotoksinsiz su)
° PPC üretimi için test edilecek numunenin bir örnegine
endotoksin katilmasi (örnegin 900 pl antikor + 100 pl CSE
konsantrasyon 50 EU/ml = nihai konsantrasyon
- Bir su kontrolünün hazirlanmasi (örnegin 1000 ul
endotoksinsiz Su)
0 Baska bir su kontrolünün hazirlanmasi (örnegin 900 ul
endotoksinsiz su + 100 ül CSE konsantrasyon 50 EU/ml =
nihai konsantrasyon
çalkalanmasi [örnegin bir Heidolph Multi Reax
çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037 rpm)]
Adim (aOl): Diyaliz membraninin yikanmasi
° Örnegin 10 kDa'lik selüloz asetat (CA) membranlar
kullanilir ve bunlar endotoksinsiz su (örnegin 300 ml
damitik su (B. Braun, Melsungen)) ile birlikte bir
kristallendirme kabina yerlestirilir
1 saat dikkatlice karistirilir (Shaker* SG 20. IDL GmbH,
Almanya veya esdeger bir cihaz, 50 ila 300 rpm, tercihen
100 rpm)
Membranlar, taze endotoksinsiz su (örnegin 300 ml damitik
su (B. Braun, Melsungen)) ile birlikte yeni bir
kristallendirme kabina aktarilir
1 saat çalkalanir (Shaker SG 20. IDL GmbH, Almanya veya
esdeger bir cihaz, 50 ila 300 rpm, tercihen 100 rpm)
(Mgß) ilave edilmesi
Örnegin MgClz formundaki Mgzh (aO) adimindaki numunelere
ilave edilir (örnegin bir 1 M'lik MgClz stok solüsyonunun
50 ul'lik bir miktari (aO) adimindaki numunelere ilave
2-5 dakika, örnegin 1 dakika çalkalanir [örnegin oda
sicakliginda bir Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda
yüksek hizda (2,037 rpm)]
numuneler oda sicakliginda 45 ila 75 dakika, tercihen 60
dakika inkübe edilir
1 dakika çalkalanir [örnegin oda sicakliginda bir Heidolph
Multi Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037 rpm)]
Adim (b): Seyreltme
(a) adimindaki numunelerden biri alinir ve tampon (pH ~7.0)
(örnegin 50 mM Tris/HCl tamponu (pH ~ 7.0)) ile 1:10
oraninda seyreltilir (örnegin 895 ul 50 mM'lik Tris tamponu
+ 105 ul numune)
Tercihen iki seyreltik numune hazirlanir
Örnegin:
o Tris tamponu ile 1:10 oraninda seyreltilmis antikor
o Tris tamponu ile 1:10 oraninda seyreltilmis 5.0 EU/ml
katkili antikor (PPC) x 2
o Tris tamponu ile 1:10 oraninda seyreltilmis LAL suyu
(arkaplan) x 2
o Tris tamponu ile 1:10 oraninda seyreltilmis 5.0 EU/ml
katkili LAL suyu (standart) x 2
0 LAL suyu = lütfen ilave ediniz
Adim (c): Diyaliz
Tüm seyreltik numuneler 1 dakika çalkalanir [örnegin oda
sicakliginda bir Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda
yüksek hizda (2,037 rpm)]
Diyaliz aracina (tercihen bir FastSpinDIALYZER) aktarilir
Her bir salter için bir diyaliz araci bir karistiricinin
üstüne yerlestirilir
Saltere endotoksinsiz su (örnegin 200 m1 damitik su (B.
Braun, Melsungen)) doldurulur
Oda sicakliginda 24 saat diyaliz gerçeklestirilir ve
endotoksinsiz su 2 saat ve 4 saat sonra degistirilir
Karistirici frekansi tercihen 50 ila 300 rpm, daha çok
tercih edildigi haliyle 200 rpm olarak ayarlanir (özellikle
bir FastSpinDIALYZER kullanilir). Karistirici tercihen 20-
60 mm'lik bir uzunluga ve 5-25 mm'lik bir çapa sahiptir.
Karistirici daha çok tercih edildigi haliyle yaklasik 40
mm'lik bir uzunluga ve yaklasik 14 mm'lik bir çapa sahip
bir manyetik karistiricidir.
Adim (d): Çalkalama
Diyalizden sonra numuneler yeni kaplara (örnegin 1.5 m1'1ik
Vida kapakli flakonlara) aktarilir ve 20-60 dakika
çalkalanir [örnegin oda sicakliginda bir Heidolph Multi
Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037 rpm)]
Adim (dOO): "Pozitif LER kontrolünün" ve diger su
kontrollerinin hazirlanmasi
1. ((dOO) adiminin mutlaka (d) adimindan sonra
gerçeklestirilmesi gerekmez. (dOO) adimi, "pozitif LER
kontrolünün" ve diger su kontrollerinin LAL analizi
bagladiginda hazir olmasi kaydiyla herhangi bir anda
gerçeklestirilebilir). "Pozitif LER kontrolü" tercihen
diyaliz bitmeden 1 saat önce hazirlanir* [örnegin 900 ul
antikor + 100 ul CSE konsantrasyon 50 EU/ml = nihai
konsantrasyon 5.0 EU/ml]
° Diger su kontrolleri hazirlanir, örnegin:
1. 900 ul antikor + 100 ul LAL suyu
2. 1000 ul LAL suyu
0 900 ul LAL suyu + 100 ul CSE konsantrasyon 50 EU/ml =
nihai konsantrasyon 5.0 EU/ml
° 1 saat çalkalanir [örnegin oda sicakliginda bir
Heidolph Multi Reax Çalkalayicisinda yüksek hizda
(2,037 rpm)]
° Numuneler endotoksinsiz su ile 1:10 oraninda
seyreltilir
o 1 dakika çalkalanir [örnegin oda sicakliginda bir
Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda yüksek hizda
(2,037 rpm)]
Adim (e): LAL analizi
Üretici firmanin talimatlari dogrultusunda standart (yani
kullanilan LAL analizi kitine dahil edilen standart)
hazirlanir ve ölçüm su sekilde baslatilir:
(1) LAL reaktifinin (Kinetik-QCLTM Reaktifi) hazirlanmasi:
At nali yengecinin (Limulus poliphemus)
amebositlerinden hazirlanan lizat ve kromojenik
substratin birlikte liyofilize edilmis karisimi
kullanimdan hemen Önce her bir flakon için 2.6 ml
Reaktif LAL Suyu ile sulandirilir.
CSE stok solüsyonunun (50 EU/ml, yani 81 standardina
CSE preparati (E. coli 055:BS-LPS, her bir flakon 50-
Analiz
Sertifikasinda belirtilen Reaktif LAL Suyu hacmiyle
sulandirilir ve 50 EU (veya IU)/ml içeren bir solüsyon
elde etmek üzere hesaplama yapilir.
CSE Stok solüsyonu bir çalkalayici üzerinde en az 15
dakika boyunca yüksek hizda siddetli sekilde
çalkalanir.
Kullanimdan önce solüsyon oda sicakligina isinmaya
birakilir ve bir çalkalayici üzerinde 15 dakika boyunca
yüksek hizda siddetli sekilde tekrar çalkalanir.
(3) CSE standart serisinin hazirlanmasi:
° CSE stok solüsyonu / Sl standardi (adim 1), tam CSE
standartlari serisini (50, 5, 0.5, 0.05 ve
elde etmek üzere oda sicakliginda Reaktif LAL Suyu ile
1:10 oraninda seyreltilir.
(4) bir 96 kuyulu Hdkroplak ELISA okuyucu formatinda LAL
100 ul Reaktif LAL Suyu taslagi, endotoksin
standartlari, ürün numuneleri, pozitif ürün kontrolleri
mikroplagin uygun gözlerine dikkatlice dagitilir.
Dolu plak mikroplak okuyucuya yerlestirilir, kapak
kapatilir.
plak 10 dakika veya daha uzun bir süre boyunca 37°C ±
1°C'de ön inkübasyona tabi tutulur.
pipetleyici yardimiyla birinci sütundan (Al-Hl)
baslamak ve kullanilan son sütuna kadar sirayla devam
etmek suretiyle mikroplagin tüm gözlerine dagitilir.
reaktif olabildigince hizli bir sekilde ilave edilir
(hava kabarciklarini önlemek için).
- Testi baslatmak için hemen bilgisayar klavyesi
üzerindeki OK butonuna basilir. (Not: Kinetik-QCLTM
analizi, mikroplak kapagi çikarilarak
gerçeklestirilir).
Burada "katmak" terimi "ilave etmek" veya "birlestirmek"
anlamina gelir. Örnegin "bir numuneye bilinen miktarda CSE
katilmasi", "bilinen miktarda CSE'nin bir numuneye ilave
edilmesi" veya "bir numunenin bilinen miktarda CSE ile
birlestirilmesi" anlamina gelir.
Lipopolisakkaritler (LPS) olarak da bilinen endotoksinler,
Gram-negatif bakterilerin dis membraninda bulunan büyük
moleküllerdir ve hayvanlarda, örnegin insanlarda güçlü immün
yanitlar uyarir. Belirtildigi üzere tarifname, bir antikor
içeren bir numunede bakteriyel endotoksinin belirlenmesine
(yani saptanmasina ve tayin edilmesine) yönelik bir yöntem
saglar, burada yöntem, burada tarif edilen (a) ila (d)
adimlarini (tercihen ayrica (aOO), (aOl) ve (dOO) adimlarini)
Bir uygulamada endotoksin, Eschericha coli endotoksini
olabilir. Dolayisiyla, burada saglanan endotoksin belirleme
yönteminin (d) adiminda belirlenen (yani saptanan ve/veya
tayin edilen) endotoksin, E. coli endotoksini olabilir.
Örnegin, LAL analizinde numuneye katilan endotoksin, E. coli
endotoksini (yani E. coli'den saflastirilan endotoksin)
olabilir. Endotoksin tercihen piyasadan temin edilebilen bir
E. coli endotoksinidir (örnegin standart kontrol endotoksini,
Uluslararasi Standart WHO Endotoksini (1.8.), E. coli
Oll3:HlO:K'den elde edilen bir endotoksin preparatidir, bu
preparat bakteriyel endotoksin testi için uluslararasi düzeyde
nihai kalibrasyon araci olarak kabul edilir. Uluslararasi
Standardin mevcut partisi, "endotoksin için Uluslararasi WHO
Standardi, 3. 1.5." olarak adlandirilir.
Referans Standart Endotoksin (RSE), Uluslararasi Standart WHO
Endotoksinine göre kalibre edilmis bir endotoksin
preparatidir. RSE'ler ulusal kurumlar (örnegin USP, EP, JP,
ChP) tarafindan üretilir ve LAL analizlerinde kullanilmak
üzere CSE'lerin kalibrasyonunda kullanilir (bkz. asagisi).
Standart Kontrol Endotoksini (CSE), bir RSE'ye göre kalibre
edilmis olan, RSE'den farkli bir endotoksin preparatidir.
CSE'ler, E. coli Oll3:HlO:K'den (örnegin .Associates of Cape
Cod, Inc.) veya E. 0011 055:B5 (örnegin Charles River, Lonza)
gibi baska E. coli suslarindan üretilen tedarikçiye özgü,
yüksek düzeyde saflastirilmis endotoksin preparatlaridir.
Tedarikçiler kendi takdirlerine bagli olarak insan serum
albümini, PEG veya nisasta gibi stabilizörler ilave edebilir.
CSE'ler, amaçlanan kullanimlarina bagli olarak çesitli
konsantrasyonlarda tedarik edilir.
Bir antikor içeren bir numunede bir endotoksinin
belirlenmesine (yani saptanmasina ve/veya tayin edilmesine)
yönelik burada saglanan yöntemin veya bir antikor içeren bir
numunenin hazirlanmasina yönelik burada saglanan yöntemin
avantajli etkisi, LAL analizinde LER etkisinin üstesinden
gelmesidir. Dolayisiyla, bir yönü itibariyla tarifname, burada
saglanan numune hazirlama yönteminin veya burada saglanan
endotoksin belirleme yönteminin, bir LAL analizinde bakteriyel
endotoksin tayininde LER etkisini asmaya yönelik kullanimi ile
Daha özel bir ifadeyle, burada saglanan numune hazirlama
yönteminin veya burada saglanan endotoksin belirleme
yönteminin avantajli etkisi, bu yöntemlerin, bir LER. etkisi
sergileyen bir antikor içeren numuneyi, enzimatik LAL
kaskatinda faktör C'ye karsi reaktif hale getirmektir.
Dolayisiyla, bir yönü itibariyla tarifname, burada saglanan
numune hazirlama yönteminin veya burada saglanan endotoksin
belirleme yönteminin, bir LER etkisi sergileyen bir antikor
içeren numuneyi enzimatik LAL kaskatinda faktör C'ye karsi
reaktif hale getirmeye yönelik kullanimi ile ilgilidir.
Burada özellikle "bir bakteriyel endotoksinin belirlenmesi"
baglaminda kullanilan "belirlemek" terimi veya dilbilgisel
varyasyonlari, bir endotoksinin saptanmasi ve/veya tayin
edilmesi ve tercihen bir endotoksinin saptanmasi ve tayin
edilmesi ile ilgilidir. Mevcut tarifname baglaminda,
endotoksin (örnegin CSE gibi bir E. 0011 endotoksini) tercihen
Burada kullanilan "bakteriyel endotoksin testi" terimi, Gram-
negatif bakterilere ait endotoksinleri saptamaya veya tayin
etmeye yönelik bir grup testi ifade eder. BET, kompendial
(yani bir standart olarak islev gören bir kompendium, örnegin
Avrupa veya ABD Farmakopesi veya diger ulusal veya
uluslararasi farmasötik standartlari ile ilgili) LAL analizini
(limulous amebosit lizat analizi) tasvir eder. Ayrica,
tarifname baglaminda LAL analizinde test edilecek numunenin pH
seviyesinin 5.7-8.0, tercihen 6.0-8.0, daha çok tercih
edildigi haliyle 6.5-7.5 olmasi tercih edilir.
insan ve hayvanlara yönelik parenteral ilaçlar, biyolojik
ürünler ve tibbi cihazlar için bir in vitro endotoksin testini
ifade eder. Daha özel bir ifadeyle, LAL analizi, at nali
yengecinden (Limulus _poliphemus veya Tachypleus tridentatus)
elde edilen amebosit lizatini kullanarak Gram-negatif
bakterilere ait endotoksinlerin saptamaya ve tayin etmeye
yönelik bir testtir. Örnegin bakteri hücresi çogalmasi, hücre
bölünmesi, bitki örtüsü kurumasi ve hücre lizizi esnasinda
bakteri hücresi yüzeyinde kontrolsüz ve spesifik olmayan bir
sekilde LPS molekülleri salinir. Salinan LPS etkili bir
bakteriyel toksindir ve Öncelikli olarak Gram-negatif
bakterilerden kaynaklanan agir enfeksiyonlarin toksik
belirtilerinden ve zararli etkilerinden (örnegin yüksek ates,
hipotansiyon ve tersinmez sok) sorumludur (Rietschel, 1994,
FASEB J. 8:217-225). Bu biyolojik LPS aktivitesinden lipit A
bileseni sorumludur. LPS, seyreltik tuz solüsyonlarinda,
makromoleküler agregalar (miseller) olusturur. Bu misellerin
olusumu, boyutu ve dinamikleri, LPS konsantrasyonu, çesitli
fizikokimyasal parametreler (örnegin sicaklik, tampon
konsantrasyonu (iyon siddeti) ve pH) ve ayrica lipit A'nin
çekirdek oligosakkariti olan 0 zincirinin yapisiyla
iliskilidir (Aurell, 1998, Biochem. Biophys. Res. Comm.
253zll9-123). Tüm Gram-negatif bakteriler arasinda yüksek
düzeyde korunan LPS lipit A kismi LAL analizinde LPS
molekülünün taninan kismidir, dolayisiyla bu test, çok çesitli
Gram-negatif bakteri kaynaklarina bagli endotoksin
kontaminasyonunu incelemek için altin standarttir ve uygun bir
LAL analizinin ilkeleri asagida tarif edilmektedir. LAL
analizinde LPS tayini, LAL jellesmesi üzerinden yapilir.
LPS'nin bu LAL aktiflestirici aktivitesi çesitli faktörlerden
etkilenir:
- LPS-LPS agregalarinin olusumu [Akama, 1984, In "Bacterial
Endotoxin" (Eds. J. Y. Homma, S. Kanegasaki, O. Lüderitz,
T. Shiba ve O. Westphal], Publisher Chemie)10
- Örnegin insan lipoproteinleri Apo A 1, lizozom, ribonükleaz
A veya insan lgG ile protein-LPS agregalarinin olusumu
Anal. Biochem. 259z42-47)
- LPS'yi bakteri hücrelerinden özütleme yöntemi [Galanos,
1984, "Bacterial Endotoxin" (Eds. J. Y. Homma, S.
Kanegasaki, O. Lüderitz, T. Shiba ve O. Westphal),
Publisher Chemie]
- bakteri türleri; Enterobacteriaceae ailesinde LAL
aktiflestirici aktivite 1000 kat kadar degiskenlik gösterir
Kanegasaki, O. Lüderitz, T. Shiba ve O. Westphal),
Publisher Chemie].
LAL analizi ABD (US), Avrupa (EP) ve Japonya (JP)
farmakopeleri arasinda uyumludur. Uyumlu farmakope
bölümlerinde (USP <85>, Ph. Eur. 2.6.14. ve JP 4.01) LAL
analizi için üç teknik tarif edilir:
- jel-pihti teknigi (endotoksin ile uyarilan jellesmeyi esas
- türbümetrik teknik (jellesme ile uyarilan bulanikligi esas
- kromojenik teknik (bir sentetik peptit-kromojen kompleksi
ayrildiktan sonra renklenmeyi esas alir).
Bu üç teknik, 6 farkli yöntemde uygulanir:
Yöntem A: jel-pihti yöntemi, sinir testi
Yöntem B: jel-pihti yöntemi, yari nicel test
Yöntem C: kinetik türbümetrik yöntem
Yöntem D: kinetik kromojenik yöntem
Yöntem E: kromojenik sonlanim noktasi yöntemi
Yöntem F: türbümetrik sonlanim noktasi yöntemi
Ph. Eur./USP/JP uyarinca bu alti yöntem esdeger olarak kabul
Mevcut tarifnamenin öncelikli bir yönü, burada saglanan numune
hazirlama yöntemi ve burada saglanan endotoksin belirleme
yöntemi ile ilgili olup, burada numunede bakteriyel endotoksin
tayini için kinetik kromojenik yöntem veya kinetik türbümetrik
yöntem kullanilir. Burada saglanan numune hazirlama yönteminde
ve endotoksin belirleme yönteminde en çok tercih edildigi
haliyle kinetik kromojenik yöntem kullanilir. Bu teknikte
endotoksin fotometrik olarak saptanabilir. Bu teknik,
endotoksinlerin LAL ile reaksiyona girmesi sonucunda bir
kromojenik substrattan (yani uygun bir kromojenik peptitten)
salinan kromoforu ölçmeye yönelik bir analizdir. Kinetik
kromojenik. analiz, reaksiyon karisiminin önceden belirlenmis
bir sogurum degerine ulasmasi için gereken süreyi (baslangiç
süresi) veya renk gelisiui hizini ölçmeye yönelik bir
yöntemdir. Test, lizat üreticisi tarafindan önerilen
inkübasyon sicakliginda (genellikle 37 ± l°C)
gerçeklestirilir. Örnegin, kinetik kromojenik LAL analizini
gerçeklestirmek için, bir numune, LAL içeren bir reaktif ve
bir kromojenik substrat (yani Ac-Ile-Glu-Ala-Arg-pNA gibi
uygun bir kromojenik peptit) ile karistirilabilir ve bir
inkübasyon plak okuyucuya yerlestirilebilir. Akabinde numune
zaman içerisinde bir renk (örnegin sari renk) olusumu için
izlenir. Bir renk olusumu için gereken süre (reaksiyon
süresi), mevcut endotoksin miktari ile ters orantilidir. Yani
çokr miktarda, endotoksin varliginda, reaksiyon hizli
gerçeklesir; az miktarda endotoksin varliginda reaksiyon
süresi uzar. Bilinmeyen numunelerde endotoksin konsantrasyonu
bir standart egrisinden hesaplanabilir. LAL analizinde, yani
burada saglanan endotoksin belirleme yönteminin (d) adiminda,
endotoksin tayini tercihen en az iki büyüklük kertesi
araligini kapsayan bir standart kalibrasyon egrisi
üzerinden gerçeklestirilir.
Örnegin kinetik kromojenik LAL tekniginde asagidaki
reaksiyonlar gerçeklesebilir. Gram negatif bakteriyel
endotoksin, LAL'de bir proenzimin aktivasyonunu
katalizleyebilir. Baslangiç aktivasyon hizi, mevcut endotoksin
konsantrasyonu ile belirlenir. Aktiflesen enzim, renksiz Ac-
ayrilmasini katalizler. Salinan pNA fotometrik olarak 405
nm'de inkübasyon süresi boyunca kesintisiz sekilde ölçülür.
Bir numunedeki endotoksin konsantrasyonu, numunenin reaksiyon
süresinin, bilinen miktarlarda endotoksin standardi içeren
solüsyonlarin reaksiyon süresi ile karsilastirilmasi yoluyla
hesaplanir. LAL analizi için üretici firmanin talimatlari
dogrultusunda "Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Kinetic-QCLM"
kite dahil edilen endotoksinin kullanilmasi öngörülür (örnegin
kitine dahil edilen E. coli 055:B5 Endotoksini).
Tarifname baglaminda LAL analizinde test edilecek numunenin pH
seviyesinin 5.7-9.0 olmasi tercih edilir. LAL analizinde test
edilecek numunenin pH seviyesi daha çok tercih edildigi
haliyle 5.8-8.0, daha da çok tercih edildigi haliyle 5.8-7.5
ve daha da çok tercih edildigi haliyle 5.8-7.0'dir. LAL
analizinde test edilecek numunenin pH seviyesi en çok tercih
edildigi haliyle 5.8-7.0'dir. LAL analizinde test edilecek
Dolayisiyla, tarifname baglaminda, LAL analizinden önce test
solüsyonunun (yani bir çözünmüs kati numune veya sivi numune)
pH seviyesinin 5.7-8.0 araliginda ve daha çok tercih edildigi
haliyle 5.8 ila 7.0 araliginda ayarlanmasi öngörülür. pH
seviyesi gerektiginde örnegin seyreltme, tamponlar ilavesi
ve/veya nötrlestirme yoluyla ayarlanabilir.
Birtakim maddeler (örnegin ß-glukanlar) LAL testine bir
dereceye kadar müdahale eder (burada su numuneleri iyi bilinen
bir istisnadir). Müdahale, LAL analizinin hassasiyetini
düsürme veya artirma seklinde olabilir. Daha özel bir
ifadeyle, müdahale faktörleri, LAL testinde saglanan LPS
tayininin hassasiyetini ve dolayisiyla endotoksin tayininin
hassasiyetini düsürebilir veya artirabilir. Dolayisiyla,
burada saglanan endotoksin belirleme yönteminin (d) adiminda
PPC geri kazanimi %50-200'lük kabul edilebilir aralikta
degilse müdahale faktörü uzaklastirilmalidir. Bu, burada
saglanan yöntemin (b) adiminda numunenin seyreltilmesi yoluyla
gerçeklestirilebilir. Daha özel bir ifadeyle numune,
endotoksinsiz su veya endotoksinsiz tampon (tercihen Tris/HCl
tamponu (pH ~ 7.0)) ile seyreltilebilir. Hassasiyet
düsüsüne/artisina yol açmayan en düsük numune seyreltme orani
(en yüksek ürün konsantrasyonu), "müdahaleci olmayan
konsantrasyon (NIC)" olarak adlandirilir. Ancak numune
seyreltiminde MVD oraninin (Maksimum Geçerli Seyreltme Orani =
bir numunede bir endotoksin sinirinin belirlenebilmesini
saglayan olasi Inaksimuni seyreltme orani) asilmamasi gerekir.
Daha özel bir ifadeyle, farkli partilerin test sonuçlarina
dayanarak, tüm partileri kapsayan bir numune seyreltme orani
(geçerlenmis numune seyreltme orani veya numune
konsantrasyonu) seçilir. Ya da baska bir ifadeyle, burada
saglanan yöntemlerin (b) adiminda PPC'de %50-200'lük bir geri
kazanim ile sonuçlanan numune seyreltme orani seçilir. Seçilen
islemin endotoksin kaybi olmadan (yani LER etkisi
sergilemeden) müdahaleyi etkili bir sekilde elimine ettigini
belirlemek. için, tanimli bir konsantrasyonda endotoksin
katkili bir numune (yani bir PPC) ile "Müdahaleci Faktör
Testi" gerçeklestirilebilir.
Dolayisiyla, bir yönü itibariyla tarifname, burada saglanan
endotoksin belirleme yöntemi ile ilgili olup, burada, burada
saglanan endotoksin belirleme yönteminin (d) adiminda bir PPC
hazirlanir ve endotoksin için test edilir. Katilmis endotoksin
kontrol standardinin geri kazanimi %50-200 arasindaysa numune
müdahaleci faktörlerden arindirilmistir.
USP/Ph. Eur./JP uyarinca BET, her bir test sonucunun ayri
olarak degerlendirilmesini saglayan bir dahili kontrol (PPC)
içerdiginden, dogru endotoksin sonuçlari için USP/Ph. Eur./JP
uyarinca BET yönteminin geçerlenmesi bir ön gereklilik
degildir.
terimi ilgili alanda bilinir ve spesifik olarak bir polisorbat
arti sitrat veya fosfat kombinasyonundan kaynaklanan
endotoksin maskelenme olayini tarif eder (Chen, J. ve
maskelenme olayi ayrica herhangi bir diger tampon bileseninden
ya da bunlarin kombinasyonlarindan kaynaklanabilir. Belirli
bir materyalin (örnegin bir tampon veya bir terapötik antikor
numunesi) LER etkisi sergiledigini belirlemek için, endotoksin
içerikleri örnegin bir endotoksin bekleme süresi çalismasinda
belirli bir süre boyunca izlenebilir. Endotoksin bekleme
süresi çalismalari, bir seyreltilmemis numuneye endotoksin
katilmasini ve endotoksin katkili numunenin bir süreligine
saklanmasini gerektirir. Numune örnegin birkaç ay
saklanabilir. Bir bekleme süresi çalismasinda endotoksin
katkili numune tercihen birkaç (örnegin 7 ila 28) gün saklanir
ve belirli zaman noktalarinda bir LAL analizi
gerçeklestirilir. Katkili endotoksin miktarinin %50'sinden
düsük. geri kazanim oranlari numunenin bir LER etkisi
sergiledigini gösterir. Endotoksin geri kazanimi %50'den
düsükse, ancak son zaman noktalarinda gözlenmiyorsa ve sadece
orta zaman noktalarinin herhangi birinde meydana geliyorsa,
test numunesi, bir maskeleme etkisi sergiledigi yönünde
yorumlanamaz.
LER olayi son yillarda FDA tarafindan iyice kabul görmüstür ve
bununla ilgili bir yönerge yayimlanmistir (bkz. Hughes, P., ve
ark., BioPharm. Asia March/April 2015, 14-25). Bu yönergede,
seyreltilmemis numuneye önceden tanimli bir miktarda CSE
katildiginda (örnegin farmasötik numunelerde
endotoksin geri kazaniminin kabul edilebilir sinirlari %50 ila
sergilemesi halinde, katkili endotoksinin geri kazanim orani,
toplam katkili endotoksin miktarinin %50'sinden düsüktür.
Burada saglanan yöntemlerde numune bir antikor, tercihen bir
monoklonal antikor ihtiva eder. Burada birbirlerinin yerine
kullanilan "numune", "test edilecek numune", "bir antikor
içeren numune" ve "bir antikor içeren test edilecek numune“
terimleri, endotoksin varligi ve/veya miktari için test
edilecek bir antikor içeren belirli bir Hdktar siviyi ifade
eder. Ya da baska bir ifadeyle, burada birbirlerinin yerine
kullanilan "numune", "test edilecek numune", "bir antikor
içeren numune" ve "bir antikor içeren test edilecek numune"
terimleri, endotoksin varligi ve/veya miktari (tercihen
varligi ve miktari) için test edilecek bir sivi ile
baglantilidir, burada söz konusu sivi bir antikor içerir. Söz
konusu "bir antikor içeren test edilecek numune" tercihen bir
terapötik antikor numunesidir. "Terapötik antikor" terimi, bir
insanda kullanilmasi amaçlanan herhangi bir antikor preparati
ile baglantilidir. Antikor (örnegin terapötik antikor)
tercihen polisorbat 80 veya sodyum sitrat tamponuyla ve daha
çok tercih edildigi haliyle polisorbat 80 ve sodyum sitrat
tamponuyla birlikte formüle edilir. Antikor en çok tercih
edildigi haliyle yaklasik 25 mM sodyum sitrat tamponu ve
yaklasik 700 mg/L polisorbat 80 ile birlikte formüle edilir ve
yaklasik 6.5'lik bir pH seviyesine sahiptir. Mevcut tarifname
baglaminda söz konusu antikorun (örnegin terapötik antikorun)
bir monoklonal antikor olmasi tercih edilir. Söz konusu
antikor (örnegin terapötik antikor) en çok tercih edildigi
haliyle anti-CD20 rituksimab antikorudur. Dolayisiyla,
tarifname baglaminda numune, bir MabThera®/Rituxan®/Zytux®
numunesi olabilir. Tarifname baglaminda test edilecek
numunenin (yani bir antikor içeren test edilecek. numunenin)
LER etkisi sergilemesi öngörülür.
Burada "antikor" terimi en genis anlamda kullanilir ve
spesifik olarak saglam monoklonal antikorlari, poliklonal
antikorlari, en az iki saglam antikordan olusan multispesifik
antikorlari (örnegin bispesifik antikorlar) ve arzu edilen
biyolojik aktiviteyi sergiledikleri sürece antikor
fragmanlarini kapsar. Ayrica insan kökenli, hümanize, kamelize
veya CDR asili antikorlar da kapsama girer.
Burada kullanildigi haliyle, "monoklonal antikor" terimi,
esasen türdes antikorlardan olusan bir antikor popülasyonundan
elde edilen bir antikoru ifade eder, yani antikor
popülasyonuna ait ayri antikorlar, dogal yoldan meydana gelen
ve az miktarlarda bulunabilen, mutasyonlar disinda özdestir.
Monoklonal antikorlar yüksek düzeyde spesifiktir* ve tek› bir
antijenik bölgeye yönlendirilmistir. Ayrica, farkli
determinantlara (epitoplara) yönlendirilmis farkli antikorlar
ihtiva eden poliklonal antikor preparatlarinin aksine, her bir
monoklonal antikor, antijen üzerinde tek bir determinanta
yönlendirilmis haldedir. Monoklonal antikorlarin spesifiteleri
disinda bir diger avantaji, diger immünglobülinler ile
kontamine olmamis halde sentezlenebilmeleridir. Niteleyici
antikor` popülasyonundan elde edilen antikorun bu karakterini
ifade eder` ve ilgili antikorun belirli bir üretini yöntemini
gerektirdigi yönünde yorumlanmamalidir. Örneginr burada tarif
edilen yöntemlerde numuneye dahil edilen monoklonal
antikorlar, ilk olarak Kohler, G. ve ark., Nature 256 (1975)
495 tarafindan tarif edilen hibridoma yöntemiyle ya da
rekombinant DNA yöntemleriyle (bkz. mesela U.S. Patent No.
4,816,567) üretilebilir.
Burada tarif edilen monoklonal antikorlar tercihen bir konakçi
hücrede ve en çok tercih edildigi haliyle bir Çin hamsteri
over (CHO) hücresinde ekspresyon yoluyla üretilir. Üretim
için, antikorun VL'sini içeren bir amino asit sekansina
ve/veya antikorun VH'sini içeren bir amino asit sekansina
(örnegin antikorun hafif ve/veya agir Zincirlerini içeren bir
amino asit sekansina) sahip bir antikoru. kodlayan bir izole
nükleik asit, bir veya daha fazla vektöre (örnegin ekspresyon
vektörüne) yerlestirilir. Bunlar konakçi hücreye dahil edilir.
Konakçi hücre sunlari içerir (örnegin sunlarla transforme
edilmis haldedir): (l) antikorun VL'sini içeren bir amino asit
sekansini ve antikorun VH'sini içeren bir amino asit sekansi
kodlayan bir nükleik aside sahip bir vektör veya (2) antikorun
VL'sini içeren bir amino asit sekansini kodlayan bir nükleik
aside sahip bir birinci vektör ve antikorun VH'sini içeren bir
amino asit sekansini kodlayan bir nükleik aside sahip ikinci
bir vektör. Konakçi hücre ökaryotik olabilir, örnegin bir Çin
Hamsteri Over (CHO) hücresi veya lenfatik hücre (örnegin YO,
NSO, Sp2O hücresi) olabilir.
Rekombinant antikor üretimi için, örnegin yukarida tarif
edildigi üzere antikoru kodlayan nükleik asit izole edilir ve
sonrasinda bir konakçi hücrede klonlama ve/veya ekspresyon
için bir veya daha fazla vektöre yerlestirilir. Bu nükleik
asit, konvansiyonel prosedürler üzerinden (mesela antikorun
agir* ve hafif Zincirlerini kodlayan genlere spesifik olarak
baglanabilen oligonükleotit problari kullanilarak) kolayca
izole edilebilir ve sekanslanabilir.
Antikor kodlayici vektörlerin klonlanmasi veya ekspresyonu
için uygun konakçi hücreler, burada tarif edilen prokaryotik
veya ökaryotik hücreleri kapsar. Antikorlar örnegin özellikle
glikosilasyon ve Pc efektör fonksiyonunun gerekli olmadigi
durumlarda bakterilerde üretilebilir. Antikor fragmanlarinin
ve polipeptitlerin bakterilerde ekspresyonu için bkz. örnegin
antikor fragmanlarinin E. coli'de ekspresyonunu tarif eden
Charlton, K.A., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo,
Ekspresyondan sonra antikor bir çözünür fraksiyonda bakteri
hücresi macunundan izole edilebilir ve akabinde
saflastirilabilir.
Prokaryotlarin yani sira, antikor kodlayici vektörler için
klonlama veya ekspresyon konakçilari olarak, kismen veya
tamamen insan glikosilasyon paternine sahip bir antikorun
üretilmesini saglayan glikosilasyon yolaklari "hümanize"
edilmis mantar ve maya suslari da dahil olmak üzere filamentöz
mantarlar veya mayalar gibi ökaryotik mikroplar da uygundur.
Glikosile antikor ekspresyonuna yönelik uygun konakçi hücreler
ayrica çok hücreli organizmalardan (omurgasizlar ve
omurgalilar) türetilebilir. Omurgasiz hücrelerinin örnekleri
bitki ve böcek hücrelerini kapsar. Özellikle Spodoptera
frugiperda hücrelerinin transfeksiyonunda böcek hücreleriyle
birlikte kullanilabilecek çok sayida bakulovirüs susu
belirlenmistir.
Konakçi olarak bitki hücresi kültürleri de kullanilabilir.
üretimine yönelik PLANTIBODIESTM teknolojisini açiklar).
Konakçi olarak omurgali hücreler de kullanilabilir. Örnegin
süspansiyonda büyüyecek sekilde uyarlanan memeli hücre
dizileri faydali olabilir. Faydali memeli konakçi hücre
dizilerinin diger örnekleri, SV40 ile transforme edilmis
maymun böbrek CVl dizisi (COS-7); insan embriyonik böbrek
dizisi (örnegin Graham, F.L. ve ark., J. Gen Virol. 36 (1977)
bebek hamster böbrek hücreleri (BHK): fare sertoli hücreleri
referansli yayinda tarif edilen TM4 hücreleri); maymun böbrek
hücreleri (CV1); Afrika yesil maymun böbrek hücreleri (VERO-
76); insan serviks karsinomu. hücreleri (HELA); kanin böbrek
hücreleri (MDCK); bufalo siçan karaciger hücreleri (BRL 3A);
insan akciger hücreleri (W138): insan karaciger hücreleri (Hep
G2); fare meme tümörü (MMT 060562): örnegin Mather, J.P. ve
yayinda tarif' edilen TRI hücreleri; MRC 5 hücreleri ve FS4
hücrelerini kapsar. Diger faydali memeli konakçi hücre
dizileri sunlari içerir: Çin hamsteri over (CHO) hücreleri,
örnegin. DHFR-CHO hücreleri (Urlaub, G. ve ark., Proc. Natl.
örnegin YO, N80 ve Sp2/O. Antikor üretimi için uygun belirli
memeli konakçi hücre dizileri ile ilgili bir inceleme için
bkz. örnegin Yazaki, P. ve Wu, A.M., Methods in Molecular
Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ
domenlerinden olusan bir monovalan fragman olan bir Fab
fragmani; (ii) mentese bölgesinde bir disülfit köprüsü
üzerinden birbirine bagli iki Fab fragmani içeren bir bivalan
fragman olan bir F(ab')2 fragmani; (iii) VH ve CH1
domenlerinden olusan bir Fd fragmani; (iv) bir antikorun tek
bir koluna ait VL ve VH domenlerinden olusan bir FV fragmani,
(V) bir VH domeninden olusan bir dAb fragmani (Ward; 1989;
Nature 341; 544-546) ve (Vi) bir izole komplementerlik
belirleyici bölge (CDR) içeren veya alternatif olarak
bunlardan olusan antijen baglayici kisimlari, yani bir
antijene (örnegin CDZO) baglanma kapasitesini koruyan "antijen
baglanma bölgelerini" (örnegin fragmanlar, alt sekanslar,
komplementerlik belirleyici bölgeler (CDR'ler)) kapsar.
Antikor fragmanlari veya türevleri ilaveten F(ab')2, FV veya
scFv fragmanlarini veya tek Zincirli antikorlari içerir.
Burada saglanan yöntemlerde antikor (yani numuneye dahil
edilen antikor) tercihen rituksimab olmaktadir.
CDZO proteinine yönelik bir kimerik monoklonal antikoru ifade
eder. CDZO, kanserli ve normal B hücrelerinin yüzeyinde
bulunur. Rituksimab 13 hücrelerini tahrip eder NK: dolayisiyla
örnegin asiri miktarda B hücreleri, asiri aktif B hücreleri
veya fonksiyon bozuklugu sergileyen B hücreleri ile
karakterize hastaliklari tedavi etmek için kullanilir. Bunlar
birtakim lenfomalari, lösemileri, transplant rejeksiyonunu ve
otoimmün bozukluklari kapsar. Rituksimab örnegin kronik
lenfositik lösemide bir subkütanöz formülasyon olarak
kullanilir. Ancak rituksimab genellikle intravenöz infüzyon
yoluyla verilir. Kemik iligindeki kök hücrelerin CDZO
proteinine sahip olmamasi, B hücrelerinin rituksimab
tedavisinden sonra tekrar yerlesmesini saglar. Burada
kullanildigi. haliyle, "rituksimab" terimi ayrica. ABD, .Avrupa
ve Japonya'dan olusan ülke grubundan seçilen bir ülkede veya
bölgede bir pazarlama yetkisi elde etmeye yönelik
gereksinimleri karsilayan tüm anti-CDZO antikorlari veya anti-
CDZO antikor fragmanlarini kapsar. "Rituksimab" terimi, en çok
tercih edildigi haliyle, sirasiyla SEQ ID NOlar: 1 ve 2 ile
gösterilen agir ve hafif zincir amino asit sekanslarina sahip
bir antikoru ifade eder. Ilgili alanin uzmanlari bir kodlayici
nükleik asit sekansinin belirli bir amino asit sekansindan
nasil elde edilecegini bilir. Dolayisiyla, SEQ ID NOlar: 1 ve10
2 bilindiginde, rituksimab için kodlayici nükleik asit
sekanslari kolayca elde edilebilir.
bir farmasötik formülasyonu ifade eder. Epoetin beta, dogal
yoldan meydana gelen eritropoietin hormonunun sentetik bir
versiyonudur. Eritropoietin saglikli böbreklerde üretilir 've
kemik iligini vücutta oksijen tasiyan kirmizi kan hücreleri
üretmek üzere uyarir. Epoetin beta ayrica belirli kanser
türlerine sahip kemoterapi gören insanlarda semptomatik anemi
tedavisinde kullanilir. Kemoterapinin yan etkilerinden biri,
kanser hücrelerinin yani sira saglikli kan hücrelerini de
öldürmesidir. Epoetin enjeksiyonlari kirmizi kan hücre
üretimini artirir ve anemi semptomlarinin hafiflemesine
yardimci olur. Epoetin kan hücresi üretimini artirdigindan,
epoetin alan insanlardan daha büyük hacimde kan alinabilir ve
bu kan, cerrahi müdahale esnasinda veya cerrahi müdahaleden
sonra transfüzyon için saklanabilir.
Burada saglanan numune hazirlama veya endotoksin belirleme
yönteminin (d) adiminda, numune (yani bir antikor içeren
numune) bir endotoksinsiz sulu solüsyona karsi diyaliz edilir,
burada numune 5.7 ila 8.0 araliginda (tercihen 6.0 ila 8.0
araliginda ve daha çok tercih edildigi haliyle 6.5 ila 7.5
araliginda) bir pH seviyesine sahiptir. Biyokimyada diyaliz,
solüsyondaki molekülleri bir yari geçirgen membrandan, örnegin
diyaliz borusundan difüzyon hizlarindaki farka göre ayirmak
için yaygin olarak kullanilan bir prosestir. Diyaliz, tibbi
diyaliz ile ayni ilkeye göre çalisan yaygin bir laboratuar
teknigidir. Canli biliminde arastirma baglaminda, en yaygin
diyaliz uygulamasi, tuzlar, indirgen maddeler veya boyalar
gibi istenmeyen küçük moleküllerin antikorlar gibi daha büyük
makromoleküllerden uzaklastirilmasidir. Diyaliz ayrica tampon
degistirme ve ilaç baglanma çalismalarinda yaygin olarak
kullanilir.
Difüzyon, solüsyondaki moleküllerin dengeye ulasan kadar daha
yüksek konsantrasyonlu bir alandan daha düsük konsantrasyonlu
bir alana net hareketi ile sonuçlanan rastgele termal
harekettir (Brown hareketi). Diyalizde bir numune ve bir
tampon solüsyonu (diyalizat olarak adlandirilir), ayrimsal
difüzyon paternlerine neden olan ve böylece hem numunedeki hem
de diyalizattaki moleküllerin ayrilmasini saglayan bir yari
geçirgen membranla ayrilir. Membranin gözenek boyutundan
dolayi numunedeki büyük. moleküller (örnegin antikorlar)
membrandan geçemez ve sonuç olarak numune haznesinden
difüzyonlari kisitlanir. Öte yandan, küçük moleküller (örnegin
bir Na-sitrat tamponunun bilesenleri) membrandan serbestçe
difüzyona. ugrayabilir ve tüm. solüsyon hacmi boyunca dengeye
ulasabilir, böylece bu moleküllerin numune ve diyalizat
içindeki genel konsantrasyonu degisir. Dengeye ulasildiginda,
moleküllerin nihai konsantrasyonu, dahil edilen solüsyonlarin
hacimlerine baglidir ve dengelenen diyalizatin taze
diyalizatla (bkz. asagidaki prosedür) ikame edildigi (veya
degistirildigi) durumlarda difüzyon küçük moleküllerin
numunedeki konsantrasyonunu daha da düsürecektir.
Örnegin Na-sitrat tamponunu numuneden (yani bir antikor içeren
numuneden) uzaklastirmaya yönelik asagidaki diyaliz prosedürü
kullanilabilir:
l. 10 kDa'lik bir molekül agirligi esik degerine sahip bir
membranin elde edilmesi ve yikanmasi
2. Numunenin diyaliz borusuna, kasetine veya aletine
yüklenmesi
3. Numunenin diyalizat içeren bir harici hazneye
yerlestirilmesi (tamponun karistirilmasi)
4. oda sicakliginda 24 saat diyaliz edilmesi; bu 24 saat
boyunca suyun iki kere degistirilmesi. Uygun hacimde
diyalizat kullanimi ve çoklu tampon ikameleri sayesinde,
numunedeki sodyum sitrat tamponu konsantrasyonu ihmal
edilebilir düzeylere (yani baslangiçtaki içerigin %1-
2'sine) düsürülebilir.
Mevcut tarifname asagidaki sinirlandirici olmayan sekillere ve
örneklere basvurmak suretiyle daha ayrintili olarak tarif
edilecektir. Sekillerde ve ayrica Örneklerde tarif edilen
deneylerin çogu belirli numaralarla gösterilir. Örnegin
ve/veya formüle edilmis rituksimab plasebosu ile
gerçeklestirildigini ve "117" referans numarasina sahip
oldugunu belirtir.
Sekillerin Açiklamasi
Fosfat ve polisorbat 20 içeren NeoRecormon® formülasyonunun
12-16 kDa'lik bir MWCO degerine sahip bir membran ile
diyalizinin zamana bagimliligi. Burada, oda sicakliginda
belirtilen sürede diyaliz, liyofilizasyon ve tartim
islemlerinden sonra elde edilen iç diyalizat agirligi
gösterilir. Gri sütunlarin üzerindeki veriler 2 ölçümün
ortalamasini (%) gösterir.
Fosfat ve polisorbat 20 içeren NeoRecormon® formülasyonunun,
diyalizden önce BSA (bovin serum albümin) muamelesine tabi
tutulan veya tutulmayan 12-16 kDa'lik bir MWCO degerine sahip
bir membran ile diyalizi. Burada, belirtilen süre sonunda elde
edilen iç diyalizatin fosfat (P) içerigi gösterilir. Soldaki
sütunlar, membranin diyalizden önce %O.2 BSA ile muamele
edildigi durumlar için P miktarini gösterir. Sagdaki sütunlar,
BSA. muamelesinin yapilmadigi durumlar için P iniktarina
karsilik gelir. Iç diyalizattan geri kazanilan fosfatin
3267) göre gerçeklestirilmistir.
LER etkisini asmaya yönelik protokolün numune olarak (A)
Rituksimab ve (B) Plasebo rituksimab ile gerçeklestirilmesi
yoluyla elde edilen geri kazanim oranlari (%). Sekillerde
frekansini ifade eder (yani "hizli dönüs", karistirici
frekansinin yüksek oldugu anlamina gelir). Bu örnek protokol
diger numunelerin, tercihen deterjan olarak sodyum sitrat
tamponu ve polisorbat 80 içeren numunelerin rutin kalite
kontrolü için de faydalidir.
LER etkisini asmaya. yönelik degistirilmis bir' protokolün 've
söz konusu protokolle elde edilen geri kazanim oranlarinin
sematik gösterimi. (A) Tarifnameye göre LER etkisini asmaya
yönelik (örnegin rituksimabda ve rituksimab plasebosunda) bir
protokolün sematik gösterimi. Ayrintili protokol Örnek 2.2'de
tarif edilir. Bu örnek. protokol diger numunelerin, tercihen
deterjan olarak sodyum sitrat tamponu ve polisorbat 80 içeren
numunelerin rutin kalite kontrolü için de faydalidir. (B)
gerçeklestirildikten sonra LER analiziyle elde edilen
rituksimab ve rituksimab plasebosu geri kazanim orani (%).
Daha fazla ayrinti için bkz. Örnek 2.2'de tarif edilen
protokol.
numune olarak Rituksimab ile gerçeklestirilmesi yoluyla elde
edilen geri kazanim oranlari (%).
Referans Örnegi 3'te tarif edilen protokolün numune olarak
Rituksimab ile gerçeklestirilmesi yoluyla elde edilen geri
kazanim oranlari (%). Referans Örnegi 2.2'de tarif edilen
protokolün gerçeklestirilmesi yoluyla elde edilen geri kazanim
oranlari [rituksimab 061].
Referans Örnegi 4'te tarif edilen protokolün numune olarak
Rituksimab ile gerçeklestirilmesi yoluyla elde edilen geri
kazanim oranlari (%). (A) Referans Örnegi 3.1'de tarif edilen
protokolün gerçeklestirilmesi yoluyla elde edilen geri kazanim
oranlari [rituksimab 062]. (B) Referans Örnegi 3.2'de tarif
edilen protokolün gerçeklestirilmesi yoluyla elde edilen geri
kazanim oranlari [rituksimab 063].
Referans Örnegi 5'te tarif edilen protokolün numune olarak
Rituksimab ile gerçeklestirilmesi yoluyla elde edilen geri
kazanim oranlari (%). (A) Referans Örnegi 4.1'de tarif edilen
protokolün gerçeklestirilmesi yoluyla elde edilen geri kazanim
oranlari [rituksimab 064]. (B) Referans Örnegi 4.2'de tarif
edilen protokolün gerçeklestirilmesi yoluyla elde edilen geri
kazanim oranlari [rituksimab 065].
Referans Örnegi 6'da tarif edilen protokolün numune olarak
rituksimab ve rituksimab plasebosu ile gerçeklestirilmesi
yoluyla elde edilen geri kazanim oranlari (%). [rituksimab
072].
Referans Örnegi 7'de tarif edilen protokolün numune olarak
rituksimab ve rituksimab plasebosu ile gerçeklestirilmesi
yoluyla elde edilen geri kazanim oranlari (%). (A) [rituksimab
079] inkübasyon yok; (B) [rituksimab 080] 4 saatlik10
inkübasyon; (C) [rituksimab 081] 1 günlük inkübasyon; (D)
Referans Örnegi 8'de tarif edilen LAL analizinin numune olarak
Rituksimab ile gerçeklestirilmesi yoluyla elde edilen geri
kazanim oranlari (%). (A) [rituksimab 002] farkli
seyreltilerle gerçeklestirilen LAL analizi; (B) [rituksimab
gerçeklestirilen LAL analizi.
Referans Örnegi 8'de tarif edilen LAL analizinin numune olarak
Rituksimab ile gerçeklestirilmesi yoluyla elde edilen geri
kazanim oranlari (%). Diyaliz ve seyreltme tek basina LER
etkisinin üstesinden gelemez [rituksimab 011].
LER etkisinin zamana bagimliligi. Sekil, Referans Örnegi l'de
tarif edilen katim. islemi ve LAL analizinin numune olarak
Rituksimab ile gerçeklestirilmesi yoluyla elde edilen geri
kazanim oranlarini (%) gösterir [rituksimab 027]. Katim
isleminden sonraki çalkalama süresi (yani 2 saniye ila 60
dakika) gösterilir.
Tampon sisteminin LER etkisi için önemi. Referans Örnegi lO'da
tarif edilen LAL analizinin gerçeklestirilmesi yoluyla elde
edilen geri kazanim oranlari (%) gösterilir. (A) numune olarak
Rituksimab 'veya sodyuni sitratin kullanildigi. ve seyreltmenin
1:2, l:5, 1:10 veya 1:20'lik bir oranda yapildigi LAL analizi
80 veya sodyum sitrat ve polisorbat 80'in kullanildigi ve
seyreltmenin 1:2, l:5 veya 1:10'luk bir oranda yapildigi LAL
analizi [rituksimab 029].
MgCLfnin LER etkisi için önemi. Referans Örnegi l3'te tarif
edilen LAL analizinin gerçeklestirilmesi yoluyla elde edilen
geri kazanim oranlari (%) gösterilir. (A) 10 mM'lik bir
konsantrasyonda MgClz ilavesi [rituksimab 030]; (B) 50 mM'lik
bir konsantrasyonda MgC12 ilavesi [rituksimab 031]; (C) 25
mM'lik bir konsantrasyonda MgC12 ilavesi [rituksimab 032]; (D)
75 mM'lik bir konsantrasyonda MgC12 ilavesi [rituksimab 033].
Mekanik islemlerin LER etkisi için önemi. Referans Örnegi
14'te tarif' edilen LAL analizinin gerçeklestirilmesi yoluyla
elde edilen geri kazanim oranlari (%) gösterilir [rituksimab
034]. Sekilde "çalkalama" ifadesi 60 dakikalik çalkalama
islemini ifade eder.
Asagidaki Örnekler, gerçek kapsami ekli istemlerde ifade
edilen mevcut bulusun anlasilmasini kolaylastirmak için
verilmistir.
Örnek 1: Teknik ekipman ve reaktifler
1. Teknik ekipman
1.1. Mikroplak okuyucu sistem (burada ayrica "okuyucu" olarak
- Infinite® 200 PRO, Çok Modlu Mikroplak Okuyucu; Tecan,
Isviçre / Tecan Deutschland GmbH, Almanya, P/N: 30050303.
° CostarTM Hücre Kültürü Plaklari, 96 Kuyulu, Fisher
Scientific, P/N: 07-200-89.10
.2. Çalkalama sistemi ve cam flakonlar
1.5 ml'lik Vida Kapakli Cam Flakonlar (N8): Macherey-Nagel
GmbH & Co. KG, Almanya, P/N: 702004 (100 adet).
N 23 PP 'vida kapakli, siyah, üstü kapali; Macherey-Nagel
GmbH & Co. KG, Almanya, P/N: 70250 (100 adet).
4 ml'lik Vida Kapakli Cam Flakonlar (N13); Macherey-Nagel
GmbH & Co. KG, Almanya, P/N: 702962 (100 adet).
N 13 PP vida kapakli, siyah, üstü kapali; Macherey-Nagel
GmbH & Co. KG, Almanya, P/N: 702051 (100 adet).
Diyaliz Ekipmani
SpinDIALYZERm, 1000 ul'lik hazne hacmi; Harvard Apparatus,
dagitimci: Hugo Sachs Elektronik Harvard Apparatus, GmbH,
Almanya, P/N SP1 74-0306 (5 adet). Not: Küllanilan Parti
Diyaliz araci, biyolojik numunelerin diyalizine yönelik
basit bir tek tarafli araçtir. 20 ul ila 5 ml araliginda
degisen numune hacimleri için çok çesitli diyaliz araci
boyutlari mevcuttur. 1 ml (burada kullanildigi uzere) için
Da araliginda degisir. Tüm ünite, neredeyse reaktif olmayan
bir materyal olan PTFE'den olusur.
ÄEEE SpinDIALYZER, 1000 ul'lik hazne hacmi, Harvard
Not: Iki tarafli membran sistemi, üst arti alt membran.
Diyaliz araci, yüksek numune geri kazanimina yönelik
PTFE'den mamul yeniden kullanilabilir bir numune haznesidir
ve daha da yüksek bir diyaliz hizi için daha büyük membran
yüzeyi alanlari saglamak üzere yeniden tasarlanmistir.
Ultra Hizli Diyaliz Araçlari, 50 ul ila 1500 ul'lik hacme10
sahiptir ve burada 1000 ul'lik hacim kullanilmistir. 1 ml
(burada kullanildigi üzere) için katalog no.: 74-0412.
Selüloz asetat membranlar, 500 Da'lik MWCO, Harvard
Apparatus, ABD, P/N: SP1 7425-CA500, yerel dagitimci: Hugo
Sachs Elektronik Harvard Apparatus GmbH, Almanya, P/N: SP1
7425-CA500.
Selüloz asetat membranlar, 10 kDa'lik MWCO, Harvard
Apparatus, ABD, P/N: SP1 7425-CA10K, yerel dagitimci: Hugo
Sachs Elektronik Harvard Apparatus GmbH, Almanya, P/N: SP1
7425-CA10K.
Not: Rituksimab ile gerçeklestirilen LER analizlerinde ve
ayrica NeoRecormonß ile gerçeklestirilen LER analizlerinde
500 Da'lik MWCO degerine sahip 'standart' membranlara ek
olarak test edilmistir.
Selüloz asetat membranlar, 25 kDa'lik MWCO, Harvard
Apparatus, ABD, P/N:SP1 7425-CA25K, yerel dagitimci: Hugo
Sachs Elektronik Harvard Apparatus GmbH, Almanya, P/N:SP1
7425-CA25K.
Not: Rituksimab ile gerçeklestirilen LER analizlerinde ve
ayrica NeoRecormon® ile gerçeklestirilen LER analizlerinde
500 Da'lik MWCO degerine sahip 'standart' membranlara ek
olarak test edilmistir.
Aqua B. Braun, steril pirojensiz su, 1 1, B. Braun
Melsungen AG, Almanya, P/N: 14090586.
Crystallizing Dishes, 900 ml, OMNILAB, Almanya, P/N:
5144008. (Not: Diyaliz .membranlarini durulamak için
kullanilir)
DURAN® Salterleri, uzun, 2000 ml, OMNILAB, Almanya, P/N:
5013163.
DURANQ Salterleri, uzun, 250 ml, OMNILAB, Almanya, P/N:
5013136.
.4. Rutin laboratuar ekipmanlari
Otoklavlama Sistemi (Not: Diyaliz haznelerinin
sterilizasyonunda kullanilir)
epT.I.P.S.® LoRetention-Reloads, PCR clean, 0.5-10 ul,
epT.I.P.S.® LoRetention-Reloads, PCR clean, 2-200 ul,
epT.I.P.S.® LoRetention-Reloads, PCR clean, 50-1000 ul,
Stripettes®, Ayri, 5 ml, Kagit/Plastik Ambalaj, Fisher
Scientific, P/N: 10420201.
2. Reaktifler
2. Kinetik kromojenik LAL analizleri ve LAL ile iliskili
reaktifler
650H (yani "Lonza kiti").
o K-QCL için endotoksin E. coli 055zB5; Lonza, Isviçre, P/N:
- Endotoksin E. coli 055:B5, 2.5 mg/flakon; Lonza, Isviçre,
o Reaktif LAL Suyu - 100 ml; Lonza, Isviçre, P/N: W50-lOO.
o MgClg, LAL ile kullanilmak 'üzere 10 rmw'likr solüsyon, 30
ml'lik flakon; Lonza, Isviçre, P/N: S50-64l.
° Tris tamponu, LAL ile kullanilmak üzere 50 mM'lik solüsyon,
ml'lik flakon; Lonza, Isviçre, P/N: 850-642.
2.2. Protein reaktifler
~ Albümin, bovin, fraksiyon V, çok düsük endotoksin içerigi,
yag asidi içermez, 25 g; Serva, Almanya, P/N: 47299.04.
° Albümin, insan serumu, fraksiyon V, yüksek saflik; 1 g;
Merck, Almanya, P/N: 126658-1GM.
3. Test edilen farmasötikler
Burada tarif edilen Örneklerde Rituksimab (içerir) ve
NeoRecormon® (epoetin-beta içerir) kullanilmistir. Bunlarin
yani sira, burada tarif edilen yöntemlerde ilgili Rituksimab
ve NeoRecormon® plasebolari uygulanmistir.
Ilgili numunenin plasebosu, terapötik etken madde içermemesi
disinda numune ile özdestir, yani rituksimab plasebosu,
rituksimab disinda formülasyonun diger tüm bilesenlerini
Örnek 2: LER etkisini asmaya yönelik yöntemler
Örnek 2.1: LER etkisini asmaya yönelik protokol
Bu Örnekte numune olarak rituksimab ve rituksimab plasebosu
kullanilmistir. Ancak, asagida ele alindigi üzere, burada
tarif edilen protokol, farmasötik antikorlarin tüm tipik
formülasyonlarinda LER etkisinin asilmasi için faydalidir.
Bu Örnekte kullanilan materyaller
- Membranlar:
° 10 kDa'lik selüloz asetat (CA) membranlar, Harvard
Apparatus, ABD, P/N:SPl 7425-CA10K
- Diyaliz araci:
° gggg› SpinDIALYZER, lOOO ul'lik hazne hacmi, Harvard
- Numune flakonlari:
° l.5 ml'lik Vida Kapakli Cam Flakonlar (N8); Macherey-
Nagel GmbH & Co. KG, Almanya, P/N: 702004
0 N 8 PP Vida kapakli, siyah, üstü kapali; Macherey-Nagel
GmbH & Co. KG, Almanya, P/N: 70250
- Kristallendirme kaplari:
- MgCl2 - stok solüsyon:
° Su içinde çözülmüs l hd MgCl2 (Analiz için› magnezyum
klorür heksahidrat, EMSURE®, ACS, ISO, Reag. Ph. Eur.,
- Tris Tamponu, LAL ile kullanilmak üzere (yani
endotoksinsiz) 50 mM'lik solüsyon, 30 ml'lik flakon; Lonza,
Isviçre, P/N: 850-642
- Numuneler:
° rituksimab plasebosu ve LAL suyu
Adim adim protokol:
Adim 1: Numunelerin hazirlanmasi
° 900 ul rituksimab plasebosu + 100 ul LAL suyu x 1
- 900 ul rituksimab plasebosu + 100 ul CSE x 1, konsantrasyon
50 EU/ml = nihai konsantrasyon 5.0 EU/ml
° lOOO pl LAL suyu x 1
° 900 ul LAL suyu + 100 ul CSE x 1, konsantrasyon 50 EU/ml =
nihai konsantrasyon 5.0 EU/ml
Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037
Adim 2: Diyaliz membraninin yikanmasi
0 On adet 10 kDa'lik selüloz asetat (CA) membran kullanilir
ve membranlar 300 ml Aqua Braun (yani damitik su, B. Braun,
Melsungen) ile birlikte kristallendirme kabina
yerlestirilir
- 1 saat çalkalanir (Shaker SG 20. IDL GmbH, Almanya veya
esdeger bir cihaz, 50 ila 300 rpm, tercihen 100 rpm)
° Membranlar taze Aqua Braun (yine 300 ml) ile birlikte yeni
bir kristallendirme kabina aktarilir
- 1 saat çalkalanir (Shaker SG 20. IDL GmbH, Almanya veya
esdeger bir cihaz, 50 ila 300 rpm, tercihen 100 rpm)
Adim 3: Yaklasik 50 mM'lik bir nihai MgC12 konsantrasyonunda
MgClz ilavesi
- Adim ldeki numunelere 50 in_ 1 M'lik MgClz stok solüsyonu
ilave edilir
° Numuneler 1 dakika Çalkalanir [oda sicakliginda bir
Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037
~ Numuneler oda sicakliginda 60 dakika inkübe edilir
Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037
Adim 4: Seyreltme
° 3. adimdaki numunelerden biri alinir ve tampon (pH ~ 7)
(yani 50 mM Tris/HCl tamponu (pH ~ 7)) ile 1:10 oraninda
seyreltilir
o 895 ul 50 mM'lik Tris tamponu + 105 ul numune
° Tekrarli bir tayin (yani iki kopya halinde tayin) için
ikiser kez gerçeklestirilir:
o Tris tamponu ile 1:10 oraninda seyreltilmis rituksimab
plasebosu x 2
o Tris tamponu ile 1:10 oraninda seyreltilmis rituksimab
plasebosu ( x 2
o Tris tamponu ile 1:10 oraninda seyreltilmis LAL suyu x
o Tris tamponu ile 1:10 oraninda seyreltilmis LAL suyu
Adim 5: Diyaliz
0 Tüm seyreltik numuneler 1 dakika çalkalanir [oda
sicakliginda bir Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda
yüksek hizda (2,037 rpm)],
- FastSpinDIALYZER aletine aktarilir
° Her bir salter (yani DURAN® salteri, uzun, 2000 m1,
OMNILAB, Almanya, P/N: 5013163) için bir diyaliz araci, bir
manyetik karistirici plaginin üzerine yerlestirilir.
Karistirici frekansi yuksek bir degere ayarlanir (yani
tercihen 200-300 rpm anlamina gelir. Karistirici, yaklasik
40 mm'lik bir uzunluga ve yaklasik 14 mm'lik bir çapa sahip
isiyla sterilize edilmis (250°C'de 4 saat) bir manyetik
karistiricidir.
° Saltere 200 ml Aqua Braun doldurulur
° 24 saat diyaliz edilir ve oda sicakliginda (21 ±2°C) 2 saat
ve 4 saat sonra Aqua Braun degistirilir
° Diyalizden sonra numune 1.5 ml'lik Vida kapakli yeni
flakonlara aktarilir
Adim 6: Çalkalama
- Numuneler 20 dakika çalkalanir [oda sicakliginda bir
Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037
Adim 7: Pozitif LER kontrolünün ve diger su kontrollerinin
hazirlanmasi
- Pozitif LER kontrolü diyaliz sonlanmadan 1 saat önce
hazirlanir
1. 900 ul rituksimab plasebosu + 100 ul LAL suyu
2. 900 ul rituksimab plasebosu + 100 ul CSE, konsantrasyon
50 EU/ml = nihai konsantrasyon 5.0 EU/ml
3. 1000 ul LAL suyu
4. 900 ul LAL suyu + 100 ul CSE konsantrasyon 50 EU/ml =
nihai konsantrasyon 5.0 EU/ml
. 1 saat çalkalanir [oda sicakliginda bir Heidolph Multi Reax
çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037 rpm)]
° Numuneler LAL suyu ile oraninda
seyreltilir
° 1 dakika çalkalanir [oda sicakliginda bir Heidolph Multi
Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037 rpm)]
Adim 8: LAL analizi
° Standart hazirlanir ve üretici firmanin talimatlarina göre
LAL analizi (Kinetik-QCLTM analizi; Lonza) baslatilir
Bulgular ve tartisma
Sekiller 3(A) (yani [rituksimab 117]) ve 3(B)'de (yani
yöntem LER etkisinin üstesinden gelebilir. Bunlarin yani sira,
bu yöntem kullanilarak, rituksimabta ve ayrica rituksimab
plasebosunda LER etkisi asilabilir. Bu, yukarida tarif edilen
protokolün belirli bir monoklonal antikor içeren bir
formülasyona bagimli olmadigini ve polisorbat 80 ve bir
kelatlayici tampon (örnegin sodyum. sitrat) içeren her
formülasyonda LER etkisini asmak için kullanilabilecegini
gösterir. Bu formülasyon antikorlar, özellikle monoklonal
antikorlar için tipiktir. Dolayisiyla, yukarida tarif edilen
yöntemin, her antikor formülasyonunda LER etkisinin
asilmasinda faydali olmasi beklenir.
Kelatlayici tamponlar (örnegin sodyum sitrat) içeren ve LER
etkisi sergileyen formülasyonlarda LAL reaktivitesini eski
haline getirmek için MgßJnin tercih edilen iki degerlikli
katyon oldugu bulunmustur.
Kelatlayici tamponu (örnegin Sodyum sitrat tamponunu)
uzaklastirmak için ikinci bir adimda (Mg2+ ilavesinden sonra)
diyaliz gerçeklestirilir. Diyaliz için tercih edilen ekipman
spinDIALYZERTM (Harvard) aletidir.
Deterjan (örnegin polisorbat 80) LER etkisinin ikinci
nedenidir. Genel olarak, bir biyolojik numunede deterjanlarin
(örnegin polisorbat 80) varligi, deterjanin kritik misel
konsantrasyonuna (CMC) (genellikle uM araligindadir)
ulasildiginda misel olusumuna yol açar. Miseller, LAL kaskati
reaksiyonunda birinci enzimi temsil eden bir serin proteaz
olan faktör C'nin LPS aracili aktivasyonunu. inhibe edebilir
antikor preparatlarinda, antikor için fonksiyonel bir
Çözünürlük saglamak amaciyla, seyreltilmemis numune genellikle
CMC'nin üstündedir. Burada incelenmis olan ürünlerde,
deterjanlarin CMC'si aslinda CMC seviyelerini asmistir
(polisorbat 80: 700 mg/l (50 kat fazlalik)), bu nedenle
polisorbat 80'in. miseller formunda. bulundugu varsayilmistir.
Yukarida tarif edilen protokolde deterjan konsantrasyonu,
deterjan konsantrasyonunun CMC degeri civarinda olmasini/CMC
degerinin altina düsmesini saglayacak sekilde seyreltilerek
azaltilir (polisorbat 80: 14 mg/l veya . Deterjanin
CMC civarindaki konsantrasyonlara seyreltilmesi miseller
halinde bölümlesmeyi elimine edebilir ve dolayisiyla katilmis
CSE moleküllerini LAL enzimleri tarafindan erisilebilir hale
getirebilir.
Dolayisiyla LER etkisi problemi (örnegin bir farmasötik ürünün
formülasyonunda sodyum sitrat ve polisorbat 80'in kullanildigi
durumlarda) artik çözülmüs olarak kabul edilebilir. Sonuç
olarak burada, farmasötik ürünlere yönelik güvenilir, saglam
ve tekrar üretilebilir bir test yöntemi saglanir.
Özet olarak, yukarida tarif edilen protokol rituksimabta ve
rituksimab plasebosunda sasirtici sekilde LER etkisinin
üstesinden gelmektedir. Öte yandan ayni protokolün
NeoRecormon® (bir antikor içermez, epoetin-beta içerir) için
tatmin edici sonuçlar verememesi, burada saglanan yöntemlerin
özellikle antikor formülasyonlari, tercihen monoklonal
antikorlar, sitrat tamponu ve polisorbat 80 içeren
formülasyonlar için faydali olduklarini gösterir.
Örnek 2.2: LER etkisini asmaya yönelik degistirilmis protokol
Bu Örnekte, degistirilmis olmasina ragmen yine de LER
etkisinin üstesinden gelen bir protokol kullanilmistir. Örnek
2.l'e kiyasla en önemli degisiklikler sunlardir:
1. Örnek 2.2'de Döndürmeli Diyaliz Araci kullanilmistir.
Öte yandan Örnek 2.1'de daha etkili diyaliz hazneleri
saglayan ve diyaliz etkinligini artiran gastSpinDIALYZER
kullanilir (membranlar silindirin her iki tarafindadir).
2. Örnek 2.2'de diyaliz membraninin MWCO degeri 500 Da'dir.
Öte yandan Örnek 2.1'de diyaliz membraninin MWCO degeri 10
kDa'dir.
3. Örnek 2.2'de seyreltme islemi endotoksinsiz su ile 1:10
oraninda gerçeklestirilir. Öte yandan Örnek 2.1'de
seyreltme islemi Tris tamponu (yani Tris/HCL tamponu (pH ~
7)) ile 1:10 oraninda (pH ~ 7) gerçeklestirilir. Numunenin
endotoksinsiz su ile 1:10 oraninda seyreltilmesi sonucunda
numunenin pH seviyesi yaklasik 6.0 olarak ayarlanir.
4. Örnek 2.2'de diyaliz süresi 4 saattir. Öte yandan Örnek
2.1'de diyaliz süresi 24 saattir.
Bu Örnekte numune olarak rituksimab ve rituksimab plasebosu
kullanilmistir. Ancak bu protokol, Örnek 2.l itibariyla ele
alindigi üzere ayni nedenlerden ötürü, tüm tipik antikor
formülasyonlarinda LER etkisini asmak için faydalidir.
Daha özel bir ifadeyle, Örnek 2.2'de kullanilan protokolün
ayrintilari asagida verilir.
Protokol incelemesi
Adim 1: "LER etkisinin ayarlanmasi" (bkz. ayrica asagidaki
plasebosu numunelerine 5 EU/ml veya 0.5 EU/ml (CSE;
Lonza, E. coli 0055:B5) katilmistir ve karisim oda
sicakliginda 60 dakika boyunca maksimum hizda
çalkalanmistir [Çalkalayici: Heidolph Multi Reax,
yüksek hizli (2,037 rpm)], böylece bir "pozitif LER
etkili" numune elde edilmistir.
Adim 2: MgC12 ilavesi: Diyalizden önce, nihai MgClz
konsantrasyonunun yaklasik 50 mM olmasini saglayacak
sekilde 2 M'lik MgC12 stok solüsyonu ilave edilir; 1.
adimda oldugu gibi 1 dakika çalkalanir.
Adim 3: 1:10 oraninda seyreltme yapilir [referans olarak
seyreltilmemis bir numune kullanilir]; 1. adimda
oldugu gibi 1 dakika çalkalama gerçeklestirilir.
Adim 4: 500 Da'lik bir membran ile 4 saat diyaliz
gerçeklestirilir (istege bagli olarak ve zorunlu
olmamak kaydiyla %0.2 BSA ile 30 dakika ön inkübasyona
yapilir), 2 saat sonra bir kere su degisimi yapilir.
Diyaliz haznesindeki solüsyon bir cam flakona
aktarilir ve 1. adimda oldugu gibi OS'de (oda
sicakliginda, yani 21 ± 2°C) 20 dakika çalkalanir.
Adim 5: kinetik LAL analizi ölçümü.
Ayrintili protokol
Adim 1: Numunelerin hazirlanmasi
~ 50 mM MgC12 için antikor solüsyonunun (rituksimab)
hazirlanmasi: l tüpe 877.5 pl rituksimab + 97.5 ul CSE (50
(5) EU CSE/ml a 5 (0.5) EU/ml nihai konsantrasyonda stok
solüsyon) doldurulur.
° Katkisiz kontrol: 877.5 ul rituksimab plasebosu + 97.5 ul
- Katkisiz su kontrolü: 975 ul su (taslak çikarma için)
o kullanilan flakonlar: seffaf düz tabanli dar agizli 1.5
ml'lik Macherey & Nagel, Ref. No. 70213
° oda sicakliginda Heidolph Multi Reax (yüksek hizli (2,037
rpm)) üzerinde 1 saat çalkalama yapilir.
Adim 2: 50 mM'lik bir nihai MgClz konsantrasyonunda MgClz ilave
edilmesi
0 Stok solüsyon l M'lik MgCl2 ' 6 Ibo: katkili numuneye ve
ayrica katkisiz numuneye (taslak) 50 pl 1 M'lik MgCl2 stok
solüsyonu ilave edilir.
Adim 3: Seyreltme
° 50 mM MgC12 içeren rituksimab numunesi: lOO ul numuneye 900
ul endotoksinsiz su (yani LAL suyu) ilave edilerek 1:10'luk
bir seyrelti hazirlanir
° Su kontrolü de ayni sekilde rituksimab yerine endotoksinsiz
su (yani LAL suyu) ile muamele edilir: lle'a seyreltilir
Adim 4: Diyaliz
. Diyalizden önce 1 dakika çalkalama yapilir [oda
sicakliginda bir Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda
yüksek hizda (2,037 rpm)].
(istege bagli olarak %0.2 BSA ile 30 dakika ön inkübasyon
tabi tutulmustur) sabitlendigi l ml'lik diyaliz araci
haznelerine (Harvard Döndürmeli Diyaliz Araci)
yerlestirilir.
- l 1 Aqua Braun'a (yani steril pirojensiz su; B. Braun,
Melsungen) karsi 24°C'de 4 saat diyaliz yapilir; 2 saat
sonra su degistirilir. Degisim suyunun sicakligi da 24°C'ye
ayarlanmistir.
- Döndürmeli Diyaliz Araçlari karistirma esliginde (manyetik
Teflon karistirici) l 1 Aqua Braun yüklü çok sayida 2 l
saltere dagitilir (diyaliz haznelerinin sayisina göre).
0 Bir 2 l salterde en fazla 5 Diyaliz Araci mevcuttur.
Adim 5: Pozitif LER kontrolünün hazirlanmasi
Bu Örnekte ayrica LAL analizinde bir pozitif LER kontrolü
kullanilir. Bu pozitif LER kontrolü, LAL analizi basladiginda
hazir olmasi kaydiyla, herhangi bir zaman noktasinda
hazirlanabilir. Pozitif LER kontrolü avantajli bir sekilde 4
saatlik diyaliz tamamlanmadan 1 saat önce hazirlanir, böylece
tüm numuneler ayni anda test edilebilir. Pozitif LER
kontrolünü hazirlamak için asagidaki protokol kullanilir:
0 rituksimab 900 ul + 100 ul CSE a nihai CSE konsantrasyonu:
.0 EU/ml.
- Oda sicakliginda bir Heidolph Multi Reax (yüksek hizli
(2,037 rpm)) üzerinde 1 saat çalkalama yapilir. Maksimum
LER etkisi (%l'den düsük geri kazanim. orani) sadece bu
kosullar altinda elde edilecektir.
° Paralel olarak asagidaki taslaklar hazirlanir:
0 5.0 EU/ml CSE içeren su
0 5.0 EU/ml CSE içeren su; 1:10 oraninda seyreltilmistir
Adim 6: LAL analizi
- Tüm numuneler hazirlandiktan sonra test baslatilir.
~ Tüm numunelerden alinan lOO'er ul'lik iki örnek, Tecan
Okuyucuda 37°C'de 10 dakika inkübe edilen bir plakta
tekrarli tayin (X2, yani iki kopya halinde tayin) için
kullanilir.
° Iyi belirlenmis bir siraya göre (makinenin okumalarina
bagli olarak) her bir numuneye lOO ul LAL Reaktifi
(Kinetik-QCLTM Analizi; Lonza) ilave edilir.
Bulgular ve tartisma:
Örnek 2.1'de tarif edilen protokol, en iyi tekrar üretilebilir
geri kazanim. oranlarini saglamistir (ayrica su kontrollerine
kiyasla). Ancak, Örnek 2.2'de tarif edilen protokol, katim
isleminde kullanilan her iki CSE konsantrasyonu için, de %50
ila %95 araliginda degisen iyi bir CSE geri kazanim orani
saglamistir` (bkz. Sekil 4(B) [rituksimab 046]). Dolayisiyla,
Örnek 2.2'de kullanilan protokolün, Örnek 2.l'de tarif edilen
protokolün fonksiyonel. bir* esdegerini temsil ettigi sonucuna
varilabilir.
Referans Örnegi 1: LER etkisinin zamana bagimliligi
Önceki teknikte LER etkisinin numuneye tanimli bir miktarda
CSE katildiktan hemen sonra ortaya çiktigi varsayilir (C.
Platco, 2014, "Low lipopolysaccharide recovery versus low
endotoxin recovery in common biological product matrices".
American Pharmaceutical Review, Eylül 01, 2014, pp. 1-6). Bu
nedenle ilk önce numuneler LPS katimindan sonra oda
sicakliginda yaklasik 2-10 dakikalik kisa bir süre boyunca
çalkalanmistir. Ancak, bu tip bir katim isleminin etkili
olmadigi görülmüstür ve bazi deneylerde katilan materyalin
maskeleme etkisinin bu kisa süre içerisinde (
maksimuma ulasmadigi gösterilmistir. LER etkisini dogru bir
sekilde analiz etmek için katim mekanizmasinin temel
proseslerden biri oldugu bulunmustur (bkz. örnegin Sekil 13
karisiminin ndsellerine nüfuz ederek CSE Hmleküllerini zaman
içerisinde maskeleyen bir kinetik olaydir. Dolayisiyla, rutin
uygulamayi temsil ettigi üzere, LER etkisini analiz etmeye
yönelik bir sonraki adimdan önce gerçeklestirilen 2-10
dakikalik çalkalama islemi uygunsuzdur ve LER etkisi için
temsili olarak kabul edilemez, çünkü bu etkinin olusmasi için
gerekli kosullara henüz ulasilmamistir. Dolayisiyla deneylere
(LAL testine göre %O'lik geri kazanim oranina ulasildigi
durumlarda mevcut olacak sekilde tanimlanir) dahil edilir.
Rituksimabta LER etkisine yönelik bir kinetik çalismada,
pozitif LER etkisinin 60 dakika veya daha uzun bir inkübasyon
süresine ihtiyaç duydugu gösterilmistir.
Daha özel bir ifadeyle, maksimum LER etkisini elde etmek için
çalkalamanin ne kadar uzun bir süre gerçeklestirilmesi
gerektigi analiz edilmistir [oda sicakliginda (21°C ± 2°C) 1.5
ml'lik distan geçme kapakli düz tabanli seffaf bir cam kapta
bir Heidolph Multi Reax çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037
rpm) maksimum, frekans (yani vorteksleme)]. Dolayisiyla, bir
flakonda (Macherey-Nagel, 1.5 ml) rituksimab numunelerine 0.5
ve 5.0 EU/ml'lik konsantrasyonlar saglayacak sekilde CSE
katilmistir. Katim isleminden sonra numuneler sirasiyla 60
çalkalanmistir. Ardindan 900 ul endotoksinsiz su (yani LAL
suyu) ile 100 ul numunenin karistirilmasi suretiyle lle'luk
seyreltiler hazirlanmistir. Seyreltme isleminden sonra
numuneler tekrar 1 dakikaligina çalkalanmistir. Sonrasinda
numuneler* LAL analizinde iki kopya halinde test edilmistir.
Daha özel bir ifadeyle, her bir numune (100 ul) bir plak
üzerine uygulanmistir ve okuyucuda. 37°C'de 10 dakika inkübe
edilmistir. Akabinde her bir numuneye 100 ul kromojen ilave
edilmistir ve ölçüni yapilmistir. Bu deneyde tüm solüsyonlar
oda sicakligindadir. Sekil l3'te [rituksimab 027] gösterildigi10
üzere, karsilik gelen seyreltilmemis numuneye kiyasla
numunenin lle'luk bir oranda seyreltildigi durumlarda LER
etkisi daha düsüktür (yani geri kazanim orani daha yüksektir).
Bunlarin yani sira, 2 saniyelik çalkalamadan sonra, 5.0 EU/ml
endotoksin içeren seyreltik numuneler için geri kazanim
degerleri hala yaklasik olarak %50'dir. Ancak çalkalama (yani
vorteksleme) süresi uzatildiginda geri kazanim oraninda sabit
bir düsüs (30 dakikalik deger hariç) gözlemlenir (bkz. Sekil
13 [rituksimab 027]). Öte yandan seyreltilmemis numunelerde
maksimum LER etkisi 2 saniye sonra bile gözlemlenir. Ancak 60
dakika çalkalanmis (yani vortekslenmis) olan seyreltik
numunelerde de anlamli bir LER etkisi gözlenmistir.
Bu bulguyar göre, katim› isleminin LPS moleküllerini deterjan
misellerinde Haskelemek için zamana ihtiyaç duydugu sonucuna
varilmistir. Yaklasik olarak %100 oraninda maskeleme veya
çalkalama için minimum 1 saatlik bir süre [örnegin oda
sicakligindar bir` Heidolphr Multi Reax çalkalayicisindar yüksek
hizda (2,037 rpm) 1.5 ila 5 ml'lik bir distan geçme kapakli,
düz tabanli seffaf cam flakonda 1 saat] veya alternatif olarak
4°C'de depolama için daha uzun bir süre (>24 sa) gerektirir.
Elde edilen "pozitif LER kontrolü" tüm grafiklerde diyagramin
sag tarafinda bir sütun olarak gösterilmistir.
Referans Örnegi 2: Insan serum albüminin (HAS) ve farkli MgClz
konsantrasyonlarinin geri kazanim oranina etkisi
HSA'nin ve farkli MgCl2 konsantrasyonlarinin endotoksin katkili
rituksimab numunelerinde geri kazanim oranina etkisini
belirlemek için asagidaki deney gerçeklestirilmistir. Bu
deneyde ayrica diyalizin geri kazanimi oranina etkisi analiz
edilmistir. Daha özel bir ifadeyle, "pozitif LER etkisini"
elde etmek için rituksimab katkili numuneler 60 dakika
çalkalanmistir. Diyalizden önce 10-75 mM MgC12 ilave
edilmistir, akabinde bir seyreltme islemi
gerçeklestirilmistir. BSA ile bloke edilmis bir membran
kullanilmamistir. Diyalizden sonra 0.01 pg/ml HSA ilave edilir
veya edilmez. Sonrasinda 20 dakika çalkalama yapilir. Bunlarin
yani sira, bazi numuneler hiç diyaliz edilmemistir. Daha özel
bir ifadeyle, LAL analizinde test edilen farkli numuneler
Sekil 5'te (yani [rituksimab 059]) gösterilir. Bu deneyde LER
etkisi bazi numunelerde diyaliz olmadan asilabilmistir. Ancak
sonraki deneylerde diyaliz olmadan LER etkisinin
tekrarlanabilir sekilde asilamadigi gösterilmistir. Ya da
baska bir ifadeyle, diyaliz olmadan, LER etkisi bazen
asilabilir ve bazen asilamaz. Dolayisiyla, numunelerin diyaliz
edilmesi, LER etkisini asmaya yönelik daha saglam bir yöntem
Numuneler 1.5 ml'lik vida kapakli bir flakonda Macherey-Nagel
ile hazirlanmistir.
Adim 1: Numunelerin hazirlanmasi
- 10 mM MgClz için katkili rituksimabin hazirlanmasi: 897 pl
rituksimab + 99.8 pl CSE, böylece 5.0 EU/ml elde edilir
0 50 mM MgClz için katkili rituksimabin hazirlanmasi: 889 pl
rituksimab + 98.8 pl CSE, böylece 5.0 EU/ml elde edilir
0 75 mM MgC12 için katkili rituksimabin hazirlanmasi: 883 pl
rituksimab + 98.1 pl CSE, böylece 5.0 EU/ml elde edilir
99.8 pl CSE, böylece 5.0 EU/ml elde edilir
98.8 pl CSE, böylece 5.0 EU/ml elde edilir
98.1 pl CSE, böylece 5.0 EU/ml elde edilir
0 60 dakika çalkalama yapilir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 2: MgClz ilavesi
4 M'lik bir MgC12 stok solüsyonu (yani 0.629 ml su içinde
kullanilmistir.
o 10 mM MgC12 için katkili numuneye 2.5 pl 4 M'lik
solüsyon ilave edilir.
0 50 mM MgC12 için katkili numuneye 12.5 pl 4 M'lik
solüsyon ilave edilir.
0 75 mM MgClz için katkili numuneye 19 pl 4 M'lik
solüsyon ilave edilir.
1 dakika çalkalama yapilir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 3: Seyreltme
1:10 oraninda seyreltiler su sekilde hazirlanmistir:
1:10'luk rituksimabin hazirlanisi: daima 900 ul LAL suyu +
100 ul numune
Yeteri kadar diyaliz araci bulunmadigindan su 1:10 oraninda
seyreltilmemistir.
1 dakika çalkalama yapilir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 4: Diyaliz
Numuneler 1 mL'lik bir diyaliz aracina yerlestirilmistir.
500 Da'lik bir membran kullanilmistir. Ancak membran LAL
suyunda yikanmistir.
Diyaliz 24°C'de 4 saat boyunca 1 L Aqua Braun'a karsi
gerçeklestirilmistir ve 2 saat sonra su degistirilmistir.
Yeni suyun sicakligi da 24°C'dir.
Diyaliz araçlari üç adet 2 L'lik saltere yerlestirilmistir
ve her bir salterde uzun bir karistirici (yani karistirma
çubugu) mevcut oldugundan döndürülmüstür.
Her bir salterde daima 4 diyaliz araci mevcuttur.10
Adim 5: Diyalizden sonra HSA ilavesi
Diyalizden sonra numuneler bölünür. HSA içeren 396 ul
numuneleri hazirlamak için her bir numune ayri bir flakona
aktarilmistir. HSA içermeyen numuneleri hazirlamak için
ayri bir flakona 400 ul ilave edilmistir.
0.01 ug/ml'lik bir HSA konsantrasyonu saglamak amaciyla,
396 ul'lik numunelere 1 ug/ml'lik. 4 ul solüsyon ilave
edilmistir.
HSA stok solüsyonu yeni hazirlanmistir.
dakika çalkalama yapilir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi].
Adim 6: Pozitif LER kontrolünün hazirlanmasi
Pozitif LER kontrolü, diger numunelerle ayni zamanda hazir
bulunmasini saglamak için 4 saatlik diyaliz sonlanmadan 1
saat önce hazirlanir.
rituksimab 900 ul + farkli CSE stok solüsyonlarindan 100 ul
CSE, böylece 5.0 EU/ml elde edilir].
oda sicakliginda 1 saat çalkalama yapilir [Heidolph Multi
Reax çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm)]
Adim 7: LAL analizi
Her bir numune (100 ul) bir plak üzerine iki kopya halinde
uygulanmistir
Okuyucuda 37°C'de 10 dakika inkübasyon
gerçeklestirilmistir.
Her bir numuneye 100 ul kromojen uygulanmistir.
Okuyucuda ölçüm baslatilmistir.
Bulgular ve Tartisma:
Sonuçlar' Sekil 5'te [rituksimab 059] gösterilir. Bu deneyde
HSA. isleminin geri kazanini oranini düsürdügü ve dolayisiyla
burada saglanan yöntemler` baglaminda daha az faydali oldugu
gösterilir. Bunlarin yani sira, sonuçlar, tatmin edici geri
kazanim oranlari saglamak için diyaliz membranina yönelik BSA
isleminin gerekli olmadigini gösterir. Bu deneyde ayrica 50
mM'lik MgCl2 konsantrasyonunun geri kazanim için optimum deger
oldugu ve 10 ve 75 mM'lik MgClz konsantrasyonunun daha düsük
geri kazanim oranlarina yol açtigi gösterilir. Ancak 75 mM'lik
MgC12 ile de tatmin edici bir geri kazanim orani elde
edilmistir. Bu deneyde ayrica MgClz ilavesinin diyaliz olmadan
bile tatmin edici aralikta (%70-100) bir geri kazanim ile
sonuçlandigi gösterilir. Ancak, yukarida belirtildigi üzere,
diyaliz olmadan LER etkisi tekrarlanabilir sekilde asilamaz.
Dolayisiyla, numunelerin diyaliz edilmesi, LER etkisini asmaya
yönelik daha saglam bir yöntem saglar. Deneyde [rituksimab
059] su kontrolü degerlerinin yüksek oldugu belirtilmistir
(degerlerin bir kismi > %220). Pozitif LER kontrolü tatmin
edicidir (yani %O'lik geri kazanim).
Referans Örnegi 3: MgC12 ilavesinden sonra 4 saatlik inkübasyon
Bu deneyde "pozitif LER etkisini" elde etmek için rituksimab
numuneleri 60 dakika çalkalanmistir. MgClz ilave edildikten
sonra seyreltilmemis numuneler oda sicakliginda 4 saat inkübe
edilmistir. Bu inkübasyondan sonra numuneler 2 dakika
çalkalanmistir. LAL analizinde test edilen farkli numuneler
Sekil 5(B)'de [rituksimab 061] gösterilir.
Numuneler 1.5 ml'lik Vida kapakli bir flakonda Macherey-Nagel
ile hazirlanmistir.
Adim 1: Numunelerin hazirlanmasi
0 10 mM MgC12
897 pl
için katkili
rituksimab/su + 99
0 50 mM
889 ul
MgC12 için katkili
rituksimab/su + 98
0 75 mM
883 pl
MgC12 için katkili
rituksimab/su + 98
0 100 mM
877 ul
MgC12 için katkili
rituksimab/su + 97
O 150 mM
866 pl
MgC12 için katkili
0 60 dakika çalkalama
çalkalayicisi, yüksek hiz
Adim 2: MgC12 ilavesi
4 M'lik bir MgC12
534.661 mg MgC12 °
C 10 mM MgC12
ilave edilir.
° 50 mM MgC12
ilave edilir.
0 75 mM MgC12
ilave edilir.
0 100 mM MgC12
ilave edilir.
° 150 mM MgC12
ilave edilir.
(2,037 rpm)]
rituksimab/su + 96.
yapilir
stok solüsyonu
1 dakika çalkalama yapilir
rituksimabin/suyun hazirlanmasi:
.8 pl CSE, böylece 5.0 EU/ml elde
rituksimabin/suyun hazirlanmasi:
.8 pl CSE, böylece 5.0 EU/ml elde
rituksimabin/suyun hazirlanmasi:
.1 pl CSE, böylece 5.0 EU/ml elde
rituksimabin/suyun hazirlanmasi:
.5 pl CSE, böylece 5.0 EU/ml elde
rituksimabin/suyun hazirlanmasi:
3 pl CSE, böylece 5.0 EU/ml elde
(2,037 rpm), oda sicakligi]
(yani 0.657 ml su içinde
6 H2O) kullanilmistir.
için katkili numuneye 2.5 pl 4 M'lik solüsyon
için katkili numuneye 12.5 pl 4 M'lik solüsyon
için katkili numuneye 19 pl 4 M'lik solüsyon
için katkili numuneye 25 pl 4 M'lik solüsyon
için katkili numuneye 37 pl 4 M'lik solüsyon
Adim 3: Seyreltme
- 1:10 oraninda seyreltiler hazirlanmistir: 900 ul LAL suyu +
100 ul numune (yani rituksimab numunesi veya su numunesi)
0 1 dakika çalkalama yapilir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 4: Pozitif LER kontrolünün hazirlanmasi
0 900 ul rituksimab + 100 ul CSE, böylece 5.0 EU/ml elde
0 900 ul rituksimab + 100 ul CSE'nin 5.0 EU/ml saglayacak
sekilde karistirilmasi yoluyla baska bir pozitif LER
kontrolü hazirlanmistir ve akabinde numune endotoksinsiz su
ile 1:10 oraninda seyreltilmistir
Adim 5: Çalkalama
- Tüm numuneler ve ayrica pozitif LER kontrolleri oda
sicakliginda 1 saat çalkalanmistir [Heidolphr Multi Reax
Çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm)]
Adim 6: LAL analizi
- Her bir numune (100 ul) bir plak üzerine iki kopya halinde
uygulanmistir
° Okuyucuda 37°C'de 10 dakika inkübasyon
gerçeklestirilmistir.
0 Her bir numuneye lOO ul kromojen uygulanmistir.
0 Okuyucuda ölçüm baslatilmistir.
Bulgular ve tartisma:
Bu deneyin sonucu Sekil 6(B)'de ([rituksimab 061]) gösterilir.
Bu Sekil yine 50 mM'lik MgClz konsantrasyonunun CSE geri10
kazanimi için tekrar üretilebilir optimum deger oldugunu
gösterir; 10, 75 ve 150 mM'lik konsantrasyonlar biraz daha
kötü sonuçlar vermektedir. MgClg ilavesinden sonra bir
inkübasyon süresi uygulandiginda, seyreltilmemis rituksimab
numuneleri herhangi bir CSE geri kazanimina yol açmamistir
(bkz. Sekil 6(B) ([rituksimab 061])). Ancak 1:10'luk
seyreltiler yaklasik olarak %50-60'lik geri kazanim
saglamistir (özellikle 10, 50, 75 veya 100 mM MgClz ilave
edildiginde). Su kontrolü ve ayrica pozitif LER kontrolü
degerleri tatmin edicidir. Bu deneyde herhangi bir diyaliz
gerçeklestirilmemistir. Ancak birkaç deneyde LER etkisinin
tekrarlanabilir sekilde açilmasi için diyalizin gerekli oldugu
gösterilmistir.
Referans Örnegi 4: MgC12 ilavesinden sonra 2 ve 4 saatlik
inkübasyon sürelerinin karsilastirilmasi
60 dakika çalkalanmistir. MgC12 ilave edildikten sonra
seyreltilmemis numuneler 2 veya 4 saat inkübe edilmistir,
akabinde 1:10 oraninda seyreltilmistir ve LAL analizinde
ölçüme tabi tutulmustur. LAL analizinde test edilen farkli
numuneler Sekiller 7(A) ve 7(B)'de (yani, sirasiyla
Numuneler 1.5 ml'lik vida kapakli bir flakonda Macherey-Nagel
ile hazirlanmistir.
Adim 1: Numunelerin hazirlanmasi
0 10 mM MgClz için rituksimabin/suyun hazirlanmasi: 897 ul
rituksimab/su + 99.8 pl farkli CSE stok solüsyonlari,
böylece 0.5 ve 5.0 EU/ml elde edilir.
o 50 mM MgC12 için rituksimabin/suyun hazirlanmasi: 889 ul
rituksimab/su + 98.8 ul farkli CSE stok solüsyonlari,
böylece 0.5 ve 5.0 EU/ml elde edilir.
0 75 mM ugciz için rituksimabin/suyun hazirlanmasi: 883 ul
rituksimab/su + 98.1 ul farkli CSE stok solüsyonlari,
böylece 0.5 ve 5.0 EU/ml elde edilir.
Adim 2: Iki pozitif LER kontrolünün hazirlanmasi
0 Pozitif LER kontrollerinden birinin endotoksinsiz su ile
1:10 oraninda seyreltilmesi.
Adim 3: Çalkalama
0 Tüm numuneler ve ayrica pozitif LER kontrolü 1 saat
çalkalanir: [Heidolph Multi Reax çalkalayicisi, yüksek hiz
(2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 4: MgClz ilavesi
0 4 M'lik bir MgClz stok solüsyonu kullanilmistir.
o 10 mM MgClg için katkili numuneye 2.5 pl 4 M'lik
solüsyon ilave edilir
0 50 mM MgClg için katkili numuneye 12.5 pl 4 M'lik
solüsyon ilave edilir
0 75 mM MgC12 için katkili numuneye 19 pl 4 M'lik
solüsyon ilave edilir
0 1 dakika çalkalama yapilir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 5: Inkübasyon süresi
° (Seyreltilmemis) numuneler (ve ayrica pozitif LER
kontrolleri) bölünür. Her bir numunenin bir yarisi
(yaklasik 500 Lüj 2 saat KM; diger' yarisi 4 saat inkübe
edilmistir.
Adim 6: Seyreltme
o 2 dakika çalkalama yapilmistir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
0 1:10 oraninda seyreltiler hazirlanmistir: 900 pl LAL suyu +
100 pl numune (yani rituksimab numunesi veya su numunesi).
0 1 dakika çalkalama yapilmistir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 7: LAL analizi
0 Her bir numune (100 pl) bir plak üzerine iki kopya halinde
uygulanmistir
- Okuyucuda 37°C'de 10 dakika inkübasyon
gerçeklestirilmistir.
- Her bir numuneye 100 ul kromojen uygulanmistir.
0 Ölçüm okuyucuda baslatilmistir
Bulgular ve tartisma:
Sonuçlar Sekiller 7(A) ve 7(B)'de (yani sirasiyla [rituksimab
endotoksin için geri kazanim oranlari ölçülmüstür. Numunelere
-75 mM MgClz ilave edildigi durumlarda, 2 saat inkübe edilen
numunelerde (Sekil 7(A), [rituksimab 062]) ve 4 saat inkübe
edilen numunelerde (Sekil 7(B), yani [rituksimab 063]) geri
kazanim aynidir. Her iki deneyde de geri kazanim oranlari çok
benzerdir. Bunlarin yani sira, 5.0 EU/ml endotoksin katkili
numunelerde diyaliz olmadan bile tatmin edici geri kazanim
oranlari (%80-90) elde edilmistir. 0.5 EU/ml endotoksin10
katkili numunelerde geri kazanim oranlari yaklasik olarak %35-
45'tir. Önemli oldugu üzere, seyreltme (lle'luk oranda)
içermeyen durumlarda ve ayrica ayrica 10-75 mM MgC12 varliginda
tam LER, yani %0 geri kazanim gözlemlenmistir. Su kontrolleri
ve ayrica pozitif LER kontrolleri tatmin edicidir. Bu
deneylerde herhangi bir diyaliz gerçeklestirilmemistir. Ancak
sonraki deneylerde diyaliz olmadan LER etkisinin bazen
asildigi ve bazen asilmadigi gösterilmistir. Dolayisiyla,
numunelerin diyaliz edilmesi, LER etkisini asmaya yönelik daha
saglam bir yöntem saglar.
Referans Örnegi 5: farkli miktarlarda MgClz ilavesinden sonra 2
saat inkübasyon süresi ile farkli miktarlarda MgC12 ilavesinden
sonra sifir inkübasyon süresinin karsilastirilmasi
60 dakika çalkalanmistir. MgClz ilave edildikten sonra
seyreltilmemis numuneler inkübe edilmemistir veya 2 saat
inkübe edilmistir. Akabinde 1:10 oraninda seyreltilmistir ve
LAL. analizinde ölçüme tabi tutulmustur. LAL analizinde test
edilen farkli numuneler Sekiller 8(A) ve 8(B)'de (yani,
sirasiyla [rituksimab 064] ve [rituksimab 065]) gösterilir.
Referans örnegi 5.1: MgClz ilavesinden sonra sifir inkübasyon
Bu deneyde numunelere MgClz ilave edildikten sonra herhangi bir
inkübasyon gerçeklestirilmemistir.
Numuneler 1.5 ml'lik Vida kapakli bir flakonda Macherey-Nagel
ile hazirlanmistir.
Adim 1: Numunelerin hazirlanmasi
o 10 mM MgC12 için rituksimabin/suyun hazirlanmasi: 897 pl
rituksimab/su + 99.8 pl farkli CSE stok solüsyonlari,
böylece 0.5 ve 5.0 EU/ml elde edilir
0 25 mM ugciz için rituksimabin/suyun hazirlanmasi: 895 pl
rituksimab/su + 99.4 pl farkli CSE stok solüsyonlari,
böylece 0.5 ve 5.0 EU/ml elde edilir.
- 50 mM NbClz için rituksimabin/suyun hazirlanmasi: 889 pl
rituksimab/su + 98.8 pl farkli CSE stok solüsyonlari,
böylece 0.5 ve 5.0 EU/ml elde edilir.
Adim 2: Iki pozitif LER kontrolünün hazirlanmasi
- Pozitif LER kontrollerinden birinin endotoksinsiz su ile
1:10 oraninda seyreltilmesi
Adim 3: Çalkalama
- Tüm, numuneler ve ayrica pozitif LER, kontrolü 60 dakika
Çalkalanmistir (yani vortekslenmis) [Heidolph. Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 4: MgClz ilavesi
4 M'lik bir MgC12 stok solüsyonu kullanilmistir.
o 10 mM MgClz için katkili numuneye 2.5 pl 4 M'lik
solüsyon ilave edilir
0 25 mM MgC12 için katkili numuneye 6.25 pl 4 M'lik
solüsyon ilave edilir
0 50 mM MgCl2 için katkili numuneye 12.5 pl 4 M'lik
solüsyon ilave edilir
0 1 dakika çalkalama yapilmistir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 5: Seyreltme
- 1 dakika Çalkalama yapilmistir [Heidolph Multi ReaX
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
0 1:10 oraninda seyreltiler hazirlanmistir.
0 1 dakika çalkalama yapilmistir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 6: LAL analizi
0 Her bir numune (100 ul) bir plak üzerine iki kopya halinde
uygulanmistir
gerçeklestirilmistir.
- Her bir numuneye 100 pl kromojen uygulanmistir.
0 Okuyucuda ölçüm baslatilmistir.
Bulgular ve Tartisma:
Sonuçlar Sekil 8(A)'da ([rituksimab 064]) gösterilmektedir.
Sonuçlar ile ilgili tartisma için bkz. Referans Örnegi 4.2.
Referans Örnegi 5.2: MgClz ilavesinden sonra 2 saatlik
inkübasyon
Bu deneyde numuneler MgClg ilave edildikten sonra 2 saat inkübe
edilmistir. 1 ila 4. adimlar yukarida Referans Örnegi 4.1
kapsaminda tarif edildigi gibi gerçeklestirilmistir. Ancak
burada. MgClz ilave edildikten sonra seyreltilmemis numuneler
oda sicakliginda (21°C)) 2 saat inkübe edilmistir.
Inkübasyondan sonra asagidaki 5 ve 6. adimlar
gerçeklestirilmistir. LAL analizinde test edilen. farkli
numuneler Sekil 8(B)'de [rituksimab 065] gösterilir.
Adim 5: Seyreltme10
o 2 dakika çalkalama yapilmistir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
0 lle oraninda seyreltiler hazirlanmistir: 900 ul LAL suyu +
100 ul numune (yani rituksimab numunesi veya su numunesi)
0 1 dakika çalkalama yapilmistir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 6: Iki pozitif LER kontrolünün hazirlanmasi
- Pozitif LER kontrollerinden birinin endotoksinsiz su ile
l:lO oraninda seyreltilmesi
Adim 7: Çalkalama
0 Tüm numuneler ve ayrica pozitif LER kontrolü 1 saat
çalkalanmistir [Heidolph Multi Reax çalkalayicisi, yüksek
hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 8: LAL analizi
0 Her bir numune (100 ul) bir plak üzerine iki kopya halinde
uygulanmistir
° Okuyucuda 37°C'de 10 dakika inkübasyon
gerçeklestirilmistir.
0 Her bir numuneye 100 ul kromojen uygulanmistir.
0 Okuyucuda Ölçüm baslatilmistir.
Bulgular ve tartisma:
Referans Örnegi 4.1'in sonuçlari Sekil 8(A)'da ([rituksimab
064]) gösterilir; Referans Örnegi 4.2'nin sonuçlari Sekil
8(B)'de ([rituksimab 065]) gösterilir. Bu iki deneyde,
seyreltme ve LAL ölçümü MgCl2 ilavesinden hemen sonra (Sekil
8(A), [rituksimab 064]) ya da MgClz ilavesinin ardindan numune
2 saat beklemeye birakildiktan sonra (Sekil 8(B), [rituksimab
065]) gerçeklestirilmistir. Tüm geri kazanim degerleri çok
benzerdir ve 5.0 EU/ml CSE katkili numunelerde diyaliz olmadan
bile tatmin edici (%60-80) geri kazanim oranlari elde
edilmistir. Ilginç bir sekilde, 2 saatlik bir inkübasyon
süresinden sonra, 25 mM'lik MgClz konsantrasyonu %100 geri
kazanim saglamistir. Dolayisiyla, MgClz ilavesinden sonra bir
inkübasyon süresinin, LER etkisini azaltmaya yönelik degerli
bir ölçüt oldugu görülmektedir. Ancak 0.5 EU/ml CSE katkili
numuneler için geri kazanim degerleri, yaklasik olarak %20-35
olmak üzere düsüktür. Bu, Mgß'ilavesi ve seyreltme islemlerine
ek olarak, LER etkisini güvenilir bir biçimde asmak için
diyalizin de gerekli bir adim oldugunu gösterir. Bu deneylerde
su kontrolü degerleri tatmin edicidir. Seyreltilmemis pozitif
LER kontrolü de tatmin edicidir (yani %0).
Referans örnegi 6: Rituksimab ve rituksimab plasebosu
numunelerinde farkli seyreltilerin karsilastirilmasi
Katim isleminden sonra "pozitif LER etkisini" elde etmek için
rituksimab ve rituksimab plasebosu numuneleri 60 dakika
çalkalanmistir. MgCl2 ilave edildikten sonra seyreltilmemis
numuneler 1 saat çalkalanmistir ve l:2, l:5, lle veya 1:20
oraninda seyreltilmistir. Sonrasinda LAL analizi
gerçeklestirilmistir. LAL analizinde test edilen farkli
numuneler Sekil 9'da ([rituksimab 072]) gösterilir.
Daha özel bir ifadeyle, asagidaki deney gerçeklestirilmistir:
Adim 1: Numunelerin hazirlanmasi
o 25 mM MgC12 için rituksimab/rituksimab plasebosu/suyun
hazirlanmasi: 895 in. rituksimab/rituksimab plasebosu/su +
99.4 ul farkli CSE stok solüsyonlari, böylece 0.5 ve 5.0
EU/ml elde edilir.
Adim 2: Üç pozitif LER kontrolünün hazirlanmasi
450 ul rituksimab plasebosu + 50 ul CSE, böylece 0.5 ve .
450 ul rituksimab + 50 ul CSE, böylece 0.5 ve 5.0 EU/ml
elde edilir (ikinci pozitif LER kontrolü).
450 ul rituksimab + 50 ul CSE, böylece 0.5 ve 5.0 EU/ml
elde edilir. Akabinde bu numune 1:10 oraninda
seyreltilmistir (üçüncü pozitif LER kontrolü).
Adim 3: Çalkalama
Tüm numuneler ve ayrica pozitif LER kontrolleri 60 dakika
çalkalanmistir (yani vortekslenmis) [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 4: MgC12 ilavesi
4 M'lik bir MgC12 stok solüsyonu kullanilmistir.
o 25 mM MgC12 için katkili numuneye 6.25 pl 4 M'lik
solüsyon ilave edilir
1 dakika çalkalama yapilmistir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 5: Seyreltme
Numuneler su sekilde seyreltilmistir:
o l:5 oraninda seyreltme: 400 ul su + 100 ul numune
0 1:10 oraninda seyreltme: 450 ul su + 50 ul numune
0 1:20 oraninda seyreltme: 475 ul su + 25 ul numune
ÜÇ pozitif LER kontrolünden biri 1:10 oraninda
seyreltilmistir.10
- MgClz içermeyen su seyreltilmemistir.
0 1 dakika çalkalama yapilmistir [Heidolph Multi Reax
Çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 6: LAL analizi
0 Her bir numune (lOO ul) bir plak üzerine iki kopya halinde
uygulanmistir
0 Okuyucuda 37°C'de 10 dakika inkübasyon
gerçeklestirilmistir.
0 Her bir numuneye lOO pl kromojen uygulanmistir.
0 Okuyucuda ölçüm baslatilmistir.
Bulgular ve Tartisma:
Sonuçlar Sekil 9'da ([rituksimab 072]) gösterilmektedir.
Önemli oldugu üzere, rituksimab ve rituksimab plasebosu için
sonuçlarda anlamli herhangi bir fark gözlenmez. Bu,
rituksimabta LER etkisinin agirlikli olarak tampon sistemine
(yani polisorbat 80 içeren sitrat tamponu) bagli oldugunu ve
antikorun (yani rituksimab) LER etkisi üzerinde önemli bir
etkiye sahip olmadigini gösterir. Ancak bu deneyde geri
kazanini oranlari hem rituksimab hem de rituksimab plasebosu
için tatmin edici degildir. Yukarida tarif edilen deneyde su
kontrolü degerleri tatmin edicidir. Seyreltilmemis pozitif LER
kontrolleri de %O'lik geri kazanim oranlariyla birlikte tatmin
Referans Örnegi 7: Rituksimab ve rituksimab plasebosu
numunelerinde MgClz ilave edilmeden önce inkübasyon süresinin
geri kazanim oranina etkisi
Asagidaki deneyde MgClg ilavesinden önce inkübasyon
sürelerinin, rituksimab ve rituksimab plasebosu numunelerinin
geri kazanini orani üzerinde bir etkiye sahip olup olmadigi
test edilmistir. Daha Özel bir ifadeyle, "pozitif LER10
etkisini" elde etmek için rituksimab ve rituksimab plasebosu
numuneleri 60 dakika çalkalanmistir. Akabinde numuneler 4°C'de
0 saat ila Ã3 gün inkübe edilmistir. Ardindan 50 mM'lik bir
konsantrasyonda MgClz ilave edilmistir ve numuneler
seyreltilmistir. Akabinde BSA ile bloke edilmis olan bir
diyaliz membrani ile diyaliz gerçeklestirilmistir. LAL
analizinde test edilen farkli numuneler Sekil lO'da
([rituksimab 079] ve [rituksimab 082]) gösterilir.
Numuneler 1.5 ml'lik vida kapakli bir flakonda Macherey-Nagel
ile hazirlanmistir.
Adim 1: Numunelerin hazirlanmasi
- 50 mM MgC12 için rituksimab/rituksimab plasebosu/suyun
hazirlanmasi: 5,346 ul rituksimab/rituksimab plasebosu/su +
596 ul farkli CSE stok solüsyonlari, böylece 0.5 veya 5.0
EU/ml elde edilmistir.
0 60 dakika vorteksleme yapilmistir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
° Sonraki prosedür için her bir numune (1 ml) yeni flakonlara
aktarilmistir
Adim 2: Inkübasyon süresi
- Numuneler 4°C'de 0 saat, 4 saat, 1 gün, 3 gün veya 7
günlügüne buzdolabina yerlestirilmistir.
0 1 gün, 3 gün veya 7 günlük inkübasyon süresinden sonra
numuneler 2 dakika çalkalanmistir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), Oda sicakligi]. 0
saat. ve 4 saatlik inkübasyon süresinden sonra numuneler
çalkalanmamistir.
Adim 3: MgClg ilavesi
0 5 M'lik bir MgClz stok solüsyonu (yani 0.891 ml su içinde
0.9055 g MgClz) kullanilmistir.
o 50 mM MgClz için katkili numunelere 10 pl 5 M'lik
solüsyon ilave edilmistir
O Oda sicakliginda 1 dakika çalkalama yapilmistir [Heidolph
Multi Reax çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm)]
Adim 4: Seyreltme
0 1:10 oraninda seyreltiler hazirlanmistir: 900 ul LAL suyu +
100 ul numune (yani rituksimab numunesi, rituksimab
plasebosu numunesi veya su numunesi)
0 MgClz içermeyen su seyreltilmemistir.
° Oda sicakliginda 1 dakika çalkalama yapilmistir [Heidolph
Multi Reax çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm)]
Adim 5: Diyaliz
- Numuneler bir 1. ml'lik diyaliz aracina ilave edilmistir.
Diyaliz, 1 il Aqua Braun'a karsi 24°C'de 4 saat boyunca
gerçeklestirilmistir ve 2 saat sonra su degistirilmistir.
Yeni suyun sicakligi da 24 °C'dir. Önceden BSA ile inkübe
edilmemis olan 500 Da'lik bir membran kullanilmistir.
0 Diyaliz araçlari üç adet 2 l saltere yerlestirilmistir ve
her bir salterde uzun bir karistirici (yani karistirma
çubugu) mevcut oldugundan döndürülmüstür.
0 Diyalizden sonra numuneler 1.5 ml'lik yeni flakonlara
aktarilmistir.
Adim 6: Çalkalama
o 20 dakika çalkalama yapilmistir [Heidolph Multi Reax
çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm), oda sicakligi]
Adim 7: Pozitif LER kontrolünün hazirlanmasi
- LER kontrolü. 4 saatlik. diyaliz sonlanmadan 1 saat önce
hazirlanmistir, böylece kontrolün diger numunelerle ayni
anda hazir bulunmasi saglanmistir.
0 900 ul rituksimab veya rituksimab plasebosu + 100 ul CSE
- Oda sicakliginda 1 saat çalkalama yapilmistir [Heidolph
Multi Reax Çalkalayicisi, yüksek hiz (2,037 rpm)]
Adim 8: LAL analizi
0 Her bir numune (lOO ul) bir plak üzerine iki kopya halinde
uygulanmistir
o Okuyucuda 37°C'de 10 dakika inkübasyon
gerçeklestirilmistir.
0 Her bir numuneye lOO pl kromojen uygulanmistir.
0 Okuyucuda ölçüm baslatilmistir.
Bulgular ve tartisma:
Sonuçlar Sekil 10(A)'da (yani [rituksimab 079], sifir
inkübasyon), Sekil lO(B)'de ([rituksimab 080], 4 saatlik
inkübasyon), Sekil lO(C)'de ([rituksimab 081], 1 günlük
inkübasyon) ve Sekil lO(D)'de ([rituksimab 082], 3 günlük
inkübasyon) gösterilir. 7 günlük inkübasyon için sonuçlar
gösterilmez. Sonuçlar yine burada tarif edilen protokoller
kullanildiginda rituksimab ve ayrica rituksimab plasebosu
numuneleri için iyi geri kazanim oranlarinin elde
edilebilecegini gösterir. Bunlarin yani sira, bu deney, MgClz
ilavesinden Önce bir inkübasyon süresinin geri kazanim
oranlarini iyilestirmedigini gösterir. Daha özel bir ifadeyle,
0-4 saatlik inkübasyon süresi arzu edilen aralikta (%50-200)
geri kazanim oranlari saglamistir, öte yandan l günlük ve 3
günlük inkübasyon süreleri daha düsük geri kazanimi oranlari
(yaklasik olarak %20-30) ile sonuçlanmistir. Sifir (yani 010
saatlik) inkübasyon gerçeklestirildiginde rituksimab için çok
iyi geri kazanim oranlari elde edilmistir (%70-80). Ayrica 5.0
EU/ml CSE katkili rituksimab plasebosu için geri kazanim orani
tatmin edicidir. 0.5 EU/ml CSE katkili rituksimab plasebosu
için geri kazanim orani negatiftir, çünkü taslak çok
yüksektir. Bu, söz konusu taslak numunenin endotoksin ile
kontamine oldugunu gösterir. Bu deneyde su kontrolünün (%80-
geri kazanim
oranlari da tatmin edicidir.
Referans Örnegi 8: Teknigin mevcut durumuna ait protokol ("LAL
analizi") ve bu protokolde yapilan degisiklikler rituksimabta
veya rituksimab plasebosunda LER etkisinin üstesinden gelemez
Bu Örnekte, yaygin olarak bilinen LAL analizinin rituksimab ve
rituksimab plasebosu preparatlarinda endotoksinleri saptama
becerisine sahip olup olmadigi belirlenmistir. Dolayisiyla
asagidaki materyaller kullanilmistir:
reaktifi (yani ACC kiti)
LAL analizleri üretici firma tarafindan tarif edildigi gibi
dogru bir sekilde gerçeklestirilmistir.
Sekiller ll(A)-(C)'de (yani sirasiyla [rituksimab 002],
standart LAL analizi, birtakim farkli seyreltilerin test
edildigi durumlarda bile tatmin edici geri kazanim. oranlari
saglamamistir. Daha özel bir ifadeyle, bir deneyde
([rituksimab 002]) rituksimab, 96 kuyulu bir plaga (yani bir
mikrotitre plagina) pipet yardimiyla ekilmistir ve buraya 0.5
EU/ml veya 5.0 EU/ml'lik bir nihai konsantrasyonda Lonza CSE
katilmistir. Sonrasinda Sekil ll(A)'da ([rituksimab 002])
gösterildigi üzere 96 kuyulu plakta su ile seyreltme islemleri
gerçeklestirilmistir. Ardindan bir LAL analizi
gerçeklestirilmistir. Ancak Sekil 11(A)'da ([rituksimab 002])
gösterildigi üzere %50'lik geri kazanima ulasilmamistir.
Benzer bir deneyde (yani [rituksimab 004]) rituksimab, bir
mikrotitre plaginin gözlerine pipet yardimiyla ekilmistir ve
buraya 0.5 EU/ml veya 5.0 EU/ml'lik bir nihai konsantrasyonda
Lonza. CSE ve ACC CSE katilmistir. Sonrasinda. Sekil 11(B)'de
([rituksimab 004]) gösterildigi üzere 96 kuyulu plakta su ile
seyreltme islemleri gerçeklestirilmistir. Akabinde ölçüm
yapilmistir. Ancak, Sekil 11(B)'de gösterildigi üzere, ACC CSE
ile %200'den yüksek bir geri kazanim elde edilmistir ve ayrica
Lonza CSE katimi, tatmin edici geri kazanim oranlari
saglamamistir.
Sonraki deneylerde, pH ayarinin LAL analizine etkisi
incelenmistir. Daha özel bir ifadeyle, bir deneyde [rituksimab
005] rituksimab bir mikrotitre plagina pipet yardimiyla
ekilmistir` ve plakta Lonza CSE katimi gerçeklestirilmistir.
Sonrasinda Sekil 11(C)'de [rituksimab 005] gösterilen su ile
seyreltme veya pH ayarlama islemleri gerçeklestirilmistir.
Ancak ne seyreltme ne de pH ayarlama islemi %50'lik bir geri
kazanim saglamamistir (bkz. Sekil 11(C) [ rituksimab 005]).
Ayrica diyaliz tek basina tatmin edici bir geri kazanim orani
ile sonuçlanmamaktadir. Daha özel bir ifadeyle, baska bir
deneyde, rituksimaba 0.5 ve 5.0 EU/ml'lik bir nihai
konsantrasyonda CSE katilmistir (yani 900 pl rituksimab
solüsyonu, . Sonrasinda
numuneler bir 1 ml'lik Döndürmeli Diyaliz Aletinde (1 ml
Teflon haznelerde) 4°C'de 4 saat diyaliz edilmistir ve su 2
saat sonra degistirilmistir. Diyaliz membrani 100 Da'lik bir
MWCO degerine sahiptir. Akabinde Sekil 12'de ([rituksimab
011]) gösterildigi üzere plakta seyreltme islemleri
yapilmistir. Sonrasinda LAL analiziyle endotoksin geri
kazanimi ölçülmüstür. Ancak iyi geri kazanim oranlari sadece
su kontrolleri için elde edilebilmistir. Rituksimab söz konusu
oldugunda maksimum. geri kazanini %5'ten düsüktür (bkz. Sekil
12, [rituksimab 011]). Dolayisiyla, diyaliz ve seyreltme tek
basina LER etkisinin üstesinden gelememektedir.
Referans Örnegi 9: Bekleme süresi çalismalari
LER. etkisini belirlemek ve izlemek amaciyla, bir endotoksin
bekleme süresi çalismasinda zaman içerisinde endotoksin
içerikleri izlenmistir. Dolayisiyla, çesitli tamponlarin
seyreltilmemis numunelerine endotoksin katilmistir ve bunlar
bir süreligine (28 gün kadar) saklanmistir. Uygun numune
karisimi katildiktan sonra PPC'de geri kazanilan kabul
edilebilir endotoksin degerleri, teorik katim degerinin (%100)
etkisi, zaman içerisinde endotoksinlerde anlamli bir kayip
üzerinden gösterilir. Daha özel bir ifadeyle, endotoksin
degerlerinde, teorik katim. degerinin %50'sinin altina dogru
olumsuz bir egilim LER etkisinin bir göstergesidir.
Bir endotoksin bekleme süresi çalismasinda birtakim
formülasyon tampon bilesenleri incelenmistir (sonuçlar için
bkz. asagidaki tablo).
Tablo 1: Bekleme süresi çalismalari
eksipiyan endotoksin endotoksin geri kazanimi
baslangi 7. 14. 21. 28.
Polisorbat 20
Polisorbat 20 +
NazHPO4
Polisorbat 20 +
NazHPO4 + NaH2P04
Polisorbat 20 +
NaQHPO4 + NaH2P04
sodyum sitrat-
dihidrat
Polisorbat 80
Na sitrat +
polisorbat 80 +
Na sitrat +
polisorbat 80
polisorbat 80 +
t.e.= tespit edilmedi
Yukaridaki
NazHPO4; .polisorbat 20 ve NaH2P04;
NaHzPO4; Na sitrat,
tabloda gösterildigi
polisorbat
Polisorbat 20,
polisorbat
NazHPO4+
polisorbat 80 ve ayrica polisorbat 80 ve NaCl içeren tamponlar
bir LER etkisi sergilemektedir.
Referans Örnegi 10: Tampon ve deterjanin LER etkisi için önemi
Birkaç deneyde sitrat ve/Veya polisorbat 80'in LER etkisi için
önemi analiz edilmistir. Daha özel bir ifadeyle, bir deneyde
numune olarak rituksimab ve 25 mM sodyum sitrat tamponu
kullanilmistir. Katim› isleminden önce pH seviyesi 7 olarak
ayarlanmistir. Sonrasinda plakta CSE katimi
gerçeklestirilmistir ve numuneler su ile seyreltilmistir.
Sekil 14(A)'da (yani [rituksimab 006]) gösterildigi üzere,
sodyum sitrat için lle'luk bir seyreltme oraniyla tatmin
edici bir geri kazanim orani elde edilebilmistir. Ancak
rituksimab söz konusu oldugunda %50'lik bir geri kazanim
oranina ulasilamamistir.
Baska bir deneyde numune olarak 25 mM sodyum sitrat tamponu,
polisorbat 80 ve bunlarin bir kombinasyonu kullanilmistir.
Daha özel bir ifadeyle, Rituksimab formülasyonundaki
konsantrasyonlar kullanilmistir (yani polisorbat 80: 0.7
mg/ml; sodyum sitrat: 9 mg/ml). Bu tampon sistemlerine 0.5 ve
.0 EU/ml Lonza CSE veya Cape cod CSE katilmistir (ancak
burada sodyum sitrata sadece Lonza katilmistir, çünkü yukarida
tarif edilen ve Sekil 14(A)'da ([rituksimab 006]) gösterilen
deneyde sodyum› sitrat tamponuna ACC katimi halihazirda
gerçeklestirilmistir. Katim isleminden sonra plakta su ile l:2
veya 1:5'lik bir seyreltme islemi gerçeklestirilmistir.
Polisorbat 80 için birkaç numunede %50 ila %200 araliginda
tatmin edici bir geri kazanim orani elde edilmistir. Öte
yandan, sodyum sitrat tamponu söz konusu oldugunda, sadece
lle'lukr seyreltme orani %50 ila %200 araliginda bir geri
kazanim orani saglamistir. Bu, LER etkisi üzerinde sitrat
tamponunun polisorbat 80'e kiyasla daha anlamli bir etkiye
sahip olugunu gösterir. Ayrica, bu deneyde numune olarak bir
sodyum sitrat ve polisorbat 80 kombinasyonunun kullanildigi
durumlarda LER etkisi asilamamistir. Bu deney, monoklonal
antikor formülasyonlarinda LER etkisinin tampon
formülasyonundan (yani sodyum sitrat tamponu ve polisorbat 80
kombinasyonundan) kaynaklandigini gösterir.
Bu sonuçlar, birkaç farkli seyreltinin test edildigi baska bir
deney ile dogrulanmistir. Daha özel bir ifadeyle, 25 mM sodyum
sitrat tamponu (pH 6.5) ve/Veya 700 mg/L polisorbat 80 (yani
rituksimab formülasyonu) içeren numuneler hazirlanmistir. Bu
preparatlara ve ayrica su kontrollerine 0.5 veya 5.0 EU/ml'lik
bir nihai konsantrasyonda Lonza CSE katilmistir.
Tüm numuneler 1.5 ml'lik bir distan geçme kapakli, düz tabanli
seffaf cam kap içerisinde vorteks makinesinde oda sicakliginda
1 saat çalkalanmistir [çalkalayici: Heidolph Multi Reax,
yüksek hiz (2,037 rpm)]. Sonrasinda Sekil 14(B)'de
([rituksimab 029]) gösterildigi üzere 1.5 inl'lik flakonlarda
endotoksinsiz su ile seyreltme islemleri gerçeklestirilmistir
ve seyreltiler (önceden oldugu gibi) 1 dakika çalkalanmistir.
Çalkalama isleminden sonra LAL analizi gerçeklestirilmistir.
Daha özel bir ifadeyle, her bir numune (100 ul) bir 96 kuyulu
plak üzerine uygulanmistir ve okuyucuda 37°C'de 10 dakika
inkübe edilmistir. Akabinde numunelerin her birine 100 ul
kromojen ilave edilmistir ve ölçüm yapilmistir. Sekil 14(B)'de
(yani [rituksimab 029]) gösterildigi üzere tamponun (yani
sodyum sitrat tamponunun) LER etkisi, deterjanin (yani
polisorbat 80) LER etkisine kiyasla daha kuvvetlidir.
Polisorbat 80 nispeten sabit bir geri kazanim orani (~%40-90,
bkz. Sekil 14(B), (yani [rituksimab 029]), sagdan 2-5.
sütunlar) sergilerken, sitrat tamponunda LER etkisi ise
seyreltme oranina baglidir. En önemlisi, polisorbat 80'in
sitrat tamponu ile birlestirildigi durumlarda (monoklonal
antikor formülasyonlarinda oldugu üzere) kuvvetli ve tekrar
üretilebilir bir LER etkisi gözlemlenir (bkz. Sekil 14(B)
(yani [rituksimab 029]). Ayrica yüksek seyreltme oranina sahip
bu numunelerde geri kazanim orani sadece ~%5-10'dur.
Dolayisiyla bu deneyde, bir pozitif LER etkisinin nasil elde
edilebilecegi gösterilir. Bu sonuç endotoksin tayini alaninda
öncülük edebilir, çünkü birtakim araçlarin ve yöntemlerin LER
etkisini asma becerisinin test edilmesini saglar.
Tampon ve deterjan etkisi ayri olarak analiz edilirken,
tamponun LER etkisi üzerindeki etkisi hem NeoRecormon® hem de
Rituksimab için daha belirgindir (bkz. örnegin Sekil l4(B),
yani [rituksimab 029]). Bu veriler sasirtici sekilde tamponun
uzaklastirilmasinin, deterjanin uzaklastirilmasindan daha
kritik oldugunu gösterir. Her iki formülasyonda da tampon
konsantrasyonlarinin karsilastirilabilir düzeyde oldugu
dikkate alindiginda (rituksimab: 25 mM sodyum sitrat ve
NeoRecormon: , bu etkinin nedeninin,
tamponun yapisinda ve/Veya fizikokimyasal özelliklerinde
bulunmasi gerekir. Sodyum sitrat iyi bilinen bir kelatlayici
anyondur, fosfatta ise bu etki daha belirsizdir. Dolayisiyla,
bu gözlemler ayrica Mgß'ilavesinin LER etkisini asmada neden
Önemli oldugunu. da açiklayabilir, çünkü. Mg2+ ile kelatlayici
tampon kompleks olusturarak LAL testinde Mg2+ konsantrasyonunu
düsürebilir.
Referans Örnegi 11: Standart fiziksel ve biyokimyasal
yöntemler, LER etkisiyle maskelenen endotoksinlerin geri
kazanimini saglamaz
LER etkisinin üstesinden gelmek için (Referans Örnegi 9'da LER
etkisine sahip oldugu belirlenen tamponlarda), farkli fiziksel
ve biyokimyasal yöntemler test edilmistir:
Endotoksin katkili numunelerin -30°C'de dondurulmasi. Bu
çalisma, LER'nin 2-8°C'ye kiyasla oda sicakliginda daha
belirgin olduguna dair ilk bulguya dayanir. Sonuç:
endotoksin katkili numunelerin dondurulmasi LER'nin
üstesinden gelmez.
Endotoksin katkili numunelerin 70°C'de 30 dakika
isitilmasi. Bu çalisma, isitmanin bazi ürünlerde endotoksin
maskelenme etkilerini üstesinden geldiginin gösterilmesi
nedeniyle yürütülmüstür (Dawson, .
Sonuç: Endotoksin katkili numunelerin isil isleme tabi
tutulmasi LER'nin üstesinden gelmez.
Endotoksin katkili numunelerin maksimum geçerli seyreltme
oraninda (MVD) seyreltilmesi. Bu çalisma, numune
seyreltmenin, LAL inhibisyonunun üstesinden gelmek için
standart yöntem olmasi nedeniyle yürütülmüstür. Sonuç:
Sekil ll'de (yani [rituksimab 002], [rituksimab 004],
basina LER etkisinin üstesinden gelemez.
Endotoksin katkili numuneler için EndoTrap Kolonlarin
kullanilmasi. Bu kolonlar, endotoksinlerin solüsyonlardan
afinite kromatografisiyle uzaklastirilmasini saglayacak
sekilde islev görür. Bir sulu endotoksin solüsyonu ile bir
test gerçeklestirilmistir. Sonuç: Endotoksinler kolondan
geri kazanilamaz.
Referans Örnegi 12: Deterjanlarin diyaliz yoluyla
uzaklastirilmasi
Piyasadan temin edilebilen birtakim diyaliz hazneleri ve
membranlari (farkli molekül agirligi esik degerlerine (MWCO)
sahip olanlar dahil), asagida detaylandirildigi gibi test
edilmistir.
Diyaliz haznelerine yönelik piyasadan temin edilebilen uygun
membranlar örnegin selüloz asetat (MWCO: 100 ila 300,000 Da),
rejenere selüloz (MWCO: 1,000 ila 50,000 Da) veya selüloz
esteri (MWCO: 100 ila 500 Da) kapsar. Burada selüloz asetat ve
selüloz ester tercih edilir, en çok tercih edilen selüloz
asetattir.
Test numuneleri (yani rituksimab) diyalizden önce
seyreltilmistir, bu sayede CMC'ye yaklasilmistir` ve diyaliz
membraninda difüzyona ugramasi beklenen artan düzeylerde
deterjan monomerleri saglanmistir. Katilan CSE'nin geri
kazanim orani üzerindeki incelemelerde, rituksimab söz konusu
oldugunda rejenere selülozun selüloz asetat kadar etkili
olmadigi ortaya çikmistir. Rituksimab ile gerçeklestirilen bir
dizi deneyde MWCO'nun tercihen ~1O kDa oldugu belirlenmistir.
Bu boyut, i) diyaliz prosesini hizlandirdigi ve ii) ayrica
deterjanin daha yüksek dereceli oligomerik agregalarinin
(misellerinin degil) membrandan geçisini sagladigi
düsünüldügünden tercih edilir, selüloz asetatin hidrofobik
karakteri (glikoz polimerleri üzerinde asetil esterler içerir)
bu tip tasinim proseslerini inhibe etmeyecektir.
Diyaliz için optimumu belirlemeye yönelik deney,
NeoRecormon®'un durumunu taklit edecek sekilde
gerçeklestirilmistir. Yukarida belirtildigi üzere, tampon ve
deterjan, numune formülasyonunda LER etkisini en çok etkileyen
bilesiklerdir. NeoRecormon® formülasyonunu taklit etmek için,
0.1 mg/ml polisorbat 20 varliginda 0.5 ml'lik (2.7 mg) toplam
hacimde tanimli bir Iniktar fosfat tamponu hazirlanmistir ve
diyalize tabi tutulmustur` (bir döndürmeli diyaliz aracinda).
Sekil 1'de, 12-16 kDa'lik bir MWCO degerine sahip bir selüloz
asetat diyaliz membraninin kullanildigi böylesi bir deneyin
çok basit bir örnegi gösterilir. Burada, belirli bir süre
geçtikten sonra iç diyalizatta kalan materyal gösterilir, bu
sayede diyalizin etkinligi kanitlanir. Daha özel bir ifadeyle,
72 saatlik (3 gün) bir süre sonunda iç diyaliz haznesinde
kalan materyalin agirligi analiz edilmistir. Sonuç oldukça
sasirticidir, çünkü NeoRecormon® formülasyonunun tam ve etkili
diyalizinin sadece oda sicakliginda daha uzun bir diyaliz
süresiyle (> 24 - 48 saat) saglanabilecegini gösterir. Bu
deney esasinda tercih edilen diyaliz süresi 20 saat ila gece
boyudur (örnegin 24 saat). Bunlarin yani sira, bu sonuç,
Harvard Döndürmeli Diyaliz Aracina kiyasla Harvard Hizli
Diyaliz Aracinin tercih edildigini gösterir, çünkü Harvard
Hizli Diyaliz Araci iki kat diyaliz membrani alanina sahiptir
ve dolayisiyla daha hizli bir diyaliz saglar.
Sekil 2'de, fosfatin diyalizin iç diyalizat bölmesine
yerlestirildigi durumlarda diyaliz etkinligi gösterilir. Bu
deneyde diyaliz membrani (MWCO: , numuneye katilan
CSE'nin spesifik olmayan absorbansini engellemek amaciyla
kullanilmadan önce %O.2 BSA ile yikanmistir (30 dakika). Ancak
burada saglanan yöntemlerde numunelerin seyreltilmesi (örnegin
1:10'luk oranda bir seyreltilmesi) deterjan konsantrasyonunu
Referans Örnegi 13: MgClg'nin LER etkisi için önemi
LER etkisinin numuneye MgCl2 ilave edilmesi yoluyla
azaltilabilecegi bulunmustur (bkz. örnegin Sekil 15 (yani
Mg”' konsantrasyonunun, sodyum sitrat konsantrasyonunun iki
kati oldugu durumlarda (yani 50 mM Mgß) gözlemlenmistir.
Daha özel bir ifadeyle, 25 mM sodyum sitrat tamponu (pH 6.5)
(yani sodyum sitrat tamponu (pH 6.5)) ve/veya, 0.7 mg/ml
polisorbat 80 içeren numuneler (pH 6.5, yani rituksimab
formülasyonu) hazirlanmistir. Bu preparatlara ve ayrica su
kontrollerine 0.5 veya 5.0 EU/ml'lik bir nihai konsantrasyonda
Lonza CSE katilmistir. Tüm numuneler 1.5 ml'lik bir distan
geçme kapakli, düz tabanli seffaf cam kap içerisinde oda
sicakliginda 1 saat çalkalanmistir [çalkalayici: Heidolph
Multi Reax, yüksek hiz (2,037 rpm)]. Akabinde numunelere 10
mM, 25mM, 50 mM veya 75 mM'lik bir konsantrasyona ulasana
kadar MgC12 ilave edilmistir. Sonrasinda 1.5 ml'lik bir
flakonda endotoksinsiz su ile Sekiller 15(A), l8(B), l8(C) ve
18(D)'de (yani [rituksimab 030 - rituksimab 033]) gösterilen
seyreltme islemleri gerçeklestirilmistir ve 1 dakika çalkalama
(yani yukarida tarif edildigi üzere vorteksleme) yapilmistir.
Çalkalama isleminden sonra LAL analizi gerçeklestirilmistir.
Daha özel bir ifadeyle, her bir numune (100 pl) bir 96 kuyulu
plak üzerine uygulanmistir ve okuyucuda 37°C'de 10 dakika
inkübe edilmistir. Akabinde numunelerin her birine 100 ul
kromojen ilave edilmistir ve ölçüm yapilmistir. Sekil 15(A)'da
([rituksimab 030]) gösterildigi uzere, MgCl2 (10 mM) tüm
seyreltik numunelerde sitratin kompleks yapici etkisini
nötralize edebilir. Magnezyum iyonlari, polisorbat 80 ve
ayrica sitrat tamponu içeren numunelerde LER etkisini azaltir.
Bu durumda 5.0 EU/ml için yaklasik olarak %50'lik ve 0.5 EU/ml
için %25'lik bir geri kazanim saglanir. Su kontrolü degerleri
teorik olarak beklenen deger (yani %70-130) civarinda degisir.
Ayrica, Sekiller l5(A), 15(B), 15(C) ve l5(D)'deki (yani
konsantrasyonun iki katina esit bir MgClz konsantrasyonunun
(yani 50 mM MgClz) en iyi geri kazanim oranlarini sagladigini
gösterir. 25 mM ve 75 mM optimal MgC12 konsantrasyonlari
degildir, ancak bu konsantrasyonlar sitrat tamponunda LER
etkisinin üstesinden gelir (geri kazanim: %75-190). Numune
olarak rituksimabin kullanildigi benzer bir deneyde, 10 mM, 50
mM veya 75 mM'lik bir MgClz konsantrasyonunda MgClz ilavesinin
ve akabinde 1:10 oraninda seyreltmenin tek basina (diyaliz
olmadan) 5.0 EU/ml'lik bir nihai konsantrasyonda katilan
endotoksinin tatmin edici düzeyde geri kazanimini sagladigi
gösterilmistir (bkz. Sekil 5 yani [rituksimab 059]).
Referans Örnegi 14: Mekanik islemlerin LER etkisi üzerindeki
Mekanik islemlerin (örnegin çalkalama ve ultrason) miselleri
dagitmada ve dolayisiyla LER etkisini azaltmada faydali olup
olmadigi test edilmistir.
Daha özel bir ifadeyle, endotoksinsiz suya (yani LAL suyuna)
ve rituksimaba 0.5 ve 5.0 EU/ml'lik bir nihai konsantrasyonda
Lonza CSE katilmistir. Akabinde numuneler 1 saat sonikasyona
tabi tutulmustur ya da 1 saat çalkalanmistir, yani
vortekslenmistir [1.5 ml'lik bir distan geçme kapakli, düz
tabanli seffaf cam kapta oda sicakliginda Heidolph Multi Reax
çalkalayicisinda yüksek hizda (2,037 rpm)]. Ardindan
endotoksinsiz su ile 1:10'luk (numunezsu) seyreltiler
hazirlanmistir. Sonrasinda seyreltik numuneler 12-16 kD'lik
bir membran (diyalizden önce %0.2 BSA içinde 30 dakika inkübe
edilmistir) ile diyaliz edilmistir. Diyaliz iki adet 2 1
salter içinde 4 saat sürdürülmüstür. Dis diyalizat ]_ 1 Aqua
Braun'dur ve 2 saatlik diyalizden sonra su degistirilmistir.
Diyalizden sonra bazi numunelere 50 mM'lik. bir nihai MgC12
konsantrasyonunda MgC12 ilave edilmistir (bkz. Sekil 16
(ayrica MgC12 içermeyen numuneler) 20 dakika çalkalanmistir
(örnegin yukarida tanimlandigi gibi vortekslenmistir).
Sonrasinda LAL analizi gerçeklestirilmistir. Daha özel bir
ifadeyle, her bir numune (100 ul) bir 96 kuyulu plak üzerine
uygulanmistir ve okuyucuda 37°C'de 10 dakika inkübe
edilmistir. Akabinde numunelerin her birine 100 ul kromojen
ilave edilmistir ve Ölçüm yapilmistir. Sekil l6'da (yani
çalkalama veya ultrasonla iyilesmemistir. Dolayisiyla, LER'ye
neden olan misellerin çalkalama veya ultrason yoluyla mekanik
olarak dagitilmasinin etkisiz oldugu sonucuna varilabilir.
Ancak MgClz (50 mM) ilavesi, %5-20 kadar iyilestirilmis geri
kazanim degerleri saglayarak LER etkisini azaltmistir.
Bunlarin yani sira, bu deneyde ayrica LER etkisini asma
bakimindan gerçeklestirilen farkli adimlarin sirasinin önemli
oldugu gösterilir. Daha özel bir ifadeyle, yukarida tarif
edilen (ve Sekil l6'da yani [rituksimab 034] gösterilen)
deneyde adimlarin sirasi (a) seyreltme, (b) diyaliz ve (c)
MgClz ilavesi seklindedir. Bu sira tatmin edici geri kazanim
oranlari saglamamaktadir (bkz. Sekil 16 [rituksimab 034]).
Ancak, Sekiller 3 ve 4'te (yani [rituksimab 046], [rituksimab
115] ve [rituksimab 117]) gösterildigi üzere, (a) MgC12
ilavesi, (b) seyreltme ve (c) diyaliz seklindeki sira, FDA
gereksinimlerini (yani %50-%200) karsilayan geri kazanim
oranlari saglamaktadir.
Claims (1)
- ISTEMLER Bir limulus amebosit lizat (LAL) analizi için bir numunenin hazirlanmasina yönelik bir yöntem olup, özelligi; burada numunenin bir antikor ihtiva etmesi ve burada yöntemin asagidaki adimlari belirtilen sirayla içermesidir: (a) tercihen MgClz formunda bulunan magnezyum iyonlarinin numuneye ilave edilmesi, (c) 5.7-8.0'lik bir pH seviyesine sahip numunenin, bir endotoksinsiz sulu solüsyona karsi diyaliz edilmesi. Bir LER etkisi sergileyen bir antikor içeren bir numunede bir bakteriyel endotoksinin belirlenmesine yönelik bir yöntem olup, özelligi; burada yöntemin asagidaki adimlari belirtilen sirayla içermesidir: (a) tercihen MgClz formunda bulunan magnezyum iyonlarinin numuneye ilave edilmesi, (b) numunenin seyreltilmesi, (c) 5.7-8.0'lik bir pH seviyesine sahip numunenin, bir endotoksinsiz sulu solüsyona karsi diyaliz edilmesi ve (d) numunedeki bakteriyel endotoksinin bir LAL analiziyle belirlenmesi. Istem 1 veya 2'de tanimlanan yöntem olup, özelligi; burada antikorun bir terapötik antikor olmasidir. Istemler l-3'ün herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özelligi; burada antikorun polisorbat 80 ile birlikte formüle edilmesidir. Istemler l-4'ün herhangi birinde tanimlanan yönteni olup, özelligi; burada antikorun bir sitrat tamponu ile birlikte formüle edilmesidir. Istemler l-5'in herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özelligi; buradar antikorunr yaklasik 25 mM sodyumr sitrat tamponu ve yaklasik 700 mg/l polisorbat 80 ile birlikte formüle edilmesi ve yaklasik 6.5'lik bir pH seviyesine sahip olmasidir. Istemler 1-6'nin herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özelligi; burada antikorun anti-CDZO antikor rituksimab olmasidir. Istemler 1-7'nin herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özeligi; burada (a) adiminda magnezyum iyonlarinin yaklasik 25 ila 75 mM'lik bir nihai konsantrasyonda ilave edilmesidir. Istemler 1-8'in herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özelligi; burada (b) adiminda numunenin pH seviyesinin, numunenin 10-50 mM Tris/HCl tamponu (pH 6.0-9.0, tercihen pH 6.0-8.0) ile seyreltilmesi yoluyla ayarlanmasidir. Istemler l-9'un herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özelligi; burada (b) adiminda numunenin 1:10 oraninda seyreltilmesidir. Istemler 1-10'un herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özelligi; burada (0) adiminda diyaliz esnasinda numunenin 6.0-8.0'lik bir pH seviyesine sahip olmasidir. Istemler 1-11'in herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özelligi; burada (0) adiminda diyalizin oda sicakliginda yaklasik 24 saat sürmesidir. Istemler 1-12'nin herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özelligi; burada (c) adiminda diyaliz için 10 kDa'lik bir molekül agirligi esik degerine sahip bir membranin kullanilmasidir. Istemler 1-13'ün herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özelligi; burada un adiminda diyaliz için bir selüloz asetat membranin kullanilmasidir. Istemler 1-14'ün herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özelligi; burada (c) adiminda diyaliz için suyun iki kere degistirilmesidir. Istemler 2-15'in herhangi birinde tanimlanan yöntem olup, özelligi, ilaveten, bilinen miktarda endotoksinin bir numune örnegine katilmasi ve endotoksin katkili numune örneginin 60 dakika ila 2 saat çalkalanmasi yoluyla bir pozitif düsük endotoksin geri kazanim (LER) kontrolünün üretilmesini içermesidir. Istemler l-l6`nin herhangi birinde tanimlanan yöntemin, bir antikor içeren numuneyi enzimatik LAL kaskatinda faktör C'ye karsi reaktif hale getirmeye yönelik kullanilmasidir.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP15178683.7A EP3124976B1 (en) | 2015-07-28 | 2015-07-28 | Improved bacterial endotoxin test for the determination of endotoxins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| TR201816369T4 true TR201816369T4 (tr) | 2018-11-21 |
Family
ID=53776384
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| TR2018/16369T TR201816369T4 (tr) | 2015-07-28 | 2015-07-28 | Endotoksin tayinine yönelik iyileştirilmiş bakteriyel endotoksin testi. |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US10585097B2 (tr) |
| EP (1) | EP3124976B1 (tr) |
| JP (2) | JP6800226B2 (tr) |
| KR (1) | KR102630300B1 (tr) |
| CN (2) | CN111638346A (tr) |
| AR (1) | AR105497A1 (tr) |
| AU (1) | AU2016298598B2 (tr) |
| BR (1) | BR112018001748A8 (tr) |
| CA (1) | CA2989960C (tr) |
| DK (1) | DK3124976T3 (tr) |
| ES (1) | ES2699526T3 (tr) |
| HR (1) | HRP20181954T1 (tr) |
| IL (2) | IL256660B (tr) |
| LT (1) | LT3124976T (tr) |
| MX (1) | MX2018000679A (tr) |
| PL (1) | PL3124976T3 (tr) |
| PT (1) | PT3124976T (tr) |
| RS (1) | RS58167B1 (tr) |
| SI (1) | SI3124976T1 (tr) |
| TR (1) | TR201816369T4 (tr) |
| WO (1) | WO2017017135A1 (tr) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US11099189B2 (en) | 2017-10-17 | 2021-08-24 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Limulus amoebocyte lysate assay and method of same |
| EP3483609B1 (en) | 2017-11-09 | 2022-01-05 | Andreas Buchberger | Method and kit for sample preparation and endotoxin determination |
| CN109613228A (zh) * | 2018-12-20 | 2019-04-12 | 湛江安度斯生物有限公司 | 一种减少或消除氢氧化铝佐剂干扰细菌内毒素检测的方法 |
| CN111141909B (zh) * | 2019-12-24 | 2023-05-30 | 南京健友生化制药股份有限公司 | 一种凝胶法检测硫代甘油中细菌内毒素的方法 |
| CN112462015B (zh) * | 2020-11-18 | 2022-07-12 | 海南倍特药业有限公司 | 一种氢溴酸瑞马唑仑细菌内毒素的检测方法 |
| CN116396916B (zh) * | 2023-03-02 | 2023-12-01 | 广州普言生物科技有限公司 | 低内毒素大肠杆菌及低内毒素重组人源胶原蛋白大肠杆菌工程菌 |
| CN117969228B (zh) * | 2024-04-02 | 2024-05-28 | 成都翼泰生物科技有限公司 | 一种菌液稀释液、制备方法、参考品、试剂盒及其应用 |
Family Cites Families (31)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US2123198A (en) * | 1936-10-23 | 1938-07-12 | Lederle Lab Inc | Treatment of antitoxins and the like |
| US4096091A (en) * | 1974-07-17 | 1978-06-20 | Baxter Travenol Laboratories, Inc. | Limulus lysate having improved capacity to precipitate in the presence of low endotoxin concentrations, and reconstituting solutions therefor |
| JPS5549791Y2 (tr) * | 1976-04-21 | 1980-11-20 | ||
| WO1983003830A1 (en) * | 1982-04-28 | 1983-11-10 | Charles Richardson White Gray | Blood products and processes for their production |
| US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| DK255887D0 (da) * | 1987-05-20 | 1987-05-20 | Claus Koch | Immunoassay |
| US5959177A (en) | 1989-10-27 | 1999-09-28 | The Scripps Research Institute | Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies |
| JP2957251B2 (ja) * | 1990-09-28 | 1999-10-04 | 生化学工業株式会社 | エンドトキシンの測定法 |
| GB9021370D0 (en) * | 1990-10-02 | 1990-11-14 | Ciba Geigy Ag | Monoclonal antibodies directed against complexes formed by thrombin and thrombin inhibitors |
| EP0861893A3 (en) | 1991-09-19 | 1999-11-10 | Genentech, Inc. | High level expression of immunoglobulin polypeptides |
| JP2761839B2 (ja) * | 1993-12-28 | 1998-06-04 | 株式会社 ソフィア | 遊技機の表示制御装置 |
| US5789199A (en) | 1994-11-03 | 1998-08-04 | Genentech, Inc. | Process for bacterial production of polypeptides |
| US5840523A (en) | 1995-03-01 | 1998-11-24 | Genetech, Inc. | Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides |
| JPH09171018A (ja) * | 1995-12-19 | 1997-06-30 | Tokuyama Corp | 免疫学的凝集反応試薬の製造方法 |
| EP0892271A1 (en) * | 1997-07-14 | 1999-01-20 | Universiteit Gent Laboratorium voor Bromatologie Faculteit Farmaceutische Wetenschappen | Detection of mycotoxins by flow-through membrane-based enzyme immunoassay |
| US6040498A (en) | 1998-08-11 | 2000-03-21 | North Caroline State University | Genetically engineered duckweed |
| JP2000105232A (ja) * | 1998-09-29 | 2000-04-11 | Sekisui Chem Co Ltd | 抗ＨＢｓ抗体測定試薬の製造方法 |
| JP4310854B2 (ja) * | 1999-06-14 | 2009-08-12 | Ｊｓｒ株式会社 | 診断薬用担体粒子および診断薬 |
| KR100797667B1 (ko) | 1999-10-04 | 2008-01-23 | 메디카고 인코포레이티드 | 외래 유전자의 전사를 조절하는 방법 |
| US7125978B1 (en) | 1999-10-04 | 2006-10-24 | Medicago Inc. | Promoter for regulating expression of foreign genes |
| AU2001296301A1 (en) * | 2000-09-26 | 2002-04-08 | Human Genome Sciences, Inc. | Nucleic acids, proteins, and antibodies |
| CA2423858A1 (en) | 2000-09-27 | 2003-03-26 | Japan Tobacco Inc. | Novel proteins, genes encoding them and method of using the same |
| DE102005002969A1 (de) * | 2005-01-21 | 2006-08-03 | Profos Ag | Verfahren zum Nachweis und zur Entfernung von Endotoxin |
| PE20090499A1 (es) * | 2007-08-09 | 2009-05-18 | Boehringer Ingelheim Int | Anticuerpos anti-cd37 |
| US8394602B2 (en) * | 2007-11-12 | 2013-03-12 | Hiroshima University | Luminescent method for measuring endotoxin |
| JP2008275638A (ja) * | 2008-06-23 | 2008-11-13 | Daicen Membrane Systems Ltd | エンドトキシン濃度の簡易測定器 |
| US7846678B2 (en) * | 2008-08-18 | 2010-12-07 | BioDtech, Inc. | Enhancing endotoxin detection |
| AR078161A1 (es) | 2009-09-11 | 2011-10-19 | Hoffmann La Roche | Formulaciones farmaceuticas muy concentradas de un anticuerpo anti cd20. uso de la formulacion. metodo de tratamiento. |
| CN102841205A (zh) | 2011-07-19 | 2012-12-26 | 辽宁思百得医药科技有限公司 | 一种检测注射用氟罗沙星细菌内毒素的方法 |
| MX356623B (es) * | 2011-09-01 | 2018-06-06 | Fresenius Medical Care Holdings Inc | Equipo para muestreo y deteccion de endotoxina en solucion acuosa. |
| CN102901726B (zh) | 2012-09-14 | 2014-08-13 | 莫水晶 | 血液细菌内毒素检测试剂盒的制备和应用 |
-
2015
- 2015-07-28 DK DK15178683.7T patent/DK3124976T3/en active
- 2015-07-28 TR TR2018/16369T patent/TR201816369T4/tr unknown
- 2015-07-28 RS RS20181468A patent/RS58167B1/sr unknown
- 2015-07-28 PL PL15178683T patent/PL3124976T3/pl unknown
- 2015-07-28 LT LTEP15178683.7T patent/LT3124976T/lt unknown
- 2015-07-28 ES ES15178683T patent/ES2699526T3/es active Active
- 2015-07-28 PT PT15178683T patent/PT3124976T/pt unknown
- 2015-07-28 EP EP15178683.7A patent/EP3124976B1/en active Active
- 2015-07-28 SI SI201530465T patent/SI3124976T1/sl unknown
-
2016
- 2016-07-27 MX MX2018000679A patent/MX2018000679A/es active IP Right Grant
- 2016-07-27 WO PCT/EP2016/067896 patent/WO2017017135A1/en active Application Filing
- 2016-07-27 US US15/739,503 patent/US10585097B2/en active Active
- 2016-07-27 CN CN202010521942.XA patent/CN111638346A/zh active Pending
- 2016-07-27 BR BR112018001748A patent/BR112018001748A8/pt unknown
- 2016-07-27 AU AU2016298598A patent/AU2016298598B2/en active Active
- 2016-07-27 CN CN201680044156.7A patent/CN108027374B/zh active Active
- 2016-07-27 CA CA2989960A patent/CA2989960C/en active Active
- 2016-07-27 AR ARP160102278A patent/AR105497A1/es unknown
- 2016-07-27 KR KR1020187006090A patent/KR102630300B1/ko active IP Right Grant
- 2016-07-27 JP JP2018524545A patent/JP6800226B2/ja active Active
-
2017
- 2017-12-31 IL IL256660A patent/IL256660B/en active IP Right Grant
-
2018
- 2018-11-21 HR HRP20181954TT patent/HRP20181954T1/hr unknown
-
2020
- 2020-01-28 US US16/774,461 patent/US11360085B2/en active Active
- 2020-05-11 IL IL274576A patent/IL274576B/en active IP Right Grant
- 2020-11-24 JP JP2020194005A patent/JP7164790B2/ja active Active
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| TR201816369T4 (tr) | Endotoksin tayinine yönelik iyileştirilmiş bakteriyel endotoksin testi. | |
| Sommer et al. | The virulence factor LecB varies in clinical isolates: consequences for ligand binding and drug discovery | |
| Moulin et al. | Towards a molecular understanding of the water purification properties of Moringa seed proteins | |
| CN100390193C (zh) | 检测内毒素的方法和试剂 | |
| CN105603049B (zh) | 一种用于体外诊断试剂的复合稳定剂及试剂盒 | |
| CN108642030A (zh) | 新重组因子c、其制造方法、及内毒素的测定法 | |
| CN109689088A (zh) | 稳定的液体纤维蛋白原 | |
| Mrázková et al. | Microscopy examination of red blood and yeast cell agglutination induced by bacterial lectins | |
| JP4399615B2 (ja) | トロンビンの安定化手段および組成物 | |
| Martínez-Alarcón et al. | Biochemical and structural studies of target lectin SapL1 from the emerging opportunistic microfungus Scedosporium apiospermum | |
| CN114814244A (zh) | 一种狼疮抗凝物检测试剂盒 | |
| Lorber | Analytical light scattering methods in molecular and structural biology: Experimental aspects and results | |
| Cho et al. | Advances in the production of olfactory receptors for industrial use | |
| JP4163056B2 (ja) | 血中インスリン濃度測定用添加剤組成物及びそれを含む採血管 | |
| AU2004303928A1 (en) | Endotoxin detection method | |
| CN107607724A (zh) | 一种用于补体c3测定试剂盒的复合稳定剂及其应用 | |
| Nguyen | Experimental phase diagrams to optimise membrane protein crystallisation | |
| Sharifi et al. | Recovery of AC enzymic activity of CyaA of Bordetella pertussis in the absence of 8 M urea with new purification methods | |
| Pham | Structure and function of metal-independent CAZy family 6 glycosyltransferase from Bacteroides ovatus | |
| RU2225609C2 (ru) | Способ определения рнк в составе рнк-содержащего компонента биологического препарата | |
| Nedeljković | Structural characterization of bacterial defense complex | |
| Fayyaz | Structural Characterization of Small basic protein (Sbp) and Accumulation associated protein (Aap): two Proteins involved in Biofilm Formation in Staphylococcus epidermidis | |
| CN109444312A (zh) | 一种托吡卡胺杂质及用途 | |
| Kamis | Purification and electron microscopic studies of two ABC transporter proteins of clinical relevance | |
| UA26727U (en) | Method for making agar and salt mixture |