JP6499488B2 - 凝固時間の測定方法、ループスアンチコアグラントの存否の判定方法及びループスアンチコアグラント検出用試薬キット - Google Patents
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Description
本発明は、凝固時間の測定方法に関する。また、本発明は、ループスアンチコアグラントの存否の判定方法及びループスアンチコアグラント検出用試薬キットに関する。
抗リン脂質抗体症候群は、血中に抗リン脂質抗体を有し、動静脈血栓症や習慣性流死産などの臨床症状を呈する疾患群の総称である。抗リン脂質抗体(aPL)とは、リン脂質、又はリン脂質とタンパク質との複合体に結合する自己抗体の総称である。aPLには、様々な抗体があり、例えば、抗カルジオリピン抗体、抗β2グリコプロテインI抗体、ホスファチジルセリン依存性抗プロトロンビン抗体、ループスアンチコアグラント(ＬＡ)が挙げられる。
ＬＡは「個々の凝固因子活性を阻害することなく、リン脂質依存性の血液凝固反応を阻害する免疫グロブリン」として定義され、リン脂質依存性の凝固反応においてリン脂質を阻害する自己抗体と考えられている。一方、ＬＡは、リン脂質依存性の凝固反応に必要なリン脂質を阻害するにもかかわらず、ＬＡを保有する患者は血栓症状を示す。
現在、ＬＡのスクリーニング検査では、リン脂質を低濃度で含む試薬を用いることで、ＬＡによるリン脂質への阻害反応を表れやすくして、凝固時間の延長を見出すことによる方法が利用されている。そのような検査では、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)測定用試薬を希釈して用いるか、又は、PTT-LA(登録商標)(ロシュ・ダイアグノスティックス社)などのようにリン脂質濃度が予め低くされている試薬が用いられる。
また、特許文献１には、リン脂質濃度の異なる２種の試薬を含む、ＬＡ検出に特化した試薬キットが記載されている。この試薬キットは、ＬＡによる凝固時間の延長を抑制することにより、ＬＡ陽性検体群とそれ以外の検体群との明確な切り分けを可能にする。ただし、この試薬キットによるＬＡ検出では、２種の試薬のそれぞれについて凝固時間を測定する必要がある。
スクリーニング検査に用いられる従来のAPTT測定用試薬は、ＬＡに対する感度が十分に満足できるものではなかった。それゆえ、従来の試薬では、正常血漿とのミキシングテストでも、ＬＡ陽性検体群とそれ以外の検体群とを明確に切り分けることが困難であった。よって、ＬＡに対する感度が改善され、ＬＡ陽性検体群とそれ以外の検体群とを精度よく鑑別することを可能にする手段が望まれる。
本発明の第１の態様によれば、凝固時間の測定方法が提供される。この方法は、ループスアンチコアグラントを含む疑いのある血液検体と、活性化剤と、リン脂質含有複合体の形成を促進するための二価の金属イオンを形成する化合物とを混合して、測定試料を調製する工程と、この測定試料に、凝固開始剤としてのカルシウム塩の水溶液を添加して、凝固時間を測定する工程とを含む。
本発明の第２の態様によれば、ループスアンチコアグラント(ＬＡ)の存否の判定方法が提供される。この方法は、血液検体と、活性化剤と、リン脂質含有複合体の形成を促進するための二価の金属イオンを形成する化合物とを混合して、測定試料を調製する工程と、この測定試料に、凝固開始剤としてのカルシウム塩の水溶液を添加して、凝固時間を測定する工程と、この凝固時間に基づいて、上記血液検体がＬＡを含むか否かを判定する工程とを含む。
本発明の第３の態様によれば、リン脂質含有複合体の形成を促進するための二価の金属イオンを形成する化合物を含む第１試薬と、活性化剤を含む第２試薬と、カルシウム塩の水溶液からなる凝固開始試薬とを含む、ループスアンチコアグラント検出用試薬キットが提供される。
本発明の第４の態様によれば、リン脂質含有複合体の形成を促進するための二価の金属イオンを形成する化合物及び活性化剤を含む第１試薬と、カルシウム塩の水溶液からなる凝固開始試薬とを含む、ループスアンチコアグラント検出用試薬キットが提供される。
本発明によれば、より感度の高いＬＡのスクリーニング検査を可能にする。また、本発明によれば、ミキシングテストにおいても、ＬＡ陽性検体と、それ以外の検体とをより明確に切り分けることを可能にする。
[１．凝固時間の測定方法]
本実施形態に係る凝固時間の測定方法(以下、単に「測定方法」ともいう)では、ＬＡを含む疑いのある血液検体と、活性化剤と、二価の金属イオンを形成する化合物とを混合して、測定試料を調製する。
本実施形態に係る凝固時間の測定方法(以下、単に「測定方法」ともいう)では、ＬＡを含む疑いのある血液検体と、活性化剤と、二価の金属イオンを形成する化合物とを混合して、測定試料を調製する。
本実施形態において、ＬＡを含む疑いのある血液検体は、凝固時間の延長原因を有する疑いのある血液検体であれば、特に限定されない。そのような血液検体としては、例えば、通常の凝固検査により凝固時間の延長が認められた検体、凝固時間の延長原因を有する疑いのある者を含む複数の被験者から得た検体群などが挙げられる。なお、凝固時間の延長原因としては、ＬＡ以外に、凝固因子インヒビター、凝固因子欠損、ヘパリンなどの血液凝固に作用する薬剤などが挙げられる。
血液検体の種類としては、血漿が好ましく、血小板除去血漿が特に好ましい。血小板は、遠心分離、フィルター分離などの公知の手法により除去できる。本実施形態では、被験者から得た血液から調製した血漿を用いることができる(以下、被験者に由来する血漿を「被検血漿」とも呼ぶ)。また、対照検体として、市販のＬＡ含有血漿、凝固因子インヒビター含有血漿、凝固因子欠損血漿、ヘパリン添加血漿などをさらに測定してもよい。
本実施形態では、正常血液検体をさらに測定してもよい。正常血液検体としては、健常者から得た血液から調製した血漿、または市販の正常血漿が挙げられる。市販の正常血漿としては、例えば、CRYOcheck Pooled Normal Plasma(Precision BioLogic Inc)などが挙げられる。
本実施形態の方法をクロスミキシングテストに利用する場合は、被検血漿と正常血漿とを少なくとも１つの混合比で混合した検体(以下、「混合血漿」ともいう)が用いられる。被検血漿と正常血漿との混合比は、被検血漿の量又は後述の定量化指標の種類などに応じて適宜決定できる。混合血漿における被検血漿の比率として、例えば、５、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90及び95％(v/v)から少なくとも１つ選択する。これらの中でも、被検血漿の比率が50％(v/v)の混合検体を調製することが好ましい。
二価の金属イオンを形成する化合物は、適当な溶媒中で二価の金属イオンを生じ、かつ該化合物から生じるアニオンが血液凝固反応を阻害しないかぎり、特に限定されない。そのような化合物としては、例えば、二価の金属と、無機酸又は有機酸との塩が挙げられる。それらの中でも、二価の金属と無機酸との塩が好ましく、例えば、塩酸、硫酸、硝酸などの酸と二価の金属との塩が挙げられる。より好ましい二価の金属塩としては、カルシウム、マグネシウム、亜鉛及び銅から選択される少なくとも１つの金属の塩が挙げられる。二価の金属イオンを形成する化合物は、無水物であってもよいし、水和物であってもよい。本実施形態では、二価の金属イオンを形成する化合物は、適切な溶媒で溶解した溶液、特に水溶液の形態で用いることが好ましい。
当該技術においては、ＬＡは、リン脂質とカルシウムイオンとの複合体、又はリン脂質とカルシウムイオンとタンパク質との複合体に結合することにより、凝固反応を阻害することが知られている。そこで、本実施形態に係る測定方法では、二価の金属イオンを形成する化合物の添加により、凝固が生じない程度において、リン脂質と二価の金属イオンの複合体、又はリン脂質と二価の金属イオンとタンパク質との複合体(以下、これらの複合体を「リン脂質含有複合体」とも呼ぶ)を予め形成させることを意図している。すなわち、本実施形態に係る測定方法では、二価の金属イオンを形成する化合物は、リン脂質含有複合体の形成を促進させるために血液検体に添加される。このように、ＬＡが結合する複合体を予め形成させることにより、ＬＡによる凝固の阻害反応が表れやすくなることが期待される。よって、本実施形態に係る測定方法では、血液検体にＬＡが含まれている場合、通常の凝固時間の測定方法に比べて、ＬＡへの感度が向上すると考えられる。なお、複合体中のリン脂質は、血液検体に含まれる内因性リン脂質であってもよいし、後述の添加されたリン脂質であってもよいし、それらの両方であってもよい。
測定試料の調製工程では、二価の金属イオンを形成する化合物の添加により凝固を生じさせること(フィブリンを生成させること)を意図していない。よって、測定試料における二価の金属イオンを形成する化合物の終濃度は、後述の凝固時間の測定工程で添加されるカルシウム塩の終濃度よりも低いことが望ましい。本実施形態では、二価の金属イオンを形成する化合物の終濃度としては、例えば0.01 mM以上２mM未満、好ましくは0.2 mM以上1.5 mM以下である。
活性化剤は、インビトロでの血液凝固を促進することが知られている公知の物質であれば、特に限定されない。そのような活性化剤は、接触因子活性化剤が好ましく、具体的には、陰性荷電を有する物質が挙げられる。そのような物質としては、例えば、エラグ酸、カオリン、セライト及びシリカなどが挙げられる。なお、エラグ酸として、金属イオンとキレートを形成した状態のエラグ酸を添加してもよい。
測定試料における活性化剤の終濃度は、特に限定されず、従来の凝固時間の測定方法と同程度であればよい。当該技術では、測定試料における活性化剤の終濃度は、例えば、エラグ酸であれば、通常3.5μM以上150μM以下、好ましくは10μM以上50μM以下であることが知られている。また、シリカであれば、通常0.04 mg/ml以上0.4 mg/ml以下、好ましくは0.07 mg/ml以上0.2 mg/ml以下であることが知られている。
本実施形態では、血液凝固を促進するために、測定試料の調製においてリン脂質をさらに添加してもよい。リン脂質としては、ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥ)、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジルセリン(ＰＳ)が挙げられる。本実施形態では、ＰＥ、ＰＣ及びＰＳから選択される１種、好ましくは２種、より好ましくは全種のリン脂質を添加できる。リン脂質は、天然由来リン脂質であってもよく、合成リン脂質であってもよい。それらの中でも、ＬＡの検出感度を向上させる観点から、合成リン脂質又は純度99％以上に精製された天然由来リン脂質が好ましい。なお、ＰＥ、ＰＣ及びＰＳの脂肪酸側鎖は特に限定されないが、例えば、パルミチン酸、オレイン酸、ステアリン酸などが挙げられる。それらの中でもオレイン酸が好ましい。
測定試料におけるリン脂質の終濃度は特に限定されないが、例えば１μg/ml以上150μg/ml以下、好ましくは５μg/ml以上50μg/ml以下である。リン脂質としてＰＥ、ＰＣ及びＰＳを含むとき、測定試料におけるＰＥの終濃度は、例えば１μg/ml以上50μg/ml以下、好ましくは５μg/ml以上25μg/ml以下であり、ＰＣの終濃度は例えば１μg/ml以上100μg/ml以下、好ましくは５μg/ml以上80μg/ml以下であり、ＰＳの終濃度は例えば0.1μg/ml以上50μg/ml以下、好ましくは１μg/ml以上10μg/ml以下である。
本実施形態において、凝固時間は、当該技術において公知の測定原理に基づいて測定される凝固時間であればよい。そのような凝固時間としては、例えば、活性化部分トロンボプラスチン時間(APTT)、希釈活性化部分トロンボプラスチン時間(dAPTT)、カオリン凝固時間(KCT)、希釈ラッセル蛇毒凝固時間(dRVVT)、トロンビン時間(TT)、及び希釈トロンビン時間(dTT)が挙げられる。これらの中でも、APTT及びdAPTTが好ましい。
本実施形態では、活性化剤としてカオリンを用い、KCT測定の原理に基づいて凝固時間を測定する場合、血液検体に含まれる内因性リン脂質が凝固反応に利用される。よって、この場合は、測定試料の調製において、上記のリン脂質を添加する必要はない。
本実施形態では、dRVVT測定の原理に基づいて凝固時間を測定する場合、測定試料の調製において、蛇毒をさらに添加してもよい。蛇毒としては、ラッセル蛇毒、テキスタリン蛇毒及びエカリン蛇毒などが挙げられる。
以下、活性化剤、リン脂質、及び蛇毒を総称して、「凝固に必要な成分」とも呼ぶ。本実施形態では、血液検体と、二価の金属イオンを形成する化合物と、凝固に必要な成分とを混合する順序は特に限定されない。例えば、血液検体と二価の金属イオンを形成する化合物とを混合してから、凝固に必要な成分を混合してもよい。また、血液検体と凝固に必要な成分とを混合してから、二価の金属イオンを形成する化合物を混合してもよい。また、二価の金属イオンを形成する化合物と凝固に必要な成分とを混合してから、血液検体を混合してもよい。あるいは、血液検体と、二価の金属イオンを形成する化合物と、凝固に必要な成分とを実質的に同時に混合してもよい。なお、先に血液検体と凝固に必要な成分とを混合する場合は、所定の条件下でインキュベートしてから、二価の金属イオンを形成する化合物を混合することが好ましい。そのような所定の条件は、血液検体中の凝固因子と、凝固に必要な成分との反応を促進させる公知の条件であればよく、例えば35℃以上40℃以下の温度にて、２分以上５分以下の時間でインキュベートする条件が挙げられる。
本実施形態に係る測定方法では、上記のようにして調製した測定試料に、凝固開始剤としてカルシウム塩の水溶液を添加して、凝固時間を測定する。よって、カルシウム塩の水溶液の添加及び混和した時を測定開始点として、凝固時間を測定する。
カルシウム塩は、測定試料中でカルシウムイオンを生じる塩であれば特に限定されず、例えば、塩化カルシウムなどが挙げられる。カルシウム塩の水溶液の添加後の測定試料中のカルシウム塩の終濃度は、凝固を生じさせるのに十分な濃度であればよく、例えば２mM以上20 mM以下、好ましくは４mM以上10 mM以下である。
本実施形態では、血液検体にＬＡが含まれている場合に、測定試料において上記のリン脂質含有複合体とＬＡとの反応を促進させるために、測定試料を所定の条件下でインキュベートしてから、カルシウム塩の水溶液を添加することが好ましい。そのような条件としては、35℃以上40℃以下の温度にて、２分以上５分以下の時間でインキュベートする条件が挙げられる。
本実施形態では、測定試料の調製及び凝固時間の測定は、用手法で行ってもよいし、全自動凝固時間測定装置で行ってもよいが、全自動凝固時間測定装置で行うことが好ましい。全自動凝固時間測定装置としては、例えば、CS-5100(シスメックス社)、CS-2400(シスメックス社)、CS-2000i(シスメックス社)が挙げられる。
本実施形態に係る測定方法では、上述のように、二価の金属イオンを形成する化合物の添加により、上記のリン脂質含有複合体が予め形成されて、ＬＡへの感度が向上していると考えられる。実際、後述の実施例１に示されるように、血液検体にＬＡが含まれている場合、通常の凝固時間測定方法に比べて、凝固時間がより延長する傾向にある。一方で、該化合物による効果は、ＬＡに選択的であるので、ＬＡ以外の凝固異常の延長原因を有する血液検体(例えば、凝固因子欠損検体、ヘパリン含有検体など)の凝固時間には影響が少ないか又は実質的にない。
[２．ＬＡの存否の判定方法]
本実施形態では、上記の測定方法により得られた凝固時間に基づいて、血液検体がＬＡを含むか否かを判定することができる。以下、ＬＡの存否の判定方法について説明する。
本実施形態では、上記の測定方法により得られた凝固時間に基づいて、血液検体がＬＡを含むか否かを判定することができる。以下、ＬＡの存否の判定方法について説明する。
本実施形態に係るＬＡの存否の判定方法では、測定試料を調製する工程及び凝固時間を測定する工程については、上記の測定方法について述べたことと同様である。なお、本実施形態では、血液検体は特に限定されず、被験者に由来する血液検体であればよい。また、対照検体として、上記の各種の凝固時間の延長原因を含む市販の血漿、市販の正常血漿を用いてもよい。
本実施形態では、上述のように、二価の金属イオンを形成する化合物の添加により、血液検体にＬＡが含まれている場合、凝固時間がより延長する傾向にある。一方で、該化合物による効果は、ＬＡに選択的である。よって、本実施形態では、測定された凝固時間が、所定の凝固時間より長い場合、血液検体はＬＡを含むと判定してもよい。反対に、測定された凝固時間が、所定の凝固時間以下である場合、血液検体はＬＡを含まないと判定してもよい。なお、所定の凝固時間は、正常血漿の凝固時間が好ましい。正常血漿の凝固時間は、被検血漿と同様にして実際に測定した凝固時間であってもよいし、用いる凝固時間測定試薬の測定原理において正常値又は基準値として知られている凝固時間であってもよい。
好ましい実施形態では、測定した凝固時間に基づいて定量化指標を取得し、取得した定量化指標の値に基づいて、検体がＬＡを含むか否かを判定する。例えば、定量化指標の値と所定の閾値とを比較して、定量化指標の値が所定の閾値以上である場合、血液検体はＬＡを含むと判定できる。反対に、定量化指標の値が所定の閾値より小さい場合、血液検体はＬＡを含まないと判定できる。
本実施形態において、定量化指標は、被検血漿、正常血漿及び／又はそれらの混合血漿の凝固時間に基づいて、クロスミキシングテストの結果を定量的に評価するための指標であれば、特に限定されない。また、公知の定量化指標を用いてもよい。公知の定量化指標としては、例えば、Index of Circulating Anticoagulant (ICA)、Percent Correction (PC)及びResponse Curve-Score (RC-S)などが挙げられる。それらの中でも、ICAが好ましい。なお、ICAはPengo V.ら、Update of the guidelines for lupus anticoagulant detection. Journal of Thrombosis and Haemostasis 2009; 7: 1737-1740に開示され、PCはChang S-H.ら、"Percent Correction" Formula for Evaluation of Mixing Studies., Am J Clin Pathol 2002;117:62-73に開示され、RC-Sは内藤澄悦ら、交差混合試験の新たな判定方法によるLA検出の評価と有用性．臨床病理、第60巻補冊、第166頁、2012に開示されている。
ICAは、ロスナー・インデックス(Rosner Index)とも呼ばれ、ＬＡ検体の判定に用いられる指標である。ICAは、下記の式により算出される。
ICA ＝ [(Ｄ−Ａ)／Ｇ]×100
(式中、Ａ：正常血漿の凝固時間、Ｄ：被検血漿の比率が50％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｇ：被検血漿の凝固時間)
ICA ＝ [(Ｄ−Ａ)／Ｇ]×100
(式中、Ａ：正常血漿の凝固時間、Ｄ：被検血漿の比率が50％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｇ：被検血漿の凝固時間)
PCは、下記のとおり、混合血漿における被検血漿の比率に応じて算出式が異なる。
PC(9:1) ＝ [(Ｇ−Ｂ)／(Ｇ−Ａ)]×100
PC(8:2) ＝ [(Ｇ−Ｃ)／(Ｇ−Ａ)]×100
PC(5:5) ＝ [(Ｇ−Ｄ)／(Ｇ−Ａ)]×100
PC(2:8) ＝ [(Ｇ−Ｅ)／(Ｇ−Ａ)]×100
PC(1:9) ＝ [(Ｇ−Ｆ)／(Ｇ−Ａ)]×100
(式中、Ａ：正常血漿の凝固時間、Ｂ：被検血漿の比率が10％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｃ：被検血漿の比率が20％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｄ：被検血漿の比率が50％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｅ：被検血漿の比率が80％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｆ：被検血漿の比率が90％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｇ：被検血漿の凝固時間)
PC(9:1) ＝ [(Ｇ−Ｂ)／(Ｇ−Ａ)]×100
PC(8:2) ＝ [(Ｇ−Ｃ)／(Ｇ−Ａ)]×100
PC(5:5) ＝ [(Ｇ−Ｄ)／(Ｇ−Ａ)]×100
PC(2:8) ＝ [(Ｇ−Ｅ)／(Ｇ−Ａ)]×100
PC(1:9) ＝ [(Ｇ−Ｆ)／(Ｇ−Ａ)]×100
(式中、Ａ：正常血漿の凝固時間、Ｂ：被検血漿の比率が10％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｃ：被検血漿の比率が20％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｄ：被検血漿の比率が50％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｅ：被検血漿の比率が80％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｆ：被検血漿の比率が90％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｇ：被検血漿の凝固時間)
RC-Sは、ロスナー・インデックスを応用した指標であり、次のようにして算出される。まず、被検血漿の比率が20及び50％(v/v)の混合血漿についてのスコアを、下記の式により算出する。
RC-S(20) ＝ [(Ｃ−Ｂ)／Ｄ]×100
RC-S(50) ＝ [(Ｄ−Ｃ)／Ｅ]×100
(式中、Ｂ：被検血漿の比率が10％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｃ：被検血漿の比率が20％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｄ：被検血漿の比率が50％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｅ：被検血漿の比率が80％(v/v)の混合血漿の凝固時間)
RC-S(20) ＝ [(Ｃ−Ｂ)／Ｄ]×100
RC-S(50) ＝ [(Ｄ−Ｃ)／Ｅ]×100
(式中、Ｂ：被検血漿の比率が10％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｃ：被検血漿の比率が20％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｄ：被検血漿の比率が50％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｅ：被検血漿の比率が80％(v/v)の混合血漿の凝固時間)
次いで、被検血漿の比率が20及び50％(v/v)の混合血漿について、クロスミキシングテストの反応曲線が直線であった仮定した場合のコントロールスコアを、下記の式により算出する。
RC-Sc(20) ＝ [[(３×Ｂ＋Ｄ)／４−Ｂ]／Ｄ]×100
RC-Sc(50) ＝ [[(Ｃ＋Ｅ)／２−Ｂ]／Ｅ]×100
(式中、Ｂ：被検血漿の比率が10％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｃ：被検血漿の比率が20％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｄ：被検血漿の比率が50％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｅ：被検血漿の比率が80％(v/v)の混合血漿の凝固時間)
RC-Sc(20) ＝ [[(３×Ｂ＋Ｄ)／４−Ｂ]／Ｄ]×100
RC-Sc(50) ＝ [[(Ｃ＋Ｅ)／２−Ｂ]／Ｅ]×100
(式中、Ｂ：被検血漿の比率が10％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｃ：被検血漿の比率が20％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｄ：被検血漿の比率が50％(v/v)の混合血漿の凝固時間、Ｅ：被検血漿の比率が80％(v/v)の混合血漿の凝固時間)
そして、被検血漿の比率が20及び50％(v/v)の各混合血漿について、コントロールスコア(Sc)に対するスコア(S)の比率を算出し、算出した２つの比率の和を定量化指標とする(下記の式を参照)。
S/Sc(20+50) ＝ (RC-S(20)／RC-Sc(20))×100＋(RC-S(50)／RC-Sc(50))×100
S/Sc(20+50) ＝ (RC-S(20)／RC-Sc(20))×100＋(RC-S(50)／RC-Sc(50))×100
本実施形態では、所定の閾値は特に限定されない。例えば、ＬＡ陽性検体、及び凝固因子欠損などＬＡ以外の凝固時間の延長原因を有する検体についてのデータの蓄積により、所定の閾値を経験的に設定できる。あるいは、ＬＡ陽性検体群と、ＬＡ以外の凝固時間の延長原因を有する検体群のそれぞれについて凝固時間を測定して、定量化指標の値を取得し、取得した値に基づいて、両群を明確に区別可能な値を、所定の閾値として設定できる。所定の閾値の算出には、ROC解析などの統計学的手法を用いてもよい。
[３．ＬＡ検出用試薬キット]
本発明の範囲には、ＬＡ検出用試薬キットも含まれる。本実施形態に係る試薬キットは、リン脂質含有複合体の形成を促進するための二価の金属イオンを形成する化合物を含む第１試薬と、活性化剤を含む第２試薬と、カルシウム塩の水溶液からなる凝固開始試薬とを含む。図３に、第１容器１１に収容された第１試薬１０１と、第２容器１２に収容された第２試薬１０２と、第３容器１３に収容された凝固開始試薬１０３とを含む本実施形態の試薬キットの一例を示した。
本発明の範囲には、ＬＡ検出用試薬キットも含まれる。本実施形態に係る試薬キットは、リン脂質含有複合体の形成を促進するための二価の金属イオンを形成する化合物を含む第１試薬と、活性化剤を含む第２試薬と、カルシウム塩の水溶液からなる凝固開始試薬とを含む。図３に、第１容器１１に収容された第１試薬１０１と、第２容器１２に収容された第２試薬１０２と、第３容器１３に収容された凝固開始試薬１０３とを含む本実施形態の試薬キットの一例を示した。
本実施形態では、上記の第１試薬及び第２試薬の少なくとも１つは、リン脂質をさらに含んでいてもよい。試薬中のリン脂質の濃度は特に限定されないが、例えば30μg/ml以上400μg/ml以下、好ましくは10μg/ml以上100μg/ml以下である。リン脂質としてＰＥ、ＰＣ及びＰＳを含むとき、試薬中のＰＥ濃度は、例えば10μg/ml以上100μg/ml以下、好ましくは20μg/ml以上50μg/ml以下であり、ＰＣ濃度は、例えば10μg/ml以上300μg/ml以下、好ましくは10μg/ml以上100μg/ml以下であり、ＰＳ濃度は、例えば１μg/ml以上75μg/ml以下、好ましくは２μg/ml以上15μg/ml以下である。なお、第１試薬及び第２試薬の両方がリン脂質を含む場合、各試薬のリン脂質濃度の合計が上記の範囲内であることが好ましい。
ここで、二価の金属イオンを形成する化合物、活性化剤、リン脂質、及びカルシウム塩の水溶液の種類については、上記の測定方法について述べたことと同じである。
本実施形態では、上記の第１試薬における二価の金属イオンを形成する化合物の濃度は、測定試料における終濃度を上記の範囲に調整可能であるかぎり、特に限定されない。全自動凝固時間測定装置により凝固時間を測定する場合、該装置が吸引可能な試薬量を考慮して、第１試薬における二価の金属イオンを形成する化合物の濃度は、例えば0.1 mM以上20 mM以下、好ましくは1.0 mM以上10 mM以下である。
本実施形態では、上記の第２試薬における活性化剤の濃度は、測定試料における終濃度を上記の範囲に調整可能であるかぎり、特に限定されない。全自動凝固時間測定装置により凝固時間を測定する場合、該装置が吸引可能な試薬量を考慮して、第２試薬における活性化剤の濃度は、例えばエラグ酸であれば10μM以上400μM以下、好ましくは50μM以上150μM以下である。また、シリカであれば、通常0.1 mg/ml以上1.0 mg/ml以下、好ましくは0.2 mg/ml以上0.6 mg/ml以下であることが知られている。
カルシウム塩の水溶液からなる凝固開始試薬におけるカルシウム塩の濃度は、凝固を生じさせることが可能な終濃度に調整可能であるかぎり、特に限定されない。全自動凝固時間測定装置により凝固時間を測定する場合、該装置が吸引可能な試薬量を考慮して、当該試薬におけるカルシウム塩の濃度は、例えば2.5 mM以上40 mM以下、好ましくは10 mM以上30 mM以下である。
別の実施形態に係る試薬キットは、リン脂質含有複合体の形成を促進するための二価の金属イオンを形成する化合物及び活性化剤を含む第１試薬と、カルシウム塩の水溶液からなる凝固開始試薬とを含む。図４に、第４容器１４に収容された第１試薬１０４と、第３容器１３に収容された凝固開始試薬１０３とを含む本実施形態の試薬キットの一例を示した。第１試薬は、リン脂質をさらに含んでいてもよい。
上述のように、本実施形態では、二価の金属イオンを形成する化合物の添加により、血液検体にＬＡが含まれている場合、凝固時間がより延長する傾向にある。一方で、該化合物による効果は、ＬＡに選択的である。よって、本実施形態に係る試薬キットは、ＬＡ検出のためのスクリーニング検査及びミキシングテストに適している。なお、本実施形態に係る試薬キットの使用手順については、上記の凝固時間の測定方法及びＬＡの存否の判定方法について述べたことと同様である。
以下に、本発明を実施例により詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
ＬＡ陽性検体を含む種々の血液検体について、本実施形態に係る測定方法と、従来の測定方法とのそれぞれにより凝固時間を測定し、測定結果を比較した。
ＬＡ陽性検体を含む種々の血液検体について、本実施形態に係る測定方法と、従来の測定方法とのそれぞれにより凝固時間を測定し、測定結果を比較した。
(１)試薬
活性化剤及びリン脂質を含む試薬として、PTT-LA(登録商標)(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いた(以下、この試薬を「APTT試薬」と呼ぶ)。凝固開始剤としてのカルシウム塩の水溶液として、25 mM塩化カルシウム液(Siemens社)を用いた。二価の金属イオンを形成する化合物を含む試薬として、カルシウム、マグネシウム、亜鉛及び銅のそれぞれの塩の水溶液(2.5 mM)を、以下のようにして調製した。
活性化剤及びリン脂質を含む試薬として、PTT-LA(登録商標)(ロシュ・ダイアグノスティックス社)を用いた(以下、この試薬を「APTT試薬」と呼ぶ)。凝固開始剤としてのカルシウム塩の水溶液として、25 mM塩化カルシウム液(Siemens社)を用いた。二価の金属イオンを形成する化合物を含む試薬として、カルシウム、マグネシウム、亜鉛及び銅のそれぞれの塩の水溶液(2.5 mM)を、以下のようにして調製した。
・2.5 mM塩化カルシウム水溶液
25 mM塩化カルシウム液(Siemens社)を蒸留水で10希釈して、2.5 mM塩化カルシウム水溶液を得た。
25 mM塩化カルシウム液(Siemens社)を蒸留水で10希釈して、2.5 mM塩化カルシウム水溶液を得た。
・2.5 mM塩化マグネシウム水溶液
まず、塩化マグネシウム六水和物(キシダ化学株式会社)を蒸留水に溶解して、50 mM塩化マグネシウム水溶液を調製した。得られた水溶液を蒸留水で20希釈して、2.5 mM塩化マグネシウム水溶液を得た。
まず、塩化マグネシウム六水和物(キシダ化学株式会社)を蒸留水に溶解して、50 mM塩化マグネシウム水溶液を調製した。得られた水溶液を蒸留水で20希釈して、2.5 mM塩化マグネシウム水溶液を得た。
・2.5 mM硫酸銅水溶液
まず、硫酸銅(II)五水和物(キシダ化学株式会社)を蒸留水に溶解して、50 mM硫酸銅水溶液を調製した。得られた水溶液を蒸留水で20希釈して、2.5 mM硫酸銅水溶液を得た。
まず、硫酸銅(II)五水和物(キシダ化学株式会社)を蒸留水に溶解して、50 mM硫酸銅水溶液を調製した。得られた水溶液を蒸留水で20希釈して、2.5 mM硫酸銅水溶液を得た。
・2.5 mM塩化亜鉛水溶液
100 mM塩化亜鉛水溶液(キシダ化学株式会社)を蒸留水で40倍希釈して、2.5 mM塩化亜鉛水溶液を得た。
100 mM塩化亜鉛水溶液(キシダ化学株式会社)を蒸留水で40倍希釈して、2.5 mM塩化亜鉛水溶液を得た。
(２)血液検体
被検血漿として、ＬＡ陽性患者の血漿(７例)、第VIII凝固因子の欠損患者の血漿(４例)、第IX凝固因子の欠損患者の血漿(４例)、及びヘパリン添加血漿(５例)を用いた。正常血漿として、Pooled Normal Plasma(Precision BioLogic Inc.社)を用いた。
被検血漿として、ＬＡ陽性患者の血漿(７例)、第VIII凝固因子の欠損患者の血漿(４例)、第IX凝固因子の欠損患者の血漿(４例)、及びヘパリン添加血漿(５例)を用いた。正常血漿として、Pooled Normal Plasma(Precision BioLogic Inc.社)を用いた。
(３)凝固時間の測定
上記の各検体(50μl)を37℃で１分間加温した後、APTT試薬(50μl)を混合し、37℃で20秒間加温した。そして、上記の各金属塩の2.5 mM水溶液(20μl)を混合して測定試料を調製した。各測定試料における二価の金属塩の終濃度は、いずれも0.416 mMであった。得られた測定試料を37℃で約３分間加温した後、25 mM塩化カルシウム液(50μl)を添加して、凝固時間を測定した。また、対照として、従来のAPTT測定方法による凝固時間の測定も行った。すなわち、上記の各検体(50μl)を37℃で１分間加温した後、APTT試薬(50μl)を混合して測定試料を調製した。得られた測定試料を37℃で約３分間加温した後、25 mM塩化カルシウム液(50μl)を添加して、凝固時間を測定した。なお、実施例１では、凝固時間の測定は、全自動凝固時間測定装置CS-2000i(シスメックス株式会社)により行った。
上記の各検体(50μl)を37℃で１分間加温した後、APTT試薬(50μl)を混合し、37℃で20秒間加温した。そして、上記の各金属塩の2.5 mM水溶液(20μl)を混合して測定試料を調製した。各測定試料における二価の金属塩の終濃度は、いずれも0.416 mMであった。得られた測定試料を37℃で約３分間加温した後、25 mM塩化カルシウム液(50μl)を添加して、凝固時間を測定した。また、対照として、従来のAPTT測定方法による凝固時間の測定も行った。すなわち、上記の各検体(50μl)を37℃で１分間加温した後、APTT試薬(50μl)を混合して測定試料を調製した。得られた測定試料を37℃で約３分間加温した後、25 mM塩化カルシウム液(50μl)を添加して、凝固時間を測定した。なお、実施例１では、凝固時間の測定は、全自動凝固時間測定装置CS-2000i(シスメックス株式会社)により行った。
(４)結果
上記の血液検体を、ＬＡ陽性検体群と、ＬＡ以外の検体群(凝固因子欠損検体及びヘパリン添加検体)とに分け、各群について、測定時間(秒)の平均を算出した。対照の測定時間の平均値に対する、本実施形態に係る測定方法による測定時間の平均値の比を、図１に示した。図１では、対照の測定時間の平均値を100％とし、上記の比を凝固時間の延長率(％)として示している。
上記の血液検体を、ＬＡ陽性検体群と、ＬＡ以外の検体群(凝固因子欠損検体及びヘパリン添加検体)とに分け、各群について、測定時間(秒)の平均を算出した。対照の測定時間の平均値に対する、本実施形態に係る測定方法による測定時間の平均値の比を、図１に示した。図１では、対照の測定時間の平均値を100％とし、上記の比を凝固時間の延長率(％)として示している。
図１に示されるように、本実施形態に係る測定方法では、ＬＡ以外の検体群の凝固時間に比べて、ＬＡ陽性検体群の凝固時間が延長される傾向にあることがわかった。よって、本実施形態に係る測定方法は、従来の測定方法よりも、ＬＡに対する感度が改善していることが示唆される。
実施例２
ＬＡ陽性検体を含む種々の血液検体について、本実施形態に係る測定方法と、従来の測定方法とのそれぞれにより凝固時間を測定し、測定した凝固時間からICAを算出して比較した。
ＬＡ陽性検体を含む種々の血液検体について、本実施形態に係る測定方法と、従来の測定方法とのそれぞれにより凝固時間を測定し、測定した凝固時間からICAを算出して比較した。
(１)試薬
実施例２では、実施例１と同じ試薬を用いた。
実施例２では、実施例１と同じ試薬を用いた。
(２)血液検体
実施例２では、実施例１と同じ被検血漿及び正常血漿を用いた。また、混合血漿として、上記の被検血漿のそれぞれと、正常血漿とを１：１で混合して、被検血漿の比率が50％(v/v)の混合血漿を用いた。
実施例２では、実施例１と同じ被検血漿及び正常血漿を用いた。また、混合血漿として、上記の被検血漿のそれぞれと、正常血漿とを１：１で混合して、被検血漿の比率が50％(v/v)の混合血漿を用いた。
(３)凝固時間の測定及び定量化指標(ICA)の算出
血液検体として、混合血漿を追加したこと以外は、実施例１と同様にして、各血液検体の凝固時間を測定した。また、対照として、従来のAPTT測定方法による凝固時間の測定を、実施例１と同様にして行った。下記の式に従って、凝固時間から各検体についてのICAを算出した。
血液検体として、混合血漿を追加したこと以外は、実施例１と同様にして、各血液検体の凝固時間を測定した。また、対照として、従来のAPTT測定方法による凝固時間の測定を、実施例１と同様にして行った。下記の式に従って、凝固時間から各検体についてのICAを算出した。
ICA ＝ [(ｂ−ｃ)／ａ]×100
(式中、ａ：被検血漿の凝固時間、ｂ：被検血漿の比率が50％(v/v)の混合血漿の凝固時間、ｃ：正常血漿の凝固時間)
(式中、ａ：被検血漿の凝固時間、ｂ：被検血漿の比率が50％(v/v)の混合血漿の凝固時間、ｃ：正常血漿の凝固時間)
(４)結果
上記の血液検体を、ＬＡ陽性検体群と、ＬＡ以外の検体群(凝固因子欠損検体及びヘパリン添加検体)とに分け、それぞれ群に含まれる検体のICAをプロットしたグラフを作成した。作成したグラフを図２に示す。図２では、ＬＡ陽性検体を○で表し、ＬＡ以外の検体を●で表す。図２に示されるように、本実施形態に係る測定方法では、従来の測定方法に比べて、ＬＡ以外の検体群と、ＬＡ陽性検体群とをより明確に切り分けできることがわかる。
上記の血液検体を、ＬＡ陽性検体群と、ＬＡ以外の検体群(凝固因子欠損検体及びヘパリン添加検体)とに分け、それぞれ群に含まれる検体のICAをプロットしたグラフを作成した。作成したグラフを図２に示す。図２では、ＬＡ陽性検体を○で表し、ＬＡ以外の検体を●で表す。図２に示されるように、本実施形態に係る測定方法では、従来の測定方法に比べて、ＬＡ以外の検体群と、ＬＡ陽性検体群とをより明確に切り分けできることがわかる。
１１ 第１容器
１２ 第２容器
１３ 第３容器
１４ 第４容器
１０１ 二価の金属イオンを形成する化合物を含む第１試薬
１０２ 活性化剤を含む第２試薬
１０３ カルシウム塩の水溶液からなる凝固開始試薬
１０４ 二価の金属イオンを形成する化合物及び活性化剤を含む第１試薬
１２ 第２容器
１３ 第３容器
１４ 第４容器
１０１ 二価の金属イオンを形成する化合物を含む第１試薬
１０２ 活性化剤を含む第２試薬
１０３ カルシウム塩の水溶液からなる凝固開始試薬
１０４ 二価の金属イオンを形成する化合物及び活性化剤を含む第１試薬
Claims (17)
- ループスアンチコアグラントを含む疑いのある血液検体と、活性化剤とを混合する工程と、
前記血液検体及び前記活性化剤の混合物と、リン脂質含有複合体の形成を促進するための二価の金属イオンを形成する化合物とを混合して、測定試料を調製する工程と、
前記測定試料に、凝固開始剤としてのカルシウム塩の水溶液を添加して、凝固時間を測定する工程と
を含む、凝固時間の測定方法。 - 測定試料における二価の金属イオンを形成する化合物の終濃度が、凝固時間の測定工程で添加されたカルシウム塩の終濃度よりも低い請求項１に記載の測定方法。
- 測定試料における二価の金属イオンを形成する化合物の終濃度が、0.01 mM以上２mM未満である請求項２に記載の測定方法。
- 二価の金属イオンを形成する化合物が、二価の金属と無機酸との塩である請求項１〜３のいずれか１項に記載の測定方法。
- 二価の金属イオンを形成する化合物が、カルシウム、マグネシウム、亜鉛及び銅から選択される少なくとも１つの金属の塩である請求項１〜４のいずれか１項に記載の測定方法。
- 凝固時間の測定工程において、測定試料を所定の条件下でインキュベートしてから、カルシウム塩の水溶液を添加する請求項１〜５のいずれか１項に記載の測定方法。
- 所定の条件が、35℃以上40℃以下の温度にて、２分以上５分以下の時間でインキュベートする条件である請求項６に記載の測定方法。
- 測定試料の調製工程において、リン脂質をさらに混合する請求項１〜７のいずれか１項に記載の測定方法。
- 血液検体として、被検血漿、及び、被検血漿と正常血漿との混合血漿から選択される少なくとも１つを用いる請求項１〜８のいずれか１項に記載の測定方法。
- 正常血漿の凝固時間をさらに測定する請求項１〜９のいずれか１項に記載の測定方法。
- 血液検体と、活性化剤とを混合する工程と、
前記血液検体及び前記活性化剤の混合物と、リン脂質含有複合体の形成を促進するための二価の金属イオンを形成する化合物とを混合して、測定試料を調製する工程と、
前記測定試料に、凝固開始剤としてのカルシウム塩の水溶液を添加して、凝固時間を測定する工程と、
前記凝固時間に基づいて、前記血液検体がループスアンチコアグラントを含むか否かを判定する工程と
を含む、ループスアンチコアグラントの存否の判定方法。 - 判定工程において、測定した凝固時間に基づいて定量化指標を取得し、取得した定量化指標の値に基づいて、血液検体がループスアンチコアグラントを含むか否かを判定する請求項１１に記載の判定方法。
- 判定工程において、定量化指標の値と所定の閾値とを比較して、
前記定量化指標の値が所定の閾値以上である場合、血液検体はループスアンチコアグラントを含むと判定し、
前記定量化指標の値が所定の閾値より小さい場合、血液検体はループスアンチコアグラントを含まないと判定する、
請求項１２に記載の判定方法。 - 定量化指標が、Index of Circulating Anticoagulant (ICA)、Percent Correction (PC)又はResponse Curve-Score (RC-S)である請求項１２又は１３に記載の判定方法。
- リン脂質含有複合体の形成を促進するための二価の金属イオンを形成する化合物を含む第１試薬と、活性化剤を含む第２試薬と、カルシウム塩の水溶液からなる凝固開始試薬とを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法に用いられる試薬キット。
- 第１試薬及び第２試薬の少なくとも１つが、リン脂質をさらに含む請求項１５に記載の試薬キット。
- 第１試薬における二価の金属イオンを形成する化合物の濃度が、0.1 mM以上20 mM以下である請求項１５又は１６に記載の試薬キット。
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