CN114814244A - 一种狼疮抗凝物检测试剂盒 - Google Patents

一种狼疮抗凝物检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种狼疮抗凝物检测试剂盒，包括SCT‑S筛选试剂、SCT‑C确认试剂以及SCT‑CaCl2溶液；SCT‑S筛选试剂包括纯化硅溶胶、重组磷脂、第一肝素中和剂、第一缓冲液和第一辅料；SCT‑C确认试剂包括纯化硅溶胶、重组磷脂、第二肝素中和剂、第二缓冲液和第二辅料；SCT‑CaCl2溶液包括钙离子；SCT‑S筛选试剂、SCT‑C确认试剂和SCT‑CaCl2溶液为液态；SCT‑S筛选试剂中重组磷脂含量低于SCT‑C确认试剂中重组磷脂含量；本发明将纯化硅溶胶和重组磷脂搭配，试剂灵敏度高，提高阳性检出率，降低假阴性；包括肝素中和剂，消除肝素影响，提高准确性；试剂为液态，使用方便、稳定性好。

Description

一种狼疮抗凝物检测试剂盒
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种狼疮抗凝物检测试剂盒。
背景技术
狼疮抗凝物（lupus anticoagulant，LA）是一组能直接与负电荷磷脂结合，或与磷脂蛋白复合物结合的免疫球蛋白，属于抗磷脂抗体（antiphospholipid antibody，APL）。持续LA阳性患者被认为有较高血栓形成和复发风险，也是不明原因习惯性流产、死胎、易栓性疾病及某些自身免疫性疾病的危险信号；LA还能增强血小板聚集和抑制纤溶活性，故LA阳性患者易出现血栓并发症。
目前检测LA常用的方法为活化部分凝血活酶时间（activated partialthromboplastin time，APTT）、 改良的稀释蝰蛇毒时间（dilute Russell viper venomtime，dRVVT）及二氧化硅凝固时间（silica clotting time，SCT）检测法，通常以筛选试验、混合试验和确认试验传统的三步法来判读是否存在LA，且间隔12周后第二次检测，LA仍为阳性时方可确诊。LA在APS的诊断和治疗中起着非常重要的作用。
SCT法相比于dRVVT法的灵敏性更高，能够最大程度地反映病人体内LA的强弱，且不受凝血因子VII的异常或缺失影响，可适用于全自动凝血分析仪，在临床应用中的前景广阔。
但市面上主流的狼疮抗凝物检测试剂盒（SCT法）均为冻干粉形态，使用前均需要进行复溶操作，增加了人工操作步骤，并且易受复溶水质，移液器准确性和操作者手法的影响。狼疮抗凝物检测试剂盒（SCT法）灵敏度有待提升，尤其是对于待测样本中存在弱LA的情况下，经常会出现假阴性的结果。狼疮抗凝物检测试剂盒（SCT法）稳定性有待提升，效期不够长，不利于客户的使用和试剂储存，因此提升试剂的稳定性是非常有必要的。现有狼疮抗凝物检测试剂盒（SCT法）抗肝素干扰能力不足，遇到含肝素样本测试时，所得的结果不可信，因此急需提升现有试剂盒的抗肝素干扰能力。狼疮抗凝物检测试剂盒（SCT法）大多为国外进口，试剂盒定价昂贵，运输时间久，到货周期长，对医院和患者均造成了一定程度的影响。因此，开发一款快速、有效、低价、稳定的国产商业化狼疮抗凝物检测试剂盒（SCT法）是非常有必要的，并且具有广泛的应用前景。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的缺陷，提供一种狼疮抗凝物检测试剂盒，价格低廉、全液体、试剂灵敏度高、便捷、快速、抗干扰能力强、稳定性好、准确性好。
一种狼疮抗凝物检测试剂盒，包括SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液；
所述SCT-S筛选试剂包括纯化硅溶胶、重组磷脂、第一肝素中和剂、第一缓冲液和第一辅料，所述SCT-S筛选试剂为液态；
所述SCT-C确认试剂包括纯化硅溶胶、重组磷脂、第二肝素中和剂、第二缓冲液和第二辅料，所述SCT-C确认试剂为液态；
所述SCT-CaCl2溶液包括钙离子溶液，所述SCT-CaCl2溶液为液态；
所述SCT-S筛选试剂中的重组磷脂的含量低于所述SCT-C确认试剂中的重组磷脂的含量。
进一步地，优选所述纯化硅溶胶在所述SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂的质量百分比均为1~2%。
进一步地，优选所述SCT-S筛选试剂中的重组磷脂的质量百分比为0.02~0.06%，所述SCT-C确认试剂中的重组磷脂的质量百分比为1~2%。
进一步地，优选所述SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液的pH均为7.2~7.4。
进一步地，优选所述第一肝素中和剂包括聚季铵盐-10，所述聚季铵盐-10在所述SCT-S筛选试剂的含量为1~3 mg/mL。
进一步地，优选所述第二肝素中和剂包括聚季铵盐-10，所述聚季铵盐-10在所述SCT-C确认试剂的含量为1~3 mg/mL。
所述第一缓冲液、第二缓冲液分别为PBS缓冲液、Tris缓冲液、Hepes缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸缓冲液中的至少一种。
进一步地，优选所述第一缓冲液、第二缓冲液均为浓度50~150 mmoL/L 的Tris缓冲液。
进一步地，优选所述第一辅料包括第一稳定剂，所述第一稳定剂包括丙氨酸、聚乙二醇6000、Span-80、BSA、HSA、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精和甘露醇中的一种或几种。
进一步地，优选第一稳定剂包括组分：丙氨酸、聚乙二醇6000、吐温-20，且以上组分在所述SCT-S筛选试剂中的质量百分比为：丙氨酸3~5%、聚乙二醇6000 2~4%、吐温-200.1~1%。
进一步地，优选所述第二辅料包括第二稳定剂，所述第二稳定剂包括丙氨酸、聚乙二醇6000、Span-80、BSA、HSA、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精和甘露醇中的一种或几种。
进一步地，优选第二稳定剂包括组分：丙氨酸、聚乙二醇6000、吐温-20，且以上组分在所述SCT-C确认试剂中的质量百分比为：丙氨酸3~5%、聚乙二醇6000 2~4%、吐温-200.1~1%。
进一步地，优选所述SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液均包括防腐剂，所述防腐剂为苯甲酸钠、叠氮化钠、Proclin-300、庆大霉素以及亚硝酸盐中的至少一种。
进一步地，优选所述SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液均包括质量百分比为0.03-0.05% 的Proclin-300。
进一步地，优选所述SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂均包括蛋白酶保护剂，所述蛋白酶保护剂为菊糖。
进一步地，优选所述蛋白酶保护剂在所述SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂的质量百分比均为2~4%。
进一步地，优选所述钙离子在SCT-CaCl2溶液的含量为20-30 mmoL/L。
本发明的有益效果：本发明提供的一种狼疮抗凝物检测试剂盒（SCT法），SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液均为液态，相比于冻干粉型试剂盒，本发明的试剂盒使用方便、成本低廉、灵敏度高、抗干扰能力强、准确性好、稳定性好，为国产首创全液态狼疮抗凝物检测试剂盒（SCT法），可以实现对进口狼疮抗凝物的检测试剂盒的替代，充分满足临床检验的需求；还能降低医院购买检测试剂的成本，同时减少病人的检测费用，降低负担；纯化硅溶胶和重组磷脂为原料，两者搭配使用，可延长阳性患者（含弱阳）SCT-S筛选试剂的凝固时间，有利于提高阳性样本的检出率，降低假阴性，试剂灵敏度更高，测试阳性样本时，单位时间内的变化幅度要显著增强，在测试弱阳样本时，其试剂的检出能力更高，对于临床诊断更有帮助和优势；SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂还包括肝素中和剂，消除了待测样本中由于存在肝素而对检测结果产生的影响，提高检测结果的准确性。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现详细说明本发明的具体实施方式。
一种狼疮抗凝物检测试剂盒，包括SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液；SCT-S筛选试剂包括纯化硅溶胶、重组磷脂、第一肝素中和剂、第一缓冲液和第一辅料，SCT-S筛选试剂为液态；SCT-C确认试剂包括纯化硅溶胶、重组磷脂、第二肝素中和剂、第二缓冲液和第二辅料，SCT-C确认试剂为液态；SCT-CaCl2溶液包括钙离子溶液，SCT-CaCl2溶液为液态；SCT-S筛选试剂中的重组磷脂的含量低于SCT-C确认试剂中的重组磷脂的含量。
本发明的试剂盒的工作原理： SCT-CaCl2溶液提供钙离子，在钙离子存在的情况下，纯化硅溶胶可直接可直接激活待测样本的内源凝血途径，SCT-S筛选试剂含有低浓度重组磷脂，对LA很敏感，SCT-C确认试剂含有过量的重组磷脂，可与LA中和，得出较短的凝血时间。若有LA存在时，SCT-S筛选试剂中由于重组磷脂含量较低，纯化硅溶胶激活依赖于重组磷脂的凝血活酶受阻，导致生成的凝血活酶量变少，使得最终的凝固时间延长，而SCT-C确认试剂中重组磷脂含量较高，纯化硅溶胶激活依赖于重组磷脂的凝血活酶过程不受影响，生成的凝血活酶量维持不变，因此可以纠正凝固时间。
本发明提供的一种狼疮抗凝物检测试剂盒（SCT法），SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液均为液态，相比于冻干粉型试剂盒，本发明的试剂盒使用方便、成本低廉、灵敏度高、抗干扰能力强、准确性好、稳定性好，为国产首创全液态狼疮抗凝物检测试剂盒（SCT法），可以实现对进口狼疮抗凝物的检测试剂盒的替代，充分满足临床检验的需求；还能降低医院购买检测试剂的成本，同时减少病人的检测费用，降低负担；使用纯化硅溶胶和重组磷脂为原料，纯化硅溶胶是经级别更高的纯化工艺处理后所得，重组磷脂是采用基因工程制备所得，二者纯度更高，反应活性更强，使用量更低，有利于节约成本；两者搭配使用，可延长阳性患者（含弱阳）SCT-S筛选试剂的凝固时间，有利于提高阳性样本的检出率，降低假阴性，试剂灵敏度更高，测试阳性样本时，单位时间内的变化幅度要显著增强，在测试弱阳样本时，其试剂的检出能力更高，对于临床诊断更有帮助和优势；在反应时间上，本发明中含有纯化硅溶胶和重组磷脂的试剂加待测样本时需孵育30s，加入氯化钙试剂后需再孵育60s即可，而市面上现有的试剂盒不仅在加入待测样本后的孵育时间在60-90s之间，加入氯化钙试剂后需再孵育90-120s不等。相比之下，本发明的反应速度更快，基线期更短，使得每个样本所需的检测时间更短，减少标本的等待时间，更快的拿到检测报告，优化用户体验，并有利于患者的临床治疗。SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂还包括肝素中和剂，消除了待测样本中由于存在肝素而对检测结果产生的影响，提高检测结果的准确性。
纯化硅溶胶是血浆中FXII的激活剂，是凝血级联反应中的内源性激活剂，可以启动体内的内源性凝血途径，发生凝血反应。纯化硅溶胶的二氧化硅粒子相较于普通硅溶胶来说更大，而粒子大小影响硅溶胶的稳定性，在等量稳定剂条件下，粒子间的斥力位能跟粒子直径成正比，所以粒子越大稳定性越好，粒子越小胶凝越快，因此纯化硅溶胶相较于普通硅溶胶来说自身更加稳定。此外，纯化硅溶胶的硅浓度更高，一般情况下可达到40%甚至50%以上，而普通硅溶胶硅浓度最高时只有30%左右，并且纯化硅溶胶中杂质更少，对硅溶胶的性能影响更小，更有利于发挥硅的激活能力。
重组磷脂是通过大肠杆菌表面展示技术，高通量筛选技术和DNA基因重组技术筛选获得的新型磷脂，其纯度可达99%以上。普通磷脂一般多从动物或植物组织中提取的，是一种混合物，纯度较低。重组磷脂的纯度更高，促凝活性相较于普通磷脂提高了5-10倍。在SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂的质量百分比均为1~2%，SCT-S筛选试剂中的重组磷脂的质量百分比为0.02~0.06%，SCT-C确认试剂中的重组磷脂的质量百分比为1~2%，在上述配比下，有利于试剂灵敏度的提高，从而提高准确度。
第一肝素中和剂包括聚季铵盐-10，第二肝素中和剂包括聚季铵盐-10，由于待测样本中存在肝素，而肝素会对检测结果产生的影响，在SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂中加入一定浓度的聚季铵盐-10，可消除样本中由于存在肝素而对检测结果产生的影响，增强试剂盒抗干扰能力，进而提高检测准确性；聚季铵盐-10具有优越水溶性和吸附能力的阳离子聚合物，刺激性低，其独特的阳离子正电荷可以中和肝素的负电荷，使得肝素失去活性，无法起到抗凝的作用，并且在使用浓度相同的情况下，聚季铵盐-10中和肝素的效果要优于传统使用的凝聚胺、鱼精蛋白等肝素中和剂。聚季铵盐-10在SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂的含量为1~3mg/mL；在以上配比下，SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂对肝素的抗干扰能力较强。
第一缓冲液、第二缓冲液分别为PBS缓冲液、Tris缓冲液、Hepes缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸缓冲液中的至少一种，以上缓冲液的种类任意选择，优选Tris缓冲液。SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液的pH均为7.2~7.4。通过采用以上任意一种缓冲液都能够有效地将SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂维持在预定的范围内，即将溶液稳定在pH为7.2-7.4之间，并且，通过采用以上的第一缓冲液、第二缓冲液不会对检测待检测样中的狼疮抗凝物造成不利的影响；进一步地，优选第一缓冲液、第二缓冲液均为浓度50~150mmoL/L的Tris缓冲液，在该缓冲液下，纯化硅溶胶和重组磷脂可以发挥最大效率，提高试剂的灵敏度，提高检测效率以及准确度。
第一辅料包括第一稳定剂，第一稳定剂包括丙氨酸、聚乙二醇6000、Span-80、BSA、HSA、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精和甘露醇中的一种或几种。第一稳定剂的种类可选择性进行添加，也可不添加；第一稳定剂的加入可提高试剂的稳定性，可以在不影响反应体系敏感性的前提下，抑制体系中的非特异性吸附；如，添加甘露醇、海藻糖、葡萄糖、明胶等一方面有利于抑制蛋白发生冷冻变性，可以保证冷冻不会导致SCT-S筛选试剂出现沉淀和非特异性聚集的情况，从而保证试剂储存、运输等稳定性，另一方面明胶大分子具有网状结构，可产生筛孔效应，能够对蛋白进行空间限位，降低了蛋白分子之间的相互碰撞，一定程度上提高了蛋白的稳定性；添加聚乙二醇6000等多羟基醇，可提高试剂的粘度，有利于纯化硅溶胶、重组磷脂均匀的悬浮于第一缓冲液中，不易沉降，从而起到较好的稳定性作用，还可作为防冻剂，有效降低凝固点，从而达到较好的抗冻融效果；添加丙氨酸等氨基酸，氨基酸作为组成蛋白质的基本单元，添加氨基酸有利于提高试剂稳定性。添加吐温-20、Span-80等可起到表面活性剂的作用，进一步提高试剂稳定性；添加BSA、HSA等可以提高SCT-S筛选试剂中的蛋白质浓度，对蛋白酶起到一定的保护作用，提高试剂的稳定性。
进一步地，优选第一稳定剂包括组分：丙氨酸、聚乙二醇6000、吐温-20，且以上组分在SCT-S筛选试剂中的质量百分比为：丙氨酸3~5%、聚乙二醇6000 2~4%、吐温-20 0.1~1%；上述配比下，有利于提高试剂盒准确性、稳定性。
第二辅料包括第二稳定剂，第二稳定剂包括丙氨酸、聚乙二醇6000、Span-80、BSA、HSA、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精和甘露醇中的一种或几种，第二稳定剂的种类可选择性进行添加，也可不添加；第二稳定剂的加入可提高SCT-C确认试剂的稳定性，可以在不影响反应体系敏感性的前提下，抑制体系中的非特异性吸附，更重要的是，提高重组磷脂的稳定性的作用；如，添加甘露醇、海藻糖、葡萄糖、明胶等一方面有利于抑制蛋白发生冷冻变性，可以保证冷冻不会导致SCT-C确认试剂出现沉淀和非特异性聚集的情况，从而保证试剂储存、运输等稳定性，另一方面明胶大分子具有网状结构，可产生筛孔效应，能够对蛋白进行空间限位，降低了蛋白分子之间的相互碰撞，一定程度上提高了蛋白的稳定性；添加聚乙二醇6000等多羟基醇，可提高试剂的粘度，有利于纯化硅溶胶、重组磷脂均匀的悬浮于第二缓冲液中，不易沉降，从而起到较好的稳定性作用，还可作为防冻剂，有效降低凝固点，从而达到较好的抗冻融效果；添加丙氨酸等氨基酸，氨基酸作为组成蛋白质的基本单元，添加氨基酸有利于提高试剂稳定性。添加吐温-20、Span-80等可起到表面活性剂的作用，进一步提高试剂稳定性；添加BSA、HSA等可以提高SCT-C确认试剂中的蛋白质浓度，对蛋白酶起到一定的保护作用，提高试剂的稳定性。
进一步地，优选第二稳定剂包括组分：丙氨酸、聚乙二醇6000、吐温-20，且以上组分在SCT-C确认试剂中的质量百分比为：丙氨酸3~5%、聚乙二醇6000 2~4%、吐温-20 0.1~1%，上述配比下，有利于提高试剂盒准确性、稳定性。
SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液均包括防腐剂，防腐剂为苯甲酸钠、叠氮化钠、Proclin-300、庆大霉素以及亚硝酸盐中的至少一种；当然防腐剂的种类可选择性的添加，也可不添加。添加防腐剂可达到防腐效果，防止由于微生物污染而导致试剂盒失效，有利于延长试剂盒的储存有效期。进一步地，优选SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液均包括质量百分比为0.03-0.05% 的Proclin-300，上述配比下，LA1筛选试剂、LA2确认试剂的防腐效果较好，有利于提高试剂的稳定性。
SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂均包括蛋白酶保护剂，当然蛋白酶保护剂的种类可选择性的添加，也可不添加。蛋白酶保护剂用于延长试剂盒中的SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂的稳定性，有利于试剂盒的长期使用和存储，有利于保护酶的活性，防止酶变性，对酶起保护作用；防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，减轻不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的；进一步地，优选蛋白酶保护剂在SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂的质量百分比均为2~4%，在该配比下，蛋白酶保护剂对SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂中的蛋白保护效果较好；进一步地，优选蛋白酶保护剂为菊糖；菊糖的羟基可以替代水分子同酶表面的酰胺基形成氢键，并且还可以束缚所包裹酶的生物活性发生变化，对酶起保护作用。防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，减轻不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性。
钙离子在SCT-CaCl2溶液的含量为20-30 mmoL/L，钙离子由氯化钙提供，在该浓度的钙离子作用下，LA1筛选试剂、LA2确认试剂中的重组蛇毒酶可快速的激活待测样本中的因子X，使因子X激活为Xa，提高试剂灵敏度，提高检测结果的准确度。
以下通过具体实施方式对本发明做进一步解释说明。
实施例1
一种狼疮抗凝物检测试剂盒，包括SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液；具体组分见下表：
表1.实施例1的试剂盒各组分配方
Figure 498501DEST_PATH_IMAGE001
注：Tris缓冲液可替换为PBS缓冲液、Hepes缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸缓冲液中任意一种或几种；丙氨酸、聚乙二醇6000、吐温20可替换为span-80、BSA、HSA、明胶、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精和甘露醇中任意一种或几种；Proclin-300 可替换为苯甲酸钠、叠氮化钠、庆大霉素以及亚硝酸盐中任意一种或几种；“/”表示不含此成分。
实施例2
一种狼疮抗凝物检测试剂盒，包括SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液；具体组分见下表：
表2.实施例2试剂盒各组分配方
Figure 415641DEST_PATH_IMAGE002
注：“/”表示不含此成分。
实施例3
一种狼疮抗凝物检测试剂盒，包括SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液；具体组分见下表：
表3.实施例3试剂盒各组分配方
Figure 929799DEST_PATH_IMAGE003
注：“/”表示不含此成分。
对比例1
对比例1中1 SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂中均不含聚季铵盐-10，其他组分及用量均与实施例1相同。
对比例2
对比例2中SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂均不含菊糖，其他组分及用量均与实施例1相同。
对比例3
对比例3中LA1筛选试剂、LA2确认试剂中将纯化硅溶胶、重组磷脂分别替换为普通硅溶剂和普通磷脂，其他组分及用量均与实施例1相同。
对实施例1~3以及对比例1~3的狼疮抗凝物检测试剂盒进行准确度、重复性、稳定性以及测试临床样本阴阳符合率。SCT法的 SCT筛选和SCT确认测定作为一项完整的试验应平行地使用，结合所列出的程序可计算出归一化比率（NR），NR的临界值为＞1.2。
应用下列公式（1）（2）（3）计算NR：
公式（1）：标准化比值（NR）＝
Figure 325009DEST_PATH_IMAGE004
；
公式（2）：SCT筛选试剂比率=
Figure 873802DEST_PATH_IMAGE005
；
公式（3）：SCT确认试剂比率=
Figure 696264DEST_PATH_IMAGE006
。
表4.实施例1~3、对比例1~3的狼疮抗凝物检测试剂盒测试正常人样本的结果
Figure 697718DEST_PATH_IMAGE007
1. 准确度测试及其结果
采用实施例1~3以及对比例1的狼疮抗凝物检测试剂盒分别测定含外源添加肝素的LA阴性控品、LA阳性质控品，每个质控品重复测试3次，按照公式（4）和（5）计算相对偏差，测试结果如表5~8所示。测试结果应符合要求：相对偏差应在±7.5%范围内。
公式（4）：
Figure 896618DEST_PATH_IMAGE008
公式（5）：
Figure 424552DEST_PATH_IMAGE009
；
式中：
T——质控品靶值；
B——相对偏差。
表5.实施例1狼疮抗凝物检测试剂盒的准确度测试结果
Figure 417915DEST_PATH_IMAGE010
表6.实施例2狼疮抗凝物检测试剂盒的准确度测试结果
Figure 906666DEST_PATH_IMAGE011
表7.实施例3狼疮抗凝物检测试剂盒的准确度测试结果
Figure 643677DEST_PATH_IMAGE012
表8.对比例1狼疮抗凝物检测试剂盒的准确度测试结果
Figure 901483DEST_PATH_IMAGE013
从表6~8的测试结果发现，实施例1~3的相对偏差比较小，证明实施例1~3都具有很好的准确性。从表8的测试结果发现，对比例1的相对偏差不符合均在±7.5%范围内的要求，由实施例1与对比例1的结果可知，通过添加适量的聚季铵盐-10可以降低待测样本中肝素的影响，防止待测样本中肝素对狼疮抗凝物测定产生干扰，实施例1中的SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂中含有一定浓度的聚季铵盐-10，消除样本中由于肝素对检测结果产生的影响，进而增加测定结果的准确度，对比例1受样本中游离肝素的干扰，导致参与凝固过程的Xa、凝血酶变少，凝固时间延长，测试结果较靶值偏差较大。因此，对比例1的准确性不如实施例1~3。
2. 重复性测试及其结果
采用实施例1~3的狼疮抗凝物检测试剂盒，测试LA阴性质控品和LA阳性质控品各 10次。按照公式（4）和（6）计算测试结果平均值（
Figure 331328DEST_PATH_IMAGE014
）和标准差（SD），按照公式（4）计算变异系 数（CV），测试结果如表9~11所示。测试结果应符合要求：LA阴性质控品变异系数（CV）≤10%； LA阳性质控品变异系数（CV）≤10%。
公式（6）：
Figure 307374DEST_PATH_IMAGE015
，式中：CV为变异系数。
表9.实施例1狼疮抗凝物检测试剂盒的重复性测试结果
Figure 582498DEST_PATH_IMAGE016
表10.实施例2狼疮抗凝物检测试剂盒的重复性测试结果
Figure 835756DEST_PATH_IMAGE017
表11.实施例3狼疮抗凝物检测试剂盒的重复性测试结果
Figure 170922DEST_PATH_IMAGE018
从表9~11的测试结果发现，实施例1~3均符合上述重复性要求。
3. 稳定性测试及其结果
1)开瓶稳定性：将实施例1~3狼疮抗凝物检测试剂盒中的SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂、SCT-CaCl2溶液开瓶后置于2~8℃储存，在第0天、第14天、第21天、第28天、第30天、第32天进行准确度测试，测试结果如表12~14所示。测试结果应符合要求：狼疮抗凝物检测试剂盒中SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂、SCT-CaCl2溶液开瓶后置于2~8℃储存可以稳定30天，即相对偏差应在±7.5%范围内。
表12.实施例1狼疮抗凝物检测试剂盒的开瓶稳定性测试结果
Figure 899844DEST_PATH_IMAGE019
表13.实施例2狼疮抗凝物检测试剂盒的开瓶稳定性测试结果
Figure 713079DEST_PATH_IMAGE020
表 14.实施例3狼疮抗凝物检测试剂盒的开瓶稳定性测试结果
Figure 211056DEST_PATH_IMAGE021
从表12~14的测试结果发现，实施例1~3符合上述开瓶稳定性要求，实施例1~3符合上述开瓶稳定性要求，SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂、SCT-CaCl2溶液开瓶后置于2-8℃至少可稳定储存32天。
2)加速稳定性：将实施例1~3及对比例2狼疮抗凝物检测试剂盒中的SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂、SCT-CaCl2溶液在未开封状态下置于37℃储存，在第0天、第12天、第14天、第16天进行准确度测试，测试结果如表15~18所示。测试结果应符合要求：狼疮抗凝物检测试剂盒中SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂、SCT-CaCl2溶液在未开封状态下置于37℃储存可以稳定14天，即相对偏差应在±7.5%范围内。
表15.实施例1狼疮抗凝物检测试剂盒的加速稳定性测试结果
Figure 717124DEST_PATH_IMAGE022
表16.实施例2狼疮抗凝物检测试剂盒的加速稳定性测试结果
Figure 667762DEST_PATH_IMAGE023
表17.实施例3狼疮抗凝物检测试剂盒的加速稳定性测试结果
Figure 284688DEST_PATH_IMAGE024
表18.对比例2狼疮抗凝物检测试剂盒的加速稳定性测试结果
Figure 637172DEST_PATH_IMAGE025
从表15~18的测试结果发现，实施例1~3符合上述加速稳定性要求，实施例1~3符合上述加速稳定性要求，SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂、SCT-CaCl2溶液未开封状态置于37℃至少可稳定储存16天。对比例 2的相对偏差在第12天检测时已不符合均在±7.5%范围内的要求，即LA1筛选试剂、LA2确认试剂、SCT-CaCl2溶液在未开封状态下置于37℃无法稳定储存12天，不符合加速稳定性要求，由实施例1与对比例2的结果可知，通过添加适量的酶蛋白保护剂菊糖利于试剂盒的长期使用和存储，有利于保护酶的活性，防止凝血酶变性，使得试剂盒具有极好的加速稳定性，相比于对比例2，实施例1-3的试剂盒具有更高的加速稳定性。
4.临床样本测试及其结果
采用参比试剂盒（ werfen，lot512357）、实施例1~3及对比例3的狼疮抗凝物检测试剂盒同时测试一组临床样本（共计50例，其中阴性和阳性各25例），以参比试剂盒的归一化比率（NR）为X轴，实施例1~3及对比例3试剂盒的归一化比率（NR）为Y轴，做阴阳符合率Kappa分析，测试结果如表19~20所示。测试结果应符合要求：阴性符合率≥90%、阳性符合率≥90%、总符合率≥90%并且Kappa值应≥0.75。
表19.实施例1~2与参比试剂测试临床样本的阴阳符合率统计
Figure 438775DEST_PATH_IMAGE026
表20.实施例3和对比例3与参比试剂测试临床样本的阴阳符合率统计
Figure 876710DEST_PATH_IMAGE027
从表19-20的测试结果发现，实施例1~3的试剂盒与参比试剂测试临床样本的阴阳符合率及Kappa值均符合要求，对比例3则不符合要求。证明实施例1~3的试剂盒与参比试剂具有较高的一致诊断率，而对比例3的一致诊断率则较差，容易出现阴阳不符的情况，发生误诊的概率较高；进一步说明纯化硅溶胶和重组磷脂搭配使用时，有利于提高阳性样本的检出率，降低假阴性，试剂灵敏度更高，测试阳性样本时，单位时间内的变化幅度要显著增强，在测试弱阳样本时，其试剂的检出能力更高。
本发明试剂盒（SCT法）能够快速、有效地对患者体内的狼疮抗凝物进行检测，并且敏感度高，相比于dRVVT及APTT试验，具有更高的灵敏性，能够定性评估患者体内是否含有狼疮抗凝物；本发明的试剂盒为全液态试剂，使用方便、成本低廉、灵敏度高、特异性强、抗干扰能力强、稳定性好，可以实现对进口狼疮抗凝物检测试剂盒（SCT法）的替代，充分满足临床检验的需求，还能降低医院购买检测试剂的成本，同时减少病人的检测费用，降低负担；通过使用特定的激活剂纯化硅溶胶并搭配重组磷脂来提高试剂的灵敏度，延长阳性患者（含弱阳）SCT-S筛选试剂的凝固时间，有利于提高阳性样本的检出率，降低假阴性；通过添加聚季铵盐-10来降低样本中肝素的影响，防止肝素对Xa及凝血酶产生影响，导致凝固时间延长，测试结果偏差较大；通过加入适量的菊糖来有效延长试剂盒的稳定性，有利于试剂盒的长期使用和储存。
以上数据及附表表明，使用本发明的试剂盒进行相关性能测试，所得结果均符合接受标准。通过上述具体实施例来验证本发明的可行性与合理性，该实施例仅为本发明可供选择的个别实施例说明，但并不局限于此。对于本领域的技术人员而言，凡是根据本发明申请的专利范围所进行的变化，修改和替换均应包含在本专利的权利要求范围内，皆属于本发明的保护范畴。

Claims (17)

1.一种狼疮抗凝物检测试剂盒，其特征在于，包括SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液；
所述SCT-S筛选试剂包括纯化硅溶胶、重组磷脂、第一肝素中和剂、第一缓冲液和第一辅料，所述SCT-S筛选试剂为液态；
所述SCT-C确认试剂包括纯化硅溶胶、重组磷脂、第二肝素中和剂、第二缓冲液和第二辅料，所述SCT-C确认试剂为液态；
所述SCT-CaCl2溶液包括钙离子溶液，所述SCT-CaCl2溶液为液态；
所述SCT-S筛选试剂中的重组磷脂的含量低于所述SCT-C确认试剂中的重组磷脂的含量。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述纯化硅溶胶在所述SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂的质量百分比均为1~2%。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述SCT-S筛选试剂中的重组磷脂的质量百分比为0.02~0.06%，所述SCT-C确认试剂中的重组磷脂的质量百分比为1~2%。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液的pH均为7.2~7.4。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一肝素中和剂包括聚季铵盐-10，所述聚季铵盐-10在所述SCT-S筛选试剂的含量为1~3 mg/mL。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二肝素中和剂包括聚季铵盐-10，所述聚季铵盐-10在所述SCT-C确认试剂的含量为1~3 mg/mL。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液、第二缓冲液分别为PBS缓冲液、Tris缓冲液、Hepes缓冲液、MES缓冲液、MOPS缓冲液、柠檬酸缓冲液中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述第一缓冲液、第二缓冲液均为浓度50~150mmoL/L 的Tris缓冲液。
9.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一辅料包括第一稳定剂，所述第一稳定剂包括丙氨酸、聚乙二醇6000、Span-80、BSA、HSA、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精和甘露醇中的一种或几种。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，第一稳定剂包括组分：丙氨酸、聚乙二醇6000、吐温-20，且以上组分在所述SCT-S筛选试剂中的质量百分比为：丙氨酸3~5%、聚乙二醇6000 2~4%、吐温-20 0.1~1%。
11.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二辅料包括第二稳定剂，所述第二稳定剂包括丙氨酸、聚乙二醇6000、Span-80、BSA、HSA、明胶、吐温-20、海藻糖、葡萄糖、β-环糊精和甘露醇中的一种或几种。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，第二稳定剂包括组分：丙氨酸、聚乙二醇6000、吐温-20，且以上组分在所述SCT-C确认试剂中的质量百分比为：丙氨酸3~5%、聚乙二醇6000 2~4%、吐温-20 0.1~1%。
13.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液均包括防腐剂，所述防腐剂为苯甲酸钠、叠氮化钠、Proclin-300、庆大霉素以及亚硝酸盐中的至少一种。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂以及SCT-CaCl2溶液均包括质量百分比为0.03-0.05% 的Proclin-300。
15.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂均包括蛋白酶保护剂，所述蛋白酶保护剂为菊糖。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白酶保护剂在所述SCT-S筛选试剂、SCT-C确认试剂的质量百分比均为2~4%。
17.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述钙离子在SCT-CaCl2溶液的含量为20-30 mmoL/L。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN117825681A (zh) * 2023-12-26 2024-04-05 米度医疗科技（中山）有限公司 一种狼疮抗凝物全液体试剂及其制备方法

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