CN117825681A - 一种狼疮抗凝物全液体试剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种狼疮抗凝物全液体试剂及其制备方法，筛选试剂和确证试剂均包括：RVV‑X激活剂、合成磷脂、试剂稳定剂、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、无机盐、无水氯化钙、蛋白质稳定剂、牛血清白蛋白、肝素中和剂、防腐剂、纯化水；本申请的狼疮抗凝物检测液体试剂盒中，狼疮抗凝物检测全液体试剂中的dRVVT筛选试剂、dRVVT确证试剂均为液态，相比于冻干粉型试剂盒，本发明的试剂盒全液体在使用前无需加纯化水进行复溶操作，使用方便，且还避免了冻干试剂复溶后不稳定差的问题；且经过测试，准确性、重复性、稳定性、抗干扰、临床试剂所得结果均符合预设要求，且能够快速、有效地对患者体内的狼疮抗凝物进行检测，具有较高的特异性高的效果。
Description
技术领域
本申请涉及血液凝结时间的技术领域，具体涉及一种狼疮抗凝物全液体试剂。
背景技术
狼疮抗凝物(LA)是一类免疫球蛋白，多数为IgG，少数为IgM或二者混合存在，它的免疫活性主要存在于IgM，是抗磷脂抗体(包括抗心磷脂抗体、狼疮抗凝物、抗β2 -糖蛋白抗体)中的一种。当凝血酶原转化为凝血酶时，需要包含有磷脂、凝血因子V、X、Ca2+等组成的凝血酶原激活物，而LA针对复合物中磷脂，它结合磷脂而使磷脂丧失活性，使凝血酶原转化为凝血酶时间延长。
目前检测LA常用的方法为活化部分凝血活酶时间(activated partialthromboplastin time，APTT)、改良的稀释蝰蛇毒时间(dilute Russell viper venomtime，dRVVT)及二氧化硅凝固时间(silica clotting time，SCT)检测法。通常以筛选试验、混合试验和确认试验传统的三步法来判读是否存在LA，且间隔12周后第二次检测，LA仍为阳性以及有临床表现方可确诊。LA在APS的诊断和治疗中起着非常重要的作用。
dRVVT检测试剂特异性高，反应过程是激活X因子的凝血过程，对高风险易栓症患者具有特异性，且不受凝血因子VII、Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ因子异常或缺失的影响，可适用于全自动凝血分析仪，在临床应用中的前景广阔。
市场上狼疮抗凝物检测试剂盒(dRVVT法)目前均为冻干粉，使用前需加纯化水进行复溶操作，增加人工操作步骤，并且结果易受移液器准确性和操作者手法的影响，使用不方便，并且复溶稳定性较差。液体试剂可以直接上机，使用方便且开瓶稳定性长。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明针对市场上dRVVT试剂均为冻干粉，液体试剂为空白的现有技术缺陷，提供一种狼疮抗凝物检测液体试剂盒，全液体试剂具有使用方便、成本可控、特异性高、稳定性好、抗干扰能力强的优点，采用的技术方案包括：
一种狼疮抗凝物全液体试剂，每升筛选试剂中包括：
作为优选，所述蛋白质稳定剂为胶原蛋白肽。
作为优选，所述合成磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸中的至少一种。本申请的技术方案中，优选地，所述合成磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸的组合物，且磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸的质量比为5:3:2。
所述防腐剂为ProClin300、山梨酸钾或乳酸钠，防腐剂防止由于微生物污染而导致试剂盒失效的问题，有利于延长试剂盒储存效期；本申请中所述筛选试剂和确证试剂的防腐剂选用ProClin300。
所述无机盐为氯化钠或氯化钾，本申请中的无机盐采用氯化钠；
所述试剂稳定剂为聚乙二醇、pvp、明胶或聚乙烯亚胺，本申请中试剂稳定剂采用聚乙二醇，聚乙二醇可起表面活性剂作用，有利于提高液体试剂的稳定性；
所述肝素中和剂为聚凝胺；肝素中和剂对普通肝素、低分子肝素、利伐沙班有强抗干扰能力，提高液体试剂的抗干扰能力；
本申请中所述筛选试剂和确证试剂均选择合成磷脂替代脑磷脂，合成磷脂是一种具有高促凝活性、可长期稳定的合成磷脂，比兔脑磷脂具有更高的活性和更好的重现性；
基于上述内容，本申请还提出了狼疮抗凝物全液体试剂的制备方法，筛选试剂或确证试剂的制备方法包括：
步骤1、按照液体试剂中组分含量将试剂稳定剂、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、氯化钠、无水氯化钙、肝素中和剂溶解在纯化水中，搅拌至完全溶解得到第一溶液；
步骤2、按照液体试剂中组分含量取纯化水溶解RVV-X激活剂，晃动瓶子，待RVV-X激活剂完全溶解并混合均匀后加入到第一溶液中，搅拌至混合均匀得到第二溶液；
步骤3、按照液体试剂中组分含量将合成磷脂、蛋白质稳定剂、牛血清白蛋白配方中溶解在纯化水中，搅拌至完全溶解后加入到第二溶液中，获得第三溶液；
步骤4、按照液体试剂中组分含量将防腐剂加到第三溶液中，搅拌至混合均匀，定容至1L并搅拌均匀后得到混合溶液；
步骤5、将混合溶液的pH值调节至7.2±0.30，制得筛选试剂或确证试剂。
本发明的有益效果：
本申请的狼疮抗凝物检测液体试剂盒中，狼疮抗凝物检测全液体(dRVVT法)试剂盒中的dRVVT筛选试剂、dRVVT确证试剂均为液态，相比于冻干粉型试剂盒，本发明的试剂盒全液体在使用前无需加纯化水进行复溶操作，使用方便，且还避免了冻干试剂复溶后不稳定的问题；
筛选试剂和确证试剂采用三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸形成了Tris-甘氨酸缓冲体系，Tris-甘氨酸缓冲体系在pH值为7.0-8.0的范围内具有良好的缓冲能力，使液体试剂处于一种稳定的状态；且添加甘氨酸作为组成蛋白质的基本单元，添加氨基酸有利于提高液体试剂的稳定性；
本申请的狼疮抗凝物检测液体试剂盒中，筛选试剂和确证试剂选择合成磷脂替代脑磷脂，合成磷脂是一种具有高促凝活性、可长期稳定的合成磷脂，具有良好的活性和重现性；
本申请的狼疮抗凝物检测液体试剂盒中，筛选试剂和确证试剂中加入了蛋白质稳定剂和牛血清白蛋白对磷脂、蛋白等起到保护作用，提高液体试剂的稳定性；
综上，本申请的狼疮抗凝物检测液体试剂盒中经过测试，准确性、重复性、稳定性、抗干扰、临床试剂比对的项目测试，所得结果均符合预设要求，且能够快速、有效地对患者体内的狼疮抗凝物进行检测，具有较高的特异性高的效果。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本申请中每升筛选试剂中包括：
本实施例中，所述蛋白质稳定剂采用10％的含有高纯度猪皮胶原蛋白多肽级分水溶液，筛选试剂和确证试剂中添加30-60mL的/>10％溶液。
本实施例中，所述合成磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸的组合物，且磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸的质量比为5:3:2。
本实施例中，所述狼疮抗凝物检测液体试剂盒的制备方法具体包括：
S1、制备筛选试剂：
S11、分别称取PEG-6000、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、氯化钠、无水氯化钙、聚凝胺配方中的量于烧杯中加入400mL纯化水，搅拌10分钟至完全溶解得到第一溶液I。
S12、移取1mL纯化水溶解RVV-X激活剂，轻轻晃动瓶子，待固体完全溶解、混合均匀。按照配方单的量将溶液适量移出，合并到上述第一溶液I中，搅拌5分钟至混合均匀，得到第二溶液I。
S13、称取合成磷脂、10％、牛血清白蛋白配方中的量于烧杯中,加入200mL纯化水，搅拌30分钟至完全溶解，液体合并到上述第二溶液I中，得到第三溶液I。
S14、量取ProClin300配方中的量，加到上述得到第三溶液I中，搅拌至混合均匀，加入纯化水定容至1L，搅拌5分钟混合均匀得到混合溶液I。
S15、调节混合溶液I的pH值至7.2±0.30(25.0±5℃)，制得筛选试剂；
S2、制备确证试剂
S21、分别称取PEG-6000、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、氯化钠、无水氯化钙、聚凝胺配方中的量于烧杯中加入400mL纯化水，搅拌10分钟至完全溶解，得到第一溶液II；
S22、移取1mL纯化水溶解RVV-X激活剂，轻轻晃动瓶子，待固体完全溶解、混合均匀。按照配方单的量将溶液适量移出，合并到上述配制第一溶液II中，搅拌5分钟至混合均匀，得到第二溶液II；
S23、称取合成磷脂、10％、牛血清白蛋白配方中的量于烧杯中,加入200mL纯化水，搅拌30分钟至完全溶解，液体合并到上述第二溶液II中，得到第三溶液II；
S24、量取ProClin300配方中的量，加到上述配制的第三溶液II中，搅拌至混合均匀，加入纯化水定容至1L，搅拌5分钟混合均匀，得到混合溶液II。
S25、调节混合溶液II的pH值至7.2±0.30(25.0±5℃)，制得确证试剂。
基于上述内容，提出本申请的实施例1-3，实施例1-3的狼疮抗凝物检测液体试剂盒中，1L筛选试剂和1L确证试剂中的组成如表1所示。
表1
本实施例所述狼疮抗凝物检测液体试剂盒的使用方法如表2所示。
表2
对实施例1-3制得的狼疮抗凝物检测试剂盒进行准确度、重复性、稳定性测试、抗干扰测试，以及与市售狼疮抗凝物检测试剂盒比对实验，比较临床样本阴阳符合率。
1、准确度检测
在狼疮抗凝剂检测中，LAdRVVT法的筛选试剂和确证试剂测定作为一项完整的试验应平行使用HemosIL dRVVT筛选和HemosIL dRVVT确认测定试剂盒。结合下面所列的公式可计算狼疮抗凝物标准化比值，临界值为>1.2。筛选比值、确证比值、标准化比值的计算公式如下：
筛选比值＝待测狼疮抗凝物筛选结果(以秒计)/筛选正常范围平均值(以秒计)；
确证比值＝待测狼疮抗凝物确证结果(以秒计)/确证正常范围平均值(以秒计)；
标准化比值＝筛选比值/确证比值。
对于各个新批次的狼疮抗凝物测定试剂盒(凝固法)在不同机型上使用，应测定新的正常范围。
测定20例正常人样本的平均值，以秒计。正常范围的平均值将用作比值计算中的分母常数。
实施例1-3的狼疮抗凝物测定试剂盒测试20例正常人样本的平均值见表3：
表3
1、准确度测试及其结果
对实施例1-3的试剂，分别测试沃芬LA阴性质控品、阳性质控品3次，取平均值，测试结果应符合要求：在质控范围内。准确度测试中沃芬LA阴性质控品靶值及范围是1.0(<1.2)、HemosIL LA阳性质控品的靶值及范围是1.66(>1.4)，实验数据见表4所示：
表4
通过对沃芬LA阴性、阳性质控品的测试，实施例1～3的质控测试值均符合质控要求范围，且阴、阳性质控标准化比值接近厂家靶值，本试剂盒准确性合格。其中实施例1的测试均值与靶值最接近，说明实施例1试剂配比是本申请的更优实施方案。
2、重复性测试及其结果
对实施例1-3的狼疮抗凝物检测试剂盒，测试沃芬LA阴性质控品和阳性质控品各10次。测试结果应符合要求：LA阴性质控品变异系数(CV)<5％；LA阳性质控品变异系数(CV)<10％。dRVVT标准化比值结果见表5所示：
表5
实施例1-3的重复性测试结果发现，实施例1-3均符合重复性要求，其中实施例1试剂重复性变异系数(CV)最小，结合准确性，表明实施例1试剂是本申请的最佳实施方案。
3、重复性测试及其结果
试剂稳定性要求：未开瓶，试剂盒在2～8℃中密闭储存，避免冷冻，可稳定12个月。dRVVT筛选试剂、dRVVT确证试剂开瓶后避免污染，2～8℃可稳定14天。
实时稳定性测试：0个月、6个月、10个月、12个月、13个月，每个阶段开新瓶试剂上机测试；
开瓶稳定性测试：试剂开瓶后仪器上机载0天、7天、10天、14天、16天，分别进行测试。
测试方法为用沃芬阴性、阳性质控品检测，每个检测重复3次取平均值。本次选择准确度、重复性最佳的实施例1进行实时稳定性、开瓶稳定性观察，dRVVT标准化比值结果见表6。
表6
/>
测试结果应符合要求：未开瓶，试剂盒在2～8℃中密闭储存，避免冷冻，可稳定12个月。dRVVT筛选试剂、dRVVT确证试剂开瓶后避免污染，2～8℃可稳定14天；实施例1实时稳定性及开瓶稳定性测试结果符合稳定性要求。
4、抗干扰测试及其结果
选取实施例1对添加不同浓度干扰物的正常人血浆进行检测，对比不同浓度干扰物含量对试剂的结果影响，重复检测两次，分别计算dRVVT标准化比值的均值，与正常血浆dRVVT标准化比值均值的偏差，进而评估对抗凝药的抗干扰能力。检测结果如表7所示：
表7
由表7可知，实施例1试剂对普通肝素的抗干扰能力达到1.0U/mL，对低分子肝素的抗干扰能力达到2.0U/mL，对利伐沙班的抗干扰能力达到160ng/mL。证明本申请试剂盒对普通肝素、低分子肝素、利伐沙班抗干扰能力强。
5、临床样本比对
采用比对试剂盒(沃芬：狼疮抗凝物(dRVVT)筛选：lotN0129382、狼疮抗凝物(dRVVT)确认：lotN0129625)与实施例1同时测试一组临床样本(共50例，其中阴性30例和阳性20例)，对阴性符合率、阳性符合率、总符合率分析。
结果应符合：阴性符合率≥90％、阳性符合率≥90％、总符合率≥90％。具体测试结果见表8所示：
表8
/>
统计结果见表9：
表9
表9的统计结果发现，实施例1的试剂与比对试剂测试临床样本的阴性符合率、阳性符合率、总符合率均符合要求。证明实施例1的试剂盒与比对试剂具有较高的一致性。
实施例1通过准确性、重复性、稳定性、抗干扰、临床试剂比对的项目测试，所得结果均符合预设要求。证明本发明实施例1的全液体试剂(dRVVT法)能够快速、有效地对患者体内的狼疮抗凝物进行检测，并且特异性高。
本发明的试剂盒为全液体试剂，使用方便、成本可控、特异性强、稳定性好、抗干扰能力强，准确性与进口品牌试剂相当，可以实现试剂国产化，充分满足临床检验的需求，降低医疗成本，同时减少病人的检测费用，降低负担。
当然，本发明并不局限于上述实施方式，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明精神的前提下还可作出等同变形或替换，这些等同的变形和替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。
Claims (9)
1.一种狼疮抗凝物全液体试剂，其特征在于，每升筛选试剂中包括：
每升确证试剂中包括：
2.根据权利要求1所述的狼疮抗凝物全液体试剂，其特征在于，所述蛋白质稳定剂为胶原蛋白肽。
3.根据权利要求1所述的狼疮抗凝物全液体试剂，其特征在于，所述合成磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的狼疮抗凝物全液体试剂，其特征在于，所述合成磷脂为磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸的组合物，且磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸的质量比为5:3:2。
5.根据权利要求1所述的狼疮抗凝物全液体试剂，其特征在于，所述防腐剂为ProClin300、山梨酸钾或乳酸钠。
6.根据权利要求1所述的狼疮抗凝物全液体试剂，其特征在于，所述无机盐为氯化钠或氯化钾。
7.根据权利要求1所述的狼疮抗凝物全液体试剂，其特征在于，所述试剂稳定剂为聚乙二醇、pvp、明胶或聚乙烯亚胺。
8.根据权利要求1所述的狼疮抗凝物全液体试剂，其特征在于，所述肝素中和剂为聚凝胺。
9.一种如权利要求1所述的狼疮抗凝物全液体试剂的制备方法，其特征在于，筛选试剂或确证试剂的制备方法包括：
步骤1、将试剂稳定剂、三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、氯化钠、无水氯化钙、肝素中和剂溶解在纯化水中，搅拌至完全溶解得到第一溶液；
步骤2、取纯化水溶解RVV-X激活剂，晃动瓶子，待RVV-X激活剂完全溶解并混合均匀后加入到第一溶液中，搅拌至混合均匀得到第二溶液；
步骤3、将合成磷脂、蛋白质稳定剂、牛血清白蛋白配方中溶解在纯化水中，搅拌至完全溶解后加入到第二溶液中，获得第三溶液；
步骤4、将防腐剂加到第三溶液中，搅拌至混合均匀，定容至1L并搅拌均匀后得到混合溶液；
步骤5、将混合溶液的pH值调节至7.2±0.30，制得筛选试剂或确证试剂。
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