WO2012173259A1 - ループスアンチコアグラントの検出方法 - Google Patents

ループスアンチコアグラントの検出方法 Download PDF

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正裕 家子
千鶴 森川
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学校法人東日本学園・北海道医療大学
積水メディカル株式会社
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
    • G01N2800/101—Diffuse connective tissue disease, e.g. Sjögren, Wegener's granulomatosis
    • G01N2800/104—Lupus erythematosus [SLE]
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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting lupus anticoagulant positivity used for diagnosis of antiphospholipid antibody syndrome.
  • LA Lupus anticoagulant
  • SLE Systemic Lupus Erythematosus
  • APTT activated partial thromboplastin time
  • PT prothrombin time
  • APS antiphospholipid antibody syndrome
  • LA is defined as an immunoglobulin that inhibits phospholipid-dependent clotting reactions in vitro (APTT, kaolin clotting time, diluted Russell snake venom time, etc.) without inhibiting individual clotting factor activities. It is not an antibody.
  • anti-cardiolipin- ⁇ 2GPI complex antibody, anti-phosphatidylserine-prothrombin complex antibody, etc. have been found as one type of responsible antibody for LA, and there are measurement systems based on the ELISA method.
  • the existence of other LA responsible antibodies other than these is not denied, and even if all of these known responsible antibodies are negative, they may be LA positive.
  • a blood clotting time measuring reagent containing phospholipid is generally used as a reagent for detecting LA. If LA is included in the sample, LA binds to the phospholipid in the reagent, so the phospholipid necessary to advance the in vitro clotting reaction is insufficient and the blood clotting time is extended. . Therefore, LA positive can be determined based on the extension of the blood coagulation time.
  • the LA detection reagent include APTT, PT, and a reagent for diluted Russell snake venom time (dRVVT).
  • Non-Patent Document 2 Blood coagulation correction test using a phospholipid-containing reagent for measuring blood coagulation time, adding normal plasma to the test plasma, and determining the degree to which the blood coagulation time is corrected (normalized) by graphing (Hereinafter, also referred to as “mixing test” or “mixing test”) (Non-Patent Document 2).
  • LA detection reagent As a commercially available LA detection reagent, a measurement reagent based on dRVVT called LA test “Gladipore” (manufactured by Medical Biological Research Institute) is used. With this reagent, the presence or absence of LA in the sample is determined based on the ratio of the coagulation time due to the addition of Russell snake venom and the coagulation time due to the addition of raschel snake venom and an excessive concentration of phospholipid.
  • Stacrot LA manufactured by Diagnostica Stago
  • Stacrot LA manufactured by Diagnostica Stago
  • LA positive patients often exhibit thrombotic symptoms, and anticoagulant therapy is often performed when LA is suspected and examination is started.
  • anticoagulant therapy is often performed when LA is suspected and examination is started.
  • a false positive may occur in APTT and dRVVT, and a false negative may occur in a mixed test.
  • heparin As anticoagulant therapy, heparin that is immediately effective and can be administered intravenously in an emergency, and warfarin, an oral anticoagulant, is used for long-term prophylaxis. Warfarin antagonizes the action of vitamin K, thereby suppressing biosynthesis in the liver of factor II (prothrombin), factor VII, factor IX, and factor X among blood coagulation factors. Therefore, in the case of a warfarin user, since the activity of these coagulation factors is reduced, APTT, PT, and dRVVT are greatly extended regardless of the presence or absence of LA. Moreover, in a mixed test, a factor deficient type may be determined regardless of the presence or absence of LA. In addition, heparin activates antithrombin and activates anticoagulant action to suppress coagulation, thus greatly extending the coagulation time regardless of the presence or absence of LA.
  • the International Society of Thrombosis and Hemostasis measures LA samples after mixing an equal volume of healthy subject plasma with test plasma to compensate for the lack of coagulation factors in samples from patients treated with warfarin. It is recommended to do.
  • the plasma of healthy subjects double-centrifugation is performed so that the platelet count is less than 10 7 / mL, and all blood coagulation factor activities are approximately 100%, and are prepared in-house at each facility and used.
  • Non-patent Document 3 Non-patent Document 3
  • some blood coagulation factors are very unstable and easily inactivated, and it is very difficult to prepare such normal human plasma, and it is difficult to obtain a stable product. It was.
  • the method using normal plasma not only dilutes LA in the test plasma, but also adds substances that interfere with LA measurement in the normal plasma (phospholipids, platelet-derived disrupted membranes, etc.) In some cases, especially when LA is weakly positive, there is a possibility of false negatives.
  • the present inventor prepared a blood sample and a diluted sample thereof, and each sample contains a blood coagulation factor before or during measurement of the blood coagulation time of each sample.
  • a buffer composition hereinafter sometimes referred to as an auxiliary reagent
  • measuring the blood coagulation time for each sample and comparing the blood coagulation time for each sample, the effect of anticoagulation therapy can be reduced.
  • the present invention was completed by finding that LA can be detected with better sensitivity and specificity than existing methods.
  • this invention provides the detection method of lupus anticoagulant characterized by including the following process (A), (B) and (C).
  • A a step of adding a buffer composition containing a blood coagulation factor to a blood sample and a diluted sample of the sample before or during measurement of the blood coagulation time,
  • B measuring blood clotting time for each sample in step (A)
  • C A step of comparing the blood coagulation time for each sample obtained in step (B)
  • the LA detection method of the present invention is characterized by performing the steps (A), (B) and (C). More specifically, as a measurement sample, a blood sample and a diluted sample of the blood sample (hereinafter also simply referred to as a diluted sample) are used, and a buffer composition containing a blood coagulation factor is added to each to increase the blood coagulation time. It is characterized by measuring and comparing its clotting time. In the case of LA-negative patients, the clotting factor is decreased in the diluted sample, resulting in a longer clotting time than in the undiluted sample. In the case of LA positive patients, the clotting factor decreases in the diluted sample, while LA also decreases.
  • a measurement sample a blood sample and a diluted sample of the blood sample (hereinafter also simply referred to as a diluted sample) are used, and a buffer composition containing a blood coagulation factor is added to each to increase the blood coagulation time. It is characterized by measuring and comparing its clotting
  • the amount of phospholipid not bound to LA in the reagent increases, and the clotting time compared to the undiluted sample.
  • the reaction of extending and shortening occurs simultaneously.
  • the coagulation time is shorter than that of the undiluted one.
  • the blood sample used in the method of the present invention is preferably whole blood or plasma, and is usually prepared by adding an anticoagulant such as sodium citrate to blood collected from a subject.
  • an anticoagulant such as sodium citrate
  • the present invention is particularly useful when the subject is a blood sample derived from a subject for which LA detection has been difficult.
  • blood samples include blood samples such as those taking warfarin, those receiving anticoagulant therapy such as heparin therapy, Vitanmin K deficient, and liver failure patients.
  • the dilution factor of the diluted sample is preferably 1.1 times or more, more preferably 1.1 to 3 times, and further preferably 1.5 to 3 times.
  • the diluent used for diluting the blood sample is preferably a buffer solution.
  • the diluted sample is further diluted and used.
  • step (A) of the method of the present invention a buffer composition containing a blood coagulation factor is added to both the blood sample and the diluted sample.
  • a buffer composition containing a blood coagulation factor is added to both the blood sample and the diluted sample.
  • a buffer composition containing a blood coagulation factor is added to both a blood sample and a diluted sample in order to suppress the coagulation time extension due to a decrease in the coagulation factor activity and increase the sensitivity to LA. To do.
  • a blood coagulation factor contained in the buffer composition used in the present invention a blood coagulation factor considered to be deficient in a test blood sample or a coagulation involved in a measurement reaction of a blood coagulation time measurement reagent to be used.
  • Factors are appropriately selected and used. Specifically, it contains at least one blood coagulation factor selected from FII, FV, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI and FXII, and from FII, FVII, FVIII, FIX, FX, FXI and FXII.
  • FII, FVII, FIX and FX are preferable to include one or two or more selected, and it is preferable to include at least one or two or more selected from FII, FVII, FIX and FX.
  • FII, FVII and FX when measuring PT, it is preferable to include one or more selected from FII, FVII and FX.
  • APTT it is preferable to include one or more selected from FII, FVIII, FIX, FX, FXI and FXII, particularly including one or more selected from FII and FIX. Is preferred.
  • dRVVT it is preferable to include the 1 type (s) or 2 or more types chosen from FII and FX.
  • the concentration of the coagulation factor is preferably 0.01 to 2.0 U / mL, more preferably 0.1 to 1.0 U / mL after adding the buffer solution composition to the test blood sample.
  • the concentration of the coagulation factor in the buffer composition is preferably 0.1 to 20 U / mL, more preferably 1 to 10 U / mL. mL.
  • the pH of the buffer solution may be any pH that does not deactivate the blood coagulation factor contained in the auxiliary reagent, and is preferably pH 6-9, more preferably pH 6.5-8.0.
  • a known buffer solution such as Good buffer solution such as HEPES can be appropriately used.
  • the concentration of the buffer solution is preferably 5 to 100 mM, more preferably 5 to 50 mM, as long as the buffer capacity during storage is maintained.
  • glycylglycine or glycylglycylglycine disclosed in JP-B-06-050999 may be added.
  • the buffer composition containing the blood coagulation factor is added to the blood sample and the diluted sample before or during measurement of the blood coagulation time.
  • adding the buffer composition before measuring the blood coagulation time corresponds to pretreatment of the blood sample and the diluted sample. That is, the buffer composition is added to the blood sample and the diluted sample to pretreat the blood sample or diluted sample, and then the blood clotting time is measured using a blood coagulation measurement reagent.
  • adding at the time of measuring the blood coagulation time corresponds to measuring the blood coagulation time by adding the buffer composition to a part of the reagent for blood coagulation measurement. Of these addition times, it is easier to ensure the storage stability of the coagulation factor contained in the buffer composition when the buffer composition is added to the blood sample and the diluted sample before measuring the blood coagulation time. Is preferable.
  • the reagent for blood coagulation time measurement may be any phospholipid-dependent blood coagulation time measurement reagent or measurement method that is sensitive to LA.
  • Prothrombin time PT
  • activated partial thromboplastin time APTT
  • Known reagents for measuring diluted PT dPT
  • dAPTT diluted APTT
  • KCT kaolin clotting time
  • dRVVT diluted Russell snake venom time
  • These known reagents are appropriately combined with phospholipids such as cephalin, contact factor activators mainly composed of negatively charged substances such as kaolin, compounds that produce Ca 2+ such as calcium chloride, snake venom and the like according to the measurement principle. It will be.
  • a dry state or a solution state that is dissolved at the time of use can be appropriately selected.
  • Commercially available products can be used as the reagents.
  • the PT measurement reagent include Coagpia (registered trademark) PT-N (manufactured by Sekisui Medical), Thrombocheck PT plus (manufactured by Sysmex Corporation), and STA reagent series PT (manufactured by Roche Diagnostics). It is commercially available.
  • APTT measurement reagent examples include Coagpia (registered trademark) APTT-N (manufactured by Sekisui Medical), Thrombocheck APTT-SLA (manufactured by Sysmex), APTT liquid “RD” and PTT-LA reagent “RD” (Roche Diagnostic Products) and the like are commercially available.
  • APTT-N manufactured by Sekisui Medical
  • Thrombocheck APTT-SLA manufactured by Sysmex
  • RD APTT liquid
  • PTT-LA reagent “RD” Roche Diagnostic Products
  • a reagent for dRVVT measurement LA test “Gladipore” (manufactured by Medical Biology Laboratory) is commercially available.
  • a reagent kit for LA detection can be prepared by combining one or more of these reagents and a buffer composition (auxiliary reagent) containing the blood coagulation factor of the present invention.
  • an average value and a standard deviation (SD) are obtained from measured values of plasma of 20 or more healthy individuals, and an average value + 2SD (in some cases, an average value ⁇ 2SD) is calculated.
  • SD standard deviation
  • ⁇ Measurement item> (1) APTT Screening Test Using PTT LA reagent “RD” (manufactured by Diagnostica Stago), measurement was performed with an automatic blood coagulation analyzer STA-R (manufactured by Roche Diagnostics). As a cut-off value for determination, a value of measured values of 20 or more healthy subjects + 2SD was used.
  • APTT test (method of the present invention) Coagpia APTT-N (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.) and a buffer solution (hereinafter referred to as auxiliary reagent) containing blood coagulation factors described below, and blood coagulation automatic analyzer CP2000 (manufactured by Sekisui Medical Co., Ltd.) with the measurement parameters shown in Table 1 Measurement was carried out at. Specifically, first, APTT is measured using a sample obtained by adding 5 ⁇ L of an auxiliary reagent to 45 ⁇ L of test plasma (condition 1).
  • APTT is measured using a sample obtained by diluting the test plasma with HBS (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM sodium chloride) (plasma 25 ⁇ L: HBS 20 ⁇ L) and adding 5 ⁇ L of an auxiliary reagent (condition 2).
  • HBS 50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM sodium chloride
  • condition 2 APTT of condition 1
  • B / A Ratio
  • auxiliary reagent 1 Based on HBS (50 mM HEPES pH 7.5, 150 mM sodium chloride), blood coagulation factors shown in Table 2 were added to prepare auxiliary reagent 1 and auxiliary reagent 2. All blood clotting factors are available from Haematologic Technologies Inc. Made using. In Tables 3 to 6 to be described later, the results when the auxiliary reagent 1 was used were shown as “present invention 1”, and the results when the auxiliary reagent 2 was used were shown as “present invention 2”.
  • Human Factor II 200 ⁇ g / mL corresponds to 2 U / mL.
  • Test plasmas A, B, and C are plasmas collected from patients receiving warfarin. The presence of LA is denied from clinical symptoms.
  • Test plasma 1-2 is plasma deficient in blood coagulation factor VIII and blood coagulation factor IX. Not taking anticoagulants.
  • Test plasma 3-10 is plasma collected from a patient receiving heparin, an anticoagulant. The presence of LA is denied from clinical symptoms.
  • Test plasma 11-37 is plasma collected from patients suspected of having antiphospholipid antibodies due to underlying diseases or clinical symptoms. Of these, 11-24 is plasma collected from patients receiving warfarin.
  • the coagulation factor deficient (FVIII and FIX) patient plasma in which LA is negated all of the APTT screening tests exceeded the cut-off value, and it is difficult to differentiate from LA positive.
  • the dRVVT test, the mixing test, and the present inventions 1 and 2 were all negative.
  • the method of the present invention is a system for supplementing the test plasma with a coagulation factor, it includes a step of comparing before and after dilution, so that the coagulation factor is simply deficient and the inhibitor is positive. The result is not ambiguous. As with the dRVVT test and the mixing test, distinction can be made clearly.
  • Table 6 shows the results of the sample group suspected of LA.
  • 13 out of 14 cases in the APTT screening test exceeded the cut-off value, but considering the results in Table 3, it is difficult to differentiate from LA positive.
  • 13 out of 14 cases in the dRVVT test 13 out of 14 cases were positive, but the results shown in Table 3 suggest that there is a possibility of producing false positives by administration of warfarin, and it is difficult to differentiate between false positives by warfarin and LA positives.
  • the negative sample (sample 16) in the APTT screening test does not match the negative sample (sample 19) in the dRVVT test.
  • 3 out of 14 cases were positive, and all 3 positive cases were also positive in the present inventions 1 and 2.
  • a ⁇ 2GPI Anti- ⁇ 2GPI antibody
  • a ⁇ 2GPI anti-phosphatidylserine / prothrombin complex
  • aPS / PT anti-phosphatidylserine / prothrombin complex

Abstract

　ワルファリンやヘパリン等の抗凝固療法を受けている患者由来の試料であっても、該抗凝固療法の影響を受けず、かつ血液凝固因子の欠乏との鑑別が可能で、健常者血漿を用いない、簡便なＬＡ検出方法の開発の提供。　次の工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含むことを特徴とするループスアンチコアグラントの検出方法。 （Ａ）血液凝固時間の測定前又は測定時に、血液試料及び該試料の希釈試料にそれぞれ血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加する工程、 （Ｂ）工程（Ａ）の各試料について血液凝固時間を測定する工程、 （Ｃ）工程（Ｂ）で得られた各試料についての血液凝固時間を対比する工程

Description

ループスアンチコアグラントの検出方法
　本発明は、抗リン脂質抗体症候群の診断に用いられる、ループスアンチコアグラント陽性を検出する方法に関する。
　ループスアンチコアグラント（ＬＡ）は、ＳＬＥ（Ｓｙｓｔｅｍｉｃ　Ｌｕｐｕｓ　Ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）患者においてはじめて報告された循環抗凝血素である。ＬＡ陽性患者の場合、臨床的にはほとんど出血傾向を認めず、むしろ血栓傾向を示す。しかし、ＬＡ陽性患者由来の試料の場合、ｉｎ　Ｖｉｔｒｏでは活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）やプロトロンビン時間（ＰＴ）の延長傾向を示す。その後の研究からＬＡは、陰性荷電を持つリン脂質と、β２－グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）又はプロトロンビンのような血液中のタンパク質との複合体に対する自己抗体であることが明らかとなり、現在はＳＬＥ以外の疾患にも多く検出されることが知られている。特に「抗リン脂質抗体症候群（Ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ　ｓｙｍｄｒｏｍｅ；ＡＰＳ）」と総称される病態で発生頻度が高く、その診断基準における検査所見の１つとなっている（非特許文献１）。
　ＬＡは、個々の凝固因子活性を阻害することなく、ｉｎ　Ｖｉｔｒｏにおけるリン脂質依存性の凝固反応（ＡＰＴＴ、カオリン凝固時間、希釈ラッセル蛇毒時間など）を阻害する免疫グロブリンと定義されており、単一の抗体ではない。例えばＬＡの責任抗体の一種としては、抗カルジオリピン－β２ＧＰＩ複合体抗体や、抗フォスファチジルセリン－プロトロンビン複合体抗体などが見出され、ＥＬＩＳＡ法による測定系が存在する。しかし、これら以外のＬＡ責任抗体の存在は否定されておらず、これら既知の責任抗体の全てが陰性であってもＬＡ陽性となる場合がある。
　ＬＡの検出用試薬としては、一般的にリン脂質を含有する血液凝固時間測定用試薬が用いられている。検体中にＬＡが含まれていると、ＬＡが試薬中のリン脂質と結合してしまうため、ｉｎ　Ｖｉｔｒｏでの凝固反応を進行させるのに必要なリン脂質が不足し、血液凝固時間が延長する。よって、該血液凝固時間の延長に基づき、ＬＡ陽性を判定することができる。該ＬＡ検出用試薬の例としては、ＡＰＴＴ、ＰＴ、及び希釈ラッセル蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）用の試薬等がある。
　また、リン脂質を含有する血液凝固時間測定用試薬を用い、被検血漿に正常血漿を添加し、その血液凝固時間が補正される（正常化する）程度をグラフ化して判定する血液凝固補正試験（以下、「混合試験」、「ミキシングテスト」ということもある）も行われている（非特許文献２）。
　市販のＬＡ検出用試薬としては、ＬＡテスト「グラディポア」（医学生物学研究所社製）というｄＲＶＶＴに基づく測定用試薬が利用されている。この試薬では、ラッセル蛇毒添加による凝固時間と、ラッセル蛇毒及び過剰濃度のリン脂質添加による凝固時間の比に基づいて検体中のＬＡの有無を判定している。
　また上記の他に、スタクロットＬＡ（ディアグノスティカ　スタゴ社製）というＬＡ検出用試薬も市販されている。この試薬では、被検血漿に正常血漿及び過剰のリン脂質を加えたものと、被検血漿に正常血漿のみを加えたものとのＡＰＴＴの凝固時間の差を見ることにより、検体中のＬＡの有無を判定している。
　しかし、前記の既存の方法では、それぞれの試薬により単独の項目を測定しただけでは、凝固時間の延長原因が単に凝固因子欠乏によるものか、凝固因子に対するインヒビターによるものか、ＬＡによるものかを鑑別することは困難である。一方、該原因の違いにより治療方針が異なるため、その鑑別は重要である。そのため、これらのＬＡ検出方法は単独で用いられることは稀であり、２種以上の検査を組み合わせて、その結果を総合的に判断することが推奨されている（非特許文献３）。
ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ　ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ　ＳＴＡＴＥＭＥＮＴ　ＯＮ　ＰＲＥＬＩＭＩＮＡＲＹ　ＣＬＡＳＳＩＦＩＣＡＴＩＯＮ　ＣＲＩＴＥＲＩＡ　ＦＯＲ　ＤＥＦＩＮＩＴＥ　ＡＮＴＩＰＨＯＳＰＨＯＬＩＰＩＤ　ＳＹＮＤＲＯＭＥ，　ＡＲＴＨＲＩＴＩＳ　＆　ＲＨＥＵＭＡＴＩＳＭ　Ｖｏｌ．４２，Ｎｏ．７，Ｊｕｌｙ　１９９９，ｐｐ　１３０９－１３１１ 検査と技術，Ｖｏｌ．３４，Ｎｏ．８，２００６年８月，ｐｐ７３５－７４２ Ｕｐｄａｔｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ｌｕｐｕｓ　ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｈａｅｍｏｓｔａｓｉｓ，７：ｐｐ１７３７－１７４０（２００９）
　前記したように、ＬＡ検出のためには、いくつもの検査を組み合わせなければならず煩雑であり、その結果の解釈についても熟練を必要とするという問題があった。例えば、数種のＬＡ検出方法にて陽性、陰性の判定が異なった場合、各検出方法の原理を考慮した解釈が必要である上、各検出方法の偽陰性・偽陽性の可能性を踏まえて判断しなければならず、既存のＬＡ検出方法ではＬＡの有無を明確に鑑別することが非常に困難である。
　また、ＬＡ陽性患者は血栓症状を呈することが多く、ＬＡを疑い検査を開始する時点で、既に抗凝固療法を施されている場合が多い。しかし、抗凝固療法を施されている患者由来の試料の場合、ＡＰＴＴ、ｄＲＶＶＴでは偽陽性、混合試験では偽陰性が生じる場合があることが知られている。
　抗凝固療法としては、緊急時には即効性があり静脈内投与が可能なヘパリン、長期投与による予防には経口抗凝固薬であるワルファリンが用いられている。ワルファリンは、ビタミンＫの作用に拮抗することにより、血液凝固因子のうち第ＩＩ因子（プロトロンビン）、第ＶＩＩ因子、第ＩＸ因子、第Ｘ因子の肝臓での生合成を抑制する。それ故、ワルファリン服用者の場合、これら凝固因子の活性が低下しているので、ＬＡの有無に関わらずＡＰＴＴやＰＴ、ｄＲＶＶＴが大きく延長する。また、混合試験ではＬＡの有無に関わらず因子欠乏型に判定される場合がある。またヘパリンはアンチトロンビンを活性化し、抗凝固作用を活性化して凝固を抑制するため、ＬＡの有無に関わらず凝固時間を大きく延長する。
　それ故、国際血栓止血学会（ＩＳＴＨ）では、ＬＡ検出の際、ワルファリン投与患者由来の試料について、不足した凝固因子を補うため、被検血漿に対して等量の健常者血漿を混合した後に測定することが推奨されている。前記健常者血漿については、血小板数が１０７／ｍＬを下回るように二重に遠心処理をし、かつ全ての血液凝固因子の活性がほぼ１００％であるものを各施設で自家調製して用いることとされている（非特許文献３）。しかし、血液凝固因子の中には活性が非常に不安定で失活しやすいものもあり、そのような健常者血漿を調製するのは非常に困難で、安定入手が容易でないという問題を有していた。
　また、前記健常者血漿の調製においては、血漿を貯留（プール）、混合する人数が多いほど、凝固因子の活性の個人毎のばらつきを平均化できるが、施設によっては健常者の人数を確保できず、血漿提供者に偏りができるためバッチ間の品質に差が生じてしまう問題もある。さらに、健常者血漿を用いる方法は、被検血漿中のＬＡを希釈してしまうだけでなく、健常者血漿に含まれるＬＡ測定を妨害する物質（リン脂質、血小板由来の破砕膜等）を添加してしまう場合もあるため、特にＬＡが弱陽性の場合は、偽陰性化してしまう可能性があるという問題もあった。
　抗凝固療法により血栓症状を抑えている間であっても、その血栓症状の原因の鑑別は治療方針を左右するため重要である。また当初ＬＡ陽性を確認し、抗凝固療法を開始した場合であっても、ＬＡの消長を監視することは非常に有用であると考えられるが、現在それを簡便に実現する方法は存在しない。
　従って、ワルファリンやヘパリン等の抗凝固療法を受けている患者由来の試料であっても、該抗凝固療法の影響を受けず、かつ血液凝固因子の欠乏との鑑別が可能で、健常者血漿を用いない、簡便なＬＡ検出方法の開発が強く望まれていた。
　そこで本発明者は、前記課題を解決すべく種々検討した結果、血液試料とその希釈試料とを準備し、該各試料の血液凝固時間の測定前又は測定時に、各試料に血液凝固因子を含む緩衝液組成物（以下、補助試薬と言うこともある）を添加し、該各試料について血液凝固時間を測定し、それらの各試料についての血液凝固時間を対比すれば、抗凝固療法の影響を受けず、既存の方法よりも感度・特異度も良好にＬＡを検出可能であることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は、次の工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含むことを特徴とするループスアンチコアグラントの検出方法を提供するものである。
（Ａ）血液凝固時間の測定前又は測定時に、血液試料及び該試料の希釈試料にそれぞれ血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加する工程、
（Ｂ）工程（Ａ）の各試料について血液凝固時間を測定する工程、
（Ｃ）工程（Ｂ）で得られた各試料についての血液凝固時間を対比する工程
　本発明によれば、ワルファリンやヘパリン等の抗凝固療法を受けている患者由来の試料であっても、該抗凝固療法の影響を受けず、ＬＡの有無を簡便かつ従来法よりも感度よく特異的に確認することが可能である。よって、患者が抗凝固療法を受けているか否かを気にする必要がない。また、ＬＡ検出のための凝固時間測定において健常者血漿を準備する必要がないため、従来問題となっていた健常者血漿のバッチ間差や安定入手が難しいという問題をも解消できる。
　本発明のＬＡ検出方法は、前記工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を行うことを特徴とする。より詳細には、測定サンプルとして、血液試料と該血液試料の希釈試料（以下、単に希釈試料ともいう）を用い、それぞれに血液凝固因子を含有する緩衝液組成物を添加して血液凝固時間を測定し、その凝固時間を比較することを特徴とする。ＬＡ陰性患者の場合、希釈試料では凝固因子が減少するため、希釈されていない試料よりも凝固時間が延長する。ＬＡ陽性患者の場合、希釈試料は、凝固因子が減少する一方、ＬＡも減少するため、試薬中のＬＡと結合していないリン脂質量が多くなり、希釈されていない試料と比較して凝固時間が延長する反応と短縮する反応が同時に生じる。ＬＡ（抗体）のリン脂質を捕らえる力価が高い場合には、希釈されていないものよりも凝固時間が短縮する。
　本発明方法に用いられる血液試料は、全血又は血漿が好ましく、通常、被検者から採取した血液に、クエン酸ナトリウムなどの抗凝固剤を加えて調製される。これらの血液試料のうち、従来ＬＡ検出が困難であった被検者由来の血液試料を対象とする場合に、本発明は特に有用である。そのような血液試料としては、ワルファリン服用者、ヘパリン療法等の抗凝固療法を受けている者、ビタンミンＫ欠乏者、及び肝不全患者等の血液試料が挙げられる。
　希釈試料の希釈倍率は、１．１倍以上が好ましく、１．１～３倍がより好ましく、１．５～３倍がさらに好ましい。血液試料の希釈に用いる希釈液は、緩衝液が好ましい。なお、血液試料があらかじめ希釈されている場合には、希釈試料はそれをさらに希釈して用いる。
　本発明方法の工程（Ａ）においては、血液試料及び希釈試料の双方に、血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加する。ＬＡ陽性患者血漿を希釈試料にて凝固時間を測定するとき、凝固因子活性の低下による凝固時間延長と、ＬＡの希釈による凝固時間短縮の両方が拮抗している。ワルファリン投与等により、患者血漿の凝固因子活性が低下している場合、凝固時間延長が優位になりやすい。そのため、本発明では、凝固因子活性の低下による凝固時間延長を抑制し、ＬＡに対する感度を上げるために、血液試料及び希釈試料のどちらに対しても、血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加する。
　本発明に用いられる緩衝液組成物に含有させる血液凝固因子としては、被検血液試料において欠乏していると考えられる血液凝固因子や、使用する血液凝固時間測定用試薬の測定反応に関与する凝固因子を適宜選択して使用する。具体的にはＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ及びＦＸＩＩから選ばれる血液凝固因子の少なくとも１種を含むものであり、さらにＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ及びＦＸＩＩから選ばれる１種又は２種以上を含むのが好ましく、さらに少なくともＦＩＩ、ＦＶＩＩ、ＦＩＸ及びＦＸから選ばれる１種又は２種以上を含むのが好ましい。さらにＰＴを測定する場合には、ＦＩＩ、ＦＶＩＩ及びＦＸから選ばれる１種又は２種以上を含むのが好ましい。ＡＰＴＴを測定する場合には、ＦＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ及びＦＸＩＩから選ばれる１種又は２種以上を含むのが好ましく、特にＦＩＩ及びＦＩＸから選ばれる１種又は２種以上を含むのが好ましい。またｄＲＶＶＴを測定する場合には、ＦＩＩ及びＦＸから選ばれる１種又は２種以上を含むのが好ましい。
　凝固因子の濃度は、被検血液試料に緩衝液組成物を添加した後において、０．０１～２．０Ｕ／ｍＬが好ましく、より好ましくは０．１～１．０Ｕ／ｍＬである。例えば、被検血液試料と緩衝液組成物を９：１の割合で混合する場合は、緩衝液組成物における凝固因子の濃度は０．１～２０Ｕ／ｍＬが好ましく、より好ましくは１～１０Ｕ／ｍＬである。
　緩衝液のｐＨは、補助試薬に含まれる血液凝固因子を失活させないｐＨであればよく、ｐＨ６～９が好ましく、より好ましくはｐＨ６．５～８．０である。緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ等のＧｏｏｄ緩衝液など、公知の緩衝液を適宜用いることが出来る。緩衝液の濃度は、保存中の緩衝能が保たれていればよく、５～１００ｍＭが好ましく、より好ましくは５～５０ｍＭである。
　尚、補助試薬には、血液凝固因子の安定化剤として公知のものを、適宜添加してもよい。例えば、特公平０６－０５０９９９号公報で開示されているグリシルグリシンやグリシルグリシルグリシンなどを添加してもよい。
　本発明方法においては、血液凝固時間の測定前又は測定時に、血液試料及び希釈試料に上記血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加する。ここで、血液凝固時間の測定前に緩衝液組成物を添加するのは、血液試料及び希釈試料の前処理に相当する。すなわち、血液試料及び希釈試料に前記緩衝液組成物を添加して血液試料又は希釈試料を前処理し、次いで血液凝固測定用試薬を用いて血液凝固時間を測定する。一方、血液凝固時間の測定時に添加するのは、血液凝固測定用試薬の一部に前記緩衝液組成物を添加して、血液凝固時間を測定することに相当する。これらの添加時期のうち、血液凝固時間の測定前に、血液試料及び希釈試料に前記緩衝液組成物を添加する方が、緩衝液組成物に含有させる凝固因子の保存安定性を確保しやすい点で好ましい。
　血液凝固時間測定用試薬としては、ＬＡに感受性を示すリン脂質依存性の血液凝固時間測定用試薬あるいは測定法であればいずれでもよく、プロトロンビン時間（ＰＴ）、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、希釈ＰＴ（ｄＰＴ）、希釈ＡＰＴＴ（ｄＡＰＴＴ）、カオリン凝固時間（ＫＣＴ）、及び希釈ラッセル蛇毒時間（ｄＲＶＶＴ）などを測定する公知の試薬を用いることができる。これら公知の試薬は、セファリンなどのリン脂質、カオリンなどの陰性荷電体を主成分とする接触因子活性化剤、塩化カルシウムなどのＣａ２＋を生じる化合物、蛇毒等を測定原理にあわせて適宜組み合わせてなるものである。試薬の形態としては、使用時に溶解される乾燥状態や、あるいは溶液状態等を適宜に選択することができる。前記試薬としてはいずれも市販品を使用できる。ＰＴ測定用試薬としては、例えばコアグピア（登録商標）ＰＴ－Ｎ（積水メディカル社製）、トロンボチェックＰＴプラス（シスメックス社製）、及びＳＴＡ試薬シリーズＰＴ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などが市販されている。ＡＰＴＴ測定用試薬としては、例えばコアグピア（登録商標）ＡＰＴＴ－Ｎ（積水メディカル社製）、トロンボチェックＡＰＴＴ－ＳＬＡ（シスメックス社製）、ＡＰＴＴリキッド「ＲＤ」及びＰＴＴ－ＬＡ試薬「ＲＤ」（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）などが市販されている。ｄＲＶＶＴ測定用試薬としては、ＬＡテスト「グラディポア」（医学生物学研究所社製）が市販されている。また、これらの試薬の１以上と本発明の血液凝固因子を含有する緩衝液組成物（補助試薬）を組みあわせてＬＡ検出用の試薬キットとすることもできる。
　血液試料と希釈試料の凝固時間を比較する方法として、比を算出することができる。例えば、血液試料の凝固時間を基準とする場合は、下記の式にて比を算出する。
　　比＝（希釈試料の凝固時間）／（血液試料の凝固時間）
　この場合、比が大きいほど希釈試料の凝固時間が延長しているのでＬＡ陰性であり、比が小さいほどＬＡ陽性と判断する。
　陰性、陽性を判断するためのカットオフ値は、凝固異常の無い健常者血漿の測定値から一般的な方法で統計学的に算出するのが望ましい。例えば、２０名以上の健常者血漿の測定値から平均値及び標準偏差（ＳＤ）を求め、平均値＋２ＳＤ（場合によっては平均値－２ＳＤ）を算出する。もしくは、パーセンタイル法などで決定する。
　以下の実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
＜測定項目＞
（１）ＡＰＴＴスクリーニング試験
　ＰＴＴ　ＬＡ試薬「ＲＤ」（ディアグノスティカ　スタゴ社製）を使用し、血液凝固自動分析装置ＳＴＡ－Ｒ（ロシュ・ダイアグノスティックス社製）にて測定を実施した。判定のためのカットオフ値には２０名以上の健常者測定値＋２ＳＤの値を使用した。
（２）ｄＲＶＶＴ試験
　ＬＡテスト「グラディポア」（医学生物学研究所社製）を使用し、血液凝固自動分析装置ＳＴＡ－Ｒにて測定を実施した。判定のためのカットオフ値には２０名以上の健常者測定値＋２ＳＤの値を使用した。
（３）混合試験
　ＰＴＴ　ＬＡ試薬「ＲＤ」（ディアグノスティカ　スタゴ社製）を使用し、血液凝固自動分析装置ＣＰ２０００（積水メディカル社製）にて測定を実施した。正常血漿としてＰｏｏｌｅｄ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｐｌａｓｍａ（以下ＰＮＰ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃ　Ｉｎｃ．）を使用した。サンプル混合割合は０、１０、２０、５０、１００％に設定し、ＣＰ２０００のミキシングテスト機能を使用して自動希釈にて測定を行った。判定はグラフを描画し上に凸であればＬＡ陽性とした。
（４）ＡＰＴＴ試験変法（本発明の方法）
　コアグピアＡＰＴＴ－Ｎ（積水メディカル社製）及び後述の血液凝固因子を含む緩衝液（以下、補助試薬）を使用し、表１に示した測定パラメーターで血液凝固自動分析装置ＣＰ２０００（積水メディカル社製）にて測定を実施した。具体的には、まず被検血漿４５μＬに補助試薬を５μＬ添加したものをサンプルとしてＡＰＴＴを測定する（条件１）。次に被検血漿をＨＢＳ（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）にて希釈したもの（血漿２５μＬ：ＨＢＳ２０μＬ）に補助試薬を５μＬ添加したものをサンプルとしてＡＰＴＴを測定する（条件２）。条件１のＡＰＴＴをＡ秒、条件２のＡＰＴＴをＢ秒とするとき、Ｂ／Ａ（Ｒａｔｉｏ）を判定のための測定値として算出する。後述の本発明１，２では希釈時の凝固時間短縮によってＬＡの有無を判別するため、Ｒａｔｉｏが小さい方が陽性となる。判定のためのカットオフ値には２０名以上の健常者血漿の測定値－２ＳＤの値を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
＜補助試薬＞
　ＨＢＳ（５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ　ｐＨ７．５、１５０ｍＭ塩化ナトリウム）をベースに、表２に示した血液凝固因子を添加して補助試薬１及び補助試薬２を調製した。血液凝固因子は全てＨａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ　Ｉｎｃ．製を使用した。
　尚、後述の表３から表６において、補助試薬１を用いた場合の結果を「本発明１」、補助試薬２を用いた場合の結果を「本発明２」として表した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記表２中、Ｈｕｍａｎ　ＦａｃｔｏｒＩＩ、２００μｇ／ｍＬは、２Ｕ／ｍＬに相当する。
＜被検血漿＞
・被検血漿Ａ，Ｂ，Ｃはワルファリンの投与を受けている患者より採取した血漿である。臨床症状等より、ＬＡの存在は否定されている。
・被検血漿１－２は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子及び血液凝固第ＩＸ因子が欠乏した血漿である。抗凝固剤の投与を受けていない。
・被検血漿３－１０は、抗凝固剤であるヘパリンの投与を受けている患者より採取した血漿である。臨床症状等より、ＬＡの存在は否定されている。
・被検血漿１１－３７は、基礎疾患や臨床症状から抗リン脂質抗体の存在が疑われる患者より採取した血漿である。これらのうち、１１－２４はワルファリン投与を受けている患者より採取した血漿である。
＜結果＞
　表３に示すとおり、ワルファリン投与・非ＬＡ群では、ＡＰＴＴスクリーニング試験において全てカットオフ値以上となり、ＬＡ陽性との鑑別は困難である。また、ｄＲＶＶＴ試験については３例中２例が偽陽性となった（表中「陽性＊」で示した）。一方、混合試験及び本発明１，２では全て陰性となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表４に示すとおり、ＬＡが否定されている凝固因子欠乏（ＦＶＩＩＩ及びＦＩＸ）患者血漿では、ＡＰＴＴスクリーニング試験において全てカットオフ値以上となり、ＬＡ陽性との鑑別は困難である。一方、ｄＲＶＶＴ試験、混合試験及び本発明１，２では全て陰性となった。本発明の方法は、被検血漿に凝固因子を補充する系ではあるが、希釈前後を比較するという工程を含むことにより、単純に凝固因子が欠乏している状態と、インヒビター陽性である場合の結果が不明瞭にならない。ｄＲＶＶＴ試験や混合試験と同様に明瞭に鑑別可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表５に示すとおり、ヘパリン投与・非ＬＡ群では、ＡＰＴＴスクリーニング試験において８例中７例がカットオフ値以上となり、ＬＡ陽性との鑑別は困難である。また、ｄＲＶＶＴ試験については８例中２例が偽陽性となった（表中「陽性＊」で示した）。一方、本発明１，２では全て陰性となった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表６ではＬＡが疑われる検体群の結果を示した。ワルファリン投与群ではＡＰＴＴスクリーニング試験において１４例中１３例がカットオフ値以上となったが、表３の結果を考慮するとＬＡ陽性との鑑別は困難である。ｄＲＶＶＴ試験についても１４例中１３例が陽性となったが、表３の結果からワルファリン投与により偽陽性を生じる可能性が示唆されており、ワルファリンによる偽陽性とＬＡ陽性の鑑別は困難である。なお、ＡＰＴＴスクリーニング試験での陰性検体（検体１６）とｄＲＶＶＴ試験での陰性検体（検体１９）は一致していない。一方、混合試験は１４例中３例が陽性となり、陽性３例は全て本発明１，２においても陽性であった。従ってｄＲＶＶＴ試験の結果中、少なくとも１４例中７例（表中「陽性＊」で示した）は偽陽性である可能性が高いと考えられる。混合試験は陰性で、本発明１，２が陽性の検体３例（検体１１，２１，２３）についてＬＡの責任抗体と考えられる抗β２ＧＰＩ抗体（以下ａβ２ＧＰＩ）、抗フォスファチジルセリン・プロトロンビン複合体抗体（以下ａＰＳ／ＰＴ）を測定したところ、検体１１，２１は両方陽性、検体２３はａＰＳ／ＰＴが陽性であった。以上よりこの３例の混合試験の結果は偽陰性であり、実際にはＬＡ陽性である可能性が非常に高いと考えられる。
　ワルファリン非投与群では、１３例中６例が全ての項目で陽性となり、２例が陰性となったためこの８例については陽性・陰性の鑑別可能であった。残り５例中、本発明１，２のみが陽性となった検体３０について、ａβ２ＧＰＩとａＰＳ／ＰＴを測定したところ、ａβ２ＧＰＩが陽性であったため、ｄＲＶＶＴ及び混合試験の偽陰性で、実際にはＬＡ陽性である可能性が非常に高いと考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　ＡＰＴＴスクリーニング試験及びｄＲＶＶＴ試験においては、ヘパリンやワルファリン等の抗凝固剤の影響を受け偽陽性を生じる。また、混合試験についてはワルファリンの影響等を受け、偽陰性が生じる場合がある。本発明方法は、ＡＰＴＴスクリーニング試験及びｄＲＶＶＴ試験のようにヘパリンやワルファリン等の抗凝固剤の影響を受けることなく、凝固因子欠乏との鑑別も明瞭であり、混合試験よりも感受性が高く偽陰性が少ない。

Claims (5)

  1. 　次の工程（Ａ）、（Ｂ）及び（Ｃ）を含むことを特徴とするループスアンチコアグラントの検出方法。
    （Ａ）血液凝固時間の測定前又は測定時に、血液試料及び該試料の希釈試料にそれぞれ血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加する工程、
    （Ｂ）工程（Ａ）の各試料について血液凝固時間を測定する工程、
    （Ｃ）工程（Ｂ）で得られた各試料についての血液凝固時間を対比する工程
  2. 　血液凝固因子が、ＦＩＩ、ＦＶ、ＦＶＩＩ、ＦＶＩＩＩ、ＦＩＸ、ＦＸ、ＦＸＩ及びＦＸＩＩから選ばれる１種又は２種以上である請求項１記載の検出方法。
  3. 　血液試料が、全血又は血漿である請求項１又は２記載の検出方法。
  4. 　血液凝固時間の測定前に、血液試料に、血液凝固因子を含む緩衝液組成物を添加する請求項１～３のいずれか１項記載の検出方法。
  5. 　血液凝固時間の測定手段が、活性化トロンボプラスチン時間又は希釈ラッセル蛇毒時間である請求項１～４のいずれか１項記載の検出方法。
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