JP4262550B2 - ループスアンチコアグラント検出試薬キット - Google Patents
ループスアンチコアグラント検出試薬キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP4262550B2 JP4262550B2 JP2003280238A JP2003280238A JP4262550B2 JP 4262550 B2 JP4262550 B2 JP 4262550B2 JP 2003280238 A JP2003280238 A JP 2003280238A JP 2003280238 A JP2003280238 A JP 2003280238A JP 4262550 B2 JP4262550 B2 JP 4262550B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- reagent
- synthetic
- partial
- concentration
- phosphatidylserine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Description
また、LAは不均一な抗体であり、陰性荷電リン脂質とβ2−グリコプロテインI(β2−GPI)またはプロトロンビンとの複合体に対する抗体であることが、近年明らかになった。LAの抗凝固作用は、LAがこの複合体と結合することによりプロトロンビンがトロンビンに変化することを阻害するために起こると考えられる。
また、凝固試薬中のリン脂質が少ないほど、LAの検出感度が高まるので、試薬を希釈したり、正確性を期するために異なった方法を2法以上組合わせることが行われている。
例えば、リン脂質の濃度が異なる2つの試薬を組合わせた活性化部分トロンボプラスチン時間測定(以下、APTTと略称する)試薬を使用し、各試薬の凝固時間から、ロスナー インデックス(Rosner Index)やループス比(Lupus Ratio)(LR)を算出し、LA陽性率を判定する手法が知られている。
さらに、既存の研究報告によれば(非特許文献1)、ウサギ脳由来リン脂質などによるリン脂質濃度の差を利用して、算術的にLAの検出が行なわれている。
またさらに、正常血漿と患者血漿を1:1の割合で混合した試料を用いて、リン脂質濃度が異なる2種類の試薬を組合わせたAPTT試薬または希釈ラッセル蛇毒測定(dRVVT)試薬を用いたときの凝固時間を測定し、患者血漿の凝固時間が正常血漿により補正される度合いを指標にしてLAを検出する方法も利用されている。
従って、LA疾患を正確に判別するためには、LA以外の凝固活性阻止因子や凝固因子欠損症による凝固時間の延長と、LAによる凝固時間の延長とを区別する必要がある。
本発明の課題は、LAの検出感度を高め、凝固因子欠損症やヘパリン等の血液凝固阻害剤を含有する検体とを区別して、LAを特異的に高精度で検出できる試薬キットを提供することにある。
つまり本発明は以下からなる。
1.合成ホスファチジルセリンを含む合成リン脂質を含有する第1の凝固時間測定試薬と合成ホスファチジルセリンを含む合成リン脂質を含有する第2の凝固時間測定試薬を備え、第1凝固時間測定試薬に含まれる合成ホスファチジルセリンの全合成リン脂質に対する割合が、第2凝固時間測定試薬に含まれる合成ホスファチジルセリンの全合成リン脂質に対する割合と異なることを特徴とするループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
2.前記第1凝固時間測定試薬に含有される合成ホスファチジルセリンの濃度が、前記第2凝固時間測定試薬に含有される合成ホスファチジルセリンの濃度比の10〜20倍である前項1に記載の試薬キット。
3.前記第1凝固時間測定試薬及び前記第2凝固時間測定試薬が活性化剤及びカルシウムイオンを更に含んでなる前項1又は2に記載の試薬キット。
4.第1凝固時間測定試薬が第1部分試薬及び第2部分試薬からなり、
第2凝固時間測定試薬が第3部分試薬及び第4部分試薬からなり、
第1部分試薬が合成ホスファチジルセリンを含む合成リン脂質を含有し、第1部分試薬中の合成ホスファチジルセリン濃度が3〜1000μg/mlであり、第3部分試薬が合成ホスファチジルセリンを含む合成リン脂質を含有し、第3部分試薬中の合成ホスファチジルセリン濃度が0.2〜200μg/mlであり、第1部分試薬の合成ホスファチジルセリン濃度が第3部分試薬の合成ホスファチジルセリン濃度より高濃度であり、第2部分試薬及び第4部分試薬がカルシウムイオンを含有する前項1に記載の検出用試薬キット。
5.前記第1部分試薬の合成ホスファチジルセリンの濃度が30〜100μg/mlである前項4に記載の試薬キット。
6.前記第3部分試薬の合成ホスファチジルセリンの濃度が2〜20μg/mlである前項4又は5に記載の試薬キット。
7.前記第1部分試薬及び前記第3部分試薬が合成ホスファチジルエタノールアミン及び合成ホスファチジルコリンを含有する前項4〜6のいずれか1項に記載の試薬キット。
8.前記合成ホスファチジルエタノールアミンの濃度が0.1〜300μg/mlであり、合成ホスファチジルコリンの濃度が2〜1000μg/mlである前項7記載の試薬キット。
9.合成ホスファチジルエタノールアミンの濃度が1〜30μg/mlであり、ホスファチジルコリンの濃度20〜100μg/mlである前項7又は8記載の試薬キット。
10.前記第1部分試薬及び前記第3部分試薬が活性化剤を含有する前項4〜9のいずれか1項に記載の試薬キット。
11.前記活性化剤がエラグ酸、カオリン、セライト及びエラジン酸から選択される1以上の活性化剤である前項10に記載の試薬キット。
12.前記第1凝固時間測定試薬及び前記第2凝固時間測定試薬が蛇毒及びカルシウムイオンを更に含んでなる前項1に記載の試薬キット。
13.前記蛇毒がラッセル蛇毒、テキスタリン蛇毒及びエカリン蛇毒から選択される1以上の蛇毒である前項12に記載の試薬キット。
14.前記第1凝固時間測定試薬及び前記第2凝固時間測定試薬が組織因子及びカルシウムイオンを更に含んでなる前項1に記載の試薬キット。
15.第1凝固時間測定試薬及び第2凝固時間測定試薬が合成ホスファチジルエタノールアミン、合成ホスファチジルコリンを含有する前項1に記載の検出用試薬キット。
16.前項1〜15のいずれか1項に記載の試薬キットを使用するループスアンチコアグラントの検出方法。
本発明のLA検出用試薬キットは、ホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第1の凝固時間測定試薬と、ホスファチジルセリンを含むリン脂質を含有する第2の凝固時間測定試薬とを含み、第1凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する含有割合が、第2凝固時間測定試薬に含まれるホスファチジルセリンの全リン脂質に対する含有割合が異なっているものである。
これらの他の成分は、凝固時間測定試薬の種類に応じて適宜選択される。例えば、第1凝固時間測定試薬及び第2凝固時間測定試薬がカルシウム及び活性化剤を含む場合には活性化部分トロンボプラスチン時間測定の測定原理に基づいて凝固時間を測定する。第1凝固時間測定試薬及び第2凝固時間測定試薬がカルシウム及び蛇毒を含む場合には、ラッセル蛇毒測定時間の原理に基づいて凝固時間を測定する。また、第1凝固時間測定試薬及び第2凝固時間測定試薬がカルシウム及び組織因子を含む場合には、プロトロンビン時間測定の原理に基づいて凝固時間を測定する。
まず検体試料を2つに分け、一方には高濃度のPSを含む第1凝固時間測定試薬を添加し、もう一方の検体試料には、低濃度のPSを含む第2凝固時間測定試薬を添加する。凝固時間測定試薬がそれぞれ第1部分試薬と第2部分試薬とに分かれている場合には、第1部分試薬と第2部分試薬とを混合してから、検体に添加してもよいし、まず第1部分試薬(又は第2部分試薬)を検体に添加した後、第2部分試薬(又は第1部分試薬)を添加してもよい。第1部分試薬又は第2部分試薬を別々に添加する場合、第1部分試薬(又は第2部分試薬)添加後、第2部分試薬(又は第1部分試薬)添加前に、必要に応じて検体と部分試薬の混合物を加熱してもよい。
検体に各試薬を添加した後、試料の凝固時間を測定する。凝固時間の測定は、当業者に公知の方法で行えばよく、公知の自動測定装置を用いて測定してもよい。
正常血漿の場合、PS含有率は凝固時間に影響を及ぼさないので、第1凝固時間試薬と第2凝固時間試薬の比に該当するLR値は1程度である。また、血液凝固因子欠損患者、ワーファリン投与患者、またはヘパリン投与患者由来の場合であっても、正常血漿と比べて凝固時間は延長されるものの、PS濃度差による凝固時間の差はほとんど認められないため、LR値は1程度となる。これに対して、LA陽性の場合には、第1凝固時間測定試薬、第2凝固時間測定試薬の各濃度、組合わせにもよるが、第2凝固時間測定試薬の方が第1凝固時間測定試薬よりも凝固時間が延びるために、LR値を比較することによりLA陽性患者由来の検体を自動的に検出することができる。
ヘペス、エラグ酸、トリス、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)及びホスファチジルコリン(PC)を混合し、第1部分試薬及び第3部分試薬を調製した。第1部分試薬の各成分の濃度はヘペスが50mM、エラグ酸が0.1mM、トリスが25mM、PSが50μg/ml、PEが50μg/ml、PCが70μg/mlであり、各成分添加後のpHは7.35である。また、第3部分試薬の各成分の濃度はヘペスが50mM、エラグ酸が0.1mM、トリスが25mM、PSが10μg/ml、PEが50μg/ml、PCが70μg/mlであり、各成分添加後のpHは7.35である。
また、塩化カルシウム濃度が25mMになるように精製水で調製したものを、第2部分試薬、第4部分試薬とした。
正常血漿としてコアグトロールNを用いた。1種類のヘパリン投与患者血漿、1種類の第VIII因子欠乏患者血漿、4種類のワーファリン投与患者血漿、5種類のLA陽性患者血漿を入手した。各患者血漿は、正常血漿と1:1で混合したものを測定試料とした。
正常血漿及び上記で調製した測定試料をそれぞれ50μlづつ2セット準備し、一方のセットの各試料に、第1部分試薬(又は第3部分試薬)50μlを添加し、37℃に3分間加温した後、各試料に第2部分試薬(又は第4部分試薬)を50μlづつ添加した。
全自動血液凝固分析装置コアグレックス800(島津製作所株式会社)を用いて、凝固時間を測定した。測定は2回行い、平均値を求めた。
〔式1〕
Lupus Ratio(LR)=(b/a)/(d/c)=bc/ad
ここで、式1中のa、b、c、およびdは、表1に示す組み合わせで得られた測定値を表す。
従って、実施例のPSの濃度のみを変えた第1凝固時間測定試薬と第2凝固時間測定試薬を組合わせた試薬キットによれば、LA陽性患者を、他の抗リン脂質依存性疾患から高感度で、容易に判別することができる。
Claims (16)
- 合成ホスファチジルセリンを含む合成リン脂質を含有する第1の凝固時間測定試薬と合成ホスファチジルセリンを含む合成リン脂質を含有する第2の凝固時間測定試薬を備え、第1凝固時間測定試薬に含まれる合成ホスファチジルセリンの全合成リン脂質に対する割合が、第2凝固時間測定試薬に含まれる合成ホスファチジルセリンの全合成リン脂質に対する割合と異なることを特徴とするループスアンチコアグラント検出用試薬キット。
- 前記第1凝固時間測定試薬に含有される合成ホスファチジルセリンの濃度が、前記第2凝固時間測定試薬に含有される合成ホスファチジルセリンの濃度比の10〜20倍である請求項1に記載の試薬キット。
- 前記第1凝固時間測定試薬及び前記第2凝固時間測定試薬が活性化剤及びカルシウムイオンを更に含んでなる請求項1又は2に記載の試薬キット。
- 第1凝固時間測定試薬が第1部分試薬及び第2部分試薬からなり、
第2凝固時間測定試薬が第3部分試薬及び第4部分試薬からなり、
第1部分試薬が合成ホスファチジルセリンを含む合成リン脂質を含有し、第1部分試薬中の合成ホスファチジルセリン濃度が3〜1000μg/mlであり、第3部分試薬が合成ホスファチジルセリンを含む合成リン脂質を含有し、第3部分試薬中の合成ホスファチジルセリン濃度が0.2〜200μg/mlであり、第1部分試薬の合成ホスファチジルセリン濃度が第3部分試薬の合成ホスファチジルセリン濃度より高濃度であり、第2部分試薬及び第4部分試薬がカルシウムイオンを含有する請求項1に記載の検出用試薬キット。 - 前記第1部分試薬の合成ホスファチジルセリンの濃度が30〜100μg/mlである請求項4に記載の試薬キット。
- 前記第3部分試薬の合成ホスファチジルセリンの濃度が2〜20μg/mlである請求項4又は5に記載の試薬キット。
- 前記第1部分試薬及び前記第3部分試薬が合成ホスファチジルエタノールアミン及び合成ホスファチジルコリンを含有する請求項4〜6のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 前記合成ホスファチジルエタノールアミンの濃度が0.1〜300μg/mlであり、合成ホスファチジルコリンの濃度が2〜1000μg/mlである請求項7記載の試薬キット。
- 合成ホスファチジルエタノールアミンの濃度が1〜30μg/mlであり、ホスファチジルコリンの濃度20〜100μg/mlである請求項7又は8記載の試薬キット。
- 前記第1部分試薬及び前記第3部分試薬が活性化剤を含有する請求項4〜9のいずれか1項に記載の試薬キット。
- 前記活性化剤がエラグ酸、カオリン、セライト及びエラジン酸から選択される1以上の活性化剤である請求項10に記載の試薬キット。
- 前記第1凝固時間測定試薬及び前記第2凝固時間測定試薬が蛇毒及びカルシウムイオンを更に含んでなる請求項1に記載の試薬キット。
- 前記蛇毒がラッセル蛇毒、テキスタリン蛇毒及びエカリン蛇毒から選択される1以上の蛇毒である請求項12に記載の試薬キット。
- 前記第1凝固時間測定試薬及び前記第2凝固時間測定試薬が組織因子及びカルシウムイオンを更に含んでなる請求項1に記載の試薬キット。
- 第1凝固時間測定試薬及び第2凝固時間測定試薬が合成ホスファチジルエタノールアミン、合成ホスファチジルコリンを含有する請求項1に記載の検出用試薬キット。
- 請求項1〜15のいずれか1項に記載の試薬キットを使用するループスアンチコアグラントの検出方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2003280238A JP4262550B2 (ja) | 2002-07-25 | 2003-07-25 | ループスアンチコアグラント検出試薬キット |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2002216782 | 2002-07-25 | ||
JP2003280238A JP4262550B2 (ja) | 2002-07-25 | 2003-07-25 | ループスアンチコアグラント検出試薬キット |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2004069697A JP2004069697A (ja) | 2004-03-04 |
JP2004069697A5 JP2004069697A5 (ja) | 2006-09-07 |
JP4262550B2 true JP4262550B2 (ja) | 2009-05-13 |
Family
ID=32032713
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2003280238A Expired - Fee Related JP4262550B2 (ja) | 2002-07-25 | 2003-07-25 | ループスアンチコアグラント検出試薬キット |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP4262550B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012047586A (ja) * | 2010-08-26 | 2012-03-08 | Sysmex Corp | ループスアンチコアグラント検出用試薬キット及びループスアンチコアグラントの存否を判定する方法 |
Families Citing this family (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2290370B8 (en) * | 2008-06-18 | 2015-05-27 | Sekisui Medical Co., Ltd. | Method for determining cause of the prolongation of blood coagulation time |
US10935560B2 (en) * | 2016-04-25 | 2021-03-02 | Instrumentation Laboratory Company | Method and kit for identifying lupus anticoagulant (LA) associated with antiphospholipid syndrome |
JP7153519B2 (ja) * | 2018-09-28 | 2022-10-14 | シスメックス株式会社 | 凝固時間測定用試薬及びその製造方法、試薬キット及び凝固時間の測定方法 |
CN111707837A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-09-25 | 上海太阳生物技术有限公司 | 狼疮抗凝物确认试剂盒(凝固法) |
-
2003
- 2003-07-25 JP JP2003280238A patent/JP4262550B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012047586A (ja) * | 2010-08-26 | 2012-03-08 | Sysmex Corp | ループスアンチコアグラント検出用試薬キット及びループスアンチコアグラントの存否を判定する方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2004069697A (ja) | 2004-03-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP1562047B1 (en) | Reagent kit for detecting lupus anticoagulant | |
US20090098585A1 (en) | Reagent kit for detecting lupus anticoagulant | |
CN102384979B (zh) | 狼疮抗凝物的检测用试剂盒及其存在与否的判断方法 | |
CN104076156A (zh) | 活化部分凝血活酶时间测定法和活化部分凝血活酶时间测定用试剂盒 | |
Lawrie et al. | The sensitivity and specificity of commercial reagents for the detection of lupus anticoagulant show marked differences in performance between photo-optical and mechanical coagulometers | |
US8759108B2 (en) | Reagent kit for detecting lupus anticoagulant and method of determining presence or absence of lupus anticoagulant | |
JP6499488B2 (ja) | 凝固時間の測定方法、ループスアンチコアグラントの存否の判定方法及びループスアンチコアグラント検出用試薬キット | |
JPWO2012173260A1 (ja) | ループスアンチコアグラント検出用血液凝固時間の測定方法 | |
JP4262550B2 (ja) | ループスアンチコアグラント検出試薬キット | |
CA2839117C (en) | Method for detecting lupus anticoagulants | |
Chantarangkul et al. | Evaluation of a fully automated centrifugal analyzer for performance of hemostasis tests. | |
CA2883260C (en) | Composition for use as an abnormal coagulation control plasma in in vitro assays | |
JP4417269B2 (ja) | ループスアンチコアグラント検出試薬キット | |
JPH11118807A (ja) | 血液凝固試験におけるアネキシンのループス血液凝固阻止因子対照または標準としての使用 | |
Massignon et al. | Prothrombin time sensitivity and specificity to mild clotting factor deficiencies of the extrinsic pathway: evaluation of eight commercial thromboplastins | |
Brien et al. | Discrepant results in INR testing | |
JP4467407B2 (ja) | ループスアンチコアグラント検出試薬キット | |
JP2004069697A5 (ja) | ||
Dempfle et al. | The influence of hirudin on plasma fibrinogen assays | |
CN103649758B (zh) | 狼疮抗凝物的检测方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060720 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060720 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20080606 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20080625 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20080821 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20090114 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20090209 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120220 Year of fee payment: 3 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4262550 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120220 Year of fee payment: 3 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150220 Year of fee payment: 6 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |