JP6028314B2 - ループスアンチコアグラントの検出方法 - Google Patents
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Description
(A)血液凝固時間の測定前又は測定時に、血液試料及び該試料の希釈試料にそれぞれ血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加する工程、
(B)工程(A)の各試料について血液凝固時間を測定する工程、
(C)工程(B)で得られた各試料についての血液凝固時間を対比する工程
尚、補助試薬には、血液凝固因子の安定化剤として公知のものを、適宜添加してもよい。例えば、特公平06−050999号公報で開示されているグリシルグリシンやグリシルグリシルグリシンなどを添加してもよい。
比=(希釈試料の凝固時間)/(血液試料の凝固時間)
この場合、比が大きいほど希釈試料の凝固時間が延長しているのでLA陰性であり、比が小さいほどLA陽性と判断する。
(1)APTTスクリーニング試験
PTT LA試薬「RD」(ディアグノスティカ スタゴ社製)を使用し、血液凝固自動分析装置STA−R(ロシュ・ダイアグノスティックス社製)にて測定を実施した。判定のためのカットオフ値には20名以上の健常者測定値+2SDの値を使用した。
LAテスト「グラディポア」(医学生物学研究所社製)を使用し、血液凝固自動分析装置STA−Rにて測定を実施した。判定のためのカットオフ値には20名以上の健常者測定値+2SDの値を使用した。
PTT LA試薬「RD」(ディアグノスティカ スタゴ社製)を使用し、血液凝固自動分析装置CP2000(積水メディカル社製)にて測定を実施した。正常血漿としてPooled Normal Plasma(以下PNP、Precision Biologic Inc.)を使用した。サンプル混合割合は0、10、20、50、100%に設定し、CP2000のミキシングテスト機能を使用して自動希釈にて測定を行った。判定はグラフを描画し上に凸であればLA陽性とした。
コアグピアAPTT−N(積水メディカル社製)及び後述の血液凝固因子を含む緩衝液(以下、補助試薬)を使用し、表1に示した測定パラメーターで血液凝固自動分析装置CP2000(積水メディカル社製)にて測定を実施した。具体的には、まず被検血漿45μLに補助試薬を5μL添加したものをサンプルとしてAPTTを測定する(条件1)。次に被検血漿をHBS(50mM HEPES pH7.5、150mM塩化ナトリウム)にて希釈したもの(血漿25μL:HBS20μL)に補助試薬を5μL添加したものをサンプルとしてAPTTを測定する(条件2)。条件1のAPTTをA秒、条件2のAPTTをB秒とするとき、B/A(Ratio)を判定のための測定値として算出する。後述の本発明1,2では希釈時の凝固時間短縮によってLAの有無を判別するため、Ratioが小さい方が陽性となる。判定のためのカットオフ値には20名以上の健常者血漿の測定値−2SDの値を使用した。
HBS(50mM HEPES pH7.5、150mM塩化ナトリウム)をベースに、表2に示した血液凝固因子を添加して補助試薬1及び補助試薬2を調製した。血液凝固因子は全てHaematologic Technologies Inc.製を使用した。
尚、後述の表3から表6において、補助試薬1を用いた場合の結果を「本発明1」、補助試薬2を用いた場合の結果を「本発明2」として表した。
・被検血漿A,B,Cはワルファリンの投与を受けている患者より採取した血漿である。臨床症状等より、LAの存在は否定されている。
・被検血漿1−2は、血液凝固第VIII因子及び血液凝固第IX因子が欠乏した血漿である。抗凝固剤の投与を受けていない。
・被検血漿3−10は、抗凝固剤であるヘパリンの投与を受けている患者より採取した血漿である。臨床症状等より、LAの存在は否定されている。
・被検血漿11−37は、基礎疾患や臨床症状から抗リン脂質抗体の存在が疑われる患者より採取した血漿である。これらのうち、11−24はワルファリン投与を受けている患者より採取した血漿である。
表3に示すとおり、ワルファリン投与・非LA群では、APTTスクリーニング試験において全てカットオフ値以上となり、LA陽性との鑑別は困難である。また、dRVVT試験については3例中2例が偽陽性となった(表中「陽性*」で示した)。一方、混合試験及び本発明1,2では全て陰性となった。
ワルファリン非投与群では、13例中6例が全ての項目で陽性となり、2例が陰性となったためこの8例については陽性・陰性の鑑別可能であった。残り5例中、本発明1,2のみが陽性となった検体30について、aβ2GPIとaPS/PTを測定したところ、aβ2GPIが陽性であったため、dRVVT及び混合試験の偽陰性で、実際にはLA陽性である可能性が非常に高いと考えられる。
Claims (5)
- 次の工程(A)、(B)及び(C)を含むことを特徴とするループスアンチコアグラントの検出方法。
(A)血液凝固時間の測定前又は測定時に、血液試料及び該試料の希釈試料にそれぞれFII、FV、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI及びFXIIから選ばれる1種又は2種以上の血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加する工程、
(B)工程(A)の各試料について血液凝固時間を測定する工程、
(C)工程(B)で得られた各試料についての血液凝固時間を対比する工程 - 血液凝固因子が、FII、FVII、FVIII、FIX、FX、FXI及びFXIIから選ばれる1種又は2種以上である請求項1記載の検出方法。
- 血液試料が、全血又は血漿である請求項1又は2記載の検出方法。
- 血液凝固時間の測定前に、血液試料に、血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加する請求項1〜3のいずれか1項記載の検出方法。
- 血液凝固時間の測定手段が、活性化トロンボプラスチン時間又は希釈ラッセル蛇毒時間である請求項1〜4のいずれか1項記載の検出方法。
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