CN106290923A - 一种活化凝血检测试剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种活化凝血检测试剂及其应用，所述试剂组分包括激活剂、混合磷脂、复合稳定剂，所述激活剂包括高岭土、白陶土、硅藻土、鞣花酸、二氧化硅、组织因子中的一种或几种，所述复合稳定剂包括多聚物、防腐剂、水溶性抗氧化剂等。该检测试剂不使用现有技术所采用的缓冲液，并且也不使用生理盐水，本发明将激活剂、混合磷脂、复合稳定剂进行组合，以复合稳定剂作为溶液环境，也可以保证检测试剂的稳定性，该检测试剂可有效避免现有技术所使用的缓冲液会促进磷脂水解的影响，并且成本低，效果好，性质稳定。

Description

一种活化凝血检测试剂及其应用

技术领域

本发明属于止血及凝血检测领域，具体涉及一种活化凝血检测试剂及其应用。

背景技术

凝血功能的评估实验对多种疾病的诊断、治疗和预后判断有着十分重要的意义。不仅可以用于对出血性疾病进行筛查和辅助诊断，还可以对血栓性疾病进行预测或风险评估；对凝血因子缺乏及血管性血友病也可以进行诊断、用药指导和预后判断。凝血检测还用来对围术期各种出凝血异常进行筛查，对于凝血功能紊乱的成分输血和用药给予指导。

生理状态下的凝血功能是由血管、血小板、凝血因子、抗凝系统及纤溶系统共同完成的。目前常用的凝血理论模型主要有凝血因子的级联反应模型和细胞模型。凝血因子的级联反应模型指出，凝血过程是由多种凝血因子参与的一系列的酶促反应，主要包括外源性激活途径、内源性激活途径和共同凝血途径，揭示了凝血因子之间有序的相互作用，认为是凝血因子控制着凝血过程。而细胞模型则强调凝血因子相互作用的关键事件是发生在特定细胞表面，并将凝血过程划分为3个阶段：启动、放大和爆发阶段。细胞模型认为，在凝血过程中，细胞表面的某些特征变化决定和影响着凝血过程的“适时”和“适度”，而血小板的激活是凝血调控的枢纽事件。

常规凝血检验以凝血四项为代表，分别为活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和纤维蛋白原(FIB)。APTT主要反映内源性凝血途径状况，常用于内源性凝血途径相关凝血因子及异常抗凝物的筛查；PT主要反映外源性凝血途径状况，常用于外源性凝血途径相关凝血因子的筛查和口服香豆素类抗凝药的监测；TT主要反映纤维蛋白原转为纤维蛋白的速率；FIB主要反映纤维蛋白原的含量。血栓弹力(Viscoelastic)检测是一种新的凝血功能检测手段，它以细胞凝血模型为基础，以全血作为检测样本，用物理方法模拟体内环境下凝血及纤溶过程，迅速判断患者是否存在凝血功能异常并分析形成原因。血栓弹力检测不需要对全血样本进行特殊处理，能够动态反映凝血过程的全貌，可以有效指导成分输血，使得输血量减少。目前已有的血液弹力检测平台主要有TEG、ROTEM、SONOCLOT等。

以上凝血检测方法中，只要检测原理中涉及到凝血因子级联反应的，其相应的检测试剂中主要含有特定的激活剂和作为血小板因子Ⅲ代替物的外源磷脂。激活剂包括高岭土、白陶土、硅藻土、鞣花酸、二氧化硅、组织因子等。当激活剂与血液或血浆接触，会激活对应内源性或外源性凝血途径。磷脂主要包括天然磷脂和合成磷脂，天然磷脂来源于动物或植物的提取物，合成磷脂主要是指通过体外的化学反应合成的磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰丝氨酸(PS)。在Ca²⁺存在的条件下，这些磷脂成分会参与形成关键的凝血因子复合物，最终使凝血酶原转变为凝血酶，导致纤维蛋白原转换为纤维蛋白，血液发生凝固。尤其是当检测样本为血浆时，由于血浆中血小板含量较低，外源磷脂的作用更加重要。

研究表明，静息状态下的血小板细胞膜上磷脂的分布是不对称的，只有痕量的PS和约20％的PE分布在细胞膜的外表面，而鞘磷脂和PC含量丰富。当血小板被激活，鞘磷脂和PC会向内转移，PS会大量的暴露在细胞表面，催化并参与形成两种酶复合物来促进凝血过程。PS的含量是决定外源磷脂催化特性的主要因素，因此血小板膜磷脂中的PS也被称为血小板第三因子(PF3)。

组成细胞膜的磷脂富含不饱和脂肪酸，在水溶液中易被氧化和水解，因此相对于凝血检测试剂中的其他组分，磷脂在长期保存中的稳定性相对最差，相应地，磷脂在保存条件下的稳定性决定了凝血检测试剂的稳定性。

磷脂的氧化可以通过加入抗氧化剂或创造无氧环境来抑制损伤程度；低温保存也有助于减少氧化的影响。此外，部分饱和的磷脂比含多不饱和脂肪酸链的磷脂是一种更好的选择。磷脂的水解能仅通过去除水分(冻干)而被完全抑制。但是，冻干的磷脂会产生物理稳定性的问题，且使用过程中增加了复溶的操作步骤，也相应地引入了额外的影响检测结果的变异因素，所以，磷脂以水性分散溶液保存是更好的选择。

研究表明，水溶液的pH值、离子强度、缓冲液种类是影响磷脂水解的主要因素。当pH为6.5时，磷脂水解速率常数最小，磷脂成分最稳定。离子强度主要通过影响带电荷的磷脂，如PS、PE等，来影响磷脂成分的水解速率。磷脂水解会进一步改变pH，从而加快水解，缓冲液可以使pH维持相对稳定，从而具有一定的保护作用。同时，特定的缓冲盐(HEPES、Tris)对于磷脂还具抗氧化的保护作用(Free Radic Res Commun.1989；6(4):243-50)。因此，目前大多凝血检测试剂将低浓度HEPES作为基本缓冲液，如Clin Chem.1997；43(7):1215-1222.、Thromb Res.1996；81(4):419-426.、Clin Lab Haematol.2004；26(3):215-223.、JTrauma Acute Care Surg.2014；76(1):107-113.、专利US2014295470等专业文献中所阐述的凝血试剂制备方法。其中，Clin Chem.1997；43(7):1215-1222.中制备的APTT试剂是国际参比试剂。另一方面，缓冲盐的浓度会因为提高溶液的离子强度而促进磷脂水解，因此目前认为，缓冲液的最优浓度应当是可确保pH恒定的最低浓度。

但是，我们在研究过程中发现，即使使用低浓度的、具有保护磷脂抗氧化的缓冲盐HEPES，仍然能够在一定程度上影响试剂保存的稳定性，推测这与其加速磷脂的水解有关；而不使用缓冲盐、甚至是不使用生理盐水，通过使用复合稳定剂，能有效加强凝血试剂的保存稳定性。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种活化凝血的检测试剂，该检测试剂不使用现有技术所采用的缓冲液，并且也不使用生理盐水，同时配合水溶性抗氧化剂、大分子多聚体(macromolecule polymers)、防腐剂作为溶液环境，也可以保证检测试剂的稳定性，该检测试剂可有效避免现有技术所使用的缓冲液会促进磷脂水解的影响，并且成本低，效果好，性质稳定。本发明的目的之二在于提供该检测试剂的应用。

为达到上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

1、一种活化凝血检测试剂，组分包括激活剂、混合磷脂、复合稳定剂。

优选的，所述激活剂包括高岭土、白陶土、硅藻土、鞣花酸、二氧化硅、组织因子中的一种或几种；所述混合磷脂为合成磷脂或天然磷脂，所述复合稳定剂包括水溶性多聚物、水溶性抗氧化剂以及防腐剂。

优选的，所述合成磷脂是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油中的至少两种，并至少包含磷脂酰丝氨酸。

优选的，所述水溶性多聚物为PVP40或PEG，所述水溶性抗氧化剂为甜菜碱、抗坏血酸、茶多酚或氨基酸类抗氧化剂，所述防腐剂为叠氮钠、苯酚、山梨酸钾中的一种或几种。

更优选的，各组分的含量为：激活剂0.001％～0.01％，水溶性多聚物0.01％～0.2％；水溶性抗氧化剂1mM～10mM；防腐剂0.02％～0.6％；混合磷脂10μg/mL～50μg/mL，其中的百分比均为质量体积百分比，单位为g/ml。

更优选的，各组分的含量为：激活剂0.0024％；PVP40 0.1％；叠氮钠0.02％；甜菜碱5mM；苯酚0.36％；混合磷脂20μg/mL，其中的百分比均为质量体积百分比，单位为g/ml。

更优选的，各组分的含量为高岭土0.0024％；PVP40 0.1％；叠氮钠0.02％；甜菜碱5mM；苯酚0.36％；混合磷脂20μg/mL，其中的百分比均为质量体积百分比，单位为g/ml。

2、所述活化凝血检测试剂在血液弹力检测或使用外源磷脂作为组分的凝血检测试剂的检测方法中的应用。

使用外源磷脂作为组分的凝血检测试剂的检测方法包括APTT或PT。

本发明所述PVP40是指聚乙烯吡咯烷酮，本发明所述PEG是指聚乙二醇。

本发明的有益效果在于：本发明公开的一种活化凝血检测试剂，该检测试剂不使用现有技术所采用的缓冲液，并且也不使用生理盐水，本发明将激活剂、混合磷脂、稳定剂、水溶性抗氧化剂以及防腐剂进行组合，以稳定剂及水溶性抗氧化剂作为溶液环境，也可以保证检测试剂的稳定性，该检测试剂可有效避免现有技术所使用的缓冲液会促进磷脂水解的影响，并且成本低，效果好，性质稳定。

具体实施方式

下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1 试剂的制备

一种活化凝血检测试剂的制备如下：

所述试剂各组分组成如下：

高岭土：0.0024％

混合磷脂：20μg/mL

PVP40：0.1％

叠氮钠：0.02％

甜菜碱：5mM

苯酚：0.36％

其中的百分比均为质量体积百分比，单位为g/ml。

按1L总体积计算并精密称取或量取相应上述组分，用蒸馏水分散均匀，并定容至1L。搅拌均匀后分装至样品管，每支40μL。

其中混合磷脂的制备按专业文献广泛报道制备(例如Clin Chem.1997；43(7):1215-1222.)，不局限于特定的、单一的具体条件。

实施例2 试剂的检测效果验证

活化凝血检测试剂的效果检测

将实施例1所配制的活化凝血检测试剂和进口活化凝血试剂用相同血样在TEG5000分析仪进行测试，该测试各项参数解释如下：R表示从检测开始到第一块纤维蛋白凝块形成之间的一段时间；Angle用于评估血凝块形成的效率；MA直接反映纤维蛋白与血小板通过GPIIb/IIIa相互联结的最强的动力学特性，代表纤维蛋白凝块的最大强度。

实施例1所得试剂与进口试剂的检测数据如表1所示：

表1 各项参数检测结果

由表1可看出，本发明试剂与参比进口试剂效果相当，这说明本发明所述试剂可用于活化凝血检测。

实施例3 试剂的稳定性研究

按照表2所述的测试组分别对每组的加速稳定性进行检测：

表2 实验组分类

注：上表中其中的百分比均为质量体积百分比，单位为g/ml。

按照实施例1所述的制备方法分别将3组试剂配成试剂样品，然后分别将每组样品在60℃条件下存放进行加速破坏，分别于配制当天、以及加速破坏的第7天和第12天进行检测，检测结果如表3所示：

表3表示各组试剂的稳定性检测结果

由表3所示检测数据可得，三组试剂在配制当天的检测效果相当，R值、Angle值、MA值的检测均值无显著差异。以PB-NS组4℃保存条件作为对照，60℃加速破坏7天后，PB-NS和PB-HS组R值均显著延长，提示初始凝血速率降低，而PB-BP组的R值、Angle值、MA值与对照无明显差别。60℃放置12天后，PB-NS和PB-HS组R值显著延长，Angle和MA值的相对偏差也均较大，而PB-BP组的各项指标与对照组相比均无明显变化。

以上结果显示，本发明所公布的复合稳定剂，能够有效改善活化凝血试剂在保存过程中的稳定性。与现有公知的技术相比，本发明所公布的活化凝血试剂，其特征在于不使用现有技术所采用的缓冲液，并且也不使用生理盐水，通过将水溶性抗氧化剂、多聚物、防腐剂组合在一起形成一种简单实用的复合稳定剂，与激活剂、混合磷脂组成凝血检测试剂，即可保证检测试剂的稳定性。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.一种活化凝血检测试剂，其特征在于，组分包括激活剂、混合磷脂、复合稳定剂。

2.根据权利要求1所述一种活化凝血检测试剂，其特征在于，所述激活剂包括高岭土、白陶土、硅藻土、鞣花酸、二氧化硅、组织因子中的一种或几种；所述混合磷脂为合成磷脂或天然磷脂，所述复合稳定剂包括水溶性多聚物、水溶性抗氧化剂以及防腐剂。

3.根据权利要求2所述一种活化凝血检测试剂，其特征在于，所述合成磷脂是磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油中的至少两种，并至少包含磷脂酰丝氨酸。

4.根据权利要求2所述一种活化凝血检测试剂，其特征在于，所述水溶性多聚物为PVP40或PEG，所述水溶性抗氧化剂为甜菜碱、抗坏血酸、茶多酚或氨基酸类抗氧化剂，所述防腐剂为叠氮钠、苯酚、山梨酸钾中的一种或几种。

5.根据权利要求2所述一种活化凝血检测试剂，其特征在于，各组分的含量为：激活剂0.001％～0.01％，水溶性多聚物0.01％～0.2％；水溶性抗氧化剂1mM～10mM；防腐剂0.02％～0.6％；混合磷脂10μg/mL～50μg/mL，其中的百分比均为质量体积百分比，单位为g/ml。

6.根据权利要求2所述一种活化凝血检测试剂，其特征在于，各组分的含量为：激活剂0.0024％；PVP40 0.1％；叠氮钠0.02％；甜菜碱5mM；苯酚0.36％；混合磷脂20μg/mL，其中的百分比均为质量体积百分比，单位为g/ml。

7.根据权利要求2所述一种活化凝血检测试剂，其特征在于，各组分的含量为高岭土0.0024％；PVP40 0.1％；叠氮钠0.02％；甜菜碱5mM；苯酚0.36％；混合磷脂20μg/mL，其中的百分比均为质量体积百分比，单位为g/ml。

8.权利要求1～7任一项所述活化凝血检测试剂在血液弹力检测或使用外源磷脂作为组分的凝血检测试剂的检测方法中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，使用外源磷脂作为组分的凝血检测试剂的检测方法包括APTT或PT。