CN110108890A - 活化部分凝血活酶时间测定试剂及其应用 - Google Patents

活化部分凝血活酶时间测定试剂及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及活化部分凝血活酶时间测定试剂及其应用，该活化部分凝血活酶时间测定试剂包括：激活剂、磷脂、缓冲剂和保护剂，其中，所述激活剂为鞣花酸。该试剂不仅对肝素的敏感性好，而且检测结果稳定可靠，可有效用于临床上肝素抗凝治疗的监测，应用前景十分广阔。

Description

活化部分凝血活酶时间测定试剂及其应用
技术领域
本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体地，本发明涉及活化部分凝血活酶时间测定试剂及其应用，更具体地，本发明涉及活化部分凝血活酶时间测定试剂、活化部分凝血活酶时间测定试剂盒以及测定活化部分凝血活酶时间的方法。
背景技术
凝血的过程是血液由液体转变为凝胶状态，其本质为可溶性的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白。活化部分凝血活酶时间(APTT)是检查机体内源性系统凝血功能有无障碍性的过筛实验，是反映凝血因子XII、XI、IX、VIII、X、V、II和I的活性指标。APTT检测原理是：将活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂与待测定的枸橼酸抗凝血浆充分混匀，37℃孵育240s，加入氯化钙溶液，从开始加入钙离子开始计时，到纤维蛋白凝块形成的时间，即为APTT。待测血浆与活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂混匀孵育一定时间的目的是让激活剂充分激活FXII、FXI，这里的激活剂起到“活化”的作用，相当于血管损伤时内皮下胶原暴露，FXII与之接触而被激活。肝素具有抗凝效果佳、价格低廉以及相对安全等优势，已被应用于临床达60多年。目前，活化部分凝血活酶时间(APTT)测定被广泛作为临床上肝素抗凝治疗监测的重要手段，市场上也已有种类众多的APTT测定试剂。
然而，性质更优的APTT测定试剂还需进一步研究开发。
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
通常认为肝素治疗时，APTT应控制在正常值的1.5～2.5倍，但发明人却发现，1.5～2.5倍的APTT水平与血栓发生与否的关系并不显著，主要原因是，不同的APTT试剂对肝素的敏感性以及稳定性差异非常之大。比较市面常见的活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒发现，APTT试剂中含有的激活剂主要有鞣花酸和白陶土或硅藻土。以鞣花酸为激活剂的APTT试剂均一性、稳定性较好，但对肝素敏感性欠佳；以白陶土或硅藻土为激活剂的APTT试剂对肝素敏感性较好，但试剂放置时间较长时易产生沉淀，试剂稳定性较差。因此，既对肝素足够敏感，又具有优良的均一性和稳定性的APTT试剂急需开发。基于上述问题，发明人经过大量的实验研究，开发了一种新的活化部分凝血活酶时间测定试剂，该试剂不仅对肝素的敏感性好，而且检测结果稳定可靠，可有效用于临床上肝素抗凝治疗的监测，应用前景十分广阔。
为此，在本发明的第一方面，本发明提出了一种活化部分凝血活酶时间测定试剂。根据本发明的实施例，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂包括：激活剂、磷脂、缓冲剂和保护剂，其中，所述激活剂为鞣花酸。所述激活剂鞣花酸激活待测血浆中的凝血因子Ⅻ，以部分凝血活酶(磷脂)替代PF3，加入Ca2+后血浆凝固，从而测定APTT。发明人发现，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂作为一个整体，各组分之间紧密关联，不可分割，进而，根据本发明实施例的活化部分凝血活酶时间测定试剂不仅对肝素的敏感性好，而且检测结果稳定可靠，可有效用于临床上肝素抗凝治疗的监测。
根据本发明的实施例，上述活化部分凝血活酶时间测定试剂还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述磷脂为兔脑磷脂。发明人发现，所述磷脂为兔脑磷脂时，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂对肝素的敏感性更好，检测结果更加准确可靠。
根据本发明的实施例，所述保护剂包括选自牛血清白蛋白、酪蛋白、人血清白蛋白的至少之一。
根据本发明的实施例，所述缓冲剂包括缓冲液，所述缓冲液包括选自Tris、HEPES、PBS、甘氨酸、MOPS缓冲液的至少之一。根据本发明的实施例，所述缓冲液的pH为8.0～9.5，如为8.2、8.4、8.6、8.8、9.0、9.2或9.4。
根据本发明的实施例，所述缓冲液的浓度为10～100mmol/L，如为11、13、15、17、19、20、22、24、25、27、29、30、50、70或90mmol/L。在一些实施例中，所述缓冲液的浓度为10～30mmol/L。在另一些实施例中，所述缓冲液的浓度为15～25mmol/L。需要说明的是，所述缓冲液的浓度指的是缓冲液中的有效成分的总浓度。例如，缓冲液为PBS缓冲液时，缓冲液的浓度指的是缓冲液中的磷酸根的总浓度。
根据本发明的实施例，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述激活剂的浓度为0.01～0.1g/L，如为0.01、0.015、0.02、0.022、0.024、0.025、0.026、0.028、0.03、0.032、0.034、0.035、0.036、0.038、0.04、0.045、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1g/L；所述磷脂的质量百分比为0.1～0.5w％，如为0.1、0.11、0.13、0.15、0.17、0.19、0.2、0.21、0.23、0.25、0.27、0.29、0.3、0.4或0.5w％；所述保护剂的浓度为1～20mg/mL，如为3、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17或19mg/mL。需要说明的是，本发明中的“基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积”指的是配置完成的终产品活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，但是鉴于配置时添加的固体质量较少，对总体积的影响较小，因此，便以缓冲液中水的体积作为活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积。另外，某一组分的“质量百分比”指的是每100mL的水中添加的该组分的质量(单位为g)。例如，所述磷脂的质量百分比为0.1～0.5w％，缓冲液中水的体积为1000mL时，添加的所述磷脂的质量为1～5g。发明人发现，若所述激活剂的浓度过低，无法激活内源性凝血机制，若所述激活剂的浓度过高，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的稳定性差且对肝素的敏感性显著降低；若所述磷脂的质量过小或所述保护剂的浓度过低，无法发挥保障凝血的功能，若所述磷脂的质量过大或所述保护剂的浓度过高，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂对肝素的敏感性显著降低。由此，所述激活剂的浓度、所述磷脂的质量百分比、所述保护剂的浓度在上述范围时，根据本发明实施例的活化部分凝血活酶时间测定试剂对肝素的敏感性更好，且更加均一、稳定，检测结果更加准确可靠。
根据本发明的实施例，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述激活剂的浓度为0.01～0.05g/L，所述磷脂的质量百分比为0.1～0.3w％，所述保护剂的浓度为5～15mg/mL。
根据本发明的实施例，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述激活剂的浓度为0.02～0.04g/L，所述磷脂的质量百分比为0.15～0.25w％，所述保护剂的浓度为8～12mg/mL。
根据本发明的实施例，所述缓冲剂进一步包括缓冲盐，所述缓冲盐包含选自锰离子、镁离子和二价铁离子的至少之一。发明人在实验过程中发现，如果在所制备的活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂中不加二价金属离子，即如镁离子，锰离子或二价铁离子，所述活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂对肝素敏感性会大大降低。
根据本发明的实施例，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述缓冲盐的质量百分比为0.01～0.3w％，如为0.05、0.1、0.12、0.14、0.15、0.17、0.19、0.2、0.22、0.24、0.25、0.27、0.29或0.3w％。发明人发现，若所述缓冲盐的质量过小，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂对肝素的敏感性会显著降低；若所述缓冲盐的质量过大，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的稳定性会显著降低。由此，所述缓冲盐的质量百分比在上述范围时，根据本发明实施例的活化部分凝血活酶时间测定试剂对肝素的敏感性更好，且更加均一、稳定，检测结果更加准确可靠。
根据本发明的实施例，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述缓冲盐的质量百分比为0.1～0.3w％。在一些实施例中，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述缓冲盐的质量百分比为0.15～0.25w％。
根据本发明的实施例，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂进一步包括：防腐剂，所述防腐剂包括选自Proclin300、山梨酸钾和对羟基苯甲酸甲酯的至少之一。根据本发明的实施例，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述防腐剂的质量百分比为0.01～1w％，如为0.02、0.04、0.05、0.07、0.09、0.1、0.12、0.14、0.15、0.17、0.19、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9w％。发明人发现，若所述防腐剂的质量过大，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的均一性会较差；若所述防腐剂的质量过小，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的稳定性和防腐效果较差，影响检测结果的准确性。由此，所述防腐剂的质量百分比在上述范围时，根据本发明实施例的活化部分凝血活酶时间测定试剂更加均一、稳定，检测结果更加准确可靠。
根据本发明的实施例，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述防腐剂的质量百分比为0.01～0.2w％。在另一些实施例中，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述防腐剂的质量百分比为0.05～0.15w％。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种活化部分凝血活酶时间测定试剂。根据本发明的实施例，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂包括：PBS缓冲液、MgAl2(SiO3)4、鞣花酸、牛血清白蛋白、兔脑磷脂和Proclin300，所述PBS缓冲液的pH为8.0～9.5，其中：基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述PBS缓冲液的浓度为20mmol/L，所述MgAl2(SiO3)4的质量百分比为0.2w％，所述鞣花酸的浓度为0.03g/L，所述牛血清白蛋白的浓度为10mg/mL，所述兔脑磷脂的质量百分比为0.2w％，所述Proclin300的浓度为0.1w％。需要说明的是，所述“缓冲液的浓度”、“活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积”和“质量百分比”的含义与前面所描述的相同。根据本发明实施例的活化部分凝血活酶时间测定试剂对肝素的敏感性更好，且更加均一、稳定，检测结果更加准确可靠。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种活化部分凝血活酶时间测定试剂盒。根据本发明的实施例，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂盒包括：前面所描述的活化部分凝血活酶时间测定试剂。
根据本发明的实施例，上述活化部分凝血活酶时间测定试剂盒还可进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂盒进一步包括：氯化钙试剂，所述氯化钙试剂包括氯化钙和水。根据本发明的实施例，基于所述氯化钙试剂的体积，所述氯化钙的浓度为1～40mmol/L，如为5、10、12、14、15、17、19、20、22、24、25、27、29、30、35、或40mmol/L。在一些实施例中，基于所述氯化钙试剂的体积，所述氯化钙的浓度为10～30mmol/L。在另一些实施例中，基于所述氯化钙试剂的体积，所述氯化钙的浓度为15～25mmol/L。需要说明的是，本发明中的“基于所述氯化钙试剂的体积”指的是配置完成的终产品氯化钙试剂的总体积，但是鉴于配置时添加的固体质量较少，对总体积的影响较小，因此，便以添加的水的体积作为氯化钙试剂的总体积。
根据本发明的实施例，所述氯化钙试剂进一步包括：防腐剂，所述防腐剂包括选自Proclin300、山梨酸钾和对羟基苯甲酸甲酯的至少之一。根据本发明的实施例，基于所述氯化钙试剂的体积，所述防腐剂的质量百分比为0.01～1w％，如为0.02、0.04、0.05、0.07、0.09、0.1、0.12、0.14、0.15、0.17、0.19、0.2、0.25、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9w％。在一些实施例中，基于所述氯化钙试剂的体积，所述防腐剂的质量百分比为0.01～0.2w％。在另一些实施例中，基于所述氯化钙试剂的体积，所述防腐剂的质量百分比为0.05～0.15w％。需要说明的是，“防腐剂的质量百分比”指的是配置氯化钙试剂时每100mL的水中添加的防腐剂的质量(单位为g)。例如，所述防腐剂的质量百分比为0.05～0.15w％，水的体积为1000mL时，添加的所述防腐剂的质量为0.5～1.5g。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种活化部分凝血活酶时间测定试剂盒。根据本发明的实施例，所述活化部分凝血活酶时间测定试剂盒包括：前面所描述的活化部分凝血活酶时间测定试剂和氯化钙试剂，所述氯化钙试剂包括氯化钙、Proclin300和水，其中：基于所述氯化钙试剂的体积，所述氯化钙的浓度为20mmol/L，所述Proclin300的质量百分比为0.1w％。需要说明的是，所述“氯化钙试剂的体积”和“质量百分比”的含义与前面所描述的相同。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种测定活化部分凝血活酶时间的方法，所述方法用于非诊断目的，如用于科学研究，通过测定活化部分凝血活酶时间，研究APTT测定试剂对肝素敏感性的变化规律等。根据本发明的实施例，所述方法包括：将枸橼酸抗凝血浆与前面所描述的活化部分凝血活酶时间测定试剂进行第一混合处理；将氯化钙试剂与第一混合处理产物进行第二混合处理，以便形成纤维蛋白凝块，所述氯化钙试剂如前面所限定的；以及基于所述纤维蛋白凝块的形成时间，确定所述活化部分凝血活酶时间。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
为了使本领域技术人员更容易理解本发明，下面对本发明中的某些术语进行解释。本领域技术人员应该理解的是，这些术语的解释仅仅是为了更好的理解本发明，而不应作为对本发明的限制。
在本文中，所述激活剂为“内源性凝血激活剂”，指的是能够启动内源性凝血因子凝血活性的成分，例如鞣花酸、白陶土和硅藻土等。
本发明的目的是提供一种用于临床监测肝素治疗的、稳定的活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒。为此，该发明还将提供该试剂盒的制备方法及使用方法。
基于上述目的，本发明提供了活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒，用来作为活化部分凝血活酶时间(APTT)检测试剂，所述活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂中含有激活剂，能够激活内源性凝血机制，同时在APTT试剂中加入盐类、磷脂、保护剂等成分，能够起到保障凝血的功能。采用本发明的活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂盒进行凝血检测，开瓶即用，不需要进行其他特殊处理，例如冻干粉末需提前半小时进行复溶。
另外，本发明还提供了活化部分凝血活酶时间(APTT)测定试剂的制备方法，包括如下步骤：
1)配置缓冲液，搅拌均匀；
2)将缓冲盐加入到缓冲液中，搅拌均匀；
3)将激活剂加入到步骤2)获得的溶液中，搅拌均匀；
4)将保护剂加入到步骤3)获得的溶液中，搅拌均匀；
5)将磷脂加入到步骤4)获得的溶液中，搅拌均匀；
6)将防腐剂加入到步骤5)获得的溶液中，搅拌均匀，得到活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂。
在本发明的一种具体实施方式中，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂和氯化钙溶液。由此，可以利用本发明的试剂盒实现对于枸橼酸抗凝血浆的APTT检测。在实际应用过程中，对于氯化钙溶液，本领域技术人员也可以根据需要现配现用。
在本发明的一种具体实施方式中，本发明提供了活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂的制备方法，包括如下步骤：
S1，配制10～100mmol/L的缓冲溶液，调节pH值至＞8；
S2，向上述S1中加入质量百分比为0.01～0.3w％的缓冲盐，搅拌均匀；
S3，在上述S2中加入0.02～0.04g/L的激活剂，搅拌均匀，调节pH值至7.2～7.8；
S4，在上述S3中加入1～20mg/mL的牛血清白蛋白，搅拌均匀；
S5，在上述S4加入质量百分比为0.1～0.5w％的磷脂，搅拌均匀；
S6，在上述S5中加入质量百分比为0.01～1w％的防腐剂，搅拌均匀，分装于容量为7mL的试剂瓶中，于2～8℃冷藏保存。
在本发明的又一种具体实施方式中，本发明提供了氯化钙溶液的制备方法，包括：称取氯化钙配制成最终浓度1～40mmol/L的溶液，再加入质量百分比0.01-1w％的防腐剂，得到氯化钙溶液。
本发明通过研制配套试剂，利用激活剂激活内源性凝血途径，在钙离子的参与下完成血浆的凝集过程，本发明试剂盒有性能稳定、均一性好、对肝素敏感、开瓶即用等优点，能够有效解决现有同类试剂对临床肝素治疗监控低敏感性的问题。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。其中：
液体生物防腐剂(Proclin 300)，含量98％，厂家：Sigma
鞣花酸，厂家：Sigma
兔脑磷脂，厂家：Berti Piero
市购的活化部分凝血活酶时间测定试剂盒(凝固法)，厂家：Siemens HealthcareDiagnostics Products GmbH
测试用凝血分析仪：Sysmex CA-1500
实施例1活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂的制备
本实施例提供了按照如下配方配制活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂，包括如下各组：
实验组1按照如下步骤制备得到活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂
步骤(1)：PBS缓冲液的制备：称取Na2HPO4.12H2O 6.78g，NaH2PO4.2H2O0.16g，加入1000mL纯化水，搅拌使其充分溶解，pH值应在8.0～9.5范围内；
步骤(2)：在步骤(1)的缓冲液中加入MgAl2(SiO3)4 2g，搅拌使其充分溶解；
步骤(3)：在步骤(2)的溶液中加入0.03g鞣花酸，搅拌使其充分溶解，调节pH至7.2～7.8；
步骤(4)：在步骤(3)的溶液中加入10.0g牛血清白蛋白，搅拌使其充分溶解；
步骤(5)：在步骤(4)的溶液中加入2g兔脑磷脂，高速搅拌10～20min使其充分溶解，之后温和搅拌24h；
步骤(6)：在步骤(5)中的溶液中加入Proclin300 1.0g，搅拌使其充分溶解，制成活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂。
将制备得到的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂分装成2mL/瓶。
实验组2按照如下步骤制备得到活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂
步骤(1)：PBS缓冲液的制备：称取Na2HPO4.12H2O 6.78g，NaH2PO4.2H2O0.16g，加入1000mL纯化水，搅拌使其充分溶解，pH值应在8.0～9.5范围内；
步骤(2)：在步骤(1)的缓冲液中加入MgAl2(SiO3)4 2g，搅拌使其充分溶解；
步骤(3)：在步骤(2)的溶液中加入0.03g白陶土，搅拌使其充分溶解，调节pH至7.2～7.8；
步骤(4)：在步骤(3)的溶液中加入10.0g牛血清白蛋白，搅拌使其充分溶解；
步骤(5)：在步骤(4)的溶液中加入2g兔脑磷脂，高速搅拌10～20min使其充分溶解，之后温和搅拌24h；
步骤(6)：在步骤(5)中的溶液中加入Proclin300 1.0g，搅拌使其充分溶解，制成活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂。
将制备得到的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂分装成2mL/瓶。
对比实验组
制备步骤与实验组1基本相同，区别仅在于：将2g兔脑磷脂改为2g兔脑粉。
实施例2活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂盒组装
本实施例2提供了几种试剂盒，所述试剂盒包括：活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂以及氯化钙试剂。
其中，所述活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂分别为实施例1的实验组1-2制备得到。
所述氯化钙试剂中氯化钙的浓度为0.02M：称取2.22g氯化钙，Proclin300 1.0g，加入到1000mL纯化水中，搅拌使其充分溶解，配成氯化钙终浓度为0.02M的氯化钙试剂。然后分装成2mL/瓶。
将实验组1、2和对比实验组制备得到的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂分别与2mL/瓶的氯化钙试剂进行组装，得到试剂盒1、试剂盒2以及试剂盒3。
然后将试剂盒在2～8℃冷藏放置备用。
实施例3活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂对肝素敏感性检测
选取五份APTT结果不同的枸橼酸抗凝血浆，将每份样本分成4份，分别向其中三份加入不同治疗剂量的肝素(肝素在血液中的含量为0.2～0.8U/mL)，样本中肝素含量为0.2U/mL、0.4U/mL、0.6U/mL，编号为样1’、样2’、样3’、样4’、样5’，样1”、样2”、样3”、样4”、样5”，样1”’、样2”’、样3”’、样4”’、样5”’，剩余一组样本则作为空白对比样本，编号为样1、样2、样3、样4、样5。分别用实施例2中的三组试剂盒与市购的活化部分凝血活酶时间测定试剂盒(凝固法)对样本进行测试，将结果进行对比，作为对比试剂盒。
市购试剂采用其试剂盒对应的流程进行操作。
实施例2中获得的试剂盒，测定流程具体如下：
S1.按仪器说明书打开CA-1500仪器；
S2.将冷藏的试剂取出，置于CA-1500该项目对应的试剂位上；
S3.将编好号的样本置于样本架上；
S4.在仪器工作菜单上选择APTT项目测试；
S5.点击“Start”，仪器自动进行测试。
测试结果如下表1～5所示。
表1：活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂对肝素敏感性检测结果(一)
表2：活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂对肝素敏感性检测结果(二)
表3：活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂对肝素敏感性检测结果(三)
表4：活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂对肝素敏感性检测结果(四)
表5：活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂对肝素敏感性检测结果(五)
从表1～5可以看出，将本发明实施例的试剂、对比实验组和市购试剂同时测试空白样本与肝素样本，当样本中肝素含量达到最低治疗剂量的肝素时，本发明实施例的试剂的APTT(肝素样本)/APTT(空白样本)均大于2.0倍左右，且随着肝素含量的升高APTT(肝素样本)/APTT(空白样本)的值上升明显，结果明显高于对比实验组和市购试剂的APTT(肝素样本)/APTT(空白样本)的值(对比实验组和市购试剂在肝素含量为最低治疗剂量时APTT(肝素样本)/APTT(空白样本)并未达到1.5)，说明本发明实施例的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂对肝素更为敏感。
另外，本领域技术人员公知，通常以鞣花酸为激活剂和非鞣花酸为激活剂的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂其测试相同样本的结果不同(参考YY/T 1157-2009)，且以鞣花酸为激活剂的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂测试敏感性远低于以非鞣花酸为激活剂的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂的测试敏感性。然而，从表1～5可以看出，本发明实施例的以鞣花酸为激活剂的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂的敏感性与以白陶土为激活剂的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂相当，打破了现有技术的常规认知。
实施例4活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂的均一性测试
针对实施例2制备得到的试剂盒，取同一批正常凝血质控品、异常凝血质控品，进行APTT测试，每个水平的质控品分别重复测试10次。
针对实施例2制备的试剂盒，测定流程与实施例3相同，测试结果如下表6所示。
表6：活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂的均一性测试结果
从表6可以看出，本发明实施例的试剂盒中以鞣花酸为激活剂的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂，即试剂盒1的变异系数在1％左右，而以白陶土为激活剂的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂，即试剂盒2的变异系数在2％左右，说明以鞣花酸为激活剂的本发明实施例的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂的均一性显著优于以白陶土为激活剂的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂。
实施例5活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂的加速稳定性测试
针对实施例2制备得到的试剂盒，分别在37℃恒温箱中加速0、4、7、10、13、15天，取同一批正常凝血质控品、异常凝血质控品，用加速后的试剂进行APTT测试。
针对实施例2制备的试剂盒，测定流程与实施例3相同，测试结果如下表7所示。
表7：活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂的加速稳定性测试结果
从表7可以看出，本发明实施例的试剂盒中以鞣花酸为激活剂的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂，即试剂盒1，加速15天后的偏差在8％左右，而以白陶土为激活剂的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂，即试剂盒2，加速15天后的偏差大于15％，说明以鞣花酸为激活剂的本发明实施例的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂的加速稳定性显著优于以白陶土为激活剂的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂。
实施例6活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂的长期稳定性测试
针对实施例2制备得到的试剂盒，分别在2～8℃冷藏环境下贮存0、3、6、9、12、14个月，取同一批正常凝血质控品、异常凝血质控品，用实验的试剂进行APTT测试。
针对实施例2制备的试剂盒，测定流程与实施例3相同，测试结果如下表8所示。
表8：活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂的长期稳定性测试结果
从表8可以看出，本发明实施例的试剂盒中以鞣花酸为激活剂的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂，即试剂盒1，于2～8℃存储14个月后的偏差在10％左右，而以白陶土为激活剂的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂，即试剂盒2，于2～8℃存储14个月后的偏差接近20％，说明以鞣花酸为激活剂的本发明实施例的活化部分凝血活酶时间(APTT)试剂的长期稳定性非常好，可以满足临床要求。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (13)

1.一种活化部分凝血活酶时间测定试剂，其特征在于，包括：
激活剂、磷脂、缓冲剂和保护剂，其中，所述激活剂为鞣花酸。
2.根据权利要求1所述的活化部分凝血活酶时间测定试剂，其特征在于，所述磷脂为兔脑磷脂；
任选地，所述保护剂包括选自牛血清白蛋白、酪蛋白、人血清白蛋白的至少之一；
任选地，所述缓冲剂包括缓冲液，所述缓冲液包括选自Tris、HEPES、PBS、甘氨酸、MOPS缓冲液的至少之一；
任选地，所述缓冲液的pH为8.0～9.5；
任选地，所述缓冲液的浓度为10～100mmol/L；
任选地，所述缓冲液的浓度为10～30mmol/L；
任选地，所述缓冲液的浓度为15～25mmol/L。
3.根据权利要求1所述的活化部分凝血活酶时间测定试剂，其特征在于，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述激活剂的浓度为0.01～0.1g/L，所述磷脂的质量百分比为0.1～0.5w％，所述保护剂的浓度为1～20mg/mL。
4.根据权利要求1所述的活化部分凝血活酶时间测定试剂，其特征在于，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述激活剂的浓度为0.01～0.05g/L，所述磷脂的质量百分比为0.1～0.3w％，所述保护剂的浓度为5～15mg/mL。
5.根据权利要求1所述的活化部分凝血活酶时间测定试剂，其特征在于，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述激活剂的浓度为0.02～0.04g/L，所述磷脂的质量百分比为0.15～0.25w％，所述保护剂的浓度为8～12mg/mL。
6.根据权利要求2所述的活化部分凝血活酶时间测定试剂，其特征在于，所述缓冲剂进一步包括缓冲盐，所述缓冲盐包含选自锰离子、镁离子和二价铁离子的至少之一；
任选地，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述缓冲盐的质量百分比为0.01～0.3w％；
任选地，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述缓冲盐的质量百分比为0.1～0.3w％；
任选地，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述缓冲盐的质量百分比为0.15～0.25w％。
7.根据权利要求1所述的活化部分凝血活酶时间测定试剂，其特征在于，进一步包括：防腐剂，所述防腐剂包括选自Proclin300、山梨酸钾和对羟基苯甲酸甲酯的至少之一；
任选地，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述防腐剂的质量百分比为0.01～1w％；
任选地，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述防腐剂的质量百分比为0.01～0.2w％；
任选地，基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述防腐剂的质量百分比为0.05～0.15w％。
8.一种活化部分凝血活酶时间测定试剂，其特征在于，包括：PBS缓冲液、MgAl2(SiO3)4、鞣花酸、牛血清白蛋白、兔脑磷脂和Proclin300，所述PBS缓冲液的pH为8.0～9.5，其中：基于所述活化部分凝血活酶时间测定试剂的总体积，所述PBS缓冲液的浓度为20mmol/L，所述MgAl2(SiO3)4的质量百分比为0.2w％，所述鞣花酸的浓度为0.03g/L，所述牛血清白蛋白的浓度为10mg/mL，所述兔脑磷脂的质量百分比为0.2w％，所述Proclin300的浓度为0.1w％。
9.一种活化部分凝血活酶时间测定试剂盒，其特征在于，包括：权利要求1～8任一项所述的活化部分凝血活酶时间测定试剂。
10.根据权利要求9所述的活化部分凝血活酶时间测定试剂盒，其特征在于，进一步包括：氯化钙试剂，所述氯化钙试剂包括氯化钙和水；
任选地，基于所述氯化钙试剂的体积，所述氯化钙的浓度为1～40mmol/L；
任选地，基于所述氯化钙试剂的体积，所述氯化钙的浓度为10～30mmol/L；
任选地，基于所述氯化钙试剂的体积，所述氯化钙的浓度为15～25mmol/L。
11.根据权利要求10所述的活化部分凝血活酶时间测定试剂盒，其特征在于，所述氯化钙试剂进一步包括：防腐剂，所述防腐剂包括选自Proclin300、山梨酸钾和对羟基苯甲酸甲酯的至少之一；
任选地，基于所述氯化钙试剂的体积，所述防腐剂的质量百分比为0.01～1w％；
任选地，基于所述氯化钙试剂的体积，所述防腐剂的质量百分比为0.01～0.2w％；
任选地，基于所述氯化钙试剂的体积，所述防腐剂的质量百分比为0.05～0.15w％。
12.一种活化部分凝血活酶时间测定试剂盒，其特征在于，包括：权利要求8所述的活化部分凝血活酶时间测定试剂和氯化钙试剂，所述氯化钙试剂包括氯化钙、Proclin300和水，其中：基于所述氯化钙试剂的体积，所述氯化钙的浓度为20mmol/L，所述Proclin300的质量百分比为0.1w％。
13.一种测定活化部分凝血活酶时间的方法，所述方法用于非诊断目的，其特征在于，包括：
将枸橼酸抗凝血浆与权利要求1～8任一项所述的活化部分凝血活酶时间测定试剂进行第一混合处理；
将氯化钙试剂与第一混合处理产物进行第二混合处理，以便形成纤维蛋白凝块，所述氯化钙试剂如权利要求10～12任一项所限定的；以及
基于所述纤维蛋白凝块的形成时间，确定所述活化部分凝血活酶时间。
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