CN108344875A - 提高活化部分凝血活酶时间试剂对肝素敏感性的方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种提高活化部分凝血活酶时间试剂对肝素敏感性的方法及用途。本申请的方法,包括在采用活化部分凝血活酶时间试剂对血浆进行检测时,向反应体系中加入可溶性锰离子和/或镁离子金属盐;或者预先在活化部分凝血活酶时间试剂中添加可溶性锰离子和/或镁离子金属盐,再用于活化部分凝血活酶时间检测。本申请的方法,通过添加可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐,进而提高了活化部分凝血活酶时间试剂对肝素的敏感性,使得活化部分凝血活酶时间试剂能够更灵敏的反映肝素浓度变化。本申请的用途包括可溶性锰离子或镁离子金属盐在制备对肝素敏感的活化部分凝血活酶时间试剂中的用途。
Description
技术领域
本申请涉及血液检测试剂领域,特别是涉及一种提高活化部分凝血活酶时间试剂对肝素敏感性的方法,及可溶性锰离子或镁离子的金属盐在制备对肝素敏感性的活化部分凝血活酶时间试剂中的用途。
背景技术
检测活化部分凝血活酶时间,即APTT(Activated Partial ThromboplastinTime),是进行内源性凝血系统筛查最常用的方法,供医疗机构用作辅助诊断。检测原理为:待测血浆加入活化部分凝血活酶时间试剂,37℃混匀预温一定时间,在钙离子参与下,激活内源性凝血系统,使纤维蛋白原转变为不溶性纤维蛋白,测定凝固所需的时间,即为待测血浆的活化部分凝血活酶时间(缩写APTT)。临床上,检验APTT常用于监控肝素治疗效果。
肝素是一种抗凝剂,是由二种多糖交替连接而成的多聚体,在体内外都有抗凝血作用。临床上主要用于血栓栓塞性疾病、心肌梗死、心血管手术、心脏导管检查、体外循环、血液透析等。患者接受肝素治疗后,其使用剂量的大小直接影响患者的治疗与预后。目前,一般采用APTT试剂对血浆进行检测,以其APTT值来评价肝素的治疗效果。具体原理为:当患者接受肝素治疗后,其血浆中APTT测值结果比未接受治疗时的结果延长。临床上医生可以通过参考正常指标,再比对患者治疗前后的差异,从而进行肝素治疗用量的调整。
但是,在实际应用中,APTT的组分不同会导致肝素对其产生的效果不同,一般不能灵敏的反映出肝素浓度的变化。正常血浆在没有添加肝素时的APTT值正常参考范围在20~40s之间,肝素在临床上使用的血液浓度通常在0.2~0.8U/mL之间,现有的APTT试剂,其测量的APTT值,不能灵敏的反映出血液中肝素浓度的变化,从而失去了临床评价肝素治疗效果的意义。
发明内容
本申请的目的是提供一种新的可以提高活化部分凝血活酶时间试剂对肝素敏感性的方法及可溶性锰离子或镁离子的金属盐在制备对肝素敏感性的活化部分凝血活酶时间试剂中的用途。
为了实现上述目的,本申请采用了以下技术方案:
本申请的一方面公开了一种提高活化部分凝血活酶时间试剂对肝素敏感性的方法,包括在采用活化部分凝血活酶时间试剂对血浆进行检测时,向反应体系中加入可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐,或者预先在活化部分凝血活酶时间试剂中添加可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐,再用于活化部分凝血活酶时间检测。
需要说明的是,本申请的关键在于,在活化部分凝血活酶时间(缩写APTT)试剂或者反应液中加入可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐,延长凝血时间,影响肝素在凝血系统中的作用,进而提高APTT试剂对肝素的敏感性。本申请的一种实现方式中,试剂对肝素的敏感性达到:在正常血浆条件下,肝素浓度达到0.4U/mL时,其APTT值为空白值的1.5~2.5倍,其中空白值是指正常血浆没有添加肝素时测量的APTT值。
还需要说明的是,本申请的关键在于向反应体系中加入可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐,该方法对现有的APTT试剂都有效,包括以鞣花酸为激活剂或白陶土为激活剂的APTT试剂等,因此,APTT试剂及其各组分可以参考现有试剂。但是,本申请的优选方案中,对APTT试剂进行了特别限定,这将在下面的方案中详细说明。
另外,可溶性锰离子或镁离子可以采用常规的可溶性锰离子或镁离子,优选的,锰离子的金属盐为硫酸锰或氯化锰;镁离子的金属盐为硫酸/或氯化镁。
优选的,可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐的用量为0.1%~1.0%。
优选的,APTT试剂的激活剂为鞣花酸或白陶土。
优选的,APTT试剂包括0.1%的鞣花酸、0.2%的磷脂、0.4%~1.0%的聚乙二醇、0.8%~1.0%的明胶以及pH值为6~8的缓冲盐。
优选的,APTT试剂包括0.1%的白陶土、0.2%的磷脂、0.4%~1.0%的聚乙二醇、0.8%~1.0%的明胶以及pH值为6~8的缓冲盐。
APTT试剂中各组份的百分比均为重量百分比,优选的缓冲盐为Tris-HCl缓冲液;更优选的,Tris-HCl缓冲液中Tris的浓度为20mmol/L。
更优选的,在APTT试剂中还含有防腐剂,本申请的一种实现方式中优选的防腐剂为叠氮钠,优选的,叠氮钠的用量为0.1%-0.5%。
本申请的另一方面公开了可溶性锰离子或镁离子的金属盐在制备对肝素敏感的活化部分凝血活酶时间试剂中的用途,锰离子或镁离子的金属盐提高含肝素样本的活化部分凝血活酶时间检测值与不含肝素样本的活化部分凝血活酶时间检测值的倍率。
其中,含肝素样本即添加肝素的血浆样本,含肝素样本的活化部分凝血活酶时间检测值,即添加肝素的血浆样本的APTT值;不含肝素样本即没有添加肝素的血浆样本,也就是空白样本,不含肝素样本的活化部分凝血活酶时间检测值,即空白值。
需要说明的是,研究显示,不同的APTT试剂,其测量的APTT值的大小存在较大差异,仅仅根据APTT值的大小,不能反映APTT试剂对肝素浓度变化的灵敏性;因此,本申请采用含肝素样本的活化部分凝血活酶时间检测值与不含肝素样本的活化部分凝血活酶时间检测值的倍率,来反映APTT试剂对肝素浓度变化的灵敏性。该倍率越大,说明添加肝素后测量的APTT值变化越大,即对肝素的灵敏度越高。
优选的,APTT试剂的激活剂为鞣花酸或白陶土。
优选的,可溶性锰离子的金属盐选自硫酸锰或氯化锰中的至少一种;可溶性镁离子的金属盐选自硫酸镁或氯化镁中的至少一种。
优选的,可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐的用量为0.1%~1.0%。
由于采用以上技术方案,本申请的有益效果在于:
本申请的方法,通过添加可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐,影响肝素在凝血系统中的作用,延长凝血时间,进而有效的提高了APTT试剂对肝素的敏感性,使得APTT试剂能够更灵敏的反映出肝素浓度的变化,对肝素治疗效果的临床检测具有重要意义。
具体实施方式
APTT值是监控肝素治疗的重要指标,但是,现有的APTT试剂不能灵敏的反映出肝素浓度的变化。在APTT试剂的优化研究过程中发现,添加锰离子和/或镁离子这两种可溶性金属盐,能够大大提高APTT试剂对肝素的敏感性,进而提出本申请。
按照本申请的方法,在采用APTT试剂对血浆进行检测时,向反应体系中加入可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐,或者预先在APTT试剂中添加可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐,再采用添加可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐的APTT试剂对血浆进行检测,能够大大提高APTT试剂对肝素浓度的敏感性。本申请的一种实现方式中,按照本申请的方法,在正常血浆条件下,肝素浓度达到0.4U/mL时,其APTT值为空白值的1.5~2.5倍。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明,不应理解为对本申请的限制。
除非特别说明,实施例中使用到的仪器、设备和溶液均为常规选择。APTT检测使用的仪器为STAGO-COMPACT全自动血凝仪。
实施例
本例将可溶性锰离子或镁离子的金属盐添加到APTT试剂中,然后再对血浆进行检测。其中,APTT试剂的激活剂为鞣花酸或白陶土。本例的APTT试剂制备方法如下:
称取白陶土或者鞣花酸1.0g溶于1000mL 20mM pH7.5Tris-HCl缓冲液中,搅拌30min,直到整个液体呈现均一白色悬浊液,然后加入2.0g磷脂,混合均匀,37℃保温1h,最后按比例加入聚乙二醇、明胶和叠氮钠,再加入锰离子或镁离子的二价金属盐,混匀,即为液体APTT试剂。叠氮钠是常用的防腐剂,其他防腐剂也可以用于本申请。TRIS是常用的缓冲盐,其他能维持pH在6~8的缓冲盐也可以用于本申请。
本例按照以上方法,分别制备了四个试剂进行试验;并采用不加入可溶性锰离子或镁离子的二价金属盐的APTT试剂作为对照试验1,采用加入氯化钠的APTT试剂作为对照试验2,采用加入硫酸钠的APTT试剂作为对照试验3。本例的四个试剂和对照试剂的各组分及用量如表1所示。
表1不同配方组成的APTT试剂
白陶土 | 鞣花酸 | 磷脂 | TRIS | 聚乙二醇 | 明胶 | 叠氮钠 | 金属盐 | |
试剂1 | 0.1% | - | 0.2% | 20mM | 0.5% | 1% | 0.1% | 硫酸镁0.5% |
试剂2 | 0.1% | - | 0.2% | 20mM | 0.4% | 0.8% | 0.1% | 氯化镁0.1% |
试剂3 | 0.1% | - | 0.2% | 20mM | 1.0% | 1.0% | 0.5% | 硫酸锰1.0% |
试剂4 | - | 0.1% | 0.2% | 20mM | 0.5% | 1.0% | 0.1% | 氯化锰0.5% |
对照1 | 0.1% | - | 0.2% | 20mM | 0.5% | 1% | 0.1% | - |
对照2 | 0.1% | - | 0.2% | 20mM | 0.5% | 1% | 0.1% | 氯化钠0.5% |
对照3 | 0.1% | - | 0.2% | 20mM | 0.5% | 1% | 0.1% | 硫酸钠0.5% |
表1中各组分的用量是其在APTT试剂中的浓度,百分比为重量百分比,溶剂为20mMpH7.5Tris-HCl缓冲液。按照表1的配方和用量配制四个试剂和三个对照。
采用正常人血浆作为测试物,向血浆中加入不同量的肝素形成血浆中肝素浓度依次为0U/mL、0.2U/mL、0.4U/mL、0.6U/mL、0.8U/mL的5个待测样品,分别采用对照1、对照2、对照3、试剂1、试剂2、试剂3、试剂4,共计七个APTT试剂对5个不同肝素浓度的待测样品进行检测,本例使用的仪器为STAGO-COMPACT全自动血凝仪。其中,0U/mL是指不添加肝素的血浆样品。测试结果如表2所示。
表2各APTT试剂的测试结果(单位:秒)
肝素浓度 | 对照1 | 对照2 | 对照3 | 试剂1 | 试剂2 | 试剂3 | 试剂4 |
0 | 31.4 | 31.7 | 31.9 | 31.3 | 31.5 | 31.7 | 32 |
0.2 | 36 | 38.2 | 39.1 | 48.2 | 42.4 | 53.9 | 45.9 |
0.4 | 40.7 | 43.5 | 44.1 | 63.4 | 55.8 | 78.2 | 65.2 |
0.6 | 60.4 | 63.4 | 62.4 | 94.1 | 83.7 | 120.6 | 94.6 |
0.8 | 83.4 | 88.3 | 90.7 | 128.6 | 113.7 | 167.3 | 126.3 |
比值 | 1.30 | 1.37 | 1.38 | 2.03 | 1.77 | 2.47 | 2.04 |
表2中,肝素浓度的单位为“U/mL”,“比值”是指0.4U/mL肝素浓度测得的APTT值与0U/mL肝素浓度测得的APTT值的比值,0U/mL肝素浓度测得的APTT值即空白值。
需要说明的是,不同的APTT试剂,其测量的0U/mL肝素浓度APTT值或其它浓度肝素的APTT值,具体数值上存在较大差异,只用某个肝素浓度下的APTT值来体现APTT试剂对肝素的敏感性不够准确;例如,可能某个APTT试剂测定的肝素浓度0.4U/mL时的APTT值同样可以达到本申请大于60秒以上的测试结果水平,但是,其0U/mL肝素浓度的APTT值本身也比较高,不能说明其对肝素敏感。因此,本例采用0.4U/mL肝素浓度测得的APTT值与0U/mL肝素浓度测得的APTT值的比值来体现APTT试剂对肝素的敏感性。
表2的结果可见,4个试剂在正常血浆条件下,肝素浓度达到0.4U/mL时,其APTT值为空白值的1.5~2.5倍;而作为对照的试剂最高也仅仅只有1.38,即对照3;由此可见,按照本例的方法,即在APTT试剂中添加可溶性锰离子或镁离子的二价金属盐,能够有效的提高APTT试剂对肝素的敏感性。此外,就表2的结果可见,在7个APTT试剂测定的0U/mL肝素浓度的APTT值相当的情况下,本例测定的肝素浓度0.2U/mL时,四个试剂的APTT值已经明显大于对照试剂的APTT值;可见,本例的四个试剂对肝素的敏感性更高。
其中,对照2和对照3虽然也添加有其它的金属盐,对照2添加的氯化钠,对照3添加的硫酸钠,但是,其效果远不及本例添加可溶性锰离子或镁离子二价金属盐的效果;可见,并非只添加金属盐即可,必须是二价金属盐,特别是锰离子或镁离子。
另外,就各组分的用量来说,锰离子或镁离子的金属盐的用量为APTT试剂总重量的0.1%~1.0%都可以达到提高APTT试剂对肝素敏感性的要求。至于APTT试剂采用常规的组分和用量即可,一般来说,其稳定剂的聚乙二醇用量为0.4%~1.0%、明胶用量为0.8%~1.0%、叠氮钠用量为0.1%~0.5%、激活剂白陶土或鞣花酸的用量为0.1%、磷脂用量为0.2%,pH值为6~8的缓冲盐。当然,不排除其它组分或用量的APTT试剂也可以按照本例的方法提高APTT试剂对肝素的敏感性。
为了方便使用,本例是直接在APTT试剂中添加的可溶性锰离子或镁离子的金属盐,然后再用于APTT检测;可以理解,也可以在进行血浆检测时,同时向反应体系中加入APTT试剂和可溶性锰离子或镁离子的金属盐,在此不做具体限定。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明,不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本申请构思的前提下,还可以做出若干简单推演或替换,都应当视为属于本申请的保护范围。
Claims (10)
1.一种提高活化部分凝血活酶时间试剂对肝素敏感性的方法,其特征在于:包括在采用活化部分凝血活酶时间试剂对血浆进行检测时,向反应体系中加入可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐;或者预先在活化部分凝血活酶时间试剂中添加可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐,再用于活化部分凝血活酶时间检测。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述可溶性锰离子的金属盐选自硫酸锰或氯化锰中的至少一种;所述可溶性镁离子的金属盐选自硫酸镁或氯化镁中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于:所述可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐的用量为0.1%~1.0%。
4.根据权利要求1-3任一项所述的方法,其特征在于:所述活化部分凝血活酶时间试剂的激活剂为鞣花酸或白陶土。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述活化部分凝血活酶时间试剂包括0.1%的鞣花酸、0.2%的磷脂、0.4%~1.0%的聚乙二醇、0.8%~1.0%的明胶,以及pH值为6~8的缓冲盐。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于:所述活化部分凝血活酶时间试剂包括0.1%的白陶土、0.2%的磷脂、0.4%~1.0%的聚乙二醇、0.8%~1.0%的明胶,以及pH值为6~8的缓冲盐。
7.可溶性锰离子或镁离子的金属盐在制备对肝素敏感的活化部分凝血活酶时间试剂中的用途,所述锰离子或镁离子的金属盐提高含肝素样本的活化部分凝血活酶时间检测值与不含肝素样本的活化部分凝血活酶时间检测值的倍率。
8.根据权利要求7所述的用途,所述活化部分凝血活酶时间试剂的激活剂为鞣花酸或白陶土。
9.根据权利要求7所述的用途,其特征在于:所述可溶性锰离子的金属盐选自硫酸锰或氯化锰中的至少一种;所述可溶性镁离子的金属盐选自硫酸镁或氯化镁中的至少一种。
10.根据权利要求7所述的用途,其特征在于:所述可溶性锰离子和/或镁离子的金属盐的用量为0.1%~1.0%。
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