CN102141570A - 活化部分凝血酶时间测定试剂、活化部分凝血酶时间测定法及判断有无抗凝血物质的方法 - Google Patents

活化部分凝血酶时间测定试剂、活化部分凝血酶时间测定法及判断有无抗凝血物质的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种可以不受受检血浆中所含外源性肝素影响、方便、准确地进行APTT测定的活化部分凝血酶时间测定试剂、活化部分凝血酶时间测定方法以及判断有无抗凝血物质的判断方法。

Description

活化部分凝血酶时间测定试剂、活化部分凝血酶时间测定法及判断有无抗凝血物质的方法
技术领域：
本发明涉及一种活化部分凝血酶时间测定试剂、活化部分凝血酶时间测定法及判断有无抗凝血物质的判断方法。
背景技术：
在接受凝血检查的患者中，有人用肝素作为治疗血栓的药物。打点滴时，为了防止导管内发生凝血反应，有的患者使用向导管内填充了含肝素生理盐水的肝素锁导管。从这些患者采集的受检血浆有时含有外源性肝素。使用此受检血浆测定活化部分凝血酶时间(APTT)，凝血时间会因肝素影响而延长。
美国专利第5262325号公开了一种消除受检血浆中所含外源性肝素对APTT测定的影响的方法。根据此方法，用肝素中和剂中和受检血浆后，再测定APTT，以此消除受检血浆中所含肝素的影响。然而，根据美国专利第5262325号记载的方法，需要事先向受检血浆加入肝素中和剂。APTT测定工作因此而变得很烦琐。另外，根据美国专利第5262325号记载的方法，进行APTT测定时，需要时常意识到受检血浆中存在肝素的可能性。特别是在医疗现场，紧急测定APTT时，往往未确认受检血浆中有无外源性肝素就对APTT进行测定。
近年来，在使用APTT测定试剂的交叉混合试验(cross mixing test)中，受检血浆中所含外源性肝素的影响也成为一个问题(检查技术，vol.34no.82006年8月p.738-739)。交叉混合试验是通过测定受检血浆和正常血浆的混合血浆的凝血时间，检查患者凝血因子是否缺损和受检血浆中有无抗凝血物质。如上所述，如果受检血浆中含有外源性肝素，凝血时间就会延 长。因此，如果在交叉混合试验中有受检血浆中所含的外源性肝素的话，恐怕将无法正确查出内源性抗凝血物质的存在。
发明内容：
本发明的范围只由后附的权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。
发明人发现，预先在APTT测定试剂中加入肝素中和剂，可以不受受检血浆中所含外源性肝素影响而方便、准确地进行APTT测定，从而完成了本项发明。
本发明提供：
(1)一种活化部分凝血酶时间测定试剂，包括肝素中和剂。
通过上述(1)所述活化部分凝血酶时间测定试剂，可以提供一种能不受受检血浆中所含外源性肝素的影响，而方便、准确地进行APTT测定的APTT测定试剂。
(2)根据上述(1)所述活化部分凝血酶时间测定试剂，包括：
含有磷脂及活化剂的第一试剂；及
含有肝素中和剂和钙盐的第二试剂。
通过上述(2)的活化部分凝血酶时间测定试剂，可以提供一种能不受受检血浆中所含外源性肝素的影响，而方便、准确地进行APTT测定的高稳定性APTT测定试剂。
(3)根据上述(1)所述活化部分凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述肝素中和剂是凝聚胺。
(4)根据上述(2)所述活化部分凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述钙盐是氯化钙。
(5)根据上述(2)所述活化部分凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述活化剂是鞣花酸、胶体硅(colloidal silica)和无水硅酸中的至少其中之一。
(6)根据上述(2)-(5)中任一项所述活化部分凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述磷脂是磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油中的至少其中之一。
(7)一种用于将受检血浆与含磷脂和活化剂的试剂混合后测定活化部分凝血酶时间的试剂，包括：
肝素中和剂；及
钙盐。
根据上述(7)的试剂，它是一种将受检血浆与含磷脂和活化剂的试剂混合后测定APTT的试剂，可以提供给人们一种可不受受检血浆所含外源性肝素影响，方便、正确地进行APTT测定的高稳定性试剂。
(8)根据上述(7)所述试剂，其特征在于，所述肝素中和剂是凝聚胺。
(9)上述(7)或(8)所述试剂，其特征在于，所述钙盐是氯化钙。
(10)一种活化部分凝血酶时间测定方法，包括：
第一混合步骤，将受检血浆与含有磷脂和活化剂的第一一试剂混合；
第二混合步骤，将上述第一混合步骤获得的试样与含肝素中和剂和钙盐的第二试剂混合；及
测定步骤，测定在上述第二混合步骤获得的试样的凝固时间。
根据上述(10)的活化部分凝血酶时间测定方法，可以提供一种不受受检血浆所含外源性肝素影响，方便、准确且试剂稳定性高的APTT测定方法。
(11)根据上述(10)所述活化部分凝血酶时间测定方法，其特征在于，所述肝素中和剂是凝聚胺。
(12)根据上述(10)所述活化部分凝血酶时引间测定方法，其特征在于，所述钙盐是氯化钙。
(13)根据上述(10)所述活化部分凝血酶时间测定方法，其特征在于，所述活化剂是鞣花酸、胶体硅和无水硅酸的至少其中之一。
(14)根据上述(10)-(13)中任一项所述活化部分凝血酶时间测定方法，其特征在于，所述磷脂是磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和 磷脂酰甘油中的至少其中之一。
(15)一种判断受检血浆中有无抗凝血物质的方法，包括：
制样步骤，将疑有上述抗凝血物质的受检血浆和正常血浆以至少三种不同比例混合，制备测定试样；
第一混合步骤，将在上述制样步骤获得的各种测定试样与含有磷脂和活化剂的第一试剂混合；
第二混合步骤，将在上述第一混合步骤获得的各种试样与含有肝素中和剂和钙盐的第二试剂混合；
测定步骤，测定在上述第二混合步骤获得的各种试样的凝固时间；及
判断步骤，根据在上述测定步骤获得的各试样的上述凝固时间，判断上述受检血浆中是否含有上述抗凝血物质。
根据上述(15)的判断受检血浆中有无抗凝血物质的判断方法，可以不受受检血浆所含外源性肝素影响，方便、准确、且试剂稳定性高地判断有无抗凝血物质。
(16)根据上述(15)所述方法，其特征在于，所述判断步骤根据在所述测定步骤获得的各试样的所述凝固时间，获取罗斯纳指数(ROSNER INDEX)值，根据获取的罗斯纳指数值，判断所述受检血浆中有无所述抗凝血物质。
(17)根据上述(15)所述方法，其特征在于，所述抗凝血物质是狼疮抗凝物、后天性血友病、凝固因子抑制物或C1失活因子。
(18)根据上述(15)所述方法，其特征在于，所述肝素中和剂是凝聚胺。
(19)根据上述(15)所述方法，其特征在于，所述钙盐是氯化钙。
(20)根据上述(15)-(19)中任一项所述方法，其特征在于，所述活化剂是鞣花酸、胶体硅和无水硅酸中的至少其中之一。
附图说明：
图1为从用含凝聚胺的钙溶液进行活化部分凝血酶时间(APTT)测定所 获得的APTT计算出的罗斯纳指数值的柱状图。
图2为从用不含凝聚胺的钙溶液进行活化部分凝血酶时间(APTT)测定所获得的APTT计算出的罗斯纳指数值的柱状图。
具体实施方式：
本实施方式中的活化部分凝血酶时间(APTT)测定试剂含有肝素中和剂。APTT测定试剂可以由含磷脂和活化剂的第一试剂及含肝素中和剂和钙盐的第二试剂组成，也可以由含磷脂和活化剂的第一试剂、含钙盐的第二试剂和含肝素中和剂的第三试剂组成。在此，第三试剂既可以在第一试剂添加后第二试剂添加前添加，也可以在第一试剂和第二试剂添加后添加。
此外，发明人发现，在APTT测定试剂中，通过向含有钙盐的试剂中添加肝素中和剂，可以不产生沉淀、且不受受检血浆中所含肝素影响地进行APTT测定。因此，在本实施方式中，含有肝素中和剂的APTT测定试剂构成，最好包括含有磷脂及活化剂的第一试剂和含有肝素中和剂和钙盐的第二试剂。
本实施方式中的活化部分凝血酶时间(APTT)测定试剂包括含磷脂和活化剂的第一试剂和含肝素中和剂和钙盐的第二试剂。
第一试剂中的磷脂只要是能够在APTT测定试剂中通用的磷脂即可，无特别限制。比如可以是磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油等。磷脂米源自牛脑、兔脑、人类胎盘、大豆和蛋黄等天然磷脂或合成磷脂等均可。最好是兔脑脑磷脂、大豆脑磷脂和合成磷脂等。
第一试剂中的磷脂浓度，可根据磷脂的种类和APTT测定条件等适当设定，无特别限制。比如第一试剂中的磷脂浓度可以是20-200μg/mL，以50-150μg/mL为宜。使用兔脑脑磷脂、大豆脑磷脂或合成磷脂为磷脂时，第一试剂中的磷脂浓度以20-200μg/mL为宜，最好是50-150μg/mL。
第一试剂中的活化剂只要是活化接触因子类的物质即可，无特别限制。比如可从包括鞣花酸、高岭土、硅藻土、胶体硅和无水硅酸等的物质组中选 择至少一种使用。在本实施方式中，最理想的活化剂如为鞣花酸和胶体硅等。
第一试剂中的活化剂浓度，可根据活化剂的种类和APTT测定条件等适当设定，无特别限定。比如第一试剂中的活化剂浓度可以是5-1000μg/mL，以20-500μg/mL为宜。使用鞣花酸作为活化剂时，第一试剂中的活化剂浓度以5-100μg/mL为宜，最好是20-50μg/mL。
第一试剂除磷脂和活化剂外，还可以包含可向APTT测定试剂中添加的其他成分。在此，其他成分如有缓冲剂、防腐剂和抗氧化剂等。
在此，缓冲剂只要是APTT测定试剂通用的缓冲剂即可，无特别限制。缓冲剂如有4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、三羟甲基氨基甲烷(TRIS)和3-(N-吗啉)丙磺酸(MOPS)等。第一试剂的pH值以5-9为宜，最好是6-8。可以用上述缓冲剂调整此第一试剂的pH值。
防腐剂只要是APTT测定试剂通用的防腐剂即可，无特别限制。防腐剂如有叠氮钠、苯酚和抗生素(环丙沙星)等，以苯酚为宜。第一试剂中的防腐剂浓度适当调整即可，无特别限制，比如可以是1-5mg/mL。
抗氧化剂只要是APTT测定试剂通用的抗氧化剂即可，无特别限制。抗氧化剂比如有丁基羟基茴香醚等。
本实施方式中的第二试剂中的肝素中和剂为对APTT测定没有影响的众所周知的肝素中和剂即可，无特别限制。比如可以从凝聚胺、硫酸鱼精蛋白和肝素酶(heparinase)等构成的物质组中选择至少其中一种作为肝素中和剂使用。本实施方式的肝素中和剂最好是凝聚胺。
在此，第二试剂中的肝素中和剂浓度，可根据肝素中和剂的种类和APTT测定条件等适当设定，无特别限制。比如第二试剂中的肝素中和剂浓度可以是0.5-100μg/mL。当使用凝聚胺作为肝素中和剂时，第二试剂中的肝素中和剂浓度以5-50μg/mL为宜，最好是10-20μg/mL。
在此，第二试剂中的钙盐只要是APTT测定试剂通用的钙盐即可，无特别限制。比如可以使用无机酸和钙的盐以及有机酸和钙的盐中的任意一种。无机酸和钙的盐如有氯化钙、亚硝酸钙、硫酸钙和碳酸钙等。有机酸和钙的 盐如有乳酸钙和酒石酸钙等。第二试剂中的钙盐以无机酸和钙的盐为宜，尤以氯化钙为宜。
第二试剂中的钙浓度可根据钙盐的种类和APTT测定条件等适当设定，无特别限制。比如，第二试剂中的钙盐浓度可以是15-50mM，最好是20-30mM。当使用氯化钙作为钙盐时，第二试剂中的钙盐浓度以15-30mM为宜，最好是20-25mM。
第二试剂除肝素中和剂和钙盐外，还可以含有可添加到APTT测定试剂的其他成分。在此，其他成分比如有缓冲剂和防腐剂。
在此，缓冲剂可以使用与上述第一试剂同样的缓冲剂。第二试剂的pH值以5-9为宜，最好在6-8之间。此第二试剂的pH值也可以和第一试剂一样使用上述缓冲剂调整。
防腐剂可以使用与上述第一试剂相同的防腐剂。第二试剂的防腐剂浓度可适当调整，无特别限制，比如可以是1-5mg/mL。
本实施方式中的试剂是在受检血浆和含磷脂及活化剂的试剂混合后，用于测定活化部分凝血酶时间的试剂，其含有肝素中和剂和钙盐。该试剂与上述本实施方式APTT测定试剂的第二试剂相同。
本实施方式中的活化部分凝血酶时间(APTT)测定方法用上述本实施方式的APTT测定试剂实施。即本实施方式中的APTT测定方法包括混合受检血浆和含磷脂及活化剂的第一试剂的第一混合步骤、混合在第一混合步骤获得的试样和含肝素中和剂及钙盐的第二试剂的第二混合步骤以及测定第二混合步骤获得的试样的凝固时间的测定步骤。
第一混合步骤只要混合受检血浆和含磷脂及活化剂的第一试剂即可，对受检血浆和第一试剂的添加顺序无限制。
在此，受检血浆只要是从患者的全血获得的血液中清除血细胞以后的部分即可，无特别限制。获取受检血浆的方法是众所周知的。获取受检血浆的方法比如有在取自患者的血液中加入抗凝剂离心处理后，取上清获得受检血浆的方法。受检血浆除用上述方法获得的受检血浆外，也可以用市面上销售 的血浆。作为市面上销售的血浆，有正常血浆、凝血因子缺损的血浆和含有凝血抑制物质的血浆等。正常血浆可举出Coag Control N(希森美康公司制)和凝血试验用标准人血浆(希森美康公司制)等。凝血因子缺损的血浆如有乏VIII因子血浆(希森美康公司制)和乏IX因子血浆(希森美康公司制)等。含有凝血抑制物质的血浆如有LA阳性血浆(George King公司制)及有抑制物的乏VIII因子血浆(FACTOR VIIIDEFICIENT PLASMA WITH INHIBITOR)(George King公司制)等。上述受检血浆可根据APTT测定条件等适当稀释使用。
第一混合步骤中使用的第一试剂与上述本实施方式的APTT测定试剂的第一试剂相同。
第一混合步骤的反应温度根据受检血浆和第一试剂的混合比例及受检血浆的稀释比例等适当设定即可，无特别限制，但一般为25℃-45℃，以30℃-40℃为宜，最好是35℃-38℃。
第一混合步骤的反应时间也可根据受检血浆和第一试剂的混合比例及受检血浆的稀释比例等适当设定，无特别限制，但一般为1-15分钟，以2-10分钟为宜，最好是3-5分钟。
在第一混合步骤中受检血浆和第一试剂的混合比例根据受检血浆的稀释比例和第一试剂的组分等适当设定即可，无特别限制。比如受检血浆和第一试剂的混合比例可以是容量比8∶2-2∶8，以6∶4-4∶6为宜，最好为5∶5。
第二混合步骤只要将第一混合步骤获得的试样和含肝素中和剂及钙盐的第二试剂混合即可，第一混合步骤获得的试样和第二试剂的添加顺序无限制。
第二混合步骤所使用的第二试剂与上述本实施方式的APTT测定试剂的第二试剂相同。
第二混合步骤中的反应温度，可根据第一混合步骤所得试样与第二试剂的混合比例和受检血浆的稀释比例等适当设定，无特别限制，但一般为20℃-45℃，以30℃-40℃为宜，最好是35℃-38℃。
在第二混合步骤中第一混合步骤所得试样和第二试剂的混合比例可根据受检血浆和第一试剂的混合比例及第二试剂的组分等适当设定，无特别限制。比如第一混合步骤所得试样和第二试剂的混合比例可以是容量比8∶2-5∶5，以7∶3-6∶4为宜，最好为2∶1。
测定步骤一般以APTT测定通用的凝固时间测定法对第二混合步骤获得的试样的凝固时间进行测定即可。在此，作为试样的凝固时间测定方法比如有用秒表进行人工肉眼测定试样凝固所需时间的方法及用测定光学信息的装置测定试样的凝固时间的方法等。也可以用市面上出售的测定试样凝固时间用凝血测定仪。市面上出售的凝血测定仪如有希森美康公司制的CS-2000i和CS-2100i等。
本实施方式的判断受检血浆中有无抗凝血物质的判断方法采用上述本实施方式APTT测定方法的交叉混合试验进行。即本实施方式涉及的判断方法包括：制样步骤，以至少三种不同比例混合被怀疑有抗凝血物质存在的受检血浆和正常血浆，制备测定试样；第一混合步骤，将制样步骤获得的各测定试样与含磷脂和活化剂的第一试剂混合；第二混合步骤，将在第一混合步骤获得的各试样与含肝素中和剂及钙盐的第二试剂混合；测定步骤，测定在第二混合步骤获得的各试样的凝固时间；判断步骤，根据在测定步骤获得的各试样的凝固时间判断受检血浆中是否含有抗凝血物质。
制样步骤制备一般交叉混合试验中所用的测定试样即可。即，将被怀疑行抗凝血物质的受检血浆和正常血浆以至少三种不同比例混合，制备测定试样。对于被怀疑有抗凝血物质的受检血浆和正常血浆的添加顺序没有限制。
在此，抗凝血物质只要是受检血浆中的、肝素以外的抗凝血物质即可。更具体地说，抗凝物可以是狼疮抗凝物(LA)、后天性血友病、凝固因子抑制物和C1失活因子等。
受检血浆是与上述本实施方式的APTT测定方法中使用的受检血浆相同的血浆。
在此，正常血浆只要是从健康者的全血获得的血液中清除血细胞以后的 部分即可，无特别限制。获取正常血浆的方法是众所周知的。比如获取正常血浆的方法如有向采自健康者的血液中添加凝血抑制剂离心分离后，取上清，获正常血浆。作为正常血浆除用上述方法获得的正常血浆外，也可以用市面上销售的血浆。市面上的正常血浆，可举出Coag Control N(希森美康公司制)和凝血试验用标准人血浆(希森美康公司制)等。上述正常血浆可根据APTT测定条件等适当稀释使用。
在此，在制样步骤制备的受检血浆和正常血浆不同混合比例的测定试样数只要是三种以上即可，无特别限制。增加测定试样数可以提高本实施方式的判断方法的精确度。本实施方式中的测定试样数可以是3-6个。
在制样步骤制备的测定试样中受检血浆和正常血浆的混合比例可以是一般交叉混合试验所用的测定试样中受检血浆和正常血浆的混合比例即可，即，混合比例中，受检血浆：正常血浆的容量比可以是0∶10-10∶0。即制样步骤中受检血浆和正常血浆的混合比例也包括受检血浆或正常血浆的混合比例为0的组合。比如，当在制样步骤制备受检血浆和正常血浆不同混合比例的三种测定试样时，可以将受检血浆和正常血浆按10∶0、1∶1及0∶10三种不同容量比混合。
制样步骤中的反应温度可根据要判断的抗凝血物质种类、受检血浆的稀释比例和正常血浆的稀释比例等适当设定，无特别限制，比如可以为25℃-45℃，以30℃-40℃为宜，最好是35℃-38℃。
在制样步骤中的反应时间可根据要判断的抗凝血物质种类、受检血浆的稀释比例和正常血浆的稀释比例等适当设定，无特别限制。比如，当受检血浆中要判断的抗凝血物质为狼疮抗凝物(LA)等当即阻碍凝血反应的物质时，在制样步骤中的反应时间可以是1-15分钟，以1-5分钟为宜，最好是1分钟。当受检血浆中要判断的抗凝血物质为后天性血友病等比较缓慢地阻碍凝血反应的物质时，制样步骤中的反应时间可以是0.2小时-5小时，以0.5小时-4小时为宜，最好是1小时-3小时。
在本实施方式的判断受检血浆中有无抗凝血物质的判断方法中，第一混合步骤、第二混合步骤和测定步骤对制样步骤制备的测定试样分别进行与上述本实施方式的APTT测定方法的第一混合步骤、第二混合步骤和测定步骤同样的处理。
判断步骤采用通用的方法即可，即在交叉混合试验中，根据测定步骤获得的各试样的凝固时间，判断受检血浆中有无抗凝血物质，无特别限制。比如有根据混合比例和凝固时间图表的形状以及罗斯纳指数值的判断方法等。更具体而言，当采取根据混合比例和凝固时间图表的形状的判断方法时，以受检血浆和正常血浆的混合比例为横坐标，以试样的凝固时间为纵坐标绘制图表，图形为凹型的话，判断为有抗凝血物质，如果不是凹型，则判断无抗凝血物质。当使用基于罗斯纳指数值的判断方法时，先设定罗斯纳指数值阈值，如果从试样的凝固时间算出的罗斯纳指数值超过阈值，则判断有抗凝血物质，如果从试样的凝固时间算出的罗斯纳指数值低于阈值，则判断无抗凝血物质。
所谓罗斯纳指数值是根据以下式(1)算出的值。
罗斯纳指数值＝((受检血浆与正常血浆混合比例为1∶1的试样的APTT)-(正常血浆的APTT))/(受检血浆的APTT)×100式(1)
下面举实施例详细说明本发明，但本发明不限于此。
[实施例]
〈实验例一〉
[在APTT测定试样中添加凝聚胺]
(试剂1)
在3mL含Thrombocheck APTT-SLA(希森美康公司制)的磷脂和活化剂的试剂中添加3μL的10mg/mL凝聚胺溶液[10mg凝聚胺(Nacalai Tesque公司制)、1mL纯水]，制备试剂1。
(试剂2)
在3mL肌动蛋白FSL(希森美康公司制)中添加3μL的10mg/mL凝聚胺溶液，制备试剂2。
(试剂3)
在3mL含HemosIL APTT-SP(三菱化学医药股份公司制)的磷脂和活化剂的试剂中添加3μL的10mg/mL凝聚胺溶液，制备试剂3。
(试剂4)
在3mL含HemosIL SynthASil APTT(三菱化学医药股份公司制)的磷脂和活化剂的试剂中添加3μL的10mg/mL凝聚胺溶液，制备试剂4。
(试剂5)
在3mL的25mM钙溶液(278mg氯化钙、100mL纯水)中添加3μL的10mg/mL凝聚胺溶液，制备试剂5。
此外，Thrombocheck APTT-SLA、肌动蛋白FSL、HemosIL APTT-SP及HemosIL SynthASil APTT的各磷脂和活化剂的种类见表1。
[表1]
Figure BSA00000397569400121
[观察在APTT测定试剂添加凝聚胺后的影响]
肉眼观察试剂1-5过六小时后有无沉淀。观察结果见表2。
[表2]
  试剂1   试剂2   试剂3   试剂4   试剂5
  沉淀   +   +   +   +   -
+：有沉淀
-：无沉淀
从表2得知，含有APTT测定试剂的磷脂和活化剂的试剂，无论其磷脂种类和活化剂种类如何，添加凝聚胺就会产生沉淀。另一方面，向APTT测定试剂的钙溶液中添加凝聚胺也不会产生沉淀。
〈实验例二〉
[测定试样的制备]
(测定试样1)
Coag Control N(希森美康公司制)37℃加热1分钟，制得测定试样1。
(测定试样2)
George King公司制狼疮抗凝物(LA)阳性血浆以37℃加热1分钟，制得测定试样2。
(测定试样3)
正常血浆使用的是Coag Control N。受检血浆使用的是George King公司生产的LA阳性血浆。将正常血浆和受检血浆以1∶1混合，以37℃加热2分钟，制备测定试样3。
(测定试样4)
将向Coag Control N中添加Novo-Heparin注射剂(Novo Nordisk A/S公司制)至0.5U/mL而制得的试样在37℃加热2分钟，制备测定试样4。
(测定试样5)
正常血浆使用的是Coag Control N。受检血浆使用的是在Coag ControlN中添加Novo-Heparin注射剂(Novo Nordisk A/S公司制)至0.5U/mL而制得的试样。以1∶1混合正常血浆和受检血浆，在37℃加热2分钟，制备测定试样5。
(测定试样6)
将在George King公司生产的LA阳性血浆中添加Novo-Heparin注射剂(Novo Nordisk A/S公司制)至0.5U/mL而制得的试样在37℃加热2分钟，制备测定试样6。
(测定试样7)
正常血浆使用的是Coag Control N。受检血浆使用的是在George King公司生产的LA阳性血浆中添加Novo-Heparin注射剂至0.5U/mL而制得的试样。以1∶1混合正常血浆和受检血浆，在37℃加热2分钟，制备测定试样7。
[APTT测定]
在反应杯中注入50μL测定试样1。再将50μL含Thrombocheck APTT-SLA的磷脂和活化剂的试剂加入反应杯，以37℃加热3分钟。然后，添加50μL含凝聚胺的钙溶液-即上述试剂5，用全自动凝血测定仪CS-2000i(希森美康公司制)测定试样凝固所需时间，获得测定值1。
除用测定试样2、测定试样3、测定试样4、测定试样5、测定试样6或测定试样7取代测定试样1外，其他均采取与测定试样1的APTT测定同样的操作，测定测定试样2-7的凝固时间，分别获取测定值2-7。
[用罗斯纳指数值分析交叉混合试验]
根据用测定试样1-7的凝固时间测定值(APTT)算出的罗斯纳指数值分析交叉混合试验的结果见图1。在此，罗斯纳指数值用上述式(1)算出。式(1)中作为正常血浆的APTT使用的是测定值1。具体算式见式(2)。
罗斯纳指数值＝((混合血浆测定值)-(测定值1))/(受检血浆测定值)×100式(2)
图1中的柱状图1和柱状图2表示使用不含肝素的血浆时的罗斯纳指数值。在此，柱状图1表示在式(2)中代入测定值1作为(受检血浆测定值)和(混合血浆测定值)时的罗斯纳指数值。柱状图2表示代入测定值2作为 (受检血浆测定值)，代入测定值3作为(混合血浆测定值)时的罗斯纳指数值。
图1中的柱状图3和柱状图4表示使用含肝素的血浆时的罗斯纳指数值。在此，柱状图3表示在式(2)中代入测定值4作为(受检血浆测定值)，代入测定值5作为(混合血浆测定值)时的罗斯纳指数值。柱状图4表示代入测定值6作为(受检血浆测定值)，代入测定值7作为(混合血浆测定值)时的罗斯纳指数值。
〈实验例3〉
用不含凝聚胺的25mM钙溶液(278mg氯化钙、100mL纯水)取代实验例2的含凝聚胺的钙溶液-即试剂5，除此之外均以与实验例2相同的操作进行APTT测定和基于罗斯纳指数值的交叉混合试验分析。交叉混合试验分析结果见图2。在图2中的柱状图1-4也与上述图1的柱状图1-4相同，柱状图1和柱状图2表示使用不含肝素的血浆时的罗斯纳指数值，柱状图3和柱状图4表示使用含肝素的血浆时的罗斯纳指数值。
从图1和图2的柱状图1和2中可以看出，使用含有凝聚胺的钙溶液进行的APTT测定也能获得与使用不含凝聚胺的钙溶液进行的APTT测定同样的罗斯纳指数值。由此说明，在钙溶液中添加凝聚胺不会对APTT测定产生影响。
从图2的柱状图3和4中得知，使用不含凝聚胺的钙溶液，对含外源性肝素的血浆进行APTT测定时，正常血浆与LA阳性血浆的罗斯纳指数值之差消失，判断LA呈阳性还是阴性很困难。另一方面，从图1的柱状图3和4中可以知道，当使用含凝聚胺的钙溶液时，外源性肝素的影响减少，即使是含外源性肝素的血浆也可以判断出LA呈阳性还是阴性。
从上述结果得知，使用含凝聚胺的钙溶液不会对APTT测定本身产生影响。通过使用含凝聚胺的钙溶液，即使是含有外源性肝素的血浆也能正确进行APTT测定。

Claims (20)

1.一种活化部分凝血酶时间测定试剂，包括肝素中和剂。
2.根据权利要求1所述的活化部分凝血酶时间测定试剂，包括：
含有磷脂及活化剂的第一试剂；及
含有肝素中和剂和钙盐的第二试剂。
3.根据权利要求1所述的活化部分凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述肝素中和剂是凝聚胺。
4.根据权利要求2所述的活化部分凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述钙盐是氯化钙。
5.根据权利要求2所述的活化部分凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述活化剂是鞣花酸、胶体硅和无水硅酸中的至少其中之一。
6.根据权利要求2-5中任一项所述的活化部分凝血酶时间测定试剂，其特征在于，所述磷脂是磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油中的至少其中之一。
7.一种用于将受检血浆与含磷脂和活化剂的试剂混合后测定活化部分凝血酶时间的试剂，包括：
肝素中和剂；及
钙盐。
8.根据权利要求7所述的试剂，其特征在于，所述肝素中和剂是凝聚胺。
9.根据权利要求7或8所述的试剂，其特征在于，所述钙盐是氯化钙。
10.一种活化部分凝血酶时间测定方法，包括：
第一混合步骤，将受检血浆与含有磷脂和活化剂的第一试剂混合；
第二混合步骤，将所述第一混合步骤获得的试样与含有肝素中和剂及钙盐的第二试剂混合；及
测定步骤，测定所述第二混合步骤所获得试样的凝固时间。
11.根据权利要求10所述的活化部分凝血酶时间测定方法，其特征在于，所述肝素中和剂是凝聚胺。
12.根据权利要求10所述的活化部分凝血酶时间测定方法，其特征在于，所述钙盐是氯化钙。
13.根据权利要求10所述的活化部分凝血酶时间测定方法，其特征在于，所述活化剂是鞣花酸、胶体硅和无水硅酸中的至少其中之一。
14.根据权利要求10-13中任一项所述的活化部分凝血酶时间测定方法，其特征在于，所述磷脂是磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱和磷脂酰甘油中的至少其中之一。
15.一种判断受检血浆中有无抗凝血物质的方法，包括：
制样步骤，将疑有所述抗凝血物质的受检血浆和正常血浆以至少三种不同比例混合，制备测定试样；
第一混合步骤，将所述制样步骤获得的各种测定试样与含磷脂和活化剂的第一试剂混合；
第二混合步骤，将所述第一混合步骤获得的各种试样与含肝素中和剂和钙盐的第二试剂混合；
测定步骤，测定所述第二混合步骤获得的各种试样的凝固时间；及
判断步骤，根据所述测定步骤获得的各试样的所述凝固时间，判断所述受检血浆中是否含有所述抗凝血物质。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述判断步骤是根据所述测定步骤获得的各试样的所述凝固时间，获取罗斯纳指数值，根据获取的罗斯纳指数值，判断所述受检血浆中有无所述抗凝血物质。
17.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述抗凝血物质是狼疮抗凝物、后天性血友病、凝固因子抑制物或C1失活因子。
18.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述肝素中和剂是凝聚胺。
19.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，所述钙盐是氯化钙。
20.根据权利要求15-19中任一项所述的方法，其特征在于，所述活化剂是鞣花酸、胶体硅和无水硅酸中的至少其中之一。
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